PARMETROS CITOGENTICOS DE ESPCIES COMERCIAIS DE CARANGIDAE

(PERCIFORMES), COM VISTAS A SUA EMPREGABILIDADE NA CONSERVAO

BIOLGICA E PISCICULTURA MARINHA

UEDSON PEREIRA JACOBINA

Tese de doutorado apresentada ao Programa

de Ps Graduao Rede Nordeste de

Biotecnologia (RENORBIO), como parte dos

requisitos para obteno do Ttulo de Doutor

em Biotecnologia

Orientador- Dr. Wagner Franco Molina

NATAL-RN

2012

Seo de Informao e Referncia

Catalogao da Publicao na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede

Jacobina, Uedson Pereira Parmetros citogenticos de espcies comerciais de carangidae (perciformes), com vistas a sua

empregabilidade na conservao biolgica / Uedson Pereira Jacobina. Natal, RN, 2012.

150 f. : il.

Orientador: Wagner Franco Molina.

Tese (Doutorado) Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Rede Nordeste de Biotecnologia.

1. Piscicultura Marinha Tese. 2. Marcadores Cromossnicos Tese. 3. Software Lekin Tese. I.

Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Ttulo.

RN/UF/BCZM CDU 639.2.04

Dedico este trabalho a meu pai Ldio

Jacobina Vieira Santos

Nem tudo que se enfrenta pode

ser modificado, mas nada pode ser

modificado at que seja enfrentado. A

tradio a personalidade dos imbecis.

Albert Einstein

AGRADECIMENTOS

Agradeo a Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao programa Rede Nordeste de

Biotecnologia (RENORBIO) pela oportunidade de realizar este trabalho.

Ao meu orientador Professor Dr. Wagner Franco Molina, pelo apoio e confiana depositada

em mim, que foram fundamentais para a realizao deste trabalho e oportunidade de

trabalhar com grupo, objeto de estudo, fantstico, os Carangdeos.

Aos professores Dr Luiz Antonio Carlos Bertollo, Marcelo de Bello Cioffi e Marcelo Vicari

pela amizade, parceria e dicas na melhoria deste trabalho.

Aos Professores Dr. Darlio Teixeira, Carlos Blaha e Paulo Srgio Marinho pelas crticas e

sugestes para a melhoria do trabalho.

Aos Professores Dr. Orlando Moreira-Filho, Vitor de Oliveira Lunardi, Carlos Alfredo

Galindo Blaha e Liliane de Lima Gurgel pelas crticas essenciais e fundamentais na

melhoria desse trabalho.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPQ) pela bolsa de pesquisa concebida em 2009.

Ao Conselho de Aperfeioamento Superior pela bolsa REUNI concebida de 2010 a 2012,

fundamental na minha permanncia e continuidade deste trabalho em Natal.

As Professoras Kattia Scortecci e Adriana Ucha pelos ensinamentos, dicas e bate papos

descontrados nas aulas de Biologia Celular fundamentais para o meu aprendizado e

amadurecimento como um futuro docente.

A minha famlia, os irmos Wilton, Wendell e Jos Welton e principalmente minha me

Beatriz Alencar Jacobina por todo amor e carinho e confiana depositada em mim.

Ao grande amigo Pablo Martinez pela convivncia, parceria nos trabalhos e claro parceiro

das melhores baladas em Natal, e por compartilhar os momentos difceis.

Aos grandes amigos Layse, Calado, Washington, Valdir, Silvio e Valrio pelo apoio e por

tornarem esta convivncia mais descontrada e bem mais feliz em minha estadia de quatro

anos em Natal.

Aos amigos de Guamar Layse, Kelly, Carol, Pedro, Calado, Acarilton, rico, Ira, Gustavo,

Diogo, Felipe, Daniel, Aline, Lucas e Lo pela amizade, apoio, compreenso e por tornar a

convincia mais fcil nos dias de labuta em Guamabeach.

Ao amigo Garcia Jnior pelo apoio e suporte na identificao das espcies.

Aos colegas do laboratrio de Gentica de Recursos Marinhos Gideo, Rodrigo Pantera,

Eurico, Allysson, Amanda, George, Clvis e Paulo por participarem direta ou indiretamente

na realizao deste trabalho.

Em geral gostaria de agradecer a todas as pessoas que de certa forma contriburam na

realizao deste trabalho.

Resumo

Entre os peixes marinhos, as famlias Carangidae e Rachycentridae se apresentam

como grupos de grande importncia comercial pela pesca e potencial para piscicultura

marinha. Entretanto, bases genticas que possam alicerar o futuro cultivo destas

espcies, sobretudo seus aspectos citogenticos so incipientes. Os padres

cromossmicos tm fornecido dados bsicos para a prospeco de processos

biotecnolgicos de manipulao cromossmica voltados ao melhoramento gentico, como

a induo a poliploidia, ginognese e andrognese, assim como obteno de estoques

monossexo e hibridizaes interespecficas. Neste trabalho apresentado um amplo

levantamento citogentico em 10 espcies, sendo sete da famlia Carangidae e de

Rachycentron canadum, espcie monotpica da famlia Rachycentridae. A caracterizao

citogentica clssica e mapeamento in situ de sequncias multignicas foram empregadas.

Adicionalmente em espcies do gnero Selene e em morftipos de Caranx lugubris foram

realizadas comparaes atravs de morfometria geomtrica. Em geral, as espcies

exibiram um marcante conservadorismo cromossmico numrico (2n=48). Apesar de

apresentar, em grande parte, frmulas cariotpicas diferenciadas, conservam diversas

caractersticas cromossmicas tpicas da Ordem Perciformes, como elevado nmero de

elementos monobraquiais, stios Ag-RONs/ DNAr 18S simples e heterocromatina reduzida,

preferencialmente centromrica. Os principais mecanismos envolvidos na diversificao

cariotpica so as inverses pericntricas, com ao secundria de fuses cntricas. Alm

do mapeamento fsico e detalhamento cromossmico para as espcies so apresentados e

discutidos padres de variabilidade intra e diversificao interespecficas, com

identificao de marcadores citotaxonmicos. Este conjunto dos dados propicia um

melhor conhecimento dos padres carioevolutivos destes grupos e condies para o

desenvolvimento de protocolos biotecnolgicos baseados na manipulao cromossmica

para estas espcies Atlnticas.

Abstract

Worldwide, families Carangidae and Rachycentridae represent one of the groups

most important commercial fish, used for food, and great potential for marine aquaculture.

However, the genetic bases that can underpin the future cultivation of these species,

cytogenetic between these aspects are very weak. The chromosomal patterns have

provided basic data for the exploration of biotechnological processes aimed at handling

chromosomal genetic improvement, such as induction of polyploidy, androgenesis and

ginogenesis, as well as obtaining monosex stocks and interspecific hybridizations. This

paper presents a comprehensive cytogenetic survey in 10 species, seven of the family

Carangidae and the monotypic family Rachycentridae. Classical cytogenetic analysis and in

situ mapping of multigene sequences were employed, and additionally for the genus Selene

and morphotypes of Caranx lugubris, comparisons were made using geometric

morphometrics. In general, conservative species exhibit a marked chromosome number

(2n=48). Although present in large part, different karyotypic form, retain many

characteristics typical of chromosomal Order Perciformes, the high number of elements

monobrachyal, Ag-NORs/18S rDNA sites and heterochromatin simply reduced, preferably

centromeric. The main mechanisms involved in karyotypic diversification are the

pericentric inversions, with secondary action of centric fusions. In addition to physical

mapping and chromosome detail for the species are presented and discussed patterns of

intra-and interspecific diversity, cytotaxonomic markers. This data set provides a better

understanding of these patterns caryoevolutyonary groups and conditions for the

development of protocols based on Biotechnology for chromosomal manipulation Atlantic

these species.

Lista de Figuras e Tabelas

Introduo

Figura-1. Relaes filogenticas baseadas em dados morfolgicos (Gushiken, 1988) para

Carangoidei (a) e de tribos da famlia Carangidae (adaptado de Reed et al., 2002) a partir de

sequncias Cit B (b). Pag-18

Tabela-1. Dados citogenticos da famlia Carangidae. Pag-19

Captulo 2

Figura 1. Caritipos de Rachycentron canadum. Colorao convencional (a) destacando os stios Ag-

NORs no par cromossmico no. 2; (b) bandamento C, destacando as RONs como regies

heterocromticas CMA3+/DAPI- ; (c) bandas de replicao, evidenciando os stios de rDNA 18S (par

2) e 5S (pares 3 e 13) como de replicao inicial; (d) double-FISH com sondas de DNAr 18S (rosa) e

5S (verde), evidenciando a localizao dos stios de DNAr 18S no par no. 2 e dos stios de DNAr 5S

nos pares 3 e 13; (e) FISH com seqncias (TTAGGG)n evidenciando a localizao de stios

telomricos nos cromossomos (laranja). Barra = 5 m. Pag-69

Figura 2. Idiograma representativo do complemento cromossmico de Rachycentron canadum,

exibindo o mapeamento citogentico das sequncias ribossomais, Ag-RONs, regies

heterocromticas e bandas de replicao dos cromossomos. Pag-70

Captulo 3

Figura 1. Caritipos das espcies Trachinotus goodei (a, d, g), Trachinotus carolinus (b, e, h) e

Trachinotus falcatus (c, f, i). Colorao convencional (a, b, c) destacando os pares portadores de

stios Ag-RONs; bandamento C (d, e, f); em destaque os pares organizadores nucleolares sob

colorao por CMA3+/DAPI-. Dupla colorao em FISH com sondas de 18S DNAr (verde) e 5S DNAr

(vermelho) (f, g, h). Barra = 5 m. Pag-78

Figura 2. rvore filogentica de parcimnia em algumas espcies da tribo Trachinotini (a),

adaptado de Reed et al. (2002). As relaes moleculares confrontam com uma frmula

cromossmica das espcies de Trachinotus analisadas. Abaixo, uma representao esquematica de

uma nova possibilidade de acrocentrizao (b) e condio derivada de stios de DNAr mltiplos

exclusivo em T. goodei (c). Em destque stios DNAr 18 e 5S em T. Falcatus. Pag-80

Captulo 4

Figura 1. Caritipos das espcies Selene brownii, S setapinnis e S. vomer. (a) Colorao convencional

destacando os stios Ag-RONs no par cromossmico no. 1; (b) bandamento C destacando a regio da

RON com colorao CMA3+/DAPI-; (c) dupla-colorao em FISH com sondas de 18S DNAr (verde) e

5S (vermelho) evidenciando a localizao dos stios de 18S DNAr no primeiro par e 5S DNAr no 9

par nos caritipos; (d) FISH com sondas (TTAGGG)n mostrando os stios telomricos nos

cromossomos. Barra = 5 m. Pag-90

Tabela 1. Distncia de Mahalanobis entre as espcies de Carangidae (diagonal inferior) e valores de

P com testes de permutao de (1000x) (diagonal superior).Pag-90

Figura 2. Variveis cannicas e projeo da forma do corpo e mensuraes de O. palometa

(estrelas pretas), C. lugubris (crculos brancos) S. brownii (quadrados pretos), S. setapinnis (estrelas

brancas), S. vomer (crculos brancos). Abaixo, forma esquemtica comparando entre espcies as

formas. Pag.-91

Captulo 5

Figura 1. Posio geogrfica no Atlntico e detalhe do Arquiplago So Pedro e So Paulo, ponto

de coleta dos morftipos de C. lugubris. Pag-98

Figura 2. Representao esquemtica dos pontos anatmicos dos 12 landmarks (a) definidos para

as anlises morfomtricas em C. lugubris; (1) extremidade do focinho; (2) depresso do perfil

frontal acima do focinho; (3) insero da primeira nadadeira dorsal (4) insero do segundo

ponto de vista dorsal, (5) ltimo raio dorsal, (6) fim da nadaeira anal, (7) insero da anal, (8)

insero nadadeira anal; (9) base final da nadadeira plvica, (10) insero da nadadeira peitoral,

(11 e 12) extremidades anterior e posterior do olho. Pag-105

Figura 3. Dendrograma de similaridade morfolgica, obtido atravs de agrupamento UPGMA, para

espcies de Caranx e Carangoides. Os morftipos de C. lugubris apresentam-se similares entre si,

mas discriminados de espcies morfologicamente mais prximas como C. hippos e C. latus. Um

segundo cluster agrupa C. crysos e C. bartholomaei de corpo alongado. Pag-106

Figura 4. Caritipos dos morftipos I (esquerda) e II (direita) de C. lugubris presentes no ASPSP.

Colorao por Giemsa, com destaque para o par no. 1 portador de stios Ag-RON (a). Bandamento C

(b). Colorao com DAPI/CMA3, exibindo stios GC-ricos dispersos nas regies centromricas e

telomricas da maioria dos pares cromossmicos (c). Double-FISH evidenciando o mapeamento dos

stios 18S DNAr (vermelho) e 5S DNAr (verde). Pag-107

Tabela 1. Espcimes utilizados nas anlises das sequncias de DNA ribossomal 16S, nmero de

acesso no GenBank e seus nmeros de depsito na coleo ictiolgica da UFRN. Pag-108

Tabela 2. Valores mersticos dos elementos seriais nos dois morftipos de C. lugubris e em outras

espcies de Carangidae dos gneros Caranx e Carangoides, com ocorrncia no Atlntico. a

Honebrink (2000); b Smith-Vaniz & Carpenter (2007). Atlantico L. Atlantico Leste; Atlantico O.

Atlantico Oriental. Pag-108

Captulo 6

Figura1. Caritipos de Carangoides bartholomaei (a), Caranx latus (b) e Caranx lugubris (c), sob

colorao convencional. Abaixo respectivamente os padres de distribuio da heterocromatina

para cada espcie. Em destaque, os pares organizadores nucleolares (par 1). Sobreposio

CMA/DAPI nas trs espcies analisadas (g,h e i). Mapeamento cromossmico por dual-color FISH de

sondas DNAr 18S (verde) e 5S (vermelho) em Carangoides bartholomaei (j), Caranx latus (k) e

Caranx lugubris (l). Barra = 5m. Pag-128

Sumrio

1-Introduo

1.1- Aquicultura, aspectos citogenticos e biodiversidade- Pag-14

1.2- Relaes filogenticas das famlias Carangidae e Rachycentridae com vistas

piscicultura marinha. Pag-16

2- Objetivos

3-Material e Mtodos

3.1-Material. Pag-21

3.2-Mtodos. Pag-21

3.2.3- Preparaes cromossmicas. Pag-21

3.2.4-Identificao de padres heterocromticos (bandamento C). Pag-22

3.2.5- Deteco de Regies Organizadoras de Nuclolos (Ag-RONs). Pag-22

3.2.6- Fluorocromos GC- e AT-especficos (CMA3 e DAPI). Pag-22

3.2.7- Hibridao fluorescente in s itu (FISH)Sondas 18S e 5S . Pag-23

3.2.8- Microfotografias e captura de imagens. Pag-24

3.2.9- Anlises Morfomtricas. Pag-25

4- Referncias. Pag-26

Resultados e Discusso

Captulo 1

Protocolos citogenticos e perspectivas biotecnolgicas voltadas piscicultura marinha.

Pag- 31

Captulo 2

Mapeamento cromossmico de seqncias repetitivas em Rachycentron canadum

(Perciformes, Rachycentridae). Implicaes para evoluo cariotpica e perspectivas para

fins biotecnolgicos. Pag- 65

Captulo 3

Perfil discriminatrio de sitios de DNAr e possivel tendncia de acrocentrizao no gnero

Trachinotus. Pag -74

Captulo 4

Peixes-Galo do Atlntico: Independncia dos padres de diferenciao cariotpica e

morfolgica. Pag-86

Captulo 5

Ocorrncia de dois morftipos de Caranx lugubris, (Carangidae) no Arquiplago So Pedro

e So Paulo, meso Atlntico. Pag- 95

Captulo 6

Mapeamento de genes 18S e 5S em espcies pelgicas dos gneros Caranx e Carangoides

(Carangidae).Pag-122

Consideraes finais. Pag-137

1

1- INTRODUO

1.1- Aquicultura, aspectos citogenticos e biodiversidade

Entre as diferentes reas da aquicultura, a piscicultura corresponde atividade de

maior volume em termos de produo mundial, sobretudo a desenvolvida em guas

continentais. Por outro lado, embora a piscicultura marinha venha se desenvolvendo de

forma crescente e em escala global, no geral ainda enfrenta algumas limitaes ao seu

pleno desenvolvimento, como questes sociais e ambientais e o baixo conhecimento da

biodiversidade de algumas regies, do ciclo de vida de espcies e dos seus aspectos

genticos podem ser elencados como empecilhos ao seu pleno desenvolvimento

(Hutchings, 2001; Dulvy et al., 2003).

No Brasil, a aquicultura tem se desenvolvido muito modestamente quando

comparada com outros pases do mundo, frente s expressivas potencialidades da

biodiversidade e condies ambientais do pas. Os grandes problemas enfrentados surgem

da falta de organizao do sistema de transferncia de tecnologia, a carncia de pesquisa

aplicada, do ordenamento e desenvolvimento, bem como da distribuio dos produtos

pesqueiros (Castagnolli, 1996). Embora em mdio prazo, esta atividade venha a ser o setor

que mais oferecer possibilidades de aumento da produo de pescado, so necessrios

estudos que possibilitem a formulao de um programa de desenvolvimento para esta

rea, levando-se em conta as particularidades das diferentes regies brasileiras (Camargo

& Pouey, 2005).

Um passo importante para o sucesso das atividades comerciais da piscicultura

recai na exata compreenso, pelo setor produtivo, das diferenas e perspectivas genticas

que envolvem as populaes naturais e estoques cativos de reprodutores. Populaes

naturais normalmente representam um repositrio de ampla base gentica da espcie,

modelado sob a ao da seleo natural, sua manuteno fonte permanente de

germoplasma a ser utilizado para fins de melhoramento gentico. Estoques cativos de

reprodutores, por outro lado, constituem quase sempre uma amostra gentica limitada,

composto por pequeno nmero de exemplares comparado s populaes naturais, nem

sempre representativa do pool gnico das populaes ou espcie e completamente

dependente do manejo e dos cruzamentos envolvidos para a sua perpetuao.

A gentica aplicada piscicultura abrange quatro principais reas que esto

intimamente interligadas, so elas: a manipulao gentica; manejo gentico,

monitoramento gentico e a conservao gentica. Nas ultimas trs dcadas, estas

2

abordagens comearam a contribuir nos programas de criao de peixes, das quais uma

das mais utilizadas a investigao e aplicaes das informaes cromossmicas (Hussain,

1996; Pandian & Koteeswaran, 1998; Arai, 2001).

Dados cromossmicos relacionados ao melhoramento gentico de peixes

cultivados tm sido foco de discusses e revises durante a ltima dcada (Hulata, 2001).

Estudos cariotpicos tm fornecido informaes bsicas sobre o nmero, tamanho e

morfologia dos cromossomos (Khan et al., 2000), que tem ajudado na compreenso dos

mecanismos evolutivos dos grupos investigados. O conhecimento sobre padres

cromossmicas das espcies fornecem dados bsicos para a padronizao dos processos

de manipulao cromossmica voltados ao melhoramento gentico. Entre estes a induo

da poliploidia, ginognese e andrognese, assim como obteno de estoques monossexo e

hibridizaes interespecficas (Wu et al., 1988; Diter et al., 1993). Estas tcnicas genticas

tm sido amplamente aplicadas em conjuno com o cultivo de espcies aqucolas no

mundo (Arai, 2001; Beardmore et al., 2001; Jankun et al., 2007).

Das 13.000 espcies de peixes marinhos descritos, apenas 2% dessas espcies

foram estudadas sob o ponto de vista citogentico (Brum, 1996). A citogentica representa

uma importante rea dos estudos genticos e o Brasil um dos maiores expoentes. A

caracterizao citogentica de populaes e espcies possibilita a identificao de

polimorfismos, diferenas populacionais sutis e espcies crpticas (Mantovani et al., 2000;

Porto-Foresti, 2006; Molina et al., 2008; Cioffi et al., 2009), que podem ser utilizadas para

o manejo adequado, monitoramento, conservao e a explorao racional dos estoques

pesqueiros.

Os peixes marinhos, comparativamente aos de gua doce apresentam, em geral

uma pequena diversidade no nmero de cromossomos (Brum, 1996). Diferente dos

ambientes continentais, os ambientes marinhos apresentam barreiras fsicas em menor

nmero ou efetividade, o que minimiza o isolamento geogrfico (Lacson, 1992). Essa

condio entre os Perciformes, maior grupo de peixes marinhos, poderia minimizar a

diversificao cariotpica e favorecer um mais amplo compartilhamento entre os grupos

do caritipo basal composto por 48 cromossomos acrocntricos (Ohno, 1970, White, 1973,

Brum, 1996, entre outros). De fato, nesta Ordem, este caritipo encontrado

freqentemente em muitas famlias, tais como Carangidae (Murofushi & Yosida, 1979),

Haemulidae (Aciolly, 2008), Pomacanthidae (Affonso et al., 2000), Pomacentridae (Molina

& Galetti, 2002), dentre outros.

3

Os estudos citogenticos em peixes marinhos neotropicais tm crescido de forma

expressiva, sobretudo em Perciformes (Arajo et al., 2010; Jacobina et al., 2011; Motta-

Neto et al., 2011; Aciolly et al., 2012; dentre outros), apesar de ainda reduzidos frente a

dimenso deste grupo. Em funo da costa brasileira (Atlntico Ocidental) apresentar uma

vasta diversidade ictiofaunstica, dados citogenticos das espcies so ainda reduzidos,

com ausncia de informaes sobre os padres cromossmicos de diversas famlias. Neste

aspecto, as anlises citogenticas em peixes tornam-se especialmente interessantes

porque eles constituem um grupo particular dentre os vertebrados pelo nmero de

espcies, diversidade de formas, comportamento e habitats e pela posio central que

ocupam na evoluo animal (Ohno, 1970). O aprimoramento de tcnicas citogenticas

clssicas e moleculares vem crescentemente permitindo acesso a regies especficas dos

cromossomos. O maior acesso estrutura dos cromossomos aumenta o poder

discriminatrio, entre caritipos aparentemente similares, e revelam mecanismos de

rearranjos insuspeitos (Ozouf-Costaz et al., 1991), bem como so teis na identificao de

homeologias.

1.2 -Relaes filogenticas das famlias Carangidae e Rachycentridae com

vistas piscicultura marinha

No ambiente marinho, Perciformes constitui a ordem dominante, caracterizada

como a maior e mais diversificada dentre os telesteos. Neste grupo a subordem Percoidei

a mais representativa, com 79 famlias, 549 gneros e 3.176 espcies (Nelson, 2006).

Nesta Ordem, a superfamlia Carangoidei representa um dos poucos grupos monofilticos,

constitudo pelas famlias Nematistiidae, Coryphaenidae, Rachycentridae, Echeneidae e

Carangidae (Johnson, 1993). Algumas caractersticas morfolgicas sugerem que

Carangidae, Coryphaenidae, Rachycentridae e Echeneidae formam um grupo

monofiltico (Johnson, 1984), onde Rachycentridae e Echeneidae formam um grupo

monofiltico, tendo Coryphaenidae como grupo-irmo do clado de Nematistiidae e

Carangidae (O'Toole, 2002). Em nmero de espcies Rachycentridae e Nemastiidae so

formadas apenas por uma nica espcie, Coryphaenidae por duas, Echeneidae por oito

(Smith-Vaniz et al., 1999; O'Toole, 2002; Collette, 2003), enquanto que Carangidae, mais

diversificada, abrange 32 gneros e 140 espcies (Smith-Vaniz, 2002).

Em todo o mundo, as famlias Carangidae e Rachycentridae representam um dos

mais importantes grupos de peixes comerciais usados para fins alimentares (Smith-Vaniz

1999). Na famlia Rachycentridae, a espcie monotpica Rachycentron canadum (Cobia),

de ampla distribuio, vivendo em guas tropicais em todo o mundo, sendo importante

4

economicamente e muito bem considerado como um candidato ideal para a aquicultura

eno cenrio mundial. Estes fatores tm estimulado a realizao de pesquisas com esta

espcie nos Estados Unidos, Mxico, Porto Rico, Austrlia, Vietnam, China e Taiwan (FAO,

2006). No Brasil, algumas regies vm tentando buscar solues para o fortalecimento

econmico com bases na aquicultura e vem incentivando polticas de desenvolvimento da

piscicultura marinha atravs de diagnsticos e definies de organismos a serem

cultivados. Atualmente, diversos rgos pblicos vm estudando a implantao no pas de

cultivos desta espcie, Rachycentron canadum, o beijupir, espcie que vem mostrando

grande potencial para a piscicultura marinha devido sua elevada taxa de crescimento

pode alcanar 6 kg em um ano de cultivo, ao alto valor comercial e a qualidade da carne

(Carvalho Filho, 1999; Domingues et al., 2007). J os membros da famlia Carangidae,

representam cerca de 5% dos desembarques anuais de peixes sseos marinhos em todo

mundo. Entretanto, informaes sobre a distribuio e abundncia da maioria dos

carangdeos insuficiente para determinar a viabilidade de explorao ou maior

explorao das espcies (Nakamura, 1980; Honebrink, 2000). Esta reduo de estoques,

alto valor econmico e caractersticas biolgicas vem aumentando as pesquisas e o

emprego de algumas destas espcies, constituintes desta familia na piscicultura marinha.

Carangidae um grupo diverso, constitudo por espcies conhecidas popularmente

como xarus, pmpanos, galos, entre outros. Suas relaes taxonmicas so pouco claras e

uma quantidade considervel de mudanas de nomenclatura vem ocorrendo (Laroche et

al. 1984, Gunn 1990, Honebrink 2000). Dados morfolgicos permitem definir quatro

tribos, sendo elas Trachinotini, Scomberoidini, Naucratini e Carangini. Nestas tribos foram

reconhecidas provisoriamente algumas subfamlias como Trachinotinae, formada pelos

gneros Lichia e Trachinotus, Scomberoidinae, composta por pelos gneros Oligoplites,

Parona e Scomberoides, Naucratinae composta pelos gneros Compogramma, Elagatis,

Naucrates, Seriola e Seriolina e Caranginae, a mais diversificada, formada por 96 espcies,

distribudas em 22 gneros (Smith-Vaniz 1984). Outras filogenias baseadas em

caractersticas morfolgicas foram tambm propostas para Carangidae (Gushiken,

1988). Hipteses filogenticas a partir de sequncias do gene mitocondrial Citocromo b,

revelam suporte para o monofiletismo das subfamlias Caranginae, Naucratinae e

Trachinotinae (Figura, 1), embora a monofilia da tribo Scomberoidini tenha se mostrado

questionvel (Reed et al., 2002).

5

Figura 1. Relaes filogenticas baseadas em dados morfolgicos (Gushiken, 1988) para

Carangoidei (a) e de tribos da famlia Carangidae (b) a partir de sequncias Cit b (adaptado de Reed

et al., 2002).

No que diz respeito aos representantes de Carangidae utilizadas na produo,

vrias espcies, como Pseudocaranx dentex e Trachinotus carolinus tm sido

extensivamente cultivadas em tanques-rede no Japo (Heilman & Spieler, 1999; Ogawa,

1992;). Neste pas a espcie Seriola quinqueradiata j vem sendo cultivada desde 1927, em

gaiolas no mar, a partir da captura de juvenis selvagens (Nakada, 2002). Outras espcies

de Seriola, como S. dumerili, tambm apresentam alto potencial para aquicultura, em

virtude de seu crescimento rpido e alto valor comercial (Mazzola et al., 2000). Mais

recentemente, o cultivo de S. lalandi tem sido implementado comercialmente na Austrlia

e Nova Zelndia, onde dependente de juvenis criados (Poortenaar et al. 2001). No gnero

Caranx, C. melampygus, espcie cujas populaes tem sofrido os efeitos da pesca intensiva

(Shomura, 1987; Friedlander & Dalzell 2004) tem atrado ateno para fins de cultivo.

Do total das cerca de 140 espcies que compem a famlia Carangidae, 25 espcies

(17,8%), de 10 gneros, j dispe de alguma informao citogentica (Tabela 1). No

entanto, a maioria destes estudos est relacionada s espcies do mar Mediterrneo

(Caputo et al., 1996; Sola et al., 2007; Chai et al., 2009).

Um painel mais extenso de marcadores cromossmicos obtidos pela aplicao de

mtodos citogenticos mais resolutivos torna-se necessrio para representantes

Atlnticos da famlia Carangidae. Estes dados possibilitaro analisar a evoluo

cromossmica, bem como a presena de marcadores populacionais ou interespecficos,

subsidiando seu emprego em prticas de manejo e explorao adequada dos estoques

pesqueiros. Anlises citogenticas aprofundadas envolvendo um nmero maior de

gneros e espcies permitiria um primeiro cenrio dos aspectos citogenticos destas

a b

6

famlias Carangidae e Rachycentridae no litoral brasileiro e suporte para seu uso futuro no

melhoramento gentico e desenvolvimento da piscicultura marinha no Brasil.

Tabela 1. Dados citogenticos da famlia Carangidae.

a acrocntrico; st subtelocnrico; m metacntrico; sm submetacntrico, NF=Nmero Fundamental

Espcies 2n NF m/sm st/a Referncias

Alectis ciliaris 48 48 - 48 Murofushi & Yosida, 1979

Atropus atropos 48 - - - Das et al., 1980

Carangoides armatus 48 - - - Das et al., 1980

Carangoides equula 48 48 - 48 Murofushi & Yoshida, 1979

Caranx equula 48 48 - 48 Murofushi & Yoshida, 1979

C. crysos 46 48 2m/sm 44 Netto, 1997

C. sansun 48 50 - 46a/2st Patro & Prasad, 1979

C. sexfasciatus 48 48 - 48 Murofushi & Yosida, 1979

Chloroscombrus chrysurus

48 48 - 48 Pauls, 1993; Netto, 1997

Selene setapinnis 46 48 2m/sm 44 Netto, 1997

Selene vomer 48 50 - 46a/2st Rodrigues et al., 2007

Seriola dumerili 48 50 2sm 46a Vitturi et al., 1986

Seriola dumerili 47 50 1m/2sm 44a Vitturi et al., 1986

Seriola dumerili 48 52 2sm 44a/2st Sola et al., 1997

S. quinqueradiata 48 50 2sm 44a/2st4

6 Ida et al., 1978

Seriola nigrofasciata 48 48 - 48 Tripathy & Das, 1988

Trachinotus carolinus 48 56 8m/sm 40 Rodrigues et al., 2007

T. falcatus 48 58 10m/sm 38 Rodrigues et al., 2007

T. goodei 48 52 4m/sm 44a Rodrigues et al., 2007

Trachurus japonicus 48 66 18 30 Murofushi & Yosida, 1979

T. mediterraneus 48 58 10 38 Vasil'ev, 1980

T. mediterraneus 48 70 4m/4sm 26a/14st Caputo et al., 1996

T. trachurus 48 50 2m 46a Caputo et al., 1996

Selar malam 48 50 2sm 46 Choudhury et al. (1993)

Selar kalla 56 56 - - Choudhury et al. (1993)

http://www.fishbase.com/Eschmeyer/GeneraSummary.cfm?ID=Trachinotushttp://www.fishbase.com/Eschmeyer/EschPiscesSummary.cfm?ID=1011http://filaman.ifm-geomar.de/Genetics/FishGeneticsSummary.cfm?GenusName=Trachurus&SpeciesName=mediterraneus&id=1278&autoctr=1001##

7

2- OBJETIVOS

2.1- Objetivo Geral

O presente trabalho objetivou estabelecer os padres cromossmicos das espcies

Atlnticas de importncia comercial que compe a famlia Carangidae, atravs de tcnicas

citogenticas convencionais e hibridao in situ, que subsidiaro uma melhor

compreenso da taxonomia do grupo, da distribuio espacial da variabilidade gentica,

dos aspectos evolutivos dos cromossomos da famlia, conservao da biodiversidade,

manejo adequado dos recursos naturais e determinao de marcadores citotaxonmicos

visando seu uso futuro no estabelecimento de plantis reprodutores para cultivo.

2.2- Objetivos Especficos

1. Determinao da macroestrutura cariotpica das espcies que compe a famlia

Carangidae, no litoral brasileiro, definindo suas tendncias evolutivas e

mecanismos de mudana;

2. Estabelecimento dos padres cromossmicos estruturais das espcies de

Carangidae pelo uso de bandamentos cromossmicos para identificao das

regies organizadoras de nuclolos e da heterocromatina constitutiva e pelo

emprego de fluorocromos base-especficos (DAPI / CMA3);

3. Mapeamento cromossmico dos genes ribossomais 18S e 5S por meio de

hibridao in situ com sondas fluorescentes (FISH);

4. Caracterizao dos padres cromatnicos de Carangidae, revelados atravs do

emprego de endonucleases de restrio e bandas de replicao pela incorporao

in vivo e in vitro do anlogo de base BrdU;

5. Diagnstico citogentico das espcies de Carangidae propiciando sua utilizao na

manejo da pesca e consolidao da piscicultura marinha de espcies com potencial

para cultivo.

8

3- MATERIAL E MTODOS

3.1-Material

O material analisado foi coletado em diversos pontos ao longo da costa do Rio

Grande do Norte, Nordeste do Brasil, assim como no Arquiplago de So Pedro e So Paulo

(0055.1'N 02920.7'W) e Atol das Rocas (35136 S, 33495 W) sobretudo em regies

reconhecidamente prioritrias em funo da biodiversidade existente, variedade de

habitats e explorao pesqueira. As coletas foram realizadas usando diferentes apetrechos

de pesca, direcionados para o ambiente a ser estudado e/ou particularidades de cada

grupo taxonmico a fim de obter maior variedade de espcies.

Os espcimes coletados foram acondicionados em sacos plsticos com adio de

oxignio puro, at a sua chegada e acomodao em tanques, nas dependncias do

laboratrio de Gentica de Recursos Marinhos da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte para posterior desenvolvimento das prticas citogenticas. Todos os espcimes

utilizados foram fixados em formol por 5 dias e transferidos para lcool etlico 85% para

futura identificao, armazenamento e depsito de exemplares testemunhos em colees

ictiolgicas e museus na Universidade Federal do Rio Grande do Norte e em outras

instituies de pesquisa qualificadas. Identificaes das espcies foram obtidas atravs de

consulta a um taxonomista de grupos marinhos.

3.2- Mtodos

3.2.1-Preparaes cromossmicas

Aps estimulao da diviso celular por meio da inoculao de agentes

mitognicos nos indivduos por 24-48 horas (Molina, 2001), os animais foram sacrificados

para retirada dos tecidos adequados s anlises citogenticas. Cromossomos mitticos

foram obtidos a partir de clulas do rim anterior, segundo a tcnica direta de air-drying

(Bertollo et al., 1978). Alternativamente, procedimentos in vitro, utilizando meio de

cultura RPMI contendo fragmentos de tecido renal (Gold et al., 1996).

A partir da suspenso celular obtida pelos procedimentos acima descritos, foi

realizada a caracterizao cariotpica dos espcimes com uso de colorao convencional.

Aps preparao de lminas coradas com Giemsa 5% em tampo fosfato (pH 6,8), foram

selecionadas as melhores metfases para definio do nmero diplide e confeco do

caritipo dos animais analisados. Os cromossomos foram classificados morfologicamente

de acordo com Levan et al. (1964) e organizados no caritipo em ordem decrescente de

tamanho.

9

3.2.2-Identificao de padres heterocromticos (bandamento C)

A heterocromatina constitutiva foi evidenciada pelo bandamento C (Sumner,

1972), com algumas adaptaes de acordo com o material em estudo. As lminas foram

tratadas com uma soluo de HCl 0,2 N, temperatura ambiente, durante 13 minutos e, a

seguir, submergidas numa soluo de hidrxido de brio 5%, temperatura ambiente,

por 1 minuto. Logo aps, as lminas foram lavadas em soluo de HCl 0,2N e incubadas

numa soluo salina 2xSSC, aquecida a 60C, por 30 minutos. Os cromossomos foram

corados com uma soluo do Giemsa 5%, em tampo fosfato pH 6,8 durante 8 minutos.

Aps cada um dos passos acima, as lminas forma lavadas com gua destilada e secas ao

ar.

3.2.3-Deteco de Regies Organizadoras de Nuclolos (Ag-RONs)

Para a deteco das regies organizadoras de nuclolos (RONs) ativas, ser

utilizado o procedimento descrito por Howell & Black (1980), empregando nitrato de

prata (AgNO3). As lminas foram tratadas com uma mistura contendo 2 partes de uma

soluo aquosa de gelatina 2% (acrescida de cido frmico 1% na proporo de 1ml para

cada 100ml de soluo) e 4 partes de uma soluo de nitrato de prata 50%. O material foi

recoberto com lamnula e incubado em estufa a 60 C, por aproximadamente 5 minutos. A

lamnula foi ento retirada com um jato de gua destilada e os cromossomos corados com

Giemsa 5% em tampo fosfato (pH 6,8) por cerca de 30 segundos. Aps esse perodo, as

lminas foram lavadas em gua corrente e secas ao ar.

3.2.4-Colorao com Fluorocromos GC- e AT-especficos (CMA3 e DAPI)

A dupla colorao por fluorocromos base-especficos (CMA3 e DAPI) seguiu a

metodologia descrita por Barros-e-Silva & Guerra (2009). Preparaes cromossmicas

foram submetidas, a seguir, em formamida 70%/2xSSC a 70C por 2 minutos.

Posteriormente, as lminas foram banhadas por duas vezes em 2xSSC temperatura

ambiente por 2 minutos em cada banho. As lminas foram ento transferidas para uma

bateria de lcool 70%, 85% e 100%, por 2 minutos em cada banho. Aps secagem, foram

adicionados 80l de cromomicina A3 em cada lmina, permanecendo 30 minutos em

cmara escura na geladeira. Aps este perodo, as lminas foram banhadas em trs vezes

em PBS 1x, dois minutos em cada banho e imediatamente montadas com 80 l de soluo

de DAPI/Antifading (0,2 g/ml).

10

3.2.5-Hibridao fluorescente in situ (FISH) Sondas 18S e 5S

A hibridao in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo com a metodologia

descrita por Pinkel et al. (1986) com algumas modificaes. As sondas foram marcadas

por nick translation (BioNick Labeling System Invitrogen) de acordo com as instrues

do fabricante. A soluo de hibridao consistiriu de 200 l de formamida 50%, 80 l de

sulfato dextrano 50%, 40 l de 20xSSC, 80 l de gua q.s.p., perfazendo um volume total de

400 l, sendo adicionado 1,5 g de sonda (DNA marcado com biotina). Em seguida, a

soluo de hibridao foi transferida para um banho fervente, durante 10 minutos, para

desnaturao do DNA e, imediatamente aps, para um recipiente com gelo, impedindo a

renaturao por choque trmico. As lminas, contendo as preparaes cromossmicas,

foram lavadas com tampo PBS 1x por 5 minutos temperatura ambiente, sob agitao e

posteriormente desidratadas em srie alcolica (70%, 85% e 100%). Em seguida, foram

colocadas em RNAse (100 g/ml) por 1 hora e 30 minutos, em cmara mida a 37 C. Aps

este perodo as lminas foram lavadas em solues salinas. O material foi desidratado em

uma srie alcolica, 5 minutos em cada banho, e tratado com formamida 70%/2xSSC a 70

C, por 5 minutos, para desnaturao dos cromossomos. Uma nova desidratao em srie

alcolica foi feita. Foram aplicados sobre a lmina, 50 l da soluo de hibridao

contendo a sonda desnaturada, permanecendo overnight a 37o C em cmara mida.

Transcorrido esse tempo, as lmina foram lavadas em soluo de formamida 50%/2xSSC a

42o C por 10 minutos, trs vezes em 0,1xSSC a 60C, 5 minutos em cada lavagem, e em

soluo Tween 20 (0,05%/2xSSC), sob agitao, por 5 minutos. Foi feito um tratamento

com 90 l de NFDM 5% (non fat dry milk leite em p desnatado) em 4xSSC, por 15

minutos temperatura ambiente. A deteco da sonda foi feita, colocando-se sobre as

lminas, 70 l de FITC (fluorescena isotil cianato-avidina conjugada) a 0,25 g/l, por 30

minutos, em cmara mida, com trs lavagens sucessivas com Tween 20, durante 5

minutos em cada lavagem. O sinal de hibridao foi amplificado com cerca de 70 l de anti-

avidina biotina-conjugada, por 30 minutos, com trs lavagens adicionais com Tween 20,

durante 5 minutos em cada lavagem. Este ciclo e o tratamento com FITC sero repetidos

mais uma vez. Finalmente, a lmina ser desidratada em srie alcolica (70%, 85% e

100%), durante 5 minutos em cada banho. Os sinais de hibridao sero detectados com

avidina-FITC e os cromossomos contra-corados com iodeto de propdio (50 g/ml) ou

DAPI (0,2 g/ml).

11

3.2.6-Microfotografias e captura de imagens

As preparaes cromossmicas convencionais foram analisadas e fotografadas em

microscpio ptico. As preparaes de FISH e de fluorocromos base-especficos foram

analisadas em fotomicroscpio de epifluorescncia Olympus BX50, equipado com sistema

digital de captura de imagens.

12

3.3-Analises Morfomtricas

Para as analises morfomtricas, fotografias sob escala foram obtidas do lado

esquerdo de cada exemplar com uma cmera digital Sony H10 (8,1 megapixels) acoplada a

um trip. Todos os exemplares tiveram o sexo definido por exame macroscpico das

gnadas. Utilizou-se e software TPSDig2 utilizado para localizar os landmarks e as

coordenadas X e Y que foram sobrepostas atravs do software CoordGen, utilizando

anlises Procruster (Rohlf & Slice, 1990). Anlises de componentes principais e variveis

cannicas tambm foram utilizadas para discernir diferenas na morfologia dentro e entre

os grupos de estudo (populaes, espcies, regies de coleta), considerando-se anlise de

significncia de MANOVA quando forem analisados mais de um grupo. Ambos os testes

foram realizados com o software PCAGen e CVAGen respectivamente. A partir da mdia de

distribuio das espcies no grfico de variveis cannicas, foram realizadas matrizes de

deformaes, para comparao de diferenas morfolgicas (Rohlf & Slice, 1990). Todas as

anlises foram realizadas no software MorphoJ 1.02 (Klingenberg, 2008).

13

4- Referncias

Accioly, I.V., Bertollo, L.A.C., Costa G.W.W.F., Jacobina, U.P & Molina, W.F. 2012. Chromosomal population structuring in Carangids (Perciformes) between northeastern and southeastern of Brazil coast. African Journal of Marine Science. In press.

Accioly, I.V & Molina, W.F. 2008. Cytogenetic studies in Brazilian marine Sciaenidae and Sparidae fishes (Perciformes). Genetics and Molecular Research 7, 358-370. Affonso, P.R.A.M. 2000. Caracterizao citogentica de peixes de recifes de corais da famlia Pomacanthidae (Perciformes). Master thesis. Universidade Federal de So Carlos, So Carlos, Brazil, pp 143.

Arai, K. 2001. Genetic improvement of aquaculture finfish species by chromosome manipulation techniques in Japan. Aquaculture 197, 205-228.

Arajo, W. C., Martnez, P. A & Molina, W. F. 2010. Mapping of ribosomal DNA by FISH, EcoRI digestion and replication bands in the cardinalfish Apogon americanus (Perciformes). Cytologia 75, 109117.

Barros-e-Silva, A.E & Guerra M. 2010. The meaning of DAPI bands observed after C-banding and FISH procedures. Biotechnic Histochemistry 85, 115-125.

Beardmore, J. A., Mair, G.C & Lewis, R.I. 2001. Monosex male production in finfish as exampled by tilapia: applications, problems, and prospects. Aquaculture 197, 283-301.

Bertollo, L.A.C. Estudos Citogenticos no gnero Hoplias Gill, 1903 (Pisces, Erythrinidae). Tese (Doutorado na Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto). Universidade de So Paulo, SP, 1978.

Brum, M. J. I. 1996. Cytogenetic studies of Brazilian marine fish. Brazilian Journal of Genetics 19, 421-427.

Camargo, S. G. O & Pouey, J.L.O.F. 2005. Aquicultura - um mercado em expanso. Revista Brasileira de Agrocincia, Pelotas 11, 393-396.

Caputo, V., Marchegiani, F & Olmo, E. 1996. Karyotype differentiation between two species of carangid fishes, genus Trachurus (Perciformes, Carangidae). Marine Biology 127, 193-199.

Carvalho Filho A. Peixes: Costa brasileira. 3.ed. So Paulo: Editora Melro, 1999. 320p.

Castagnolli, N. Aqicultura para o ano 2000. Braslia: 1996. 95 p.

Chai, X., Lu, L.R & Clarke, S. 2009. Karyotype analysis of the yellowtail kingfish Seriola lalandi lalandi (Perciformes: Carangidae) from South Australia. Aquaculture Research 40, 1735-1741.

Cioffi M. B., Martins, C., Centofante, L., Jacobina, U & Bertollo, L. A. C. 2009. Chromosomal variability among allopatric populations of erythrinidae fish Hoplias malabaricus: mapping of three classes of repetitive DNAs. Cytogenetic and Genome Research 125, 132141.

14

Collette, B.B. 2003. Family Echeneidae. in K. E. Carpenter, ed. The living marine resources of the western Central Atlantic. FAO Species identification guide for fishery purposes and Amerixan Society. American Society Ichthyologists & Herpetologists. Speciation Publication. 5, 14141419

Diter, A., Quillet E & Chourrout, D. 1993. Suppression of first egg mitosis induced by heat shocks in the rainbow trout. Journal of Fish Biology 42, 777-786.

Domingues E.C., Peregrino Jr, R.B., Manzella Jr, J.C., Vaske Jr, T., Hazin, F.H.V., Cavalli R.O., Severi W., Hamilton, S. Aspectos biolgicos do beijupir, Rachycentron canadum, espcie potencial para o desenvolvimento da piscicultura marinha no Nordeste. In: Seminrio de Piscicultura Alagoana, 2, 2007, Penedo, AL. Anais .. Penedo, AL: UFAL, 2007..17 p. (Resumo).

Dulvy, N.K., Ellis, J.R., Goodwin, N.B., Grant, A., Reynolds, J.D & Jennings, S. 2004 Methods of assessing extinction risk in marine fishes. Fish and Fisheries 5, 255-276.

FAO, 2006. The state of World fisheries and aquaculture 2006. Rome: FAO, 2007. 164p.

Friedlander A & Dalzell P. 2004. A review of the biology and fisheries of two large jacks, ulua (Caranx ignobilis) and omilu (Caranx melampygus), in the Hawaiian archipelago. In: Friedlander A, editor. Status of Hawaiis Coastal Fisheries in the New Millennium, revised 2004 edition. Proceedings of the 2001 fisheries symposium sponsored by the American Fisheries Society, Hawaii Chapter. Honolulu (HI): Hawaii Audubon Society 1, 171185.

Gunn, J. S. 1990. Revision of selected genera of the family Carangidae. Records of the Australian Museum, Supplement 12.

Gushiken, S. 1988. Phylogenetic relationships of the Perciform genera of the family Carangidae. Japan Journal Ichthyology 34, 443461.

Heilman, M.J & Spieler, R.E. 1999. The daily feeding rhythm to demand feeders and the effects of timed meal-feeding on the growth of juvenile Florida pompano, Trachinotus carolinus. Aquaculture 180, 5364.

Honebrink, R.R. 2000. A review of the Biology of the Carangidae, with emphasis on species found in Hawaiian waters. DAR Technical Report 20-01. Division of Aquatic Resources, Department of Land and Natural Resources Honolulu, (HI). 43p.

Howell, W.M. & Black, D.A. 1980.Controlled silver staining of nucleolus organizer region with protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36, 1014-1015.

Hulata, G. 2001. Genetic manipulations in aquaculture: a review of stock improvement by classical and modern technologies. Genetica 111, 155-173.

Hussain, M.G. 1996. Advances in chromosome engineering research in fish: review of methods, achievements and applications. Asian Fisheries Science 9, 4561.

Hutchings, J.A. 2001 Influence of population decline, fishing, and spawner variability on the recovery of marine fish. Journal of Fish Biology 59, 306322.

15

Jacobina, U. P., Cioffi, M. B., Souza, L. G. R., Calado, L. L., Tavares, M., Manzella Jr, J., Bertollo, L. A. C & Molina, W. F. 2011. Chromosome mapping of repetitive sequences in Rachycentron canadum (Perciformes: Rachycentridae): Implications for karyotypic evolution and perspectives for biotechnological uses. Journal of Biomedicine and Biotechnology 1, 1-8.

Jankun, M., Kuzminski, K & Fugala-Slezniow, G. 2007. Cytologic ploidy determination in fish an example of two salmonid species. Environmental Biotechnology 3, 52-56.

Johnson, G. D. 1984. Percoidei: Development and Relationships. In: H.G. Moser et al. (Eds.), Ontogeny and Systematics of Fishes. American Society Ichthyologists & Herpetologists. Speciation Publication 1, 464-498.

Johnson, G. D. 1993. Percomorph phylogeny: progress and problems. Bulletim Marine Science 52, 3-28.

Khan, T. A.; Bhise, M. P & Lakra, W. S. 2000. Chromosome manipulation. In fish a review. Indian Journal of Animal Science 70, 213-221.

Klingenberg, C.P., 2008 MorphoJ. Faculty of Life Sciences, University of Manchester, Manchester. Available from: http://www.flywings.org.uk/MorphoJ page.htm.

Lubbock, R., Edwards, A., 1981. Fishes of Saint Pauls Rocks. Journal of Fish Biology 18, 135-157.

Lacson, J. M. 1992. Minimal genetic variation among samples of six species of coral reef fishes collected at La Parguera, Puerto Rico, and Discovery Bay, Jamaica. Marine Biology 112, 327-331.

Laroche, W. A., Smith-Vaniz, W. F & Richardson S.L. 1984. Carangidae development. In: H.G. Moser et al. (Eds.), Ontogeny and Systematics of Fishes. Speciation Publication. American Society of Ichthyolists and Herpetologists 1, 510-522.

Levan, A., Fredga, K & Sandberg, A.A. 1964.Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas 52, 201-220.

Mazzola A., Favaloro, E & Sara, G. 2000. Cultivation of the Mediterranean amberjack, Seriola dumerili, Risso (1810), in submerged cages in the Western Mediterranean Sea. Aquaculture 181, 257268.

Molina, W.F. 2001. An alternative method for mitotic stimulation in fish cytogenetics. Chromosome Science 5, 149-152.

Molina, W.F. Galetti Jr. P.M. 2002. Robertsonian rearrangements in the reef fish Chromis (Perciformes, Pomacentridae) involving chromosomes bearing 5S rRNA genes. Genetics and Molecular Biology 25, 373-377.

Motta-Neto, C.C, Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C, Molina, W. F. 2011. Extensive chromosomal homologies and evidence of karyotypic stasis in Atlantic grunts of the genus Haemulon (Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 401, 7579.

16

Murofushi, M & Yoshida, T. H.1979. Cytogenetical studies on fishes. II. Karyotypes of four carangid fishes. Japanese Journal of Genetics 54, 367-370.

Nakada, M. 2002. Yellowtail culture development and solutions for the future. Reviews in Fisheries Science 10, 559-575.

Nakamura E. L. 1980. Carangids of the northern Gulf of Mexico. In: Flandorfer M, Skupien L (eds) Proceedings of a workshop for potential fishery resources of the northern Gulf of Mexico, March 45, 1980, New Orleans, La 1833.

Nelson, J. S. 2006. Fishes of the world, 4 ed. John Wiley & Sons, New York.

Ohno, S. 1970. Evolution by gene duplication. New York. Springer-Verlag, 160p.

Ogawa, K. 1992. Caligus longipedis infection of cultured striped jack, Pseudocaranx dentex (Teleostei: Carangidae) in Japan. Fish Pathology 27, 197-205.

OToole, B. 2002. Phylogeny of the species of the superfamily Echenoidea (Perciformes: Carangoidei: Echeneidae, Rachycentridae, and Coryphaenidae), with an interpretation of echeneid hitchhiking behaviour. Canadian Journal of Zoology 80, 596623.

Ozouf-Costaz, C., Hureau J. C & Beaunier M. 1991. Chromosome studies of fish of the, suborder Notothenioidei collected in the Weddell Sea during EPOS 3 cruise. Cybium 15, 271-289.

Pandian, T.J & Koteeswaran, R. 1998. Ploidy induction and sex control in fish. Hydrobiologia 384, 167243.

Pinkel, D., Straume, T & Gray, J.W. 1986. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 83, 2934-2938.

Poortenaar, C. W., Hooker, S. H & Sharp N. 2001. Assessment of yellowtail kingfish Seriola lalandi lalandi reproductive physiology, as a basis for aquaculture development. Aquaculture 201, 271286.

Reed, D.L., Carpenter, K.E & Gravelle, M.J. 2002. Molecular systematics of the Jacks (Perciformes: Carangidae) based on mitochondrial cytochrome b sequences using parsimony, likelihood, and Bayesian approaches. Molecular Phylogenetics and Evolution 23, 513-524.

Rohlf F.J. & D.E. Slice, 1990. Methods for comparison of sets of landmarks. Systematic Zoology 39: 40-59.

Shomura, R. S. Hawaiis marine fishery resources: yesterday (1900) and today (1986). 1987. Administrative Report, NMFS Honolulu Laboratory, Southeast Fisheries Science Center H, 87-21

Smith-Vaniz, W. F. 1999. Carangidae. In. Carpenter, K.E. and Niem, V.H. (Eds). The living marine resources of the Western Central Pacific. Volume 4. Bony fishes part 2 (Mugilidae

17

to Carangidae). FAO species identification guide for fishery purposes . FAO, Rome, 2659-2756p.

Smith-Vaniz, W.F. 2002.The living marine resources of the Western Central Atlantic. . In Carpenter, K. E. (Ed). Vol. 3: Bone fishes Part 2. (Opstognathidae to Molidae), sea turtles and marine mammals. FAO Species Identification Guide for Fishery Purposes and American Society of Ichthyologists and Herpetologists Special Publication No. 5. FAO, Rome. 1426-1468p.

Sola L., Cipelli O., Gornung E., Rossi A. R., Andaloro F. & Crosetti D. 1997. Cytogenetic characterization of the greater amberjack, Seriola dumerili (Pisces: Carangidae), by diferent staining techniques and fluorescence in situ hybridization. Marine Biology 128, 573-577.

Sumner, A.T.A.1972. A single technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research 75, 3004-306.

Tripathy N. K & Das C.C. 1988. Karyotypes of five Indian Perciform fishes. Copeia.1988, 231-233. Wu C.J.,YeY.Z & Chen R.D. (1986) Genome manipulation in carp (Cyprinus carpio L.). Aquaculture 54, 57-61.

Wu, C.Y., Li, J.J., Xia, E.Z., Peng, Z.S., Tan, S.Z., Li, J., Wen, Z.C., Huang, X.H., Cai, Z.L & Chen, G.J. 1988. Transplant and artificial cultivation of Eucheuma striatum in China. Oceanolology Limnology Sinica. 19, 410 417.

Capitulo 1

PROTOCOLOS CITOGENTICOS E PERSPECTIVAS BIOTECNOLGICAS VOLTADAS PISCICULTURA MARINHA

Molina, W.F & Jacobina, U.P

1

PROTOCOLOS CITOGENTICOS E PERSPECTIVAS BIOTECNOLGICAS VOLTADAS PISCICULTURA MARINHA-UMA REVISO

Wagner Franco Molina & Uedson Pereira Jacobina Introduo

O conhecimento dos aspectos da biodiversidade nos ecossistemas

marinhos sensivelmente menor em relao ao ambiente terrestre. Apenas 10%

da investigao sobre a biodiversidade global tm sido dedicado a estes

ecossistemas (Hendriks et al., 2006). Isto particularmente preocupante em face

s mudanas globais decorrentes da sobreexplorao de recursos naturais e as

alteraes climticas. Estas alteraes vm causando efeitos impactantes em vrios

ecossistemas importantes ao ambiente marinho, incluindo regies estuarinas e de

recifes de corais (Pauly et al., 2002; Hughes et al., 2003) gerando efeitos variados

sobre as populaes de peixes (Hendriks, et al., 2006). Atrelado a questes

ambientais a reduo dos estoques pesqueiros naturais est intrinsecamente e

perigosamente relacionada segurana alimentar e ao bem estar social mundial

(Camargo & Pouey, 2005; Jiang, 2010). Neste aspecto, a produo pesqueira

alcanou seu potencial mximo de extrao, sendo incapaz de atender a demanda

mundial de forma sustentvel. Um tero das reservas mundiais de peixes est

esgotado ou em fase de recuperao e necessitam de ser reconstitudas (FAO,

2006). Estima-se caso o ritmo de explorao da pesca extrativa marinha se

mantenha, que haja um colapso global das atividades de pesca comercial at 2048

(Geraque, 2006). Os setores da pesca e aquacultura representam meio de

subsistncia para 540 milhes de pessoas. Alm disto, dependncia deste insumo

constatada pelo consumo histrico alcanado em 2010, contabilizando em mdia

de 17 quilos de pescado por pessoa, ou 15% da dieta mdia de protenas de origem

animal para trs bilhes de pessoas (FAO, 2010). Assim, senso comum que a

aquacultura representa a nica alternativa futura vivel manuteno do consumo

de protena animal de origem aqutica.

2

Atualmente, a produo da piscicultura marinha est concentrada

principalmente no salmo do Atlntico (Salmo salar) a espcie cuja produo teve

a maior expanso nos ltimos anos. Outras espcies que tambm tiveram aumento

significativo de produo foram o robalo europeu (Dicentrarchus labrax) e o pargo

(Sparus aurata) (Alarcon & Alvares, 1999; Zanuy, 2001).

Um passo importante para o sucesso desta atividade recai na exata

compreenso, pelo setor produtivo, das diferenas e perspectivas genticas que

envolvem as populaes naturais e estoques cativos de reprodutores. Populaes

naturais normalmente representam um repositrio de ampla base gentica da

espcie, modelado sob ao da seleo natural, sua manuteno fonte

permanente de germoplasma a ser utilizado para fins de melhoramento gentico.

Estoques cativos de reprodutores, por outro lado, constituem quase sempre uma

amostra gentica limitada nem sempre representativo do pool gnico das

populaes ou espcies e completamente dependente do manejo e dos

cruzamentos envolvidos para a sua perpetuao.

Desde meados da dcada de 80, abordagens genticas passaram a

contribuir nos programas de criao de peixes com o emprego de tcnicas clssicas

e modernas, levando a um crescimento vertiginoso entre outras abordagens, da

investigao e aplicaes das informaes cromossmicas (Hussain, 1996; Arai,

1997a,b; Pandian & Koteeswaran, 1998; Jacobina et al., 2011). De fato, os

conhecimentos sobre o cromossomo e marcadores de DNA esto cada vez mais

incorporados aquicultura de forma prtica eficiente. Neste sentido, o

desenvolvimento de tecnologias de manipulao cromossmica, identificao de

sexo cromossmico, criopreservao de gametas, transgnicos e o mapeamento

gentico, abordagens apoiadas no melhor conhecimento dos cromossomos das

espcies e relacionadas ao melhoramento gentico de peixes cultivados, tm sido

foco de discusses e revises durante a ltima dcada (Hulata, 2001).

A piscicultura marinha vem se desenvolvendo de forma crescente em escala

global, contudo em geral enfrenta algumas limitaes ao seu pleno

desenvolvimento, fatores como baixo conhecimento sobre a biodiversidade de

algumas regies, conhecimento limitado sobre o ciclo de vida de espcies, questes

sociais e ambientais e reduzido conhecimento sobre aspectos genticos das

3

espcies podem se colocar como empecilhos ao seu pleno desenvolvimento

(Hutchings, 2001; Dulvy et al., 2003).

Diante da importncia da aplicao das informaes e protocolos genticos

na aquicultura marinha, aqui apresentada uma breve reviso sobre os principais

empregos e perspectivas do estudo dos cromossomos relacionados piscicultura

marinha.

Identificao da biodiversidade de espcies e estoques

A citogentica representa o ramo da gentica relativo ao estudo dos

cromossomos quanto a seus aspectos morfolgicos e funcionais, sua variao e

evoluo. Nas ltimas dcadas, a citogentica vem se destacando por uma

abordagem eficiente na caracterizao de grupos naturais, utilizando dados

cariotpicos para identificao de espcies (citotaxonomia) e na elaborao de

padres de relacionamento e ou filogenias (citossistemtica). A grande maioria das

espcies cariotipicamente nica, diferindo de outras em relao ao nmero e a

morfologia cromossmica e/ou em relao a caractersticas estruturais dos seus

cromossomos (Dias & Giuliano-Caetano, 2002).

Cerca de 3.425 espcies e sub-espcies j tm algum nvel de informao

cromossmica conhecida (Arai, 2011). Estes dados tm se mostrado uma

ferramenta auxiliar na taxonomia, uma vez que os mtodos tradicionais de

classificao de espcies com a utilizao de anlises de caracteres morfolgicos

esto sujeitos a uma maior variao geogrfica ou ambiental (Bertollo et al., 1978).

Caracteres cromossmicos vm sendo progressivamente utilizados com sucesso na

identificao de espcies crpticas (Bertollo et al., 1978; Moreira-Filho et al., 1991),

assim como nas relaes entre espcies (Brum & Galetti, 1997). No que diz

respeito aos estudos em peixes, ela tm fornecido importantes subsdios para o

melhor entendimento das relaes evolutivas entre espcies e populaes.

A identificao da biodiversidade uma etapa fundamental para medidas

de conservao dos recursos pesqueiros ameaados alm de contribuir para seu

uso sustentvel e manejo. Caractersticas cromossmicas tm sido relacionadas

entre os mais poderosos marcadores genticos na identificao taxonmica de

unidades evolutivas significativas (Moritz et al., 1996).

4

Estudos citogenticos na regio Neotropical tm mostrado algumas

unidades taxonomicas evolutivas como no caso da espcie nominal Hoplias

malabaricus que possui sete cittipos em diverge quanto ao nmero diploide de

2n=39 a 42 cromossmos, com ocorrcia de sistema de cromossomos sexuais

simples ou mltiplo, assim como, ausncia destes (Bertollo, et al., 2000). Alguns

cittipos mostram ampla distribuio geogrfica, enquanto outros parecem ser

endmicos a determinadas bacias hidrogrficas. Situaes de simpatria e sintopia

entre cittipos, sem a deteco de espcimes com frmulas cromossmicas

hbridas, j foram constatadas em vrias localidades, o que refora a diferenciao

existente nesse grupo, sugerindo a inexistncia de fluxo gnico entre os cittipos

(Ferreira et al., 1989; Scavone et al., 1994; Lemos et al., 2002; Pazza & Jlio Jr.,

2003; Born & Bertollo, 2006). Diferenas quanto ao nmero diplide tambm

foram detectadas em Synbranchus marmoratus em que o nmero diplide varia de

2n=42 a 2n=46, assim como a presena de tipos diferenciais de hemoglobina tipo I

(2n=44 a 46) e tipo II (2n=42) (Nakamoto et al., 1986; Torres, 2000). Uma alta

variabilidade na frmula cariotpica tem sido identificada na espcie Astyanax

scabripinnis, que tambm mostra marcada diferenciao relacionada quantidade

e variabilidade de blocos heterocromticos e stios Ag-RONs (Moreira-Filho &

Bertollo, 1991; Mizoguchi et al., 1998; Mantovani et al., 2000).

Neste sentido, estudos citogenticos se mostram teis a diferentes

propsitos na caracterizao de populaes e espcies, seja na identificao de

polimorfismos (Mantovani et al., 2000; Porto-Foresti, 2007; Molina & Galetti,

2008), diferenas populacionais sutis (Cioffi et al., 2009), na deteco de espcies

crpticas (Moreira-Filho et al., 1991; Aguilar & Galetti, 2008; Vicari et al., 2008). De

forma aplicada, estes dados possibilitam o monitoramento e manejo adequado,

visando conservao e a explorao racional dos estoques pesqueiros.

As informaes cariotpicas ainda so incipientes em espcies de peixes

marinhos, que representam uma das grandes fronteiras a serem ultrapassadas

para expanso da piscicultura comercial em alguns pases. Grande parte dos

estudos disponveis tem focado na determinao dos aspectos da macroestrutura

cariotpica de variados grupos, entre eles alguns de grande importncia para a

aquicultura (e.g. Jacobina et al., 2011). Desta forma, tm sido identificados

marcadores citotaxonmicos, sistemas de cromossomos sexuais, cromossomos Bs

5

(supranumerrios) e os mecanismos evolutivos envolvidos na sua diferenciao

(Brum, 199; Molina, 2007; Martinez et al., 2009, entre outros).

Tcnicas clssicas de caracterizao cromossmica (colorao convencional,

Ag-RONs, bandamento C) vem sendo empregadas na maior parte dos estudos

citogenticos em vertebrados, assim como em peixes. Estes conhecimentos,

embora apresentem limitaes, tem disponibilizado um conhecimento aplicvel a

vrios fins biotecnolgicos, destacando-se a manipulao cromossmica e a

obteno de linhagens poliplides, ginogenticas, androgenticas e deteco de

hbridos interespecficos (Komen & Thogard, 2007; Piferrer et al., 2011).

Devido possibilidade de variao mesmo entre espcies prximas, as

regies organizadoras nucleolares (RONs) esto entre os marcadores

citotaxonmicos mais empregados. As RONs so regies do DNA responsveis pela

transcrio do RNA ribossmico, frequentemente exibem padres particulares aos

diferentes grupos de peixes, podendo variar no nmero, localizao, intensidade

de colorao e tamanho, com diferenas inter-individuais dentro de uma mesma

espcie ou mesmo em mosaico, entre clulas de um mesmo indivduo (Morelli,

1998). Variaes numricas inter ou intra-individuais no tamanho, localizao e no

nmero j foram descritas em vrios gneros. Em alguns grupos, a presena destes

stios em apenas um par de cromossomos a condio mais frequente. Este padro

j foi observado tanto em famlias dulccolas como Prochilodontidae (Pauls &

Bertollo, 1990), Anostomidae (Galetti et al., 1984), Parodontidae (Moreira-Filho et

al., 1985), assim como em espcies marinhas das famlias Carangidae (Caputo,

1996), Mugilidae (Sola, 2007), Lutjanidae (Rocha & Molina, 2008), Apogonidae

(Arajo et al., 2009), entre outras. Em outros peixes ocorrem NORs mltiplas ou

simples, como Astyanax (Morelli, 1981; Moreira-Filho, 1989; Paganelli, 1990),

Hoplias (Born & Bertollo 2000; Vicari et al., 2003), ou preferencialmente mltiplas

como em Salmo (Martnez et al., 2009).

Um padro muitas vezes distintivo entre os caritipos dos peixes reside na

distribuio e qualificao da heterocromatina. Regies heterocromticas

compreendem DNA repetitivo, identificados preliminarmente pelo bandamento C

ou por fluorocromos base-especficos. Os caritipos de muitas espcies de

Perciformes tem mostrado uma distribuio da heterocromatina principalmente

nas regies centromricas e terminal (Molina, 2007). Contudo, outros grupos

6

filogenticos como Characiformes, podem apresentar grandes segmentos

heterocromticos em posio intersticial como em Astyanax (Mantovani et al.,

2000).

Fluorocromos base-especficos vm sendo empregadas acessoriamente

para qualificar as regies cromossmicas heterocromticas em peixes. Em peixes,

as RONs com poucas excees, apresentam-se como regies de intensa

fluorescncia quando submetidos fluorocromos GC-especficos (Schweizer,

1980). Por outro lado, o DAPI (4'-6-diamidino-2-phenylindole) forma complexos

fluorescentes com o DNA, mostrando especificidade por regies ricas em bases AT.

Segmentos heterocromticos ricos em bases AT so menos frequentes em peixes

podendo, contudo, serem encontrados em algumas espcies (Amemiya & Gold,

1986). Estes e outros mtodos vm permitindo a identificao da estrutura,

organizao molecular, o mapeamento de genes especficos, at o comportamento

dos cromossomos nas diferentes fases do ciclo celular.

Mapeamento cromossmico - Hibridao in situ Deteco de seqncias repetitivas e telomricas

Os DNAs satlites representam uma importante poro do genoma

eucarioto composta por diferentes classes de DNA repetitivos, no codificadora e

organizada em tandem, com unidades de cerca de 100-300 pares de bases

(Sumner, 1990; Epplen & Epplen-Haupt, 2002), que podem estar dispersas no

genoma, ou organizadas em matrizes em tandem (Charlesworth et al., 1994;

Koehler et al., 1997).

Unidades de DNAs satlites podem estar presentes de centenas a milhares

de cpias em um genoma. Diferentes famlias de DNA satlite tm sido isoladas,

caracterizadas e localizadas em cromossomos de diversas espcies, evidenciando

uma grande correlao com regies de heterocromatina constitutiva (John, 1988;

Lohe et al., 1993; Lohe & Hilliker, 1995). Unidades monomricas repetidas so

comumente detectadas nas regies centromricas e telomricas de alguns ou de

vrios cromossomos de um determinado organismo, associadas a blocos de

heterocromatina constitutiva (Tyler-Smith & Willard, 1993). Alm da quantidade e

da localizao de sequncias especficas de DNA satlite variarem grandemente

entre espcies distintas, estas muitas vezes mostram-se espcie-especficas, o que

7

sugere no somente uma origem distinta, como tambm pode ser resultado de um

processo evolutivo dinmico que leva contnua gerao, amplificao, eliminao

e substituio de famlias de DNAs satlites (Ugarkovic & Plohl, 2002). Embora

anlises envolvendo DNA repetitivos venham sendo realizadas em um grande

nmero de taxa (Singh et al., 1980; Dibartolomeis et al., 1992; Capriglione et al.,

1994; Rajyashri & Singh, 1995; Subramanian et al., 2003; Li et al., 2005; Krzywinski

et al., 2005; Bulazel et al., 2006; Navajas-Perez et al., 2006), ainda se conhece muito

pouco sobre a composio molecular de diferentes tipos de DNAs satlites em

alguns grupos de vertebrados, como em peixes. Estudos em diferentes espcies de

peixes telesteos tm demonstrado que repeties de DNA satlite podem ser teis

em estudos filogenticos (De La Herrn et al., 2001; Saito et al., 2007; Kantek et al.,

2009), para explicitar as relaes entre complexos de espcies (Mantovani et al.,

2004; Vicari et al., 2008; Kantek et al., 2009), determinar origens de cromossomos

supernumerrios (Mestriner et al., 2000; Jesus et al., 2003; Ziegler et al., 2003;

Artoni et al., 2006) e caracterizar cromossomos sexuais (Matsuda et al., 1997;

Devlin et al., 2001; Centofante et al., 2002; Vicente et al., 2003; Vicari et al., 2003).

Um novo e grande salto qualitativo das anlises cromossmicas tem

ocorrido a partir da disponibilizao das tcnicas de hibridao in situ. Estas

metodologias que envolvem sequncias alvo e sondas especficas aumentaram a

resoluo e preciso no mapeamento cromossmico pelo acesso a regies

especficas dos cromossomos, desde genes de cpia simples a unidades repetitivas

particulares (Kasahara, 2009). Alm de sequncias relacionadas a regies

especficas, podem ser obtidas sondas com a inteno de analisar braos

cromossmicos ou cromossomos inteiros. Diante das possibilidades de uso, os

procedimentos de FISH abriram maiores perspectivas para a citogentica

comparativa, tanto voltada para anlises de evoluo cromossmica ou deteco

de caractersticas cariotpicas aplicadas voltadas produo.

A ampliao de estudos acerca da composio e distribuio de diferentes

famlias de DNAs satlites em peixes e outras regies cromossmicas poder

fornecer maiores contribuies caracterizao gentica de diferentes espcies e

compreenso da evoluo do genoma dos peixes, com especial foco em domnios

de heterocromatina.

8

Sequncias telomricas

Os telmeros, regies particulares encontradas nas extremidades dos

cromossomos eucariotos so compostos por repeties da sequncia (TTAGGG)n

DNA e protenas (Shippen, 1993), com papel importante na estabilizao

cromossmica prevenindo fuses e degradao (Blackburn & Szostak, 1984). Sua

estrutura bsica e funo se mostram conservados ao longo da evoluo dos

vertebrados (Meyne et al., 1990; Chew et al., 2002). Apesar do conservadorismo

destas regies, o tamanho das sequncias telomricas variam de espcie para

espcie (Martins et al., 2004).

A anlise destas regies so especialmente indicadas na visualizao de

rearranjos de reduo ou aumento cromossmico, sugeridos pela presena de

sinais ectpicos intersticiais (Reed & Phillips, 1995). Situaes deste tipo j foram

identificadas em algumas espcies de interesse comercial, como trutas e salmes

(Abun et al., 1996) e cicldeos, como Oreochromis niloticus (Chew et al., 2002).

Contudo a no ocorrncia de sequncias telomricas internalizadas em

cromossomos que sofreram translocao Robertsoniana tem sido descritos para

algumas espcies de peixes (Molina & Galetti, 2002). Este fato j descrito para

outros grupos vertebrados no incomum (Meyne et al., 1990) e possivelmente

decorrente de perdas durante o processo de fuso ou acmulo de mutaes ou

aquisio de elementos repetitivos gerando ausncia completa da sequncia

original ou reduo ou ausncia de homologia com as sondas limitando sua

deteco.

Marcadores citotaxonmicos e aspectos funcionais DNA ribossomal 18S e 5S

Estudos sobre genes ribossomais tm ganhado destaque em anlises

citogenticas ou moleculares em uma ampla variedade de animais e plantas,

especialmente na caracterizao de espcie e/ou populaes/estoques. Em

eucariotos superiores, estes genes so organizados em duas famlias multignicas

distintas de repeties em tandem, compostas por centenas de milhares de cpias.

Uma classe representada pelo 45S rDNA, unidade transcricional que codifica o

18S, 5,8S e 28S rRNAs, e um espaador intergnico no transcrito (IGS). Os stios

9

de DNAr 45S ativos constituem as regies organizadoras de nuclolos (NORs), que

aparecem como constries secundrias, visveis como cromatina menos

condensada, nos cromossomos metafsicos. As protenas associadas s NORs

transcricionalmente ativas so argentoflicas permitindo que estes stios

cromossmicos sejam detectados por reao prata (Santoro, 2005).

A outra classe de genes rRNA codificam para o 5S rRNA que consiste de uma

seqncia altamente conservada de 120pb que separada de cada unidade

transcricional por um espaador no-transcrito varivel (NTS) (Longe David,

1980). A seqncia de genes rRNA so bem conservadas, quando se compara entre

os taxa, enquanto os espaadores no-transcritos mostram grande extenso e

variao de seqncias, que acredita-se proporcione um dinamismo acentuado

para os genes rRNA (Galetti & Martins, 2004).

A tcnica de FISH com sondas para a famlia 45S, em peixes, tem sido

amplamente empregada para validar polimorfismos de Ag-NORs, resultantes de

atividade diferencial de transcrio, assim como decorrentes do nmero variavl

de repeties presentes pelo RNAr.

Ao contrrio do RNAr 45S, que pode ser identificado pela impregnao com

a prata, a localizao dos stios de DNAr 5S realizado por hibridao in situ. O

mapeamento de genes RNAr 5S em diversas espcies de peixes tem evidenciado

stios comumente localizados em poro intersticial dos cromossomos, como

observado em espcies de salmondeos e outras famlias (Fujiwara et al., 1998;

Martins & Galetti, 1999; Vicente et al., 2001).

Na piscicultura a utilizao destes marcadores cromossmicos se revela

importante na identificao de hbridos interespecficos como no caso das espcies

de Piauu (Leporinus macrochepalus) e Piapara (Leporinus elongatus) (Hashimoto,

2008), assim como verificao de poliploides induzidos artificialmente como em

alguns ciprinideos, como no caso do Tropidophoxinellus alburnoides (Carmona et

al.,1997), assim como em salmoniformes na truta arco-ris Salmo gairdneri

(Refestie et al., 1981) e Rhodeus ocellatus (Ueno & Arimoto, 1982), entre outros.

Marcadores cromossmicos tm revelado a letalidade entre cruzamentos

de trutas arco ris (Onchorhynchus mykkis) portadores de polimorfismos nas

regies organizadoras de nuclolo, uma vez que rearranjos cromossmicos

envolvendo uma inverso pericntrica ocasionaram uma disfuno na sntese de

10

protenas e consequentemente letalidade no indivduo portador de tal rearranjo.

Neste caso, o indivduo portador de dois segmentos nucleolares no mesmo

cromossomo era uma condio de letalidade (Porto Foresti et al., 2004).

Aspectos citogenticos de cruzamentos heteroespecficos

Na piscicultura, dentre as metodologias de manipulao gentica a que mais

tem sido aplicada a hibridao, que pode envolver o cruzamento entre linhagens

da mesma espcie (intraespecfica) ou grupos geneticamente diferentes pelo

cruzamento entre espcies separadas (interespecfica). Esta tcnica de reproduo

visa alcanar caractersticas especficas desejveis ou melhoramento de uma forma

geral do desempenho no cultivo. Geralmente, resulta na produo de prole que

apresenta um desempenho melhor do que a mdia de ambas as espcies parentais,

conhecido como vigor hbrido ou heterose positiva (Bartley et al., 2001)

At recentemente, anlises citogenticas tm sido consideradas

principalmente como uma ferramenta para estudos evolutivos, sendo pouca

utilizada no manejo e monitoramento de estoques cultivados. Caso as anlises

convencionais no sejam suficientes para caracterizar um grupo ou indivduo sob

anlise, a identificao pode ser baseada em outros marcadores cromossmicos

estruturais derivados de deteco das regies organizadoras de nuclolo, bandas

de replicao pela incorporao da 5-bromodeoxiuridina (5-BrdU), colorao por

fluorocromos base-especficos e o mapeamento de sequncias especficas com o

uso da hibridao in situ fluorescente (FISH) (Ocalewicz et al., 2007; Porto-Foresti

et al., 2006).

Mtodos citogenticos apresentam vrias vantagens em relao a outros

marcadores genticos. Alm do baixo custo, constituem uma forma precisa de se

identificar desde nveis de ploidia, procedncia dos complementos

cromossmicos dos parentais nos produtos resultantes de hibridao

interespecfica (Toledo-Filho et al., 1994; Ocalewicz et al., 2007). Em alguns casos,

o nmero diplide e morfologia cromossmica so similares, como no caso dos

pacus e tambaquis e seus hbridos recprocos. Por outro lado, hbridos triploides

(3n) provenientes do cruzamento destas espcies so precisamente detectveis

entre os hbridos interespecficos gerados (Almeida-Toledo et al., 1987). Algumas

11

vezes as espcies parentais apresentam diferentes composies cariotpicas,

relacionadas diferenas no nmero diploide, frmula cariotpica e/ou nmero

fundamental, de tal maneira que, os produtos hbridos podem ser caracterizados

pela valor diploide intermedirio em relao aos parentais ou diferena

morfolgica de alguns cromossomos com qualquer das espcies parentais, como

em Colossoma macropomum e Mylossoma duriventris (Kossowski et al., 1983).

Quando hbridos e parentais apresentam o mesmo caritipo (similaridade

numrica e morfolgica), torna-se necessrio o emprego das metodologias de

bandamento cromossmico para identificao de pares marcadores espcie-

especficas. O padro heterocromtico dos cromossomos permite a precisa

identificao dos parentais e dos hbridos obtidos dos cruzamentos entre o pacu

(Piaractus mesopotamicus) e o tambaqui (Colossoma macropomum) (Almeida-

Toledo et al., 1987). Resultados prticos similares para identificao de hbridos

em peixes tem sido obtidos para diferentes espcies de valor econmico, como em

Cipriniformes carpas (Almeida-Toledo et al., 1995) e Salmoniformes cultivados

(Kendal et al., 2009 ).

De fato, a manipulao gentica que consiste na juno de genomas

evolutivamente diferenciados atravs da hibridao interespecfica induzida de

grande empregabilidade prtica, os resultados obtidos atravs desta tcnica

precisam, entretanto, ser parcimoniosamente interpretados, devido s questes de

segurana ambiental, pelo risco de introgresso de genes exgenos em populaes

naturais e quanto heterogeneidade dos produtos hbridos (Ryman & Utter, 1987;

Toledo-Filho et al., 1988). A caracterizao citogentica dos parentais e a

identificao gentica de estoques hbridos um procedimento bastante

recomendvel para as estaes de piscicultura que utilizam essas tcnicas no

melhoramento animal. Apesar dos riscos biosegurana ambiental os resultados

esperados atravs das hibridao, reforam sua utilizao em algumas condies

diante da possibilidade de manejo adequado a uma menor explorao dos

estoques naturais, ou prticas favorveis dos estoques cultivados, produo de

indivduos com caractersticas qualitativas diferenciadas ao consumo alimentar,

pesca esportiva e produo de peixes ornamentais.

Manipulao cromossmica em peixes marinhos Casos e perspectivas

12

O conhecimento prvio dos padres cromossmicos de uma espcie

cultivvel abre perspectivas para a implementao e monitoramento de tcnicas

voltadas produo de peixes. Entre as possibilidades se destaca a manipulao

cromossmica. Metodologias deste tipo vm sendo empregadas com sucesso em

diversas espcies de peixes de grande valor econmico (Beardmore et al., 2001;

Devlin et al., 2002; Zang et al., 2004). A manipulao cromossmica se d pela

interferncia fsica ou funcional nos cromossomos, durante o ciclo celular, por

agentes fsicos ou qumicos. Dois objetivos bsicos tm estimulado pesquisas nesta

rea, o primeiro consiste na manipulao de lotes completos de cromossomos de

uma espcie, conhecido como poliploidizao, o segundo a obteno de

indivduos com genoma de apenas um dos parentais, processos conhecidos como

ginognese (genoma materno preservado) ou andrognese (genoma paterno

preservado).

Poliplides podem ser definidos como organismos com um ou mais

conjuntos de cromossomos adicionais com relao ao nmero mais

freqentemente encontrados na natureza para uma determinada espcie.

Poliploidia tem sido envolvido na especiao de animais e principalmente em

plantas (Mable, 2004; Hegarty & Hiscock, 2007). Nos peixes este mecanismo

parece ter surgido extensivamente, de forma independente, vrias vezes durante a

sua evoluo, com maior incidncia nos grupos mais primitivos (Legatt & Iwama,

2003). Peixes poliplides induzidos artificialmente vm sendo usados na

aquicultura para alcanar esterilidade ou aumento de produo (Donaldson &

Devlin, 1996).

Interaes genticas e epigenticas entre genes redundantes em peixes

poliplides (Comai, 2005), provavelmente influenciaram o destino da sua

evoluo, levando extensa diversidade biolgica atual (Le Comber & Smith,

2004). A poliploidia est relacionada a evoluo de diversos grupos de espcies,

como alguns ciprindeos e cobitdeos (Ueda & Ojima, 1978; Luskov et al., 2002;

Vasil'ev et al., 2003; Juchno & Boro, 2006), bem como alguns outros importantes

na aquicultura como os esturjes e salmondeos (Allendorf & Thorgaard, 1984).

13

Processos de poliploidizao espontnea, a partir de alteraes meiticas

ou mitticas, tm sido observados em vrias ordens filogeneticamente distantes

(Schulz, 1967; Thorgaard & Gall, 1979).

O conhecimento do caritipo de vrias espcies de interesse comercial,

possibilitou o monitoramento da manipulao de conjuntos cromossmicos

durante a induo de alguns processos, como a poliploidizao, ginognese e

andrognese. Em peixes essa manipulao compreende, basicamente, a adio ou a

subtrao de um conjunto completo haplide ou diplide, na meiose ou mitose,

respectivamente. Este grupo de organismos oferece vantagens tcnicas em relao

aos vertebrados superiores, entre elas, a fecundao externa, prolificidade e

diferenciao sexual controlvel.

A poliploidizao consiste na produo de indivduos com nmero igual ou

superior a trs conjuntos cromossmicos haplides completos.

Experimentalmente em peixes podem ser produzidos indivduos com diferentes

nveis de ploidia. Poliploides so encontrados espontaneamente em populaes

selvagens (Molina et al., 2007). Com indutores apropriados podem ser facilmente

obtidos em muitas espcies comercialmente importantes de peixes (Piferrer et al.,

2009).

Os trabalhos de induo poliploidia esto direcionados para a obteno

principalmente de indivduos triplides que frequentemente apresentam alto grau

de esterilidade reprodutiva. Esta condio atribuda presena do terceiro

conjunto de cromossomos, que provoca a interrupo na meiose I na

gametognese, resultando em diferentes nveis de supresso do desenvolvimento

gonadal, que neste caso vai depender da espcie e do sexo (Wang et al., 2002; Nam

& Kim, 2004; Francescon et al., 2004). A incapacidade de reproduzir triplides tem

sido considerada uma alternativa para as espcies em que a reproduo deve ser

controlada, como nos casos de introduo de espcies exticas nos ambientes

naturais ou com risco de contato com ecossistemas no nativos e em peixes

transgnicos (Hindar et al., 1991a,b; Youngson et al., 2001).

Em salmondeos, o efeito da esterilidade desejvel por evitar a degradao

fsica e susceptibilidade s doenas relacionadas com a maturao sexual. Desta

forma, possvel a continuidade do crescimento durante o perodo reprodutivo, j

que a energia para o metabolismo reprodutivo ser canalizada para o crescimento

14

corpreo. Alm disso, a maturao sexual muitas vezes associado com maior

incidncia de doenas, ou alteraes nas propriedades organolpticas das partes

comestveis, como no caso de muitos salmondeos. Estes problemas tem sido

evitados atravs da induo a poliploidia, particularmente a triploidia (Piferrer et

al., 2009).

Todas as estratgias utilizadas na obteno da poliploidia artificial

envolvem a interferncia na diviso celular durante a meiose ou mitose. A

produo de indivduos triploides, por exemplo, tem sido alcanada atravs de

duas estratgias. A primeira consiste na induo da triploidia diretamente nos

ovos, por tratamento fsico ou qumico, administrado logo aps a fertilizao. O

segundo caminho atravs da obteno de reprodutores tetraplides e posterior

cruzamento com indivduos diplides. Em peixes, esta via pouco recomendada,

pois a sobrevivncia dos indivduos tetraploides bastante reduzida. Comentrios

adicionais e aplicaes a triploidia podem ser encontrados em alguns trabalhos

clssicos como os de Arai (2001), Felip et al. (2001), Hulata (2001), Tiwary et al.

(2004) e Maxime (2008), dentre outros.

Outro objetivo relacionado com a manipulao cromossmica a produo

de linhagens monosexo, obtido atravs de ginognese e andrognese.

Diferentemente da poliploidia, h modos de perpetuao clonal do genoma de um

dos parentais em peixes, tais como a ginognese. Esta condio rara na natureza

e requer gametas de outro indivduo para estimular o processo (Schultz, 1980).

Um exemplo bem estudado de ginognese em meio natural com a espcie

Poecilia formosa (Schartl et al., 1995), Carassius auratus gibelio (Cherfas, 1981;

Yamashita et al., 1993) e Oreochromis niloticus (Carrasco et al., 1999).

A ginognese e andrognese artificial consistem na produo de indivduos

com apenas a informao gentica materna ou paterna, respectivamente. Na

ginognese o ovcito fertilizado por um espermatozide que foi geneticamente

inativado por radiao. Na andrognese o ovcito irradiado e fertilizado com

espermatozide normal. Em ambos os casos a diploidizao pode ser obtida

impedindo-se a 1a diviso mittica. Algumas espcies comerciais tm tido bastante

sucesso na produo de indivduos ginogenticos como, por exemplo, na carpa

comum, Cyprinus carpio (Komen et al., 1991).

15

Citogentica e genmica de peixes uma interface

O mapeamento de genomas tornou-se uma ferramenta poderosa para

diversos campos de interesse das pesquisas biolgicas, entre eles aqueles voltados

para