(polymerase chain reaction – reakcija lančane polimerizacije)

Osnovni principi:Fenomeni “ topljenja ”

(denaturacije) DNKRaskidanje vodoničnih veza i

prelazak sekundarne u primarnu strukturu na tački topljenjaSniženjem temperature dolazi do ponovnog uspostavljanja vodoničnih veza izmedju parova baza

Komplementarnost azotnih baza

Koraci tokom analize:1.Ekstrakcija i prečišćavanje DNK iz ćelije2.Testiriranje čistoće izolovane DNK3.PCR reakcija4.Utvrdjivanje broja i veličine dobijenih fragmenata

Ekstrakcija DNKZavisno od vrste organizma i lokalizacije u okviru istog4 principijelna koraka:1. liziranje ćelije (mehanički,enzimski, ultrazvukom, ..) i oslobadjanje ćelijskog sadržaja2. Uklanjanje membranskih lipida (primena

pufera sa dodatkom detergenata)3.Otklanjanje proteina ( dejstvom proteinaza, uz

dodatak helirajućih agenasa)4. precipitacija DNK (najčešće nekim alkoholom)

Medjutim,...Danas se sve češće koriste

kitovi koji sadrže tzv. spin kolone i već pripremljene pufere za ekstrakciju

Spin kolone napunjene su modifikovanim silika gelovima i funkcionišu po principu apsorpcione i jonoizmenjivačke hromatografije

Čistoća izolovane DNK utvrdjuje se spektrofotometrijski-

odnos A260/A280 treba da bude izmedju 1,7 i 1,9

Kvantifikacija izolovane DNK- na osnovu merenja apsorbance referentnog rastvora i uzorka na 260 nm

Princip PCR metode:Za PCR reakciju neophodno je: prajmeri specifični

za krajeve željene sekvence, matrica, komplementarni nukleotidi, Taq polimeraza, ligaza, pufer (pH 8,3-8,8), MgCl2

Koraci:1.Denaturacija DNK (96° C)2.“Anniling” (hibridizacija prajmera i matrice) (55°

C)3. Elongacija (72° C) Prajmeri: 15-30 nukleotida Broj ciklusa: 25-40Eksponencijalno umnožavanje target sekvence

Aparatura

Utvrdjivanje veličine dobijenih produkata:Agarozna elektoforeza

Primena molekulskih markeraBojenje etidijum bromidom-

interkalacija u dvostruku spiralu DNK (π-π interakcije)

Pod UV svetlošću-mesta na kojima se EtBr vezao za molekul DNK, uočavaju se kao obojene trake na neobojenoj pozadini