Upload
phamhanh
View
225
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
PELACAKAN AKTIVITAS ANTIKANKER TERHADAP TIGA SENYAWA SANTON TERPRENILASI DARI SPESIES GARCINIA
Oleh:
Dwi Oktaviani Jamil
(1406 100 062)
Dosen Pembimbing:
Prof.Dr.Taslim Ersam,MS.
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
ITS Surabaya 2010PAKTI
LATAR BELAKANG
PAKTI
KANKER
Sel kanker
Sel kanker
Pengobatan
Kemoterapi
Bahan bioaktif sintetis
Bahan bioaktif dari Isolasi Bahan Alam
TUMBUHAN
Hutan Tropika Indonesia
Senyawa Metabolit Sekunder
SantonANTIKANKER
Garcinia sp.
O
O
B A
•
PERMASALAHAN
TUJUAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas senyawa-senyawa santon terprenilasi yang diisolasi dari spesies Garcinia sebagai antikanker baru.
Santon Terprenilasi
ANTIKANKER
PAKTI
?
METODOLOGI
PAKTI
Alat:bak pemeliharaan hewan coba, gavage, seperangkat alat bedah, seperangkat alat gelas (labutakar, pipet tetes, mikro pipet, gelas ukur, gelas beaker, gelas arloji, tabung reaksi, corong gelas),mortar, mikropipet, rak tabung reaksi, penangas air, stirrer, botol semprot, waterbath, tabungmikro (Ependorf), lemari pendingin, digital pH meter (Inolab-WTW), neraca analitik (Sartoriusbasic P-160), tabung sentrifugasi, alat sentrifugasi (Denley tipe BR 401), inkubator (memmert),spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), mikroskop cahaya (Nicon), hot plate, dan autoklaf(Gnatus).
Bahan:Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah senyawa terapi (1), senyawa terapi (2),senyawa terapi (3), tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar, PBS (Phospat BufferSaline), balok es, NaCl 0,9%, larutan stok MDA (malondialdehid), aquades, TCA 5%, HCl 1N, Na-tiobarbiturat, benzopiren, formaldehid 10%, etanol (80%, 90%, 95%, dan absolut), larutan xilol,parafin cair, antibodi primer anti-Rat-PCNA, p53 wild-type, dan Ras, antibodi sekunder Anti-Rabbit IgG Biotin labeled, kromogen DAB (diamino benzidine), H2O2, serum 2% BSA, pelarut SA-HRP (Strep Avidin-Horseradish Peroxidase), dan aquades steril.
METODOLOGI
Isolasi Senyawa*
-dikeringkan
-ekstraksi
-fraksinasi
-pemisahan/Pemurniaan
-penentuan struktur
*telah dilakukan pada penelitian sebelumnya
G. Tetranda & G. dulcis
Santon terprenilasi
PAKTI
Dibedah dan diambil organ paru
Dikonfirmasi jumlah radikal bebas (MDA)
Ekspresi PCNA, Ras, dan p53
-diadaptasi selama 7 hari-dikelompokkan menjadi 5 kelompok
Uji In vivoTikus Wistar
(berat badan 200-250 g)
K0 K2 K3 K4 K1
-Diinjeksi 4x (berselang sehari) secara intraperitorial dengan larutan benzopirendosis 200mg/kg BB) dan diinkubasi selama 30 hari
Kelompok tikus kanker B
Kelompok tikus kanker C
Kelompok tikus kanker D
Kelompok tikus kanker A
-Diobati 7x dengan senyawa (1)(dosis 100mg/kgBB)-Diinkubasi 7
hari.
-Diobati 7x dengan senyawa (2)(dosis 100mg/kgBB)-Diinkubasi 7 hari.
-Diobati 7x dengan senyawa (3)(dosis 100mg/kgBB)- Diinkubasi 7 hari.
PAKTI
- diperfusi dengan PBS pH 7,4- diambil, dipotong kecil-kecil, direndam dalam PBS pH 7,4- ditimbang 0,45 g- digerus dalam mortal yang diletakkan diatas balok es
1. Uji Malon dialdehida (MDA)a. Pembuatan homogenate paru
Tikus
- dibedah, diambil parunya
Paru
Homogenat
- ditambah 0,5 mL 0,9% NaCl dingin- dimasukkan dalam ependorf 1,5 mL- disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 20 menit
Supernatan
Uji MDA
PAKTI
- diinkubasi pada water bath 100oC selama 30 menit- dibiarkan dalam suhu ruangan- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (maks = 533 nm)
- dimasukkan dalam tabung reaksi kecil- ditambah 550 L aquades-ditambah 100 L 20% TCA- dihomogenkan ditambah 250 L HCl 1N- dihomogenkan- ditambah 100 L 1% Na-tiobarbiturat- dihomogenkan- disentrifugasi 500 rpm selama 10 menit
b. Pembuatan kurva standar MDA
100 L larutan stok MDA dengankonsentrasi 0,1,2,3,4,5,6,7, dan 8 g/mL
Supernatan
Absorbansi larutan standart + kurva standart MDA
PAKTI
- diinkubasi pada water bath 100oC selama 30 menit- dibiarkan dalam suhu ruangan- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (maks = 533 nm)
- dimasukkan dalam tabung reaksi kecil- ditambah 550 L aquades-ditambah 100 L 20% TCA- dihomogenkan ditambah 250 L HCl 1N- dihomogenkan- ditambah 100 L 1% Na-tiobarbiturat- dihomogenkan- disentrifugasi 500 rpm selama 10 menit
c. Preparasi sampel untuk pengukuran MDA
100 L supernatan paru
Supernatan
Absorbansi Sampel
PAKTI
-dimasukkan dalam larutan silol selama 20 menit, sebanyak 2 kali pada suhu ruang
-dimasukkan dalam larutan silol selama 30 menit pada suhu 60-63°C-dicelupkan dalam parafin cair-embedding blok parafin-didinginkan pada suhu 4°C
-diambil dan direndam dalam etanol 70% selama 24 jam-dimasukkan dalam etanol 80% selama 2 jam-dimasukkan dalam etanol 90% selama 20 menit-dimasukkan dalam etanol 95% selama 20 menit-dimasukkan dalam etanol absolut selama 20 menit dan diulangi sebanyak 3 kali
2.Pembuatan Gambaran Histologi Parua.Embedding Paru
Paru dalam formaldehid 10%
Paru hasil dehidrasi dengan etanol
Paru dalam blok parafin
PAKTI
- diiris dengan ukuran 5 μm-didinginkan pada suhu ruang (dimasukkan air) -dimasukkan dalam air hangat dengan suhu 38-40°C-diambil dengan objek glass-dikeringkan di atas hot plate dengan suhu 38-40°C sampai kering-diinkubasi pada suhu 38-40°C selama 24 jam
b. Pembuatan Preparat Paru
Paru dalam blok parafin
Preparat paru disimpan pada suhu ruang
PAKTI
-dicelupkan dalam larutan silol 2x5 menit-dicelupkan dalam etanol bertingkat dimulai dari absolut, 95%, 90%, 80% dan 70% masing-masing 5 menit.-dicuci dengan aquades-dicuci dengan PBS pH 7,4-diaplikasi dengan 3% H2O2 selama 10 menit- dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-dibloking menggunakan serum 2% BSA selama 60 menit-diinkubasi dengan antibodi primer anti-Rat-p53; anti-Rat-PCNA; dan Ras semalam pada 4°C-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-ditetesi dengan antibodi sekunder berlabel biotin-diinkubasi selama 1 jam-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-ditambah dengan SA-HRP selama 40 menit-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-ditambah kromogen DAB -dibilas dengan aquades-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-dilakukan counterstaining dengan Mayer hematoxilen selama 10 menit-dicuci dengan air kran-dikering anginkan-diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x
c. Imunohistokimia Preparat Paru
Preparat paru
Aktivitas proliferasi sel ( skor p53; PCNA; dan Ras)
PAKTI
Hasil dan Pembahasan Senyawa santon terprenilsai diisolasi dari dua tumbuhan Garcinia, yaitu G.
tetranda dan G.dulcis.
Tiga senyawa santon terprenilasi terbagi menjadi 3 golongan yaitu:
santon monoprenilasi, santon diprenilasi, dan santon triprenilasi.
PAKTI
1,3,6-trihidroksi-7-metoksi-8-(prenil)-4-(geranil) santon (3)
Struktur tiga senyawa santon terprenilasi
O
OH OH
OH
HO
O
HO OH
OHO
O
MeO
1,4,5,7-tetrahidroksi-2(1,1 dimetil alil) santon (1)
α-mangostin (2)
OHHO O
OHO
MeO
PAKTI
Hewan uji diinjeksi dengan senyawa terapi, kemudian dibedah
dan diambill organ parunya.
PAKTI
Persiapan Hewan Uji
Gambar.1 Proses Pembedahan Hewan Coba
Uji MDA (malondialdehid) MDA dihasilkan akibat adanya stress oksidatif sel. Stress oksidasi sel sendiri
merupakan ketidak seimbangan antara antioksidan dengan radikal bebas yang ada dalam tubuh.
Pengukuran kadar MDA pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan modifikasi metode tes thiobarbituric acid (TBA) yang dikembangkan oleh Alvarez dan Storey (1995).
hv+ H
PAKTI
Gambar.2 Reaksi Pembentukan Radikal benzopiren
Kromogen MDA-TBA
Pengukuran MDA dilakukan dengan mengukur absorbansi supernatan paru menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ= 533 nm
PAKTI
Gambar.3 Reaksi Pembentukan Kromogen MDA-TBA (merah muda)
konsentrasi
MDA
(µ g/mL) Absorbansi
0 0
1 0.168
2 0.224
3 0.278
4 0.382
5 0.445
6 0.533
7 0.642
8 0.711
Gambar. 4 Kurva Standar MDA
y = 0.084x + 0.039R² = 0.992
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 2 4 6 8 10
ab
sorb
an
si
konsentrasi (μg/mL)
Tabel.1 Data Absorbansi MDA Kurva standar
PAKTI
Pada penelitian ini digunakan kurva standar MDA untuk mengukur konsentrasi MDA pada hewan uji.
Tabel .2 Data absorbansi MDA hewan uji yang telah diobati dengan senyawa terapi
Kode
Kelompok
Kode
Senyawa
Terapi
Absorbansi [MDA]Rerata
[MDA]1 2 3 1 2 3
Biru 1 10,27 0,3 0,3 2,75 2,51 2,75 2,67
merah 1 10,27 0,3 0,3 2,75 2,87 2,99 2,87
merah biru 1 10,29 0,3 0,3 2,99 2,63 2,75 2,79
Biru 2 20,38 0,4 0,4 4,06 3,70 3,94 3,90
merah 2 20,36 0,4 0,4 3,82 3,82 3,70 3,78
merah biru 2 20,35 0,4 0,4 3,70 3,94 4,06 3,90
Biru 3 30,41 0,4 0,4 4,42 4,77 4,54 4,58
merah 3 30,45 0,5 0,5 4,89 5,25 5,01 5,05
merah biru 3 30,45 0,5 0,4 4,89 5,01 4,77 4,89
Kontrol negatif0,2 0,2 0,2 1,92 2,04 2,27 2,08
Kontrol positif0,52 0,5 0,6 5,73 5,85 6,20 5,92
Keterangan
Kontrol negatif : Tikus sehat
Kontrol positif : Tikus sakit
Uji MDA (malondialdehid)
2,78
3,86
4,84
PAKTI
Paru Tikus Sehat dan Sakit
Histologi paru tikus sehat dan tikus sakit (kanker).
Gambar .5 Histologi paru (a) tikus sehat dan (b) tikus sakit
(a) (b)
Sel terlihat kompakSel terlihat banyak
kerusakan
PAKTI
diamati menggunakan mikroskop cahayap53, PCNA, dan Ras
Imunohistokimia
aktivitas prolifersi akan ditunjukkan oleh inti yang berwarna kecoklatan.
PAKTI
Histologi paru yang mengekspresikan p53
(3)(2)(1)
(tikus sehat)(tikus sakit)
Gambar.6 histologi paru yang mengekspresikan p53
PAKTI
Histologi paru yang mengekspresikan PCNA
(tikus sakit) (tikus sehat)
(1) (2) (3)
Gambar.7 histologi paru yang mengekspresikan PCNA
PAKTI
Histologi paru yang mengekspresikan Ras
(tikus sakit) (tikus sehat)
(1) (2) (3)
Gambar.8 histologi paru yang mengekspresikan Ras
PAKTI
Imunohistokimia
Gambar.9 Data p53, PCNA, dan Ras untuk masing-masing senyawa terapi, kontrol negatif dan kontrol positif
PAKTI
Mekanisme Antikanker
B-X
B DNA B-DNA
X
X-B-DNA
B-X + DNA
Gamabr.10 Skema interaksi obat dan penyakit. Keterangan
X: santon; B: benzopiren; DNA: DNA di dalam tubuh
PAKTI
1
2
(kanker)
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian terhadap tiga senyawa santonterprenilasi yang berasal dari dua spesies Garciniamenunjukkan bahwa ketiga senyawa yang telah diuji kadarMDA dan ekspresi p53, PCNA, dan Ras poten sebagaiantikanker, dimana senyawa (1) lebih aktif dibandingkansenyawa lainnya. Hal ini ditunjukkan oleh nilai MDA senyawa(1) yang hampir sama dengan kontrol negatif dan data ekspresip53 menunjukkan nilai tertinggi pada uji imunohistokimia.
PAKTI
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk sifat toksisitas
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai hubunganstruktur dan aktivitas senyawa.
PAKTI
Ucapan Terimakasih
• Hibah Program Penelitian Guru Besar LPPM-ITS
• Lab. Kimia Organik ITS dan Lab. Biokimia Universitas Brawijaya
Malang
• Kelompok PAKTI
• Seluruh pihak yang berperan demi kelancaran seminar ini.
PAKTI