PENGARUH PENINGKATAN LIPOFILISITASPADA SENYAWA ANALOG UK-3A DALAM MENGHAMBAT

PERTUMBUHAN SEL KANKER P-388

Hanafi, M., Y. Anita, AMJ. Putra, A. Darmawan, N. Artanti, Linar Z. UdinPusat Penelitian Kimia - L1PI, Kawasan Puspiptek, Kabupaten Tangerang 15314·

hanafi124@yahoo,com, myname yulja@yahoo.com

INTISARI

UK-3A adalah Antibiotika UK-3Amempunyai struktur dilakton cincin sembilan,diisolasi sebagai minor komponen dariStreptomyces sp. 517-02. Antibiotika tersebutmempunyai potensi dalam menghambatpertumbuhan sel kanker leukemia P388 dan KBdengan nilai rc, 38 dan 20 mg/mL. Untukmelihat kenaikan efek lipofilitas dari aktivitas antikanker dari senyawa analog UK-3A,berdasarkanpada parameter hubungan struktur dan aktivitas(QSAR)dan nilai energy binding dengan proteinBeL-xL. Senyawa-senyawa analog UK-3A, 3-hydroxypicolinyl serin metil ester disintesis dariasam 3-hidroksipikolinat dan L-serin metil esterkemudian senyawa tersebut diesterifikasiterhadap 3-hydroxypicolinyl serine methyl ester(A) dengan asam pentanoat(l), hexanoat(2),heptanoat(3), dan oktanoat (4). Senyawa-senyawatersebut diidentifikasi dengan menggunakanspektoophotometer IH and 13CFT -NMR,FTIR danMS. Hasil uji aktivitas menunjukkan bahwasenyawa 3-hidroksipikolinil serin oktil metil ester(PSMOE) menunjukkan peningkatan aktivitasyang spesifik dalam menghambat pertumbuhansel kanker leukemia P388 dengan nilai ICso 15,4mg/rnl.,

Kata kunci :Anti kanker, Streptomyses sp 517-02, UK-3A,Analog UK-3A, danP388

26

ABSTRACT

Antibiotic UK-3A contains a 9-membereddilactone ring. It had been isolated as a minorcomponent from the mycelium of 5 trepyomyces sp. 517-01.The antibiotic was hypothesized to be potential toinhibit the growth of leukemia cancer cell line of P388and KB with ICso 38 and 20 Dg/mL, respectively. Tounderstand the effect of lipophilicity increase of theanalogues on their anticancer activities based on QSARparameter (Log P) and binding energy to BcL-xLprotein. To produce analogues of UK-3A, 3-hydroxypicolinyl serine methyl ester (A) wassynthesized from 3-hydroxypicolinic acid and L-serinemethyl ester. The product was then esterified bypentanoic (1), hexanoic (2), heptanoic (3), and octanoic(4). The final products were confirmed with IHand 13CFT-NMR and FTIR spectra, and alsoMS spectra. Thenthey were tested against P388 Murine Leukemia cells.The result of bioassay showed lipophilicity increase of3-hydroxypicolinyl serine methyl octhyl ester (PSMOE)correlated positively with their anticancer activityincrease, withICso 15.4mg/mL against P388 cell lines.

Keywords: Anticancer, Streptomyces sp 517-02, UK-3A,Analog UK-3A andP388

PENDAHULUAN

Senyawa antibiotika UK-3A merupakansenyawa dilakton cincin sembilan telah diisolasidari micelium Streptomyces sp.517-02, yangmempunyai aktivitas dalam menghambatpertumbuhan antikanker antara lain terhadapselleukemia P388 dan KB, masing-masing

JKTI, VOL. .11, No.1, Juni, 2009

mempunyai nilai ICso sebesar 38 dim 20 mg}mLsecara in-vitro. Antibiotika UK-3A sebagaidilakton cincin ssembilan apabila dihidrolisismenghasilkan senyawa 3-hidroksipikolinil serinmetil ester (A) dan ester lakton cincin 5 (B)(Gambar 1)mengakibatkan aktivitasnya menurun(tidak aktif) dalam menghambat sel kanker P388·

KB invitr 1-5maupun secaramVI o.

R~~)::::o

UK-2A: R = -OMeUK-3A: R = -OB

Gambar 1. Struktur Molekul UK-2A,UK-3: AdanB

1

1

Kematian sel ini diatur oleh suatu seriprotein yang disebut protein pro-apoptosie'. Didalam sel juga terdapat protein-protein anti-apoptosis yang dapat menghambat terjadinyaapoptosis dengan mempengaruhi kerja protein-protein pro-apoptosis (Gambar 2). Dalam selnormal jumlah protein ini adalah proposionaldengan protein pro-apoptosis, sehingga prosesapoptosis dapat terjadi secara periodik. Tetapipada beberapa sel kanker, protein anti-apoptosisini terekspresi dengan jumlah yang sangat banyak,sehingga sel terus membelah secara tidakterkontrol dan menjadi sel kanker'. Bcl-xl, adalah

JKTI, VOL. 11, No.1, Juni, 2009

salah satu dari protein anti-apoptosis pada selkanker payudara. Diperkirakan jika protein inidapat dihambat, sel kanker akan kembalimengikuti mekanisme apoptosis. Mendisaininhibitor Bcl-xl, adalah dasar dari penemuan obatantikanker payudara yang spesifik'?',

Bcl-2. Bel-xL Sax, Bad, Bak.Mel-I, and.Bfl-IIAl Bcl-xs, and.Nip3

•I9

Gambar 2. Protein Bcl-xl, (kiri) menghambat kerjaprotein pro-apoptosis (kanan)

Sfntesis senyawa analog UK-3A dilakukandengan modifikasi berdasarkan hubunganstruktur kimia dan aktivitas biologi (QSAR),makauntuk mensintesis senyawa analog dari UK-3Adapat dilakukan dengan memvariasikan gugus-gugus lebih bersifat non polar tanpamenghilangkan gugus aktifnya, diharapkandapat menembus membran sel kanker yangbersifat hidrofobik. Dengan meningkatkan sifatlipofilisitas juga berdasarkan parameterhubungan struktur dan aktivitas (QSAR) danenergy docking dengan protein Bcl.xL.12-17

Berdasarkan parameter tersebut, senyawa sintetikbaru tersebut merupakan analog dari senyawainduknya diharapkan mempunyai aktivitasbiologi yang sama atau lebih besar, sehinggaberpotensial sebagai calon obat anti kanker.

Untuk meningkatkan aktivitas senyawa A,maka dilakukan esterifikasi dengan beberapaasam gun a meningkatkan lipofilisitasnyasehingga diharapkan dapat dengan mudahmenembus dinding sel. Bila senyawa A

27

diesterifikasi dengan beberapa }enis asam yaitupentanoat - oktanoat (1 - 4), temyata clidugasenyawa 4 menunjukkan aktivitas berdasarkandata QSAR.

Berdasarkan hasil tersebut maka padamakalah ini akan dilaporkan sintesis senyawa 4,identifikasi dan aktivitas nya dalam menghambatpertumbuhal sel kanker leukemia P388.

BAHAN DAN METODA

Alat:Alat instrumentasi berupa, LC-MS (Mariner

Biospectrometri), NMR (500 MHz, Jeol). TLCmenggunakan plate Silika gel (E.Merck, Kieselgel60 F2S4I 0.25 mm) dan kolom kromatografi, alatgelas sebelum digunakan dikeringkan dalam oven(70 "C), Semua reaksi dilakukan dibawah konclisigas Nitrogen dengan cara mengisi balon dengangas N,

Bahan:L-serin metil ester, asam 3-hidroksipikolinat,

asam oktanoat, disikloheksilkarbodiimida (Dcqdan dimetilaminopiridin (DMAP), piridin, CD031

kloroform, heksana, etil asetat, dan silka gel,sebagai fasa diam untuk pemurnian secara kolomkromatografi.

Metoda:Terdapat 2 tahap sintesis analog UK-3A :

Pertama: Reaksi amidasi (senyawa A)Kedua : Reaksi esterifikasi senyawa A denganberbagai asam karboksilat seperti asam pentanoat(1),heksanoat (2),heptanoat (3),dan oktanoat (4)

W'J::" .::~c;\~OH 0 0 OCi1l OH 0 O~OCi1l

Asaro 3-hydroxypikolinat L-Scrin metil ester-HeI PikoliDil serin motil ester (A)

28

. II( ·DCCIDMAPCHCh • RoT. 4h

Produk esterifikasi (analog-analog UK-3A)R;(l)CA (pSMPE)

(2) C;Hl1(PSMHE)(3) G;li13 (pSMHpE)(4) C1115(PSMOE)

Gambar 2. Sintesis Senyawa Analog-analog UK-3A(Senyawa1-4)

Uji aktivitas antikanker secara in vitro"Sel kanker Murine leukemia P-388 dengan

pertumbuhan pada fase logaritma, dilarutkandalam tabung kultur dengan jurnlah sel sekitar 3103 sel /rnl, dalam media RPMI 1640. Seldiinokulasikan dalam microplate 96 lubang dasarrata, dikultivasi dalam inkubator CO2 selama 24jam untukmenumbuhkan sel.

Hari kedua dilakukan penambahan sampelyang dilarutkan dalam pelarut DMSO.Pengenceran sampel dilakukan denganmenambahkan larutan bufer fosfat (PBS) pH(7,30-7,65). Sampel dengan konsentrasi yangberagam ditambahkan ke dalam sel dalammicroplate lalu kocok dengan microplate mixerdan simpan kembali dalam inkubator Co2, Sebagaikontrol negatif cligunakan DMSO dan kontrolpositif cligunakan senyawa standar cis-platina. Seldiinkubasi selama 48jam, kemudian ditambahkanreagen MTI [3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida] dan dikocok menggunakanmicroplate mixer. Inkubasi clilanjutkan selama 4jam, kemudian ditambahkan stop solution (SDS)dan dikocok dengan baik tanpa meninggalkanbusa yang mengganggu dalam pengamatan.Inkubasi dilanjutkan kembali selama 24jam.

Pengukuran rapatan optis (OD) dilakukan24 jam setelah penambahan stop solution. Ujiaktivitas antikanker ini dilakukan dengan tiga kaliulangan."

JKTI, VOL. 11, No.1, Juni, 2009

HASIL DAN DISKUSI

Hasil Sintesis senyawa ASenyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester

(PSME) berupa kristal jarum berwarna putihdengan titikleleh 90-91°C,denganrendemen 68,42%. Untuk meningkatkan aktivitas senyawa A,maka dilakukan perancangan turunanmyadengan melakukan esterifikasi dengan beberapaasam karboksilat. Hasil identifikasidengan FT-NMR menunjukkan bahwa senyawa tersebuttelah terbentuk, dengan munculnya signal amidapedadaerahgeserankirniad-Bve (d).

Pada pendahuluan telah dijelaskan bahwabila UK-3A dihidrolisis dan menghasilkansenyawa A dan B, maka kedua senyawa tersebuttemyata tidak menunjukkan adanya aktivitasdalam menghambat pertumbuhan sel kankerkarena nilai ICso > 100 mg/rnl. Hal ini inimenunjukkan bahwa dilakton cincin sembilanmempunyai peranan penting dalam menghambatpertumbuhan sel kanker tersebut. Dengandemikian untuk meningkatkan aktivitasnya,maka senyawa A akan diesterifikasi denganbeberapa asam seperti asam pentanoat,heksanaoat, heptanoat dan oktanoat. Untuk itutelah dilakukan kajian parameter hubunganstruktur dan aktivitas (QSAR) menggunakansoftware hyperchem 7.0 dan Arguslab 4.0.Berdasarkan parameter QSAR tersebut (Tabel1),menmunjukkan bahwa senyawa 4 diduga palingaktif, dengan semakin besarnya nilai log P danluas permukaan. Disamping itu bila dilihat energiinteraksinya dengan protein Bcl.xL, makasenyawa tersebut mempunyai energi terkecil.Sebagai pembanding dilakukan uji uji poarameterQSAR dari obat komersial Taxol, Antimycin A3atau senyawa UK-3A sendiri. Berdasarkan hasiltersebut menduga bahwa senyawa 4 berpotensisebagai antikanker. Dengan demikian, makasenyawa 4disintesis dan diuji aktivitasnya.

JKTI, VOL. 11, No.1, Juni, 2009

('I~ 0nX:°~o 0

ambar 3. Struktur senyawa PSMOE (4)

Tabell. Hasil Perhitungan Parameter QSAR, UK-3AdanAnalognya

No Senyawa LogP Surface Area EdockingKcal/mol

Antimycin 1.30 648,45 -10,24

UK-3A 1.61 757,87 -11,65

Taxo! 2.25 819,35 -10,39

1 PSMPE 0.37 405,7 -9,70

2 PSMHE 0.76 530,0 -10,28

3 PSMHpE 1.16 567,17 -10,79

4 PSMOE 1.56 603,37 -11,93

Gambar 4. Virtual molecular docking senyawa 4dalam menginhibitor Bel-xL (Energi=-11.93kcal/mol)

Tabe12. Hasil Uji Sitotoksik terhadap Pertumbuhan SelKankerP388

No. Senyawa (IC5O J.lWmL) P388"

1 UK-3A 38,4

2 PSMOE 15,4

29

Berdasarkan Hasil uji aktivitas senyawaanalog-analog UK-3A, terbukti bahwa senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil oktil ester (PSMOE,4)dengan nilai rc., 15,4 gl mL (Table 2)menunjukkan kemampuannya dalammenghambat sel kanker P388. Hasil tersebut lebihbaik dari pada aktivitas senyawa UK-3A. Hal inidapat dinyatakan bahwa pembukaan cincindilakton dapat digantikan dengan memvariasikangugus ester yang bersifat non polar yaitu rantaipanjang seperti asam oktanoatyang sesuai dengansifat permeabilitas membran.

Untuk mensintesis senyawa 4, makasenyawa A diesterifikasi dengan asam oktanoatdengan adanya aktivator dan katalisator DCC danDMAP dalam pelarut CHCl3. Hasil esterifikasitersebut menghasilkan senyawa 4 denganrendemen 87,10 % (b/b), setelah melalui prosespemurnian menggunakan kromatografi kolom,dengan silica gel sebagi fasa diam dan fasa geraknya campuranheksana - etil asetat..

HasH identifikasi dengan FT-IRmenunjukkan vibrasi ulur gugus karbonil amidamaupun ester ditunjukkan oleh pita serapan padaV 1746 em? dan tekukan NH pada V 1653 em".Senyawa 4juga dianalisa oleh spektrummassanya

- -"'-~-~-' - ----

.................. '.' ' -:-:-:.;-:-:-:-:.:-:-:-:-:.:.:.;.;.; '.' :.;.;.:.;.;.:-:- .;.:-:-:-:-;.:-:.:.

berat molekul (Mj 365,93 g/mol. Senyawa 4 jugadibuktikan dengan spektrofotometer IH_NMRdan I3C_NMR(Gambar 5). Data dari spektrum IH_NMR daerah geseran kimia dH gugus amida(-CONH) ditunjukkan oleh puneak yang munculpada dH 8,65 (d) yang berinteraksi dengan gugusmetin dan muncul downfield karena membentukikatan hidrogen intermolekuler, gugus hidroksil(-OH) dH 11,67 (s) muncul downfield karenamembentuk ikatan hidrogen intramolekulerdengan gugus karbonil amida.

Data dari spektrum IC_NMRdaerah geserankimia gugus amida (-CONH) de 173,55.

Berdasarkan parameter hubungan strukturdan aktivitas (QSAR) dan melalui metode virtualmolecular docking senyawa 3-hidroksipikolinilserin metil oktil ester (PSMOE) dapat mengikat sisiaktif dari Bcl-xl, yang lebih stabil dari UK-3Asendiri."?' Hal ini berarti pembukaan cincindilakton analog UK-3A lebih baik dalammenginhibitor Bcl-xl, (protein anti-apoptosis). [ikaprotein ini dapat diinhibisi maka sel-sel kankeryang ada dapat mengikuti mekanisme apoptosisdengan baik, sehingga dapat mencegah terjadinyakanker.

~,,j,~ .•,J. "., .• 1 ]1,1. I ,,~•• ".Lil i

30 JKTI, VOL. 11, No.1, Juni, 2009

KESIMPULAN

Esterifikasi senyawa 3-hidroksipikolinatdengan asam oktanoat menghasilkan 3-Hidroksipokolinil serin metil oktil ester (4),dengan yang baik (87,10 %) Senyawa ini dapatmeningkatkan lipofilisitas sebagai penggantigugus dilakton cincin sembilan pada UK-3ADapat disimpulkan bahwa pembukaan cincindilakton UK-3A dengan rantai panjang dapatmenginhibitor aktivitas protein Bel-xL. Denganmendisain inhibitor Bel-xL (ligan) merupakanproses dasar pencarian obat anti-kanker yangefektif.

UCAP AN TERIMA KASIH

Terima kasih kepada LIPI, Japan Society forthe Promotion of Sciences aSPS), dan Osaka CityUniversity, yang telah mendukung pelaksanaanpenelitian ini.

DAFfAR PUSTAKA

1. Ueki, M.,Abe, M.Hanafi, K. Shibata, T. Tanaka,and M. Taniguchi. UK-2A, B, C and D, NovelAntifungal Antibiotics from Streptomyces sp.517-02. 1. Fermentation, Isolation, andBiological Properties. J. Antibtiocs, 49 (7), 639,1996.

2. Hanafi, M., K. Shibata, M. Ueki., and M.Taniguchi. UK-2A, B,C and D, novel antifungalantibiotics from Streptomyces sp. 517-02. II.Structural elucidation. J. Antibiotics, 49, 1226-1231,1996.

3. Ueki, M., A Kusumoto, M. Hanafi, K. Shibata &M. Taniguchi. UK-3A, a novel antifungalantibiotic from Streptomyces sp. 517-02,Fermentation, isolation, structurel elucidationand biological propewrties. J. Antibiotics, 50,551-555,1997

4, Anita, Y. et al., "Synthesis and cytotoxicityassay of analogues of UK-3A, a novelantifungi from Streptomyces sp. 517-02".Indonesian Journal Of Chemistry. Vol 7, No.2,

JKTI, VOL. 11, No.1, Juni, 2009

PPP 111-230,Yogyakarta, June 2007.5. Hanafi, M. Studies of Novel Antibiotic Metabolites

from Streptomyces sp. 517-02. Department ofChemistry, Faculty of Science, Osaka CityUniversity. Japan, 1995.

6. Simstein, R. et al. Apoptosis, chemoresistance,and breast cancer: insights from the MCF-7 cellmodel system. Experimental Biology andMedicine, 228, 995 -1003, 2003.

7. Ricci, M.S. et al. Chemotherapeutic approachesfor targeting cell death pathways. TheOncologist, 11,342 - 357,2006.

8. Ghobrial, I.M. et aI. Targeting apoptosispathways in cancer therapy. CA Cancer J. Clin.,55,178-194,2005.

9. Ferreira, CG. et aI. Apoptosis: target of cancertherapy. Clinical Cancer Research, 8, 2024-2034,2002.

10.Mohamed 1. Carcinoma of the Breast. In: SkeelR.T. (Ed.). Handbook of Cancer Chemotherapy (7thed.).Lippincott Williams &Wilkins, 2007.

1l.Putra, AM.J. et aI., 2007, "UK-2A anaIogues:potential inhibitors of Bel-xL" . ProsidingInternatioanl Conference on Chemical Sciences(ICCS 2007)Yogyakarta, May 24 - 26.

12.Enyedy, LJ. et al.,200l, "Discovery of small-molecule inhibitors of Bel-2 through structure-based computer screening". J. Med. Chem., 44,4313-4324.

13.Ferreira, CG. et al., 2002, "Apoptosis: target ofcancer therapy". Clinical Cancer Research, 8,2024-2034.

14.Ghobrial, LM. et aI., 2005, "Targeting apoptosispathways in cancer therapy" .CA CancerJ. Clin.,55,178-194.

15.http://en.wikipedia.org/wiki/Apoptosis, 2007.16.Shangary, S. et al., 2003, "Recent advances in

the development of anticancer agents targetingcell death inhibitors in the Bcl-2 protein family.Leukemia", 17, 1470 -1481.

17.Patrick, G., 2001, Instant notes in medicinalchemistry. BIOSScientific Publisher.

18.Sahidin; Hakim, E. H., .et al., 2006, "CytotoxicProperties of Oligostilbenoids from the Tree BarksofHopeaDryobalamides"., 60~,723.

31