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Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 1
Pflanzliche Symbiosen
Thomas Boller, Andres Wiemken und Vreni Wiemken
Herbstsemester 2009
Freitag, 14-18, alternierend mit"Geobotanik" (Christian Körner)
http://plantbiology.unibas.ch/teaching/teaching.htm
Gesamttitel
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 2
3. Bakterien als Pathogene
Titelblatt
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 3
Mutualistische Symbiose Bakterien-Pflanzen:Knöllchen-Symbiose der Leguminosen (Fabaceae)
Bilder aus dem WWW
Knöllchen-Symbiose
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 4
Antagonistische Symbiose Bakterien-Pflanzen:Agrobacterium tumefaciens (Erreger der Wurzelhalsgalle)
Bilder aus Schopfer und Brennicke, 1999
Agrobacterium (Schopfer)
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 5
Vielfalt der Bakterienkrankheiten
Vielfalt der Bakterienkrankheiten
Skript – p. 2
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 6
Pseudomonas phaseolicola
Pseudomonas phaseolicola auf Bohnen
Bild aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 7
Clavibacter michiganense
Clavibacter michiganense auf Tomaten
Bild aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 8
Xanthomonas campestris
Xanthomonas campestris auf Kohl
Bild aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 9
Xanthomonas vesicatoria
Xanthomonas vesicatoria auf Tomate
Bild aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 10
Titel Feuerbrand
Feuerbrand: eine gefährliche bakterielle Krankheit für Obstbäume
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 11
Feuerbrand: Erreger
Erwinia amylovora, ein Bakterium (von Bienen übertragen)
Feuerbrand 1
Skript p. 3; Bilder aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 12
Vermehrungszyklus des Feuerbrandes
Feuerbrand 1
Skript p. 3; Bilder aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 13
Feuerbrand 2
Feuerbrand: Symptome beim Apfel
Bilder aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 14
Feuerbrand Karte
Feuerbrand: Quarantäne-Massnahmen
Skript – p. 3
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 15
Feuerbrand: Befallskarte im Kanton Zürich im Jahr 2002
Feuerbrand Kt Zürich
Skript p. 3; Bild aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 16
Cotoneaster Friedhof
Cotoneaster, eine wichtige Wirtspflanze für Feuerbrand
Bild aus der Berner Zeitung
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 17
Cotoneaster befallene Pflanze
Cotoneaster, eine wichtige Wirtspflanze für Feuerbrand
Bild aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 18
Massnahmen gegen Feuerbrand
"Beliebte Pflanze macht Ärger"
Cotoneaster z.B. in Friedhöfen, Gärten, Anlagen
Seit 1. Januar 2003 ist das In-Verkehr-Bringen und Vermehren sämtlicher Cotoneaster Arten
in der ganzen Schweiz verboten!
Feuerbrand-Bekämpfung: Entfernung von Cotoneaster
Bild aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 19
Titel Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens und "Genetic engineering" in der Natur
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 20
Antagonistische Symbiose Bakterien-Pflanzen:Agrobacterium tumefaciens (Erreger der Wurzelhalsgalle)
Agrobacterium (Schopfer)
Skript p. 4
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 21
Agrobacterium und "genetic engineering" in der Natur
Agrobacterium Transformation
T-DNA: in Bakteriumnicht "exprimiert"
T-DNA: in Pflanze"exprimiert"
T-DNA - Transfer
Wundsignal
Induktion desDNA-Transfers
Skript p. 4
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 22
Agrobacterium: das Ti-Plasmid
Agrobacterium: Ti-Plasmid
Tumor-Gene 1,2:Auxin-Synthese
Tumor-Gen 3:Cytokinin-Synthese
Octopin-Syntheseund-Transport
Skript p. 5
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 23
Agrobacterium: Octopin
Agrobacterium Octopin
Skript p. 5
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 24
Erwinia chrysanthemi - Titel
Erwinia carotovora und Erwinia chrysanthemi:
Pectolytische Enzyme als Angriffswaffen
(Pathogenizitätsfaktoren bzw. Virulenzfaktoren)
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 25
Erwinia carotovora auf Karotte
Erwinia_carotovora_Karotte
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 26
Erwinia carotovora auf Salat
Erwinia_carotovora_Salat
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 27
Erwinia carotovora auf Chicorino
Erwinia_carotovora_Chicorino
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 28
Erwinia carotovora auf Kartoffel
Erwinia_carotovora_Kartoffel
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 29
Erwinia carotovora auf Radieschen
Erwinia_carotovora_Kartoffel
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 30
Angriffswaffen von Bakterien
Angriffswaffen von Bakterien
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 31
Angriff eines Weichfäule-Bakteriums (Erwinia sp.)
Erwinia_carotovora_Radies
Bakterien "mazerieren" das Gewebe!(Auflösung der Mittellamelle aus Pectin)
Skript p. 6
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 32
Struktur von Pectin; pectolytische Enzyme
Struktur von Pectin; pectolytische Enzyme
Polygalacturonsäure (Pectin)
Hydrolase: Pectinase
Lyase: Pectolyase
+ H2O
Skript p. 6
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 33
Klassische Fragestellung der (molekularen)Phytopathologie
Pathogenitätsfaktor/ Virulenzfaktor
"Ist ein gegebenes Molekül (Enzym, Toxin etc.) kausal für die Krankheit wichtig?"
Ist es ein Pathogenitätsfaktor?
Ist es ein Virulenzfaktor?
Ist es ein (unwichtiges) Begleitprodukt?
Pathogenitätsfaktoren sind qualitativ wichtig: Krankheit ja oder nein ...
Virulenzfaktoren sind quantitativ wichtig: stärkere oder geringere Symptome
Skript p. 7
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 34
Klassische Fragestellung der Pathologie
Kochsche Postulate
"Ist ein gegebener Mikroorganismus kausal für die Krankheit wichtig?"
Der Mikroorganismus muss stetig im kranken Gewebe vorhanden sein.
Der Mikroorganismus muss in Reinkultur isoliert werden können.
Der isolierte Mikroorganismus muss die Krankheits- symptome auslösen
Koch'sche Postulate
Skript p. 7
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 35
Robert Koch, der Entdecker des Tuberkulose-Erregers
Robert Koch
1843 Robert Koch wird in Clausthal (Harz) geboren. Er wächstgemeinsam mit zehn Geschwistern auf.
1866 Abschluß seines vierjährigen Medizinstudiums in Göttingen
1867- 1880 Tätigkeit als praktischer Arzt
1876 Bei Versuchen zur Entstehungsgeschichte der gefürchtetenTierseuche Milzbrand weist Koch erstmals spezifischeKrankheitserreger als Krankheitsursache nach. Bisher führte mandiese Krankheit auf "Miasmen", d.h. die Luft verunreinigendeGifte, zurück. Publikation der Versuchsergebnisse in "Beiträgezur Biologie der Pflanzen".
1881 Koch gelingt der Nachweis des Tuberkulose-Bakteriums
1884 Er entwickelt mit den "Kochschen Postulaten" eine Definitionbakteriologischer Erregernachweise, die in abgewandelter Formbis heute Gültigkeit hat.
1885 Berufung zum Professor an der Berliner Universität
1897-1906 Wiederholte Forschungsreisen in die Tropen. Er untersuchtEntstehung und Ausbreitung der Pest, der Malaria, derSchlafkrankheit und der Rinderpest.
1905 Nobelpreis für Medizin.
1910 Koch stirbt in Baden-Baden
Bild aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 36
Robert Koch auf einer seiner Expeditionen
Robert Koch, Expedition
Bild aus dem WWW
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 37
Die Koch'schen Postulate (publiziert 1884)
Kochsche Postulate
... so müssen sich jene drei Postulate erfüllen lassen, deren Erfüllung für den stricten Beweis der parasitären Natur einer jeden derartigen Krankheit unumgänglich nothwendig ist:
1.) Es müssen constant in den lokal erkrankten Partien Organismen in typischer Anordnung nachgewiesen werden.
2.) Die Organismen, welchen nach ihrem Verhalten zu den erkrankten Theilen eine Bedeutung für das Zustandekommen dieser Veränderung beizulegen wäre, müssen isolirt und rein gezüchtet werden.
3.) Mit den Reinculturen muss die Krankheit experimentell wieder erzeugt werden können.
Skript p. 7
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 38
Entsprechendes Vorgehen für molekulare Studien
Molekulare Version Kochsche Postulate
"Ist ein gegebenes Molekül kausal für die Krankheit wichtig?"
Das Molekül muss stetig im kranken Gewebe vorhanden sein.
Das Molekül muss isoliert und gereinigt werden können.
Das isolierte Molekül muss die Krankheitssymptome auslösen.
Mutanten des Krankheitserregers, die das Molekül nicht bilden, müssen avirulent sein.
Skript p. 7
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 39
Beispiel: Pectolytische Enzyme von Erwinia chrysanthemi
Beispiel: pectolytische Enzyme
"Sind die pectolytischen Enzyme kausal für die Krankheit wichtig?"
Enthält das kranke Gewebe pectolytische Enzyme?
Können pectolytische Enzyme isoliert werden?
Lösen isolierte pectolytische Enzyme die Krankheits- symptome aus?
Ja!
Ja!
Ja!
Aber: Erwinia chrysanthemi besitzt mehrere verschiedene pecto-lytische Enzyme! Welche davon sind Virulenz-/bzw. Pathogenitäts-faktoren?
Skript p. 7
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 40
Alan Collmer (Cornell University, Ithaca, New York)
Alan Collmer
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 41
Jagd auf pectolytische Enzyme
Jagd auf pectolytische Enzyme
Bakterium wird auf Medien mit Pectin gezüchtet (Pectin als C-Quelle).
Pectolytische Enzyme werden isoliert, gereinigt, charak- terisiert, ansequenziert.
Gene für die entsprechenden Proteine werden identi- fiziert, kloniert.
Sechs verschiedene pectolytische Enzyme identifiziert und deren Gene kloniert: pehX, pelX, pelA, pelB, pelC und pel E!
Skript p. 7
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 42
Funktioneller Nachweis der Aktivität der Genprodukte
Funktionstest
Klonierte Gene werden in Escherichia coli exprimiert (Laborstamm, der kein Pectin spalten kann).
Transgene Escherichia coli werden auf Pectin-Platten ausplattiert.
Kolonien, welche pectolytische Enzyme produzieren, machen "Löcher" in die Platte.
Alle sechs Gene liefern funktionelle Enzyme!
Skript p. 7
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 43
Funktioneller Nachweis der Aktivität der Genprodukte
Pectinagar-Test
JOURNAL OF BACTERIOLOGY 179 (8): 2503-2511 APR 1997
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 44
Knock-out der entsprechenden Gene in E. chrysanthemi
Knock-out Mutanten
Homologe Rekombination ("Marker-Austausch") mit Hilfe eines DNA-Stücks, das aussen Homologie zum Ziel-Gen aufweist und im Zentrum einen "Resistenz-Marker".
Mutierte Stämme werden mit Hilfe des "Resistenz- Markers" selektioniert; Mutationen werden kombiniert
Der sechsfach mutierte Stamm sollte keine "Löcher" mehr in Pectin-Platten machen.
Grosse Überraschung: Der sechsfach mutierte Stamm ist auf Chrysanthemen-Blattstücken immer noch pathogen!!
Stimmt!
Skript p. 8
Wie geht es jetzt weiter?
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 45
Suche nach weiteren pectolytischen Enzymen!
Abstract Kelemu/Collmer 93
Appl. Environ. Microbiol., Jun 1993, 1756-1761, Vol 59, No. 6 Copyright © 1993, American Society for Microbiology Erwinia chrysanthemi EC16 Produces a Second Set of Plant-Inducible Pectate Lyase Isozymes S Kelemu and A Collmer Department of Plant Pathology, Cornell University, Ithaca, New York 14853-5908 The enterobacterium Erwinia chrysanthemi causes soft-rot diseases involving extensive tissue maceration in a wide variety of plants and secretes multiple pectic enzymes that degrade plant cell walls and middle lamellae. An E. chrysanthemi mutant with directed deletions or insertions in genes pehX, pelX, pelA, pelB, pelC, and pelE, which encode exo-poly-(alpha)-d-galacturonosidase, exopolygalacturonate lyase, and four isozymes of pectate lyase, respectively, was constructed by the marker exchange of a cloned pehX::TnphoA fragment into E. chrysanthemi CUCPB5010, a (Delta)(pelA pelE) (Delta)(pelB pelC)::28bp (Delta)(pelX)(Delta)4bp derivative of strain EC16. This mutant, E. chrysanthemi CUCPB5012, no longer caused pitting in a standard pectate semisolid agar medium used to detect pectolytic activity in bacteria. Nevertheless, the mutant still macerated leaves of chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium), although with reduced virulence. The mutant was found to produce significant pectate lyase activity in rotting chrysanthemum tissue and in minimal media containing chrysanthemum extracts or cell walls as the sole carbon source. Activity-stained, ultra-thin-layer isoelectric focusing gels revealed the presence in these preparations of several pectate lyase isozymes with pIs ranging from highly acidic to highly alkaline. Sterile culture fluids containing these isozymes were able to macerate chrysanthemum leaf tissue. Unlike the products of the pelA, pelB, pelC, and pelE genes in E. chrysanthemi EC16, these plant-inducible pectate lyase isozymes were not produced in minimal medium containing pectate. The results suggest that E. chrysanthemi produces two sets of independently regulated pectate lyase isozymes that are capable of macerating plant tissues.
Skript p. 8
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 46
Schlussfolgerung
Schlussfolgerung
Die neu entdeckten Enzyme kommen im kranken Gewebe vor!
Die neu entdeckten Enzyme können isoliert werden!
Die isolierten Enzyme verursachen die Krankheits- symptome (Mazerierung des Gewebes)!
Wie geht es jetzt weiter?
Die Koch'schen Postulate sind erfüllt!
Skript p. 8
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 47
Angriffswaffen von Bakterien
Abwehrkräfte der Pflanzen
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 48
Review Innate Immunity
"Erkennung": Flagellin-Erkennung und "innate immunity"
Skript p. 9
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 49
Review Innate Immunity
"Innate immunity" bei Tieren und Pflanzen
Skript p. 9
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 50
Review Innate Immunity
Ablauf der Immun-Abwehr bei PFlanzen
Skript p. 9
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 51
Titel Zipfel
Nature 428, 764-767, 2004 Skript p. 10
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 52
Zipfel Fig. 1a
Fig. 1a: Bakterien-Wachstum in Pflanzen,die mit flg22 vorbehandelt wurden
Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004
Dieses Experiment zeigt auch, dass es bei Infiltration keinen Unterschied in der Anfälligkeit von Wildtyp und fls2 gibt ...
Skript p. 11
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 53
Zipfel Fig. 3a
Fig. 3a: Krankheits-Anfälligkeit bei Sprüh-Inokulation
Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004
... aber bei Sprüh-Inokulation sind die fls2 Mutanten deutlich empfindlicher!
Skript p. 11
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 54
Zipfel Fig. 3b
Fig. 3b: Bakterielles Wachstum nach Sprüh-Inokulation
Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004
Skript p. 11
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 55
Zipfel Fig. 3c
Fig. 3c: Ökotyp Ws-0 (eine natürliche fls2 Mutante)wird durch Transformation mit dem FLS2-Gen resistenter!
Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004
Skript p. 11
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 56
Die flg22-induzierte Resistenz ist auch in Mutanten aktiv!
Skript p. 11
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 57
Zipfel Fig. 2
Fig. 2: Es muss noch weitere MAMPs geben!
Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004
Skript p. 11
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 58
Angriffswaffen von Bakterien
Hrp-Gene und das "Wettrüsten"zwischen Bakterien und Pflanzen
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 59
Entdeckung von Hrp-Genen
Entdeckung von hrp-Genen
Interessante Beobachtung: Bestimmte Mutationen bei phytopathogenen Bakterien (Beispiel: Pseudomonas syringae) führen:
1) zum Verlust der Fähigkeit, in der inkompatiblen Inter-aktion eine "Hypersensitive Reaktion" (HR) auszulösen, und gleichzeitig
2) zum Verlust der Pathogenität in der kompatiblen Interaktion.
Die entsprechenden Gene wurden hrp genannt.
Skript p. 12
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 60
Der "Hrp gene cluster"
Hrp-Gen-Cluster
Skript p. 12
Mehrere Transkripte und viele Proteine für den gleichen "Injektionsapparat"!
Transkripte/Proteine im Genom anders gruppiert, dienen dem gleichen Zweck ("Injektionsapparat")
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 61
Bakterielle Sekretionssysteme
Bakterielle Sekretionssysteme
z.B. pectolytischeEnzyme z.B. Proteasen
"Effektor-Proteine"
"Injektions-Kanüle"
Skript p. 12
T-DNA!
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 62
Vergleich von Pflanzen und Tieren (I)
Vergleich Pflanzen/Tiere I
Skript p. 13
Effektor-Proteine fördern Endocytose!
Effektor-Proteine unterdrücken Abwehr!
Effektor-Proteine unterdrücken Abwehr!
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 63
Vergleich von Pflanzen und Tieren (II)
Vergleich Pflanzen/Tiere II
Skript p. 13
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 64
Induktion und Funktion der "Effektor-Proteine"
Induktion und Funktion Effektor-Proteine
Induktion von hrp- und Effektor-Genen
"Normaler" Wirt:Effektor-Proteine schwächen Abwehr:Resultat Krankheit
Wirt mit Resistenzgen:Effektor-Proteine werden "erkannt":Resultat HR,keine Krankheit
Skript p. 14
R
>30 "xop"-Gene für "Effektor-Proteine"!
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 65
Zusammenfassung zur Funktion der "Effektorproteine"
Schlussfolgerung
Die Effektorproteine sind Virulenzfaktoren, welche u.a. die allgemeine Abwehrbereitschaft der Pflanze reduzieren.
Wenn die Pflanze aber ein Resistenzgen gegen ein gegebenes Effektorprotein besitzt, wird dieses ein Avirulenzfaktor und löst eine HR aus.
Doppelnatur der Effektorproteine: HR - P ...
Nicht im Skript!
Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 66
"Effektorproteine", AVR-Faktoren und Co-Evolution
Schlussfolgerung
Schritt 1: Pflanze "erkennt" Bakterium (z.B. via Flagellin)
Schritt 2: Bakterium unterdrücktErkennung via Effektor A
Schritt 3: Pflanze "erkennt" Effektor A
Schritt 4: Bakterium unterdrücktErkennung via Effektor B
Schritt 5: Pflanze "erkennt" Effektor B
Evolution
Stä
rke
der
Ab
weh
r
Skript p. 14