PHA production, from bacteria to plants

徐献毅

背景介绍

图 1 ：含有 PHA 的细菌电镜照片

• 聚羟基脂肪酸酯 polyhydroxyalkanoates (PHA)– 由微生物合成的一类生物聚酯– 作为细胞内的碳源和能量的储存物质– 具有生物可降解性和生物相容性

CH2 x

O

O

R

n

图 2 ： PHA 的结构通式

PHA 结构的多样性

—[O—*CH—(CH2)m—C—]n——

R

O

O

O

3HO

O

O

3HHx

O

O

3HDO

O

3HDD

O

O

3HBO

O

3HV

CH3C2H5C3H7C5H11C9H19C7H15

PHA 结构的多样性为设计、合成

新型材料提供了前提。

本实验所生产： PHA 的化学结构

• PHA 共聚酯 : 含有两种以上的单体成分

—[CH—CH2—C—O]a——[CH—CH2—C—O]b—

O O

P(3HB-co-3HV)聚羟基丁酸羟基戊酸酯

(PHBV)

CH3 C2H5

Abstract• The genes encoding the polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthe

tic pathway in Ralstonia eutropha (3-ketothiolase, phaA orbktB ; acetoacetyl-CoA reductase, phaB ; and PHA synthase, phaC ) were engineered for plant plastid targeting and expressed using leaf (e35S) or seed-specific (7s or lesquerella hydroxylase) promoters in Arabidopsis and Brassica. PHA yields in homozygous transformants were 12–13% of the dry mass in homozygous Arabidopsis plants and approximately 7% of the seed weight in seeds from heterozygous canola plants. When a threonine deaminase was expressed in addition to bktB, phaB and phaC, a copolyester of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyvalerate was produced in both Arabidopsis and Brassica.

significance

• PHA 具有良好的材料性能，类似于石油化工材料，如：聚乙烯，聚丙烯。但是通过菌体发酵过程生产的日用品，比石油化工产品昂贵许多。不具有商业上的竞争性。因此本实验设想 :

• PHA production in plant systems may lead to lower costs by using CO2 for carbon and sunlight for energy.

• In addition, a plant production system may have a lower overall environmental impact.

模式植物 Arabidopsis thalianna 生产 PHB 的尝试

• 利用内源的 3-ketothiolase ，外源的 phaB,phaC生产的 PHB 的含量只有 0.14% 干重。产量非常低。并且发现外源的 phaB 或 phaB 和 phaC 同时表达细胞质时，植物生长受抑制很严重。

• 分析原因：（异源的 PHB 在植株中合成消耗了细胞质中大约 50% 的乙酰 CoA. 可能由于乙酰 CoA分流过多 , 导致内源异戊二烯类和类黄酮等重要物质合成的底物不足而影响了植株的正常生长发育；也可能因为 PHB 在细胞质、液泡和细胞核中的积累对植物生长产生毒害作用 , 尤其是在细胞核中的 PHB 可能与 DNA 相作用 . ）

尝试实验中受到的启发：• 实验发现：没有在质体和线粒体中发现 PHB 颗粒。

原因可能是 PHB 颗粒的疏水性，使其只能进入单层膜细胞器而不能进入双层膜细胞器中。（设想：选择目标为质体）

• 质体中进行着旺盛的从碳源转向乙酰 COA 的代谢，含有丰富的乙酰 COA 。并且当光合作用旺盛时，以淀粉粒的形式暂时储存在叶绿体时，发现并没有对叶绿体的功能产生影响。

改进方案：• PHA accumulation In the plastids ：• All three genes from the PHA biosynthetic pathw

ay from R. eutropha, consisting of the 3-ketothiolase (phaA ), phaB and phaC, were N-ter-minally fused to chloroplast transit peptides and ex-pressed under 35S promoter control. Plants harboring the complete PHA biosynthetic pathway were obtained by crossing experiments. One of the resulting plants accumulated approximately 14% PHB as CDM 。

转基因油菜种子生产 PHB 的尝试

• 原因：油菜作为世界第一大油料作物，其体内脂肪酸合成旺盛，是生产 PHB 的合适目标。

• 位点：定位于种子的质体，即把 PHB 的合成限定于特定细胞器、特定组织、特定发育阶段 , 不仅可以最大限度地减少 PHB 合成对植物生长发育的影响并提高产量 , 还可有利于 PHB 的提取。

• 方法：利用从拟南芥的 12S 种子储存蛋白 CRB的编码基因中分离出来的启动子 , 连同叶绿体导肽 , 将 PHB 的合成定位于油菜种子的胚中 , PHB最终含量达种子鲜重的 1%.

利用转基因植物生产 phbv 的研究

• PHBV 具有较好的柔韧性和较低的熔点，比 PHB更适合生产塑料。

• 由于 eutropha 的 phaA 基因产物不能有效地催化丙酰 CoA 和乙酰 CoA 合成酮戊酰 CoA,他们从 eutropha克隆了另一个酮硫裂解酶基因—— bktB. bktB 基因产物可有效地催化丙酰 CoA 和乙酰 CoA 合成 β- 酮戊酰 CoA, 进一步与乙酰乙酰 CoA 在phaB 和 phaC 基因产物的催化下合成 PHBV, 丙酰 CoA则来源于苏氨酸 . 在植物体内 ,苏氨酸在脱氨酶的作用下转化为 β－酮丁酸 , 内源的丙酮酸脱氢酶催化 β－酮丁酸转化为丙酰 CoA 。

PHBV 代谢途径

结果：将 PHA 合成的所需酶的基因导入到拟南芥质体中 : 通过实验获得了最高占植株的干重 0.8% 的产率。并且 3HV 的含量在4-17%之间变化。

转基因植物生产 PHA 的问题与展望 转基因植物中合成的 PHA 含量还很低 , 种类也比较单一 。提高 PHA 在植

物体内表达量的研究外 , 同时也要注意增加 PHA 的品种 , 尤其是物理机械特性更佳的 PHA 。 为此可考虑从以下几个方面来进行：(1) 尽量避免基因沉默现象 , 最大限度地提高转基因植物中 PHA 合成基因表达的稳定性。

(2) 加强植物体内脂肪酸代谢的研究。 (3) 以 PHA 颗粒替代油脂体。 (4)寻找更适合的合成 PHA 的场所。如马铃薯。 马铃薯块茎是大有希望的 PHA 合成位点 , 因为马铃薯的块茎产量大大高于油料作物的种子 , 价格也低廉得多 , 可以通过无性繁殖方式大量、快速地繁殖 , 而且已经获得转 PHB 合成酶基因的马铃薯植株 , 只要我们加强碳代谢调控的研究 , 尽快找到从碳源流向乙酰 CoA 的调控方法 , 有可能比利用油料作物生产 PHB更具有优势。

关于 Canola oil( 改良油菜子油 )

• Canola oil 是用经基因改良的油菜 (Rape ， Brassica napus) 种子榨出的食用油。精制 (refined)后的 Canola oil 含59% 单不饱和脂肪酸， 22% 多不饱和脂肪酸和 7%饱和脂肪酸。 <2% 芥酸， erucic acid 。

未 经基因改良的油菜子油（普通）中芥酸含量可高达 30-60% ( 如中国原产油菜子油 ) 。芥酸在试验动物中可引发心肌坏死 (heart lesions) ，所以 1986年以前，油菜子油在美国的主要用途为工业原料 ( 可怜中国人祖祖辈辈吃了几千年！ ) 。基因改良后的油菜子油的芥酸含量少于 2% ，而且含大量不饱和脂肪酸，因而成为健康食用油。但由於Canola oil 含不饱和脂肪酸多，高温下易分解生成致肺癌的化学物，不适用传统的中式烹调 (热油锅 ) 。

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