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Phénotypage de la réparation de l’ADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro multiparamétrique
Anne-Laure RAFFIN
Soutenance de thèse : 5 Juin 2009
Thèse préparée au laboratoire Lésions des Acides Nucléiques
Directrice de thèse: Dr. Sylvie SAUVAIGO
PLAN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
1. Introduction
• La réparation de l’ADN
• Le Xeroderma pigmentosum
• Les outils pour étudier la réparation de l’ADN
2. Objectifs
3. Matériels et Méthodes
• Préparation des lysats cellulaires
• Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo
4. Résultats
• Le niveau basal de réparation
• Réponse à une irradiation UVB
• Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation
5. Conclusions et perspectives
PLAN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
1. Introduction
• La réparation de l’ADN
• Le Xeroderma pigmentosum
• Les outils pour étudier la réparation de l’ADN
2. Objectifs
3. Matériels et Méthodes
• Préparation des lysats cellulaires
• Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo
4. Résultats
• Le niveau basal de réparation
• Réponse à une irradiation UVB
• Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation
5. Conclusions et perspectives
L’ALTÉRATION DE LA MOLÉCULE D’ADN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Double hélice d’ADN
ADN lésé
Lésion de l’ADN
Source de dommages
Introduction: la réparation de l’ADN
LES RÉPONSES CELLULAIRES FACE AUX DOMMAGES DE L’ADN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
cellule
Arrêt réplication Arrêt de la transcription
Source endogène ou exogène de dommage
Lésions de l’ADN
Mutagénèse
- Restauration de la séquence d’ADN
- Reprise du cycle cellulaire
Réparation de l’ADN
Cancérogenèse
Apoptose
Introduction: la réparation de l’ADN
LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
XU
X X X
A
G
T X
X
CH3
C
(CH3)n T
X X
Site abasique
Adduits volumineux
Dimère de Pyrimidine
Coupure double brins
Pontages intra et inter-brin
Uracile Modification de la base
Alkylation
mésappariement
O6 methyl guanosine
Introduction: la réparation de l’ADN
LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
XU
X X X
A
G
T X
X
CH3
C
(CH3)n T
X X
Site abasique
Adduits volumineux
Dimère de Pyrimidine
Coupure double brins
Pontages intra et inter-brin
Uracile Modification de la base
Alkylation
mésappariement
O6 methyl guanosine
Petites lésions: modifient la structure chimique des composants de l’ADN mais ne déforment pas la double hélice
Introduction: la réparation de l’ADN
LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
XU
X X X
A
G
T X
X
CH3
C
(CH3)n T
X X
Site abasique
Adduits volumineux
Dimère de Pyrimidine
Coupure double brins
Pontages intra et inter-brin
Uracile Modification de la base
Alkylation
mésappariement
O6 methyl guanosine
Lésions volumineuses: modifient la structure chimique des composants de l’ADN et déforment la double hélice
Introduction: la réparation de l’ADN
LES DIFFÉRENTS VOIES DE RÉPARATION DE L’ADN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
XU
X X X
A
G
T X
X
CH3
C
(CH3)n T
X X
BER NER NHEJ / HR MMR DR
BER: Base Excision Repair
NER: Nucleotide Excision Repair
NHEJ: Non-Homologous End joining
HR: Homologous Recombination
MMR: MisMatch Repair
DR: Direct Reversal
Introduction: la réparation de l’ADN
LES ÉTAPES ET FACTEURS DE LA BER ET DE LA NER
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Reconnaissance du dommage
BER NER
XPC, (XPE), XPA and TFIIH
Glycosylases
Excision du dommageGlycosylases + AP endonucléase
Endonucléases XPG et XPF-ERCC1,
XPA
Resynthèse de l’ADN Polymérases δ, ε, RPA, XPA?
Polymérase β + Polymérases δ, ε
Ligature Ligase ILigase III ou I
Base Excision Repair Nucleotide Excision Repair
GG et TC-NER
Introduction: la réparation de l’ADN
LES ADN N-GLYCOSYLASES ET L’APE1
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
• Substrats: petites lésions de l’ADN
Introduction: la réparation de l’ADN
• Fonction des ADN N-glycosylases: coupure de la liaison N-Glycosidique
• Spécificité des ADN N-Glycosylases: un type de dommage ou un groupe de
dommages
• Exemple d’ADN N-Glycosylases: UNG (Uracile), OGG1 (8-oxoG), NTH1 (Diol de
Thymine, 5 Formyluracile), NEIL1 (Diol de Thymine, Fapy-A, Fapy-G, 8-oxoG)
• Fonction de APE1 et des ADN N-Glycosylases bifonctionnelles : coupure de la
liaison phosphodiester
LES RÔLES DE XPA ET XPC
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
• Substrats: lésions volumineuses de l’ADN
Introduction: la réparation de l’ADN
• XPC:
– Spécificité d’intervention: uniquement réparation globale du génome
– Fonction: Reconnaissance de l’ADN endommagé (1er facteur à intervenir)
• XPA:
– Spécificité d’intervention: réparation globale du génome et réparation couplée à la
transcription
– Interactions avec d’autres facteurs de la NER: TFIIH, ERCC1 et RPA
– Fonction(s): « Chef d’orchestre » de la NER: de la reconnaissance du dommage à la
resynthèse de l’ADN
= Rôle complexe qui reste encore à clarifier
BER NER
• Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997)
• XPC stimule activité de la TDG (Schimizu et al., 2003), OGG1 (d’Errico et al.,
2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008)
• hHR23 (A et B) stimule MPG (Miao et al., 2000)
• RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000)
• XPG stimule NTH1 (Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999)
• Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydatif que des cellules
saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008)
LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION
Introduction: la réparation de l’ADN
BER NER
• Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997)
• XPC stimule activité de la TDG (Schimizu et al., 2003), OGG1 (d’Errico et
al., 2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008)
• hHR23 (A et B) stimule MPG (Miao et al., 2000)
• RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000)
• XPG stimule NTH1 (Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999)
• Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydant que des cellules
saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008)
LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION
Introduction: la réparation de l’ADN
LES CARACTÉRISTIQUES DU XERODERMA PIGMENTOSUM
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
• 1968: relation XP – déficience de la NER (Cleaver 1968)
• 7 groupes XP (A à G): déficience d’une protéine de la NER + XPV
• Hypersensibilité aux UV : apparition de lésions pigmentaires dès le plus jeune âge
• Apparition cancer: risque multiplié par 1000. Tumeurs de la peau vers l’âge de 8
ans (Daya-Grosjean et al. 1995)
• Certaines formes: troubles neurologiques
• Espérance de vie: 15-20 ans (XP classiques) (de Boer and Hoejmakers 2000)
• Pas de traitement
• Diagnostic: test UDS (Unscheduled DNA Synthesis)
Introduction: le Xeroderma pigmentosum
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
LES AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DES TESTS DE MESURE DE LA RÉPARATION DE L’ADN
Vision minimaliste de la réparation de l’ADN: une lésion étudiée à la fois
Test in vitro sur support permettant une mesure conjointe de la réparation de plusieurs lésions à partir d’un seul lysat cellulaire
Introduction: Les outils pour étudier la réparation
UDS (Unscheduled
DNA Synthesis)
HCR (Host Cell Reactivation)
Imagerie cellulaire
Excision-Resynthèse en
solution (Wood, 1988)
Paramètres mesurés
Principe du test
incorporation nucléotide
radiomarqué (resynthèse)
"Récupération" d'une activité enzymatique
Anticorps fluorescent,
protéine de la réparation
fluorescente
incorporation nucléotide
radiomarqué (resynthèse)
Mesure d'activités enzymatiques de réparation de l'ADNRecrutement des facteurs de la réparation dans le temps et l'espace
Test in vivo
Inconvénients
Radioactivité
Durée
PLAN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
1. Introduction
• La réparation de l’ADN
• Le Xeroderma pigmentosum
• Les outils pour étudier la réparation de l’ADN
2. Objectifs
3. Matériels et Méthodes
• Préparation des lysats cellulaires
• Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo
4. Résultats
• Le niveau basal de réparation
• Réponse à une irradiation UVB
• Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation
5. Conclusions et perspectives
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
LES OBJECTIFS DE L’ÉTUDE
• Proposer un outil de diagnostic de la maladie XP alternatif à l’UDS
– Fiabilité
– Rapidité
– Sensibilité
– Peu de cellules
Utiliser l’outil « puce réparation » pour caractériser des phénotypes de
réparation de l’ADN de lignées XP
Objectifs
• Etudier la réparation de l’ADN de lignées XPA et XPC
– Quel est le niveau basal de réparation? Influence de la concentration protéique
– Quelle est la réponse à un traitement génotoxique? UVB
PLAN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
1. Introduction
• La réparation de l’ADN
• Le Xeroderma pigmentosum
• Les outils pour étudier la réparation de l’ADN
2. Objectifs
3. Matériels et Méthodes
• Préparation des lysats cellulaires
• Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo
4. Résultats
• Le niveau basal de réparation
• Réponse à une irradiation UVB
• Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation
5. Conclusions et perspectives
LA PRÉPARATION DES LYSATS CELLULAIRES
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Tampons ioniques
Protéines
Test in vitro de la réparation
dosage
Matériels et Méthodes
Congélation
DMSO+SVF+milieu
Fibroblastes SV40 de patients XP
3 à 5 x 106 cellules
(Test en solution de Wood et al.: 109 cellules)
LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
[support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!!
Puce OligoPuce Plasmide
Gain de fluorescence
Matériels et Méthodes
lésions
plasmide
surface de la biopuce
incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5
Excision des lésions + Resynthèse
LES LÉSIONS DE LA PUCE PLASMIDE
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
8oxoGuanine
N
NHNH
NO
O
RNH2
Diols de pyrimidine
NH
N
O
O
R
NH
N
O
O
R
CH3CH3
NH
NCH3
O
R
NH
N
O
CH3
O
R
OH
H
6-4 PP
Photoproduits
+
T-T CPD
N
N
N
NN
OH
R
O
OHN
N
N
NN
OH
R
+
Bases alkylées
Adduits
CisplatineG
GPt
NH2
NH2
AT CTAGCATGGCC
TACGA CGT CCGG
Sites abasiques
Matériels et Méthodes
Co
ntr
ol
CP
D-6
4 A
CP
D-6
4 B
CP
D-6
4 C
8oxo
_A
8oxo
_B
8oxo
_C
Alk
B_A
Alk
B_B
Alk
B_C
Cis
P_A
Cis
P_B
Cis
P_C
Ab
aS_A
Ab
aS_B
Ab
aS_C
Gly
col_
A
Gly
col_
B
Gly
col_
C
Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
to
tale
PARAMÈTRES MESURÉS
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Phénotype de
réparation
Quantification de la fluorescence totale
Matériels et Méthodes
Part relative de l’intensité de fluorescence des différentes lésions
pCPD-64
p8oxoG
pAlkB
pCisP
pAbaS
pGlycol
pCPD-64 p8oxoG pAlkB pCisP pAbaS pGlycol
Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
to
taleSoustraction
du contrôle
Somme des Intensité de fluo pour la même lésion
Profil d’ER
(Excision-Resynthèse)
LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
[support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!!
Puce OligoPuce Plasmide
fluorophore Cy3
lésions
oligonucléotide
surface de la biopuce
incubation aveclysat cellulaire
Excision des lésions
Perte de fluorescence
Matériels et Méthodes
Gain de fluorescence
lésions
plasmide
surface de la biopuce
incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5
Excision des lésions + Resynthèse
LES ACTIVITÉS ENZYMATIQUES MESURÉES AVEC LA PUCE OLIGO
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
- NTH1: Diol de thymine, Dihydrothymine
- NEIL1?: Diol de thymine, Dihydrothymine
- UNG: Uracile (U-A ou U-G)
- SMUG1: Uracile (U-A ou U-G)
- TDG: Mésappariement G-T
- MBD4: Mésappariement CG-GT
- MPG: Ethénoadénine
- APE1: THF (équivalent site abasique)
Matériels et Méthodes
PLAN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
1. Introduction
• La réparation de l’ADN
• Le Xeroderma pigmentosum
• Les outils pour étudier la réparation de l’ADN
2. Objectifs
3. Matériels et Méthodes
• Préparation des lysats cellulaires
• Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo
4. Résultats
• Le niveau basal de réparation
• Réponse à une irradiation UVB
• Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation
5. Conclusions et perspectives
0
20
40
60
80
100
120
140
160
pCPD-64 p8oxoG pAlkB pCisP pAbaS pGlycol
% p
ar r
app
ort
au
lys
at t
émo
inXPC
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Niveau basal de réparation
0,3 mg/mL
- Déficience pour la réparation des lésions prises en charge par la BER et la NER
Implication de la protéine XPC dans la réparation des petites lésions
Phénotype XPC ≠ Phénotype Témoin
PHÉNOTYPE D’EXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (1)
Lysat témoin
0
20
40
60
80
100
120
140
160
pCPD-64 p8oxoG pAlkB pCisP pAbaS pGlycol
% p
ar r
app
ort
au
lys
at t
émo
inXPCXPA
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Niveau basal de réparation
Phénotype XPA = Phénotype Témoin à cette concentration protéique
Rôle de XPA dans la réparation de la 8-oxoG? Pas de rôle établi dans la littérature (Klein et al., 1992; Dusinska et al., 2006 ≠ Rünger et al., 1995)
PHÉNOTYPE D’EXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (2)
0,3 mg/mL
Lysat témoin
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Niveau basal de réparation
PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DE L’ADN DE LYSATS TOTAUX
La discrimination des phénotypes XP est encore plus difficile avec les lysats totaux
ER XPC = 85 % du témoin
ER XPA = 100 % du témoin
0
20
40
60
80
100
120
140
pCPD-64 p8oxoG pAlkB pAbaS pGlycol
% p
ar r
app
ort
au
lys
at t
émo
inXPCXPA
Lysat témoin
0
20
40
60
80
100
Tg siteabasique
OligoContrôle
CG-GT dHT EthdA U-G U-A
Tau
x d
e co
up
ure
(%
)Témoin FibroblasteXPCXPA
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Niveau basal de réparation
PHÉNOTYPE D’EXCISION DE LYSATS NUCLÉAIRES
- Activités glycosylases et APE1 équivalentes dans tous les lysats testés sauf pour l’excision des diols de thymine
- Le lysat XPA excise les diols de thymine avec une plus faible efficacité que le lysat témoin: interaction XPA avec NTH1, NEIL1?
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Niveau basal de réparation
CONCLUSIONS NIVEAU BASAL DE RÉPARATION
Niveau basal + concentration standard de protéines
– XPC < Témoin
– XPA = Témoin
XPC joue un rôle dans la réparation des petites lésions
BER et XPA?
??Faire varier des paramètres expérimentaux pour gagner de l’information
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB
PARAMÈTRES MESURÉS EN RÉPONSE AUX UVB
Exposition des cellules aux UVB (attention à la confluence)
0, 5 et 20 J/m²
24 h
Cycle cellulaire
(Cytométrie en flux)
Cytotoxicité
(test MTT)
Réparation de l’ADN
(test in vitro d’ER)
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB
CYTOTOXICITÉ 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB
Les cellules XP sont plus sensibles aux UVB
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
Doses UVB (J/m²)
% d
e s
urv
ie
Témoin fibro
XPC fibro
XPA fibro
M1
M2
M3
M4
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB
CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB
Souche témoin
0
20
40
60
80
100
Sub-G1 G1 S G2phases du cycle
% d
e ré
par
titi
on
Souche XPC-/-
0
20
40
60
80
100
Sub-G1 G1 S G2
phases du cycle
% d
e ré
par
titi
on
Souche XPA -/-
0
20
40
60
80
100
Sub-G1 G1 S G2phases du cycle
% d
e ré
par
titi
on
M1
M2M3
M4 M1
M2 M3
M4
0 J/m²
5 J/m²
20 J/m²
M1
M2
M3
M4 M1
M2
M3
M4M1
M2
M3
M4
0J/m² 20J/m²
0J/m² 20J/m²0J/m² 20J/m²
Fibroblastes
**
**
****
*
*
**
**
**
**
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB
CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB
Souche témoin
0
20
40
60
80
100
Sub-G1 G1 S G2phases du cycle
% d
e ré
par
titi
on
Souche XPC-/-
0
20
40
60
80
100
Sub-G1 G1 S G2
phases du cycle
% d
e ré
par
titi
on
Souche XPA -/-
0
20
40
60
80
100
Sub-G1 G1 S G2phases du cycle
% d
e ré
par
titi
on
0 J/m²
5 J/m²
20 J/m²
Fibroblastes
**
**
****
*
*
**
**
**
**
• Les cellules XP réagissent différemment des cellules témoin suite aux UVB
• XPC XPA5 J/m²
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB
EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H)
-50
0
50
100
150
200
pCPD-64 p8oxo pAlkB pAbaS pGlycol
% d
e va
riat
ion
par
rap
po
rt a
u n
on
irr
adié Témoin Fibroblaste
• Stimulation de l’ER avec le lysat nucléaire témoin
Après l’irradiation UVB des cellules :
Stimulation
Inhibition
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB
EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H)
-50
0
50
100
150
200
pCPD-64 p8oxo pAlkB pAbaS pGlycol
% d
e va
riat
ion
par
rap
po
rt a
u n
on
irr
adié Témoin Fibroblaste
XPA
XPC
• Peu ou pas d’effet de l’irradiation sur la réparation des lysats XP
Après l’irradiation UVB des cellules :
Inhibition
Stimulation
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB
CONCLUSIONS RÉPONSE AUX UVB
UVB + concentration standard de protéines
– Stimulation des activités d’ER avec le lysat nucléaire témoin
– Pas de stimulation pour les lysats XP
Meilleure discrimination des phénotypes de réparation après un traitement préalable des cellules
Rappel: Sans irradiation, XPA = Témoin
Translocation des protéines de réparation vers le noyau en réponse à un traitement génotoxique: XPA (Wu et al., 2007), XPD (Fung et al., 2008)
Néo-synthèse des protéines de la réparation en réponse à l’irradiation UV
PLAN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
1. Introduction
• La réparation de l’ADN
• Le Xeroderma pigmentosum
• Les outils pour étudier la réparation de l’ADN
2. Objectifs
3. Matériels et Méthodes
• Préparation des lysats cellulaires
• Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo
4. Résultats
• Le niveau basal de réparation
• Réponse à une irradiation UVB
• Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation
5. Conclusions et perspectives
p8oxo-G
0,E+00
1,E+07
2,E+07
3,E+07
4,E+07
5,E+07
6,E+07
7,E+07
0 1 2 3
temps de réparation (h)
Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
to
tale
t
pCisP
0,E+00
1,E+07
2,E+07
3,E+07
4,E+07
5,E+07
0 1 2 3
temps de réaction (h)
Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
to
tale
pCPD-64
0,0E+00
5,0E+07
1,0E+08
1,5E+08
0 1 2 3
temps de réaction (h)
Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
to
tale
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet de la concentration protéique
EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (1)
• Plus de protéines: cinétique différente suivant les lésions (vitesse initiale, plateau, allure biphasique)
0,9 mg/mL protéines
0,3 mg/mL protéines
Mécanismes différents suivant la concentration?
Lysat nucléaire témoin
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet de la concentration protéique
pCPD-64p8oxoGpCisPpAlkBpAbaSpGlycol
pCPD-64p8oxoGpCisPpAlkBpAbaSpGlycol
Augmentation de la part relative d’ER des photoproduits, des adduits du cisplatine et de la 8-oxoG
Activités NER et réparation de la 8-oxoG favorisées à forte concentration
Lysat nucléaire témoin0,3 mg/mL 0,9 mg/mL
EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (2)
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet de la concentration protéique
EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LES PHÉNOTYPES DE RÉPARATION XP
0
20
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0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
concentration du lysat nucléaire (mg/mL)
% e
xcis
ion
-res
ynth
èse
par
rap
po
rt
au l
ysat
tém
oin
Lysat XPC
Lysat témoin
0
20
40
60
80
100
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140
160
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
concentration du lysat nucléaire (mg/mL)
% e
xcis
ion
-res
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pa
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pp
ort
au
lys
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émo
in
Lysat XPA
• Nette diminution du niveau relatif de réparation de XPA à partir de 0,7 mg/mL
(sauf pour les diols de pyrimidine)
Lysat témoin
• Léger effet de la concentration sur le niveau relatif d’ER du lysat nucléaire XPC
pour les photoproduits, les adduits du cisplatine et la 8-oxoG
pCPD-64 p8oxoG pAlkB pCisP pAbaS pGlycol
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet de la concentration protéique
CONCLUSIONS EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE
Niveau basal + beaucoup de protéines
– Meilleure efficacité des activités NER et de réparation de la 8-oxoG
– Peu d’effet de la concentration sur le profil relatif de XPC
– Effet de la concentration sur le profil relatif de XPA
Rappel: avec peu de protéine, XPA = Témoin
Meilleure discrimination des phénotypes XP à fortes concentrations protéiques
DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (1)
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
• Nos tests in vitro d’excision-resynthèse et d’excision permettent d’appréhender
la réparation de l’ADN comme un réseau enzymatique dynamique et complexe
Résultats
• Les ratios Protéines / ADN ou Protéines / Lésions sont des paramètres à prendre
en considération lors des tests in vitro
• Les niveaux de réparation obtenus pour XPA et XPC sont supérieurs à ceux de
la littérature obtenus avec d’autres méthodes de mesure in vivo (Athas et al., 1991;
Cleaver 2005) et in vitro (Masutani et al., 1993)
• Le niveau basal avec la concentration standard est à considérer: il apporte de
nouvelles informations quant aux régulations et mécanismes mis en jeu à de telles
concentrations protéiques. Que se passe-t-il in vivo?
DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (2)
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats
Stimulation de la réparation en réponse aux UVB
Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG à forte concentration??
2. Irradiation UVB
3. Augmentation de la concentration protéique
Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG: Implication des facteurs XP dans la réaction d’ER
Discrimination possible
1. Niveau basal + concentration protéique standard
Activités NER limitantes? A quoi est dû le niveau basal?
Discrimination difficile
PLAN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
1. Introduction
• La réparation de l’ADN
• Le Xeroderma pigmentosum
• Les outils pour étudier la réparation de l’ADN
2. Objectifs
3. Matériels et Méthodes
• Préparation des lysats cellulaires
• Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo
4. Résultats
• Le niveau basal de réparation
• Réponse à une irradiation UVB
• Effet de la concentration protéique sur le phénotype d’ER
5. Conclusions et perspectives
BILAN: TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA RÉPARATION DE L’ADN
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Conclusions et perspectives
Informations complémentaires
Type de test Puce oligo Puce plasmideActivités mesurées Excision Excision-resynthèse
Enzymes concernées ADN N -Glycosylases et APE1
Résultante d'un enchaînement de plusieurs réactions
Réaction en présence d'ATP
NON OUI
Concentration protéique du lysat
20 µg/mL 300 µg/mL
APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (1)
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Niveau basal avec concentration protéique standard : faible discrimination des phénotypes XP
DIAGNOSTIC ?
Irradiation des cellules au préalable
Augmentation de la concentration protéique
Meilleure discrimination des phénotypes XPA et XPC
Approfondir l’étude à tous les groupes de complémentation, de A à G
Approfondir les phénotypes et arriver à déterminer une signature de la réparation de l’ADN pour chaque groupe XP pour pouvoir clairement les identifier
Conclusions et perspectives
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100
200
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500
pCPD-64 p8oxoG pAlkB pCisP pGlycolPo
urc
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é (M
1 0
mM
)Témoin fibroblaste
XPC
XPA
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Tester des petites molécules: M1
APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (2)
[M1]= 0,1 mM
[Lysat nucléaire]= 0,7 mg/mL
M1 0 mM
• Profil de XPC très différent de XPA
• En utilisant des petites molécules, il serait possible de discriminer facilement les différents groupes de complémentation?
Conclusions et perspectives
PERSPECTIVES
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Fibroblastes primaires: Confirmer les résultats obtenus à partir des lignées
Amélioration du test : nature des lésions (photoproduits: séparer les CPDs
des 6-4 PPs)
Comprendre la signification du niveau basal
Approfondir l’effet de la concentration sur les activités de réparation (lysats
totaux, autres groupes de complémentation)
Rôle de XPA dans la réparation des dommages oxydatifs? Hypothèse:
Relation avec les troubles neurologiques développés par ces patients
Echantillon: arriver à travailler à partir d’un prélèvement sanguin?
Conclusions et perspectives
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Remerciements
Laboratoire FRE 29-39, IGR, Stabilité génétique et oncogenèse (Pr. Alain Sarasin)
Laboratoire CEA, Stabilité génétique et oncogenèse (Dr. Denis Biard)
Laboratoire CEA, Plateforme cytométrie en flux, iRTSV (Véronique Collin-Faure, Serge Candéias)
CEA, INSTN, Contrat de Formation par la Recherche
Sylvie Sauvaigo
Zohra Termache
Sylvain, Francette, Jocelyne, Gwenaëlle
… Et tout le LAN
Florence Pivard et Sandrine Bessette, stagiaires ESTBB en 2007 et 2008
MERCI!
TITRE DE DIAPO
Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Partie