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Physikalische Kartierungund
Genexpressionsanalysenim Genom von Neurospora crassa
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Gradeseines Doktors der Naturwissenschaften
an der Universität Konstanz
Mathematisch-Naturwissenschaftliche SektionFachbereich Biologie
vorgelegt von
Verena Aign
Tag der mündlichen Prüfung: 21. Februar 2002
Referent: Prof. Dr. R. Knippers
Referent: Prof. Dr. K.-P. Schäfer
Diese Arbeit wurde von November 1997 bis August 2001 unter der Leitung von Herrn
Prof. Dr. R. Knippers, Fachbereich für Biologie der Universität Konstanz, am Deut-
schen Krebsforschungszentrum Heidelberg in der Abteilung „Funktionelle Genomana-
lyse“ unter der Leitung von Dr. J. D. Hoheisel angefertigt.
Herrn Prof. Dr. Rolf Knippers danke ich herzlich für die Betreuung meiner Promotions-
arbeit.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Jörg Hoheisel für die Möglickeit, die Promotion in
seiner Abteilung durchführen zu können, für seine stete Diskussionsbereitschaft und
seine vielen Lösungsvorschläge bei Fragen, die im Laufe meiner praktischen Arbeit
auftraten. Ebenso danke ich ihm für die Ermöglichung eines Forschungsaufenthaltes in
USA sowie vieler Kongressbesuche im In- und Ausland.
Besonders herzlich möchte ich mich bedanken bei Mareike Grees für ihre engagierte
Mitarbeit vorallem bei der Etablierung und Durchführung der Versuche zu den Genex-
pressionsanalysen. Ausserdem danke ich ihr und Sandra Schwarz für viele nette Stun-
den im Labor X021 und beim „Chinesen“.
Carmen Fischer danke ich für viele Hybridisierungen zur physikalischen Kartierung.
Für Tips und Tricks bezüglich des physikalischen Kartierens möchte ich mich bei Jens
Hanke und Marcus Frohme bedanken, für die hilfreiche Unterstützung beim „expression
profiling“ danke ich vorallem Andrea Bauer, Frank Diehl und Boris Beckmann.
Bei Ole Brandt und Boris Beckmann bedanke ich mich für ihre stete Hilfsbereitschaft
bei allen geklärten und ungeklärten Fragen rund um UNIX und PC, bei Kurt Fellenberg
bedanke ich mich für seine unermüdliche Geduld und seine Einführung in die uner-
gründlichen Tiefen von M-Chips.
Ebenso möchte ich mich auch bei allen anderen Mitarbeitern der AG Hoheisel für die
angenehme Arbeitsatmosphäre im Container bedanken.
Mein herzlichster Dank gilt Markus für sein grosses Verständnis, seine ausdauernde
Geduld und die moralische Unterstützung, die er mir nicht zuletzt durch etliche wissen-
schaftliche Anregungen und wertvolle Diskussionen gewährleistet hat.
Inhaltsverzeichnis
I
A Abkürzungen ...................................................................................................1
B Zusammenfassung .........................................................................................2
1. Einleitung.........................................................................................................4
1.1. Der Modellorganismus Neurospora crassa ..................................................................4
1.1.1. Historischer Hintergrund ......................................................................................................4
1.1.2. Lebenszyklus .......................................................................................................................5
1.1.3. Das Genom von Neurospora crassa......................................................................................7
1.1.4. Neurospora crassa Genom-Projekt .......................................................................................8
1.2. Physikalische Kartierung .............................................................................................9
1.3. DNA-Chip-Technologie ..............................................................................................10
1.4. Genexpressionsanalysen.............................................................................................12
2. Material und Methoden................................................................................16
2.1. Material ......................................................................................................................16
2.1.1. Chemikalien und Biochemikalien .......................................................................................16
2.1.2. Enzyme..............................................................................................................................17
2.1.3. DNA-Längenstandards .......................................................................................................18
2.1.4. Primer für PCR ..................................................................................................................18
2.1.5. Häufig verwendete Puffer, Medien und Lösungen...............................................................18
2.1.6. Verwendete Chemikaliensätze ............................................................................................21
2.1.7. Materialien.........................................................................................................................21
2.1.8. Geräte ................................................................................................................................22
2.1.9. Bibliotheken.......................................................................................................................23
2.1.9.1. Genomische Cosmid-Bibliothek..................................................................................23
2.1.9.2. Genomische BAC-Bibliothek......................................................................................23
2.1.9.3. cDNA-Bibliothek........................................................................................................24
2.2. Methoden Physikalische Kartierung..........................................................................25
2.2.1. Anzucht und Replikation von genomischen Bibliotheken ....................................................25
2.2.2. Herstellung genomische Cosmid-Bibliothek .......................................................................25
2.2.2.1. Präparation genomischer DNA aus Neurospora crassa ................................................25
2.2.2.2. Partialrestriktion genomischer DNA und Dephosphorylierung .....................................26
2.2.2.3. Ligation der N. crassa-DNA in den Vektor pLawrist-4 ................................................27
2.2.2.4. Transfektion ...............................................................................................................27
2.2.2.5. Überführung von Klonen in Mikrotiterplatten..............................................................27
2.2.3. Herstellung von DNA-Filtern .............................................................................................28
2.2.4. Selektion Chromosom II- bzw. V spezifischer Cosmid-Bibliotheken ...................................29
Inhaltsverzeichnis
II
2.2.5. Selektion einer Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek ..............................................30
2.2.6. Präparation von Cosmid-DNA............................................................................................30
2.2.7. Präparation von BAC-DNA................................................................................................31
2.2.8. Hybridisierung mit radioaktiv markierter DNA...................................................................32
2.2.8.1. Radioaktive Markierung der DNA...............................................................................32
2.2.8.2. Hybridisierung der radioaktiv markierten Sonden ........................................................32
2.2.8.3. Autoradiographien ......................................................................................................33
2.2.8.4. Regeneration der Filter................................................................................................33
2.2.9. Hybridisierung mit Digoxigenin-markierter DNA ...............................................................33
2.2.9.1. Markierung von DNA mit Digoxigenin .......................................................................33
2.2.9.2. Hybridisierung der mit Digoxigenin markierten DNA..................................................33
2.2.9.3. Chemilumineszente Signaldetektion mit CSPD®.........................................................34
2.2.9.4. Regeneration der Filter................................................................................................34
2.2.10. Analyse der Hybridisierungsdaten ....................................................................................34
2.3. Methoden Genexpressionsanalysen ...........................................................................36
2.3.1. Anzucht und Replikation der cDNA-Bibliothek ..................................................................36
2.3.2. PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek ..........................................................................36
2.3.3. Herstellung heterologer Kontrollen.....................................................................................37
2.3.4. Herstellung der DNA-Chips ...............................................................................................38
2.3.4.1. Beschichtung von Glas-Objektträgern mit Poly-L-Lysin ..............................................38
2.3.4.2. Aufbringen der DNA auf die Chips .............................................................................38
2.3.5. Mycelproben von Neurospora crassa .................................................................................40
2.3.6. Isolierung von RNA aus Neurospora crassa .......................................................................40
2.3.7. Markierung von komplexen Proben durch cDNA-Erststrangsynthese ..................................41
2.3.7.1. Reverse Transkription unter Verwendung von aa-dUTP...............................................41
2.3.7.2. Kupplung von reaktiven Fluoreszenzfarbstoff-Estern an aa-dUTP................................42
2.3.7.3. Photometrische Einbaubestimmung von Cy3/Cy5........................................................42
2.3.8. Hybridisierung auf Glas-Chips ...........................................................................................43
2.3.9. Auswertung der Hybridisierungsdaten ................................................................................45
2.3.9.1. Detektion....................................................................................................................45
2.3.9.2. Quantifizierung der Signalintensitäten mit GenePix™ .................................................45
2.3.9.3. Datenanalyse mit M-Chips..........................................................................................45
3. Ergebnisse .......................................................................................................49
3.1. Physikalische Kartierung ...........................................................................................49
3.1.1. Herstellung der gesamt-genomischen Cosmid-Bibliothek....................................................49
3.1.2. Selektion chromosomenspezifischer Cosmid-Bibliotheken..................................................52
3.1.3. Selektion Chromosom II-spezifische BAC-Bibliothek.........................................................54
3.1.4. Präparation von Cosmid-DNA............................................................................................55
3.1.5. Präparation von BAC-DNA................................................................................................56
Inhaltsverzeichnis
III
3.1.6. Physikalische Kartierung....................................................................................................57
3.1.7. Sequenzanalyse ..................................................................................................................65
3.2. Genexpressionsanalysen.............................................................................................69
3.2.1. PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek ..........................................................................69
3.2.2. Herstellung heterologer Kontrollen.....................................................................................70
3.2.3. Herstellung der DNA-Chips ...............................................................................................71
3.2.4. Isolierung von RNA aus Neurospora crassa .......................................................................72
3.2.5. Generierung der Hybridisierungsdaten................................................................................72
3.2.6. Datenanalyse mit M-Chips .................................................................................................74
3.2.7. Vergleich der Transkriptionsprofile von N. crassa mit S. cerevisisae ...................................76
3.2.8. Genexpression von N.crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien..........................78
4. Diskussion .......................................................................................................90
4.1. Das Neurospora crassa Genom-Projekt .....................................................................91
4.2. Physikalische Kartierung ...........................................................................................92
4.2.1. Verwendete Bibliotheken ...................................................................................................92
4.2.2. Selektion von Sub-Bibliotheken .........................................................................................95
4.2.3. Präparation von BAC-DNA................................................................................................96
4.2.4. Hybridisierungstechniken ...................................................................................................97
4.2.5. Kartierungsstrategie Chromosom V ....................................................................................98
4.2.6. Kartierungsstrategie Chromosom II ..................................................................................100
4.3. Genexpressionsanalysen...........................................................................................101
4.3.1. DNA-Chip-Technologie ...................................................................................................101
4.3.2. Verwendete cDNA-Bibliothek..........................................................................................102
4.3.3. Amplifikation der cDNA-Bibliothek.................................................................................103
4.3.4. Markierungsreaktion ........................................................................................................103
4.3.5. Hybridisierung .................................................................................................................105
4.3.6. Genexpression von N.crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien........................106
4.4. Ausblick ....................................................................................................................110
5. Literaturverzeichnis........................................................................................112
6. Eigene Publikationen.....................................................................................121
7. Lebenslauf ........................................................................................................122
Abkürzungen
1
A) Abkürzungsverzeichnisaa-dUTP Aminoallyl-2´-Desoxyuridin-5´-triphosphatATP Adenosin-5´-triphosphatBAC bacterial artificial chromosomebp BasenpaareBSA Rinderserumalbumin (bovine serume albumine)cDNA komplementäre DNA (complementary DNA)CSPD 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetan-3,2 -(5 chloro)tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan}-4-yl Phenylphosphat
dATP 2´-Desoxyadenosin-5´-triphosphatdCTP 2´-Desoxycytidin-5´-triphosphatDEPC DiethylpyrocarbonatdGTP 2´-Desoxyguanosin-5´-triphosphatDIG-11-dUTP Digoxigenin-11-2´-desoxyuridin-5´-triphosphatDMSO DimethylsulfoxidDNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid )dNTP 2´-Desoxyribonukleosid-5´-triphosphatDTT DithiothreitoldTTP 2´-Desoxythymidin-5´-triphosphatdUTP 2´-Desoxyuridin-5´-triphosphatE. coli Escerichia coliEDTA EthylendiamintetraessigsäureFGSC Fungal Genetic Stock Centerg Grammh Stundekb Kilobasenpaare (= 1000 )l LiterM Molarm~ milli (10-3)Mb Megabasenpaare (=1.000.000 )min MinutemRNA kodierende RNA (messenger RNA)n~ nano (10-9)ORF offener Leserahmen (open reading frame)PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)SDS NatriumdodecylsulfatTris Tris (hydroxymethyl)-aminomethantRNA Transfer-RNAU Einheit (Unit)µ~ Mikro (10-6)
Zusammenfassung
2
B) Zusammenfassung
Der filamentöse Ascomycet Neurospora crassa dient seit mehr als 50 Jahren als Mo-
dellorganismus vor allem für genetische Studien. Um das bisher erlangte Wissen, das in
mehr als 5000 Veröffentlichungen publiziert wurde, für das gesamte Genom zu kom-
plettieren und um daraus tiefere Einblicke in die Biologie von Pilzen gewinnen zu kön-
nen, wurde eine Genom-Initiative ins Leben gerufen, deren erstes Ziel die vollständige
Sequenzierung von N. crassa ist. Das deutsche Neurospora crassa Genom-Projekt, dass
1998 initiiert wurde, machte es sich zur Aufgabe, die Chromosomen II und V, die zu-
sammen etwa ein Drittel der Gesamtsequenz ausmachen, zu sequenzieren.
Die im ersten Teil dieser Arbeit erstellten physikalischen Klonkarten von Chromosom II
und V dienten als Basis für die Sequenzierung. Für die Kartierung wurde zunächst eine
genomische Cosmid-Bibliothek hergestellt, zu der eine bereits bestehende Cosmid-
Bibliothek hinzugefügt wurde, so dass man insgesamt eine 17-fache Abdeckung des
Genoms auf Cosmid-Ebene erreichte. Weiterhin wurde eine genomische BAC-
Bibliothek mit einer 15-fachen statistischen Abdeckung zur Verfügung gestellt. Aus
diesen Bibliotheken wurden zunächst Chromosomen-spezifische Sub-Bibliotheken se-
lektiert. Dazu wurden die Klone der genomischen Bibliotheken in einem hochdichten
Raster auf Nylonmembranen angeordnet. Die Selektion der Cosmid-Sub-Bibliotheken
erfolgte durch Hybridisierung radioaktiv markierter chromosomaler DNA auf die Mem-
branen mit der genomischen Cosmid-Bibliothek. Im Falle der BAC-Sub-Bibliothek
wurden Chromosom-spezifische Cosmide auf die Membranen mit der genomischen
BAC-Bibliothek hybridisiert. Die bei diesen Hybridisierungen positiven BAC-Klone
wurden als Chromosom-spezifisch identifiziert und selektiert.
Ausgehend von den Sub-Bibliotheken wurde die physikalische Kartierung durch Hybri-
disierung begonnen. Die DNA einzelner Klone wurde nach Markierung auf die Mem-
branen der Sub-Bibliotheken hybridisiert, wodurch benachbarte Klone identifiziert wer-
den konnten. Die Anordnung der Klone anhand ihrer Hybridisierungsmuster zu einer
physikalischen Karte erfolgte mit einem Softwarepaket. Um Lücken in den Karten
schliessen zu können, wurden in der Endphase die Hybridisierungen auf die Membra-
nen mit den genomischen Bibliotheken durchgeführt. Die resultierende Karte von
Chromosom II besteht aus 13, die Karte von Chromosom V aus 21 Bereichen zusam-
menhängender Klone. Basierend auf diesen physikalischen Klonkarten wurde die Se-
quenzierung der beiden Chromosomen begonnen.
Zusammenfassung
3
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Genexpressionsanalysen mit Hilfe der DNA-Chip-
Technologie durchgeführt. Die klonierten Fragmente einer zur Verfügung gestellten
cDNA-Bibliothek, die 4700 Klone enthielt, wurden mittels PCR amplifiziert und in ei-
nem hochdichten Raster auf Glas-Chips aufgebracht. Durch Hybridisierung komplexer
RNA-Proben wurden die Transkriptionsprofile für drei verschiedene Wachstumsbedin-
gungen für Mycel von N. crassa erstellt. Zwei Mycel-Proben waren auf Minimalmedi-
um gewachsen, wobei bei einer Probe als Kohlenstoff-Quelle im Minimalmedium Sac-
charose enthalten war, bei der zweiten Probe stattdessen Natriumacetat. Die dritte Probe
war auf sogenanntem Vollmedium gewachsen, dass ausser Saccharose zusätzlich Hefe-
Extrakt und Caseinhydrolysat enthielt. Für den Vergleich der Genexpression wurden
jeweils zwei mRNA-Populationen nach Markierung durch reverse Transkription mit
unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen auf die Chips cohybridisiert. Nach Detektion
und Quantifizierung der Signalintensitäten, die direkt mit der Häufigkeit des entspre-
chenden Transkripts korrelieren, wurden aus dem Verhältnis der Signalintensitäten bei-
der Proben Faktoren für Induktion bzw. Repression der zugehörigen Gene bestimmt.
Die bioinformatische Datenanalyse erfolgte mit einem eigens in der Arbeitsgruppe für
Genexpressionsanalysen auf DNA-Chips entwickelten Programm. Neben der Normali-
sierung der Daten wurde mit dem Programm die Durchführung einer Korrespondenza-
nalyse ermöglicht. Mit dieser Methode wurden die Transkriptionsprofile der drei zu
vergleichenden Proben analysiert und in einem anschaulichen Diagramm visualisiert.
Es konnte gezeigt werden, dass bei Proben, die auf Minimalmedium gewachsen sind,
mehr Stoffwechselwege aktiviert sind als bei Wachstum auf einem nährstoffreichen
Vollmedium. Bei Wachstum auf Acetat-haltigem Medium sind ebenfalls mehr Stoff-
wechselwege induziert, wenn auch vergleichsweise schwächer als in Minimalmedium.
Da Acetat eine unzureichende Nährstoffquelle für N. crassa ist, ist die Stoffwechselak-
tivität insgesamt geringer.
Einleitung
4
1. Einleitung
1.1. Der Modellorganismus Neurospora crassa
1.1.1. Historischer Hintergrund
Der filamentöse Pilz Neurospora crassa wurde bekannt, als mit der „Ein-Gen-ein-
Enzym“-Hypothese (Beadle, 1945) die erste Verbindung zwischen Genen und ihrer
biochemischen Funktion hergestellt wurde. Entdeckt wurde er bereits ein Jahrhundert
früher, als im warmen und feuchten Sommer von 1842 Brot aus den Bäckereien von
Paris mit einem orangen Pilz bedeckt war. Seinen heutigen Namen bekam er 1927 von
Shear und Dodge (Shear & Dodge, 1927). Seit über 50 Jahren gilt er als Modellorga-
nismus, bedingt einerseits durch sein schnelles Wachstum, seine kurze Replikationszeit
und seine hohe Fruchtbarkeit, durch die er routinemässig und unkompliziert im Labor
kultiviert werden kann, aber auch durch andere Vorteile wie eine geringe Chromoso-
menzahl, cytologisch leicht zugängliche Produkte der Meiose oder seine fehlende Pa-
thogenität. Seither wurden zahlreiche genetische und biochemische Studien an Neu-
rospora durchgeführt, die in über 5000 Veröffentlichungen festgehalten wurden. So
wurden beispielsweise mit Neurospora die ersten biochemischen Mutanten isoliert
(Beadle & Tatum 1941) und grundlegende Erkenntnisse über die Rekombination (Mit-
chell, 1955; Catcheside et al., 1964) erhalten. Bis heute wurden über 1000 Gen-Loci
charakterisiert und auf den sieben Chromosomen kartiert (Perkins et al., 2000). Im Fun-
gal Genetic Stock Center (http://www.fgsc.net/) in Kansas, USA, werden mehr als 8000
verschiedene Neurospora-Stämme und -Mutanten gelagert und verwaltet. Gerade in den
letzten Jahren diente Neurospora als einer der führenden Organismen zur Untersuchung
von Photobiologie (Lauter, 1996) und zirkadianem Rhythmus (Bell-Pedersen, 2000;
Dunlap, 1999).
1.1.2. Lebenszyklus
Der Lebenszyklus von Neurospora crassa (Davis, 2000) teilt sich in zwei Stadien auf,
die Haplophase und die Diplophase (siehe Abb.1.1).
Während der Haplophase bilden sich die fadenförmigen Mycelien aus, die vielkernig
Einleitung
5
sind. Das Mycel verzweigt sich in einzelne Hyphen, aus denen durch Abschnürung die
haploiden Macroconidien gebildet werden, die eine intensive orange Farbe haben.
Macroconidien haben einen bis mehrere, am häufigsten jedoch zwei Zellkerne. Die
Macroconidien können bei geeigneten Wachstumsbedingungen wiederum zu Mycelien
auskeimen. Durch einen hydrophoben Protein-Mantel werden die Macroconidien vor
Feuchtigkeit geschützt, wodurch sie schon durch leichte Luftbewegungen weiträumig
verteilt werden können. Daraus kann eine sehr rasche Kolonisierung neuer Bereiche
durch N. crassa resultieren.
Abb. 1.1: Lebenszyklus von N. crassa (Davis, 2000)
Vereinzelt werden während der Haplophase auch einkernige Microconidien gebildet.
Diese enstehen im Gegensatz zu den Macroconidien nicht durch Abschnürung, sondern
werden direkt aus den Zellen der sogenannten Microconidiophoren ausgestossen.
Mitose,Bildung derAscosporen
Ascosporen-Mikrokolonie
keimendeAscospore Vegetative
Hyphen
Ascus mitAscosporen
Meiose II
Meiose I
Zellkern-Fusion
KonjugierteTeilung
AscogonialeHyphen
Diplophase
Haplophase,Bildung der Macroconidien
Conidium desentgegengesetztenPaarungstyps
AscogoniumAscogonium-Zellkern
befruchtender Kern
Einleitung
6
N. crassa als heterothallischer Organismus bildet Mycelien zweier verschiedener Paa-
rungstypen aus, Typ a und Typ A. Der Eintritt in die Diplophase erfolgt, wenn Conidien
des einen Paarungstyps auf Mycel des anderen Paarungstyps treffen. Bei dem als weib-
lichen Elternteil dienenden Mycel, das sowohl Typ a als auch Typ A sein kann, hat sich
zuvor ein mehrzelliges Protoperithecium ausgebildet. Dieses besteht aus einem Knoten
von Hyphen, die mehrere spezielle Zellen, die Ascogonien, umgeben. Eine der Ascogo-
nien dient als weibliche Keimzelle. Die umliegenden Hyphen bilden eine dichte Schutz-
schicht, durch die, ausgehend von der Keimzelle, eine oder mehrere filamentöse
Trichogynen ragt. Diese Trichogyne wächst Pheromon-gesteuert auf ein Conidium des
entgegengesetzten Paarungstyps zu, bis es zu Kontakt und Zellfusion kommt. Der Zell-
kern des Conidiums wandert nun durch die Trichgyne zum Ascogonium im Inneren des
Protoperitheciums. In dem sich nun vergrössernden Perithecium kommt es zunächst zu
mehreren synchronen mitotischen Teilungen, bevor es durch Verschmelzung von Zell-
kernen entgegengesetzten Paarungstyps zur Ausbildung mehrerer Zygoten kommt. Die
Zygoten befinden sich in sich allmählich ausformenden sackartigen Gebilden, den Asci.
Hier durchlaufen sie zwei meiotische Teilungen mit einer sich anschliessenden mitoti-
schen Teilung, so dass jeder Ascus acht Zellkerne, die Ascosporen, enthält. Die Ascos-
poren sind von einer harten, melanisierten Zellwand umgeben. In einem Perithecium
können 200-400 Asci enthalten sein. Die Perithecien sind zum Schutz ebenfalls mit ei-
ner melanisierten harten Wand umgeben. Unter geeigneten Bedingungen wie z.B. Hit-
zeschock brechen die Asci auf und entlassen die haploiden Ascosporen. Mit dem Kei-
men der Ascosporen zu Mycelien beginnt erneut die Haplophase des Lebenszyklus.
1.1.3. Das Genom von Neurospora crassa
Der Modellorganismus Neurospora crassa gehört zu den filamentösen Ascomyceten,
auch Schlauchpilze genannt.
Abb. 1.2: Phylogenetischer Stammbaum von N.crassa
Überreich: EukaryotenReich: Pilze
Stamm: AscomycetaUnterstamm: Pezizomycotina
Klasse: SordariamycetesOrdnung: Sordariales
Familie: SordariaceaeGattung: Neurospora
Art: crassa
Einleitung
7
Das Genom von N. crassa hat eine Länge von ca. 43 Mb. Der Chromosomensatz ist
haploid, es gibt sieben Chromosomen, von denen das kleinste 4,0 Mb und das grösste
10,3 Mb umfasst (Orbach et al., 1988). Die DNA hat einen GC-Gehalt von durch-
schnittlich 54%, in codierenden Bereichen kann der GC-Gehalt bis zu 64% betragen.
Das Genom beinhaltet etwa 8% repetitive Sequenzen, die meisten davon codieren für
ribosomale RNA oder tRNA (Radford & Parish, 1997). Die Gesamtzahl der Gene von
Neurospora crassa wurde auf 10-12.000 geschätzt (Nelson et al., 1997; Kelkar et al.,
2001). Das Genom von N. crassa ist im Vergleich zum Genom von Saccharomyces
cerevisiae (Goffeau et al., 1997), ebenfalls ein Ascomycet und erster vollständig se-
quenzierter eukaryotischer Organismus, dreimal so gross und besitzt schätzungsweise
1,5 bis 2,2 mal so viele Gene (Braun et al., 2000).
1.1.4. Neurospora crassa Genom-Projekt
Im Jahr 1997 wurde eine internationale Genom-Initiative ins Leben gerufen (Bennett,
1997), deren erstes grosses Ziel die Sequenzierung des Modellorganismus N. crassa ist.
Durch die Entschlüsselung der Sequenz von N. crassa soll die Grundlage geschaffen
werden, um mehr Erkenntnisse über die Biologie von Pilzen zu gewinnen. Denn obwohl
N. crassa selbst keine industrielle und wirtschaftliche Bedeutung hat, ist er phylogene-
tisch sehr nah verwandt mit einigen Pflanzenpathogenen wie Cochliobolus, dem Erreger
von Braunfleckenkrankheit bei Mais, dem weitverbreiteten, u.a. Wurzel- und Stengel-
fäulnis verursachenden Fusarium oder dem Reisbranderreger Magnaporthe grisea.
Durch eine detailierte Sequenzanalyse von N. crassa erhofft man sich, Rückschlüsse auf
diese weniger gut untersuchten Pflanzenpathogene ziehen zu können. Weiterhin soll mit
der Sequenzierung der Grundstein gelegt werden für eine intensive Untersuchung von
Transkriptom und Proteom von N crassa. Dem Genom-Projekt kommt zugute, dass
N. crassa ein bislang schon sehr detailiert untersuchter Organismus ist. Die Grösse des
Genoms sowie die Anzahl und Grösse der einzelnen Chromosomen sind bekannt, eben-
so wie die Loci von mehr als 1000 Genen (Perkins et al., 2000).
Das deutsche Neurospora crassa Genom-Projekt, gefördert von der Deutschen For-
schungsgemeinschaft (DFG), wurde 1998 initiiert. Sein Ziel war es, Chromosom II mit
einer Grösse von 4,6 Mb und Chromosom V mit einer Grösse von 9,2 Mb zu sequenzie-
ren. Dazu wurden zunächst, wie in dieser Arbeit beschrieben, geordnete physikalische
Klon-Karten der beiden Chromosomen erstellt. Aus diesen Karten wurden zum Sequen-
Einleitung
8
zieren Klone ausgewählt, die eine möglichst minimale Überlappung aufweisen, wo-
durch die Redundanz der erzeugten Sequenzdaten deutlich reduziert werden konnte.
Dieses Vorgehen wurde bereits in früheren Sequenzierungs-Projekten erfolgreich an-
gewandt (Schizosaccharomyces pombe : Hoheisel et al., 1993, Saccharomyces cerevi-
siae, Chromosom XII : Scholler et al., 1995).
Die Sequenzierung wurde bei MWG Biotech AG (Ebersberg) durchgeführt, bei MIPS
(Martinsried Institute for Protein Sequences, München) wurden die Sequenzdaten zu-
sammengeführt, annotiert und in einer Datenbank veröffentlicht (Mewes et al., 2000;
MNCDB : "MIPS Neurospora crassa database", http://www.mips.biochem.mpg.de/proj
/neurospora/ ). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt liegen von Chromosom II 3,5 Mb anno-
tierte Sequenzdaten vor, was ca. 76% von Chromosom II entspricht. Es bestehen noch
12 Lücken, ca. 1 Mb des Chromosoms konnte noch nicht erfasst werden. Von Chromo-
som V wurden bisher 4,2 Mb sequenziert und annotiert, was ca. 46% des Chromosoms
entspricht. Hier gibt es noch 14 Lücken, es fehlen an Sequenz noch 5 Mb, von denen
ca. 2 Mb ein hoch-repetetives rRNA-Gencluster beinhalten, das nicht sequenziert wer-
den soll.
Die restlichen Chromosomen sollten in einer Kollaboration mit dem amerikanischen
"Neurospora Genome Project" sequenziert werden. Inzwischen wurde jedoch das ge-
samte Genom im sogenannten "Whole Genome Shotgun"-Verfahren, also ohne vorheri-
ges Kartieren der einzelnen Chromosomen, vom Whitehead Institute Center for Genome
Research (WICGR, Massachusetts, USA) sequenziert. Innerhalb eines halben Jahres
wurden hier knapp über 38 Mb sequenziert und ebenfalls in einer Datenbank öffentlich
zugänglich gemacht (WICGR Neurospora Database, http://www-
genome.wi.mit.edu/annotation/fungi/neurospora/). Der Abschluss der Sequenzierung
und die vollständige Annotation des gesamten Genoms sollen bis Januar 2002 durchge-
führt werden.
1.2. Physikalische Kartierung
Am Anfang fast aller Genomprojekte steht die Sequenzierung des zu untersuchenden
Genoms. Da auch moderne Sequenziergeräte nur DNA-Stücke bis zu 1 kb Länge am
Stück sequenzieren können, muss die genomische DNA zunächst fragmentiert werden.
Die Fragmente werden je nach Grösse in entsprechende Vektoren kloniert und anschlie-
Einleitung
9
ssend sequenziert. Die Erstellung einer physikalischen Karte hilft dabei, die Redundanz
der erzeugten Sequenzdaten zu verringern, da sie eine geordnete, lineare Anordnung der
Fragmente darstellt, aus denen dann zum Sequenzieren diejenigen ausgesucht werden
können, die eine minimale Überlappung aufweisen. Dem gegenüber steht der soge-
nannte "shotgun"-Sequenzierungsansatz, bei dem zufällig ausgewählte Fragmente se-
quenziert werden, die erst nachträglich mit erheblichem Rechenaufwand zur vollständi-
gen Sequenz angeordnet werden. Durch die rein zufällige Auswahl der zu sequenzie-
renden Fragmente wird ein hoher Überschuss an redundanten Daten erzeugt.
Für das Erstellen von physikalischen Karten gibt es im Wesentlichen zwei verschiedene
Methoden:
Bei der älteren Restriktionskartierung werden überlappende Fragmente nach Restrikti-
onshydrolyse und Analyse durch Gelelektrophorese aufgrund der entstandenen Ban-
denmuster identifiziert und geordnet (Coulson et al. 1986). Bei der physikalischen Kar-
tierung durch Hybridisierung, die im Rahmen dieser Arbeit angewendet wurde, werden
überlappende Klone aufgrund ihrer Hybridisierungsmuster angeordnet und zu "contigs"
(von engl. contigous = benachbart; zusammenhängende Bereiche überlappender Frag-
mente) zusammengefasst (Hoheisel et al., 1993; Scholler et al., 1995). Dazu werden die
zu ordnenden Fragmente in einem definierten Raster auf eine Membran aufgebracht.
Als Hybridisierungssonden können die Fragmente selbst, aber auch Oligonukleotide
(Craig et. al., 1990), genetische Marker oder Klone aus anderen Bibliotheken (Hoheisel
& Lehrach, 1993, Aign et al., 2001) dienen. Die Auswahl der Sonden erfolgt zunächst
nach dem als "sampling without replacement" bezeichneten Verfahren (Press et al.,
1988), bei dem nur solche Klone als Sonden ausgewählt werden, die in den vorange-
gangenen Hybridisierungen noch kein positives Hybridisierungssignal erzeugt haben.
Später werden zum Schliessen der Lücken diejenigen Klone als Sonde ausgewählt, die
an contig-Enden liegen, um bestehende contigs zu verlängern oder gar mit anderen con-
tigs verbinden zu können.
Einleitung
10
1.3. DNA-Chip-Technologie
Die DNA-Chips werden je nach Trägermaterial, Art der Nukleinsäuremoleküle und
Mechanismus der Immobilisierung unterschieden in "macroarrays", "microarrays" und
"oligo-arrays" (Granjeaud et al., 1999; DeRisi & Iyer, 1999). Die Terminologie für die
DNA-Chip-Technologie wurde dahingehend definiert, dass die auf dem Chip immobili-
sierte DNA als Sonde bezeichnet wird, auf die die Probe in Form von markierter DNA
oder RNA hybridisiert wird ("The Chipping Forecast", 1999).
In Anlehnung an die von Southern (1975) entwickelten Hybridisierungstechniken be-
stehen macroarrays aus flexiblen Membranen wie Nitrocellulose, Nylon oder Polypro-
pylen, auf die durch mechanische Dispensierung die Sonden in Form von PCR-
Produkten, Plasmid-Klonen oder langen Oligonukleotiden (50-70 bp) (Kane et al.,
2000) aufgebracht werden. Zu den macroarrays gehören deshalb auch die für die physi-
kalische Kartierung durch Hybridisierung verwendeten Klonfilter. Die Bindung der
DNA erfolgt elektrostatisch über die positiv geladene Oberfläche der Membranen.
Durch das poröse Trägermaterial und die dadurch erforderliche grössere Menge an Son-
denmaterial können Raster mit einer Dichte von nicht mehr als 100 Sonden pro cm2
erstellt werden, bei einer Membrangrösse von 22x22 cm entspricht dies ca. 36.000 Son-
denpunkten. Die Hybridisierung muss durch die Grösse und die Porösität der Membra-
nen in relativ grossen Volumina von bis zu 20 ml stattfinden, wodurch die zu hybridi-
sierende Probe stark verdünnt wird. Die Proben sind meist radioaktiv markiert, in selte-
nen Fällen auch chemilumineszent.
Für die Herstellung von microarrays werden feste Trägermaterialien, meist Glas, ver-
wendet. Auch hier werden meist PCR-Produkte, seltener auch Plasmid-Klone oder lan-
ge Oligonukleotide mit Hilfe von Robotern mechanisch in einem definierten, hoch-
dichten Raster aufgebracht. Die Glasoberfläche ist derart modifiziert, dass die Nuklein-
säuremoleküle entweder kovalent gebunden werden oder nicht-kovalent durch La-
dungswechselwirkungen an der Oberfläche haften. Für diese nicht-poröse Trägermatrix
sind im Gegensatz zu den porösen Membranen der macroarrays geringere Mengen an
Sondenmaterial erforderlich. Dadurch und durch die Verwendung von Fluoreszenz-
markierten Hybridisierungsproben, die mit hochauflösenden CCD-Kameras oder konfo-
calen Lasermikroskopen detektiert werden können, wurde eine Miniaturisierung der
microarrays gegenüber den macroarrays erreicht. Die Raster der microarrays können
eine Dichte von bis zu 2000 Sondenpunkten pro cm2 erreichen. Die Grösse der verwen-
Einleitung
11
deten Glas-Chips beträgt üblicherweise 25x75 mm. Die Hybridisierung kann daher in
sehr kleinen Volumina von 10-40 µl durchgeführt werden, meist unter einem Deckglas,
wodurch eine hohe Probenkonzentration und somit eine verstärkte Sensitivität erreicht
wird.
Die sogenannten oligoarrays sind eine Untergruppe der microarrays und unterscheiden
sich von diesen dadurch, dass die Sonden in Form von kurzen Oligonukleotiden in situ
auf der Chip-Oberfläche, die meistens aus Glas besteht, synthetisiert werden. Die Syn-
these erfolgt photolithographisch oder nasschemisch, wobei die Oligonukleotide
schrittweise um jeweils ein Nukleotid verlängert werden (Fodor et al., 1991; Maskos
und Southern, 1992; Lipshutz et al., 1999). Die höchsten Rasterdichten werden zur Zeit
durch photolithographische Verfahren erreicht. So werden beispielsweise bei Affyme-
trix Raster mit einer Dichte von bis zu 400.000 Oligonukleotiden auf einer Fläche von
1,6 cm2 synthetisiert (Schena et al., 1998; http://www.affymetrix.com). Da jeder Syn-
theseschritt eine Ausbeute von nur ca. 95% hat, werden vorzugsweise Oligonukleotide
synthetisiert, die maximal eine Basenlänge von 20-30 bp haben, da bei längeren Oligo-
nukleotiden die Rate unvollständiger Sequenzen zu stark ansteigen würde. Da bei die-
sen kurzen Oligonukleotiden die Spezifität für ein Gen nicht immer gewährleiset ist,
werden meist mehrere verschiedene Oligonukleotide für ein Gen ausgewählt, die das
Gen über seine Länge hinweg abdecken. Ausserdem wird zur besseren Differenzierung
von unspezifischen Kreuzhybridisierungen zu jedem der Sequenz exakt entsprechenden
Oligonukleotid („perfect match“) ein zweites Oligonukleotid synthetisiert, das in der
Mittelposition ein sequenzfremdes Nukleotid enthält („mismatch“). Die oligoarrays
werden ausser für Genexpressionsanalysen vorallem auch für die Detektion von SNPs
(single nucleotide polymorphism) eingesetzt.
Einleitung
12
1.4. Genexpressionsanalysen
Die Untersuchung von Genexpression mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie basiert auf
der Hybridisierung von mRNA auf ein hochdichtes Raster von immobilisierten Nu-
kleinsäuremolekülen, die mit den Sequenzen der zu untersuchenden Gene korrelieren.
Im Gegensatz zu älteren Techniken wie dem "Northern Blot", bei dem nur einzelne Ge-
ne analysiert werden können, ist es mit der DNA-Chip-Technologie möglich, die
Genexpression von mehreren tausend Genen gleichzeitig zu untersuchen (Brown &
Botstein, 1999; Lockhart & Winzeler, 2000).
Die für Genexpressionsanalysen verwendeten DNA-Chips basieren häufig auf cDNA-
Bibliotheken. Mittels PCR werden die klonierten cDNA-Fragmente amplifiziert, die
PCR-Produkte werden anschliessend auf Chips aufgebracht. Alternativ werden auch
oligoarrays mit bis zu 25 bp langen Oligonukleotiden verwendet, seltener sind micro-
arrays im Einsatz, auf die synthetisierte Oligonukleotide mit einer Länge von 50-70 bp
aufgebracht wurden. Ein Vorteil in der Verwendung von cDNA-Bibliotheken für
Genexpressionsanalysen liegt darin, dass weder die Sequenz des zu untersuchenden
Genoms, noch nähere Informationen über einzelne Gene bekannt sein müssen. Dadurch
ist es aber nicht möglich, zwischen eventuell vorhandenen Spleiss-Varianten einzelner
Gene zu differenzieren. Ist die Sequenz des Genoms bekannt, können gezielt Primer-
Paare für eine Amplifikation oder lange Oligonukleotide ausgewählt werden, mit denen
ganz spezielle Fragestellungen beantwortet werden können. Auch bei der Verwendung
oligoarrays muss die Sequenz des zu analysierenden Genoms bekannt sein.
Für die Hybridisierung wird die RNA als komplexe Probe markiert, sie enthält also jede
in dem zu untersuchenden biologischen Material vorhandene mRNA-Spezies entspre-
chend ihrer Transkriptmenge. Je höher die Expression eines Gens ist, desto grösser ist
sein Anteil in der markierten RNA und desto stärker ist das zugehörige Hybridisie-
rungssignal (Freeman et al., 2000; Schena et al., 1995). Werden für die Markierung
zweier Proben unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die aufgrund ihrer
Exzitations- und Emissionsspektren unabhängig voneinander detektiert werden können,
ist die kompetitive Hybridisierung dieser beiden Proben möglich. Dazu werden die zu
vergleichenden Zellzustände, respektive deren mRNA-Populationen, mit unterschiedli-
chen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und parallel auf einen Chip hybridisiert. Diese
zwei Zellzustände können somit in einer einzelnen Hybridisierung direkt quantitativ
miteinander verglichen werden.
Einleitung
13
Abb. 1.3: Genexpressionsanalysen mittels DNA-Chip-Technologie (Duggan et al., 1999). A) Zwei zuvergleichende RNA-Proben werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen mar-kiert und gemeinsam auf einen Chip cohybridisert. B) Nach sukzessiver Anregung undDetektion der beiden Farbstoffe werden die erhaltenen Bilder als Falschfarbendarstel-lung übereinandergelegt.
Bei radioaktiver Markierung der Proben können die Hybridisierungen der verschiede-
nen Proben nur einzeln erfolgen, die Signalintensitäten müssen dann von Chip zu Chip
verglichen werden.
In beiden Fällen schliesst sich an die Detektion und Quantifizierung der durch die Hy-
bridisierung erhaltenen Signalintensitäten eine ausführliche bioinformatische Datena-
nalyse an (Schuchhardt et al., 2000; Schadt et al., 2000; Tseng et al., 2001). Dabei wer-
den die Daten zunächst normalisiert, um Hybridisierungen direkt miteinander ver-
gleichbar zu machen. Unterschiede zwischen einzelnen Hybridisierungen, die eine
Normalisierung erforderlich machen, können hervorgerufen werden durch ungleiche
Ausgangsmengen von RNA oder cDNA, abweichende Effizienz der Markierungsreakti-
on, Unterschiede in der Hybridisierungseffizienz oder dem abweichenden Verhalten der
beiden Fluoreszenzfarbstoffe bei Markierung und Detektion. Da die Experimente zur
statistischen Validierung der Ergebnisse meist mehrmals wiederholt werden (Lee et al.,
2000), muss auch bei kompetitiven Hybridisierungen nicht nur eine Normalisierung
innerhalb des Chips erfolgen, sondern auch zwischen verschiedenen Chips.
Wird in einem Experiment nur ein Zellzustand mit einem Kontrollzustand verglichen,
können die Ergebnisse der Datenanalyse in einem zweidimensionalen Koordinatensy-
ExzitationLaser 2Laser 1
Emission
Datenanalyse
Darstellung inFalschfarben
Kombination derFalschfarbenbilder
cDNA-Bibliothek Referenz
PCR-Amplifikation
Hybridisierungder Probe aufden Chip
RNA
Spotten auf Glas
ReverseTranskription
Markierungmit
Fluoreszenz
Test
A) B)
Einleitung
14
stem dargestellt werden (Beißbarth et al., 2000). Die normalisierten Signalintensitäten
des einen Zellzustands werden gegen die normalisierten Signalintensitäten des Kon-
trollzustands aufgetragen (Abb. 1.4). Der Faktor für Induktion bzw. Repression eines
Gens ergibt sich, indem die Signalintensitäten beider Bedingungen für dieses Gen ins
Verhältnis gesetzt werden (DeRisi et al., 1996; Chen et al.,1997). Gene, die unter bei-
den Bedingungen gleich stark exprimiert werden, liegen in dem Koordinatensystem
entlang der Winkelhalbierenden mit der Steigung eins. Gene, die in dem zu untersu-
chenden Zellzustand stärker exprimiert werden als unter der Kontrollbedingung, liegen
oberhalb, Gene, die schwächer exprimiert werden, liegen unterhalb dieser Diagonale.
Abb. 1.4: Darstellung der Genexpression zweier zu vergleichender RNA-Proben im Diagramm
In dieser Arbeit wurde zur Normalisierung und Datenanalyse die Software M-Chips
(Fellenberg et al., eingereicht) verwendet, die eigens für diesen Zweck entwickelt wur-
de. Ein Bestandteil dieser Software ist die Korrespondenzanalyse (Greenacre, 1984).
Mit diesem Algorithmus, der seinen Ursprung in der Soziologie hat und nun speziell auf
die Datenanalyse von Genexpressionsstudien mittels DNA-Chiptechnologie angepasst
wurde, werden die Gene als Vektoren in einem multidimensionalen Raum dargestellt.
Die Anzahl der Dimensionen entspricht der Anzahl der untersuchten Bedingungen.
Ebenso wird jede Bedingung in einem multidimensionalen Raum dargestellt. Hier ergibt
sich die Anzahl der Dimensionen aus der Anzahl der untersuchten Gene. Beide Räume
werden anschliessend mit minimalem Informationsverlust kombiniert auf eine einzelne
Signalintensitäten
Kontrolle
Gene, die im untersuchten Zellzustand
gleich stark exprimiert werden wie im
Kontrollzustand
Gene, die im untersuchten Zellzustand
stärker exprimiert werden als im Kontroll-
zustand
Gene, die im untersuchten Zellzustand
schwächer exprimiert werden als im
Kontrollzustand
Signalintensitäten
Zellzustand 1
Einleitung
15
zweidimensionale Ebene projeziert. Induktion bzw. Repression der Gene kann nun di-
rekt aus ihrer Lage in der Ebene abgelesen werden. Gene, die im Diagramm dicht bei-
einander liegen, verhalten sich unter den untersuchten Bedingungen gleich oder sehr
ähnlich (Fellenberg et al., 2001).
Material und Methoden
16
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Chemikalien und Biochemikalien
Allgemeine Laborchemikalien Merck, Darmstadt
(Reinheitsgrad: pro analysii
oder höchst möglich) Sigma, Deisenhofen
Serva, Heidelberg
Fluka, Neu-Ulm
Roth, Karlsruhe
[α-32P]-dCTP Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
Adenosin-5´-triphosphat Roche Diagnostics, Mannheim
Agarose Life Technologies, Karlsruhe
Aminoallyl-dUTP Sigma, Deisenhofen
Ampicillin Serva, Heidelberg
Bacto Agar Difco, Detroit, MI, USA
Bacto Tryptone Difco, Detroit, MI, USA
Bacto Yeast Extract Difco, Detroit, MI, USA
Bernsteinsäureanhydrid Fluka, Neu-Ulm
Betain Sigma, Deisenhofen
Blockierungsreagenz Roche Diagnostics, Mannheim
CSPD Roche Diagnostics, Mannheim
Cy3-monoreaktiver Ester Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
Cy5-monoreaktiver Ester Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
DEPC Roth, Karlsruhe
Desoxy-Ribonukleotid-5´-Triphosphate Larova Biochemie GmbH, Teltow
Dextransulfat Sigma, Deisenhofen
Dichlorethan Fluka, Neu-Ulm
DIG-11-dUTP Roche Diagnostics, Mannheim
Material und Methoden
17
Dimethylsulfoxid Fluka, Neu-Ulm
Dithiothreitol Life Technologies, Karlsruhe
Heringsperma-DNA Roche Diagnostics, Mannheim
Hexamer-Nukleotid-Gemisch Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
Kanamycin Serva, Heidelberg
Kresolrot Sigma, Deisenhofen
Natriumdodecylsulfat Merck, Darmstadt
N-Methylimidazol Fluka, Neu-Ulm
Oligo(dT)12-18 Life Technologies, Karlsruhe
Poly-L-Lysin Sigma, Deisenhofen
Rinderserumalbumin Serva, Heidelberg
RotiPhenol, pH 8.0 Roth, Karlsruhe
tRNA Roche Diagnostics, Mannheim
2.1.2. Enzyme
Taq Polymerase wurde aus dem überproduzierenden Stamm DH5α/pTP4 (L. Schalk-
wyk, ICRF, London, UK) isoliert (Pluthero, 1993).
DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment MBI Fermentas, St. Leon-Roth
EcoRI MBI Fermentas, St. Leon-Roth
MboI New England Biolabs, Schwalbach
Proteinase K Roche Diagnostics, Mannheim
Pronase E Serva, Heidelberg
Ribonuklease A Sigma, Deisenhofen
SuperScriptII Life Technologies, Karlsruhe
T4-DNA-Ligase Life Technologies, Karlsruhe
Taq DNA-Polymerase Qiagen, Hilden
Material und Methoden
18
2.1.3. DNA-Längenstandards
Für die Gelelektrophorese wurden folgende Längenstandards verwendet:
SmartLadder (Eurogentec, Brüssel), Banden bei:
200 bp; 400 bp; 600 bp; 800 bp; 1000 bp; 1500 bp; 2000 bp; 2500 bp; 3000 bp;
4000 bp; 5000 bp; 6000 bp; 8000 bp; 10.000 bp.
GeneRuler™ (MBI Fermentas, St. Leon-Roth), Banden bei:
100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 600 bp; 700 bp; 800 bp; 900 bp; 1031 bp;
1200 bp; 1500 bp; 2000 bp; 3000 bp.
2.1.4. Primer für PCR
Alle PCR-Primer wurden von ThermoHybaid, Ulm bezogen. Sie hatten alle die Quali-
tätsstufe "gereinigt durch RP-HPLC".
Die Primer-Sequenzen wurden mit dem Programm "primer3" (http://www-
genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi, Whitehead Institute, USA) ermittelt.
PCR-Primerpaare DNA-Sequenz
T7 5`- TAATACGACTCACTATAGGG –3`T3 5`- AATTAACCCTCACTAAAGGG –3`
rabbit-α-globin-forward 5`- CTCTGAGCAGATCAAAGCCC –3`rabbit-α-globin-reverse 5`- ATATTTGGAGGTCAGCACGG –3`
rabbit-β-globin-forward 5`- GTGAGGAGAAGTCTGCGGTC –3`rabbit-b-globin-reverse 5`- GAAGTCAGATGCTCAAGGGG – 3`
2.1.5. Häufig verwendete Puffer, Medien und Lösungen
DEPC-H2O 1 ml DEPCad 1 l H2O,ÜN bei 37°C inkubieren, autoklavieren
DNA-Auftragspuffer 0,25 % Bromphenolblau0,25 % Xylencyanol
30 % Glycerinin H2O
Medien
Material und Methoden
19
2YT-Medium 1,6 % (w/w) Bacto Tryptone1 % (w/w) Bacto Yeast Extract
0.5 % (w/w) NaCl96.9 % (w/w) H2O
autoklavieren
2YT-Agar 1.5 % (w/w) Bacto Agar1,6 % (w/w) Bacto Tryptone
1 % (w/w) Bacto Yeast Extract0.5 % (w/w) NaCl
96.9 % (w/w) H2Oautoklavieren
10x H.M.F.M.: 3 mM MgSO4 x 7 H2O15 mM Tri-Natriumcitrat x 2 H2O70 mM (NH4)2SO4
55 % (w/v) Glyzerinad 800 ml H2O, autoklavieren
270 mM KH2PO4
130 mM K2HPO4
ad 200 ml H2O, autoklavieren,nach getrenntem Autoklavieren beide Lösungen vereinigen
2YT-F: 2YT10 % 10x H.M.F.M
50x Vogels Medium 150 g Na3-citrat x 5 H2O250 g KH2PO4
100 g NH4NO3
10 g MgSO4 x 7 H2O5 g CaCl2 x 2 H2O
ad 1 l H2O+ 2-3 ml Chloroform
1x Vogels Medium 20 ml 50x Vogels Medium1 ml 10 mg/ml Biotin (in 50% EtOH)1 ml Spurenelemente-Lsg.
autoklavieren
Spurenelemente-Lsg. 5g Citronensäure x 1 H2O5g ZnSO4
1g Fe(NH4)2(SO4)2 x 6 H2O0,25 g CuSO4 x 5 H2O0,05 g MnSo4 x 1 H2O0,05 g H3BO3
0,05 g Na2MoO4 x 4 H2Oad 100 ml H2O+ 1 ml Chloroform
Alkalische Lyse
Material und Methoden
20
Lösung I: 50 mM Glucose25 mM Tris-HCl, pH 8.010 mM EDTA
Lösung II: 0.2 M NaOH1 % SDS
Lösung III: 5 M KOAc2 M HOAc
Hybridisierung auf Klonfilter
Church-Puffer: 0.5 M Na-phosphat, pH 7.27 % (w/w) SDS
1 mM EDTA
Waschpuffer: 40 mM Na2HPO4, pH 7.20.1 % (w/w) SDS
Hybridisierungspuffer: Church-Puffer0.1 mg/ml Fischsperma-DNA
Regenerations-Puffer: 5 mM Na-phosphat0.1 % (w/w) SDS
Radioaktive Markierung von DNA
LS-Mix: 5 �
l Oligo-Puffer OL175
�l TM-Puffer
175 �
l Hepes, pH 6.6
Oligo-Puffer OL: 45 U/ml Primer dN61 mM Tris-HCl, pH 8.01 mM EDTA, pH 8.0
TM-Puffer: 250 mM Tris-HCl, pH 8.025 mM MgCl250 mM β-Mercaptoethanol
Prozessieren von Nylon-Filtern
Denaturierungspuffer: 0.5 M NaOH1.5 M NaCl
Neutralisierungspuffer: 1 M Tris-HCl, pH 7.61.5 M NaCl
Pronase-Puffer: 50 mM EDTA
Material und Methoden
21
100 mM NaCl1% (v/v) Sarcosyl NL-30
50 mM Tris-HCl, pH 8.50.25 mg/ml Pronase (frisch einwiegen!)
Digoxigenin-Detektion mit CSPD®
Maleinsäure-Puffer: 0.1 M Maleinsäure1.15 M NaCl
mit NaOH auf pH 7.5 einstellen,autoklavieren
CSPD®-Waschpuffer : Maleinsäurepuffer0.3% (v/v) Tween 20
10x Blocking: 10% (w/v) Blockierungsreagenzin Maleinsäurepuffer, autoklavieren
Detektionspuffer: 0.1 M Tris-HCl, pH 9.50.1 M NaCl
Antikörper-Verdünnung: Anti-DIG-AP-Konjugate 1:10000in Maleinsäurepuffer
CSPD®-Lösung: CSPD® 1:100in Detektionspuffer
PCR
10x PCR-Puffer 500 mM KCl100 mM Tris-HCl, pH 8,3
2.1.6. Verwendete Chemikaliensätze
Gigapack® III XL Packaging Extract Stratagene, La Jolla, CA, USA
QIAprep® Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden
QIAGEN® Plasmid Mini Kit Qiagen, Hilden
2.1.7. Materialien
Agarplatten, 12x8 cm Nunc, Wiesbaden
Agarplatten, 22x22cm Nunc, Wiesbaden
Autoradiographie-Film Hyperfilm™-MPAmersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
Autoradiographie-Kassetten AGS, Heidelberg
Deckgläschen, 20x20 mm + 20x40 mm Merck Eurolab, Darmstadt
Material und Methoden
22
Eppendorfgefäße, 1.5 ml und 2.0 ml Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg
Falcon, 50 ml und 15 ml Becton Dickinson, Heidelberg
Glas-Chips Menzel, Braunschweig
Hybond™-N+-membranen, 22x22 cm Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
Hybridisierungsflaschen Glasbläser, DKFZ Heidelberg
Hybridisierungskammern Telechem, Sunnyvale, USA
Kimwipes lite Präzisionstücher Roth, Karlsruhe
Lumi-Film Roche Diagnostics, Mannheim
Mikrotiterplatten, 384er Nunc, Wiesbaden
Mikrotiterplatten, 384er Nunc, Wiesbaden
MultiScreen-PCR Platten Millipore, Eschborn
PCR-Mikrotiterplatten, 384er MJ Research, Waltham MA, USA
Pizza-Boxen Genetix, Christchurch, UK
Plastikreplikatoren, 384er, NrX5050 Genetix, Christchurch, UK
Polyfiltronics, 384er Whatman Inc., Clifton, USA
Spotting-Pins SMP3 Telechem, Sunnyvale, USA
UV-Küvette (Uvette) Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg
Whatman 3MM-Papier Bender und Hobein, Bruchsal
2.1.8. Geräte
Heizblock Grant Instruments, Cambridge, UK
Photometer Ultrospec 2000 Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
Roboter "BioGrid" BioRobotics, Cambridge, UK
Rotationsofen H. Saur Laborbedarf, Reutlingen
ScanArray 5000 GSI Lumonics, Unterschleissheim
Schüttler mit Wasserbad "Belly Dancer" CLF Laborgeräte, Emersacker
SDDC-2 MicroArrayer Eurogentec, Darmstadt
Sparc-V-Computer Sun Microsystems, Langen
Thermocycler PTC-200 MJ Research, Waltham MA, USA
UV-Crosslinker UVC 500 Hoefer, San Francisco, USA
Vakuum-Konzentrator H. Saur Laborbedarf, Reutlingen
Videosystem Geldoc 1000 Biorad, München
Zentrifuge "Biofuge pico" Heraeus Instruments, Hanau
Material und Methoden
23
Zentrifuge "Megafuge 1.0R" Heraeus Instruments, Hanau
Zentrifuge, Sorval RC 2-B Dupont Instruments, Bad Homburg
2.1.9. Bibliotheken
2.1.9.1. Genomische Cosmid-Bibliothek
Für die physikalische Kartierung wurde von Dr. J. Arnold (University of Georgia,
Athens, USA) und dem Fungal Genetics Stock Center (FGSC, Kansas, USA) eine ge-
nomische Cosmid-Bibliothek zur Verfügung gestellt, die sich aus zwei Sub-
Bibliotheken zusammensetzt. Die Sub-Bibliotheken unterschieden sich in ihrer Größe
und in den ihnen zugrunde liegenden Klonierungsvektoren.
Tabelle 2.1: Genomische Cosmid-Bibliotheken vom FGSC
Vektor Antibiotika-
Resistenz
Anzahl
Klone
Anzahl
96er PlattenHersteller
pLORIST6Xh Kanamycin 12000 125 H. Kelkar, 2001
pMOcosX Ampicillin 4800 50 M. Orbach, 1994
Die durchschnittliche Insertgrösse beträgt 34 kb (Kelkar et al., 2001), beide Bibliothe-
ken zusammen haben damit eine 13-fache Abdeckung des Genoms von N. crassa.
2.1.9.2. Genomische BAC-Bibliothek
Die genomische BAC-Bibliothek wurde von LION Bioscience (Heidelberg) zur Verfü-
gung gestellt.
Tabelle 2.2: Genomische BAC-Bibliothek
Vektor Antibiotika-
Resistenz
Anzahl
Klone
Anzahl
96er PlattenHersteller
pBeloBACKan Kanamycin 9216 24 LION Bioscience
Die durchschnittliche Insertgrösse, ermittelt aus 20 zufällig ausgewählten Klonen, be-
trägt 69 kb (persönl. Mitteilung, T. Schlüter). Damit ergibt sich für die Bibliothek eine
statistische Abdeckung von 15 Genomäquivalenten.
Material und Methoden
24
2.1.9.3. cDNA-Bibliothek
Vom "Neurospora Genome Project" (University of New Mexico, USA) wurde eine uni-
direktionale cDNA-Bibliothek zur Verfügung gestellt. Sie beinhaltet 4700 Klone und
wurde mit dem Uni-ZAP XR Vektorsystem (Stratagene, La Jolla, USA) hergestellt
(Nelson et al., 1997). Dabei wurde mRNA aus drei verschiedenen Entwicklungsstadien
verwendet, Conidien, Mycel und Perithecium. Für diese drei Sub-Bibliotheken ergaben
sich folgende durchschnittliche Insertgrössen (Nelson et al., 1997):
Tabelle 2.3: Insertgrössen cDNA-Bibliothek
Gewebe Insertgrö-
sseConidien 1,3 kb
Mycel 1,5 kb
Perithecium 1,7 kb
Die bisher ermittelten cDNA-Sequenzen wurden in der Genome Sequence DataBase
(GSDB) des National Center for Genome Resources (NCGR) und unter
http://biology.unm.edu/~ngp/home.html veröffentlicht.
Material und Methoden
25
2.2. Methoden Physikalische Kartierung
2.2.1. Anzucht und Replikation von genomischen Bibliotheken
Die genomische Cosmid-Bibliothek, die freundlicherweise von Dr. J. Arnold (Univer-
sity of Georgia, Athens, USA) und dem FGSC (Kansas, USA) zur Verfügung gestellt
wurde, lag zunächst in insgesamt 175 Mikrotiterplatten im 96er Format vor. Für eine
einfachere Handhabung wurde die Bibliothek mit Hilfe des Roboters "BioGrid" in 384er
Platten repliziert, so dass sich der Umfang der Bibliothek auf 44 Platten reduzierte. Die
Platten waren mit 2YT-F-Medium gefüllt, dem je nach Vektor (siehe 2.1.9.1.) 50 µg/ml
Ampicillin oder 50 µg/ml Kanamycin zugesetzt war. Nach Inkubation bei 37°C für 16 h
wurden durch Animpfen frischer Mikrotiterplatten mit 384er Plastikreplikatoren zwei
Kopien der Bibliothek erstellt, die ebenfalls über Nacht bei 37°C inkubiert wurden. Die
Bibliotheken wurden bei -80°C gelagert. Die Benennung der Klone erfolgte entspre-
chend ihrer Positionierung in den Koordinaten der 384er Mikrotiterplatten.
Die genomische BAC-Bibliothek, die von der Firma LION Bioscience (Heidelberg) zur
Verfügung gestellt wurde, lag in 24 Mikrotiterplatten im 384er Format vor. Mit Hilfe
des Roboters "BioGrid" wurde die Bibliothek sechsmal in mit 2YT-F-Medium und
30 µg/ml Kanamycin gefüllte 384er Mikrotiterplatten kopiert. Nach Inkubation für 16 h
bei 37°C wurden die Platten bei -80°C gelagert.
2.2.2. Herstellung genomische Cosmid-Bibliothek
Zusätzlich zu der Cosmid-Bibliothek vom FGSC (Kansas, USA) wurde eine weitere
Cosmid-Bibliothek hergestellt. Als Klonierungsvektor diente hierbei pLawrist4.
2.2.2.1. Präparation genomischer DNA aus Neurospora crassa
Als Material für die Präparation hoch-molekularer genomischer DNA aus Neurospora
crassa diente bei -80°C gefrorenes Mycel vom Wildtypstamm 74-OR23-1A, das
freundlicherweise von Dr. U. Schulte (Uni Düsseldorf) zur Verfügung gestellt wurde.
Zunächst wurde ein 500 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml TEN9 (100 mM EDTA,
50 mM Tris-HCl, pH 9.0, 200 mM NaCl) und 100 µg/ml RNase A bereit gestellt.
Etwa 2 g gefrorenes Mycel wurden in einem sterilen Mörser, der auf -80°C vorgekühlt
Material und Methoden
26
war, unter Zugabe von flüssigem Stickstoff pulverisiert und sofort unter vorsichtigem
Schwenken portionsweise mit einem vorgekühlten Löffel in den Erlenmeyerkolben
überführt. Die Lösung wurde in ein 50 ml Falcon-Reaktionsgefäß gefüllt, mehrmals
vorsichtig invertiert und 10 min bei 30 rpm auf dem Rollschüttler bewegt. Nach Zugabe
von 1 ml 20 %igem SDS folgten nach mehrmaligem Invertieren weitere 10 min auf dem
Rollschüttler bei 30 rpm. Anschließend wurde 1 ml 10 mg/ml Proteinase K zugegeben
und die Lösung über Nacht bei 37°C auf dem Rollschüttler bei 30 rpm inkubiert. Die
Lösung wurde 10 min bei 3000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit
20 ml Phenol, pH 8.0, versetzt, zwei Stunden bei 30 rpm geschüttelt und anschliessend
10 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Mit der wässrigen Phase wurde die Phenol-
Extraktion wiederholt und anschliessend 20 min bei 9000 rpm und 25°C zentrifugiert.
Der Überstand wurde zur Fällung mit dem 0.8-fachen Volumen Isopropanol und dem
0.1-fachen Volumen 3 M NaOAc versetzt. Nach 20 min Zentrifugation bei 9000 rpm
und 4°C wurde das DNA-Sediment in 400 µl H2O gelöst. Zur Kontrolle wurde ein Ali-
quot der DNA auf einem Agarosegel überprüft, die Bestimmung der Konzentration er-
folgte photometrisch oder fluorimetrisch.
2.2.2.2. Partialrestriktion genomischer DNA und Dephosphorylierung
35 µg genomische DNA von N. crassa wurden in einem Endvolumen von 200 µl
1x NEB-4-Puffer mit 5 U MboI bei 37°C hydrolysiert. Nach 1 min, 2 min, 3 min, 4 min,
5 min, 8 min, 30 min und 60 min wurden Aliquots von je 25 µl entnommen; die Re-
striktionshydrolyse wurde in den Aliquots durch Zugabe von je 25 µl 0.5 M EDTA und
anschliessender Inkubation bei 68°C für 10 min gestoppt.
Nach einer Phenol- und einer Chloroform/Isoamylalkohol (24:1)-Extraktion mit jeweils
gleichen Volumina wurde die DNA durch Zugabe vom 0.1-fachen Volumen 5 M NaCl
und dem 2.5-fachen Volumen Ethanol gefällt. Nach einer Zentrifugation bei 15000 rpm
und 4°C für 20 min wurde das DNA-Sediment in 44 µl H2O gelöst.
Die DNA-Lösung wurde mit 5 µl 10x NEB-4-Puffer und 1 µl alkalischer Phosphatase
versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch 10 minütiges Inkubieren
bei 70°C gestoppt. Zur vollständigen Inaktivierung der alkalischen Phosphatase wurden
zum Reaktionsansatz 2 µl 0.5 M EDTA, 2 µl 20% SDS und 2 µl 10 mg/ml Proteinase K
gegeben und 30 min bei 56°C inkubiert. Nach Phenol- und Chloroform/Isoamylalkohol
(24:1)-Extraktion mit anschliessender Ethanol-Fällung und Zentrifugation (siehe oben)
Material und Methoden
27
wurde die DNA in 16 µl H2O aufgenommen. Ein Aliquot der Partialrestriktionsansätze
wurde auf einem Agarosegel überprüft.
2.2.2.3. Ligation der N. crassa-DNA in den Vektor pLawrist-4
5 µl aus den Partialrestriktionsansätzen wurden in einem Endvolumen von 15 µl 1x T4-
DNA-Ligasepuffer mit 2 µg pLawrist-4 Vektorarmen, 4 mM ATP und 1 µl T4-DNA-
Ligase (1U/µl ) über Nacht bei 16°C ligiert. Die Lagerung der Ligationsprodukte er-
folgte bei 4°C für maximal 4 Wochen.
2.2.2.4. Transfektion
Die Transfektion der Ligationsprodukte in E. coli DH5α erfolgte mit dem Gigapack®
III XL Packaging Extract nach Anweisungen des Herstellers. Je 600 µl des Transfekti-
onsansatzes wurden auf 2YT/Kanamycin (30 µg/ml)- Agarplatten (22x22 cm) ausge-
strichen und für 12-16 h bei 37 °C inkubiert.
2.2.2.5. Überführung von Klonen in Mikrotiterplatten
Mit Hilfe von sterilen Zahnstochern wurden einzelne Kolonien in 384er Mikrotiterplat-
ten überführt, die zuvor mit 2YT-F-Medium und 30 µg/ml Kanamycin befüllt worden
waren. Die Platten wurden bis zu 24 h bei 37°C inkubiert. Durch Animpfen frischer
Mikrotiterplatten mit 384er Plastikreplikatoren wurden zwei Kopien der Bibliothek er-
stellt. Die Lagerung der Bibliothek erfolgte bei -80°C.
Material und Methoden
28
2.2.3. Herstellung von DNA-Filtern
Zunächst wurden Hybond N+-Membranen luftblasenfrei auf mit 300 ml
2YT/Antibiotikum-Agar gefüllte Nunc-Schalen (22x22 cm) gelegt. Der Transfer der
Klone auf die Filter erfolgte mit Hilfe des Roboters "BioGrid", der das Erstellen eines
hochdichten Rasters mit bis zu 70 Klonen pro cm2 ermöglichte. Ein 384er Metallnadel-
replikator brachte jeden Klon doppelt in einer definierten Anordnung auf die Filter auf.
Je nach Anzahl der Klone können verschiedene Raster gewählt werden, in der vorlie-
genden Arbeit wurde meist das 4x4-Raster, aber auch das 2x2-Raster verwendet. Dabei
wird der Filter in 6 Felder unterteilt, jedes 7x11 cm gross, entsprechend der Grösse ei-
ner Mikrotiterplatte und somit des Metallnadelreplikators.
Abb. 2.1: Raster, in dem die Klone auf die Filter aufgebracht werden. A): Einteilung des Filters in6 Felder, B) Ansicht eines Feldes mit der Koordinatenbenennung mit Anordnung derdoppelt aufgebrachten Klone im C) 4x4-Raster oder D) 2x2-Raster
1 2
Feld 1
Feld 3
Feld 2
Feld 4
Feld 5 Feld 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 2417
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
1 2 3 4
5 6 7 8
A)
C) D)
B)
Material und Methoden
29
Wird in Abhängigkeit der zu transferierenden Klon-Bibliothek nicht die gesamte Filter-
grösse beansprucht, können bis zu sechs Kopien einer Bibliothek auf die sechs Felder
eines Filters transferiert werden, die nach der anschliessenden Prozessierung mit einem
Skalpell in einzelne Filter zerschnitten werden.
Anschliessend wurden die Agar-Platten mit den Membranen über Nacht bei 37°C inku-
biert. Die Inkubationszeit wurde dabei so gewählt, dass die Kolonien zwar möglichst
gross wurden, benachbarte Kolonien aber noch deutlich voneinander getrennt waren.
Die DNA wurde in situ auf dem Filter gebunden (Hoheisel et al., 1991). Dazu wurden
die Filter zunächst zweimal für je 4 min auf mit Denaturierungspuffer getränktem
Whatman 3MM-Papier bei Raumtemperatur inkubiert, anschliessend wurden die Filter
für mindestens 5 min auf ein mit Neutralisierungspuffer getränktes Whatman 3MM-
Papier gelegt. Die neutralisierten Filter wurden in 400 ml Pronase-Puffer 1 h bei 37°C
inkubiert, das Einbringen der Filter in den Puffer erfolgte so vorsichtig und langsam,
dass die Filter zwar vollständig von Puffer bedeckt waren, die Kolonien jedoch nicht
abgespült wurden. Anschliessend wurden die Filter auf Whatman 3MM-Papier bei
Raumtemperatur vollständig getrocknet. Die trockenen Filter wurden im Crosslinker
mit UV-Licht mit einer Energie von 1200 x 100 µJ/cm2 bestrahlt, wodurch die DNA
auf den Filtern fixiert wurde. Zwischen den Hybridisierungen wurden die Filter in
Church-Puffer gelagert, zur längerfristigen Lagerung wurden sie getrocknet.
2.2.4. Selektion Chromosom II- bzw. V spezifischer Cosmid-Bibliotheken
Zunächst wurden DNA-Filter hergestellt (siehe 2.2.3.), die sowohl die Cosmid-
Bibliothek vom FGSC in den Vektoren pLORIST6Xh und pMOcosX als auch die Cos-
mid-Bibliothek im Vektor pLawrist-4, die im Rahmen dieser Arbeit angefertigt wurde
(siehe 2.2.2.), enthielten. Jeweils 70 ng chromosomale DNA der Chromosomen II und
V, die freundlicherweise von Dr. U. Schulte zur Verfügung gestellt wurde, wurde wie in
2.2.8. beschrieben radioaktiv markiert und auf die Cosmid-Filter hybridisert. Die Aus-
wertung der Autoradiographien erfolgte manuell. Frische Mikrotiterplatten wurden mit
Hilfe von sterilen Zahnstochern mit den Cosmid-Klonen, die positive Signale zeigten,
angeimpft, von den chromosomenspezifischen Bibliotheken wurden je 3 Kopien ange-
legt (2.2.1.).
Material und Methoden
30
2.2.5. Selektion einer Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek
Zur Selektion einer Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek wurden zunächst
DNA-Filter mit der gesamten BAC-Bibliothek hergestellt (2.2.3.). Auf diese wurde
DNA von Cosmid-Klonen, die schon, wie in 2.2.4. beschrieben, als Chromosom-II-
spezifisch identifiziert worden waren, hybridisiert. Die Markierung der DNA erfolgte
unter Verwendung von Digoxigenin (2.2.9.). Die Klone wurden entweder einzeln oder
in Gruppen von zwei oder drei Klonen hybridisiert. Die BAC-Klone mit positivem Hy-
bridisierungssignal wurden in frische Mikrotiterplatten transferiert, die Platten wurden
anschliessend mehrfach kopiert (2.2.1).
2.2.6. Präparation von Cosmid-DNA
Die Präparation von Cosmid-DNA erfolgte durch alkalische Lyse (Birnboim & Doly,
1979). Flüssigkulturen wurden durch Animpfen von je 5 ml 2YT-Medium und 30 µg/ml
Kanamycin bzw. 50 µg/ml Ampicillin mit Bakterienklonen angelegt und 16 h bei 37 °C
unter Schütteln bei 220 rpm inkubiert. Die Kulturen wurden 10 min bei 4000 rpm zen-
trifugiert, die sedimentierten Zellen wurden in 100 µl Lösung I resuspendiert, in ein
1.5 ml Eppendorfgefäss überführt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschlie-
ssend wurden zur alkalischen Lyse 200 µl Lösung II zugegeben, vorsichtig gemischt
und 5 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 150 µl Lösung III wurde 15 min auf Eis
inkubiert, anschliessend wurden die festen Zellbestandteile 10 min bei 13000 rpm ab-
zentrifugiert. Zur Entfernung von RNA wurde der Überstand mit 10 µl 10 mg/ml RNase
A versetzt und mindestens 1 h bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde zunächst mit dem
gleichen Volumen Phenol, pH 8.0, anschliessend mit dem gleichen Volumen Chloro-
form/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Durch Zugabe vom 2.5-fachen Volumen Ethanol
und dem 0.1-fachen Volumen 3 M NaOAc, pH 5.2 wurde die DNA bei -70°C für min-
destens 30 min gefällt. Nach Abzentrifugation für 30 min bei 13000 rpm, Waschen mit
70 %igem Ethanol und Trocknen wurde die DNA in 50 µl H2O gelöst. Zur Überprüfung
der DNA-Qualität durch Restriktionsanalyse wurden 3 µl der DNA-Lösung mit 0.5 µl
EcoRI, 1 µl 10x EcoRI-Puffer und 5.5 µl H2O versetzt, 1 h bei 37°C inkubiert und auf
einem 1 %igem Agarosegel überprüft.
Material und Methoden
31
2.2.7. Präparation von BAC-DNA
Die Präparation von BAC-DNA erfolgte nach einem modifiziertem Protokoll des QIA-
prep® Spin Miniprep Kits. Verwendet wurden die vom Hersteller gelieferten Säulen und
Puffer, lediglich Puffer N3 wurde durch den Puffer P3 aus dem QIAGEN® Plasmid Mini
Kit ersetzt. Zunächst wurden Flüssigkulturen angelegt, indem 7 ml 2YT-Medium und
30 µg/ml Kanamycin mit Hilfe eines Zahnstochers mit Bakterienklonen aus der gefro-
renen Bibliothek angeimpft wurden und ca. 16 h bei 37°C unter Schütteln bei 220 rpm
inkubiert wurden. Die Bakterienzellen wurden durch 20 minütige Zentrifugation bei
4000 rpm sedimentiert. Um die Ausbeute an BAC-DNA zu maximieren, erwies es sich
als unerlässlich, die Resuspension der Zellen in Puffer P1, die Lyse der Zellen in Puffer
P2 und die Neutralisation des Lysats mit Puffer P3 für jeden Klon direkt nacheinander
und ohne Verzögerung durchzuführen und nicht etwa bei der parallelen Präparation
vieler Klone zunächst alle mit Puffer P1, dann alle mit Puffer P2 und anschliessend alle
mit Puffer P3 zu behandeln, wie dies z.B. bei Plasmid- oder auch Cosmid-Präparationen
möglich ist.
Das Zellsediment wurde in 250 µl Puffer P1 und 200 µg/ml RNase A resupendiert und
in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss überführt. Nach sofortiger Zugabe von 250 µl
Puffer P2 und Mischen durch mehrmaliges Invertieren wurden 350 µl Puffer P3 zuge-
geben und vorsichtig gemischt. Nach Zentrifugation für 10 min bei 13000 rpm wurde
der Überstand durch Zugabe von 590 µl Isopropanol 30 min bei -20°C gefällt. Die DNA
wurde 30 min bei 13000 rpm zentrifugiert, mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen
und nach Trocknen bei Raumtemperatur in 26 µl H2O aufgenommen. Nach der Zugabe
von 3 µl 10x EcoRI-Puffer und 0.5 µl EcoRI wurde 1 h bei 37°C inkubiert. Der Re-
striktionsansatz wurde mit 150 µl Puffer PB versetzt und auf die QIAprep®-Säule auf-
getragen. Die Säule wurde 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert und der Durchfluss ver-
worfen. Anschliessend wurde die Säule mit 750 µl Puffer PE gewaschen, 1 min zentri-
fugiert, und nach Verwerfen des Durchflusses erneut 1 min zentrifugiert. Die Elution
erfolgte mit 30 µl 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, das auf 65°C temperiert worden war. Auf
einem 1 %igem Agarosegel wurden 8 µl des Eluats überprüft.
Material und Methoden
32
2.2.8. Hybridisierung mit radioaktiv markierter DNA
2.2.8.1. Radioaktive Markierung der DNA
Die radioaktive Markierung der Sonden erfolgte nach der Methode des "Random Hexa-
mer Priming" von Feinberg und Vogelstein (1983). Bei dieser Methode wird die DNA
ausgehend von zufälligen Hexamer-Primern mit dem Klenow-Fragment repliziert, wo-
bei durch den Einbau von [α-32P]-dCTP eine radioaktive Markierung erfolgt.
Für die Herstellung von radioaktiv markierten Sonden wurden 20-500 ng Cosmid-DNA
(2.2.6.) in 15 µl H2O 5 min bei 95°C denaturiert, anschliessend sofort auf Eis gekühlt
und mit 18 µl LS-Mix, 0.75 µl 20 mg/ml BSA, 1 µl AGT-dNTP-Mix (je 0.5 M dATP,
dGTP und dTTP), 10 µCi [α-32P]-dCTP und 6 U Klenow-Fragment für mindestens 3 h
bei 37°C inkubiert.
Zur Entfernung nicht eingebauter Nukleotide wurde die DNA durch Zugabe von 2 µl
10 mg/ml tRNA oder Heringsperma-DNA, 2 µl 0.5 M EDTA, 2 µl H2O, 10 µl 3 M
NaOAc und 40 µl Isopropanol 30 min bei -80°C gefällt. Nach Zentrifugation für 30
min bei 13000 rpm wurde das Sediment in 100 µl H2O aufgenommen und direkt in die
Hybridisierung eingesetzt.
2.2.8.2. Hybridisierung der radioaktiv markierten Sonden
Die Hybridisierungen wurden in Glasflaschen (Durchmesser 3.5 cm, Länge 16 cm für
13x8 cm große Filter, Länge 30 cm für 22x22 cm große Filter) in einem beheizbaren
Hybridisierschrank unter ständiger Rotation durchgeführt. Um einen Druckausgleich zu
gewährleisten, waren die Schraubverschlüsse der Glasflaschen in der Mitte durchbohrt.
Die Filter wurden mit der DNA-Seite nach innen luftblasenfrei an die Innenwand der
Flaschen gelegt, je nach Filterzahl und Größe auch überlappend. Zunächst wurde eine
Vorhybridisierung mit 10 ml (kleine Flaschen) bzw. 15 ml (große Flaschen) Hybridisie-
rungspuffer für 2 h bei 65°C durchgeführt. Anschliessend wurde die markierte Sonde
(2.2.8.1.) 5 min bei 95 °C denaturiert, auf Eis gekühlt und direkt in den Hybridisie-
rungspuffer der Vorhybridisierung gegeben. Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C für
12-16 h. Zum Waschen wurden die Filter zunächst einzeln bei Raumtemperatur kurz
mit Waschpuffer gespült. Anschliessend wurden bis zu 20 kleine Filter oder bis zu
5 große Filter gemeinsam in einer Plastikbox in 500 ml Waschpuffer bei 65°C unter
leichtem Schwenken 10-30 min gewaschen.
Material und Methoden
33
2.2.8.3. Autoradiographien
Die gewaschenen Filter wurden auf Whatman 3MM-Papier kurz angetrocknet, luftdicht
in Klarsichtfolie verpackt und für die Autoradiographie in mit Verstärkerfolien versehe-
nen Filmkassetten mit Hyperfilm™-MP-Filmen exponiert. Je nach Menge der gebunde-
nen Radioaktivität, die mit einem Geigerzähler grob abgeschätzt wurde, wurden die
Filme für 2-24 h bei -80°C exponiert. Die Entwicklung der Autoradiographien erfolgte
manuell in Tauchbädern.
2.2.8.4. Regeneration der Filter
Durch zweimaliges Inkubieren in 500 ml Regenerationspuffer für 30 min bei 95°C wur-
den bis zu 5 große oder 20 kleine Filter gleichzeitig regeneriert. Die Lagerung der Filter
zwischen den Hybridisierungen erfolgte in Church-Puffer, oder bei längeren Zeiträumen
in getrockneter Form.
2.2.9. Hybridisierung mit Digoxigenin-markierter DNA
2.2.9.1. Markierung von DNA mit Digoxigenin
Die Markierung von DNA mit Digoxigenin erfolgte ebenfalls nach der Methode des
"Random Hexamer Priming" (2.2.8.1.).
20-500 ng Cosmid- oder BAC-DNA (2.2.6., bzw. 2.2.7.) in 16 µl H2O wurden nach
Zugabe von 18 µl LS-Mix, 1.5 µl 10 mg/ml BSA, 1 µl dNTP-Mix ( je 1 mM dATP,
dGTP und dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP) und 6 U Klenow-Fragment
mindestens 2 h bei 37°C inkubiert. Die markierte DNA wurde durch Zugabe von 4 µl
0.5 M EDTA, 2 µl 10 mg/ml tRNA oder Heringsperma-DNA, 4 µl H2O, 10 µl
3 M NaOAc, pH 6.0 und 10 µl Isopropanol 30 min bei -80°C gefällt. Nach Zentrifugati-
on für 30 min bei 13000 rpm wurde die DNA in 100 µl H2O aufgenommen.
2.2.9.2. Hybridisierung der mit Digoxigenin markierten DNA
Die Vorhybridisierung und Hybridisierung der mit Digoxigenin markierten Sonden er-
folgte analog der Hybridisierung von radioaktiv markierten Sonden wie in 2.2.8.2. be-
schrieben. Zum Waschen der Filter wurde die Hybridisierungslösung verworfen und
durch 15 ml Waschpuffer ersetzt. Die Filter wurden 15 min bei 65°C unter Rotation
gewaschen.
Material und Methoden
34
2.2.9.3. Chemilumineszente Signaldetektion mit CSPD®
Bei den folgenden Schritten wurden jeweils bis zu 5 große oder 16 kleine Filter zusam-
men in einer Plastikbox auf einem Schüttler behandelt. Zunächst wurden die Filter kurz
mit 250 ml CSPD®-Waschpuffer gespült. Nach einer 30-minütigen Inkubation in
250 ml 1 x Blocking-Lösung wurden die Filter für weitere 30 min in 200 ml Antikörper-
Verdünnung (Antidigoxigenin-Alkalische-Phosphatase-Konjugat) inkubiert. Anschlie-
ssend wurden die Filter zweimal je 15 min in 200 ml CSPD®-Waschpuffer gewaschen
und für mindestens 2 min in Detektionspuffer äquilibriert. Die Filter wurden einzeln
1 min in 200 ml CSPD®-Verdünnung inkubiert, anschliessend luftblasenfrei in Plastik-
folie eingeschweisst, wobei überschüssige CSPD®-Lösung durch Reiben aus dem Beu-
tel herausgedrückt wurde. Die Exposition von Röntgenfilmen oder Lumi-Filmen er-
folgte bei 37°C für 2-12 h in Filmkassetten. Die Entwicklung der Filme wurde manuell
in Tauchbädern durchgeführt.
2.2.9.4. Regeneration der Filter
Zur Regeneration wurden bis zu 5 große oder 16 kleine Filter in einer Plastikbox 5 mal
für 5 min mit 300 ml frisch aufgekochtem Regenerationspuffer gewaschen. Zwischen
den Hybridisierungen wurden die Filter in Church-Puffer, bei längeren Zeiträumen in
getrockneter Form aufbewahrt.
2.2.10. Analyse der Hybridisierungsdaten
Die Auswertung der Autoradiographien bzw. der durch Chemilumineszenz belichteten
Filme erfolgte manuell. Für jede verwendete Sonde wurde eine Datei erstellt, die mit
dem Sondennamen benannt wurde. In diesen Dateien waren alle Klonnamen enthalten,
die mit der jeweiligen Sonde ein Hybridisierungssignal ergaben. Diese Dateien dienten
als Ausgangspunkt für die Kartierungs-Software.
Die Kartierung erfolgte mittels des Softwarepaketes "Contig" (Mott et al. 1993,
http://www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/~andy/welcome.html).
Material und Methoden
35
Der folgende Algorithmus berechnet aus den Hybridisierungsmustern Distanzen zwi-
schen allen möglichen Sondenpaar-Kombinationen:
Dab = ( Nab - Pab ) / Nab
mit:Dab = Distanz zwischen den Sonden ´a` und ´b`Nab = Summe der Klone, die mit ´a` oder ´b` hybridisierenPab = Summe der Klone, die mit ´a` und ´b` hybridisieren
Die Werte für alle Sondenpaarkombinationen liegen zwischen 0 und 1. Im Falle eines
identischen Hybridisierungsmusters ergibt sich Dab = 0, im anderen Extrem ergibt sich
für zwei völlig verschiedene Hybridisierungsmuster eine Distanz Dab = 1, die Sonden
sind also mindestens eine Klonlänge voneinander entfernt. Nach der Ermittlung der Di-
stanzen berechnet das Programm in einem als "simulated annealing" bezeichneten Ver-
fahren (Press et al. 1988) eine Sondenanordnung, die den kürzesten Gesamtabstand
aufweist. Anschliessend werden die Klone anhand dieser Sondenreihenfolge angeord-
net, wodurch Bereiche überlappender Klone, sogenannte "contigs" gebildet werden.
Material und Methoden
36
2.3. Methoden Genexpressionsanalysen
2.3.1. Anzucht und Replikation der cDNA-Bibliothek
Die vom "Neurospora Genome Project" (University of New Mexico, USA) zur Verfü-
gung gestellte cDNA-Bibliothek lag zunächst in insgesamt 49 Mikrotiterplatten im
96er-Format vor. Mit Hilfe des Roboters "BioGrid" wurden 3 Kopien der Bibliothek in
je 15 mit 2YT-F-Medium und 50 µg/ml Ampicillin gefüllte 384er Mikrotiterplatten er-
stellt. Nach Inkubation für 16 h bei 37°C wurden die Bibliotheken bei -80°C gelagert.
2.3.2. PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek
Die PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek wurde in 384er Mikrotiterplatten in ei-
nem Reaktionsvolumen von je 25 µl durchgeführt.
Tabelle 2.4: Pipettierschema für die PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek
Reagenzien 1x 25 µµµµl Mix für 384er Platte
400 x 25 µµµµl
Endkonzentration
H2O 12.525 µl 4850 µl
10x PCR-Puffer 2.5 µl 1000 µl 1x
37.5 mM MgCl2 1.5 µl 600 µl 2.25 mM
dNTPs (je 25 mM) 0.2 µl 80 µl 0.2 mM
5 M Betain 7.5 µl 3000 µl 1.5 mM
30 mM Cresolrot 0.075 µl 30 µl 0.09 mM
100 µM Primer T3 0.1 µl 40 µl 0.4 µM
100 µM Primer T7 0.1 µl 40 µl 0.4 µM
Taq-Polymerase 0.1 µl 40 µl
Der Reaktionsmix wurde in der 384er-PCR-Mikrotiterplatte vorgelegt, anschliessend
wurde jeder 25 µl-PCR-Ansatz mit Hilfe steriler 384er Plastikreplikatoren mit Bakteri-
en-DNA aus der cDNA-Klon-Bibliothek angeimpft.
Nach einem ersten Denaturierungsschritt bei 95°C für 5 min folgten 36 Zyklen mit
30 sec bei 95°C, 30 sec bei 52°C und 2 min bei 72°C. Nach einem abschliessenden Po-
Material und Methoden
37
lymerisationsschritt bei 72°C für 10 min wurden die PCR-Ansätze auf 4°C gekühlt.
Je 2,5 µl der PCR-Ansätze wurden anschliessend hinsichtlich der Effizienz der PCR-
Reaktion mittels Gelelektrophorese überprüft.
2.3.3. Herstellung heterologer Kontrollen
Für die Herstellung heterologer Kontrollen, die zusätzlich zur cDNA-Bibliothek auf die
DNA-Chips aufgebracht werden sollten, wurde Globin aus Kaninchen gewählt. Einer-
seits sollte ein Oligonukleotid („rabbitspot3“) mit einer Länge von 80 Basen, dessen
Sequenz aus der Kaninchenglobin-mRNA-Sequenz gewählt wurde, als heterologe Kon-
trolle verwendet werden. Die Sequenz von „rabbitspot3“ wurde mit dem Programm
"primer3" (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi, Whitehead In-
stitute, Massachusetts, USA) ermittelt. Es ist ein 80mer mit einem GC-Gehalt von 50%
und einer theoretischen Schmelztemperatur von 90,4°C. Die Sequenz von „rabbitspot3“
lautet:
5´-GGC AAC GTG CTG GTT GTT GTG CTG TCT CAT CAT TTT GGC AAA GAA
TTC ACT CCT CAG GCA TGC CTA TCA GAA GGT-3´
Weiterhin wurde je ein PCR-Produkt aus α-Globin bzw. β-Globin amplifiziert. Dazu
wurde in einem ersten Schritt aus Kaninchenglobin-mRNA über reverse Transkription
einzelsträngige cDNA hergestellt. 100 ng Kaninchenglobin-mRNA und 1 µg Oli-
go(dT)12-18 wurden in einem Volumen von 11 µl H2O mit 1 µl dNTP-Mix (je 10 mM
dATP, dCTP, dGTP, dTTP) versetzt und 10 min bei 65°C inkubiert. Der Ansatz wurde
auf Eis gestellt, kurz zentrifugiert und mit 4 µl 5x Reaktionspuffer, 2 µl 0.1 M DTT,
1 µl Rnasin und 1 µl SuperScript II (200 U/µl) versetzt. Nach Inkubation für 1 h bei
42°C wurde die Reaktion bei –20°C gestoppt. Der Ansatz wurde mit 1 µl Rnase I ver-
setzt und 15 min bei 37°C inkubiert. Die resultierende einzelsträngige cDNA diente als
Matrize in der nun folgenden PCR-Reaktion. Die PCR wurde in 96er Mikrotiterplatten
durchgeführt, mit einem Reaktionsvolumen von je 50 µl. Für eine Reaktion wurden 5 µl
10x PCR-Puffer (Qiagen), 1 µl dNTP-Mix (je 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 µl
10 µM forward-Primer, 1 µl 10 µM reverse-Primer, 0.4 µl Taq-Polymerase (Qiagen)
und 39.6 µl H2O mit 0.2 µl cDNA (siehe oben) versetzt. Nach einer anfänglichen De-
naturierung für 3 min bei 94°C wurden 35 Zyklen mit 1 min bei 94°C, 30 sec bei 54°C
Material und Methoden
38
und 1 min bei 72°C durchlaufen. Nach einem weiteren Polymerisationsschritt für
10 min bei 72°C wurde auf 4°C gekühlt. In einem 1%igem Agarosegel wurden die
PCR-Produkte auf Qualität und Grösse überprüft. Die Reinung der PCR-Produkte er-
folgte mit MultiScreen-PCR-Reinigungsplatten. Die Konzentration der PCR-Produkte
wurde fluorimetrisch bestimmt. Anschliessend wurden mit 3x SSC/1.5 M Betain Lö-
sungen mit 300 ng/µl, 200 ng/µl und 100 ng/µl hergestellt.
2.3.4. Herstellung der DNA-Chips
2.3.4.1. Beschichtung von Glas-Objektträgern mit Poly-L-Lysin
Die Beschichtung der Objekträger mit Poly-L-Lysin wurde von Achim Stephan nach
einem in Stanford entwickelten Protokoll (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/
index.html) durchgeführt. Zunächst wurden je 20 Objektträger zusammen in einem Pla-
stikhalter kurz in EtOH gewaschen. Alle weiteren Schritte erfolgten bei Raumtempera-
tur auf dem Schüttler, dabei wurden je 40 Objektträger parallel in Plastikbehältern in
einem Volumen von 400 ml behandelt. Im ersten Schritt wurde die Glasoberfläche mit
10 %iger NaOH angeätzt, zunächst 1 h auf dem Schüttler, anschliessend 15 min im Ul-
traschallbad. Anschliessend wurden die Objektträger 3-4mal mit H2O gewaschen, um
Reste von NaOH gründlich zu entfernen. Zur Beschichtung wurden die Objektträger
60 min auf dem Schüttler und 15 min im Ultraschallbad in einer Lösung aus 40 ml Po-
ly-L-Lysinlösung, 40 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,
2 mM KH2PO4) und 320 ml 95 %igem EtOH inkubiert. Anschliessend wurden die Ob-
jektträger zweimal in H2O und dreimal in EtOH für 30 sec gewaschen. Nachdem die
beschichteten Objektträger mit N2 trocken geblasen worden waren, wurden sie für
15 min bei 45°C inkubiert. Die Lagerung der mit Poly-L-Lysin beschichteten Glas-
Chips erfolgte bei 4°C in vor Luftfeuchtigkeit geschützten Plastikbehältern.
2.3.4.2. Aufbringen der DNA auf die Chips
Zur Konzentrierung der DNA wurde das Volumen der PCR-Ansätze von 25 µl auf
ca. 12-15 µl reduziert, indem die Platten nur mit Mull abgedeckt für 40 h bei 7°C inku-
biert wurden. Von diesen eingeengten PCR-Ansätzen wurden je 5 µl aus den PCR-
Platten in Polyfiltronics-Mikrotiterplatten umpipettiert. Die Herstellung des hochdichten
Rasters auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Glas-Chips erfolgte mit dem Roboter
Material und Methoden
39
SDDC-2 MicroArrayer, der die DNA-Lösung mit 16 Mikrodispensierungs-Nadeln
(SMP3, TeleChem) auf die Glasoberfläche transferierte (Abb. 2.2). Die Luftfeuchtigkeit
im Inneren des Robotergehäuses wurde dabei konstant auf 55%, die Temperatur auf
21°C gehalten.
Abb. 2.2: Raster, in dem die cDNA-Bibliothek auf die Objektträger (25x75 mm) aufgetragen wur-de. Mit jeder der 16 Nadeln wurden 18 spots in x-Richtung und 20 spots in y-Richtungaufgetragen. Der Abstand der spots in x-Richtung betrug 250 µµµµm, in y-Richtung 220 µµµµm
Nachdem die gesamte cDNA-Bibliothek auf die Glas-Chips transferiert war, wurde der
Umriss des Rasters mit einem Diamantschreiber markiert. Die Chips wurden durch kur-
zes Auflegen auf einen 80°C-warmen Heizblock getrocknet und im Crosslinker mit UV-
Strahlung einer Energie von 600x100 µJ/cm2 behandelt.
Für die Blockierung der positiv geladenen Poly-L-Lysin-Oberfläche wurden zunächst
1 g Bernsteinsäureanhydrid vollständig in 200 ml Dichlorethan gelöst und anschliessend
mit 2.5 ml N-Methylimidazol versetzt. Die Lösung wurde in einen Behälter gefüllt, in
dem die Chips in einem Plastikhalter 1 h bei Raumtemperatur abgedeckt unter leichtem
Schütteln inkubiert wurden. Anschliessend wurden die Chips in 200 ml Dichlorethan
kurz gewaschen. Zur Denaturierung der DNA auf den Chips wurden diese im Halter in
95°C-heissem Wasser für 2 min inkubiert. Nach einem Waschschritt in 95 %igem Etha-
nol liess man die Chips bei Raumtemperatur trocknen.
Block 1
Block 2
y-Richtung
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12
13 14 15 16
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12
13 14 15 16
x-Richtung
Material und Methoden
40
2.3.5. Mycelproben von Neurospora crassa
Die Mycelproben von N. crassa wurden von Dr. U. Schulte (Uni Düsseldorf) und von
Dr. H. Linden (Uni Konstanz) zur Verfügung gestellt. Der verwendete Stamm war der
Wildtyp-Stamm 74-OR23-1A. Die drei Proben, die zur Untersuchung der Genexpressi-
on von N. crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien verwendet wurden,
wuchsen in Vogels-Medium für 22 h bei 28°C, jeweils mit folgenden Nährstoff-
Zusätzen:
Tabelle 2.5: Wachstumsbedingungen der Mycel-Proben
Probe Nährstoff-Zusatz
„Minimalmedium“ 2% Saccharose
„Vollmedium“ 2% Saccharose, 0,25% Hefeextrakt, 0.1% Caseinhydrolysat
„Acetat“ 0.5% Natriumacetat
Die Probe, die zum Vergleich mit S. cerevisiae verwendet wurde, war 48 h in Vogels-
Medium im Dunkeln kultiviert worden.
2.3.6. Isolierung von RNA aus Neurospora crassa
Alle Puffer und Lösungen wurden mit DEPC-H2O angesetzt, die Mörser und Spatel
wurden zur Sterilisation 2 h bei 160°C gebacken.
Für die Isolierung von RNA aus N. crassa wurden etwa 2 g gefrorenes Mycel in einem
gekühlten Mörser mit flüssigem Stickstoff pulverisiert. In 2 ml Eppendorfgefässen wur-
den 750 µl Lysis-Puffer (0.6 M NaCl, 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0 und
4 % SDS) und 750 µl Phenol vorgelegt, diese wurden dann mit pulverisiertem Mycel
aufgefüllt.
Nach kräftigem Schütteln für 20 min wurde 10 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Der
Überstand wurde erneut mit 750 µl Phenol versetzt, 2 min kräftig geschüttelt und
10 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Zur Fällung wurde der Überstand mit 560 µl 8 M
LiCl gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Zentrifugation für 10 min bei
10000 rpm wurde der Niederschlag in 300 µl H2O aufgenommen und durch Zugabe von
Material und Methoden
41
30 µl 3 M NaOAc und 750 µl EtOH erneut bei -70°C für mindestens 30 min gefällt. Die
RNA wurde 10 min bei 10000 rpm abzentrifugiert, mit 70%igem EtOH gewaschen,
getrocknet und in 100 µl H2O aufgenommen. Die Qualität der isolierten RNA wurde in
einem 1,2 %igem Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch
überprüft.
2.3.7. Markierung von komplexen Proben durch cDNA-Erststrangsynthese
Die Markierung der Proben mit Fluoreszenzfarbstoffen erfolgte in einem zweistufigen
Prozess: zunächst wurde ausgehend von RNA durch reverse Transkription cDNA syn-
thetisiert, wobei Aminoallyl-markiertes dUTP verwendet wurde. Im zweiten Schritt
wurde ein monoreaktiver Fluoreszenzfarbstoff-NHS-Ester an die Amino-Gruppe des
markierten dUTP gebunden. Bei anschliessender Hybridisierung auf Chips, die als he-
terologe Kontrollen Sequenzen aus Kaninchenglobin enthielten, wurde ausserdem zu
jeder Markierungreaktion eine definierte Menge an Kaninchenglobin-mRNA hinzuge-
fügt.
2.3.7.1. Reverse Transkription unter Verwendung von aa-dUTP
15 µg Gesamt-RNA (2.3.6.) wurden mit 2.5 µg Oligo(dT)12-18 und, bei Verwendung der
heterologen Kontrollen, mit 7.5 ng Kaninchenglobin-mRNA in 14.5 µl H2O 10 min bei
70°C inkubiert und anschliessend auf Eis gekühlt. Nach Zugabe von 6 µl 5x Reakti-
onspuffer, 0.6 µl 50x dNTP-Mix (je 25 mM dATP, dCTP, dGTP, 10 mM aa-dUTP,
15 mM dTTP), 3 µl 0.1 M DTT, 1.9 µl SuperScriptII (200 U/µl) und 3 µl H2O wurde
die reverse Transkription für mindestens 3 h bei 42°C inkubiert. Die Reaktion wurde
mit 10 µl 0.5 M EDTA abgestoppt und die RNA durch Zugabe von 10 µl 1 N NaOH für
15 min bei 65°C hydrolysiert. Die Reaktion wurde anschliessend mit 25 µl 1 M Hepes,
pH 7.5 neutralisiert. Zur Entfernung von Puffer und nicht eingebauter Nukleotide wurde
die cDNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt. Zunächst wurden zum
neutralisierten Reaktionsansatz 25 µl H2O und 100 µl Puffer PB zugegeben. Die Lösung
wurde auf eine QIAquick-Säule aufgetragen, 1 min zentrifugiert und nach Verwerfen
des Durchflusses zweimal mit 750 µl Puffer PE gewaschen. Dazwischen wurde jeweils
1 min zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Nach dem zweiten Waschschritt
wurde zweimal zentrifugiert, um den Puffer PE vollständig zu entfernen. Die cDNA
wurde mit zweimal 30 µl 0.6 µM NaOH, pH 7.5 eluiert.
Material und Methoden
42
2.3.7.2. Kupplung von reaktiven Fluoreszenzfarbstoff-Estern an aa-dUTP
Die reaktiven Farbstoffester wurden für die Kupplungsreaktion aliquotiert, indem ein
vom Hersteller geliefertes Aliquot in 72 µl DMSO gelöst wurde und auf 16 Aliquots
à 4.5 µl verteilt wurde. Diese Aliquots wurden im Vakuum-Konzentrator getrocknet und
bei 4°C im Exsiccator lichtgeschützt gelagert.
Die mit aa-dUTP markierte cDNA (2.3.7.1) wurde in einem Vakuum-Konzentrator ge-
trocknet. Anschliessend wurde die cDNA in 9 µl 0.1 M NaHCO3 gelöst und zu einem
Aliquot des monoreaktiven NHS-Farbstoffesters (Cy3 bzw. Cy5) gegeben. Die Kupp-
lungsreaktion wurde für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Um nicht ge-
bundenen NHS-Farbstoffester zu blockieren, wurde der Ansatz mit 4.5 µl 4 M Hy-
droxylamin gemischt und weitere 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
Für die anschliessende Reinigung mit dem QIAquick PCR Purification Kit wurden bei
einer nachfolgenden Zweifarben-Hybridisierung die entsprechenden Cy3- und Cy5-
Reaktionen vereint, ansonsten erfolgte die Reinigung getrennt. Die Ansätze wurden mit
H2O auf ein Volumen von 100 µl aufgefüllt, mit 500 µl Puffer PB gemischt, auf die
Säulen aufgetragen, 1 min zentrifugiert und anschliessend zweimal mit je 750 µl Puffer
PE gewaschen. Die Elution erfolgte mit zweimal 30 µl Puffer EB. Die markierte cDNA
wurde nach der photometrischen Einbaubestimmung (2.3.7.3.) im Vakuum-
Konzentrator getrocknet und entweder direkt in die Hybridisierung eingesetzt oder bei
4°C lichtgeschützt bis zu 1 Woche gelagert.
2.3.7.3. Photometrische Einbaubestimmung von Cy3/Cy5
Der Einbau der Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und Cy5 wurde photometrisch bestimmt.
Dazu wurden 50 µl des Eluats (2.3.7.2.) in einer sterilen UV-Küvette (Uvette, Eppen-
dorf) im Photometer bei 260 nm, 550 nm und 650 nm vermessen.
Material und Methoden
43
Über das Lambert-Beer´sche Gesetz:
Axx = εxx · c · l
mit A : Absorption, gemessen bei xx nmε : Extinktionskoeffizient für die gemessene Substanz bei xx nmc : Konzentration der gemessenen Substanzl : Schichtdicke der Küvette
und den Extinktionskoeffizienten für
cDNA : ε260 = 10000 l/mol · cm
Cy3 : ε550 = 150000 l /mol · cm
Cy5 : ε650 = 250000 l /mol · cm
wurden die Konzentrationen der cDNA und der beiden Fluoreszenzfarbstoffe berechnet.
Die gemessene Absorption bei 260 nm wurde zunächst mit folgenden Formeln korri-
giert, um die gleichzeitige Absorption durch die Farbstoffmoleküle zu berücksichtigen:
A260 korrigiert = A260 - (0.08 · A550)
A260 korrigiert = A260 - (0.05 · A650)
Über die folgenden Formeln wurde anschliessend über das Verhältnis der Konzentratio-
nen die prozentuale Einbaurate von Cy3 bzw. Cy5 bestimmt.
( [Cy3] / [cDNA] ) x 100 = % Einbau Cy3
( [Cy5] / [cDNA] ) x 100 = % Einbau Cy5
2.3.8. Hybridisierung auf Glas-Chips
Alle Hybridisierungen wurden als Zweifarben-Experiment durchgeführt, d.h. dass eine
Probe, die mit Cy3 markiert war, zusammen mit einer zweiten Probe, die mit Cy5 mar-
kiert war, auf einen Chip hybridisiert wurde.
Um das benötigte Probenvolumen möglichst klein zu halten, wurden die Hybridisierun-
gen unter einem Deckgläschen durchgeführt. Je nach Grösse des Deckgläschens werden
so nur zwischen 12 und 40 µl an Probenvolumen benötigt. Zur Hybridisierung wird der
Material und Methoden
44
DNA-Chip mit Deckglas in eine Hybridisierungskammer eingebracht
(http://arrayit.com), die anschliessend in ein Wasserbad gelegt wird. Damit die Hybridi-
sierungslösung unter dem Deckglas während der Hybridisierung nicht eintrocknet, wird
im Inneren der Hybridisierungskammer ein feuchtes Milieu geschaffen, indem in ent-
sprechende Vertiefungen in der Hybridisierungskammer Wasser gegeben wird.
Die für die Hybridisierung benötigten Deckgläschen (24x40 mm) wurden in 0.5 %igem
SDS gereinigt, mit ddH2O gespült und abgetrocknet, wobei darauf geachtet wurde, dass
die Oberfläche staubfrei war. In die Hybridisierungskammer wurde in beide Vertiefun-
gen je 5 µl H2O pipettiert.
Die markierte cDNA (2.3.7.) wurde in 25 µl Hybridisierungspuffer (5 % (w/v) Dextran-
sulfat, 3x SSC, 1 % (v/v) SDS, 5x Denhardt´s, 50 % Formamid) und 1.5 µl 10 mg/ml
poly(dA) gelöst, 10 min bei 80°C denaturiert und auf Eis gekühlt. 24 µl der Probe wur-
den auf das Deckglas pipettiert. Anschliessend wurde das Deckglas mit einer Pinzette
vorsichtig umgedreht und luftblasenfrei auf dem Chip plaziert. Der Chip wurde sofort in
die Hybridisierungskammer eingebracht, die Kammer wurde verschlossen und in ein
auf 42°C temperiertes Wasserbad gelegt. Die Hybridisierung erfolgte für 16 h im Dun-
keln bei 42°C.
Anschliessend wurde der DNA-Chip der Hybridisierungskammer entnommen und zur
Ablösung des Deckglases in ein mit 50 ml Waschpuffer I (2x SSC, 0.1 % SDS) gefüll-
tes Falcon-Gefäss gestellt. Nach Ablösung des Deckglases wurde der Chip mehrmals
kurz im Waschpuffer I geschwenkt, anschliessend in einem Plastikhalter in ein mit
500 ml Waschpuffer II (1x SSC) gefülltes Becherglas transferiert und unter leichtem
Schwenken 3 min bei Raumtemperatur gewaschen. Der Chip wurde anschliessend
30 sec in 500 ml Waschpuffer III (0.2x SSC) gewaschen, gut abgeschüttelt und zum
Trocknen in einer mit Whatmann 3MM-Papier ausgelegten Plastikschale 1 min bei
1800 rpm zentrifugiert. Bis zur Detektion, die direkt im Anschluss erfolgte, wurden die
DNA-Chips bei Raumtemperatur in lichtgeschützten Behältern gelagert.
Material und Methoden
45
2.3.9. Auswertung der Hybridisierungsdaten
2.3.9.1. Detektion
Die DNA-Chips wurden mit dem Lasermikroskop ScanArray 5000 detektiert. Die An-
regung von Cy3 bzw. Cy5 erfolgte seriell. Zunächst wurden die durch Cy5 erzeugten
Signale mit einem Laser mit einer Anregungswelle von 633 nm und einer Emissions-
wellenlänge von 670 nm detektiert. Anschliessend wurde mit einem zweiten Laser, der
eine Anregungswelle von 543 nm und eine Emissionswellenlänge von 570 nm hat, die
durch Cy3 erzeugten Signale detektiert. Die erzeugten Bilder wurden getrennt im
16bit-TIFF-Format gespeichert.
2.3.9.2. Quantifizierung der Signalintensitäten mit GenePix™
Die Quantifizierung der Signalintensitäten erfolgte mit der Software GenePix™. Dabei
wurden die detektierten Bilder zunächst in Falschfarben wiedergegeben, wobei entspre-
chend der Laser-Wellenlängen für Cy3 die Farbe Grün und für Cy5 die Farbe Rot ge-
wählt wurde. Die Software überlagert anschliessend diese beiden Bilder. Hat ein Signal
in beiden Laser-Kanälen die gleiche Intensität, ergibt sich die Mischfarbe gelb, das zu-
gehörige Gen wird also in beiden Proben in gleicher Menge transkribiert. Wird ein Gen
nur in einer der beiden Proben exprimiert, dann erhält man nur in einem der beiden Ka-
näle ein Signal, dass dementsprechend entweder rot oder grün dargestellt wird. Für dif-
ferentiell exprimierte Gene ergeben sich zwischen diesen beiden Extrema alle Misch-
farben zwischen rot und grün, je nach Transkripthäufigkeit in den zu vergleichenden
Proben.
Zur Quantifizierung der Signalintensitäten wird über das Falschfarbenbild ein Raster
gelegt, dass automatisch oder manuell an das Bild angepasst werden kann. Die Intensi-
täten beider Fluoreszenzfarbstoffe werden für jedes Signal berechnet und in einer
Tabelle mit der eindeutigen Zuordnung zu den Genfragmenten ausgegeben.
2.3.9.3. Datenanalyse mit M-Chips
Die Software M-Chips („Multi-Conditional Hybridization Intensity Processing Soft-
ware"), die eigens am DKFZ für die Datenverarbeitung von Expressionsanalysen auf
DNA-Chips entwickelt wurde, beinhaltet die Normalisierung der Daten, verschiedene
Filtermethoden zur Bewertung der Relevanz der aquirierten Daten und mit der Korre-
spondenzanalyse eine Methode, um Experimente mit mehr als zwei verschiedenen Be-
Material und Methoden
46
dingungen zu beschreiben und übersichtlich darzustellen.
Normalisierung:
Eine Normalisierung der generierten Signalintensitäten war erforderlich, da diese an-
sonsten aufgrund von Unterschieden, die u. a. durch verschiedene Einbauraten bei der
Markierung der RNA, unterschiedliches Verhalten der beiden Fluoreszenzfarbstoffe
oder abweichende Effizienz der einzelnen Hybridisierungen auftreten können, nicht
direkt miteinander vergleichbar waren.
Zur Normalisierung wurden die Signalintensitäten der zu untersuchenden Bedingung
gegen die Signalintensitäten der Kontrollbedingung in einem zweidimensionalen Koor-
dinatensystem aufgetragen. Bei mehrfacher Wiederholung des Experiments wurden die
individuellen Datensätze der zu untersuchenden Bedingung gegen den Median der zu-
sammengefassten Datensätze der Kontrollbedingung aufgetragen. Anschliessend wurde
die Regressionsgerade mit y=mx+b wird bestimmt. Die Steigung der Regressionsgera-
den wurde durch multiplikative Korrektur auf den Wert 1 gebracht, nach additiver
Korrektur des Y-Achsenabschnitts verlief die Gerade durch den Ursprung des Koordi-
natensystems.
Die Berechnung der Regressionsgeraden kann nach drei verschiedenen Methoden erfol-
gen. Zum einen werden für die Berechnung die Signalintensitäten aller oder zumindest
einer Mehrheit der Gene verwendet. Zum anderen kann die Berechnung anhand der
Signalintensitäten einzelner ausgewählter Gene erfolgen, wobei einerseits konstitutiv
exprimierte Gene, sogenannte „Haushaltsgene“, verwendet werden können, andererseits
heterologe Kontrollsequenzen (Eickhoff et al., 1999), deren komplementäre, organis-
musfremde RNA zur Markierungsreaktion in definierter Menge hinzugefügt werden
muss.
Datenfilterung:
Vor einer weiteren Analyse wurden die normalisierten Daten nach verschiedenen Qua-
litätskriterien gefiltert. Zum einen wurden solche Gene aussortiert, deren Signalintensi-
täten unterhalb eines Schwellenwerts lagen. Ein zweites Qualitätskriterium war der
Faktor der Induktion bzw. Repression, der aus dem Verhältnis der normalisierten Si-
gnalintensitäten berechnet wurde. Ausserdem erfolgte eine Filterung der Daten nach der
Stringenz der Änderung der Genexpression.
Signalintensitätsschwellenwert: Zu vielen Sonden auf dem DNA-Chip gibt es unter den
zu untersuchenden Bedingungen keine komplementäre mRNA-Spezies in der Probe.
Material und Methoden
47
Die bei diesen Sonden resultierenden Signale werden durch unspezifische Kreuzhybri-
disierungen verursacht. Signale mit sehr geringer Intensität können nicht vom durch
unspezifische Signale verursachten Hintergrundrauschen unterschieden werden. In ei-
nem solchen Fall können keine fundierten Aussagen über eventuelle Änderungen in der
Genexpression gemacht werden. Deshalb werden durch Definition eines Signalintensi-
tätsschwellenwertes zu schwache oder unspezifische Signale herausgefiltert. Dieser
Schwellenwert wurde für jedes Experiment individuell bestimmt.
Verhältnis der Signalintensitäten von Cy3 zu Cy5: Das Verhältnis der Signalintensitäten
von Cy3-markierter Probe zu Cy5-markierter Probe ergibt den Induktions- bzw. Re-
pressionsfaktor eines Gens. Mit diesem zweiten Qualitätskriterium werden diejenigen
Gene herausgefiltert, die unter den untersuchten Bedingungen nicht differentiell expri-
miert werden, d.h. deren Expression sich um weniger als ein zu definierendes Vielfa-
ches ändert.
Stringenzkriterium: Zur Bestimmung, ob bei einem Gen eine statistisch signifikante
Änderung der Expression vorliegt, wurden zwei Methoden verwendet. Die stringentere
Methode ist die Min/Max-Separation der Signalintensitäten. Wird ein Gen in Probe 1
stärker exprimiert als in Probe 2, müssen alle Intensitätswerte für dieses Gen aus
Probe 1 höher liegen als die Intensitätswerte aus Probe 2 (siehe Abb.2.3). Durch Defi-
nition einer bestimmten Differenz zwischen dem Minimal-Wert min(x) der Datenpunkte
mit der höheren Intensität und dem Maximal-Wert max(o) der Datenpunkte mit der
niedrigeren Intensität kann die Stringenz der Min/Max-Separation noch erhöht werden.
Weniger stringent dagegen ist die Methode der Standardabweichung-Separation. Hier-
bei wird die Differenz berechnet zwischen dem arithmetischen Mittel der Datenpunkte
mit der höheren Intensität �
(x) verringert um eine Standardabweichung σ(x) und dem
arithmetischen Mittel der Datenpunkte mit der niedrigeren Intensität �
(o) erhöht um
eine Standardabweichung σ(o). Die Standardabweichung-Separation ist weniger anfäl-
lig für einzelne, von den übrigen Messungen abweichende Datenpunkte.
Material und Methoden
48
Abb. 2.3: Methoden für die Beurteilung der statistischen Signifikanz von Genexpressionsände-rungen
Korrespondenzanalyse:
Mit Hilfe der Korrespondenzanalyse (Greenacre, 1984) ist es möglich, Beziehungen
sowohl von Genen untereinander, als auch zwischen Genen und den zu untersuchenden
Bedingungen zu visualisieren und zu erklären. Dazu werden die normalisierten und ge-
filterten Hybridisierungsdaten in einer Matrix zusammengestellt. Die Anzahl der Gene
sei dabei g, die Anzahl der zu untersuchenden Bedingungen b. Die Gene werden in den
Reihen aufgetragen, die Bedingungen in den Spalten. Mit Hilfe dieser Matrix lässt sich
jedes Gen als Vektor in einem entsprechend der Anzahl der Bedingungen
b-dimensionalen Raum darstellen, jede Bedingung analog in einem g-dimensionalen
Raum. Anschliessend werden diese beiden multidimensionalen Räume mit minimalem
Informationsverlust auf eine zweidimensionale Ebene projeziert. Um den Grad des In-
formationsverlusts beurteilen zu können, wird für jede Korrespondenzanalyse der In-
formationsgehalt für die Darstellung der Varianz in den einzelnen Dimensionen berech-
net. Werden, wie in der vorliegenden Arbeit, nur drei Bedingungen miteinander vergli-
chen, können in den ersten beiden Dimensionen 100% der Varianz dargestellt werden.
ooo
o
x
x
x
x
Min/Max-Separation
ooo
ox
x
x
x
Standardabweichung-Separation
min(x)
max(o)
(x)�
(x)
�(x)-σ(x)
�(o)+σ(o)
�(o)
Ergebnisse
49
3. Ergebnisse
3.1. Physikalische Kartierung
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden im Rahmen des Neurospora crassa Ge-
nom-Projekts physikalische Klonkarten der Chromosomen II und V von N. crassa er-
stellt. Als Basis dafür diente eine genomische Cosmid-Bibliothek, von der Teile im
Rahmen dieser Arbeit hergestellt wurden, die mit einer vom Fungal Genetic Stock
Center (FGSC) und der University of Georgia bereit gestellten Cosmid-Bibliothek er-
gänzt wurden. Weiterhin wurde im Lauf des Kartierungsprojekts zusätzlich eine geno-
mische BAC-Bibliothek von LION Bioscience zur Verfügung gestellt. Die folgende
Tabelle zeigt eine Übersicht über die zur physikalischen Kartierung verwendeten Bi-
bliotheken.
Tabelle 3.1: Verwendete Klon-Bibliotheken für die physikalische Kartierung von Chr. II und V vonN. crassa
Bibliothek Klonierungsvektor Herkunft AnzahlKlone
theoretischeAbdeckung
pLawrist-4 V. Aignsiehe unten 2.600
pLORIST6Xh Universityof Georgia 12.000genomische Cosmid-
Bibliothek
pMOcosX FGSC 4.800
17-fach
genomische BAC-Bibliothek pBeloBAC11 LION Bio-
science 9.216 15-fach
Ausgehend von den physikalischen Klonkarten wurde bei MWG Biotech die Sequen-
zierung der beiden Chromosomen begonnen.
3.1.1. Herstellung der gesamt-genomischen Cosmid-Bibliothek
Zu Beginn des Neurospora crassa Genom-Projekts standen für die physikalische Kar-
tierung und anschliessende Sequenzierung weder die Cosmid-Bibliotheken aus den
USA noch die BAC-Bibliothek zur Verfügung. Deshalb wurde zunächst eine gesamt-
genomische Cosmid-Bibliothek hergestellt. Dazu wurde hochmolekulare genomische
DNA aus N. crassa isoliert, die anschliessend fragmentiert und in einen Cosmid-Vektor
kloniert wurde.
Ergebnisse
50
genomische DNA
1 2
1 kb
10 kb
Präparation genomischer DNA aus N. crassa
Zellen von N. crassa-Mycel wurden in gefrorenem Zustand in einem Mörser aufge-
schlossen und durch Zugabe von SDS und Proteinase K lysiert. Nach Abtrennung der
Zellbestandteile durch Zentrifuation und der Entfernung von Proteinen durch Phenolex-
traktion wurde die genomische DNA mit Hilfe von Isopropanol gefällt (siehe 2.2.2.1.)
Ein Aliquot der genomischen DNA wurde gelelektrophoretisch in einem 1.5 %igem
Agarosegel überprüft.
Abb. 3.1: In Spur 1 wurde der Marker (SmartLadder) aufgetragen, Spur 2 enthält 500 ng genomi-sche DNA von N. crassa
Als hochmolekulare Bande oberhalb der 10 kb-Bande des Markers ist die genomische
DNA gut zu erkennen. Im unteren Bereich ist ein geringer Anteil an degradierter RNA
zu sehen. Die fluorimetrische Konzentrationsbestimmung ergab eine Konzentration von
580 µg/ml.
Klonierung der DNA von N. crassa in den Cosmid-Vektor pLawrist-4
Für die Herstellung der genomischen Cosmid-Bibliothek wurde der Vektor pLawrist-4
(de Jong et al., 1989) verwendet. Er besitzt neben zwei cos-Sequenzen des Bacteriopha-
gen λ , durch die das Verpacken der Cosmide in den Phagenkopf ermöglicht wird, ein
Kanamycin-Resistenzgen. Bei dem verwendeten Cosmid-Klonierungssystem wird zu-
nächst partiell fragmentierte DNA an linearisierte Cosmid-Vektorarme ligiert. Die Li-
gationsprodukte werden in vitro in λ-Phagenköpfe verpackt und in E. coli-Zellen trans-
fiziert. Nach erfolgreicher Transfektion werden die Cosmide über die cos-Sequenzen
zirkularisiert. Da in den Cosmid-Vektor nur Fragmente mit einer Länge von 28-44 kb
Ergebnisse
51
kloniert werden können, wurde die hochmolekulare genomische DNA zunächst mit der
Restriktionsendonuclease MboI fragmentiert. Der an der Schnittstelle enstehende 5`-
Überhang ist zu der BamHI-Schnittstelle des Cosmid-Vektors komplementär. Um
Fragmente im gewünschten Längenbereich zu erhalten, wurde die Restriktionshydroly-
se, kontrolliert über die Dauer der Reaktion, nur partiell durchgeführt (siehe 2.2.2.2.).
Gleichzeitig wird durch die partielle Durchführung der Restriktionshydrolyse gewähr-
leistet, dass überlappende DNA-Fragmente entstehen. Anhand dieser Überlappungen
können bei der physikalischen Kartierung benachbarte Fragmente identifiziert und ent-
sprechend ihrer Reihenfolge im Genom angeordnet werden. Nach der partiellen Re-
striktion wurden die DNA-Fragmente dephosphoryliert, um zu verhindern, dass es zur
Ligation zweier Fragmente kommen kann. Die zu verschiedenen Zeitpunkten abge-
stoppten Reaktionen wurden zur Bestimmung der idealen Reaktionsbedingungen über
ein Agarosegel analysiert.
Abb. 3.2: Spur M enthält den Marker (SmartLadder). In den folgenden Spuren sind die nach ver-schiedenen Zeiten abgestoppten Aliquots der Partialrestriktion aufgetragen: 1) 1min; 2)2min; 3) 3 min; 4) 4 min; 5) 5 min; 6) 8 min; 7) 30 min; 8) 60 min.
Während in Spur 1) und 2) noch die hochmolekulare Bande der genomischen DNA zu
sehen ist, erkennt man in den restlichen Spuren mit zunehmender Dauer der Restriktion
einen stetig grösser werdenden Anteil an niedermolekularem Abbauprodukten. Nach 30
min ist keine hochmolekulare DNA mehr sichtbar.
Für die Ligation der fragmentierten DNA in den Vektor pLawrist-4 (siehe 2.2.2.3.)
wurden die Reaktionen verwendet, die nach 3 min und 4 min abgestoppt wurden. Eine
Größenselektion der klonierten Fragmente wurde durch die anschliessende Verpackung
in λ-Phagen erreicht (siehe 2.2.2.4.), da in die Phagenköpfe nur klonierte Fragmente mit
1 2 3 4M 5 6 7 8
1 kb
10 kb
Ergebnisse
52
einer Länge von 28-44 kb verpackt werden können. Insgesamt wurden 10 Ligationsan-
sätze in Phagen verpackt und in frisch kultivierte E. coli-Zellen transfiziert. Nach Aus-
plattieren der Transfektionsansätze auf Agarplatten konnten ca. 4000 Klone identifiziert
werden. Da in einigen Bereichen der Agarplatten die Klondichte zu hoch war, um kon-
taminationsfrei einzelne Klone separieren zu können, konnten insgesamt nur 2600 Klo-
ne in Mikrotiterplatten überführt werden. Die so gewonnene pLawrist-4-Bibliothek
wurde aus Sicherheitsgründen wie in 2.2.1. beschrieben mehrmals kopiert.
Herstellung von DNA-Filtern
Die 2.600 Klone der pLawrist-4-Bibliothek wurden zusammen mit den 12.000 Klonen
der pLORIST6Xh-Bibliothek auf 22x22 cm grosse Nylonmembranen im 4x4-Raster
transferiert. Dabei wurden nur 5/6tel des Filters beansprucht (siehe 2.2.3.). Die 4.800
Klone der pMOcosX-Bibliothek wurden wegen ihrer abweichenden Antibiotika-
Resistenz ebenfalls im 4x4-Raster separat auf Nylonmembranen transferiert. Da hierfür
nur ein Drittel eines Filters beansprucht wurden, konnte die Bibliothek insgesamt in
dreifacher Kopie je Nylonmembran aufgebracht werden.
3.1.2. Selektion chromosomenspezifischer Cosmid-Bibliotheken
Für das physikalische Kartieren der Chromosomen II und V war es zunächst erforder-
lich, aus den gesamt-genomischen Bibliotheken für jedes Chromosom spezifische Sub-
Bibliotheken zu selektionieren. Dies erfolgte im Fall der Cosmid-Bibliothek durch Hy-
bridisierung von chromosomaler DNA auf Filter, die die gesamt-genomische Cosmid-
Bibliothek enthielten. Die Klone mit positivem Hybridisierungsergebniss wurden dann
als Chromosom II– bzw. Chromosom V-spezifisch identifiziert. Die für die Hybridisie-
rung verwendete chromosmale DNA, die von Dr. U. Schulte zur Verfügung gestellt
wurde, war durch Auftrennen genomischer DNA in einem Pulsfeldgel und Ausschnei-
den der entsprechenden Banden von Chromosom II bzw. Chromosom V erhalten wor-
den.
Cosmid-Bibliothek Chromosom II
Durch die Hybridisierung DNA von Chromosom II, die durch Replikation ausgehend
von Hexamer-Oligonukleotiden ("random hexamer priming") radioaktiv markiert wor-
den war, auf die gesamt-genomische Cosmid-Bibliothek und die anschliessende Aus-
Ergebnisse
53
wertung der Autoradiographien konnten insgesamt 1369 Klone als Chromosom II-
spezifisch identifiziert werden (siehe Abb. 3.3). Diese wurden unterschieden in 864
Klone mit starker Signalintensität und 505 Klone mit schwacher Signalintensität. Die
Stärke der Signalintensität hängt unter anderem vom Überlappungsgrad von Sonde und
Probe ab, aber auch von der auf dem Filter gebundenen DNA-Menge. Die Klonanzahl
entspricht bei einer durchschnittlichen Insert-Länge von 34 kb (Kelkar et al., 2000) ei-
ner 10fachen statistischen Abdeckung des 4,6 Mb grossen Chromosoms. Da die Ge-
samt-Bibliothek eine Abdeckung von 17 Genomäquivalenten hat, wurden mit grosser
Wahrscheinlichkeit nicht alle Klone, die zu Chromosom II gehören, durch die Hybridi-
sierung identifiziert. Für die Anfangsphase der physikalischen Kartierung war diese
Sub-Bibliothek dennoch ausreichend.
Abb. 3.3: Selektion der Chromosom II-Sub-Bibliothek durch Hybridisierung radioaktiv-markierter chromosomaler DNA auf die genomische Cosmid-Bibliothek. Gezeigt ist ex-emplarisch die Hybridisierung auf den Filter, der die 14.600 Klone der pLawrist-4- undder pLORIST6Xh-Bibliothek enthält.
Die Klone wurden nach Signalintensität getrennt in insgesamt sechs Mikrotiterplatten
im 384er Format überführt. Im weiteren Verlauf wurden für diese Klone nicht mehr die
ursprünglichen Bezeichnungen aus der gesamt-genomischen Bibliothek verwendet,
sondern die Namen entsprechend ihrer Positionierung in den Mikrotiterplatten der
Chromosom II-spezifischen Cosmid-Bibliothek.
Ergebnisse
54
Cosmid-Bibliothek Chromosom V
Analog zur Selektion der Chromosom II-spezifischen Cosmid-Bibliothek wurde DNA
von Chromosom V radioaktiv markiert und auf die gesamt-genomische Cosmid-
Bibliothek hybridisiert. Durch Auswertung der Autoradiographien konnten insgesamt
2163 Klone identifiziert werden, was statistisch einer 8,5 fachen Abdeckung der 9,2 Mb
des Chromosoms entspricht. Auch hier lag die theoretische Abdeckung deutlich unter
der 17-fachen Abdeckung der genomischen Bibliothek, folglich wurden nicht alle
Chromosom V-Klone durch die Hybridisierung selektiert. Diese Sub-Bibliothek wurde
dennoch als Basis für die physikalische Kartierung eingesetzt. Die Klone wurden unter-
schieden in 778 Klone mit starker Signalintensität und 1385 Klone mit schwacher Si-
gnalintensität und entsprechend dieser Unterscheidung getrennt in insgesamt sieben
Mikrotiterplatten im 384er Format überführt. Die Benennung der Klone erfolgte auch
hier im folgenden nach den Koordinaten der Mikrotiterplatten der Chromosom V-
spezifischen Cosmid-Bibliothek.
Herstellung von DNA-Filtern der Cosmid-Sub-Bibliotheken
Die Klone der chromosomenspezifischen Cosmid-Bibliotheken wurden auf Nylon-
Membranen im 4x4-Raster transferiert. Entsprechend ihrer Antibiotika-Resistenz wur-
den die pMOcosX-Klone getrennt von den pLawist-4- und den pLORIST6Xh-Klonen
auf die Membranen aufgebracht. Für jedes Chromosom erhielt man deshalb zwei 7x11
cm grosse Filter.
3.1.3. Selektion Chromosom II-spezifische BAC-Bibliothek
Da die BAC-Bibliothek erst zu einem späteren Zeitpunkt zur Verfügung stand, an dem
die Kartierung von Chromosom V auf Cosmid-Ebene schon weit fortgeschritten war,
wurde darauf verzichtet, eine Chromosom V-spezifische BAC-Bibliothek zu selektie-
ren. Dagegen wurde für die Kartierung von Chromosom II eine Auswahl der Chromo-
som II-spezifischen BAC-Klone vorgenommen.
Da für eine Hybridisierung von chromosomaler DNA analog zu 3.1.2. nicht mehr genü-
gend Material vorhanden war, wurde zur Selektion der chromosomenspezifischen BAC-
Bibliothek eine andere Strategie gewählt: 190 zufällig ausgewählte Klone der Chromo-
som II-spezifischen Cosmid-Bibliothek wurden mit Digoxigenin-11-dUTP markiert und
auf die gesamt-genomische BAC-Bibliothek hybridisiert. Dadurch konnten insgesamt
Ergebnisse
55
751 BAC-Klone identifiziert werden, die in 2 Mikrotiterplatten im 384er Format über-
führt wurden. Durch die Hybridisierung weiterer Chromosom II-spezifischer Cosmid-
Klone konnten keine neuen BAC-Klone identifiziert werden, so dass man die Selektion
nach der Hybridisierung von 190 Cosmid-Sonden beendete. Bei einer durchschnittli-
chen Insertgrösse von 69 kb hat die Chromosom II-spezifische Bibliothek eine 11-fache
theoretische Abdeckung.
Herstellung von DNA-Filtern der BAC-Sub-Bibliothek
Die Klone der Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek wurden im 2x2-Raster auf
je ein Feld der 22x22 cm grossen Nylon-Membranen transferiert.
3.1.4. Präparation von Cosmid-DNA
Die als Sonde für die physikalische Kartierung verwendete Cosmid-DNA wurde durch
alkalische Lyse der E. coli-Wirtszellen und anschliessender Phenol-Extraktion wie in
2.2.6. beschrieben präpariert. Ein Aliquot der Ansätze wurde nach Restriktionshydroly-
se auf einem Agarosegel elektrophoretisch hinsichtlich Qualität und Ausbeute der prä-
parierten Cosmid-DNA überprüft.
Abb. 3.4: Spur M enthält den Marker (SmartLadder). In den Spuren 1)-12) wurde die DNA von 12zufällig ausgewählten Cosmid-Klonen aufgetragen.
Das Gel zeigt, dass die DNA in allen 12 Ansätzen seine ausreichende Reinheit aufwies,
um von der Restriktionsendonuklease EcoRI hydrolysiert zu werden. In einigen weni-
gen Fällen konnte bei der Cosmid-DNA-Präparation nur sehr wenig (siehe Spur 2 in
Abb. 3.4) oder gar keine DNA isoliert werden. Dies traf aber nur bei etwa 1% aller prä-
parierten Cosmid-Klone zu.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 kb
10 kb
Ergebnisse
56
3.1.5. Präparation von BAC-DNA
Während Cosmid-Vektoren in bis zu 50-facher Kopie pro E. coli-Zelle vorkommen,
liegen BAC-Vektoren nur in ein- bis maximal zweifacher Kopie vor. Bei gleichem
Ausgangsvolumen an Bakterienkultur ist die Ausbeute an Vektor-DNA bei einer BAC-
DNA-Präparation daher sehr viel geringer als bei einer Cosmid-DNA-Präparation.
Durch einige Modifikationen konnte das bestehende Protokoll für den QIAprep® Spin
Miniprep Kit soweit optimiert werden, dass bei geringem Zeitaufwand eine höhere
Ausbeute an BAC-DNA als durch herkömmliche Minipräparationsprotokolle erhalten
werden konnte. Neben der Verwendung eines grösseren Volumens an Bakterienkultur,
der Steigerung der verwendeten RNase A-Konzentration und dem Austausch eines im
Kit enthaltenen Puffers war vor allem die Fragmentierung der BAC-DNA durch die
Restriktionsendonuklease EcoRI vor dem Auftrag auf die Anionenaustauscher-Säulen
ein wichtiger Optimierungsschritt, da die Elution kleinerer Fragmente wesentlich effizi-
enter ist als die der intakten BACs. Von jedem Ansatz wurde ein Aliquot gelelektropho-
retisch auf Qualität und Ausbeute der BAC-DNA überprüft.
Abb. 3.5: Das Gel zeigt die DNA von vier zufällig ausgewählten BAC-Klonen. Spur M enthält denMarker (SmartLadder). Die Spuren a)-d) zeigen die DNA, die durch Präparation nachdem modifiziertem Protokoll gewonnen wurde (siehe 2.2.7.), die Spuren A)-D) zeigen dieDNA nach Präparation durch das herkömmliche Protokoll des QIAprep® Spin MiniprepKits.
Deutlich auf dem Gel zu sehen ist die erheblich geringere DNA-Menge in den Spuren
A)-D). In den Spuren a)-d) ist im niedermolekularen Bereich degradierte Bakterien-
RNA zu sehen, die trotz erhöhter Zugabe von RNaseA noch vorhanden ist.
M Ma b c d A B C D
1 kb
10 kb
Ergebnisse
57
3.1.6. Physikalische Kartierung
Zur physikalischen Kartierung durch Hybridisierung werden einzelne Klone auf die
Filter der zu kartierenden Klon-Bibliothek hybridisiert. Anhand der Hybridisierungsmu-
ster können Klone mit überlappenden Sequenzen identifiziert werden. Daraus ergibt
sich eine relative Anordnung der Klone zueinander, die eine sequenzabhängige Rekon-
struktion des zu kartierenden DNA-Abschnitts darstellt.
Hybridisierung
Die Hybridisierungen zur Kartierung wurden in der Anfangsphase mit radioaktiv mar-
kierten Sonden durchgeführt (siehe 2.2.8.). Hinsichtlich einer vereinfachten Handha-
bung wurde jedoch bald dazu übergegangen, die Sonden mit Digoxigenin zu markieren
und über Chemilumineszenz zu detektieren (siehe 2.2.9.). Die Markierung sowohl der
radioaktiv markierten als auch der mit Digoxigenin markierten Sonden erfolgte durch
Replikation der Sonden-DNA, wobei mit Hilfe einer DNA-Polymerase ausgehend von
Hexamer-Oligonukleotiden entsprechend markierte Nukleotide eingebaut wurden
("random hexamer priming"). Die Detektion der durch radioaktive Sondenmarkierung
erhaltenen Signale erfolgte auf Röntgenfilmen, die durch radioaktive Strahlung ge-
schwärzt werden. Für die Detektion der mit Digoxigenin-markierten Sonden wurden die
Klon-Filter nach entsprechenden Wasch- und Blockierungsschritten in einer Antikör-
perlösung inkubiert. Dieser gegen Digoxigenin gerichtete Antikörper war mit alkali-
scher Phosphatase konjugiert. Nach Bindung des Antikörpers wurden die Filter kurz in
einer Lösung mit dem chemilumineszenten Substrat CSPD® inkubiert. Die alkalische
Phosphatase reagiert mit CSPD®, wobei dieses zerfällt und Energie in Form von Licht
freisetzt. Dieses Licht kann durch die Schwärzung von speziellen Lumi-Filmen detek-
tiert werden.
Als Sonden wurden ausschliesslich Klone der Cosmid- und BAC-Bibliotheken ver-
wendet.
Ergebnisse
58
Abb. 3.6: Hybridisierung auf Klonfilter. Exemplarisch sind gezeigt A) die Hybridisierung einerradioaktiv markierten Cosmid-Sonde auf einen Filter der Cosmid-Sub-Bibliothek vonChr. V und B) die Hybridisierung einer mit Digoxigenin markierten BAC-Sonde auf diegenomische BAC-Bibliothek (Ausschnitt).
Auswertung
Die Autoradiographien bzw. die durch Chemilumineszenz belichteten Filme wurden
manuell ausgewertet. Dazu wurden mit Hilfe einer transparenten Rastervorlage, die auf
den Film gelegt wurde, die Koordinaten der Klone mit positivem Signal bestimmt. Ein
Klon wurde nur dann als positiv gewertet, wenn beide zum Klon gehörenden Signale
positiv waren. Die Herkunftsplatte der Klone ergab sich aus der relativen Anordnung
der beiden Doppel-Signale zueinander (siehe Abb. 2.1). Anhand der Platten-Nummer
und der Koordinaten konnten die Klone eindeutig identifiziert werden. Eine Betrach-
tung der Signalintensität war insofern für die Auswertung irrelevant, da nur zwischen
positivem und nicht-positivem Signal unterschieden wurde. Für jede Hybridisierungs-
sonde wurde eine eigene Textdatei erstellt, die mit dem Namen der Sonde bezeichnet
wurde und die Namen aller Klone mit positivem Hybridisierungssignal für diese Sonde
beinhaltete. Diese Textdateien dienten als Berechnungsgrundlage für das Softwarepaket
AA)
B)
Ergebnisse
59
"Contig" (Mott et al., 1993). Aus der Anzahl von gemeinsam getroffenen Klonen wur-
den für jede mögliche Sondenpaarkombination Distanzwerte berechnet (siehe 2.2.10.).
Anschliessend wurde die Sondenreihenfolge kalkuliert, die den kleinsten Wert für die
Gesamtdistanz aufweist. Anhand dieser Sondenreihenfolge wurden die Klone einem
zweiten Schritt entsprechend ihrem Hybridisierungsmuster angeordnet. Die Darstellung
der so berechneten physikalischen Karte erfolgte in einer zweidimensionalen Matrix.
Die Sonden sind in den Zeilen dargestellt, die Spalten beinhalten, dargestellt durch
schwarze Balken, die bei der Hybridisierung der jeweiligen Sonde positiven Klone
(Abb. 3.8).
Kartierungsstrategie Chromosom II
Folgende Bibliotheken wurden für die physikalische Kartierung von Chromosom II
verwendet:
Tabelle 3.2: Bibliotheken, die zur physikalischen Kartierung von Chr. II verwendet wurden
Bibliothek Anzahl KloneInsertgrösse
(Durchschnitt)
Beispiel für
Klonbenennung
Chr.II-Cosmid-Bibliothek
Genomische Cosmid-Bibliothek
1369
19.40034 kb
1k20
1a9g
Chr. II-BAC-Bibliothek
Genomische BAC-Bibliothek
2163
921669 kb
3d7bac
9a16bac-g
Für die Kartierung von Chromosom II wurde anfangs sowohl die Chromosom II-
spezifische BAC-Bibliothek als auch die Chromosom II-spezifische Cosmid-Bibliothek
verwendet (siehe Abb. 3.7). Zunächst wurden nur BAC-Klone als Sonden verwendet.
Die Sonden wurden fortlaufend aus den Mikrotiterplatten, beginnend mit Mikrotiter-
platte 1, ausgewählt, wobei ab der zweiten Hybridisierungsrunde nur diejenigen Klone
als Sonde verwendet wurden, die in den vorherigen Hybridisierungsexperimenten noch
kein positives Signal aufwiesen. Durch dieses als "sampling without replacement" be-
zeichnete Verfahren wurde ermöglicht, dass nach nur 50 Hybridisierungen 96 % der
Klone in mindestens einer Hybridisierung detektiert werden konnten. Anschliessend
wurden sowohl aus der Cosmid- als auch aus der BAC-Sub-Bibliothek solche Klone als
Sonde ausgewählt, die in der physikalischen Karte am Rand von Bereichen zusammen-
Ergebnisse
60
hängender Klone (="contigs") lagen, um eventuelle Anschluss- oder Verbindungsklone
zu anderen contigs zu finden. Als keine signifikanten Fortschritte beim Schliessen der
Lücken mehr erzielt werden konnten, wurden die Sonden nicht mehr auf die Sub-
Bibliotheken, sondern auf Filter mit den gesamt-genomischen Bibliotheken hybridisiert.
Somit sollte sichergestellt werden, dass auch diejenigen Chromosom II-Klone detektiert
werden, die bei der Selektion der Sub-Bibliotheken nicht erfasst worden waren.
Abb. 3.7: Kartierungsstrategie Chromosom II
Nach der Hybridisierung von insgesamt 191 BAC-Klonen und 273 Cosmid-Klonen
resultierte schliesslich eine physikalische Karte, die nur noch 13 contigs beinhaltete. Die
relative Anordnung der einzelnen contigs zueinander erfolgte durch den Vergleich mit
der genetischen Karte (Perkins et al., 2000). Dabei wurden die contigs so angeordnet,
dass die Reihenfolge der durch Sequenzanalyse einzelner Klone gefundenen Gene mit
der Reihenfolge der Genloci in der genetischen Karte übereinstimmt.
1.) „sampling without replacement“
2.) Schliessen der Lücken mit Sub-Bibliotheken
ca. 50 contigs
ca. 20 contigs
genomische BAC-Bibliothek
genomische Cosmid-Bibliothek
3.) Schliessen der Lücken mit genomischen Bibliotheken
13 contigs
Klone BAC-Chr.II-Bibliothek
BAC-Chr.II-Bibliothek
Cosmid-Chr.II-Bibliothek
Hybridisierung
Klone an contig-Rändern(BACs oder Cosmide)
BAC-Chr.II-Bibliothek
Cosmid-Chr.II-Bibliothek
Hybridisierung
Klone an contig-Rändern(BACs oder Cosmide)
Hybridisierung
Ergebnisse
61
Abb. 3.8: Physikalische Karte von Chromosom II. Die Sonden sind in den Spalten dargestellt, diebei ihrer Hybridisierung positiven Klone als schwarze Balken in den Spalten. Oberhalbder physikalischen Karte ist die genetische Karte (Perkins et al., 2000) gezeigt.
2g19
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3 an
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R
Ergebnisse
62
Kartierungsstrategie Chromosom V
Für die physikalische Kartierung von Chromosom V wurden folgende Klon-
Bibliotheken verwendet:
Tabelle 3.3: Bibliotheken, die zur physikalischen Kartierung von Chr. V verwendet wurden
Bibliothek Anzahl KloneBeispiel für Klon-
benennung
Chr.V-Cosmid-Bibliothek
Genomische Cosmid-Bibliothek
1369
19.400
4g12
8c4g
Genomische BAC-Bibliothek 9216 1c16bac-g
Die physikalische Kartierung von Chromosom V wurde zunächst ausschliesslich mit
der Chromosom V-spezifischen Cosmid-Bibliothek durchgeführt. Analog zur Kartie-
rung von Chromosom II wurden, nachdem alle Klone mindestens in einer Hybridisie-
rung ein positives Signal gezeigt hatten, Klone an contig-Enden als Sonden verwendet
(Abb. 3.9). Als nach über 1000 Hybridisierungen die sehr grosse Anzahl von über 100
contigs nicht weiter reduziert werden konnte, wurde dazu übergegangen, die Sonden auf
die gesamt-genomische Cosmid- und BAC-Bibliothek zu hybridisieren. Dadurch konnte
die Zahl der contigs in der physikalischen Karte von Chromosom V letztendlich auf 21
reduziert werden.
Ergebnisse
63
Abb. 3.9: Kartierungsstrategie Chromosom V
Insgesamt wurden 1192 Cosmid-Klone und 82 BAC-Klone als Sonden verwendet.
Auch hier wurden die contigs relativ zueinander angeordnet, indem die Reihenfolge von
Klonen, die durch Sequenzanalyse identifizierte Gene enthielten, mit der Reihenfolge
dieser Genloci in der genetischen Karte (Perkins et al., 2000) verglichen wurde.
1.) „sampling without replacement“
2.) Schliessen der Lücken mit Sub-Bibliotheken
ca. 100 contigs
ca. 40 contigs
genomische BAC-Bibliothek
genomische Cosmid-Bibliothek
3.) Schliessen der Lücken mit genomischen Bibliotheken
21 contigs
Klone Cosmid-Chr.V-Bibliothek
Cosmid-Chr.V-Bibliothek
Hybridisierung
Klone an contig-Rändern(Cosmide)
Cosmid-Chr.V-Bibliothek
Hybridisierung
Klone an contig-Rändern(BACs oder Cosmide)
Hybridisierung
Ergebnisse
64
Abb. 3.10: Physikalische Karte von Chromosom V. Oberhalb der physikalischen Karte ist die gene-tische Karte (Perkins et al., 2000) gezeigt.
4k1
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1%;
11%
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Lef
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6%)
sod-
2: L
inke
d to
cyh
-2
Ergebnisse
65
3.1.7. Sequenzanalyse
Bisher wurden bei MWG Biotech AG 3,5 Mb von Chromosom II und 4,2 Mb von
Chromosom V sequenziert. Das entspricht 76% von Chromosom II und 46% des
Chromosom V. Die Assemblierung und Annotierung der Sequenzdaten erfolgte bei
MIPS (Martinsried Institute for Protein Sequences).
Bei der Analyse der bisher erhaltenen Sequenzen von Chromosom II und V konnten
insgesamt 2256 offene Leserahmen (engl. „ORF“= open reading frame) identifiziert
werden (http://www.mips.biochem.mpg.de/proj/neurospora/). Durch ausführliche Da-
tenbankvergleiche erfolgte eine Klassifikation der ORFs entsprechend ihrer Homologie
zu bereits bekannten Proteinen nach einem bei MIPS entwickelten System in sechs
Klassen. Danach konnten 94 ORFs (4%) einem bekanntem Protein zugeordnet werden,
41 davon auf Chromosom II, 53 auf Chromosom V (G. Mannhaupt, persönl. Mittei-
lung). Diese sind in den Tabellen 3.4 und 3.5 aufgeführt. Von diesen bekannten Protei-
nen haben nur 19 einen kartierten Gen-Locus auf Chromosom II, 25 sind als Locus auf
Chromosom V kartiert (Perkins et al., 2000).
Tabelle 3.4: Gene, die bei der Sequenzanalyse auf Chromosom II lokalisiert wurden
Klon/contigLänge
(Amino-
säuren
Beschreibung Gen-Locus
bac24m22 792 Vermutlich C6 Zink-Cluster Transkriptionsfaktorbac24m22 412 homolog zu Alkohol-Dehydrogenase bli-4bac23h20 977 Glycin-reiches Protein het-CORbac23h20 571 RNA-Splicingfaktor pad-1bac23h20 397 Orotidin-5-phosphatdecarboxylase pyr-4bac23b10 115 Vacuolare ATP-Synthase, Untereinheit Gbac23b10 1287 DNA-abhängige RNA-Polymerase II RPB140bac10k17 1132 Leucin-tRNA-Ligase, cytosolischbac10k17 449 alpha-Tubulin Bbac11o9 760 rekombinatorisches Reparatur-Protein mus-23bac12n19 572 Aminosäurenpermease NAAP1bac17c10 744 NADH-Dehydrogenase (Ubichinon) 78K-Ketten-Vorläuferbac17c10 439 Actin-verwandtes Protein 3 arp3bac18e6 646 Hitzeschockprotein 70 hsp70bac19c19 290 Ribosom-assoziiertes Protein Rap-1bac19c19 364 H+-transportierende ATPase, Vakuole, 41 kDa-Untereinheitbac1d1 920 H+-transportierende ATPasebac1d1 469 mitochondriale Citratsynthasebac22k18 313 ADP,ATP carrier-Proteinbac23d6 667 Acetyl-CoA-synthetase
Ergebnisse
66
Fortsetzung Tabelle 3.4
bac24h17 483 negativer Regulationfaktor pregbac2a19 929 Ribonucleosid-Diphosphatreductase, grosse Kette un-24bac2a19 236 regulatorisches Protein cys-3bac2a19 680 Heterokaryon Inkompatibilitäts-Protein het-6ORbac2a19 297 3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein]-reductase oar-1bac2g14 490 c-14 Sterolreductase erg-3bac2g14 93 Conidiationsprotein 6 con-6bac5o22 626 Glucan-1,4-alpha-glucosidasebac7f21 432 Chorismatsynthase/Flavinreductase, NADPH-abhängigbac7f21 353 Deoxyhypusinsynthasebac7k22 103 Histon H4bac7k22 136 Histon H3bac7n14 644 Actin-verwandtes Protein ro-7bac7n14 454 Ubichinol-Cytochrom C-reductase Komplex Protein 2-Vorläuferbac8b20 171 Cytochrom C-Oxidase, Kette V-Vorläuferbac8b20 519 H+-transportierende ATP-Synthase (EC 3.6.1.34), beta-Kettebac8b8 354 Allantoicasebac8j24 856 Vacuolare ATP-Synthase, 98 Kda-Untereinheitbac8l21 1300 Dynactin (150 KDa Dynein-assoziiertes Polypeptid) ro-3bac9g16 338 Glyceraldehyd- 3-phosphatdehydrogenase ccg-7bac9j10 203 GTP-bindendes Protein ypt1
Tabelle 3.5: Gene, die bei der Sequenzanalyse auf Chromosom V lokalisiert wurden
Klon/contigLänge
(Amino-
säuren)
Beschreibung Gen-
Locus
12f11 161 H+-transportierende ATPase, Lipid-Bindeprotein2e4 548 Isocitratlyase acu-32e4 624 Mitochondriales Vorläufer-Protein, Import-Rezeptor tom702e4 380 Centractin ro-4g65a3 888 Chitinsynthase 3 chs-318a7 927 Transkriptionsaktivator-Protein acu-1565e11 324 Regulator der Conidiation rca-121d9 152 Nucleosiddiphosphatkinase18f11 245 Mangansuperoxid-Dismutase, Vorläufer sod-218f11 607 H+-transportierende ATPase, vacuolar, 67K-Kette18f11 454 Glutamatdehydrogenase NADP+g15d1 744 neutrale Trehalase alpha,alpha-Trehaloseglucohydrolase15e11 668 alkalische Phosphatasebac8g12 197 Dynactin Arp1 p25-Untereinheit RO1264c2 661 Clock-controlliertes Gen 8 ccg-893g11 71 Glucose-repressierendes Protein grg-117e5 369 vermutlich Protein-Disulfidisomerase-Vorläufer
Ergebnisse
67
Fortsetzung Tabelle 3.5
bac11n2 229 RAS-2 Protein9g6 256 C-8 Sterolisomerase erg-19g6 705 Hitzeschockprotein 80 hsp809g6 120 FK506-Bindeprotein FKBPbac7h23 283 mitochondriales Porinbac7h23 301 60S-ribosomales Protein L594c8 149 Calmodulinbac8l3 600 Doppelstrangbruch-Reparaturprotein mus-11bac10h4 1646 cpc-3-Protein cpc-3bac10h4 349 mitochondrialer Importrezeptor MOM38g15g9 153 Ribonuclease T15e6 656 UV-Endonuclease uve-1bac11o8 797 Komplex I-Intermediat-assoziiertes Protein CIA84, Vorläufer20h10 202 NADH-Dehydrogenase Ubichinon 29/21K-Ketten-Vorläufer20h10 107 Ubichinol-Cytochrome-C-Reductase, Kette VIII123a4 347 Farnesylpyrophosphatsynthetase123a4 263 NADH-Ubichinon-Oxireductase, 24 kDa-Untereinheit-Vorläufer nuo24123a4 385 CAMP-abhängige Proteinkinase, regulatorische Kette mcb123a4 1032 Transkriptions-Elongations-Komplex, Untereinheit CDC68bac14a6 503 S-Adenosylmethionindecarboxylase spe-2bac14a6 696 L-Aminosäure-Oxidase7f4 706 Glycogensynthase99h12 517 Phosphoprotein-phosphatase, 3-alpha katalytische Kette99h12 149 ribosomales Protein L27a.e99h12 375 Formatdehydrogenase99h12 994 Leucin-tRNA-Ligase-Vorläufer, mitochondrialbac11h24 402 Ketol-Säure-Reductoisomerase ilv-2bac11h24 917 Chitinsynthase 1 chs-1bac11h7 291 Spermidinsynthase spe-3bac11h7 355 G-protein, alpha-Kettebac13o20 532 1,3-beta-Glucansynthasebac7a16 375 Actinbac7a16 488 Stickstoff-Metabolismus-Regulationsprotein nmrbac8p8 428 Farnesyltranstransferase al-3bac8p8 142 Clock-controlliertes Gen 6 ccg-6bac8p8 643 Ascosporen-Maturation-1-Protein Asm-1
Von den übrigen identifizierten offenen Leserahmen weisen 644 ORFs (29%) Ähnlich-
keit mit einem bekannten Protein auf, weitere 242 ORFs (11%) haben sogar eine grosse
Ähnlichkeit mit einem bekannten Protein. Ähnlichkeit mit einem unbekanntem Protein
war bei 568 ORFs (25%) zu finden, Ähnlichkeit mit einem nicht näher charakterisierten
EST bei 115 ORFs (5%). Bei 592 ORFs (26%) konnte keinerlei Homologie zu bereits
bekannten Proteinen festgestellt werden, hier handelt es sich also um völlig neue Gene.
Ergebnisse
68
Abb. 3.11: Klassifikation der bisher identifizierten offenen Leserahmen auf Chr. II und V nachihrer Homologie.
Eine Klassifikation der vorhergesagten offenen Leserahmen hinsichtlich ihrer Protein-
funktion ergab, dass ca. 12% (264) für den Stoffwechsel zuständig sind, 2% (46) für den
Energiehaushalt, 7% (160) für Zellwachstum, Zellteilung und DNA-Synthese, 7% (153)
für die Transkription und 3% (59) für die Proteinsynthese. 52% (1177) sind bisher nicht
klassifiziert, die restlichen Proteine übernehmen Funktionen wie zelluläre Organisation,
Signaltransduktion, Transportmechanismen oder Zellverteidigung, Alterungsprozesse
und Zelltod (17%).
Untersuchungen der bisher sequenzierten Genom-Abschnitte ergaben, dass die Gen-
dichte bei etwa 4 kb pro Gen liegt (G. Mannhaupt, mündliche Mitteilung; Nelson et al.,
1997). Legt man die daraus folgenden Schätzungen zugrunde, dass sich die Gesamtzahl
der Gene von N. crassa auf etwa 10-12.000 Gene beläuft, wurden auf den Chromoso-
men II und V, die zusammen etwa ein Drittel der Länge des Genoms ausmachen, bisher
zwischen 19 und 23% aller Gene identifiziert. Da aber weder die vollständige Sequenz
beider Chromosomen vorliegt, noch alle vorliegenden Sequenzen analysiert und anno-
tiert wurden, ist diese Zahl zum gegenwärtigen Zeitpunkt bei weitem nicht vollständig.
Desweiteren ergab sich, dass bei 75% der untersuchten Gene kein oder nur ein Intron
gefunden wurde. Diese Introns weisen eine durchschnittliche Länge von 50-100 kb auf.
Die eingehendere Analyse der Gene mit bisher unbekannter Funktion, in denen sich N.
crassa von allen bisher sequenzierten Organismen, vor allem aber auch von der sehr
nah verwandten Hefe S. cerevisiae unterscheidet, lässt viele neue Erkenntnisse über die
Biologie filamentöser Ascomyceten erwarten.
4%
26%
5%
29%
25%
11%
bekanntes Protein
keine Ähnlichkeit
Ähnlichkeit mit EST
Ähnlichkeit mitbekanntem Protein
Ähnlichkeit mitunbekanntem Protein
grosse Ähnlichkeit mitbekanntem Protein
Ergebnisse
69
3.2. Genexpressionsanalysen
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Genexpressionsanalysen mit Hilfe der
DNA-Chip-Technologie durchgeführt. Ausgehend von einer cDNA-Bibliothek, die vom
amerikanischen Neurospora Genome Project zur Verfügung gestellt wurde, wurden
DNA-Chips hergestellt. Für die Genexpressionsanalysen wurden exemplarisch drei ver-
schiedene Wachstumsbedingungen für Mycel von N. crassa ausgesucht. RNA-Proben
aus diesen Mycelien wurden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und
paarweise auf die Chips hybridisert. Durch intensive bioinformatische Analyse der Hy-
bridisierungsdaten wurden die Transkriptionsprofile der Proben erstellt und in einer
Korrespondenz-Analyse miteinander verglichen.
Darüberhinaus wurde auf dem N.crassa-DNA-Chip eine Probe aus S. cerevisiae mit
einer Probe aus N. crassa verglichen. Dieser Versuch diente der Validierung der Quali-
tät der hergestellten DNA-Chips.
3.2.1. PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek
Zunächst wurden die klonierten Fragmente der cDNA-Bibliothek wie in 2.3.2. be-
schrieben mittels PCR amplifiziert. Die cDNA-Bibliothek lag in 15 Mikrotiterplatten im
384er Format vor, die Amplifikation erfolgte daher ebenfalls in 384er PCR-Platten. Jede
Mikrotiterplatte wurde in dreifacher Kopie amplifiziert. Dadurch wurde sichergestellt,
dass trotz des geringen Reaktionsvolumen von je 25 µl in den 384er-PCR-Platten genü-
gend Material für die Herstellung der DNA-Chips zur Verfügung stand. Startpunkte für
die Amplifikation waren Vektor-spezifische Oligonukleotide („T7“ und „T3“), durch
die gewährleistet wurde, dass ausschliesslich die Sequenz des klonierten cDNA-
Fragments amplifiziert wurde und nicht Teile des Vektors selbst. Die Effizienz der
PCR-Reaktionen wurde in einem 1%igem Agarosegel überprüft. Insgesamt konnten ca.
96% aller cDNA-Klone amplifiziert werden.
Ergebnisse
70
Abb. 3.12: Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Amplifikation. Gezeigt sind exemplarisch 96PCR-Produkte. In den Spuren M wurde der Marker (GeneRuler) aufgetragen.
Nur wenige Spuren enthalten keine Bande, bei zwei Spuren sind zwei Banden zu erken-
nen, wahrscheinlich lag hier eine Kontamination mit einem zweiten cDNA-Klon vor.
3.2.2. Herstellung heterologer Kontrollen
Durch die Verwendung heterologer Kontrollen, die sowohl in Form von DNA-
Fragmenten als Sonde auf die Chips aufgebracht werden, als auch als mRNA in defi-
nierter Menge zur Markierungsreaktion der Probe hinzugefügt werden, ist eine Norma-
lisierung der Hybridisierungen leichter möglich, da diese Kontrollen feste Bezugs-
punkte für die Datenanalyse liefern (Eickhoff et al., 1999). Dadurch, dass die gemesse-
nen Signalintensitäten für diese Kontrollen immer konstant sein müssen, wird der Ver-
gleich von Datensätzen verschiedener Herkunft erleichtert. Wird die Kontroll-Sonde in
mehreren Verdünnungen aufgebracht, erhält man entsprechend Bezugspunkte für ver-
schieden starke Signalintensitäten.
Sequenzen, die als heterologe Kontrollen verwendet werden, dürfen keine Homologien
zum zu untersuchenden Organismus aufweisen, da sonst mit Kreuzhybridisierungen zu
rechnen wäre. Eine Kreuzhybridisierung würde zu Verfälschungen in der resultierenden
Signalintensität führen und somit die Verwendbarkeit als Bezugspunkt für die Normali-
sierung erheblich beeinträchtigen. Als N. crassa-fremde Kontrolle wurde Kanincheng-
lobin gewählt. Zum einen ist die Sequenz des Globins bei Säugetieren zwar stark kon-
serviert, beim Pilz N. crassa bisher jedoch nicht bekannt. Zum anderen ist die mRNA
von Kaninchenglobin kommerziell verfügbar und kann somit direkt als Probe verwen-
det werden. Um sicherzustellen, dass es bei der Verwendung von Kaninchenglobin als
heterologe Kontrolle nicht zu Kreuzhybridisierungen mit N. crassa-DNA kommen
kann, wurde die Sequenz des Kaninchenglobins zunächst mit Hilfe des BLAST-
Algorithmus („basic local alignment search tool“, Altschul et al., 1990) mit der bisher
M M
Ergebnisse
71
bekannten genomischen Sequenz von N. crassa verglichen. Dabei wurden keine Über-
einstimmungen festgestellt. Zusätzlich wurde markierte mRNA aus Kaninchenglobin
auf den Neurospora-DNA-Chip hybridisiert, wobei keine Kreuzhybridisierungen detek-
tiert werden konnten (Ergebnisse nicht gezeigt).
Wie in 2.3.3. beschrieben, wurde zunächst ausgehend von Kaninchenglobin-mRNA
eine cDNA-Erststrangsynthese durchgeführt. Diese cDNA diente dann in einem zweiten
Schritt als Matrize für die Amplifikation eines α- bzw. β-Globin-spezifischen Frag-
ments mittels PCR. Nach der Reinigung der PCR-Produkte wurde je ein Aliquot gele-
lektrophoretisch auf Grösse und Qualität überprüft.
Abb. 3.13: Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Produkte der heterologen Kontrollen aus Ka-ninchen-Globin. In Spur M wurde der Marker (GeneRuler) aufgetragen. Spur 1 enthältdas 268 bp grosse αααα-Globin-spezifische PCR-Produkt, Spur 2 das 490 bp grosse ββββ-Globin-spezifische PCR-Produkt.
3.2.3. Herstellung der DNA-Chips
Für die Herstellung der DNA-Chips wurden zunächst Objektträger mit Poly-L-Lysin
beschichtet (2.3.4.1.). Anschliessend wurden wie in 2.3.4.2. beschrieben mit Hilfe des
Roboters SDDC-2 MicroArrayer die PCR-Produkte in einem definierten, hochdichten
Raster aufgebracht, wobei während eines Roboter-Laufs 50 Chips gleichzeitig herge-
stellt werden konnten. Anschliessend wurden die DNA-Chips einer Blockierungsreakti-
on unterzogen, bei der freie Amin-Gruppen von Poly-L-Lysin durch Reaktion mit
Bernsteinsäureanhydrid blockiert werden. Dadurch soll vermieden werden, dass es an
M 1 2
490 bp
268 bp
500 bp
200 bp
Ergebnisse
72
Stellen, an denen keine Sonden-DNA aufgebracht wurde, zu unspezifischen Hybridisie-
rungen kommen kann, die zu einem erhöhten Hintergrund führen.
3.2.4. Isolierung von RNA aus Neurospora crassa
Für die Isolierung der RNA aus den drei Mycel-Proben „Vollmedium“, „Minimalmedi-
um“ und „Acetat“ wurden zunächst die Zellen durch Pulverisieren des gefrorenen My-
cels im Mörser aufgeschlossen und anschliessend durch Zugabe von SDS lysiert. Nach
einer Phenolextraktion wurde die RNA mit LiCl gefällt (siehe 2.3.6.). Die Qualität der
RNA wurde in einem 1,2%igen Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen über-
prüft.
Abb. 3.14: RNA aus den Mycelproben 1) Vollmedium; 2) Minimalmedium und 3) Acetat
Aufgetragen wurden nach fluorimetrischer Konzentrationsbestimmung je 1 µg RNA. Zu
erkennen sind deutlich die Banden der ribosomalen RNA. Die RNA ist nicht degradiert,
da keine Abbauprodukte im niedermolekularen Bereich zu sehen sind.
3.2.5. Generierung der Hybridisierungsdaten
Die RNA-Proben wurden markiert, indem durch reverse Transkription unter Verwen-
dung von Aminoallyl-dUTP einzelsträngige cDNA synthetisiert wurde. In einem zwei-
ten Schritt wurden reaktive Fluoreszenzfarbstoffester an das eingebaute Amino-allyl-
dUTP gekoppelt (siehe 2.3.7.). Die durch Absorptionsmessung bestimmte Einbaurate
lag typischerweise bei 1-2%. Die Hybridisierungen erfolgten wie in 2.3.8. beschrieben
1 2 3 1 2 3
Ergebnisse
73
als Zweifarben-Experiment. Bei den Experimenten zur Genexpression bei Wachstum in
verschiedenen Nährmedien wurde jede Hybridisierung viermal wiederholt. Die Probe
„Vollmedium“ wurde jeweils als Kontrolle eingesetzt, die mit der Probe „Minimalme-
dium“ bzw. „Acetat“ cohybridisiert wurde. Dabei wurden die einzelnen Proben je
zweimal mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 und zweimal mit Cy5 markiert. Durch die
viermalige Wiederholung sollte eine statistische Validierung der Ergebnisse erreicht
werden (Lee et al., 2000). Darüber hinaus sollten durch den Wechsel des Farbstoff Ab-
weichungen durch unterschiedliches Verhalten der beiden Fluoreszenzfarbstoffe bei
Markierung und Detektion ausgeglichen werden (Taniguchi et al., 2001).
Die Hybridisierung zum Vergleich von N. crassa mit S. cerevisiae wurde aufgrund
mangelnden RNA-Materials nur zweimal wiederholt, ebenfalls mit Austausch der bei-
den Fluoreszenzfarbstoffe.
Nach Hybridisierung und Waschen wurden die Glas-Chips direkt detektiert, wobei auf-
grund der geringeren Photostabilität immer die durch Cy5 erhaltenen Signale zuerst
detektiert wurden.
Abb. 3.15: Gesamt-Chip und Ausschnittsvergrösserung nach Detektion der durch Cy3 erhaltenenSignale nach der Hybridisierung von Cy3-markierter Probe "Vollmedium".
Signalintensität
Ergebnisse
74
Die erhaltenen Signalintensitäten wurden mit der Software GenePix™ quantifiziert.
Abb. 3.16: Ausschnitt eines Chips in der Darstellung von GenePix, auf den die Cy3-markierte Pro-be "Vollmedium" zusammen mit der Cy5-markierten Probe "Minimalmedium" hybri-disiert wurde. Die Software GenePix überlagert die in Falschfarben dargestellten Bilder,die durch Detektion des Cy3-Kanals (=grün) und des Cy5-Kanals (=rot) resultieren undquantifiziert die Signalintensitäten.
Die Ergebnisse aus GenePix™ wurden in Form einer Tabelle abgespeichert, in der jeder
Sonde die zugehörigen Signalintensitäten für den Cy3- und den Cy5-Kanal sowie der
Wert für die Intensität des lokalen Hintergrunds zugeordnet wurden. Diese Daten dien-
ten als Grundlage für die Auswertung mit der Software M-Chips.
3.2.6. Datenanalyse mit M-Chips
Für die Datenanalyse mit M-Chips (Fellenberg et al., 2001) wurden zunächst die durch
die Quantifizierung mit GenePix™ erhaltenen Signalintensitäten für jede einzelne Hy-
bridisierung in die Datenbank geladen. Wiederholungen von Hybridisierungen unter
gleichen Bedingungen wurden dabei zu Experimenten zusammengefasst. Experimente
können mit M-Chips einzeln, aber auch in Kombination mit anderen Experimenten
analysiert werden. Wurden die Hybridisierungen wie in der vorliegenden Arbeit als
Zweifarben-Experiment durchgeführt, ist es von grosser Relevanz, dass bei den kombi-
nierten Experimenten jeweils die gleiche Kontrollbedingung gewählt wurde. Ansonsten
sind die Experimente durch den kompetitiven Charakter der Hybridisierungen nicht
miteinander vergleichbar.
Der erste Schritt der Datenanalyse besteht in der Normalisierung der Daten. Dazu wer-
den paarweise die Signalintensitäten der zu vergleichenden Datensätze in einem Koor-
Ergebnisse
75
dinatensystem gegeneinander aufgetragen. Anschliessend wird durch die Datenpunkte
eine Regressionsgerade gelegt. Grundlage für die Berechnung dieser Gerade war ein
Algorithmus, der eine signifikante Mehrheit aller Datenpunkte verwendet. Diese Me-
thode hatte sich schon in früheren Projekten in unserer Arbeitsgruppe
(A. thaliana, M. Scheideler; S. cerevisiae, N. Hauser) als robuster gegenüber der Be-
rechnung unter der Verwendung von heterologen Kontrollen erwiesen. Durch multipli-
kative und additive Korrektur wird die Regressionsgerade so angepasst, dass sie mit
einer Steigung von 1 durch den Ursprung des Koordinatensystems verläuft. Dadurch
erhält man die normalisierten Signalintensitäten für beide zu vergleichenden Bedingun-
gen (siehe 2.3.9.3.).
Anschliessend erfolgt eine Filterung der Daten, um die grosse Menge der anfallenden
Daten auf diejenigen Gene zu reduzieren, die eine signifikante Änderung in ihrer Ex-
pression zeigen. Die gemessenen Daten wurden durch Wiederholung auf zwei verschie-
denen Ebenen erhalten. Zum einen war jede Sonde doppelt auf den Chip aufgebracht
worden, so dass man bei einer Hybridisierung zwei Datenpunkte für jedes Gen erhielt.
Zum anderen wurden die Hybridisierungen zwei- bzw. viermal wiederholt, so dass man
insgesamt für jedes Gen vier bzw. acht Datenpunkte erhielt. Die Wiederholung von Ex-
perimenten ermöglicht durch die entstehende Redundanz eine statistische Validierung
der Ergebnisse. Desweiteren erlaubt eine grössere Datenmenge eine genauere Definition
eines Signalintensitätsschwellenwertes, der auswertbare Signale vom Hintergrundrau-
schen trennt. Durch verschiedene Filterkriterien (siehe unten) wurden Daten ohne Rele-
vanz aus dem Datensatz entfernt, so dass nur Daten, die eine Änderung im Expressions-
profil charakterisieren, für weitere Analysen verwendet wurden. In der vorliegenden
Arbeit wurden insgesamt drei verschiedene Filterkriterien verwendet: zum einen wur-
den die Daten anhand eines Signalintensitätsschwellenwertes gefiltert, zum anderen
wurden nur solche Daten verwendet, bei denen, gemessen am Verhältnis der Signalin-
tensitäten beider Fluoreszenzfarbstoffe zueinander, eine Änderung der Genexpression
vorlag, zum dritten erfolgte eine Filterung nach der Stringenz der Änderung (Beißbarth
et al., 2000).
Mit den gefilterten Daten kann im Anschluss eine Korrespondenzanalyse (Fellenberg et
al., 2001) durchgeführt werden, alternativ stehen auch noch andere cluster-Algorithmen
wie der des hierarchischen Clusterns zur Verfügung.
Ergebnisse
76
Farbkodierte Liste mit Induktions-/Repressionsfaktoren
Aus dem Verhältnis der normalisierten Signalintensitäten der Probe unter Testbedin-
gung zu den Intensitätswerten der Probe unter der Kontrollbedingung wird der Grad der
differentiellen Expression ermittelt. Die Signalintensitätsverhältnisse werden umge-
rechnet in Faktoren mit positivem Vorzeichen für die Induktion und Faktoren mit nega-
tivem Vorzeichen für die Repression eines Gens. Diese Faktoren werden in Form einer
farbkodierten Tabelle ausgegeben. Hierbei sind die Induktions- und Repressionsfakto-
ren je nach Stringenz der Genexpressionsänderung farblich unterlegt. Folgt die Ände-
rung statistisch signifikant dem hochstringenten "Min/Max-Separation"-Kriterium (sie-
he 2.3.9.3.), sind die Faktoren für eine Induktion rot unterlegt, für eine Repression blau.
Ist die Änderung der Genexpression durch das weniger stringente "Standardabwei-
chung-Separation"-Kriterium belegt, sind die Induktionsfaktoren gelb unterlegt, die
Repressionsfaktoren hellblau. Konnten die Ergebnisse durch keine dieser beiden Quali-
tätskriterien gesichert werden, erfolgt keine farbliche Unterlegung der Faktoren.
3.2.7. Vergleich der Transkriptionsprofile von N. crassa mit S. cerevisisae
Das Transkriptionsprofil einer RNA-Probe aus N. crassa wurde mit dem Transkripti-
onsprofil einer RNA-Probe aus S. cerevisiae (Wildtypstamm FY1679) verglichen, um
feststellen zu können, ob man grundsätzlichmit den N. crassa-DNA-Chips Änderungen
in der Genexpression detektieren kann. Für diesen Zweck wurde die Hefe S. cerevisiae
gewählt, da diese phylogenetisch mit N. crassa verwandt ist und somit aufgrund einer
Sequenzhomologie von ca. 40% (Braun et al., 2000) entsprechend gut mit zahlreichen
Proben auf dem Chip hybridisieren sollte. Andererseits bestehen zwischen beiden Orga-
nismen genug Unterschiede, die folglich auch mit Hilfe des N. crassa-DNA-Chips zu
detektieren sein sollten.
Die RNA aus S. cerevisiae wurde freundlicherweise von S. Bastuck und N. Hauser zu
Verfügung gestellt. Die RNA-Probe aus N. crassa war aus Mycel isoliert worden, dass
48 h im Dunkeln auf Vogels-Medium gewachsen war. Für den Vergleich wurden beide
Proben markiert und auf den N.crassa-DNA-Chip cohybridisert (3.2.5.). Nach der Hy-
bridisierung wurden die Signalintensitäten quantifiziert und mit M-Chips normalisiert
(3.2.6.). Die RNA-Probe aus S. cerevisiae wurde als Kontrollbedingung eingesetzt, mit
der die Probe aus N. crassa verglichen wurde. Zur Veranschaulichung wurden die Si-
gnalintensitäten, die aus der Hybridisierung der mRNA aus N. crassa resultierten, in
Ergebnisse
77
einem zweidimensionalen Koordinatensystem ("scatterplot") gegen die Signalintensi-
täten aufgetragen, die sich aus der Hybridisierung der Probe aus S. cerevisiae ergaben.
Abb. 3.17: Hybridisierung N. crassa vs. S. cerevisiae: Auftragung der Signalintensitäten in einemscatterplot. Gene, deren Signalintensitäten auf einer Gerade durch den Ursprung mit derSteigung 1 liegen, werden in beiden Proben gleich stark exprimiert. Gene, deren Si-gnalintensitäten oberhalb dieser Gerade liegen, werden in N. crassa stärker exprimiert,Gene, deren Signalintensitäten unterhalb dieser Gerade liegen, werden in S. cerevisiaestärker exprimiert.
Die mit M-Chips berechneten farbkodierten Listen (3.2.6.) wurden nur statistisch aus-
gewertet, da die beiden Proben aufgrund unterschiedlicher Wachstumsbedingungen in
biologischer Hinsicht nicht direkt miteinander vergleichbar waren. Während das Mycel
von N. crassa in Vogels-Medium gewachsen war, dem als einzige Kohlenstoffquelle
Saccharose zugesetzt worden war, wurde die Hefe in YPD-Medium kultiviert, in dem
ausser Glucose zusätzlich Hefe-Extrakt und Pepton enthalten war. Die Listen wurden
nach Induktions- und Repressionsfaktoren sortiert. Weiterhin wurden nur solche Gene
berücksichtigt, bei denen die statistische Signifikanz der Expressionsänderung entweder
durch die Min/Max-Separation oder die Standardabweichung-Separation der einzelnen
Datensätze validiert werden konnte. Die statistische Signifikanz beruht hierbei auf 4
Datensätzen, da die Hybridisierung auf die Chips mit den jeweils doppelt aufgebrachten
Genen zweimal wiederholt wurde. Eine signifikante Änderung der Genexpression wur-
de bei insgesamt 3275 (87%) der detektierten 3760 Gene beobachtet.
Nach dem "Min/Max-Separation"-Kriterium lag bei 1189 (36%) Genen eine signifi-
SignalintensitätenS. cerevisiae
Signal-intensitätenN. crassa
Steigung m=1
Ergebnisse
78
kante Induktion in N. crassa im Vergleich zu S. cerevisiae vor, reprimiert wurden 1407
(43%) Gene. Die meisten Expressionsänderungen lassen sich somit reproduzierbar de-
tektieren. Bei weiteren 167 (5%) Genen wurde eine Induktion zumindest durch das
"Standardabweichung-Separation"-Kriterium statistisch validiert, eine Repression bei
512 (16%) Genen.
Bei 2074 (63%) dieser statistisch validierten Gene lagen die Induktions- und Repressi-
onsfaktoren unter dem Wert 2, hier war die Genexpressionsänderung um weniger als
das zweifache geändert. Bei den restlichen 1201 (37%) Genen konnten Induktionen und
Repressionen um mehr als das zweifache beobachtet werden.
Durch diese Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass die N.crassa-DNA-Chips dafür
geeignet sind, für Genexpressionsanalysen eingesetzt zu werden, da sich selbst geringe
Änderungen im Transkriptionsprofil in vier Datensätzen reproduzierbar detektieren las-
sen.
3.2.8. Genexpression von N.crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien
Für die Genexpressionsanalysen bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien wurde als
Kontrolle die Probe "Vollmedium" verwendet, die erste Bedingung war die Probe "Mi-
nimalmedium", als zweite Bedingung wurde die Probe "Acetat" eingesetzt.
Nach der Normalisierung wurden die Daten gefiltert. Dabei wurde für die normalisiser-
ten Signalintensitäten von Kontrolle und Bedingungen ein Schwellenwert festgelegt,
bewertet wurde dabei für jedes Gen der maximale Wert aus allen wiederholten Hybridi-
sierungen. Als zweites Filterkriterium galt ein Verhältnis der Signalintensitäten von
Kontrolle zu mindestens einer der Bedingungen von 2, was einer mindestens zweifa-
chen Änderung der Genexpression entspricht. Mit dem dritten Kriterium wurden die
Daten nach der Stringenz der Genexpressionsänderung gefiltert, hier wurde die
Min/Max-Separation der Datensätze ausgewählt. Mit den gefilterten Daten wurde eine
Korrespondenzanalyse (siehe 2.3.9.3.) durchgeführt.
Ergebnisse
79
Abb. 3.18: Korrespondenzanalyse zum Vergleich der Proben "Vollmedium", "Minimalmedium"und "Acetat". Die Profile 1-3 zeigen die Transkriptionsprofile von "idealen" Genen(siehe Text). Die Gene bzw. Klone werden im Diagramm als schwarze Punkte darge-stellt, die Hybridisierungen dagegen farbig.
In dem resultierenden zweidimensionalen Diagramm (Abb. 3.18) sind Hilfslinien ein-
getragen. Sie beschreiben das Transkriptionsprofil (Profil 1-3) von hypothetischen Ge-
nen, deren gesamte Signalintensität auf eine Bedingung fokussiert ist, während sie in
allen anderen Bedingungen gleich Null ist. Die Koordinaten dieser Gene werden als
Standard-Koordinaten bezeichnet. Da diese hypothetischen Gene weit ausserhalb des
Diagramms liegen würden, sind in der Abbildung nicht deren Standard-Koordinaten,
sondern Geraden, die vom Ursprung des Diagramms in Richtung der Standardkoordi-
naten zeigen, als Hilfslinien dargestellt. Je näher ein Gen an diesen Hilfslinien liegt,
desto besser lässt sich sein Transkriptionsprofil durch das ideale Profil der hypotheti-
schen Gene beschreiben.
Folgende Beobachtungen können anhand der Korrespondenzanalyse gemacht werden:
I
II
Profil 1
Profil 2
Profil 3III
IV
Profil 1 Profil 2 Profil 3
Vollmedium Minimalmedium Acetat
Ergebnisse
80
Die zu der Bedingung „Minimalmedium“ (blau) bzw. zu der Bedingung „Acetat“ (grün)
gehörenden redundanten Datensätze liegen dicht beieinander, woraus sich eine hohe
Reproduzierbarkeit der Hybridisierungen ableiten lässt. Bei der als Kontrolle verwen-
dete Bedingung "Vollmedium" wurde für die Normalisierung der Median aus allen red-
undanten Datensätzen verwendet, der auch in der Korrespondenzanalyse anstelle der
einzelnen Datensätze aufgetragen ist. Zu erkennen sind vier deutlich voneinander sepa-
rierte Gruppierungen von Genen, die Transkriptionsprofile der drei Bedingungen sind
also gut voneinander getrennt. Die beiden rot umrandeten Gruppen I und II sind dem
Profil 1 zuzuordnen, hier handelt es sich um Gene, die bei Wachstum auf Vollmedium
induziert sind, bzw. bei Wachstum auf Minimalmedium oder einem Acetat-haltigen
Medium reprimiert sind. Die blau umrandete Gruppe III lässt sich weitgehend durch das
Profil 2 beschreiben. Die hier enthaltenen Gene sind bei Wachstum auf Minimalmedi-
um deutlich höher exprimiert als unter den anderen beiden Wachstumsbedingungen. Bei
der grün umrandeten Gruppe IV handelt es sich um Gene, die näherungsweise durch das
Profil 3 beschrieben werden können. Sie sind bei Wachstum auf dem Acetat-haltigen
Medium sehr viel stärker induziert als bei Wachstum auf Voll- oder Minimalmedium.
Insgesamt wurden für die Korrespondenzanalyse 170 Gene bzw. Klone ausgewählt, die
übrigen wurden durch die Qualitätskriterien als unsignifikant verändert herausgefiltert.
Gruppe III enthält 95 Klone, 57 Klone sind in Gruppe IV enthalten, und nur 10 Klone
bzw. 8 Klone in den Gruppe I und II. Falls vorhanden, wurde diesen 170 Klonen durch
Datenbankvergleich (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)
eine Sequenz und eventuelle Homologien zu bekannten Genen zugeordnet.
Im folgenden sind die Klone, die in diesen Gruppen zusammengefasst werden konnten,
in farbkodierten Listen (3.2.6.3.) mit Induktions- bzw. Repressionsfaktor und, falls vor-
handen, einer Zuordnung zu einem Gen und der accession-Nummer der Sequenz in der
NCBI-Datenbank gezeigt. Von diesen Klonen wurden 30% noch nicht sequenziert, bei
weiteren 16% wurde konnte keine Sequenzhomologie zu bereits bekannten Genen ge-
funden werden. Bei den restlichen 54% der Klone handelt es sich um identifizierte Ge-
ne, die teilweise aufgrund der hohen Redundanz der cDNA-Bibliothek in mehreren Ko-
pien vorliegen.
Ergebnisse
81
Tabelle 3.6: Klone, die in Gruppe I (rote Umrandung) der Korrespondenzanalyse (Abb. 3.18) zu-sammengefasst wurden. Die farbliche Kodierung entspricht der Stringenz, mit derGenexpressionsänderung belegt werden konnte: dunkelblau unterlegt sind Represssi-onsfaktoren, die durch Min/Max-Separation, hellblau unterlegt sind Repressionsfakto-ren, die durch Standard-Abweichungseparation der wiederholten Datensätze berechnetwerden konnten. Induktionsfaktoren sind rot unterlegt, wenn sie auf einer Min/Max-Separation der wiederholten Datensätze basieren, bei gelber Unterlegung liegt eineStandard-Abweichungseparation vor. Für Faktoren ohne farbliche Unterlegung giltkeines der beiden Qualitätskriterien.
Relative Änderungbezüglich der Kon-
trolle(„Vollmedium“)
"Minimal-medium" "Acetat"
Klon-Name Beschreibung Accession-Nr.
-3.18 +1.13 nm3e10 nicht sequenziert-4.88 +1.03 nm4e11 keine Homologie AA898270
-3.61 +1.05 nm4h11 Halorhodopsin (Licht-induzierte Chlo-rid-Pumpe) AI392478
-4.48 -1.23 nm6b7 keine Homologie AA901660-4.31 +1.07 nm8b5 nicht sequenziert-3.80 -1.40 sc7d8 nicht sequenziert
-4.14 -1.29 sm2c6 C. elegans C25D7.i Genprodukt,Chromosom III AI392184
-3.83 +1.28 sm6e6 nicht sequenziert-4.09 +1.32 sm7a4 nicht sequenziert-3.03 +1.06 sp8a8 nicht sequenziert
Neben sechs noch nicht sequenzierten Klonen enthält diese Gruppe nur vier Klone mit
bekannter Sequenz. Bei zwei dieser Klone wurde keine Homologie zu bekannten Genen
festgestellt, ein Klon enthält das für Halorhodopsin kodierende Gen, die Sequenz des
zweiten ist homolog zu einem Genprodukt mit unbekannter Funktion aus C. elegans. In
dieser Gruppe sind 7 Gene enthalten, die zwar eine Änderung ihrer Expression in Mi-
nimalmedium um mehr als den Faktor 3 aufweisen, bei denen diese Änderung jedoch
durch keins der Stringenzkriterien bestätigt werden konnte.
Ergebnisse
82
Tabelle 3.7: Klone, die in Gruppe II (rote Umrandung) der Korrespondenzanalyse (Abb. 3.18) zu-sammengefasst wurden
Relative Änderungbezüglich der Kon-
trolle(„Vollmedium“)
"Minimal-medium" "Acetat"
Klon-Name Beschreibung Accession-Nr.
-1.14 -4.59 sc6b4 keine Homologie BF072412
-1.14 -4.61 sc7b4 hypothetisches Protein SPAC10F6.16, S.pombe BF739665
-1.25 -3.92 sc8b3 nicht sequenziert-1.26 -8.35 sc7c6 nicht sequenziert-1.28 -5.24 sc5b12 keine Homologie AI399009-1.29 -6.86 nc2d2 keine Homologie AI397728-2.79 -5.00 w6h2 keine Homologie AI398949-4.23 -4.76 sc10c2 nicht sequenziert
Diese Gruppe enthält insgesamt acht Klone, von denen fünf bereits sequenziert wurden.
Davon konnte nur ein Klon der Sequenz eines hypothetischen Proteins aus S. pombe
zugeordnet werden, dessen Funktion bislang noch unbekannt ist. In dieser Tabelle wird
deutlich, dass sich durch das stringente Qualitätskriterium der Min/Max-Separation oder
auch der weniger stringenten Standardabweichung-Separation selbst geringe Änderun-
gen in der Expression eines Genes um weniger als das 1,5-fache reproduzierbar belegen
lassen.
Tabelle 3.8: Klone, die in Gruppe III (blaue Umrandung) der Korrespondenzanalyse (Abb. 3.18)zusammengefasst wurden
Relative Änderungbezüglich der Kon-
trolle(„Vollmedium“)
"Minimal-medium" "Acetat"
Klon-Name Beschreibung Accession-Nr.
+2.58 +1.19 w6e9 Stress-induzierbares Protein STI35 AI398924+3.13 +1.41 w10e2 ADP/ATP-Carrier Protein, N. crassa AI398885+3.14 +1.12 w9e5 nicht sequenziert
+3.40 +1.31 w13h9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI397535
+3.41 +1.72 w7d9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398642
+3.51 +1.52 w9c3 keine Homologie AI399353
+3.63 +1.31 w9g11 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398975
Ergebnisse
83
Fortsetzung Tab. 3.8+3.72 +1.11 w9e3 nicht sequenziert+3.76 +1.53 w9c5 nicht sequenziert
+3.79 +1.73 sc5f6 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399633
+3.82 +1.07 w1h7 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398589
+3.90 +1.67 w7d5 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398548
+3.93 +2.12 w13e4
Acylcarrier-Protein, mitochondrialerVorläufer (ACP), N. crassa (NADH-Ubichinonoxidoreductase 9.6 KD Unter-einheit)
AI398454
+4.11 -1.26 w1d12 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398520
+4.28 +1.32 nm7b10 keine Homologie AA901915+4.47 +1.41 w8h4 Stress-induzierbares Protein STI35 AI398472
+4.53 +2.07 w8c10 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398808
+4.63 +1.55 w7a6 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398533
+4.80 -1.24 w10d3 keine Homologie AI399034
+4.85 +1.33 w8b11 Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, N. crassa AI398835
+4.93 +1.05 w1f12 Stress-induzierbares Protein STI35 AI398574+5.14 +1.57 w1e3 nicht sequenziert+5.24 +1.70 w10c9 60S ribosomales Protein AI398507+5.40 +1.02 w13e12 keine Homologie AI398998
+5.44 +1.81 w7b8 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398540
+5.44 +1.50 w6f8 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399213
+5.62 +1.25 w8d1 nicht sequenziert+5.68 -1.25 sm3b10 nicht sequenziert+5.75 -1.21 sc5h8 Translation-elongations-Faktor 2 AI416427+5.80 +2.07 w10g4 keine Homologie AI398902
+5.94 +1.41 w6f12 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398938
+5.96 +1.24 w13b8 keine Homologie AI399378+6.07 +2.38 w8a10 nicht sequenziert+6.08 +1.09 w8b3 Stress-induzierbares Protein STI35 AI398663+6.60 +1.51 w13f8 ATP-Synthase, Untereinheit 9 AI399001+6.61 +1.59 nc3g6 keine Homologie AA901910+6.73 +3.27 w6e7 keine Homologie AI399322
+6.92 +2.19 w7h1 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398720
+6.95 +1.87 w7g3 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398645
+6.97 +1.15 w10h1 40.3 kD Protein C17C9.12 inChromosom I, S. pombe AI399263
+7.00 +1.14 w7d12 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398815
+7.02 +2.21 w9f4 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399337
Ergebnisse
84
Fortsetzung Tabelle 3.8
+7.10 +1.88 w10e11 Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, N. crassa AI399527
+7.15 +1.78 w8a5 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398550
+7.17 +1.58 sp1f9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI392287
+7.28 +1.55 w10b9 Transaldolase AI398504
+7.37 +1.95 w6f7 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399212
+7.38 +2.52 w8a2 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398549
+7.46 +2.01 w7d1 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398810
+7.72 +2.32 w13b6 60S ribosomales Protein AI398442
+7.72 +2.86 w1e12 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399073
+7.77 +1.80 nm7c2 nicht sequenziert
+7.82 +1.12 w9b1 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398766
+7.84 +1.77 w9h9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398988
+7.88 -1.06 sp8h3 nicht sequenziert
+7.99 +2.76 w6b10 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399314
+8.17 +2.15 w9e7 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI397522
+8.23 +2.11 w1g5 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398578
+8.27 +1.79 w8d9 vermutlich ATP-abhängige RNA-Helicase DBP5 (Helicase CA5/6) AI398873
+8.33 +2.46 w13e9 nicht sequenziert+8.37 +2.02 w9e12 keine Homologie AI397526+8.45 +1.00 sp3h4 nicht sequenziert
+8.48 +1.90 w1b4 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398512
+8.53 +1.59 w6d3 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398910
+8.57 +1.20 sp9a7 nicht sequenziert
+8.58 +2.72 w13c6 Peroxisomal-ähnliches Protein, Asper-gillus fumigatus AI398824
+8.66 +2.19 w8h8 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398708
+9.01 +2.40 w6h10 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399220
+9.05 +1.85 w13a4 keine Homologie AI398990
+9.23 +2.09 w1g2 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398576
+9.23 +3.05 w9b12 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399334
+9.32 +2.68 nc1b7 keine Homologie AA901911+9.36 +2.51 w13h4 nicht sequenziert+9.55 +2.80 w8h2 Histidin-3 Protein, N. crassa AI398704
Ergebnisse
85
Fortsetzung Tabelle 3.8+9.83 +1.17 sc5g1 Stress-induzierbares Protein STI35 AI397603
+9.94 +3.46 w1e6 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399241
+9.94 +1.29 w10h7 Ubichinol-Cytochrom C-Reduktase-Komplex Untereinheit VIII AI399120
+10.02 +3.42 w13e1 minor allergen Alt A VII, Alternariaalternata AI398455
+10.10 +2.67 w1e2 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398525
+10.37 +1.18 w10b8 Stress-induzierbares Protein STI35 AI398503
+10.70 +2.07 sc1h3 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI392532
+10.91 +2.33 nm7h12 keine Homologie AA898678+11.10 +2.13 w10a3 60S ribosomales Protein AI399017
+11.45 +2.71 w8f11 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398692
+12.01 +2.87 sm4f8 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym BF072767
+12.20 +2.69 w8h1 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398703
+12.27 +3.50 sc2h11 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI392549
+12.33 +3.16 w9a10 nicht sequenziert+12.72 +1.82 w10h9 Glucokinase AI399289
+13.28 +2.98 sc7f9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym BF072529
+14.02 +2.61 sm3g7 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym BF072643
+14.20 +2.33 sc1c6 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI392375
+14.30 +4.14 sm6g12 nicht sequenziert
+18.74 +3.60 sm3c9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym BF072566
Die Gruppe III beinhaltet insgesamt 95 Klone, davon 80 mit bekannter Sequenz. Bei 12
der sequenzierten Klone handelt es sich um unbekannte Gene, 45 weitere Klone kodie-
ren für das nmt1-Protein. Die folgende Tabelle zeigt als Auszug aus Tabelle 3.8. die in
Gruppe II identifizierten Gene mit der Kopienanzahl, in der sie in dieser Gruppe vor-
kommen. Ausserdem erfolgt eine Zuordnung zum Gewebetyp, in dem sie exprimiert
werden und Klassifizierung nach ihrer Proteinfunktion.
Ergebnisse
86
Tabelle 3.9: Gene, die in Gruppe III der Korrespondenzanalyse identifiziert wurden
Gen
Anzahl der
Kopien in
Gruppe III
Gewebetyp Proteinfunktion
Stress-induzierbares Pro-tein STI35 6 Mycel, Co-
nidien Stress-Antwort
nmt1-Protein 45Mycel,Conidien,Perithecium
Metabolismus: Cofaktor
Acylcarrier-Protein (ACP) 1 Mycel
ATP-Synthase 1 Mycel
ADP/ATP-Carrier-Protein 1 MycelUbichinol-Cytochrom C-reduktase Komplex 1 Mycel
Metabolismus:Oxidative Phosphorylierung
Transaldolase 1 Mycel Metabolismus:Pentosephosphat-Zyklus
Glucokinase 1 MycelGlyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase 2 Mycel
Metabolismus:Glycolyse
ATP-abhängige RNA-Helicase DBP5 1 Mycel RNA-Synthese
Histidin-3-Protein-Komplex(Histidinoldehydrogenase,Phosphoribosyladenosin-5'-triphosphatpyrophospho-hydrolase, Phosphoribosyl-adenosin-5'-monophosphatcyclohydrolase)
1 Mycel Aminosäurestoffwechsel: Hi-stidin-Biosynthese
Translation-Elongationsfaktor 2 1 Conidien
60S ribosomales Protein 3 MycelProtein-Synthese
40.3 kD ProteinC17C9.12, S. pombe 1 Mycel
Kleines Allergen Alt AVIII, A. alternata 1 Mycel
Peroxisomal-ähnlichesProtein, A. niger 1 Mycel
Unklassifiziert
Ergebnisse
87
Die folgende Tabelle zeigt die Klone, die in Gruppe IV der Korrespondenzanalyse zu-sammengefasst wurden.
Tabelle 3.10: Klone, die in Gruppe IV (grüne Umrandung) der Korrespondenzanalyse (Abb. 3.18)zusammengefasst wurden
Relative Änderungbezüglich der Kon-
trolle(„Vollmedium“)
"Minimal-medium" "Acetat"
Klon-Name Beschreibung Accession-Nr.
+2.16 +3.48 sc1a8 keine Homologie AI399383+2.63 +3.54 sc4f4 nicht sequenziert+1.08 +4.76 nc5h3 ccg-6, mögliches Polypeptid, N. crassa AI392069+1.17 +5.81 nc3a11 keine Homologie AA898660+1.96 +6.44 np2b10 keine Homologie AA898959+1.28 +6.78 nm8g3 nicht sequenziert
+3.56 +6.81 sc5h3 Pyruvatdecarboxylase (cfp Genpro-dukt), N. crassa AI397668
+3.13 +7.09 nc5e3 keine Homologie AI397785+2.15 +8.10 sc1b10 keine Homologie AI398298+2.47 +8.10 sc8d5 nicht sequenziert+2.64 +8.19 sc4d3 nicht sequenziert+2.55 +8.59 sm6b12 nicht sequenziert+1.92 +9.16 sc7f2 keine Homologie BF072523+2.11 +9.18 nc5g2 Acetolactatsynthase, kleine Untereinheit AI392061+3.71 +9.71 sc4f9 nicht sequenziert+7.30 +11.08 sc8d8 nicht sequenziert+3.41 +11.32 sc8d10 nicht sequenziert
+5.25 +14.19 sc1a2 Cyclophilin A, N. crassa, Translation-Elongationsfaktor 2 AI392522
+3.89 +15.56 sc9d8 nicht sequenziert
+2.59 +16.20 sc3d1 ORF YGL141w, hypothetisches 105.6kD Protein in MRF1-SEC27 AI392495
+3.54 +17.84 nc3e6 keine Homologie AI397804+4.46 +18.57 sc10e4 nicht sequenziert
+9.30 +18.80 sc7e8 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) BF072518
+12.70 +21.29 sc9a6 nicht sequenziert
+7.19 +23.21 nc5h1 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392068
+8.51 +23.65 sc5f2 Pyruvatdecarboxylase (cfp Genpro-dukt), N. crassa AI397597
+6.03 +24.42 sc10d12 nicht sequenziert+4.55 +25.66 sc2c11 nicht sequenziert
+8.50 +26.79 nc2c2 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392004
+13.85 +29.21 sc2h8 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392426
+10.26 +29.73 sc2h3 nicht sequenziert+12.75 +31.07 sc4f2 nicht sequenziert
Ergebnisse
88
Fortsetzung Tabelle 3.10+14.66 +31.53 nc3g3 nicht sequenziert
+12.55 +31.67 sc2a2 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392361
+13.92 +32.11 sc8d3 nicht sequenziert+17.34 +34.66 sc4h10 nicht sequenziert+15.70 +34.97 sc10e2 nicht sequenziert+8.43 +35.15 nc1e6 keine Homologie AA901617
+11.33 +36.81 nc5g7 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392064
+13.31 +37.86 sc4f7 nicht sequenziert+10.71 +38.84 sc4d1 nicht sequenziert+19.87 +39.44 sc10d10 nicht sequenziert+21.20 +40.12 sm6b10 nicht sequenziert
+13.75 +40.73 nc5d7 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392042
+16.92 +40.96 sc1e11 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392487
+18.34 +41.07 sc10c5 nicht sequenziert
+12.32 +42.56 nc3e4 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392088
+18.90 +46.19 sc4c7 nicht sequenziert+8.14 +49.34 np1h1 nicht sequenziert+20.67 +52.93 sc4a7 nicht sequenziert+18.33 +53.63 sc8h11 nicht sequenziert
+19.81 +57.14 sc5h1 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI416425
+20.21 +68.86 sc3c3 keine Homologie AI398340
+22.07 +73.46 sc1a6 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392524
+28.29 +86.64 sc1a7 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392485
+14.29 +96.80 sc1c11 keine Homologie AI398326
Gruppe IV der Korrespondenzanalyse enthält 56 Klone, von denen 28 nicht sequenziert
wurden. Von den sequenzierten Klone zeigen 10 Klone keine Homologie zu bekannten
Genen. Die verbleibenden 18 Klone sind in der folgenden Tabelle unterteilt nach ihrer
Proteinfunktion aufgelistet.
Ergebnisse
89
Tabelle 3.11: Gene, die in Gruppe IV der Korrespondenzanalyse identifiziert wurden
GenAnzahl derKopien inGruppe IV
Gewebetyp Proteinfunktion
ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer) 12 Conidien
ccg-6 1 Conidienzirkadianer Rhythmus
Pyruvatdecarboxylase 2 Conidien Metabolismus
Acetolactatsynthase 1 Conidien Aminosäuremetabolismus
Cyclophilin A 1 Conidien Stress-Antwort
ORF YGL141w 1 Conidien Unklassifiziert
Bei den Genexpressionsanalysen, die mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie auf N. cras-
sa durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass bei Wachstum auf Minimal- oder
einem Acetat-haltigen Medium viele Gene im Vergleich zum Wachstum auf einem
nährstoffreichen Vollmedium induziert werden. Es handelt sich hierbei vorallem um
Gene, die an verschiedenen Stoffwechsel- oder Biosynthesewegen beteiligt sind. Zum
anderen scheinen ungünstige Nährstoffangebote einen gewissen Stress auf die Zellen
auszuüben, da auch eine höhere Expression von Stress-induzierten Genen beobachtet
werden konnte.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich die hergestellten Neurospora-DNA-Chips
gut für Genexpressionsanalysen eignen. Mit ihnen kann eine differentielle Expression
über einen grosen Bereich detektiert werden. Induktionen um das bis zu 96-fache wur-
den konnten genauso detektiert werden wie sehr geringe Änderungen um das 1,14-
fache. Durch die mehrmalige Wiederholung von Experimenten und die in M-Chips im-
plementierten Signifikanz-Kriterien konnten sowohl die sehr geringen Änderungen wie
auch die sehr grossen Unterschiede in der Genexpression statistisch validiert werden.
Diskussion
90
4. Diskussion
Im Februar 2001 wurde die Entschlüsselung der 2,9x109 bp langen Sequenz des huma-
nen Genoms bekannt gegeben (Venter et al., 2001). Dies war der bisherige Höhepunkt
in der Geschichte der Genomforschung. Der erste vollständig sequenzierte Organismus
war das Bakterium Haemophilus influenzae mit einer Grösse von 1,83 Mb (Fleisch-
mann et al., 1995). Weitere Meilensteine waren die Sequenzierung der Hefe Saccha-
romyces cerevisiae mit einer Genomgrösse von etwa 12 Mb als erster eukaryotischer
Organismus (Goffeau et al., 1997), der Taufliege Drosophila melanogaster mit 137 Mb
(Adams et al., 2000) und der Pflanze Arabidopsis thaliana mit 130 Mb (The Arabidop-
sis Genome Initiative, 2000).
Die Sequenzierung der DNA bildet nur die Grundlage der Genomforschung. Sie wird
ergänzt durch die Annotierung des sequenzierten Genoms, also die Identifizierung und
Lokalisierung der Gene. Hierbei wird der Sequenz als reiner Abfolge von DNA-
Bausteinen eine Funktion zugeordnet. Im Anschluss kann man sich der wesentlich um-
fangreicheren funktionellen Genomanalyse widmen, indem man beispielsweise in
Genexpressionsanalysen das Transkriptom des Organismus untersucht. Unter definier-
ten Bedingungen werden von verschiedenen biologischen Proben Transkriptionsprofile
erstellt, indem deren mRNA-Populationen bezüglich der Transkripthäufigkeit der in
ihnen enthaltenen Gene analysiert werden. Bei diesen Proben kann es sich zum Beispiel
um Tumorgewebe handeln, das im Vergleich zu gesundem Gewebe untersucht wird,
oder um Zellen, die unter verschiedenen Temperatur-, Licht- oder Nährstoffbedingun-
gen gewachsen sind. Da die Transkripthäufigkeit direkt mit der Genaktivität korreliert,
kann durch den Vergleich der Transkriptionsprofile die regulatorische Funktion der Ge-
ne festgestellt werden. Biochemische Vorgänge werden somit auf molekularer Ebene
untersucht und erklärt.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden physikalische Klonkarten zweier Chro-
mosomen des filamentösen Ascomyceten Neurospora crassa erstellt, die als Grundlage
für die anschliessende Sequenzierung dienten. Der zweite Teil der Arbeit widmet sich
im folgenden der funktionellen Genomanalyse. Mittels der DNA-Chip-Technologie
wurden exemplarisch für drei Wachstumsbedingungen Transkriptionsprofile von N.
crassa erstellt, die dann mit Hilfe bioinformatischer Werkzeuge analysiert und vergli-
chen wurden.
Diskussion
91
4.1. Das Neurospora crassa Genom-Projekt
Im Mittelpunkt des deutschen Neurospora crassa Genom-Projekts, dass 1998 initiiert
wurde, stand die Sequenzierung der Chromosomen II und V. Diese beiden Chromoso-
men decken mit 4,6 Mb von Chromosom II und 9,2 Mb von Chromosom V zusammen
etwa ein Drittel des Gesamtgenoms ab, das eine Grösse von 42,9 Mb hat. Die restlichen
fünf Chromosomen sollten im Rahmen des amerikanischen Neurospora Genome Pro-
ject an der University of Georgia sequenziert werden.
Da alle sieben Chromosomen von N. crassa mittels Pulsfeldgelelektrophorese physika-
lisch sehr gut separierbar sind (Orbach et al., 1988), wurde für die Sequenzierung zu-
nächst ein Chromosomen-orientierter Ansatz gewählt. Dabei werden für die einzelnen
Chromosomen physikalische Klonkarten erstellt, auf deren Basis anschliessend die Se-
quenzierung erfolgt. Aus der DNA derjenigen Klone, die aufgrund ihres minimalen
Überlappungsgrades aus der physikalischen Karte zur Sequenzierung ausgewählt wur-
den, werden durch Ultraschallbehandlung Fragmente generiert, die eine Länge von 0.8-
1.6 kb haben. Durch Klonierung dieser kurzen Fragmente wird eine sogenannte „shot-
gun“- oder Zufalls-Bibliothek erstellt. Die einzelnen Klone dieser shotgun-Bibliothek
werden sequenziert und durch Sequenzvergleiche mittels Computer-gestützter Algo-
rithmen zu einer durchgehenden Sequenz zusammengefügt. Der bioinformatische Auf-
wand ist dabei relativ gering, da die Sequenzdaten, die zusammengefügt werden müs-
sen, je nach verwendetem Klonierungsvektor insgesamt nur eine Länge von 35-70 kb
ergeben. Während das deutsche Neurospora crassa Genom-Projekt für die von ihm
übernommenen Chromosomen diesen Ansatz erfolgreich verfolgte, wird seit Herbst
2000 der gesamte Organismus im „Whole Genome Shotgun“-Verfahren vom Whitehead
Institute Center for Genome Research (WICGR, Massachusetts, USA) sequenziert. Da-
zu wurden zwei genomische Bibliotheken hergestellt, eine mit einer durchschnittlichen
Insertgrösse von 4 kb, die zweite mit einer durchschnittlichen Insertgrösse von 40 kb.
Jedes klonierte DNA-Fragment wurde von beiden Seiten auf einer Länge von etwa 500
bp ansequenziert. Die gesammelten Sequenzdaten wurden mit Hilfe hochentwickelter
Algorithmen zu lückenlosen Bereichen zusammenhängender Sequenzen (contigs) zu-
sammengefügt. Der hohe bioinformatische Aufwand, der sich daraus ergibt, ist nur mit
leistungsstarken und komplexen Computerprogrammen zu bewältigen. Bereits im Fe-
bruar 2001 wurden mit 38 Mb knapp 90% der Sequenz von N. crassa im Internet veröf-
fentlicht und zugänglich gemacht, darin enthalten sind noch über 900 Lücken. Zu dieser
Diskussion
92
Entwicklung kam es vor allem durch immense Fortschritte und Automatisation in der
Sequenziertechnik und die während der letzten Jahre ständig wachsenden Kapazitäten
an Sequenzierungs-Einrichtungen. Zudem wird durch hochentwickelte bioinformatische
Werkzeuge eine zuverlässige und schnelle Verarbeitung und Auswertung der bei einem
shotgun-Ansatz in hoher Redundanz generierten Sequenzdaten ermöglicht. Dadurch
können selbst grössere Genome wie N. crassa auch ohne vorherige physikalische Kar-
tierung in relativ kurzer Zeit sequenziert werden. Dies war noch zu Beginn des Neu-
rospora crassa Genom-Projekts nicht denkbar.
4.2. Physikalische Kartierung
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit ist die physikalische Kartierung der Chromoso-
men II und V von N. crassa beschrieben. Wie bereits in früheren Projekten gezeigt
wurde, kann durch die Erstellung von physikalischen Klonkarten als Grundlage für eine
Sequenzierung die Redundanz der generierten Sequenzdaten signifikant verringert wer-
den (Hoheisel et al., 1993, Scholler et al., 1995). Durch die vorherige Anordnung der
Klone können gezielt benachbarte Klone mit möglichst geringem Überlappungsgrad für
die Sequenzierung ausgewählt werden. Dies ist bei einem „shotgun“-
Sequenzierungsansatz nicht möglich, da hier Klone sequenziert werden, die rein zufällig
ausgewählt werden und über die keine Informationen bezüglich ihrer Lokalisierung im
Genom vorliegen.
4.2.1. Verwendete Bibliotheken
Für die physikalische Kartierung wurde eine genomische Cosmid-Bibliothek verwendet,
die eine 17-fache Abdeckung des Gesamtgenoms aufwies. Zu einem späteren Zeitpunkt
wurde zusätzlich eine genomische BAC-Bibliothek, die 15 Genom-Äquivalente bein-
haltete, herangezogen.
Der Vorteil bei der Verwendung einer BAC-Bibliothek liegt in der Klonierbarkeit von
grösseren DNA-Fragmenten. Dadurch kann der zu kartierende Abschnitt durch eine
geringere Anzahl an überlappenden Klonen abgedeckt werden als bei der Verwendung
von Klonbibliotheken mit kleinen Fragmenten. Während die Grösse von Fragmenten,
die in Cosmide kloniert werden können, bedingt durch die DNA-Menge, die maximal in
den Kopf des Bacteriophagen λ verpackt werden kann, auf etwa 40-50 kb limitiert ist,
Diskussion
93
konnten in BACs schon bis zu 1Mb grosse DNA-Fragmente kloniert werden (Cai et al.,
1995). Üblicherweise liegt die Fragmentgrösse von BAC-Bibliotheken jedoch bei
durchschnittlich 300 Mb. Die Inserierung solch grosser Fragmente wird unter anderem
dadurch ermöglicht, dass die Transformation von BACs in den Wirt E. coli durch Elek-
troporation mit grosser Effizienz durchführbar ist (Shizuya et al., 1992). Das Klonie-
rungssystem ist damit unabhängig von einer Verpackung in Bacteriophagen und die
damit verbundene Grössenselektion. Da die BAC-Vektoren auf dem F-Plasmid (engl.
fertility) des Bakteriums E. coli basieren, unterliegen sie dessen strenger Replikations-
kontrolle und liegen daher in nur in 1-2 Kopien pro Zelle vor. Eine Folge dieser Repli-
kationskontrolle ist die grosse Stabilität der Klone über viele Generationen hinweg. Bei
den inserierten Fragmenten kommt es trotz ihrer Grösse weniger zu Rekombination,
Insertion oder Deletion von DNA-Bruchstücken, wie dies häufig bei anderen Klonie-
rungsvektoren der Fall sein kann.
Cosmid-Vektoren, die dagegen in hoher Kopienzahl pro Zelle vorliegen, haben den
Nachteil, dass einige Sequenzen, die bedingt durch die hohe Kopienzahl zur Instabilität
der Klone führen, folglich nur schwer klonierbar sind. Dazu gehören vor allem repetiti-
ve Sequenzen.
Ein wichtiges Kriterium für Bibliotheken, die zur physikalischen Kartierung durch Hy-
bridisierung verwendet werden, ist, dass sie den zu kartierenden Bereich in überlappen-
den Fragmenten repräsentieren. Nur durch diese Überlappungen ist die Identifikation
benachbarter Klone möglich. Ein als Sonde verwendeter Klon kann benachbarte Klone
in einer Hybridisierung nur dann detektieren, wenn der Überlappungsgrad mehr als 30%
beträgt (J. Hoheisel, persönliche Mitteilung). Bei beiden verwendeten Bibliotheken
wurde die zu klonierende DNA durch Partialrestriktion mit einer Restriktionsendonu-
klease fragmentiert. Durch den partiellen Charakter der Restriktion wird gewährleistet,
dass überlappende Fragmente unterschiedlicher Länge entstehen. Bedingt durch die
zeitliche Begrenzung der Reaktion wird die DNA nicht vollständig fragmentiert, son-
dern nur an einzelnen, zufällig verteilten Schnittstellen. Nachteil dieser Methode ist,
dass die Schnittstellen der jeweiligen Restriktionsendonuklease nicht gleichmässig im
Genom verteilt sind. So kann es grosse Bereiche ohne die jeweiligen Schnittstellen ge-
ben, die folglich nicht fragmentiert werden können und somit aufgrund ihrer Grösse
nicht kloniert werden.
In frühereren Kartierungsprojekten wurde empirisch festgestellt, dass mindestens 10
Genom-Äquivalente erforderlich sind, um eine lückenlose physikalische Karte erstellen
Diskussion
94
zu können (Hoheisel et al., 1993). Die tatsächliche Abdeckung entlang eines Chromo-
soms kann aus diversen Gründen sehr stark variieren (Hoheisel et al., 1995; Frohme et
al., 2000). Bei einer geringen statistischen Redundanz ist es daher leicht möglich, dass
einzelne Regionen gar nicht oder nur unzureichend in der Bibliothek repräsentiert sind.
Für eine gleichmässigere Abdeckung kann nicht nur eine höhere Redundanz, sondern
auch die Verwendung von mehr als einer Bibliothek sorgen. Deshalb wurden in der
vorliegenden Arbeit sowohl eine Cosmid- als auch eine BAC-Bibliothek verwendet, die
sich nicht nur im verwendeten Klonierungsvektor und damit in der Insertgrösse unter-
schieden, sondern auch in der Fragmentierung der inserierten DNA. Im Fall der Cos-
mid-Biblothek wurde die Fragmentierung mit der Restriktionsendonuclease MboI
durchgeführt wurde, bei der BAC-Bibliothek dagegen wurde EcoRI verwendet. Eine
gute Alternative wäre auch die Verwendung einer Bibliothek gewesen, deren klonierte
DNA durch mechanische Scherung, etwa durch Ultraschallbehandlung, fragmentiert
wurde. Die durch Scherung entstehenden Fragmente sind sequenzunabhängig über den
zu kartierenden Abschnitt verteilt, man kann also eine sehr gleichmässige Abdeckung
erwarten. Da aber eine Klonierung von durch Scherung erhaltenen Fragmenten sehr
ineffizient ist, wurde in der vorliegenden Arbeit auf die Generierung einer solchen Bi-
bliothek verzichtet.
Ein weiteres Qualitäts-Kriterium einer zum physikalischen Kartieren verwendeten Bi-
bliothek ist ein möglichst geringer Gehalt an chimären Klonen. Dadurch, dass ein chi-
märer Klon zwei DNA-Fragmente enthält, die aus verschiedenen Regionen des Genoms
stammen, täuscht er in der Hybridisierung Überlappungen von Klonen oder contigs vor,
die in Wirklichkeit nicht bestehen. Bei der Erstellung der Cosmid-Bibliothek wurden
deshalb verschiedene Massnahmen ergriffen, um die Enstehung chimärer Klone zu ver-
hindern: die Ligation zweier genomischer Fragmente miteinander wurde zum einen
durch eine zuvorige Dephosporylierung der Fragmente unterbunden, zum anderen durch
einen deutlichen Überschuss des Cosmid-Vektors während der Ligation. Ausserdem
wurden die Bedingungen der Partialrestriktion so gewählt, dass hauptsächlich grosse
Fragmente entstanden, die aufgrund der durch die Verpackung in λ-Phagenköpfe gege-
benen Grössenselektion nur einzeln kloniert werden konnten. Bei der Verwendung von
BACs als Klonierungsvektor konnte gezeigt werden, dass die Anzahl an gebildeten
chimären Klonen üblicherweise sehr gering ist (Zimmer & Gibbins, 1997). Im Laufe
der Kartierung und später auch der Sequenzierung wurde festgestellt, dass etwa 10%
aller Klone aus beiden Bibliotheken trotz der im Vorfeld ergriffenen Massnahmen chi-
Diskussion
95
mär sind. Chimäre Klone, die als Sonden verwendet werden, können meist recht leicht
in der Karte anhand ihres Hybridisierungsmusters detektiert werden, da sie als einzige
Sonde zwei contigs miteinander verknüpfen. Diese Verknüpfung kann aber meist durch
die Hybridisierungsdaten anderer Sonden nicht bestätigt, teilweise sogar widerlegt wer-
den. Chimäre Klone, die nicht als Sonde verwendet wurden, sondern als positiver Klon
bei einer Hybridisierung detektiert werden, führen zu einem erhöhten Hintergrund an
falsch-positiven Klonen, oft werden aber auch hier die scheinbaren Verknüpfungen
durch die Hybridisierung anderer, nicht-chimärer Sonden widerlegt.
4.2.2. Selektion von Sub-Bibliotheken
Für die Kartierung wurden zunächst Sub-Bibliotheken der beiden betreffenden Chromo-
somen generiert. Dies geschah durch die Selektion der zu dem jeweiligen Chromosom
gehörenden Klone aus den gesamt-genomischen Bibliotheken. Dieser Ansatz wurde der
direkten Erstellung von Chromosom-spezifischen Bibliotheken durch die Klonierung
von chromosomaler DNA vorgezogen, da für eine Klonierung grosse Mengen an Aus-
gangsmaterial benötigt werden, die durch Separation und Isolierung der chromosomalen
DNA mittels Pulsfeldgelelektrophorese nur mit sehr grossem zeitlichen und materiellen
Aufwand erhältlich sind.
Die Selektion der Cosmid-Sub-Bibliotheken erfolgte durch Hybridisierung radioaktiv
markierter chromosomaler DNA auf Klonfilter der gesamt-genomischen Bibliothek,
eine Strategie, die bereits bei der Kartierung von Trypanosoma cruzi erfolgreich ange-
wendet wurde (Frohme et al., 1998). Alle Klone mit positivem Hybridisierungssignal
wurden als zum jeweiligen Chromosom zugehörig identifiziert und selektiert. Da die
generierten Sub-Bibliotheken aber nur eine 8,5-fache Abdeckung von Chromosom V
bzw. eine 10-fache Abdeckung von Chromosom II aufwiesen, was nur knapp der Hälfte
der Redundanz der gesamt-genomischen Cosmid-Bibliothek entspricht, ging man davon
aus, dass nicht alle Klone der jeweiligen Chromosomen identifiziert worden waren.
Dies könnte einerseits darin begründet sein, dass eine zu geringe Menge chromsomaler
DNA für die Markierungsreaktion eingesetzt wurde oder dass die Effizienz der Markie-
rung nicht ausreichend war. Andererseits kann auch eine schlechte Hybridisierungseffi-
zienz dazu führen, dass etliche, eigentlich positive Klone nur sehr schwache Signale
produzieren, die bei der Auswertung der Autoradiographien nicht identifiziert werden.
Da aber nur eine sehr begrenzte Menge an chromosomaler DNA zur Verfügung stand,
Diskussion
96
konnte die Hybridisierung nicht wiederholt werden. Ein weiteres Problem bei der Se-
lektion einer Sub-Bibliothek durch die Hybridisierung chromosomaler DNA kann das
Auftreten von falsch-positiven Klonen sein, die zu einem anderen als dem zu selektie-
renden Chromosom gehören. Bei der Chromosomenseparation mittels Pulsfeldgelelek-
trophorese kann es sowohl bei der Elektrophorese selbst als auch beim Ausschneiden
der chromosomalen Bande zu einer Kontamination mit DNA von anderen Chromoso-
men kommen. Diese Kontaminationen würden in der anschliessenden Hybridisierung
zu falsch-positiven Signalen führen. Ebenso kann es durch die Existenz von homologen
oder repetitiven Sequenzen während der Hybridisierung zur Identifikation falsch-
positiver Klone kommen.
Für die Selektion der BAC-Sub-Bibliothek wurde eine andere Strategie gewählt, da die
Hybridisierung chromosomaler DNA auf die Klonfilter der BAC-Bibliothek nur wenige
schwache Signale lieferte. Cosmidklone, die zuvor als zu Chromosom II gehörig identi-
fiziert worden waren, wurden einzeln oder in Gruppen von bis zu sechs Klonen auf die
genomische BAC-Bibliothek hybridisiert. Alle BAC-Klone mit positivem Hybridisie-
rungssignal wurden dann ebenfalls Chromosom II zugeordnet. Dieses Verfahren wurde
solange durchgeführt, bis keine neuen BAC-Klone mehr identifiziert werden konnten.
Es ergab sich eine Sub-Bibliothek mit einer rechnerischen 11-fachen Abdeckung von
Chromosom II. Auch hier liegt die Redundanz deutlich unter derjenigen der gesamt-
genomischen BAC-Bibliothek. Diese Differenz hat ihre Ursache unter anderem darin,
dass schon die zur Hybridisierung verwendeten Cosmid-Klone aus einer Sub-Bibliothek
mit geringer Redundanz stammten.
Auf eine Selektion einer BAC-Sub-Bibliothek von Chromosom V wurde verzichtet, da
hier die Kartierung zu dem Zeitpunkt, als die BAC-Bibliothek zur Verfügung gestellt
wurde, bereits mit der Cosmid-Bibliothek schon so weit fortgeschritten war, dass zum
Schliessen der Kartierungslücken die gesamt-genomische BAC-Bibliothek eingesetzt
wurde.
4.2.3. Präparation von BAC-DNA
Da BAC-Vektoren bedingt durch die Replikationskontrolle des F-Plasmids, auf dem sie
basieren, nur in 1-2 Kopien pro E. coli-Zelle vorliegen, ist die Ausbeute bei einer BAC-
DNA-Präparation naturgemäss sehr gering. Um dennoch ohne erhöhtem Aufwand ge-
genüber der Cosmid-DNA-Minipräparation genügend DNA für die Markierungsreakti-
Diskussion
97
on von Sonden zu erhalten, wurden bestehende Minipräparationsprotokolle modifiziert.
Eine mit geringem Zeitaufwand verbundene Methode stellte der QIAprep® Spin Mini-
prep Kit dar. Dieser zeichnet sich dadurch aus, dass er es ermöglichte, die DNA von bis
zu 24 BAC-Sonden innerhalb weniger Stunden parallel zu isolieren. Mehrere Modifika-
tionen des vom Hersteller vorgesehenen Protokolls mussten eingeführt werden, um das
Verfahren für die Isolierung von BAC-DNA zu optimieren. Statt der üblichen 5 ml
Bakterien-Übernachtkultur wurden 7 ml angesetzt, um die Menge an E. coli-Zellen und
somit die Menge an BAC-DNA zu steigern. Ein noch grösseres Volumen wurde nicht
gewählt, da man aufgrund von Schüttler- und Zentrifugenkapazitäten die Bakterien in
15-ml-Falcon-Röhrchen kultivieren wollte. Da das Verhältnis von Bakterien-RNA zu
BAC-DNA sehr gross ist, wurde der Gehalt an RNase A, die im Resuspensionspuffer
enthalten ist, gegenüber der vom Hersteller empfohlenen Menge verdoppelt. Der im Kit
mitgelieferte Puffer N3, der zur Neutralisation nach der alkalischen Lyse und somit der
Fällung von Zellbestandteilen und Proteinen dient, wurde durch den in anderen von
Qiagen erhältlichen DNA-Präparations-Kits verwendeten Puffer P3 ersetzt. Dieser ent-
hält im Gegensatz zu N3 keine chaotropen Guanidiniumsalze. Letzteres inaktiviert Pro-
teine, würde also auch das zur Fragmentierung der BAC-DNA vor der Säulenreinigung
eingesetzte Restriktionsenzym unwirksam machen. Es erwies sich weiterhin als uner-
lässlich, die Klone seriell zu behandeln, also den Aufschluss der E. coli-Zellen für jeden
Klon einzeln nacheinander durchzuführen. Bei einer parallelen Präparation mehrerer
Klone hingegen, bei der man zunächst die Zellen aller Klone resuspendiert, dann alle
lysiert und anschliessend bei allen durch Neutralisation die Zellbestandteile fällt, wird
die Inkubationszeit der einzelnen Schritte zu lang. Dies wirkt sich aufgrund des ungün-
stigen Verhältnisses von Vektor-DNA zur chromosomalen DNA der E. coli-Zellen ne-
gativ auf die Ausbeute an BAC-DNA aus. Zur weiteren Ausbeutesteigerung wurde die
BAC-DNA vor der Säulenreinigung mit einer Restriktionsendonuclease fragmentiert, da
kleinere Fragmente sich besser von den Anionenaustauschersäulen eluieren lassen, wäh-
rend die sehr grosse intakte BAC-DNA sehr fest an das Säulenmaterial bindet.
4.2.4. Hybridisierungstechniken
Die Hybridisierungen zur physikalischen Kartierung wurden zunächst wie schon in frü-
heren Kartierungsprojekten (Hoheisel et al., 1993; Scholler et al., 1995; Hanke et al.,
1998) mit radioaktiv markierten Sonden durchgeführt. Da aber aufgrund der grossen
Diskussion
98
Sondenzahl mit einer erhöhten gesundheitlichen Belastung zu rechnen war, wurde nach
einer nicht-radioaktiven Markierungs- und Detektionsmethode gesucht. Auf das eben-
falls in unserer Arbeitsgruppe (P. Scholler, persönl. Mitteilung) schon etablierte Atto-
Phos-System (Boehringer, Mannheim) wurde dabei verzichtet, da die zur Detektion der
Fluoreszenzsignale benötigten Kapazitäten nicht verfügbar waren. Mit der chemilumi-
neszenten Detektion von mit Digoxigenin-markierten Sonden wurde eine Methode ge-
funden, die bei vergleichbarer Sensitivität der Hybridisierungen in der Handhabung
wesentlich unkomplizierter war als die Hybridisierung radioaktiv markierter Sonden.
Durch den hohen Durchsatz (bis zu 20 Hybridisierungen parallel) konnten die zur De-
tektion benötigten Mengen an Antikörper- und Substrat-Lösungen relativ gering gehal-
ten werden. Der grössere zeitliche Aufwand durch verschiedene Wasch- und Inkubati-
onsschritte wurde durch kürzere Expositionszeiten der Filme ausgeglichen. Durch die
Möglichkeit der Detektion der chemilumineszenten Signale auf Filmen konnte der be-
stehende Engpass bei den Scannerkapazitäten umgangen werden.
4.2.5. Kartierungsstrategie Chromosom V
Die Kartierung von Chromosom V wurde zunächst nur basierend auf der Cosmid-Sub-
Bibliothek begonnen. Dabei wurde in der Anfangsphase nach dem als „sampling wi-
thout replacement“ (Press et al., 1988) bezeichneten Verfahren vorgegangen, später
wurden zum Schliessen der Lücken Klone von contig-Enden als Sonde ausgewählt. Erst
zu einem sehr späten Zeitpunkt, als mit der Sub-Bibliothek keine Fortschritte mehr er-
zielt werden konnten, wurde zunächst die gesamt-genomische Cosmid-Bibliothek und
schliesslich auch die gesamt-genomische BAC-Bibliothek hinzugenommen. Durch die
Verwendung der gesamt-genomischen Bibliotheken in der späteren Phase des Kartie-
rens sollte sichergestellt werden, dass auch diejenigen Klone identifiziert werden konn-
ten, die aufgrund der relativ geringen Redundanz der Sub-Bibliotheken in diesen nicht
enthalten waren.
Sowohl praktische Erfahrung (Hoheisel et al., 1993) als auch theoretische Vorhersagen
(Grigoriev, 1993) haben gezeigt, dass zum lückenlosen Kartieren eine Anzahl von Son-
den ausreicht, die ungefähr der dreifachen Anzahl an Klonen entspricht, die zu einer
minimalen Klonabdeckung des zu kartierenden Abschnitts nötig sind. Für die Kartie-
rung von Chromosom V wurden jedoch mit 1192 Cosmidklonen und 82 BAC-Klonen
ca. 50% mehr als die berechneten 800 Cosmidsonden verwendet. Trotz dieser grossen
Zahl an Hybridisierungen gelang es nicht, die verbleibenden 20 Lücken in der physika-
Diskussion
99
lischen Karte zu schliessen. Die meisten der Sonden, die in der finalen Phase der Kartie-
rung hybridisiert wurden, lieferten nur redundante Informationen, ohne Lücken zwi-
schen contigs zu schliessen.
Da diese Lücken auch beim Sequenzieren lange bestehen blieben und sich hier trotz der
zusätzlichen Verwendung zweier Plasmid-Bibliotheken mit verschieden grossen Inserts
und einer YAC-Bibliothek bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt nur teilweise schliessen
liessen (B. Fartmann, persönl. Mitteilung), könnte es sich hier um Bereiche handeln, die
prinzipiell schlecht oder überhaupt nicht klonierbar sind. Eine Begründung dafür könnte
sein, dass auf diesen Abschnitten Gene lokalisiert sind, die für die beim Klonieren als
Wirtszellen verwendeten E. coli letal sind oder deren Wachstum stark hemmen. Solche
Abschnitte werden dann zwar kloniert, die betroffenen Zellen sterben jedoch ab und
werden dadurch nicht mit in die Bibliothek aufgenommen. In einem solchen Fall wäre
die Verwendung einer weiteren Bibliothek, die mit einem von E. coli-unabhängigen
Klonierungssystem generiert wurde, hilfreich gewesen. Da aber sowohl bei der Cosmid-
Bibliothek als auch bei der BAC-Bibliothek E. coli-Zellen als Wirt verwendet wurden,
kann ein Fehlen von Genomabschnitten durch eine letale oder stark wachstumshem-
mende Funktion der darauf befindlichen Gene nicht ausgeschlossen werden. Weiterhin
besteht die Möglichkeit, dass es Abschnitte im Genom gibt, die weder Schnittstellen für
die verwendete Restriktionsendonuklease EcoRI, noch für MboI haben. Sind solche
Abschnitte grösser als die durch die Klonierungsvektoren vorgegeben Ausschlussgrö-
ssen, können diese Abschnitte weder in den Cosmiden noch in BACs kloniert werden.
So ist z.B. von der Cosmid-Bibliothek bekannt, dass sie keine Klone mit telomeren Se-
quenzen enthält (Kelkar et al., 2001). Dies ist begründet durch die Sequenz der Telo-
mer-Region, die aus sehr vielen repetitiven Einheiten („repeats“) besteht, die keine
Schnittstellen für die beiden verwendeten Restriktionsendonukleasen beinhalten. Eben-
so ist das rRNA-Gencluster, das auf dem linken Arm von Chromosom V lokalisiert ist
(Radford & Parish, 1997), in der Cosmid-Bibliothek unterrepräsentiert (Kelkar et al.,
2001). Schon in früheren Genomprojekten wurde gezeigt, dass rRNA-Sequenzen
schwierig oder gar nicht zu klonieren sind (Johnston et al., 1997; Frohme et al., 2000).
Die Tatsache, dass trotz der Verwendung zweier verschiedener, theoretisch ausreichend
redundanter Bibliotheken und der Hybridisierung von weit mehr als der berechneten
Sondenanzahl noch Kartierungs- und Sequenzierungslücken bestehen blieben, lässt dar-
auf schliessen, dass die in den Lücken liegenden Abschnitte von Chromosom V in bei-
den Bibliotheken nicht vorhanden waren.
Diskussion
100
4.2.6. Kartierungsstrategie Chromosom II
Bei der physikalischen Kartierung von Chromosom II wurde eine andere Strategie ver-
folgt als bei der Kartierung von Chromosom V. Chromosom II wurde von Anfang an
basierend auf den Cosmid- und BAC-Sub-Bibliotheken kartiert, später wurden auch hier
in der Phase des Lücken-Schliessens beide gesamt-genomischen Bibliotheken verwen-
det. Während bei Chromosom V grösstenteils Cosmidklone als Sonden verwendet wur-
den, dienten bei Chromosom II sowohl BAC- als auch Cosmidklone als Sonde. Auch
für die Kartierung von Chromosom II wurde durch die Verwendung von 191 BAC-
Klonen und 273 Cosmidklonen die theoretische Zahl von 200 benötigten BAC-Sonden
überschritten. In der Endphase konnten trotz der Verwendung der hochredundanten ge-
samt-genomischen Bibliotheken analog zu Chromosom V bestehende contigs nur be-
stätigt werden, ohne die verbleibenden 12 Lücken zu schliessen. Deshalb wird auch hier
die Vermutung bestätigt, dass die in den Lücken plazierten Genomabschnitte nicht klo-
niert wurden.
Eine Methode zum Schliessen der bestehenden Sequenzlücken bestünde in der Verwen-
dung einer weiteren Bibliothek, die sich möglichst im Klonierungssystem und der
Insert-Grösse unterscheidet. Weiterhin besteht die Möglichkeit, Sequenzen an contig-
Enden als Primer zu verwenden, mit denen in einer PCR an genomischer DNA die feh-
lenden Sequenzen amplifiziert werden können. Dies ist aber nur bei Lücken möglich,
die kleiner als 3 kb sind. Eine aufwendigere Methode besteht darin, schrittweise be-
kannte Sequenzen durch Primerextension („primer walking“) auf genomischer DNA zu
verlängeren. Dies erfordert aber für jeden Schritt die Generierung neuer Primer und ist
dadurch sehr zeit- und kostenaufwendig.
Erst die genaue Analyse der vollständigen Sequenz beider Chromosomen wird zeigen,
welche Sequenzen in den zum jetzigen Zeitpunkt noch bestehenden Lücken liegen und
welche Gene in ihnen lokalisiert sind. Das wird erst letztendlich darüber Aufschluss
geben, welches die Ursachen für das Fehlen dieser Sequenzen in beiden Bibliotheken
waren.
Diskussion
101
4.3. Genexpressionsanalysen
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Genexpressionsanalysen unter Ver-
wendung der DNA-Chip-Technologie durchgeführt. Dazu wurde zunächst eine cDNA-
Bibliothek mittels PCR amplifiziert, die PCR-Produkte wurden anschliessend in einem
hochdichten Raster auf Glas-Chips transferiert. Um dieses System zu etablieren, wurden
exemplarisch drei verschiedene Wachstumsbedingungen ausgewählt, deren Transkripti-
onsprofile auf dem N. crassa-Chip erstellt wurden. Weiterhin wurde die Genexpression
von N. crassa mit der Genexpression der Hefe S. cerevisiae verglichen, um die Qualität
der Chips zu validieren.
4.3.1. DNA-Chip-Technologie
Obwohl die DNA-Chip-Technologie eine noch sehr junge Technologie ist, existieren
schon viele verschiedene Systeme, die sich vorallem in der Beschaffenheit der Oberflä-
che und in Art und Länge der auf den Chip aufzubringenden Nukleinsäuren unterschei-
den.
Neben vielen anderen Möglichkeiten der Oberflächen-Modifikation werden vor allem
zwei Typen von Glas-Chips verwendet. Zum einen werden Glas-Chips mit Poly-L-
Lysin beschichtet (Schena et al., 1995), die aufzubringende DNA, die durch die Phos-
phatgruppen mit negativen Ladungen versehenen ist, haftet durch Ladungswechselwir-
kungen an der positiv geladenen Oberfläche. Zum anderen gibt es Glas-Chips, deren
Oberfläche mit Aldehyd-Gruppen funktionalisiert ist. Die zu transferierende DNA muss
zusätzliche Aminogruppen enthalten, über die sie kovalent mit den an der Oberfläche
gebundenen Aldehyd-Gruppen verknüpft wird. Die benötigten Amino-Gruppen können
beispielsweise durch Amplifikation unter Verwendung von Amino-modifizierten PCR-
Primern eingefügt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden ausschliesslich Glas-Chips verwendet, die mit Poly-
L-Lysin beschichtet waren. Die Beschichtung ist nach einem in Stanford entwickelten
Protokoll leicht für bis zu 40 Chips parallel durchzuführen, wodurch nicht nur qualitativ
hochwertigere, sondern auch kostengünstigere Chips als die kommerziell erhältlichen
zugänglich sind (M. Beier, persönl. Mitteilung). Für die Amplifikation der cDNA-
Bibliothek können Standard-PCR-Primer ohne Modifikation verwendet werden.
Diskussion
102
4.3.2. Verwendete cDNA-Bibliothek
Neben der Oberflächenmodifikation unterscheiden sich DNA-Chips in Art und Länge
der auf den Chip aufzubringenden DNA. Häufig werden cDNA-Bibliotheken verwen-
det. Die cDNA-Fragmente werden mittels PCR amplifiziert, wobei meistens die Ver-
wendung eines universellen Primer-Paares möglich ist. Eine zweite Möglichkeit besteht
darin, mit Gen-spezifischen Primern genomische DNA zu amplifizieren. Nachteil dieser
Methode ist das aufwendige Design der spezifischen Primer-Paare und der erhöhte
Aufwand bei der Durchführung der PCR. Weiterhin ist die Verwendung von 50-70 bp
langen Oligonukleotiden möglich, wobei auch hier ein aufwendiges Design der Gen-
spezifischen Sequenzen nötig ist.
Die in der vorliegenden Arbeit für die Genexpressionsanalysen an N. crassa verwendete
cDNA-Bibliothek wurde freundlicherweise vom „Neurospora Genome Project“ (Uni-
versity of New Mexico, USA) zur Verfügung gestellt. Diese cDNA-Bibliothek setzt sich
aus drei Sub-Bibliotheken zusammen, die jede ein bestimmtes Entwicklungsstadium des
Lebenszyklus von N. crassa repräsentiert: Perithecium, Conidien und Mycel. Von ei-
nem grossen Teil der Bibliothek sind die entsprechenden EST´s (expressed sequence
tag) bekannt und in einer Datenbank (Genome Sequence DataBase GSDB; National
Center for Genome Resources NCGR) öffentlich zugänglich. Es handelt sich um eine
nicht-normalisierte Bibliothek, viele Gene liegen also in mehrfacher Kopienzahl vor. Da
bisher nicht alle in der Bibliothek enthaltenen cDNA-Klone sequenziert und analysiert
wurden, ist der genaue Grad der Redundanz jedoch nicht bekannt. Bei einer Untersu-
chung von 1423 zufällig ausgewählten Klonen (Nelson et al., 1997) wurden insgesamt
994 verschiedene Gene identifiziert. Dabei kamen 838 Gene (59 %) nur einmal vor, 156
Gene dagegen in Kopienzahlen zwischen 2 und 55.
Da die Anzahl der Gene von N. crassa auf 10-12.000 geschätzt wurde (Nelson et al.,
1997; Kelkar et al., 2001), ist die cDNA-Bibliothek mit 4700, teils redundanten Klonen
bei weitem nicht vollständig. Solange aber weder die vollständige Sequenz vorliegt,
noch alle Gene identifiziert wurden, ist diese bestehende cDNA-Bibliothek ein guter
Ansatz, um die DNA-Chip-Technologie für N. crassa zu etablieren. Liegen vom voll-
ständigen Gensatz EST-Klone vor, kann das bestehende System entsprechend erweitert
werden.
Diskussion
103
4.3.3. Amplifikation der cDNA-Bibliothek
Die Amplifikation der cDNA-Bibliothek wurde in 384er Mikrotiterplatten durchgeführt.
Vorteil dabei war, dass man die PCR-Platten direkt und ohne kontaminationsgefährdete
Umpipettierschritte aus den 384er Mikrotiterplatten der cDNA-Bibliothek animpfen
konnte. Da das Reaktionsvolumen bedingt durch das 384er-Format nur 25 µl betrug,
wurde jede Platte insgesamt dreimal amplifiziert, um über eine ausreichende Menge an
PCR-Produkt für Vorversuche und das Herstellen der DNA-Chips zu verfügen.
In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass sich bei Verwendung von Betain
als Zusatz zur PCR die PCR-Produkte direkt auf die mit Poly-L-Lysin beschichteten
Chips aufbringen lassen (Diehl et al., 2001). Da Betain eine stabilisierende Wirkung auf
DNA und Proteine hat (Santoro et al., 1992) und ausserdem zu einer Angleichung der
Stabilität von A-T- und G-C-Basenpaaren führt (Rees et al., 1993), trägt es einerseits
zur Optimierung der PCR-Bedingungen bei (Henke et al., 1997). Andererseits erhöht
der Zusatz von Betain die Viskosität der auf den Chip aufzubringenden Lösung und
verringert so deren Evaporationsgeschwindigkeit. Im Gegensatz zur Verwendung von
herkömmlichen Puffern wie 3xSSC bleiben die transferierten Tropfen der DNA-Lösung
mit dem sehr geringen Volumen von maximal 1 nl länger feucht. Die DNA, die allein
durch Ladungswechselwirkung an der Oberfläche haftet, kann sich dadurch einerseits
gleichmässiger über die Fläche des Tropfens verteilen, andererseits wird die Reaktions-
dauer verlängert. Beide Effekte führen dazu, dass mehr DNA an der Oberfläche gebun-
den werden kann.
4.3.4. Markierungsreaktion
Die Markierung von RNA-Proben mit Fluoreszenzfarbstoffen durch reverse Transkrip-
tion kann mit zwei verschiedenen Methoden durchgeführt werden. Zum einen besteht
die Möglichkeit des direkten Einbaus von Fluoreszenz-markierten Nukleotiden während
der reversen Transkription. Dieses Verfahren wird auch bei der radioaktiven Markie-
rung von RNA-Proben verwendet. Nachteil dieser Methode ist, dass der Einbau der
modifizierten Nukleotide aufgrund der Grösse des Fluoreszenzfarbstoffmoleküls ste-
risch stark gehindert ist. So wird normalerweise ein Einbau von einem Fluoreszenzfarb-
stoffmolekül pro 1000 Nukleotide erreicht (Daten nicht gezeigt). Die Menge an Ge-
samt-RNA, die zu einer erfolgreichen Markierung benötigt wird, liegt zwischen 20 und
50 µg. Eine zweite Möglichkeit der Markierung bietet der indirekte Einbau von Mar-
Diskussion
104
kern. In einem zweistufigen Verfahren wird zunächst während der reversen Transkripti-
on einzelsträngige cDNA generiert, die durch Einbau von Aminoallyl-dUTP modifiziert
ist. Im einem zweiten Schritt wird an diese Aminoallyl-Reste ein monoreaktiver Fluo-
reszenzfarbstoffester gekuppelt. Dieses indirekte Markierungsverfahren wurde dem di-
rekten Einbau Fluoreszenz-markierter Nukleotide vorgezogen, da es aufgrund der ge-
ringen sterischen Hinderung des Aminoallyl-dUTP zu höheren Einbauraten führt. So
konnte ein Einbau von einem Fluoreszenzfarbstoffmolekül auf 50-150 Nukleotide er-
reicht werden. Da bei N. crassa die Ausbeute an RNA nicht der limitierende Faktor ist,
wurden jedoch in die Markierung mindestens 7.5-15 µg Gesamt-RNA eingesetzt. Durch
diesen Überschuss soll gesichert werden, dass auch weniger häufig vorkommende Tran-
skripte detektiert werden können.
Sowohl bei der direkten als auch bei der indirekten Markierungsreaktion durch reverse
Transkription wird die cDNA-Erststrangsynthese ausgehend von Gesamt-RNA unter
Verwendung von Oligo(dT)-Primern durchgeführt. Dadurch kann auf den zeitaufwen-
digen und mit Ausbeute-Verlusten verbundenen Zwischenschritt einer mRNA-
Isolierung verzichtet werden (Hauser et al., 1998). Die Verwendung von Oligo(dT)-
Primern bot sich auch deshalb an, weil schon die cDNA-Bibliothek auf mRNA basiert,
die durch Fraktionierung von Gesamt-RNA durch Chromatographie an Oligo(dT)-
Cellulose gewonnen wurde (Lucas et al., 1970). Die zu den Sonden korrespondierenden
Transkripte werden somit in jedem Fall auch mit der Markierungsreaktion erfasst. Al-
ternativ zur Verwendung von Oligo(dT)-Primern für die reverse Transkription können
auch Hexamer-Oligonukleotide eingesetzt werden (Feinberg & Vogelstein, 1983). Da-
bei würde aber nicht nur die mRNA transkribiert werden, sondern vor allem auch ribo-
somale RNA, die 95% der Gesamt-RNA ausmacht. Eine vorangehende Isolierung von
mRNA wäre hier unumgänglich. Vorteil bei der Verwendung von Hexamer-
Oligonukleotiden wäre, dass sehr lange Transkripte gleichmässiger über ihre gesamte
Länge markiert würden, während bei der Verwendung von Oligo(dT)-Primern naturge-
mäss nur die Bereiche des Transkripts ausgehend vom 3´-Ende mit einer Länge bis zu 2
kb markiert werden. Weiterhin wäre die Verwendung eines Gemischs von Gen-
spezifischen Primern möglich. Dabei würden aber immer nur einzelne Gene markiert
werden, nicht die gesamte mRNA-Population.
Die in der vorliegenden Arbeit für die Markierung verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe
Cy3 und Cy5 (Mujumdar et al., 1993) eignen sich aufgrund ihrer gut getrennten Excita-
tions- und Emissionsspektren sehr gut für Zweifarben-Experimente auf DNA-Chips.
Diskussion
105
Nachteil der beiden Farbstoffe ist, dass sie bei Lichteinstrahlung wenig stabil sind. Die-
ses Ausbleichen macht sich bei Cy5 stärker bemerkbar als bei Cy3, weshalb beim De-
tektieren immer zuerst der Cy5-Kanal eingelesen wird. Gute Alternativen bieten die
Alexa™-Fluoreszenzfarbstoffe (Molecular Probes, Niederlande), die sich durch eine
stärkere Fluoreszenz und eine grössere Photostabilität auszeichnen (Wildsmith et al.,
2001). Da die für das verwendete Markierungssystem benötigten monoreaktiven Farb-
stoffester jedoch nur als Bestandteil sehr teurer Reaktionskits verfügbar waren, wurde
auf die Verwendung von Alexa-Farbstoffen verzichtet.
4.3.5. Hybridisierung
Für die Hybridisierung der komplexen Proben auf die DNA-Chips wurde ein Forma-
mid-haltiger Puffer (Welford et al., 1998) verwendet. Da Formamid eine destabilisie-
rende Wirkung auf Wasserstoffbrückenbindungen und somit auf die DNA-Helix hat,
wird die Schmelztemperatur der DNA erheblich herabgesetzt. Dadurch kann die Hybri-
disierung statt bei in wässrigen Puffern erforderlichen 65°C bei nur 42°C durchgeführt
werden, ohne die Stringenz der Hybridisierung herabzusetzen. Die Durchführung der
Hybridisierung in einem temperierten Wasserbad wird dadurch erleichtert. Ein wesent-
licher Vorteil des Formamid-haltigen Puffers gegenüber wässrigen Puffersystemen be-
steht jedoch darin, dass bei der Hybridisierung ein höheres Verhältnis von Signal zu
Hintergrund erzielt wird (Cheung et al., 1999). Um unspezifische Hybridisierungen zu
vermeiden und dadurch die Hintergrundsignale möglichst niedrig zu halten, enthielt der
Hybridisierungspuffer Blockierungsreagenzien wie Denhardt´s-Lösung, SDS und po-
ly(dA). Das ebenfalls im Hybridisierungspuffer enthaltene Dextransulfat trägt dazu bei,
die Hybridisierungskinetik zu beschleunigen (Wahl et al., 1979).
Die Durchführung von Genexpressionsanalysen durch die Hybridisierung einer kom-
plexen RNA-Probe auf einen DNA-Chip basiert auf dem Prinzip, dass die für ein Gen
detektierte Signalintensität direkt mit der Transkripthäufigkeit dieses Gens korreliert
(Schena et al., 1995; Nguyen et al., 1995). Um dies zu gewährleisten, muss die auf den
Chip aufgebrachte Menge an Sondenmaterial in deutlichem Überschuss zu der hybridi-
sierten Probe vorhanden sein. Aus dem Durchmesser der einzelnen Sondenpunkte
(spots) und der Konzentration der aufzubringenden DNA-Lösung, die im vorliegenden
Fall zwischen 100 und 200 ng/µl betrug, kann die auf dem Chip immobilisierte DNA-
Menge kalkuliert werden (Cheung et al., 1999), sie wird bei einem spot-Durchmesser
Diskussion
106
von 100 µm auf etwa 0.2-0.4 ng geschätzt. In die Markierungsreaktion durch reverse
Transkription wurden 15 µg Gesamt-RNA eingesetzt, was bei einem mRNA-Anteil von
etwa 5% einer Menge von 0.75 µg mRNA entspricht. Die reverse Transkription hat üb-
licherweise eine Effizienz von 10% (Granjeaud et al., 1999), so dass man an markierter
Probe etwa 75 ng erhält, die sich auf alle in der komplexen Probe enthaltenen mRNA-
Spezies verteilen. Die tatsächlich gemessene cDNA-Menge lag sogar meist unter die-
sem Wert (Daten nicht gezeigt). Selbst wenn ein Transkript mit der relativ grossen Häu-
figkeit von 1/1000 vorhanden ist, liegt es mit einer Menge von 0.075 ng noch deutlich
unter der korrespondierenden Sonde. Die Hybridisierung erreicht also nie den Sätti-
gungszustand der 100%igen Abdeckung der Sonden mit Probe. Nur dadurch ist ge-
währleistet, dass die detektierte Signalintensität einer Sonde nach der Hybridisierung
proportional ist zu der Häufigkeit des komplementären Transkripts in der komplexen
Probe.
Die Hybridisierungen wurden unter einem Deckglas durchgeführt, wodurch das benö-
tigte Volumen an Hybridisierungspuffer mit 24 µl sehr gering gehalten werden konnte.
Nachteil dieser Methode ist, dass es unter dem Deckglas zu keiner aktiven Vermischung
des Hybridisierungspuffers kommt. Bei Luftblasen oder einer ungleichmässigen Ver-
teilung der Lösung unter dem Deckglas kann es zu einem unregelmässigen Hybridisie-
rungsergebniss mit Bereichen von allgemein schwächeren Signalintensitäten kommen.
Die Hybridisierungskinetik beruht allein auf der Braun´schen Molekülbewegung. Diese
Nachteile werden jedoch durch die hohe Probenkonzentration ausgeglichen.
4.3.6. Genexpression von N.crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien
Die Genexpressionsanalysen wurden durchgeführt, um RNA-Proben aus Mycel von N.
crassa zu vergleichen, dass in drei verschiedenen Nährmedien gewachsen war. Im Mi-
nimalmedium diente Saccharose als einzige Kohlenstoff-Quelle, während im Acetat-
haltigen Medium die Saccharose durch Natriumacetat ersetzt worden war. Im Vollme-
dium war neben Saccharose zusätzlich Casein-Hydrolysat und Hefe-Extrakt enthalten.
Die Bedingung „Vollmedium“ wurde als Kontrolle eingesetzt, mit der die beiden Be-
dingungen „Minimalmedium“ und „Acetat“ verglichen wurden. Wie zu erwarten war,
wurden bei Wachstum unter diesen beiden Bedingungen etliche Gene im Vergleich zur
Kontrolle „Vollmedium“ induziert. Bei nur sehr wenigen Genen kam es zu einer gerin-
geren Expression gegenüber der Kontrolle. Da in beiden Bedingungen weniger Nähr-
Diskussion
107
stoffe zur Verfügung stehen als in der Kontrolle, werden hier mehr Stoffwechselwege
aktiviert, um den nötigen Energiebedarf decken zu können.
Die Gene mit der grössten Änderung ihrer Expression können in drei Gruppen unterteilt
werden. Zum einen gibt es eine kleine Gruppe von Genen, deren Expression bei
Wachstum in Vollmedium niedriger ist als bei Wachstum in Minimalmedium oder in
einem Acetat-haltigen Medium. Hierbei handelt es sich entweder um nicht sequenzierte
Klone oder um Gene, die funktionell noch nicht charakterisiert werden konnten. Aus-
nahme bildet das Gen, das für Halorhodopsin kodiert. Bei diesem Gen konnte die Ex-
pressionsänderung aber weder durch Standardabweichung-Separation noch durch
Min/Max-Separation der einzelnen wiederholten Datensätze validiert werden. Damit ist
der hier angegebene Repressionsfaktor statistisch nicht signifikant genug, um im fol-
genden diskutiert zu werden.
Eine zweite Gruppe umfasst die Gene, die nur bei Wachstum in Minimalmedium indu-
ziert werden. Besonders auffällig ist hier das Gen, das für das nmt1-Protein kodiert und
das in 45 Kopien in dieser Gruppe vorliegt. Bei Wachstum in Minimalmedium ist es um
das 10-fache stärker exprimiert, bei Wachstum auf Acetat-haltigem Medium immerhin
noch um mehr als das Doppelte. Dieses Protein ist an der Thiamin-Biosynthese betei-
ligt. Schon in früheren Studien (Maundrell, 1990; Hansen et al., 1998) konnte gezeigt
werden, dass die Expression von nmt1 (= no message in thiamine) durch Thiamin (Vit-
amin B1) vollständig reprimiert wird. Da das im Vollmedium enthaltene Hefe-Extrakt
reich an Vitamin B1 ist, wird das nmt1-Gen hier nicht transkribiert. Dagegen ist sowohl
im Minimalmedium als auch im Acetat-haltigen Medium kein Thiamin enthalten, die
Expression von nmt1 ist induziert. Die schwächere Induktion von nmt1 im Acetat-
haltigen Medium im Vergleich zum Minimalmedium könnte dadurch erklärt werden,
dass Acetat eine schlechte Nährstoffquelle für N. crassa ist, so dass der gesamte Stoff-
wechselapparat weniger aktiv ist oder auf alternative Stoffwechselwege fokussiert ist.
Die stark induzierte Expression von nmt1 in Minimalmedium (Maundrell, 1990) erklärt
auch die hohe Kopienzahl dieses Transkripts in der cDNA-Bibliothek, zu deren Her-
stellung ebenfalls auf Minimalmedium gewachsenes Mycel verwendet wurde.
Weiterhin zeigen bei Wachstum in Minimalmedium zwei Enzyme der Glykolyse eine
stärkere Expression: Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Glucokinase. Mit
der ATP-Synthase, dem Acylcarrier-Protein, dem ADP/ATP-Carrier-Protein und dem
Ubichinol-Cytochrom C-Reduktase Komplex werden vier Gene induziert, die an der
oxidativen Phosphorylierung beteiligt sind. Transaldolase ist als Enzym aus dem Pento-
Diskussion
108
sephosphat-Zyklus ebenfalls in Minimalmedium stärker exprimiert als in Vollmedium.
Sowohl die oxidative Phorphorylierung als auch der Pentosephosphatweg dienen der
Bereitstellung von Energie-Äquivalenten (ATP bzw. NADPH), die bei Wachstum im
nährstoffärmeren Minimalmedium für die verstärkte Aktivierung zusätzlicher Stoff-
wechselwege nötig sind. Durch den Pentosephosphat-Zyklus werden zusätzlich Pento-
sen und Tetrosen in wechselnden Verhältnissen erzeugt, die bei der Biosynthese von
Nukleosiden und Aminosäuren benötigt werden.
Diese Stoffwechselaktivierung wird auch deutlich an der Induktion der Gene, die für die
an der RNA-Synthese beteiligten ATP-abhängigen RNA-Helicase und dem an der Pro-
tein-Synthese beteiligten 60S ribosomalen Protein sowie dem Translation-
Elongationsfaktor 2 kodieren. Ein erhöhter Bedarf an Enzymen bedingt auch einen An-
stieg derjenigen Enzyme, die an der Synthese dieser benötigten Enzyme beteiligt sind.
Weiterhin wird z.B. auch die Expression des am Aminosäurestoffwechsel beteiligten
Histidin-3-Protein induziert, bei Wachstum in Minimalmedium um den Faktor 9, im
Acetat-haltigen Medium immerhin noch um den Faktor 2,8. Es wird benötigt zur Bio-
synthese von Histidin. Mit Northern Blot-Analysen (Legerton & Yanofsky, 1985)
konnte schon früher gezeigt werden, dass die Transkripthäufigkeit des Genkomplexes
his-3 bei Histidin-Mangel stark induziert ist.
Studien an dem phytopathogenen Pilz Fusarium spp. zum Gen sti35 (Choi et al., 1990),
das ebenfalls bei Wachstum in Minimalmedium induziert ist, konnten zeigen, dass die-
ses Gen bei verschiedenen Stress-Bedingungen wie Behandlung mit Alkohol, diversen
Chemikalien oder Hitze stark induziert wird. Die Induktion von sti35 in Minimalmedi-
um liefert nun einen Hinweis, dass auch ein geringer Nährstoffgehalt ähnlichen Stress
auf die Zellen auszuüben scheint. Dies scheint jedoch nicht für das Wachstum auf Ace-
tat-haltigem Medium zu gelten, da hier keine Induktion von sti35 zu beobachten ist. Die
genauen Mechanismen der Stressantwort durch sti35 sind bislang unbekannt.
Die dritte Gruppe beinhaltet die Gene, deren Transkription am stärksten bei Wachstum
im Acetat-haltigen Medium induziert wird. Diese Gene sind, wenn auch vergleichswei-
se schwächer, ebenfalls bei Wachstum in Minimalmedium induziert. Auffällig ist hier
die Induktion zweier Gene, von denen bislang nur bekannt ist, dass sie durch Licht in-
duziert werden: ccg-2 und ccg-6 (= clock-controlled gene) (Loros & Dunlap, 1991;
Bell-Pedersen et al., 1996). Die sehr hohe Expression dieser beiden Gene, die in abge-
schwächter Form auch bei Wachstum auf Minimalmedium beobachtet wird, kann daher
nicht unmittelbar mit dem Wachstum auf Acetat-haltigem Medium in Verbindung ge-
Diskussion
109
bracht werden. Eine mögliche Erklärung wäre, dass das Mycel dieser Bedingung im
Gegensatz zu dem Mycel der anderen beiden Bedingungen zu einem Zeitpunkt geernet
wurde, an dem aufgrund des zirkadianen Rhythmus von N. crassa unabhängig vom
Nährstoffangebot diese Licht-induzierten Gene stark exprimiert waren. Daran wird er-
sichtlich, welchen Einfluss die genaue Einhaltung der experimentellen Bedingungen auf
die Analyse und vorallem den Vergleich von Transkriptionsprofilen haben kann. Durch
die grosse zeitliche und örtliche Distanz zwischen Kultivierung der Mycel-Proben und
der Hybridisierung ihrer mRNA-Populationen auf die DNA-Chips war es jedoch nicht
mehr möglich, die genauen Wachstums- und Ernte-Bedingungen der einzelnen Proben
nachzuvollziehen. Alternativ besteht auch die Möglichkeit, dass hier neue, bislang un-
bekannte Regulationsmechanismen vorliegen, die bei Wachstum sowohl auf Acetat als
auch auf Minimalmedium zur Induktion von ccg-2 und ccg-6 führen. Das Produkt von
ccg-2 ist Hydrophobin (Bell-Pedersen et al., 1992), das ein Bestandteil der Conidien-
wände ist. Eine denkbare Alternative zur Lichtinduktion wäre daher, dass der Organis-
mus unter suboptimalen Bedingungen wie dem Wachstum auf nährstoffarmen Medien
verstärkt Conidien ausbildet, um so seine Überlebenschancen zu vergrössern. Dies wür-
de unabhängig von zirkadianem Rhythmus oder Lichteinwirkung zu einer Induktion
von ccg-2 führen.Von ccg-6 ist bisher keine biochemische Funktion bekannt, seine In-
duktion könnte aber ein Hinweis dafür sein, dass es analog zu ccg-2 an der Bildung der
Conidien beteiligt ist.
Weiterhin wird bei Wachstum auf Acetat-haltigem Medium die Expression von Cyclo-
philin A um das 14-fache induziert, in Minimalmedium noch um das 5-fache. Von Cy-
clophilin ist bekannt, dass es als Antwort auf Stresseinwirkungen wie z.B Hitze indu-
ziert wird (Joseph et al., 1999). Auch hier könnten bislang unbekannte Mechanismen
vorliegen, durch die Cyclophilin auch bei Nährstoffmangel bzw. Zugabe von Natriuma-
cetat induziert wird.
Ebenfalls bei Wachstum im Acetat-haltigen Medium induziert ist das Gen, das für die
Acetolactatsynthase kodiert. Dieses Enzym ist beteiligt an der Biosynthese von Valin.
Bei Untersuchungen der Acetolactatsynthase im Cyanobakterium Synechocystis (Mae-
stri & Joset, 2000) konnte gezeigt werden, dass es in Gegenwart von Na+-Ionen zu einer
Induktion kommt. Da beim Kultivieren der Probe „Acetat“ dem Nährmedium Natriu-
macetat zugesetzt worden war, liesse sich dieser Induktionsmechanismus auch auf N.
crassa übertragen.
Die Gene, die in mehrfacher Kopie vorliegen, können hinsichtlich ihrer Gewebe-
Diskussion
110
Spezifität untersucht werden. Betrachtet werden die Gene mit drei und mehr Kopien,
bei weniger Kopien ist das Vorkommen in einem Gewebetyp nicht repräsentativ genug
für dieses Gewebe. Das mit der sehr hohen Redundanz von 45 Kopien vorkommende
Gen nmt1 wurde sowohl in Conidien als auch im Mycel und im Perithecium exprimiert.
Seine Expression ist also unabhängig vom Gewebetyp, es wird konstitutiv exprimiert.
Dagegen wurde das Licht-induzierte Gen ccg-2 mit 12 Kopien nur in Conidien expri-
miert. Da das Produkt von ccg-2 Hydrophobin ist, das nur in Conidien vorkommt, ist
diese Gewebespezifität leicht erklärbar. Das Gen für das Stress-induzierbare Protein
STI35 wurde mit sechs Kopien sowohl in Conidien als auch in Mycel induziert, eine
besondere Gewebespezifität liegt hier demnach nicht vor.
Die Genexpressionsanalysen, die auf dem N. crassa-DNA-Chip exemplarisch für drei
verschiedene Wachtumsbedingungen für N. crassa-Mycel durchgeführt wurden, konn-
ten zeigen, dass bei Wachstum auf nährstoffarmen Medium im Vergleich zu Wachstum
auf nährstoffreichem Vollmedium viele Gene induziert werden. Dazu gehören vor allem
Gene, die an verschiedenen Stoffwechselwegen beteiligt sind, aber auch Stress-
induzierbare Gene.
4.4. Ausblick
Die Sequenzierung eines Organismus legt den Grundstein für systematische Funktions-
analysen seines Genoms. Eine physikalische Kartierung, wie sie in der vorliegenden
Arbeit für zwei Chromosomen des filamentösen Ascomyceten Neurospora crassa
durchgeführt wurde, trägt dazu bei, die Redundanz der generierten Sequenzierungsdaten
zu verringern, da aus der physikalischen Karte als lineare Anordnung überlappender
Klone gezielt benachbarte Klone mit geringem Überlappungsgrad für die Sequenzie-
rung ausgewählt werden können. Durch die ständig wachsenden Ressourcen an
hochautomatisierten Sequenzierungseinrichtungen werden inzwischen aber auch Orga-
nismen in der Grössenordnung von N. crassa (43 Mb) im „whole-genome-shotgun“-
Verfahren sequenziert, also ohne vorherige physikalische Kartierung. Durch ein ent-
sprechend grosses Aufgebot an Geräten und bioinformatischen Werkzeugen konnte die
zu 90 % vollständige Sequenzierung von N. crassa am Whitehead Institute Center for
Genome Research (WICGR, Massachusetts, USA) innerhalb weniger Monate durchge-
führt werden.
Diskussion
111
Durch eine detailierte Analyse wurde bei 74 % der bislang im Rahmen des deutschen
Neurospora Genom-Projekts erhaltenen Sequenzen von Chromosom II und V eine Ho-
mologie zu bekannten oder noch nicht charakterisierten Proteinen aus öffentlichen Da-
tenbanken gefunden. Dies stellt eine deutliche Verbesserung zu früheren Studien dar,
bei denen durch Datenbankvergleiche von EST-Sequenzen aus N. crassa gerade 40 %
der untersuchten Sequenzen durch Homologie einem Protein zugeordnet werden konn-
ten (Nelson et al., 1997; Braun et al., 2000). Dies zeigt, welches Potential in der syste-
matischen Analyse und Annotation eines sequenzierten Genoms steckt. Ausführliche
Homologie-Vergleiche vor allem mit der nah verwandten Hefe S. cerevisiae, aber auch
mit anderen bereits sequenzierten Organismen werden Aufschlüsse über Verwand-
schaftsgrade und evolutive Vorgänge geben können.
Mit der DNA-Chip-Technologie wurde eine Technik entwickelt, die es ermöglicht, die
Genexpression vieler tausend Gene gleichzeitig zu untersuchen. Der in der vorliegenden
Arbeit entwickelte N. crassa-DNA-Chip enthält zwar nur einen Teil aller Gene von
N. crassa, ist aber, da der vollständige Gensatz noch nicht bekannt ist, ein wichtiger
Schritt, um die DNA-Chip-Technologie für diesen Organismus zu etablieren. Er diente
dazu, exemplarisch die Genexpression unter drei verschiedenen Wachstumsbedingun-
gen miteinander zu vergleichen. Zukünftige Experimente könnten sich damit befassen,
die Änderungen der Genexpression auch unter zeitlichen Verläufen zu beobachten. Die
detailierte Untersuchung der bei der Erstellung der Transkriptionsprofile identifizierten
Gene wird helfen, regulatorische Mechanismen und bislang unbekannte Zusammenhän-
ge verschiedener Stoffwechselwege aufzudecken und zu erklären.
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Eigene Publikationen
121
6. Eigene Publikationen
Aign, V., Schulte, U. und Hoheisel, J. D. (2001)
Hybridization-based mapping of Neurospora crassa linkage groups II and V
Genetics, 157, (3), 1015-1020
Hoheisel, J.D., Diehl, F., Scheideler, M., Hauser, N., Aign, V., Matysiak, S. &
Beier, M. (2001).
Improving DNA-chip technology; chemical aspects.
in: Novel Approaches in Biosensors and Rapid Diagnostic Assays
(Liron, Z., Brohmberg, A. and Fisher, M., eds.),
Kluwer Academic/Plenum Publishers, London, 165-172.
Lebenslauf
122
7. Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name: Verena Aign
Anschrift: Friedensstr. 39
69121 Heidelberg
Geburtsdatum: 24.05.1972
Geburtsort: Frankfurt/ Main
Familienstand: ledig
Eltern: Dr. phil Bernhard Aign und Dr. med Renate Aign
Staatsangehörigkeit: deutsch
Schulausbildung:
1978-1982: Grundschule Landgraf-Ludwig-Schule, Bad Homburg
1982-1991: Gymnasium Kaiserin-Friedrich-Schule, Bad Homburg
Studium:
10/91-09/97 : Studium an der Technischen Hochschule Darmstadt (THD)
• Studiengang: Chemie
• Diplomarbeit am Institut für Biochemie, THD
Thema: „Ermittlung der cDNA-Sequenz von 5-Oxo-L-
prolinase aus Schwein“
seit 11/97 Promotion am Deutschen Krebsforschungszentrum, Heidelberg
Abtlg. Funktionelle Genomanalyse, Dr. Jörg Hoheisel
Thema: „ Physikalische Kartierung und Genexpressionsanalysen
im Genom von Neurospora crassa“