PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIrepository.usd.ac.id/17682/2/088114052_Full.pdf · PT. Ifars -Solo yang telah bersedia memberikan baku asam traneksamat

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASAM TRANEKSAMATDENGAN AGEN PENDERIVAT O-FTALALDEHID SECARA

SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Natalia Windari Rahardjo

NIM : 088114052

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA2012



SKRIPSI



Oleh:


NIM : 088114052


YOGYAKARTA2012



SKRIPSI



Oleh:


NIM : 088114052


YOGYAKARTA2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i



SKRIPSI



Oleh:


NIM : 088114052


YOGYAKARTA2012

i



SKRIPSI



Oleh:


NIM : 088114052


YOGYAKARTA2012

i



SKRIPSI



Oleh:


NIM : 088114052


YOGYAKARTA2012


ii

Persetujuan Pembimbing



Skripsi yang diajukan oleh:


NIM : 088114052

telah disetujui oleh:


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Trust in the LORD; and do good; so shalt thou dwell in theland, and verily thou shalt be fed. (Psalm 37:3)

We learn wisdom from failure much more than success. We often

discover what we will do, by finding out what we will not do.

Samuel Smiles

Karya ini kupersembahkan untuk:

Papa, Mama, Adikku atas doa, perhatian dan semangat yang

diberikan padaku.

Om Kiong Bing dan keluarganya yang telah banyak membantuku

dalam penyelesaian studi ini.

Penolong dan penyemangatku Franky

Almamaterku Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma


v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, Februari 2012

Penulis



vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAHUNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas SanataDharma:

Nama : Natalia Windari Rahardjo

Nomor mahasiswa : 088114052

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada PerpustakaanUniversitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:



beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikankepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalandata, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasiknnya di Internet ataumedia lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari sayamaupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama sayasebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal: 3 April 2012

Yang menyatakan

(Natalia Windari Rahardjo)


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas

segala anugerah dan penyertaan-Nya kepada penulis selama menyelesaikan

penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini.

Skripsi berjudul “Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Traneksamat

dengan Agen Penderivat O-Ftaladehid secara Spektrofotometri Ultraviolet” ini

disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

(S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Keberhasilan dalam penulisan skripsi ini juga tidak terlepas dari bantuan

dan dukungan berbagai pihak yang telah memberikan saran, kritik, dan dukungan

kepada penulis, maka dari itu penulis mengucapkan terima kasih yang setulus-

tulusnya kepada:

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pembimbing yang

dengan penuh kesabaran memberikan pengarahan, masukan, dukungan,

kritik dan saran baik selama penelitian maupun penyusunan skripsi ini.

3. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan

masukan, kritik dan saran yang bermanfaat untuk skripsi ini.

4. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku dosen penguji yang telah

memberikan masukan, kritik dan saran yang bermanfaat untuk skripsi ini.


viii

5. Lucia Wiwid Wijayanti M.Si. selaku dosen pembimbing akademik yang

telah memberikan semangat, masukan dan dukungan yang bermanfaat

kepada penulis dalam menjalankan studi di Fakultas Farmasi USD.

6. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen yang telah banyak

memberikan kritik, saran dan dukungan yang bermanfaat dalam

penyusunan skripsi ini.

7. PT. Ifars-Solo yang telah bersedia memberikan baku asam traneksamat

yang berguna dalam skripsi.

8. Anggun Aji Mukti, Fitriana Susanti dan Agnes Anania yang telah banyak

memberikan bantuan baik reagen o-ftalaldehid, diskusi, maupun

semangat dalam penyelesaian skripsi ini.

9. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman yang berharga

sehingga berguna dalam proses penyusunanan skripsi ini.

10. Pak Parlan dan Mas Bimo selaku laboran Laboratorium Kimia Organik

dan Laboratorium Kimia Analisis Instrumental, Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas bantuan dan kerjasamanya

selama penelitian.

11. Pak Bambang dan Mas Devi selaku laboran Laboratorium Analisis

Makanan, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta yang

telah banyak membantu selama proses penelitian di laboratorium.

12. Papa, Mama dan Novi, yang tak pernah bosan memberikan semangat,

doa, dan dukungan sampai akhirnya skripsi ini selesai.


ix

13. Om Kiong Bing dan keluarganya. Terimakasih atas segala bantuan yang

telah diberikan kepada penulis sehingga studi ini dapat selesai.

14. Teman seperjuanganku, Franky Limawan. Terima kasih atas

kebersamaan, kekompakan, semangat, pengalaman baik maupun buruk

selama melakukan penelitian ini. Semoga pengalaman berharga yang

telah kita lewati dapat berguna bagi masa depan kita kelak.

15. Yanuar, Jefta, Pius, Yuni, Elisa, Melisa, Usi, Satya, Edward, Widi dan

Cynthia. Terimakasih atas semua bantuan dan semangat yang diberikan

sehingga skripsi ini dapat selesai.

16. Teman-teman kosku Mba Icha, Bobo, Novia, Feny, Dewi, Elen, Novi,

Felis, Puji dan Anin yang selalu memberikan semangat dalam

penyelesaian skripsi ini.

17. Teman-teman FST A dan B 2008, terimakasih atas kebersamaan yang

telah kita lalui di fakultas farmasi ini. Semoga kebersamaan ini dapat

terus berlanjut.

18. Semua pihak lainnya yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah

membantu dalam penyelesaian skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan

skripsi ini, oleh karena itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang

membangun. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi setiap pembacanya.

Yogyakarta, Februari 2012

Penulis


x

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL.........................................................................................................................i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ...............................................................................ii

HALAMAN PENGESAHAN...........................................................................................................iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................................................................iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...........................................................................................v

PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH...........................................................................vi

PRAKATA........................................................................................................................................vii

DAFTAR ISI.....................................................................................................................................x

DAFTAR TABEL.............................................................................................................................xiv

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................................................xv

DAFTAR LAMPIRAN.....................................................................................................................xvii

INTISARI..........................................................................................................................................xx

ABSTRACT........................................................................................................................................xxi

BAB I PENGANTAR .....................................................................................................................1

A. Latar Belakang .............................................................................................................................1

1. Perumusan masalah..................................................................................................................4


xi

2. Keaslian Penelitian...................................................................................................................5

3. Manfaat Penelitian ...................................................................................................................5

B. Tujuan Penelitian..........................................................................................................................6

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ............................................................................................7

A. Asam Traneksamat.......................................................................................................................7

B. O-Ftalaldehid (OPA) ....................................................................................................................8

C. Derivatisasi ...................................................................................................................................10

D. Spektrofotometri UV....................................................................................................................13

E. Teknik Perhitungan Kuantitatif ....................................................................................................18

F. Kesalahan dalan Analisis ..............................................................................................................19

G. Validasi Metode Analisis .............................................................................................................21

1. Spesifisitas ...............................................................................................................................22

2. Linieritas ..................................................................................................................................23

3. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)..................................................................23

4. Ketepatan (accuracy) ...............................................................................................................24

5. Ketelitian (precision) ...............................................................................................................24

H. Landasan Teori .............................................................................................................................25

I. Hipotesis ........................................................................................................................................27


xii

BAB III METODE PENELITIAN ...............................................................................................29

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...................................................................................................29

B. Variabel Penelitian .......................................................................................................................29

C. Definisi Operasional .....................................................................................................................30

D. Bahan............................................................................................................................................30

E. Alat ...............................................................................................................................................31

F. Tata Cara Penelitian......................................................................................................................31

1. Pembuatan Dapar Borat pH 8 ..................................................................................................31

2. Pembuatan Larutan OPA..........................................................................................................31

3. Pembuatan Larutan Stok Asam Traneksamat ..........................................................................32

4. Pembuatan Larutan Intermediet Baku Asam Traneksamat......................................................32

5. Pembuatan Larutan Seri Baku dan Kurva Baku Asam Traneksamat ......................................32

6. Recovery Baku .........................................................................................................................33

7. Akurasi dan Presisi Menggunakan Standar Adisi....................................................................33

8. Analisis Hasil ...........................................................................................................................34

9. Penetapan Kadar Asam Traneksamat dalam Sampel Kapsul ..................................................35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................................37

A. Pembuatan Larutan.......................................................................................................................37


xiii

1. Larutan Asam traneksamat.......................................................................................................37

2. Larutan Dapar Borat.................................................................................................................37

3. Larutan OPA ............................................................................................................................38

4. Larutan Baku Asam traneksamat .............................................................................................41

B. Pembuatan Kurva Baku Asam Traneksamat ................................................................................44

C. Validasi Metode............................................................................................................................47

1. Spesifisitas ...............................................................................................................................47

2. Linieritas ..................................................................................................................................52

3. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)..................................................................52

4. Akurasi .....................................................................................................................................56

5. Presisi .......................................................................................................................................58

D. Penetapan Kadar Asam Traneksamat dalam Kapsul....................................................................59

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ..........................................................................................64

A. Kesimpulan ..................................................................................................................................64

B. Saran .............................................................................................................................................64

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................................65

LAMPIRAN......................................................................................................................................69

BIOGRAFI PENULIS ......................................................................................................................132


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Kategori pengujian parameter validasi ..................................................Error! Bookmark not defined.22

Tabel II. Kriteria penerimaan recovery berdasarkan kadar analit ......................Error! Bookmark not defined.24

Tabel III. Kriteria penerimaan RSD dari ketentuan Horwitz dan dari

ketentuan AOAC Peer Verified Methods (PVM) berdasarkan

kadar analit.................................................................................................Error! Bookmark not defined.25

Tabel IV. Data replikasi kurva baku asam traneksamat ........................................Error! Bookmark not defined.46

Tabel V. Hasil penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel batch 1 .......Error! Bookmark not defined.61

Tabel VI. Hasil penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel batch 2...... Error! Bookmark not defined.62


xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur asam traneksamat .................................................................Error! Bookmark not defined.7

Gambar 2. Struktur o-ftalaldehid .........................................................................Error! Bookmark not defined.8

Gambar 3. Reaksi o-ftalaldehid dengan amina primer ........................................Error! Bookmark not defined.9

Gambar 4. Diagram Tingkat Energi Elektronik...................................................Error! Bookmark not defined.14

Gambar 5. Spektrofotometer Single-beam...........................................................Error! Bookmark not defined.17

Gambar 6. Spektrofotometer Double-beam .........................................................Error! Bookmark not defined.17

Gambar 7. Reaksi Cannizzaro pada OPA ............................................................Error! Bookmark not defined.40

Gambar 8. Usulan reaksi fotodegradasi OPA ......................................................Error! Bookmark not defined.41

Gambar 9. Spektra absorbansi OPA dalam dapar borat pH 8..............................Error! Bookmark not defined.42

Gambar 10. Penurunan absorbansi hasil derivatisasi asam traneksamat

dengan OPA .......................................................................................Error! Bookmark not defined.43

Gambar 11. Reaksi antara asam traneksamat dengan OPA dengan adanya

merkaptoetanol menghasilkan senyawa hasil

derivatisasi............... ..........................................................................Error! Bookmark not defined.44

Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom dari senyawa hasil

derivatisasi .........................................................................................Error! Bookmark not defined.44

Gambar 13. Hubungan antara kadar asam traneksamat dengan absorbansi

hasil derivatnya replikasi I .................................................................Error! Bookmark not defined.47


xvi

Gambar 14. Spektra hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA

setelah 4 menit reaksi .........................................................................Error! Bookmark not defined.48

Gambar 15. Spektra hasil degradasi produk derivatisasi asam

traneksamat dengan OPA setelah 35 menit reaksi .............................Error! Bookmark not defined.49

Gambar 16. Reaksi degradasi produk derivatisasi asam traneksamat

dengan OPA ......................................................................................Error! Bookmark not defined.49

Gambar 17. Spektra hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA

setelah 4 menit reaksi dan tingkat overlapping yang terjadi..............Error! Bookmark not defined.50

Gambar 18. Spektra larutan asam traneksamat dalam sampel kapsul

tanpa derivatisasi menggunakan OPA ...............................................Error! Bookmark not defined.51

Gambar 19. Spektra larutan asam traneksamat 30 µg/mL (dari sampel

kapsul) dengan OPA setelah 4 menit reaksi.......................................Error! Bookmark not defined.51

Gambar 20. Kurva baku untuk menghitung LOD dan LOQ replikasi I ................Error! Bookmark not defined.53


xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat analisis asam traneksamat.................................................. Error! Bookmark not defined.70

Lampiran 2. Hasil scanning panjang gelombang larutan OPA dalam

dapar borat pH 8 segera setelah dibuat .............................................. Error! Bookmark not defined.71


dapar borat pH 8 setelah 1 jam dibuat ............................................... Error! Bookmark not defined.72


dapar borat pH 8 setelah 2 jam dibuat ............................................... Error! Bookmark not defined.73


dapar borat pH 8 setelah 3 jam dibuat ..............................................sError! Bookmark not defined.74


dapar borat pH 8 setelah 4,5 jam dibuat ............................................ Error! Bookmark not defined.75

Lampiran 7. Hasil scanning panjang gelombang hasil derivatisasi asam

traneksamat dan OPA setelah 4 menit reaksi .................................... Error! Bookmark not defined.76

Lampiran 8. Hasil scanning panjang gelombang hasil degradasi dari

hasil derivatisasi antara asam traneksamat dan OPA setelah

35 menit reaksi................................................................................... Error! Bookmark not defined.77

Lampiran 9. Spektra penurunan absorbansi hasil derivatisasi asam

traneksamat dengan OPA selama 1 jam ............................................ Error! Bookmark not defined.78

Lampiran 10. Contoh perhitungan kadar larutan baku asam traneksamat ............... Error! Bookmark not defined.80


xviii

Lampiran 11. Perhitungan persamaan kurva baku asam traneksamat ..................... Error! Bookmark not defined.81

Lampiran 12. Range linieritas kurva baku asam traneksamat.................................. Error! Bookmark not defined.83

Lampiran 13. Pembuatan kurva baku asam traneksamat untuk

menghitung LOD dan LOQ............................................................... Error! Bookmark not defined.87

Lampiran 14. Perhitungan LOD dan LOQ teoritis................................................... Error! Bookmark not defined.90

Lampiran 15. Perhitungan LOD dan LOQ praktis ................................................... Error! Bookmark not defined.92

Lampiran 16. Perhitungan akurasi dan presisi larutan baku asam

traneksamat ........................................................................................ Error! Bookmark not defined.94

Lampiran 17. Spektra larutan asam traneksamat dalam serbuk kapsul

tanpa derivatisasi menggunakan OPA............................................... Error! Bookmark not defined.97

Lampiran 18. Spektra hasil derivatisasi asam traneksamat dari sampel

kapsul................................................................................................. Error! Bookmark not defined.98

Lampiran 19. Penetapan kadar asam traneksamat dalam kapsul batch 1 ................ Error! Bookmark not defined.99


traneksamat dalam sampel serbuk kapsul batch 1............................. Error! Bookmark not defined.104

Lampiran 21. Penetapan kadar asam traneksamat dalam kapsul batch 2 ................ Error! Bookmark not defined.109


traneksamat dalam sampel serbuk kapsul batch 2............................. Error! Bookmark not defined.113

Lampiran 23. Penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel serbuk

kapsul batch 1.................................................................................... Error! Bookmark not defined.118


xix

Lampiran 24. Penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel serbuk

kapsul batch 2.................................................................................... Error! Bookmark not defined.119

Lampiran 25. Perhitungan standar deviasi slope dan intersep dari kurva

baku untuk LOQ dan standar deviasi slope dan intersep

dari kurva adisi pada batch 1............................................................. Error! Bookmark not defined.120

Lampiran 26. Perhitungan standar deviasi slope dan intersep dari kurva

baku untuk LOQ dan standar deviasi slope dan intersep

dari kurva adisi pada batch 2............................................................. Error! Bookmark not defined.124

Lampiran 27. Uji signifikansi slope pada kurva LOQ dengan slope pada

kurva adisi batch 1 dan batch 2 ......................................................... Error! Bookmark not defined.128

Lampiran 28. Uji signifikansi intersep pada kurva LOQ dengan intersep

pada kurva adisi batch 1 dan batch 2 ................................................ Error! Bookmark not defined.130


xx

INTISARI

Asam traneksamat merupakan senyawa dengan amina primer yang hanyamemiliki gugus kromofor pendek dan tidak memiliki auksokrom, sehingga tidakdapat ditetapkan kadarnya secara langsung menggunakan spektrofotometerultraviolet (UV) ataupun visible (Vis). Untuk dapat menetapkan kadarnya, perludilakukan derivatisasi menggunakan agen penderivat tertentu dan menghasilkansenyawa turunan asam traneksamat yang memiliki kromofor dan auksokrom yangcukup untuk dapat ditetapkan kadarnya menggunakan spektrofotometer UV. Olehkarena itu, dalam penelitian ini dilakukan pengembangan metode spektrofotometriUV dengan derivatisasi menggunakan agen penderivat o-ftalaldehid (OPA) untukmenetapkan kadar asam traneksamat dalam kapsul asam traneksamat®.

Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental dengan rancanganpenelitian deskriptif. Pada penelitian ini dilakukan pembuatan kurva bakumenggunakan regresi linier antara kadar asam traneksamat dengan absorbansihasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA. Untuk menentukan validitasmetode, digunakan parameter spesifisitas, linearitas, batas deteksi, bataskuantitasi, ketepatan, dan ketelitian.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai koefisien korelasi (r) darikurva baku hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA sebesar 0,9998,rentang nilai recovery-nya sebesar 98,44-101,63%, rentang nilai CV sebesar0,190-1,261%, batas deteksinya 0,227 µg/mL dan batas kuantitasinya 0,758µg/mL pada pengukuran di panjang gelombang 334 nm. Maka dapat disimpulkanbahwa metode ini memiliki validitas yang baik untuk spesifisitas, linearitas, batasdeteksi, batas kuantitasi, ketepatan, dan ketelitiannya.

Kata kunci : asam traneksamat, o-ftalaldehid (OPA), spektrofotometri UV,

validasi


xxi

ABSTRACT

Tranexamic acid is a compound with primary amine which have shortchromophore and have not auxochrome, so can not be directly determined byultraviolet (UV) spectrophotometry method nor visible (Vis) spectrophotometry.To determine that compound, it needs derivatization with a specific derivatizingagent to produce the derivate of tranexamic acid which have enough chromophoreand auxochrome to determined by ultraviolet (UV) spectrophotometry method.This research is to develop spectrophotometry method with derivatization by o-phthalaldehyde (OPA) to determine the level of tranexamic acid concentration inpharmaceutical product (asam traneksamat® capsule).

This research is a descriptive non experimental research. In this study,done by making a standard curve of derivate of tranexamic acid by using a linearregression between concentration of tranexamic acid against the derivate oftranexamic acid absorbance. To determine the validity of the method, parameterssuch as selectivity, linearity, limit of detection, limit of quantitation, accuracy, andprecision were determined.

The result of correlation coefficient (r) of standard curve of derivate oftranexamic acid was 0.9998, range of recovery values were 98.44-101.63%, rangeof CV values were 0.190-1.261%, limit of detection was 0.227 µg/mL and limit ofquantitation was 0.758 µg/mL, which measured in 334 nm. Therefore, it can beconcluded that the method has good validity for specificity, linearity, limit ofdetection, limit of quantitation, accuracy, and precision.

Keywords: tranexamic acid, o-phthalaldehyde (OPA), UV spectrophotometry,validation


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Asam traneksamat merupakan senyawa yang digunakan untuk

pengobatan jangka pendek pada orang yang memiliki gangguan pendarahan

(hemofilia) untuk mencegah dan mengurangi pendarahan ketika pencabutan gigi.

Senyawa ini juga digunakan pada orang dengan kondisi risiko pendarahan tinggi

untuk mengontrol pendarahan pada saat-saat seperti setelah operasi atau cidera,

selama mimisan berat, atau selama menstruasi berat. Asam traneksamat bekerja

dengan membantu pembekuan darah secara normal untuk mencegah dan

menghentikan pendarahan berkepanjangan. Senyawa ini termasuk dalam kelas

obat yang disebut anti-fibrinolitik (Anonim, 2011).

Saat ini asam traneksamat telah tersedia dalam beberapa bentuk sediaan

obat salah satunya yaitu bentuk kapsul. Untuk menjaga keamanan dan khasiat dari

suatu sediaan obat, diperlukan suatu metode yang valid dan cepat dalam

menetapkan kadar asam traneksamat, sehingga kualitas dan mutu sediaan kapsul

tersebut terjamin.

Dilihat dari struktur molekulnya, asam traneksamat merupakan senyawa

amin primer dan merupakan turunan dari asam amino lisin (Dunn and Goa, 1999).

Senyawa ini tidak memiliki kromofor dan auksokrom yang cukup sehingga tidak

dapat ditetapkan kadarnya secara langsung menggunakan spektrofotometri UV

atau vis. Oleh karena itu, metode derivatisasi dibutuhkan untuk menghasilkan


2

senyawa turunan asam traneksamat dengan perpanjangan kromofor dan

bertambahnya auksokrom untuk dapat dideteksi menggunakan spektrofotometri

UV sehingga dapat ditetapkan kadarnya dengan lebih spesifik dan sensitif.

Beberapa penelitian yang telah dilakukan sebelumnya yaitu analisis

kuantitatif asam traneksamat dalam serum manusia menggunakan kromatografi

cair detektor electrospray ionisasi spektrofotometri masa (Delyle, Abe, Batisse,

Tremey, Fischler, Devillier et al., 2010), determinasi asam traneksamat

menggunakan kromatografi cair spektrofotometri massa tandem (Chang, Yin,

and Chow, 2004), determinasi asam traneksamat dalam tablet dengan HPLC dan

detektor ELS (Evaporative Light Scattering) (Patil, Rane, Sangshetti, and Shinde,

2010), metode spektrofotometri untuk estimasi simultan ethamsylate dan asam

traneksamat dalam sediaan tablet kombinasi (Issarani, Vankar, and Nayak, 2010).

Namun demikian, beberapa instrumen tersebut di atas yang digunakan dalam

penelitian asam traneksamat tidak dimiliki oleh kebanyakan laboratorium analisis

di Indonesia karena terlalu canggih.

Penetapan kadar asam traneksamat dapat dilakukan dengan metode

konvensional titrasi. Dilihat dari strukturnya, asam traneksamat memiliki sifat

asam yang terletak pada gugus karboksilatnya, sehingga dapat ditetapkan

kadarnya menggunakan metode titrasi alkalimetri. Analisis asam traneksamat

dapat dilakukan secara titrasi alkalimetri dengan deteksi menggunakan

potensiometri (Anonim, 2005a). Namun, titrasi konvensional hanya dapat

dilakukan pada senyawa tunggal dengan kadar besar seperti pada bahan baku atau

sediaan dengan zat aktif tunggal. Hal ini disebabkan karena titrasi konvensional


3

memiliki selektifitas dan sensitifitas yang lebih rendah dibandingkan dengan

metode spektrofotometri UV.

Berdasarkan data tersebut, masih jarang ditemukan adanya penetapan

kadar asam traneksamat menggunakan spektrofotometri padahal metode

spektrofotometri memiliki kelebihan mudah dan cepat dalam penggunaannya,

memiliki selektivitas dan sensitivitas yang cukup baik untuk penetapan kadar

senyawa tunggal dalam suatu sediaan serta merupakan metode dengan instrumen

yang umum digunakan pada laboratorium di Indonesia. Untuk dapat dianalisis

menggunakan spektrofotometri, asam traneksamat harus diderivatisasi

menggunakan agen penderivat sehingga menghasilkan senyawa yang memiliki

kromofor dan auksokrom.

Salah satu agen penderivat yang dapat digunakan untuk derivatisasi asam

traneksamat yaitu o-ftaladehid (OPA) (Danielson, Gallaghe, and Bao, 2000). OPA

banyak digunakan untuk derivatisasi asam amino karena reaksinya cepat dan

hanya bereaksi dengan amina primer dalam medium larutan basa (pH 9-11) dan

dengan adanya merkaptan (seperti 2-mercaptoethanol) untuk membentuk derivat

indol yang berfluoresensi (Coppex, 2000). OPA dipilih karena memiliki kelebihan

lain seperti, OPA memiliki sensitivitas yang tinggi bila dibandingkan dengan agen

penderivat lain yang umum digunakan seperti fluoresamin dan ninhidrin.

Fluoresamin mudah terhidrolisis dalam air, derivat fluoresen yang dihasilkan

fluoresamin sangat tidak stabil dalam pelarut air dan sensitivitasnya 2-5 kali lebih

rendah dari pada hasil derivatisasi dengan OPA. Reaksi antara amina primer (α-

asam amino) dengan ninhidrin membutuhkan waktu yang lebih lama jika


4

dibandingkan dengan OPA (Coppex, 2000). OPA memiliki gugus aldehid yang

dapat bereaksi dengan gugus amina primer pada asam traneksamat dan

menghasilkan senyawa hasil derivatisasi yang memiliki kromofor dan auksokrom

sehingga dapat dideteksi menggunakan spektrofotometri UV.

Penelitian ini merupakan penelitian gabungan dari optimasi metode

dengan agen penderivat o-ftalaldehid secara spektrofotometri UV, sehingga

setelah mendapatkan metode yang optimal, perlu dilakukan validasi metode agar

metode tersebut dapat digunakan untuk penetapan kadar asam traneksamat dalam

sediaan kapsul asam traneksamat®. Validasi metode ini dilakukan untuk

memenuhi parameter spesifisitas, presisi, akurasi dan linieritas sehingga ada

jaminan bahwa metode yang digunakan ini dapat dipercaya. Setelah parameter

validasi metode pengukuran asam traneksamat tersebut terpenuhi, maka

didapatkan metode yang valid dan reprodusibel dalam penetapan kadar asam

traneksamat dalam sediaan kapsul asam traneksamat®.

1. Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat disusun permasalahan

sebagai berikut:

1. Apakah penetapan kadar asam traneksamat dengan agen penderivat

OPA secara spektrofotometri UV memenuhi parameter spesifisitas,

linieritas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi dan presisi?

2. Apakah metode spektrofotometri ultraviolet (UV) yang telah

tervalidasi dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar asam

traneksamat dalam kapsul asam traneksamat®?


5

2. Keaslian Penelitian

Berdasarkan data-data penelitian yang telah dilakukan sebelumnya,

masih jarang ditemukan metode untuk menetapkan kadar asam traneksamat

menggunakan spektrofotometri UV di Indonesia. Sejauh peneliti mengetahui,

determinasi asam traneksamat dalam tablet pernah dilakukan menggunakan

metode HPLC dan detektor ELS (Patil et al., 2010). Determinasi asam

traneksamat dalam serum manusia pernah dilakukan dengan HPLC menggunakan

derivatisasi pre-kolom fenil isotiosianat (Matsubayashi, Kojima, and Tachizawa,

1988) dan menggunakan kromatografi cair yang dikombinasikan dengan deteksi

spektrofotometri massa ionisasi electrospray (Delyle et al., 2010).

Analisis asam traneksamat menggunakan metode spektrofotometri yang

pernah dilakukan sebelumnya yaitu estimasi asam traneksamat dan ethamsilat

secara berkesinambungan dalam tablet kombinasi (Issarani et al., 2010). Selain

itu, determinasi asam traneksamat dalam sediaan hidrogel dengan metode

spektrofotometri juga pernah dilakukan menggunakan penderivat naphthalene-

2,3-dicarboxaldehyde/cyanide (Duangrat, Wongsri, and Pongpaibul, 2007).

3. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan memiliki manfaat sebagai berikut:

a. Manfaat teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi

di dunia kefarmasian, khususnya di bidang industri obat asam traneksamat

mengenai metode spektrofotometri UV dengan agen penderivat OPA untuk

menetapkan kadar asam traneksamat dalam sediaan kapsul asam traneksamat®

yang memiliki akurasi, presisi, spesifisitas dan linearitas yang baik.


6

b. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

sumbangan ilmiah mengenai metode alternatif untuk penetapan kadar asam

traneksamat, yaitu menggunakan agen penderivat OPA dengan metode

spektrofotometri UV.

c. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat menyediakan metode

penetapan kadar asam traneksamat yang valid dan dapat dimanfaatkan oleh pihak

industri dalam penjaminan kualitas produknya.

B. Tujuan Penelitian

Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka penelitian

ini bertujuan untuk:

1. Mengetahui spesifisitas, linieritas, batas deteksi, batas kuantitasi,

akurasi dan presisi metode penetapan kadar asam traneksamat dengan

agen penderivat OPA secara spektrofotometri UV.

2. Mengetahui bahwa metode spektrofotometri UV yang telah tervalidasi

untuk menetapkan kadar asam traneksamat menggunakan agen

penderivat OPA dapat diaplikasikan pada sediaan kapsul asam

traneksamat®.


7

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Asam Traneksamat

Gambar 1. Struktur asam traneksamat

Asam traneksamat seperti yang ditunjukkan oleh gambar 1 memiliki

rumus molekul C8H15NO2 dengan berat molekul 157,21 g/mol dan titik lebur 386-

392° C. Kelarutan asam traneksamat dalam air sekitar 1g/6 mL, sangat sedikit

kelarutannya dalam alkohol, eter, praktis tidak larut dalam kebanyakan pelarut

organik lain dan tidak higroskopis (Anonim, 2001). Asam traneksamat (trans-4-

(Aminomethyl) cyclohexanecarboxilic acid) merupakan turunan sintetik asam

amino lisin yang memiliki efek antifibrinolitik dengan cara memblok sisi ikatan

lisin dengan plasminogen dan banyak digunakan untuk mengatasi gangguan

pendarahan (Dunn and Goa, 1999).

Asam traneksamat memiliki gugus fungsional karboksil dan amina,

dimana nilai absorptivitas molar dari karboksil yaitu sebesar 50-70 M-1.cm-1

dengan panjang gelombang 200-210 nm sedangkan nilai absorptivitas molar

amina sebesar 2,80 M-1.cm-1 dengan panjang gelombang 195 nm (Willard,

Merritt, Dean, and Settle, 1988). Namun pada panjang gelombang sekitar 210 nm


8

masih ditemukan banyak gangguan yang berasal dari pelarut yang dapat dideteksi

juga pada panjang gelombang sekitar 210 nm. Selain itu, nilai absorptivitas molar

senyawa ini sangat kecil, maka akan kesulitan untuk dideteksi menggunakan

spektrofotometer UV.

B. O-Ftalaldehid (OPA)

Gambar 2. Struktur o-ftalaldehid

OPA dengan rumus molekul C8H6O2 seperti yang ditunjukkan gambar 2

memiliki bentuk kristal atau serbuk berwarna kuning. Bobot molekul OPA

sebesar 134,14 g/mol, OPA larut dalam metanol dan dietil eter (Anonim, 2005b).

OPA banyak digunakan untuk derivatisasi asam amino karena reaksinya cepat dan

hanya bereaksi dengan amina primer dalam medium larutan basa (pH 9-11) dan

dengan adanya merkaptan (seperti 2-mercaptoethanol) untuk membentuk derivat

indol yang berfluoresensi (Gambar 3). Reaksi derivatisasi terjadi pada suhu ruang

selama 2 menit dalam campuran dapar borat (pH 6-8 untuk amina primer) dan

metanol. Reaksi derivatisasi menggunakan OPA pada amina primer sempurna

dalam waktu 5 menit pada suhu ruangan, namun hasil derivatnya yang berupa

isoindol sangat tidak stabil (Coppex, 2000).


9

Gambar 3. Reaksi o-ftalaldehid dengan amina primer

Analisis protein menggunakan OPA cepat dan sensitif. Reaksinya selesai

dalam waktu kurang dari 1 menit. Reaksi ini berlangsung secara spontan,

sehingga reaksinya berlangsung dalam beberapa menit. Metode ini sensitif (dapat

mendeteksi protein dalam rentang kadar nanogram) dan o-ftalaldehid lebih stabil

dibandingkan fluorescamine (Ahmed, 2004).

OPA memberikan sensitivitas deteksi yang lebih besar dibanding agen

penderivat lainnya. Hal ini disebabkan karena dua kriteria penting: yang pertama,

OPA tidak berfluoresensi sendiri sehingga tidak akan mengganggu deteksinya

(Toyo’oka, 1999). Kedua, reaksinya terjadi dengan cepat pada suhu kamar

sehingga meminimalkan penggunaan waktu yang lama (Blackburn, 1989).

Kelebihan OPA dibandingkan ninhidrin yaitu selain sensitivitasnya

rendah, ninhidrin memerlukan waktu reaksi yang lama dan biaya instrumen yang


10

tinggi (Lindroth, Hamberger, and Sandberg, 1985). Reaksi derivatisasi

menggunakan OPA dapat diaplikasikan untuk derivatisasi pre- atau post- kolom.

Pada pre-kolom, derivatisasi dapat dicapai secara manual atau otomatis dengan

mengontrol waktu reaksi dan interval waktu sebelum injeksi. Metode tersebut

memberikan sensitivitas yang tinggi dan reprodusibilitas analisis. OPA juga

digunakan pada analisis post-kolom karena waktu reaksi yang singkat dan sifat

fluorogenik (tidak berfluoresen) (Coppex, 2000).

C. Derivatisasi

Dalam suatu analisis, kemungkinan banyak terdapat zat-zat yang

memberikan absorbansi maksimal pada panjang gelombang 200-210 nm,

umumnya merupakan bahan-bahan yang digunakan sebagai pelarut, khususnya

yang mempunyai ikatan hidrogen. Proses derivatisasi dilakukan untuk mengatasi

keadaan tersebut dengan cara:

1. Mereaksikan zat yang dianalisis dengan zat tertentu sehingga terjadi pergeseran

panjang gelombang maksimal ke arah pergeseran merah.

2. Mereaksikan zat yang dianalisis dengan zat tertentu sehingga menghasilkan

senyawa yang berfluoresensi.

Perlu diperhatikan bahwa zat penderivat harus memberikan reaksi yang

cepat dan stabil serta meningkatkan sensitivitas pengukuran (Mulja dan

Suharman, 1995). Selain OPA, agen penderivat yang dapat digunakan untuk

derivatisasi amina menurut Toyo’oka (1999) yaitu:


11

1. Ninhidrin

Ninhidrin hanya bereaksi dengan amina primer (terutama α-asam amino

kecuali untuk sistein). Hasil derivatisasinya memiliki sensitivitas yang rendah,

waktu reaksi yang lama dan biaya instrument yang tinggi.

2. Fluoresamin

Fluoresamin mudah terhidrolisis dalam air, derivat fluoresen yang

dihasilkan fluoresamin sangat tidak stabil dalam pelarut air dan sensitivitasnya

2-5 kali lebih rendah dari pada hasil derivatisasi dengan OPA.

3. 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (FDNB)

FDNB bereaksi dengan gugus amina primer dan sekunder menghasilkan

2,4-dinitrophenyl (DNP). Meskipun produk derivat yang dihasilkan stabil,

namun FDNB bersifat toksik, sehingga penanganannya menggunakan

protective gloves.

4. 4-Fluoro-3-nitrobenzotrifluoride (FNBT)

FNBT bereaksi dengan amina primer dan tidak dapat bereaksi dengan

amina sekunder. FNBT dapat bereaksi dengan poliamina menghasilkan N-2’-

nitro-4-trifluoromethylphenyl polyamine (NTP-polyamine).

5. 2,4,6-Trinitrobenzene-1-sulfonic Acid (TNBS)

TNBS bereaksi dengan gugus amina primer dan peptida pada larutan

dengan pH 8 dan suhu ruang tanpa menghasilkan reaksi samping yang tidak

diinginkan. Produk derivatnya (N-trinitrophenyl) memiliki absoptivitas molar

yang tinggi pada panjang gelombang 340 nm.


12

Agen penderivat yang dapat digunakan untuk menderivatisasi gugus

karboksil menurut Toyo’oka (1999) yaitu:

1. Reagen alkil halida

Contoh reagen alkil halida yaitu phenacyl bromide (PHB), p-

bromophenacyl bromide (BPB), α-bromo-2’-acetonaphtone (BAN) dan

panacyl bromide (PB). Reagen alkil halida bereaksi dengan asam karboksilat

dalam asetonitril di bawah kondisi sejuk dan reaksinya dikatalisis oleh crown

ether dan ion potasium atau basa organik seperti trietilamin dan etilamin.

2. Amina aromatis

Contoh reagen amina aromatis yaitu p-methoxyaniline, p-chloroaniline

dan 1-naphthylamine yang dapat langsung bereaksi dengan asam klorida pada

gugus karboksil. Derivat amida dapat dibentuk dengan amina aromatis dengan

mengkonversikan asam karboksilat menjadi asam klorida. Senyawa yang biasa

digunakan untuk membentuk asam klorida yaitu triethylphosphin atau oxalyl

chloride dan thionyl chloride.

3. Hidrazin

2-Nitrophenylhydrazides (NPH) bereaksi dengan rantai asam amino

pendek dan panjang dan juga rantai asam karboksilat lurus dan bercabang

dengan adanya 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride

(EDC).


13

4. Hidroksil amina

Hidroksil amina dapat digunakan untuk derivatisasi sederhana dan cepat

pada ester asam lemak hingga asam hidroksamik, yang menyerap dengan kuat

pada panjang gelombang rendah daerah UV (206 atau 213 nm).

D. Spektrofotometri UV

Spektrofotometri UV adalah salah satu teknik analisis spektroskopik

yang menggunakan radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm)

dengan menggunakan alat spektrofotometer. Pada analisis menggunakan

spektrofotometri UV, dilakukan pembacaan absorbansi (penyerapan) atau

transmitansi (penerusan) radiasi elektromagnetik oleh suatu molekul. Hasil

pembacaan absorbansi disebut sebagai absorban (A) dan tidak memiliki satuan,

sedangkan hasil pembacaan transmitansi disebut transmitan dan memiliki satuan

%T (Mulja dan Suharman, 1995).

Absorbansi cahaya oleh molekul dalam daerah spektra ultraviolet dan

visible tergantung dari struktur elektronik molekul (Sastrohamidjojo, 2001).

Apabila suatu molekul dikenai radiasi elektromagnetik (REM) maka akan terjadi

eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital elektron

antiikatan kalau ada kesesuaian dengan energi untuk eksitasi. Ada empat tipe

transisi elektronik yang mungkin terjadi yaitu σ → σ* , π → π*, n → π*, n → σ*.

Eksitasi elektron (σ → σ*) membutuhkan energi yang terbesar dan terjadi pada

daerah ultraviolet jauh yang diberikan oleh ikatan tunggal, misalnya alkana.

Eksitasi elektron π → π* diberikan oleh ikatan rangkap dua dan rangkap tiga, juga


14

terjadi pada daerah ultraviolet jauh. Eksitasi elektron (n → σ*) terjadi pada gugus

karbonil yang terjadi pada ultraviolet jauh (Mulja dan Suharman, 1995). Diagram

tingkat energi elektronik dapat dilihat pada gambar 4.

Gambar 4. Diagram tingkat energi elektronik (Pavia, Lampman, and Kriz, 2001)

Bouguer, Lambert dan Beer membuat suatu persamaan matematik yang

menghubungkan antara absorban atau transmitan terhadap intensitas radiasi atau

konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan yang mengabsorbsi:

A= = ε. b. c (1)

dimana: T = % transmitan

A = absorban

ε = koefisien ekstingsi molar (L.mol-1 cm-1)

c = konsentrasi (mol.L-1)

b = tebal larutan (cm)

Hubungan antara nilai % dengan absorptivitas molar (ε) adalah

sebagai berikut:

ε = % x M-1. cm-1. (2)


15

Nilai ε didefinisikan sebagai daya serap molar atau koefisien ekstingsi

molar. Nilai ε adalah karakteristik untuk molekul atau ion penyerap dalam pelarut

tertentu, pada panjang gelombang tertentu dan tidak bergantung pada konsentrasi

dan panjang gelombang lintasan radiasi (Sastrohamidjojo, 2001). Secara umum,

dapat dikatakan bahwa nilai ε sangat mempengaruhi puncak spektra yang

dihasilkan oleh suatu zat. Rincian nilai ε terhadap puncak spektra adalah: 1-10:

sangat lemah; 10-102: lemah; 102-103: sedang; 103-104: kuat; 104-105: sangat kuat

(Mulja dan Suharman, 1995).

Radiasi dari spektrofotometer, diserap oleh molekul melalui adanya

eksitasi elektron pada ikatan antar atom penyusun senyawa, sehingga awan

elektron mengalami redistribusi. Radiasi yang digunakan biasanya berada pada

daerah panjang gelombang >200 nm untuk menghindari gangguan dari

pembacaan absorban pelarut. Semakin lemah ikatan antar atom maka dibutuhkan

lebih sedikit energi radiasi untuk mengeksitasi elektronnya. Pada daerah panjang

gelombang >200 nm, energi yang dibutuhkan tidak cukup untuk mengeksitasi

elektron σ ke σ*, sehingga diperlukan ikatan antar atom dengan ikatan yang lebih

lemah, yaitu ikatan dengan elektron π yang dengan mudah tereksitasi menjadi π*

pada panjang gelombang >200 nm. Adanya ikatan rangkap terkonjugasi (ikatan

rangkap yang diselingi ikatan tunggal), dapat meningkatkan intensitas absorpsi

yang terjadi dan juga meningkatkan panjang gelombang pengukuran (Watson,

2003).

Pemilihan pelarut yang digunakan dalam spektroskopi UV merupakan

hal yang cukup penting. Kriteria pelarut yang baik adalah yang tidak


16

mengabsorbsi radiasi UV pada daerah yang sama dengan analitnya. Biasanya,

pelarut yang dipilih adalah yang tidak memiliki sistem terkonjugasi. Air, etanol

95% dan n-heksan merupakan pelarut yang banyak digunakan. Zat-zat tersebut

tidak terlihat dalam daerah spektra ultraviolet dimana puncak absorbsi analit

biasanya muncul (Pavia et al., 2001).

Analisis kuantitatif zat tunggal pada spektrofotometri menggunakan

pengukuran absorbansi senyawa pada panjang gelombang maksimum, yaitu

panjang gelombang dimana terjadi eksitasi elektronik yang memberikan

absorbansi yang maksimum (Mulja dan Suharman, 1995). Beberapa alasan

digunakannya panjang gelombang maksimum dalam suatu analisis kuantitatif

adalah sebagai berikut:

- Pada panjang gelombang maksimum diperoleh kepekaan analisis yang

maksimal, karena pada panjang gelombang tersebut perubahan absorbansi

untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar.

- Di sekitar panjang gelombang maksimum, bentuk kurva absorbansi datar dan

pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi.

- Jika dilakukan pengukuran ulang akan memberikan kesalahan yang kecil

ketika digunakan panjang gelombang maksimum (Gandjar dan Rohman, 2007).

Pada umumnya konfigurasi dasar spektrofotometer UV berupa susunan

peralatan optik yang terkonstruksi sebagai berikut (Gambar 5 dan 6):


17

Gambar 5. Spektrofotometer Single-beam

Gambar 6. Spektrofotometer Double-beam

Spektrofotometer single beam, memiliki kelebihan antara lain sistemnya lebih

sederhana dan murah dibandingkan spektrofotometer double beam, tetapi

keterbatasannya adalah tidak dapat mengkoreksi perubahan respon serapan akibat

turbiditas sampel atau perbedaan intensitas cahaya baik dari sumber radiasi

maupun dari pengaruh luar. Keterbatasan ini merupakan alasan dikembangkannya

spektrofotometer double beam. Kelebihan spektrofotometer double beam adalah

mampu mengkoreksi perubahan respon serapan akibat perbedaan intensitas


18

cahaya, fluktuasi pada kelistrikan instrumen, dan serapan blangko.

Keterbatasannya adalah sistem double beam lebih rumit dan harganya lebih mahal

daripada spektrofotometer single beam (Haven, Tetrault, and Schenken, 1994).

E. Teknik Perhitungan Kuantitatif

Pada banyak industri farmasi, produk obat dapat diproduksi dengan

berbagai variasi konsentrasi. Untuk mengembangakan dan melakukan validasi

suatu metode, dapat digunakan 3 macam teknik perhitungan kuantitatif:

1. Single-Point Calibration

Suatu metode analisis dapat dikembangkan dan divalidasi dengan

menggunakan satu konsentrasi standar yang digunakan untuk menguji semua

level konsentrasi analit. Metode ini dipilih karena sederhana dan mudah

dilakukan untuk menguji kadar analit. Walaupun demikian, metode ini

membutuhkan cara ekstraksi dan pengenceran yang berbeda untuk tiap

konsentrasi analit agar dapat dihasilkan final solution dengan konsentrasi

yang mendekati konsentrasi standar.

2. Multiple-Point Calibration

Metode lain yang dapat digunakan untuk kuantifikasi kadar analit adalah

dengan membuat berbagai konsentrasi standar yang mencakup seluruh

konsentrasi analit. Plot standar yang dihasilkan, selanjutnya digunakan untuk

menghitung konsentrasi analit dalam sampel. Namun, metode ini hanya valid

apabila semua konsentrasi analit tercakup dalam plot standar yang dibuat.

Keuntungan metode ini adalah tidak diperlukan proses preparasi sampel yang


19

berbeda-beda untuk tiap konsentrasi analit. Keterbatasannya adalah

pembuatan konsentrasi standar yang bervariasi, dapat meningkatkan

kemungkinan terjadinya kesalahan penimbangan atau pengenceran dalam

pembuatan larutan standar.

3. One Standard Calibration for Each Strength

Metode yang menjadi alternatif terakhir untuk mengembangkan dan

memvalidasi metode adalah dengan membuat satu konsentrasi standar untuk

tiap konsentrasi analit. Metode ini ditempuh apabila tidak diperoleh respon

analit yang linier pada rentang konsentrasi standar yang dibuat (Chan, Lam,

Lee, and Zang, 2004).

F. Kesalahan dalam Analisis

Istilah kesalahan didasarkan pada perbedaan antara hasil pengukuran

(nilai perhitungan) dengan nilai sebenarnya. Nilai sebenarnya dari suatu kuantitas

yang diukur merupakan sesuatu yang tidak pernah kita ketahui secara pasti,

namun nilai sebenarnya (true value) diterima jika nilai tersebut mempunyai

ketidakpastian yang paling kecil diantara nilai-nilai lain dari suatu pengukuran

kuantitas (Gandjar dan Rohman, 2007). Menurut Gandjar dan Rohman (2007),

ada tiga macam kesalahan dalam analisis kimia yaitu: 1). Kesalahan gamblang

(gross error), 2). Kesalahan acak (random error), dan 3). Kesalahan sistematik

(systematic error).

Kesalahan gamblang merupakan kesalahan yang sudah jelas karena

melibatkan kesalahan yang besar, akibatnya kita harus memutuskan untuk


20

mengabaikan percobaan yang telah kita lakukan dan memulainya dari awal lagi

secara menyeluruh. Contoh kesalahan gamblang adalah sampel tumpah; pereaksi

yang akan digunakan tercemar; larutan yang dipersiapkan salah; dan alat yang

akan digunakan rusak.

Kesalahan acak merupakan kesalahan yang nilainya tidak dapat

diramalkan dan tidak ada aturan yang mengaturnya serta nilainya berfluktuasi.

Kesalahan acak merupakan jenis kesalahan yang selalu terjadi dalam analisis

sebagai akibat adanya sedikit variasi yang tidak dapat ditentukan (dikontrol)

dalam pelaksanaan prosedur analisis.

Kesalahan sistematik merupakan kesalahan yang mempunyai nilai

definitif (nilai tertentu). Hasil analisis yang mengandung kesalahan ini dapat

mengarah ke arah yang lebih kecil atau ke arah yang lebih besar dari rata-rata.

Kesalahan sistematik bersifat ajeg (konstan) dan berhubungan dengan ketelitian

(akurasi) hasil analisis. Kesalahan jenis ini mengakibatkan penyimpangan tertentu

dari rata-rata (mean). Beberapa faktor yang mempengaruhi kesalahan sistematik

antara lain:

a. Kesalahan personil dan operasi

Kesalahan ini disebabkan oleh cara pelaksanaan analisis dari analis (personil)

dan bukan karena metode.

b. Kesalahan alat dan pereaksi

Kesalahan ini dapat disebabkan oleh pereaksi yang kurang murni, alat yang

kurang valid atau pemakaian alat yang kurang tepat walaupun alatnya sendiri

baik.


21

c. Kesalahan metode

Kesalahan metode dapat disebabkan kesalahan pengambilan sampel dan

kesalahan akibat reaksi kimia yang tidak sempurna (Gandjar dan Rohman,

2007).

Untuk memperkecil kesalahan sistematik dapat dilakukan beberapa cara,

antara lain:

1. Kalibrasi (peneraan) alat yang dipakai

Cara ini dimaksudkan untuk memperkecil kesalahan alat.

2. Dilakukan penetapan blanko

Di sini dilakukan pekerjaan seperti pada percobaan sebenarnya, tetapi dengan

tidak menggunakan sampel yang diselidiki (Gandjar dan Rohman, 2007).

G. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita,

2004). Parameter-parameter yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode

analisis antara lain spesifisitas, linearitas, akurasi, presisi, LOD dan LOQ.

Perbedaan prosedur pengujian suatu analit membutuhkan parameter

validasi yang berbeda. Kategori pengujian yang paling umum yang data

validasinya sangat dibutuhkan menurut USP-NF (United States Pharmacopeial

Convention, 2007) tabel I yaitu:


22

a. Kategori I : prosedur analitik untuk penetapan kadar komponen utama dalam

bahan baku atau bahan aktif (termasuk pengawet) dalam produk akhir

farmasetik.

b. Kategori II : prosedur analitik untuk penetapan ketidakmurnian dalam bahan

baku atau senyawa degradasi pada produk akhir farmasetik.

c. Kategori III : prosedur analitik untuk penetapan karakteristik dayaguna obat

(misalnya disolusi, pelepasan obat).

d. Kategori IV : prosedur analitik untuk uji identifikasi.

Tabel I. Kategori pengujian parameter validasi

KarakteristikAnalisis

Kategori IKategori II

Kategori III Kategori IVKuantitatif Limit Test

Akurasi Ya Ya * * TidakPresisi Ya Ya Tidak Ya TidakSpesifisitas Ya Ya Ya * YaBatas deteksi Tidak Tidak Ya * TidakBatas Kuantitasi Tidak Ya Tidak * TidakLinieritas Ya Ya Tidak * TidakRentang Ya Ya * * Tidak

Keterangan : * tergantung dari masing-masing uji

1. Spesifisitas

Spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur

zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang

mungkin ada dalam matriks sampel. Spesifisitas metode ditentukan dengan

membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai,

senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, atau pembawa plasebo dengan hasil

analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tersebut (Harmita, 2004).


23

2. Linieritas

Linearitas adalah kemampuan metode analisis (pada rentang tertentu)

untuk menghasilkan respon yang proporsional terhadap konsentrasi analit di

dalam sampel. Syarat suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik

adalah apabila nilai koefisien korelasi (r)-nya ≥ 0,999, terutama untuk penetapan

kadar senyawa utama (Snyder, Kirkland, and Glajch, 1997).

3. Batas Deteksi (limit of detection / LOD) dan Batas Kuantitasi (limit of

quantitation / LOQ)

Batas deteksi adalah konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang dapat

dideteksi dan masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan respon

blanko. Batas deteksi dinyatakan sebagai perbandingan signal-to-noise (S/N)

antara hasil uji sampel dengan analit yang diketahui konsentrasinya dan blangko.

Rasio signal-to-noise untuk batas deteksi sekurang-kurangnya 3:1 (Snyder et al.,

1997). Penentuan batas deteksi juga dapat didasarkan pada perhitungan tiga kali

nilai standar deviasi blangko dibagi dengan nilai slope kurva baku (Anonim,

2005c).

Batas kuantitasi merupakan konsentrasi terkecil analit dalam sampel

yang masih dapat memenuhi kriteria akurasi dan presisi (Harmita, 2004). Batas

kuantitasi dapat dihitung berdasarkan perhitungan sepuluh kali nilai standar

deviasi blangko dibagi dengan nilai slope kurva baku (Anonim, 2005c).


24

4. Ketepatan (accuracy)

Ketepatan (accuracy) adalah ukuran yang menunjukkan kedekatan hasil

analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen

perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Ada tiga cara dalam

menentukan akurasi yaitu: 1). Dengan membandingkan dengan reference

standard; 2). Menghitung recovery analit yang ditambahkan ke dalam blangko

matriks dan 3). Standar adisi analit (Snyder et al., 1997). Kriteria rentang recovery

yang dapat diterima ditentukan berdasarkan kadar analit, seperti yang tertera pada

tabel II.

Tabel II. Kriteria penerimaan recovery berdasarkan kadar analit

Kadar Analit (%) Unit Recovery range (%)100 100% 98-10210 10% 98-1021 1% 97-103

0,1 0,1% 95-1050,01 100 ppm 90-1070,001 10 ppm 80-1100,0001 1 ppm 80-1100,00001 100 ppb 80-1100,000001 10 ppb 60-1150,0000001 1 ppb 40-120

(AOAC cit., Gonzales and Herrador, 2007)

5. Ketelitian (precision)

Ketelitian adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara

hasil uji individual yang diperoleh dari pengambilan sampel berulang yang telah

dihomogenkan dengan suatu metode analisis (Snyder et al., 1997). Presisi

umumnya dinyatakan dengan koefisien variasi (CV) atau standar deviasi relatif

(RSD), seperti yang tertera pada tabel III.


25

Tabel III. Kriteria penerimaan RSD dari ketentuan Horwitz dan dari ketentuan AOAC PeerVerified Methods (PVM) berdasarkan kadar analit

Kadar Analit (%) UnitHorwitz%RSD

AOAC PVM%RSD

100 100% 2 1,310 10% 2,8 1,81 1% 4 2,7

0,1 0,1% 5,7 3,70,01 100 ppm 8 5,30,001 10 ppm 11,3 7,30,0001 1 ppm 16 110,00001 100 ppb 22,6 150,000001 10 ppb 32 210,0000001 1 ppb 45,3 30

(Gonzales and Herador, 2007)

H. Landasan Teori

Asam traneksamat merupakan turunan sintetik asam amino lisin yang

memiliki efek antifibrinolitik dan banyak digunakan untuk mengatasi gangguan

pendarahan. Asam traneksamat memiliki gugus fungsional karboksil dan amin,

dimana nilai absorptivitas molar dari karboksil yaitu sebesar 50-70 M-1.cm-1

sedangkan nilai absorptivitas molar amina sebesar 2,80 M-1.cm-1. Karena nilai

absorptivitas molar dari senyawa ini sangat kecil, maka tidak dapat dideteksi

menggunakan spektrofotometer UV. Selain itu, dilihat dari strukturnya, asam

traneksamat hanya memiliki gugus kromofor pendek dan tidak memiliki

auksokrom sehingga tidak dapat dideteksi menggunakan spektrofotometer UV.

Derivatisasi terhadap asam traneksamat dilakukan agar didapatkan senyawa yang

memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat dideteksi menggunakan

spektrofotometer UV.


26

OPA merupakan agen penderivat yang memiliki gugus aldehid yang akan

bereaksi dengan amina primer pada asam traneksamat. Senyawa hasil derivatisasi

ini akan memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat ditetapkan

kadarnya menggunakan spektrofotometer UV dengan lebih spesifik dan sensitif.

OPA dipilih karena reaksinya cepat dan hasilnya sensitif.

Penetapan kadar asam traneksamat dapat dilakukan dengan metode

konvensional titrasi. Dilihat dari strukturnya, asam traneksamat memiliki sifat

asam yang terletak pada gugus karboksilatnya, sehingga dapat ditetapkan

kadarnya menggunakan metode titrasi alkalimetri. Namun, titrasi konvensional

hanya dapat dilakukan pada senyawa tunggal dengan kadar besar seperti pada

bahan baku atau sediaan dengan zat aktif tunggal. Hal ini disebabkan karena titrasi

konvensional memiliki selektivitas dan sensitivitas yang lebih rendah

dibandingkan dengan metode spektrofotometri UV.

Metode spektrofotometri UV digunakan karena cukup selektif dan

sensitif untuk menetapkan kadar senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat

dengan OPA. Selain itu, prosesnya cepat dan alatnya mudah digunakan sehingga

spektrofotometri UV banyak digunakan untuk menetapkan kadar senyawa tunggal

dalam jumlah besar dalam suatu sediaan. Senyawa hasil derivatisasi yang lebih

sensitif ini diharapkan memiliki linieritas yang baik antara kadar dengan

absorbansinya, memiliki batas deteksi dan batas kuantitasi yang lebih kecil serta

memberikan nilai presisi dan akurasi yang memenuhi kriteria.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah penetapan kadar asam

traneksamat dengan agen penderivat OPA menggunakan spektrofotometer UV


27

dapat memenuhi parameter validasi seperti spesifisitas, linieritas, batas deteksi,

batas kuantitasi, presisi dan akurasi yang baik. Spesifisitas dapat diketahui dari

perbandingan absorbansi masing-masing senyawa, baik senyawa hasil derivatisasi

dan OPA maupun asam traneksamat dan hasil derivat asam traneksamat dengan

OPA akan memiliki panjang gelombang yang berbeda pada rekaman spektra UV-

nya. Linieritas dianalisis berdasarkan nilai r ≥ 0,999, batas deteksi dan batas

kuantitasi berdasarkan perhitungan antara standar deviasi blangko dan slope kurva

baku, akurasi dianalisis berdasarkan % recovery untuk analit 100% adalah 98-

102% (AOAC cit., Gonzales and Herrador, 2007) dan presisi dianalisis

berdasarkan CV (Coefficient of Varience) ≤ 1,3% (AOAC cit., Gonzales and

Herrador, 2007). Penentuan % recovery yang harus memenuhi syarat tersebut

ditujukan untuk mengurangi kesalahan sistematik sedangkan penentuan CV yang

harus memenuhi syarat yang ditetapkan tersebut ditujukan untuk mengurangi

kesalahan acak.

I. Hipotesis

Berdasarkan landasan teori di atas, dapat disusun hipotesis sebagai

berikut:

1. Penetapan kadar asam traneksamat menggunakan agen penderivat OPA

dengan metode spektrofotometri UV memiliki validitas yang baik untuk

parameter spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi,

dan presisi.


28

2. Metode spektrofotometri ultraviolet (UV) yang telah tervalidasi dapat

diaplikasikan untuk menetapkan kadar asam traneksamat dalam sediaan

kapsul asam traneksamat®.


29

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan

rancangan penelitian deskriptif. Jenis penelitian non eksperimental karena subjek

penelitian tidak diberikan perlakuan, yaitu pH, operating time (OT) dan panjang

gelombang pengukuran tetap. Rancangan penelitian bersifat deskriptif karena

peneliti hanya mendeskripsikan keadaan yang ada.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah seri kadar baku asam

traneksamat.

2. Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah spesifisitas, linearitas,

batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi.

3. Variabel pengacau terkendali

Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah cahaya, suhu

reaksi, pengotor pada alat, dan kemurnian pelarut yang digunakan. OPA bersifat

fotosensitif sehingga mudah terdegradasi jika terpapar cahaya. Untuk mencegah

hal tersebut maka larutan OPA yang telah dibuat dimasukkan dalam gelas Beaker

yang telah dibungkus aluminium foil. Suhu reaksi diatur pada suhu lemari


30

pendingin (2-8ºC). Alat yang digunakan dicuci dengan menggunakan asam

pencuci dan metanol. Pelarut yang digunakan adalah pelarut dengan derajat pro

analysis yang memiliki tingkat kemurnian yang tinggi.

C. Definisi Operasional

1. Baku asam traneksamat yang divalidasi adalah baku asam traneksamat yang

diperoleh dari P.T. Ifars - Solo (Certificate of Analysis terlampir di

Lampiran 1).

2. Larutan dapar yang digunakan merupakan larutan dapar borat dengan pH 8

yang merupakan hasil optimasi Limawan (2012).

3. Spektrofotometri yang digunakan adalah seperangkat alat spektrofotometer

UV merek Hitachi U-2900.

4. Absorbansi yang diukur merupakan absorbansi senyawa hasil derivatisasi

asam traneksamat menggunakan agen penderivat OPA.

5. Parameter validasi metode yang digunakan adalah spesifisitas, linearitas,

batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi.

D. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi baku asam

traneksamat (P.T. Ifars) dengan kemurnian 99,8% secara titrasi, o-ftalaldehid

(p.a., Nacalai), merkaptoetanol, metanol, asam borat, NaOH, KCl, (p.a., E.

Merck), kapsul asam traneksamat®, kertas saring, kapas merk Selection, aquades

(Laboratorium Analisis Makanan UGM).


31

E. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Spektrofotometer

UV-Vis merk Hitachi U-2900, kuvet UV, pH meter merk Hanna HI 83141, neraca

merk Precisa A 125 SCS dengan kepekaan 0,1 mg (4 digit di belakang koma,

satuan g), neraca analitik merk Boeco Germany dengan kepekaan 0,1 mg (4 digit

di belakang koma, satuan g), mikropipet skala 100-1000 µL merk Socorex,

mikropipet skala 10-200 µL merk Gilson pipetman dan seperangkat alat gelas

yang lazim digunakan di laboratorium analisis.

F. Tatacara Penelitian

1. Pembuatan dapar borat pH 8

Ditimbang 1,55 g H3BO3 dan 1,85 g KCl, kemudian dilarutkan dalam

aquades sampai 250 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 125 mL, kemudian

ditambahkan dengan 9,75 mL larutan NaOH 0,1 M dan aquades sampai volume

250 mL. pH larutan diukur, kemudian pH-nya ditepatkan menjadi 8 dengan

menambahkan larutan H3BO3 atau larutan NaOH (Perrin and Dempsey, 1974).

2. Pembuatan larutan OPA

Ditimbang lebih kurang saksama 100,0 mg OPA, kemudian dilarutkan

dalam 2 mL metanol. Ditambah 100 µL merkaptoetanol dan dapar borat pH 8

hingga volume tepat 200 mL, kemudian dicampur hingga homogen. Larutan

disimpan dalam lemari pendingin dan ditempat gelap (± 1 jam). Larutan OPA

inilah yang kemudian ditambahkan pada larutan baku asam traneksamat.


32

3. Pembuatan larutan stok asam traneksamat (2 mg/mL)

Ditimbang lebih kurang saksama 100,2 mg baku asam traneksamat,

kemudian dilarutkan dengan aquades. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar

50,0 mL dan ditambahkan aquades hingga tanda.

Keterangan: Tingkat kemurnian baku asam traneksamat 99,8% (b/b) dengan teknik titrasi,

sehingga untuk memperoleh asam traneksamat 100 mg, maka bobot baku asam traneksamat yang

ditimbang sebesar 100,2 mg.

4. Pembuatan larutan intermediet baku asam traneksamat (1 mg/mL)

Larutan stok asam traneksamat 2 mg/mL dipipet 5 mL dan dimasukkan

dalam labu ukur 10,0 mL. Aquades ditambahkan hingga tanda.

5. Pembuatan larutan seri baku dan kurva baku asam traneksamat

Dipipet 50; 100; 150; 200; dan 250 µL dari larutan intermediet asam

traneksamat 1 mg/mL, kemudian dimasukkan dalam labu takar 5,0 mL yang telah

dibungkus kertas aluminium. Larutan OPA pH 8 yang telah didinginkan pada

suhu 2-8ºC selama ± 1 jam ditambahkan hingga volume tepat 5,0 mL kemudian

digojog, sehingga diperoleh kadar seri baku sebesar 10; 20; 30; 40; dan 50 µg/mL.

Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 334 nm menggunakan

spektrofotometer UV setelah didiamkan di tempat gelap pada suhu lemari

pendingin selama 4 menit (terhitung setelah 45 detik penambahan larutan OPA

pH 8). Kurva regresi linear antara kadar asam traneksamat dengan absorbansi

senyawa hasil derivatisasi dibuat, kemudian ditentukan persamaan garis regresi

linear dan tentukan nilai koefisien korelasinya. Syarat suatu metode dikatakan

memiliki linearitas yang baik adalah apabila nilai koefisien korelasi (r)-nya ≥

0,999, terutama untuk penetapan kadar senyawa utama (Snyder et al., 1997).


33

6. Recovery baku

Larutan intermediet asam traneksamat 1000 µg/mL dipipet sebanyak 50;

150; dan 250 µL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5,0 mL yang telah

dibungkus dengan kertas aluminium. Larutan OPA pH 8 yang telah didinginkan

pada suhu lemari pendingin selama 1 jam ditambahkan pada masing–masing labu

hingga volume tepat 5,0 mL. Labu digojog dan didiamkan di tempat gelap pada

suhu lemari pendingin selam 4 menit (terhitung setelah 45 detik penambahan

larutan OPA pH 8). Replikasi masing-masing konsentrasi dilakukan sebanyak 5

kali sehingga diperoleh 15 data. Absorbansi yang diperoleh dicatat. Kadar asam

traneksamat dihitung dengan memasukkan nilai absorbansi ke persamaan kurva

baku yang diperoleh.

7. Akurasi dan presisi menggunakan standar adisi

Ditimbang lebih kurang seksama 117,6 mg (untuk batch 1) dan 121, 7

mg (untuk batch 2) serbuk kapsul yang telah dihomogenkan dalam mortir. Untuk

akurasi dan presisi kadar rendah: ditambahkan 10,0 mL larutan baku asam

traneksamat (10 mg/mL). Untuk akurasi dan presisi kadar sedang: ditambahkan

20,0 mL larutan baku asam traneksamat (10 mg/mL). Untuk akurasi dan presisi

kadar tinggi: ditambahkan 30,0 mL larutan baku asam traneksamat (10 mg/mL).

Masing-masing dimasukkan dalam gelas beker dan dilarutkan dengan aquades,

kemudian dimasukkan dalam labu ukur 100,0 mL dan ditambah aquades hingga

volume tepat 100,0 mL. Campuran tersebut digojog hingga homogen. Penyarian

asam traneksamat dilakukan menggunakan corong, kapas dan kertas saring

sebanyak 3 kali. Larutan sampel diambil 100 µL, dimasukkan dalam labu ukur 10


34

mL. Larutan OPA pH 8 ditambahkan hingga volume tepat 10,0 mL.

Absorbansinya diukur pada λ 334 nm setelah didiamkan di tempat dingin dan

gelap selama 4 menit. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali untuk setiap kadar

(rendah, sedang dan tinggi) sehingga didapatkan 9 data untuk setiap batch.

8. Analisis Hasil

Validasi metode analisis yang digunakan dalam penetapan kadar asam

traneksamat pada penelitian ini dapat ditentukan berdasarkan parameter berikut:

a. Spesifisitas

Pada metode ini, spektra panjang gelombang maksimum yang dihasilkan

oleh campuran larutan OPA dengan pelarut dibandingkan dengan spektra panjang

gelombang maksimum yang dihasilkan oleh campuran larutan OPA dengan asam

traneksamat. Jika panjang gelombang maksimum (selective UV-wavelength) dari

pola spektra berbeda, dapat dikatakan bahwa metode tersebut spesifik (Ermer and

Miller, 2005). Spesifisitas metode ini juga dapat dilihat dari besarnya overlapping

yang terjadi antara produk derivatisasi dengan larutan OPA.

b. Linearitas kurva baku

Linearitas dilihat dari nilai koefisien korelasi (r) dari hasil pengukuran

seri larutan baku asam traneksamat. Suatu metode dikatakan memiliki linearitas

yang baik jika nilai r ≥ 0,999 (Snyder et al., 1997).


35

c. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)

Absorbansi larutan baku konsentrasi terkecil setelah diderivatisasi

dengan OPA diukur minimal 3 kali. Nilai LOD diperoleh pada 3 x SD blangko

dibagi slope kurva baku dan nilai LOQ diperoleh pada 10 x SD blangko dibagi

slope kurva baku (Anonim, 2005c).

d. Ketelitian (precision)

Ketelitian metode analisis dinyatakan dengan koefisien variasi (CV) yang

dihitung dengan cara berikut:

CV = . x 100%

Kriteria presisi yang diterima untuk kadar zat analit 100% adalah CV ≤

1,3% (AOAC cit., Gonzales and Herrador, 2007).

e. Ketepatan (accuracy)

Akurasi metode analisis dinyatakan dengan % perolehan kembali

(recovery) yang dihitung dengan cara berikut:

% recovery = x 100%

Kriteria akurasi yang diterima untuk kadar zat analit 100% adalah 98-

102% (AOAC cit., Gonzales and Herrador, 2007).

9. Penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel kapsul

Uji keseragaman bobot dilakukan dengan cara: ditimbang 20 kapsul.

Ditimbang lagi kapsul satu persatu. Isi semua kapsul dikeluarkan, ditimbang

seluruh bagian cangkang kapsul, dihitung bobot isi kapsul dan bobot rata-rata tiap


36

isi kapsul. Perbedaan dalam persen bobot isi tiap kapsul terhadap bobot rata-rata

tiap isi kapsul tidak boleh lebih dari ± 7,5% untuk kapsul yang memiliki bobot

rata-rata lebih dari 120 mg (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI,

1995).

Dua puluh kapsul asam traneksamat® yang telah dilakukan uji

keseragaman bobot kapsul dihomogenkan dalam mortir. Kemudian ditimbang

saksama serbuk kapsul 119,5 mg untuk batch 1 dan 121,1 mg untuk batch 2 yang

setara dengan 100 mg asam traneksamat (sesuai leaflet yang tertulis). Serbuk

kapsul dilarutkan dalam aquades hingga volume tepat 100,0 mL dan digojog

hingga homogen. Penyarian dilakukan 3 kali menggunakan kapas dan kertas

saring sehingga didapatkan filtrat yang jernih. Filtrat dipipet 300 µL, kemudian

dimasukkan dalam labu ukur 10 mL. Larutan OPA pH 8 ditambahkan hingga

volume tepat 10,0 mL. Diamkan ditempat gelap dan dingin selama 4 menit

(setelah 45 detik penambahan larutan OPA). Absorbansinya diukur menggunakan

spektrofotometer UV. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali untuk setiap batch

sehingga didapatkan 5 data absorbansi untuk setiap batch. Kadar terukur asam

traneksamat dihitung dengan cara memasukkan absorbansi yang didapat ke dalam

persamaan regresi linier kurva baku dan ditentukan kadar rata-rata asam

traneksamat untuk setiap batch. Menurut Supplement II Japanese Pharmacopeia

kapsul asam traneksamat mengandung tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih

dari 105,0% dari yang tertera pada label kemasan asam traneksamat.


37

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pembuatan Larutan

1. Larutan Asam Traneksamat

Asam traneksamat baku yang digunakan merupakan senyawa

berbentuk serbuk yang sangat mudah larut dalam air dan memiliki tingkat

kemurnian 99,8% secara titrasi (CoA pada Lampiran 1.). Pada pembuatan

larutan asam traneksamat digunakan pelarut aquades, yaitu air yang

mengalami penyulingan untuk menjamin kemurniannya dan tidak

mengandung bahan-bahan lain yang mungkin dapat mengganggu analisis.

Aquades juga dipilih karena memenuhi kriteria yang baik untuk analisis

secara spektrofotometri ini, diantaranya tidak memberikan serapan pada

daerah yang sama dengan analit, tidak berinteraksi dengan analit, tidak

berwarna dan memiliki kemurnian yang cukup tinggi jika digunakan untuk

keperluan analisis.

2. Larutan Dapar Borat

Larutan dapar borat terdiri dari campuran asam borat (H3BO3) dan

kalium klorida (KCl) serta larutan natrium hidroksida (NaOH) untuk

mengatur agar larutan berada pada kondisi pH tertentu, dalam penelitian

ini dibuat larutan dapar borat dengan pH 8 yang merupakan hasil optimasi

(Limawan, 2012). Dapar borat ini berfungsi untuk memberikan suasana

basa dan mempertahankan pH pada waktu reaksi derivatisasi terjadi. Hal


38

ini dilakukan karena reaksi derivatisasi antara amin primer dengan agen

penderivat OPA hanya berlangsung dalam suasana basa.

3. Larutan OPA

Pembuatan larutan OPA mengikuti cara pembuatan reagen yang

terdapat dalam deskripsi produk “OPA, Amine Detection Reagent” dari

Uptima. OPA dilarutkan dalam metanol karena OPA larut dalam metanol

(Anonim, 2005b). Metanol merupakan pelarut organik yang memiliki

indeks polaritas 5,1 (Snyder, Kirkland, and Dolan, 2010) dan memiliki

kelarutan dalam air 100% (Stauffer, Dolan, and Newman, 2008). Metanol

digunakan juga karena pada panjang gelombang di atas 210 nm tidak

memberikan serapan yang berarti, sehingga tidak mengganggu pengukuran

absorbansi analit.

Setelah OPA dilarutkan dalam metanol, kemudian ditambahkan

merkaptoetanol, yaitu senyawa pengkopling untuk menambah gugus

auksokrom pada derivat yang terbentuk antara asam traneksamat dengan

OPA. Gugus auksokrom yang terbentuk akan memperpanjang konjugasi

gugus kromofor dan menaikkan intensitas absorpsi senyawa hasil

derivatisasi sehingga nilai absorptivitas molar derivat meningkat. Hal ini

menyebabkan peningkatan nilai absorbansi pada konsentrasi yang sama.

Merkaptoetanol merupakan senyawa organik sehingga lebih mudah

bercampur dalam pelarut metanol.

Dapar borat yang ditambahkan ke dalam larutan OPA adalah dapar

borat pH 8 yang merupakan hasil optimasi Limawan (2012). Hal ini


39

dilakukan karena pada suasana basa, amin primer berada dalam bentuk

molekul seluruhnya sehingga reaksi derivatisasi amin primer dengan agen

penderivat OPA dapat berlangsung optimal. Gugus NH2 dalam suasana

basa memiliki sifat nukleofilik yang kuat. Namun pH dari dapar borat juga

harus diatur sedemikian sehingga tidak lebih dari 10, karena pada pH lebih

tinggi dari 10 memungkinkan terjadinya reaksi Cannizzaro (self reaction)

pada gugus aldehid dari OPA menghasilkan ion o-hidroksimetil benzoat

(Gambar 9). Senyawa tersebut sukar bereaksi dengan amin primer pada

asam traneksamat karena gugus C karbonilnya menjadi kurang elektrofilik

dibandingkan C karbonil OPA. Hal ini disebabkan karena adanya

stabilisasi resonansi antara elektron bebas dari gugus O karbonil kepada

gugus C karbonilnya. Menurut McDonald and Sibley (1981), pada pH 10-

14 terjadi penurunan absorptivitas molar atau koefisien ekstingsi molar (ε)

dari OPA karena berkurangnya gugus kromofor dari OPA, dimana ikatan

rangkap pada gugus aldehid OPA akan hilang sehingga ε menjadi lebih

kecil.


40

O

O

H 2 O

O H

O H

O

O

O H

O

-O H

O

O

O H

-O H

O

O

OO

O

O

-O H -O H

Gambar 7. Reaksi Cannizzaro pada OPA (McDonald and Sibley, 1981)

Menurut Blackburn (1989), jika reaksi derivatisasi dilakukan pada

pH di bawah 6 maka reaksi derivatisasi amin primer menggunakan agen

penderivat OPA tidak dapat berlangsung karena pada pH di bawah 6 gugus

amina dari asam traneksamat akan terprotonasi, sehingga kehilangan sifat

nukleofilisitasnya dan tidak dapat bereaksi dengan gugus aldehid dari

OPA.

Larutan OPA ini hanya tahan selama 2 jam maka kemudian

disimpan dalam lemari pendingin untuk mencegah degradasi OPA oleh

cahaya. OPA bersifat fotodegradatif dan mudah teroksidasi oleh udara

sehingga OPA disimpan dalam ruangan yang gelap dan dingin. OPA yang

telah mengalami oksidasi berubah menjadi bentuk karboksilatnya (Gambar

8). Gambar 8 merupakan usulan reaksi karena belum ada referensi yang

menunjukkan reaksi fotodegradasi OPA yang sebenarnya.


41

Gambar 8. Usulan reaksi fotodegradasi OPA(Anania, 2011)

Dalam suasana basa, asam 2-formilbenzoat dan asam ftalat berada

dalam bentuk terion, sehingga reaksi adisi amina nukleofilik oleh gugus

amina pada asam traneksamat sukar terjadi. Stabilisasi resonansi antara

gugus O dengan C karbonil akan menyebabkan atom C karbonil semakin

stabil dan kurang elektrofilik. Jika OPA telah mengalami fotodegradasi,

maka reaksi derivatisasi dengan asam traneksamat tidak akan terjadi.

Untuk mencegah fotodegradasi dari OPA, maka digunakan aluminium foil

untuk melapisi permukaan labu ukur yang digunakan untuk menyimpan

OPA dan untuk reaksi, karena diharapkan aluminium dapat melindungi

larutan dari cahaya.

Menurut Limawan (2012), hasil derivatisasi asam traneksamat

dengan OPA memiliki nilai ekstingsi molar sebesar 9413,09 L M-1.cm-1.

Senyawa dengan nilai ԑ tersebut memiliki absorptivitas molar berada pada

tingkat kuat untuk diukur menggunakan spektrofotometer UV (Mulja dan

Suharman, 1995).

4. Larutan Baku Asam Traneksamat

Larutan baku asam traneksamat terdiri dari larutan asam

traneksamat yang direaksikan dengan larutan OPA. Secara teoritis, reaksi


42

antara asam traneksamat dengan OPA membutuhkan perbandingan

molekul yang sama yaitu 1 : 1. Tetapi, sebagai jaminan bahwa semua

molekul asam traneksamat telah terderivatisasi, maka penambahan OPA

dibuat berlebih. Pada pembuatan larutan baku ini perbandingan mol antara

asam traneksamat dengan OPA sekitar 1 : 11. Pada gambar 9, larutan

OPA memberikan absorbansi pada panjang gelombang 220 nm sampai

320 nm dan memiliki panjang gelombang maksimum pada 260,5 nm

sehingga sisa OPA yang tidak bereaksi dengan asam traneksamat tidak

akan mengganggu nilai absorbansi hasil derivatisasi yang terbentuk.

Gambar 9. Spektra absorbansi OPA (0,5 mg/mL) dalam dapar borat pH 8

Setelah larutan OPA di tambahkan ke dalam asam traneksamat,

campuran tersebut didiamkan di tempat gelap pada suhu lemari pendingin

sekitar 2-8º C selama 4 menit (terhitung setelah 45 detik penambahan

larutan OPA). Reaksi dilakukan pada suhu 2-8º C untuk menghindari

terjadinya reaksi Cannizaro. Menurut Coppex (2000), reaksi yang terjadi

antara asam traneksamat berlangsung sangat cepat sekitar 2 menit dan

produk derivatnya sangat tidak stabil pada suhu ruang maka reaksinya

dilakukan pada suhu lemari pendingin, untuk memperlambat proses


43

degradasi produk derivatnya (Gambar 10). Menurut Direktorat Jenderal

Pengawasan Obat dan Makanan RI (1995), suhu lemari pendingin adalah

suhu dengan rentang 2-8º C. Waktu reaksi yang digunakan yaitu selama 4

menit terhitung setelah 45 detik penambahan larutan OPA. Prosedur ini

merupakan hasil optimasi Limawan (2012) karena pada waktu reaksi 4

menit tersebut reprodusibilitas pengukuran absorbansi hasil derivatisasi

paling bagus.

Gambar 10. Penurunan absorbansi hasil derivatisasi asam traneksamat denganOPA

Dengan adanya merkaptoetanol, OPA bereaksi dengan asam

traneksamat menghasilkan senyawa yang memiliki gugus kromofor dan

auksokrom (Gambar 11). Gambar 12 menunjukkan gugus kromofor dan

auksokrom pada senyawa hasil derivatisasi. Senyawa hasil derivatisasi ini

yang absorbansinya diukur menggunakan spektrofotometer UV.


44

COHO

NH2

H

H

O

O

o-f talaldehidasam traneksamat

OH

N

S

OH

COHO

asam 4-((1-(2-hidroksietiltio)-2H -isoindol-2-il)metil)sikloheksankarboksilat

Gambar 11. Reaksi antara asam traneksamat dengan OPA dengan adanya merkaptoetanolmenghasilkan senyawa hasil derivatisasi

Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom dari senyawa hasil derivatisasi (Guguskromofor ditunjukkan oleh garis merah, sedangkan gugus auksokrom ditunjukkan oleh

garis biru)

Konsentrasi seri larutan baku asam traneksamat yang dibuat yaitu

10; 20; 30; 40; dan 50 µg/mL. Kemudian dibuat kurva regresi linier untuk

asam traneksamat.

B. Pembuatan Kurva Baku Asam Traneksamat

Setelah masing-masing seri larutan baku asam traneksamat direaksikan

dengan larutan OPA dan diukur absorbansinya, dibuat kurva baku dan persamaan

regresi liniernya. Kurva baku ini menunjukkan hubungan antara absorbansi hasil


45

derivatisasi dengan kadar asam traneksamat. Absorbansi yang terbaca merupakan

absorbansi produk derivatisasi asam traneksamat dengan OPA, yang merupakan

representasi absorbansi asam traneksamat karena asam traneksamat akan bereaksi

seluruhnya dengan OPA membentuk produk derivatnya (A derivat ≈ A asam

traneksamat). Kadar asam traneksamat dalam sampel dapat diketahui dengan

menggunakan persamaan regresi linier kurva baku yang dibuat.

Kurva baku asam traneksamat dibuat menggunakan lima seri kadar asam

traneksamat, yaitu 10; 20; 30; 40 dan 50 µg/mL, dan untuk masing-masing kadar

dilakukan replikasi 3 kali. Seri kadar kurva baku ini dipilih berdasarkan rentang

dimana konsentrasi asam traneksamat yang digunakan masih memberikan nilai

absorbansi yang proporsional atau menunjukkan linieritas yang baik dengan

konsentrasinya. Pada lampiran 12 ditunjukkan bahwa absorbansi dari 13 seri

kadar asam traneksamat masih memberikan nilai linieritas yang baik, yang

dinyatakan dengan nilai koefisien korelasi (r). Menurut Snyder et al. (1997),

syarat suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik adalah apabila nilai

koefisien korelasi (r)-nya ≥ 0,999, terutama untuk penetapan kadar senyawa

utama. Pada lampiran 12 dicantumkan data yang didapat pada penelitian ini yaitu

pada replikasi I nilai r = 0,9977, pada replikasi II nilai r = 0,9992 sedangkan pada

replikasi III nilai r = 0,9993. Hal ini membuktikan bahwa pada rentang kadar

asam traneksamat 1 µg/mL hingga 100 µg/mL masih memberikan linieritas yang

baik, sehingga untuk pembuatan kurva baku asam traneksamat dapat dipilih

rentang kadar yang masih linier. Pada penelitian ini dipilih seri kadar asam

traneksamat dari 10; 20; 30; 40 dan 50 µg/mL.


46

Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang maksimum

derivat yang terbentuk, yaitu pada panjang gelombang 334 nm dengan waktu

reaksi optimum 4 menit (terhitung setelah 45 detik penambahan larutan OPA

pertama kali) berdasarkan hasil optimasi yang dilakukan Limawan (2012).

Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi seri kadar asam traneksamat,

diperoleh data seperti yang tertera pada tabel IV. Bersasarkan data absorbansi

tersebut kemudian ditentukan persamaan kurva baku dan nilai koefisien

korelasinya (r) untuk masing-masing replikasi.

Tabel IV. Data replikasi kurva baku asam traneksamat

Kadar asamtraneksamat

(µg/mL)

Absorbansi*Replikasi I

Absorbansi*Replikasi II

Absorbansi*Replikasi III

10 0,292 0,288 0,29520 0,576 0,565 0,57330 0,830 0,832 0,84540 1,121 1,133 1,13250 1,378 1,378 1,371

Persamaan kurvabaku

y = 0,02717x +0,0243

y = 0,02748x +0,0148

y = 0,02711x +0,0299

Koefisien korelasi r = 0,9998 r = 0,9996 r = 0,9996* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA

Berdasarkan data pada tabel IV tersebut dipilih persamaan kurva baku

yang memiliki linieritas paling baik. Linieritas menunjukkan hubungan antara

kadar asam traneksamat dengan absorbansi derivatnya dan dapat dilihat dari nilai

koefisien korelasi (r). Menurut Snyder et al. (1997), syarat suatu metode

dikatakan memiliki linearitas yang baik adalah bila nilai koefisien korelasi (r)-nya

≥ 0,999, terutama untuk penetapan kadar senyawa utama. Ketiga replikasi kurva

baku tersebut memiliki nilai r > 0,999 sesuai yang disyaratkan, namun yang

digunakan selanjutnya yaitu persamaan kurva baku replikasi I karena memiliki


47

nilai koefisien korelasi yang paling besar, yang menunjukkan bahwa hubungan

antara kadar asam traneksamat dan absorbansi derivatnya semakin proporsional.

Artinya, absorbansi hasil derivat akan meningkat secara proporsional seiring

dengan peningkatan kadar asam traneksamat. Gambar 13 berikut ini merupakan

gambar hubungan antara kadar asam traneksamat dengan absorbansi derivatnya.

* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPAGambar 13. Hubungan antara kadar asam traneksamat dengan absorbansi hasil

derivatnya replikasi I

C. Validasi Metode

Parameter validitas metode untuk penetapan kadar asam traneksamat

secara spektrofotometri UV yang diamati dalam penelitian ini adalah spesifisitas,

linieritas, LOD, LOQ, akurasi dan presisi.

1. Spesifisitas

Spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya

mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya

komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004). Pada

y = 0,02717x + 0,0243r = 0,9998

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 20 40 60

Abs

orba

nsi*

Kadar Asam Traneksamat (µg/mL)

Replikasi I


48

penelitian ini, spesifisitas metode dibuktikan dengan cara membandingkan

panjang gelombang maksimum dari larutan OPA dengan panjang gelombang

maksimun dari produk derivatisasi antara asam traneksamat dengan OPA serta

tingkat overlapping yang terjadi. Jika panjang gelombang maksimum (selective

UV-wavelength) dari pola spektra berbeda, maka dapat dikatakan bahwa

metode tersebut spesifik (Ermer and Miller, 2005), karena pada panjang

gelombang tersebut tidak ada absorbansi dari senyawa lain, hanya senyawa

analit saja yang terukur.

Berdasarkan data yang diperoleh, panjang gelombang maksimum

larutan OPA yaitu 260,5 nm yang ditunjukkan pada gambar 9, sedangkan

panjang gelombang maksimum hasil derivatisasi asam traneksamat dengan

OPA yaitu 334 nm yang ditunjukkan pada gambar 14. Setelah kedua gambar

tersebut dibandingkan, maka dapat diketahui bahwa OPA tidak memberikan

absorbansi pada panjang gelombang 334 nm, sehingga metode ini dikatakan

spesifik.

Gambar 14. Spektra hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA setelah 4 menitreaksi

Metode ini juga dapat membedakan absorbansi produk derivat dengan

hasil degradasi produk derivat. Hal ini dibuktikan dari spektra hasil degradasi


49

produk derivat yang memiliki panjang gelombang maksimum berbeda dengan

panjang gelombang maksimum produk derivat seperti yang tertera pada

gambar 15. Hasil degradasi produk derivat memiliki panjang gelombang

maksimum sebesar 246-280 nm.

Gambar 15. Spektra hasil degradasi produk derivatisasi asam traneksamat (30 µg/mL)dengan OPA setelah 35 menit reaksi

Gambar 16. Reaksi degradasi produk derivatisasi asam traneksamat dengan OPA(Coppex, 2000)

Berdasarkan lampiran 7 dan 8, dapat diketahui bahwa senyawa hasil

degradasi produk derivat memiliki absorbansi yang meningkat setelah 35 menit

reaksi karena data yang didapat menunjukkan bahwa pada konsentrasi asam

traneksamat yang sama, setelah 4 menit reaksi, senyawa pada panjang


50

gelombang 246 nm memiliki absorbansi sebesar 0,259, sedangkan setelah 35

menit reaksi, senyawa pada panjang gelombang 246 nm memiliki absorbansi

sebesar 0,482. Hal ini berbanding terbalik dengan absorbansi produk derivat.

Pada konsentrasi asam traneksamat yang sama, setelah 4 menit reaksi, produk

derivat dengan panjang gelombang 334 nm memiliki absorbansi sebesar 0,799,

sedangkan setelah 35 menit reaksi, produk derivat dengan panjang gelombang

334 nm memiliki absorbansi sebesar 0,108. Hal ini menunjukkan bahwa seiring

berjalannya waktu, produk derivatisasi yang terbentuk juga semakin kecil

karena telah terdegradasi.

Gambar 17. Spektra hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA setelah 4 menitreaksi dan tingkat overlapping yang terjadi

Keterangan:

Gambar 17 menunjukkan bahwa tingkat overlapping yang terjadi

antara produk derivat dengan hasil degradasi produk derivat sangat kecil

sehingga dapat dikatakan bahwa adanya hasil degradasi produk derivat tidak


51

mengganggu pengukuran absorbansi produk derivatisasi asam traneksamat

dengan OPA.

Berdasarkan spektra larutan asam traneksamat dalam sampel kapsul,

tidak ada absorbansi pada panjang gelombang 344 nm seperti yang ditunjukkan

pada gambar 18, selain itu, setelah larutan sampel yang mengandung asam

traneksamat diderivatisasi dengan OPA juga tidak ada absorbansi yang

mengganggu pengukuran hasil derivat pada panjang gelombang 334 nm seperti

yang ditunjukkan oleh gambar 19.

Gambar 18. Spektra larutan asam traneksamat (30 µg/mL) dalam sampel kapsul tanpaderivatisasi menggunakan OPA

Gambar 19. Spektra larutan asam traneksamat 30 µg/mL (dari sampel kapsul) dengan OPAsetelah 4 menit reaksi

Pengukuran absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat

dengan OPA dilakukan pada panjang gelombang 334 nm karena pada panjang


52

gelombang tersebut tidak terdapat gangguan senyawa lain baik dari eksipien,

pereaksi, pelarut maupun hasil degradasinya, sehingga metode ini spesifik

untuk penetapan kadar asam traneksamat.

2. Linieritas

Linieritas suatu metode dapat dilihat dari nilai koefisien korelasi (r)

yang didapat dari persamaan kurva baku asam traneksamat setelah

diderivatisasi dengan OPA. Suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang

baik jika nilai r ≥ 0,999 (Snyder et al., 1997). Nilai r menunjukan hubungan

antara kadar analit dengan absorbansi yang dihasilkan. Jika nilai r semakin

mendekati 1, maka hubungan antara kadar analit dengan absorbansinya

semakin linier. Pada penelitian ini didapatkan nilai r untuk tiga replikasi kurva

baku yaitu sebesar 0,9998; 0,9996 dan 0,9996 (Tabel IV). Ketiga replikasi

kurva baku tersebut memiliki nilai r ≥ 0,999 sehingga dapat dikatakan bahwa

metode ini memenuhi syarat linieritas yang baik.

3. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)

Untuk penetapan kadar zat aktif dalam suatu sediaan obat yang

termasuk kategori I, sebenarnya tidak memerlukan parameter validasi batas

deteksi dan batas kuantitasi. Namun pada penelitian ini dilakukan penetapan

batas deteksi dan batas kuantitasi untuk memberikan informasi mengenai

sensitivitas metode dalam pengukuran absorbansi hasil derivatisasi asam


53

traneksamat dengan OPA. Informasi LOD dan LOQ ini dapat berfungsi untuk

menentukan kadar seri baku yang digunakan.

Menurut ICH, LOD merupakan konsentrasi terkecil dari suatu analit

dalam sampel yang masih dapat terdeteksi, tetapi tidak perlu terkuantifikasi

pada nilai sebenarnya (Ermer and Miller, 2005). Penentuan batas deteksi dapat

didasarkan pada perhitungan tiga kali nilai standar deviasi blangko dibagi

dengan nilai slope kurva baku yang dibuat pada rentang kadar mendekati LOQ

(Anonim, 2005c).

* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPAGambar 20. Kurva baku untuk menghitung LOD dan LOQ replikasi I

Untuk penentuan LOD dan LOQ secara teoritis dibutuhkan persamaan

kurva baku baru yang berada pada kadar rendah mendekati LOQ. Rentang

konsentrasi yang digunakan pada kurva baku untuk perhitungan LOD dan LOQ

tidak boleh melebihi 10-20 kalinya LOD. Hal ini bertujuan agar konsentrasi

LOD dan LOQ yang didapat mendekati nilai sebenarnya dan tidak terjadi

penyimpangan kadar yang terlalu jauh, karena pada rentang konsentrasi

y = 0,0267x + 0,0011r = 0,99997

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0 10 20 30 40

Abs

orba

nsi*

Kadar Asam Traneksamat(µg/mL)

Replikasi I


54

tersebut, peningkatan variasi biasanya dapat diasumsikan memiliki pengaruh

yang kecil terhadap parameter dispersi dari regresi linier (Ermer and Miller,

2005). Kurva baku untuk menghitung LOD dan LOQ direplikasi 3 kali,

kemudian dipilih satu kurva baku yang memiliki nilai koefisien korelasi paling

besar yaitu pada replikasi I (Gambar 20) dan digunakan untuk menghitung nilai

LOD dan LOQ teoritis. Berdasarkan kurva baku replikasi I diketahui nilai

slope sebesar 0,0267 (Lampiran 13). Selanjutnya dilakukan pengukuran

absorbansi blangko sebanyak 15 kali untuk mengetahui nilai standard

deviation (SD)-nya. Blangko yang digunakan adalah larutan OPA dalam dapar

borat pH 8. Data absorbansi blangko yang diperoleh dapat dilihat pada

lampiran 14.

Secara teoritis, nilai LOD dapat dihitung sesuai rumus. Hasil dari

perhitungan LOD secara teoritis yaitu:

LOD = = ,, = 0,227 µg/mL (Lampiran 14).

LOQ merupakan konsentrasi terkecil dari analit di dalam sampel yang

masih dapat terkuantifikasi dengan memenuhi standar presisi dan akurasi yang

baik (Ermer and Miller, 2005). Batas kuantitasi dapat dihitung berdasarkan

perhitungan sepuluh kali nilai standar deviasi blangko dibagi dengan nilai slope

kurva baku (Anonim, 2005c).

Slope yang digunakan untuk menghitung LOQ secara teoritis juga

berasal dari slope kurva baku replikasi I yaitu sebesar 0,0267. Begitu juga

dengan SD blangko untuk menghitung LOQ berasal dari pengukuran

absorbansi blangko OPA dalam dapar borat sebanyak 15 kali (Lampiran 14).


55

Perhitungan LOQ secara teoritis dapat dilihat pada lampiran 14. Hasil

perhitungan LOQ secara teoritis yaitu

LOQ = = ,, = 0,758 µg/mL (Lampiran 14).

LOQ pada penetapan kadar zat aktif dalam suatu sediaan tidak dapat

digunakan sebagai kadar terkecil dari kurva baku, namun dapat digunakan

sebagai kadar dalam rentang konsentrasi yang masih dapat dikuantifikasi

secara reliabel dan reprodusibel dengan presisi dan akurasi melalui penggunaan

hubungan konsentrasi-respon pada metode bioanalisis (Chan et al., 2004).

Setelah diketahui nilai LOD dan LOQ teoritis, kemudian dibuktikan

dengan melakukan pengukuran absorbansi pada kadar LOD dan LOQ tersebut

untuk mengetahui nilai absorbansi pada kadar LOD dan LOQ teoritis. Data

penelitian yang didapat menunjukkan bahwa metode yang digunakan masih

dapat mendeteksi analit pada kadar 0,227 µg/mL dengan nilai absorbansi rata-

rata sebesar 0,0822. Namun pada kadar analit 0,758 µg/mL, metode yang

digunakan sudah dapat menghasilkan nilai absorbansi rata-rata sebesar 0,0968

yang dapat digunakan untuk perhitungan kadar analit dalam metode

bioanalisis, karena pada kadar tersebut telah dicapai reprodusibilitas yang baik

yang dapat dilihat dari nilai CV = 0,864. Syarat reprodusibilitas yang baik

menurut AOAC yaitu nilai CV ≤ 1,3 (AOAC cit., Gonzales and Herrador,

2007).


56

4. Akurasi

Ketepatan (accuracy) adalah ukuran yang menunjukkan kedekatan

hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai

persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (Snyder et al.,

1997). Syarat % recovery yang baik menurut AOAC cit., Gonzales and

Herrador yaitu 98-102%. Dalam penelitian ini penentuan ketepatan dilakukan

menggunakan cara yang ketiga yaitu dengan menggunakan standar adisi analit

karena cara yang pertama dan kedua tidak mungkin dilakukan kecuali jika

peneliti mendapatkan blank matriks dari sampel obat yang digunakan. Oleh

karena itu, maka diperlukan penetapan kadar sampel terlebih dahulu untuk

mengetahui kadar analit dalam sampel kapsul sehingga memudahkan peneliti

dalam perhitungan.

Berdasarkan lima kali replikasi penetapan kadar asam traneksamat

dalam serbuk kapsul batch 1 didapatkan kadar asam traneksamat rata-rata

sebesar 85,05% (b/b) untuk batch 1 dan 82,15% (b/b) untuk batch 2, untuk

perhitungannya secara rinci dapat dilihat pada lampiran 19 dan 21. Kemudian

setelah diketahui kadar asam traneksamat dalam sampel serbuk kapsul, peneliti

dapat memperkirakan melalui perhitungan kadar terukur yang akan digunakan

agar setelah diadisi menggunakan larutan baku asam traneksamat dengan tiga

level kadar, absorbansi yang dihasilkan masih berada dalam rentang kurva

baku yang dipergunakan untuk perhitungan kadar yang telah terbukti linier.

Ekstrapolasi tidak dikehendaki karena diluar rentang kurva baku yang

digunakan tidak ada jaminan linieritas antara kadar analit dengan absorbansi


57

yang dihasilkan. Adisi larutan baku asam traneksamat dilakukan pada tiga level

konsentrasi yaitu kadar rendah, sedang dan tinggi. Hal ini bertujuan untuk

membuktikan bahwa penggunaan metode pada kadar rendah, sedang dan tinggi

tersebut memberikan hasil yang tepat. Berdasarkan hasil pengukuran

absorbansi larutan serbuk kapsul batch 1 setelah diadisi menggunakan tiga

level kadar larutan baku, didapatkan data bahwa pada level rendah, recovery

yang didapatkan sebesar 99,87 – 101,63%; pada level sedang, recovery yang

didapatkan sebesar 98,73 – 98,96% dan pada level tinggi, recovery yang

didapatkan sebesar 99,96 - 101,43%. Perhitungan secara lengkap tercantum

pada lampiran 20. Recovery yang didapatkan pada batch 1 level rendah, sedang

dan tinggi tersebut memenuhi syarat yang ditetapkan AOAC untuk recovery 98

– 102%.

Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi larutan serbuk kapsul batch

2 setelah diadisi menggunakan tiga level kadar larutan baku, didapatkan data

bahwa pada level rendah, recovery yang didapatkan sebesar 99,32 – 101,00%;

pada level sedang, recovery yang didapatkan sebesar 99,10 – 100,73% dan

pada level tinggi, recovery yang didapatkan sebesar 98,44 - 100,96%.

Perhitungan secara lengkap tercantum pada lampiran 22. Recovery yang

didapatkan pada batch 2 level rendah, sedang dan tinggi tersebut memenuhi

syarat yang ditetapkan AOAC untuk recovery 98 – 102%.


58

5. Presisi

Ketelitian adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara

hasil uji individual yang diperoleh dari pengambilan sampel berulang yang

telah dihomogenkan dengan suatu metode analisis (Snyder et al., 1997).

Menurut United Stated Pharmacopeia Convention (2005), presisi suatu metode

ditentukan berdasarkan koefisien variasi (CV) yang diperoleh dari pengulangan

pengukuran suatu sampel homogen. Kriteria presisi yang diterima untuk kadar

zat analit 100% adalah CV ≤ 1,3% (AOAC cit., Gonzales and Herrador, 2007).

Menurut dokumen ICH Q2(R1), cara untuk menentukan repeatability

dapat dilakukan dengan menggunakan 9 kali penetapan dengan 3 level

konsentrasi dan 3 kali replikasi untuk masing-masing konsentrasi. Setelah

dilakukan tiga kali replikasi pada level kadar rendah, sedang dan tinggi

didapatkan data koefisien variasi sebagai berikut: pada sampel kapsul batch 1

CV level rendah sebesar 0,899%; CV level sedang sebesar 0,190% dan CV

level tinggi sebesar 0,660%. Sedangkan pada sampel kapsul batch 2 CV level

rendah sebesar 0,841%; CV level sedang sebesar 0,799% dan CV level tinggi

sebesar 1,261%. CV yang didapatkan pada batch 1 dan batch 2 baik pada level

rendah, sedang dan tinggi memenuhi syarat yang ditetapkan AOAC untuk

syarat CV ≤ 1,3%.

Presisi dan akurasi yang dilakukan menggunakan standar adisi ini

bertujuan untuk mengetahui apakah selama proses preparasi sampel ada analit

yang hilang. Untuk mengetahui baik atau tidaknya metode yang digunakan ini

maka dapat dilihat dari parameter akurasi presisi. Pada lampiran 25 dan 26 dapat


59

diketahui nilai standar deviasi dari slope dan intersep kurva LOQ; kurva adisi

sampel batch 1 dan kurva adisi sampel batch 2. Setelah dilakukan analisis statistik

menggunakan independent t-test dengan taraf kepercayaan 95% maka dapat

diketahui bahwa slope yang didapat dari kurva LOQ jika dibandingkan dengan

slope yang didapat dari kurva adisi pada batch 1 dan batch 2 secara statistik tidak

berbeda signifikan (Lampiran 27). Intersep yang didapat dari kurva LOQ jika

dibandingkan dengan intersep yang didapat dari kurva adisi pada batch 1 dan

batch 2 secara statistik juga tidak berbeda signifikan (Lampiran 28) sehingga

dapat disimpulkan bahwa preparasi sampel yang dilakukan tidak mempengaruhi

kadar asam traneksamat yang didapat secara signifikan.

D. Penetapan Kadar Asam Traneksamat dalam Kapsul

Teknik pengambilan sampel yang dilakukan dalam penetapan kadar asam

traneksamat dalam kapsul ini merupakan probability sampling secara simple

random sampling, dimana pengambilan sampel dilakukan secara random sehingga

setiap unit populasi mempunyai kesempatan yang sama untuk diambil sebagai

sampel. Cara random merupakan usaha untuk mendapatkan sampel yang

representatif karena adanya bias pemilihan dapat diperkecil sekecil mungkin

(Nasution, 2003).

Sampel yang digunakan berupa sediaan kapsul dari satu jenis merk

dengan zat aktif asam traneksamat. Dalam satu jenis merk tersebut diambil 20

kapsul dengan nomor kode produksi (batch) yang sama. Pemilihan nomor kode

produksi yang sama bertujuan untuk mendapatkan kriteria homogenitas karena


60

mengalami proses produksi yang sama. Pada penelitian ini dilakukan penetapan

kadar asam traneksamat pada 2 nomor kode produksi untuk mengetahui apakah

metode yang telah tervalidasi dapat diaplikasikan pada sampel kapsul asam

traneksamat. Sampel yang digunakan berjumlah 20 kapsul untuk setiap batch,

dengan tujuan agar pemilihan sampel representatif yaitu sampel yang dianalisis

benar-benar mencerminkan populasi yang diwakilinya. Pada penetapan kadar

asam traneksamat dalam kapsul asam traneksamat® ini dilakukan 5 replikasi untuk

menjamin reprodusibilitas dari kadar terukur yang didapat.

Uji keseragaman bobot dilakukan pada setiap 20 kapsul yang digunakan

untuk analisis. Pengujian ini berfungsi untuk menjamin bahwa 20 kapsul yang

dianalisis memenuhi keseragaman bobot sesuai yang dipersyaratkan Farmakope

Indonesia Edisi IV (1995). Setelah pengujian tersebut, serbuk kapsul

dihomogenkan dalam mortir dan stamper, agar kadar yang terukur dapat mewakili

populasi sampel. Proses penyiapan sampel dilakukan dengan cara melarutkan

serbuk kapsul dengan akuades kemudian disaring menggunakan kertas saring dan

kapas sebanyak 3 kali yang merupakan hasil optimasi dari Limawan (2012).

Penyaringan ini bertujuan agar partikel-partikel bahan tambahan yang tidak larut

yang ada pada serbuk kapsul dapat tertinggal pada kapas dan kertas saring

sehingga filtrat yang dihasilkan jernih. Filtrat yang jernih ini yang kemudian

ditetapkan kadar asam traneksamatnya dengan diderivatisasi menggunakan OPA

secara spektrofotometri UV. Sampel yang akan diderivatisasi diharapkan jernih

agar pada saat pengukuran hasil derivat menggunakan spektrofotometer UV tidak

terjadi scattering. Scattering merupakan pengahamburan cahaya oleh karena


61

adanya partikel-partikel tidak larut, sehingga absorbansi yang dihasilkan tidak

reprodusibel.

Pada penetapan kadar asam traneksamat dalam kapsul digunakan kondisi

spektrofotometer UV yang telah divalidasi sehingga panjang gelombang

pengukuran yang digunakan yaitu 334 nm. Sebagai jaminan spesifisitas,

dilakukan scanning filtrat sampel yang belum diderivatisasi dengan OPA.

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan dapat dinyatakan bahwa tidak ada

serapan lain pada penjang gelombang 334 nm sehingga absorbansi pada panjang

gelombang 334 nm merupakan absorbansi asam traneksamat dalam kapsul yang

telah diderivatisasi dengan OPA (Gambar 18 dan 19). Hasil penetapan kadar asam

traneksamat dalam sediaan kapsul asam traneksamat® terdapat pada tabel V untuk

batch 1 dan tabel VI untuk batch 2.

Tabel V. Hasil penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel batch 1

Replikasike-

Absorbansi*Kadar asamtraneksamat(mg)/kapsul

Kadar asamtraneksamat dalam %

(b/b)I 0,854 254,606 101,84II 0,846 252,151 100,86III 0,85 253,378 101,35IV 0,859 256,140 102,46V 0,851 253,685 101,47

Rata-rata 253,992 101,60 ± 0,595SD 0,595CV 0,586

* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA


62

Tabel VI. Hasil penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel batch 2

Replikasike-



(b/b)

I 0,838 249,571 99,828II 0,838 249,365 99,746III 0,834 248,344 99,337IV 0,836 248,752 99,501V 0,832 247,526 99,010

Rata-rata 248,711 99,484 ± 0,329SD 0,329CV 0,331


Pada penetapan kadar ini dapat diketahui ketelitian (precision) yang

berupa repeatability, yaitu derajat kedekatan hasil yang diperoleh pada kondisi

kerja yang sama dalam waktu pengukuran yang dekat (Snyder et al., 1997).

Penentuan precision pada sampel dilakukan sebanyak 5 replikasi dengan kondisi

kerja dan analis yang sama. Ketelitian dinyatakan dengan koefisien variasi (CV).

Pada penelitian ini CV yang diperoleh pada penetapan kadar asam traneksamat

dalam kapsul asam traneksamat® batch 1 setelah dilakukan 5 replikasi yaitu

sebesar 0,586%, sedangkan pada batch 2 yaitu sebesar 0,331%. Nilai kedua CV

tersebut masuk dalam persyaratan yang ditentukan untuk kadar analit 100% yaitu

CV ≤ 1,3% (AOAC cit., Gonzales dan Herrador, 2007), sehingga dapat dikatakan

bahwa metode spektrofotometri UV pada penetapan kadar asam traneksamat

dalam kapsul asam traneksamat® memiliki ketelitian yang baik.

Tabel V menunjukkan bahwa kadar rata-rata asam traneksamat dalam

kapsul asam traneksamat® batch 1 setelah dilakukan 5 replikasi yaitu sebesar

101,60 ± 0,595% (b/b). Tabel VI menunjukkan bahwa kadar rata-rata asam


63

traneksamat dalam kapsul asam traneksamat® batch 2 setelah dilakukan 5

replikasi yaitu sebesar 99,484 ± 0,329% (b/b). Hal ini sesuai dengan persyaratan

yang ditetapkan pada Supplement II Japanese Pharmacopeia yang menyatakan

bahwa kapsul asam traneksamat mengandung tidak kurang dari 95,0% dan tidak

lebih dari 105,0% dari yang tertera pada label kemasan kapsul asam traneksamat.

Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa metode derivatiasai dengan OPA

dan pengukuran hasil derivat menggunakan spektrofotometri UV dapat

diaplikasikan pada penetapan kadar asam traneksamat dalam kapsul asam

traneksamat® dan kadar asam traneksamat dalam kapsul asam traneksamat® sesuai

dengan yang tertera pada label kemasan.


64

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Metode spektrofotometri UV untuk penetapan kadar asam traneksamat dalam

kapsul dengan agen penderivat OPA memiliki validitas yang baik untuk

parameter spesifisitas, linieritas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan

presisi.

2. Metode yang telah tervalidasi tersebut dapat diaplikasikan untuk menetapkan

kadar asam traneksamat dalam sediaan kapsul asam traneksamat®.

B. Saran

Perlu dilakukan optimasi dan validasi mengenai pengaruh suhu terhadap

stabilitas hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA.


65

DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, H., 2004, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification,and Characterization, CRC Press, USA, pp. 64-66.

Anania, A., 2011, Validasi Metode Penetapan Kadar Heptaminol HCl denganAgen Penderivat O-ftalaldehid secara Spektrofotometri Ultraviolet,Skripsi, p. 27.

Anonim, 2001, The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, andBiological, 13th ed., Merck & Co., Inc., USA, p. 9648.

Anonim, 2005a, European Pharmacopoeia, 5th edition, European Directorate forthe Quality of Medicine, Strasbourg, p. 2610.

Anonim, 2005b, Material Safety Data Sheet for O-Phtalaldehyde,http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9926544, diakses tanggal24 November 2011.

Anonim, 2005c, Validation Of Analytical Procedures: Text And MethodologyQ2(R1), International Conference On Harmonization Of TechnicalRequirements For Registration Of Pharmaceuticals For Human Use, 7,11-12.

Anonim, 2011, Tranexamic Oral – Cyclokapron,http://www.medicinenet.com/tranexamic_acid-oral/article.htm, diaksestanggal 3 November 2011.

Blackburn, S., 1989, Handbook of Chromatography, CRC Press, USA, p. 268.

Chan, C. C., Lam, H., Lee, Y. C., and Zang, X. M., 2004, Analytical MethodValidation and Instrument Performance Verification, John Wiley &Sons, New Jersey, pp. 14, 109.

Chang, Q., Yin, O. Q. P., and Chow, M. S. S., 2004, Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method for the Determination ofTranexamic Acid in Human Plasma, J. Chromatogr. B, pp. 275-280.

Coppex, L., 2000, Derivatives for HPLC Analysis, Diploma Thesis, University ofGenf., pp. 8-9, 20-21, 16-17, 60.

Danielson, N.D., Gallagher, P.A., and Bao, J.J., 2000, Chemical Reagents andDerivatization Procedures in Drug Analysis, Encyclopedia of AnalyticalChemistry, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, pp. 7042–7076, 10-11.


66

Delyle, S. G., Abe, E., Batisse, A., Tremey, B., Fischler, M., Devillier, P., et al.,2010, A Validated Assay for the Quantitative Analysisof TranexamicAcid in Human Serum by Liquid Chromatography Coupled withElectrospray Ionization Mass Spectrometry, Clin. Chim. Acta, 411, pp.438-443.

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, FarmakopeIndonesia, jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta,p. li.

Duangrat, C., Wongsri, K., and Pongpaibul, Y., 2007, Spectrofluorimetricdetermination of tranexamic acid in hydrogel patch formulations byderivatization with naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde/cyanide, J CosmetSci., 58 (3), pp. 215-27.

Dunn, C.J. and Goa, K.L., 1999, Tranexamic Acid: A Review of Its Use inSurgery and Other Indications, Adis International Ltd., New Zealand, 57(6), pp. 1005-32.

Ermer, J. and Miller, J. H., 2005, Method Validation in Pharmaceutical Analysis,Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, pp. 53, 101, 110.

Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,Yogyakarta, pp. 11-15, 220-265.

Gonzales, A. G. and Herrador, M. A., 2007, A Practical Guide to AnalyticalMethod Validation, Including Measurement Uncertainty and AccuracyProfiles, Trends Anal. Chem., 26 (3), pp. 232-234.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,Majalah Ilmu Kefarmasian, 1 (3), pp. 117-134.

Haven, M. C., Tetrault, G.A., and Schenken, J. R., 1994, LaboratoryInstrumentation, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 88-90.

Issarani, R., Vankar, K. K., and Nayak, D. K., 2010, Spectrophotometric Methodsfor Simultaneous Estimation of Ethamsylate and Tranexamic Acid fromCombined Tablet Dosage Form, Int J. Chem Tech Res., 2 (1), pp. 74-78.

Limawan, F., 2012, Optimasi Metode Penetapan Kadar Asam Traneksamatdengan Agen Penderivat OPA secara Spektrofotometri UV, Skripsi,Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, pp. 30-49.

Lindroth, P., Hamberger, A., and Sandberg, M., 1985, Neuromethods; 3, AminoAcids, The Humana Press, Inc., USA, pp. 98-100.


67

Matsubayashi, K., Kojima, C., and Tachizawa, H., 1988, Determination oftranexamic acid in human serum by high-performance liquidchromatography using selective pre-column derivatization with phenylisothiocyanate, J Chromatogr., 433, pp. 225-34.

McDonald, R. S. and Sibley, C. E., 1981, The intramolecular Cannizzaro reactionof phthalaldehyde, Can J. Chem., 59, pp. 1061-1067.

Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga,Surabaya, pp. 26-34, 267.

Otsuji, H., 2004, Ultraviolet-visible Reference Spectra in the Supplement II to theJapanese Pharmacopeia, 14th ed., The Minister of Health, Labour andWelfare, Japan, pp.1745-1746.

Patil, K.R., Rane, V. P., Sangshetti, J. N. and Shinde D. B., 2010, AssayDetermination of Tranexamic acid in Pharmaceutical Dosage Form(Tablet) Using HPLC and ELS Detector, Eurasian J. Anal. Chem., 5 (3),pp. 204-211.

Pavia, D.L., Lampman, G.M., and Kriz, G.S., 2001, Introduction to Spectroscopy,3th ed, Thomson Learnin, Inc., USA, pp. 187, 353-359.

Perrin, D.D. and Dempsey, B., 1974, Buffers for pH and Metal Ion Control,Chapman and Hall, London, p. 147.

Nasution, R., 2003, Teknik Sampling, Digitized by USU digital library, pp. 2-3.

Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, Liberty, Yogyakarta, pp. 1-43.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC MethodDevelopment, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 67-68,161, 687-691.

Snyder, L. R., Kirkland, J. J., and Dolan, J. W., 2010, Introduction to ModernLiquid Chromatography, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, p. 33.

Stauffer, E., Dolan, J.A., and Newman, R., 2008, Fire Debris Analysis, Elsevier,Inc., USA, p. 389.

Toyo’oka, T., 1999, Modern Derivatization Methods for Separation Sciences,John Wiley and Sons, England, pp. 43, 65-67, 74, 78-83.

United States Pharmacopeial Convention, 2007, USP30 – NF 25, United StatesPharmacopeial Convention Inc., Rockville, p. 225.


68

Watson, D.G., 2003, Pharmacutical Analysis: A Textbook for Pharmacy Studentsand Pharmaceutical Chemists, Churchill Livingstone, USA, p. 77.

Willard, H.H., Merritt, L.L., Dean, J.A., and Settle, F.A., 1988, InstrumentalMethods of Analysis, 7th ed., A Division of Wadsworth, Inc. California, p.185.


69PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

70

Lampiran 1. Sertifikat analisis asam traneksamat


71

Lampiran 2. Hasil scanning panjang gelombang larutan OPA dalam dapar borat pH 8

segera setelah dibuat

Spektra larutan OPA (0,5 mg/mL) dalam dapar borat pH 8


72


setelah 1 jam dibuat



73





74





75


setelah 4,5 jam dibuat



76

Lampiran 7. Hasil scanning panjang gelombang hasil derivatisasi antara asam traneksamat

(30µg/mL) dan OPA setelah 4 menit reaksi


77

Lampiran 8. Hasil scanning panjang gelombang hasil degradasi dari hasil derivatisasi antara

asam traneksamat (30µg/mL) dan OPA setelah 35 menit reaksi


78

Lampiran 9. Spektra penurunan absorbansi hasil derivatisasi asam traneksamat dengan

OPA selama 1 jam

ABS = absorbansi hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA pada suhu dingin

........... lanjutan (19)


79

Lanjutan (18)...........


80

Lampiran 10. Contoh perhitungan kadar larutan baku asam traneksamat

a. Skema pembuatan

Kurang lebih 100,2 mg serbuk baku asam traneksamat ditimbang saksama

↓

Larutkan dalam 50 mL aquades (Li)

↓

Pipet 5 mL larutan stok asam traneksamat (Li) masukan dalam labu ukur 10

mL kemudian tambahkan aquades hingga volume tepat 10 mL (Larutan

intermediet).

Pipet 50; 100; 150; 200 dan 250 µL larutan intermediet, masukkan ke dalam

labu ukur 5 mL

↓

Tambahkan larutan OPA pH 8 hingga volume tepat 5,0 mL.

b. Perhitungan seri kadar asam traneksamat

Bobot baku asam traneksamat hasil penimbangan = 100,2 mg

Kadar asam traneksamat dalam 50 mL aquades =, , %= 2 mg/mL

= 2000 µg/mL (Li)

Kadar asam traneksamat dalam larutan intermediet = 1000 µg/mL

Dengan perhitungan : V1 x C1 = V2 x C2

5 mL x 2000 µg/mL = 10 mL x C2

C2 = 1000 µg/mL

Seri Kadar Perhitungan Kadar Asam Traneksamat

150 µL x 1000 µg/mL5 mL = 10 µg/mL

2100 µL x 1000 µg/mL5 mL = 20 µg/mL

3150 µL x 1000 µg/mL5 mL = 30 µg/mL

4200 μL x 1000 μg/mL5 mL = 40 μg/mL

5250 µL x 1000 µg/mL5 mL = 50 µg/mL


81

Lampiran 11. Perhitungan persamaan kurva baku asam traneksamat

a. Pengukuran absorbansi seri larutan baku asam traneksamat

Kadar asam traneksamat(µg/mL)

Absorbansi* I Absorbansi* II Absorbansi* III

10 0,292 0,288 0,29520 0,576 0,565 0,57330 0,830 0,832 0,84540 1,121 1,133 1,13250 1,378 1,378 1,371


b. Perhitungan persamaan kurva baku asam traneksamat menggunakan regresi

linier

Replikasi I : y = 0,02717x + 0,0243

r = 0,9998

Replikasi II : y = 0,02748x + 0,0148

r = 0,9996

Replikasi III : y = 0,02711x + 0,0299

r = 0,9996

c. Kurva baku asam traneksamat


y = 0,02717x + 0,0243r = 0,9998

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 20 40 60

Abs

orba

nsi*


Replikasi I


82



y = 0,02748x + 0,0148r = 0,9996

00,20,40,60,8

11,21,41,6

0 20 40 60

Abs

orba

nsi*


Replikasi II

y = 0,02711x + 0,0299r = 0,9996

00,20,40,60,8

11,21,41,6

0 20 40 60

Abs

orba

nsi*


Replikasi III


83

Lampiran 12. Range linieritas kurva baku asam traneksamat

a. Skema pembuatan


↓


↓


mL kemudian tambahkan aquades hingga volume tepat 10,0 mL (Larutan

intermediet).

Pipet 5; 15; 25; 50; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450 dan 500 µL larutan

intermediet, masukkan dalam labu ukur 5 mL

↓

Tambahkan larutan OPA pH 8 hingga volume tepat 5,0 mL.

b. Perhitungan seri kadar asam traneksamat


Kadar asam traneksamat dalam 50 mL aquades =, , %= 2 mg/mL

= 2000 µg/mL (Li)



5 mL x 2000 µg/mL = 10 mL x C2

C2 = 1000 µg/mL


15 μL x 1000 μg/mL5 mL = 1 μg/mL

215 μL x 1000 μg/mL5 mL = 3 μg/mL

325 μL x 1000 μg/mL5 mL = 5 μg/mL

450 μL x 1000 μg/mL5 mL = 10 μg/mL


84

5100 μL x 1000 μg/mL5 mL = 20 μg/mL

6150 μL x 1000 μg/mL5 mL = 30 μg/mL

7200 μL x 1000 μg/mL5 mL = 40 μg/mL

8250 μL x 1000 μg/mL5 mL = 50 μg/mL

9300 μL x 1000 μg/mL5 mL = 60 μg/mL

10350 μL x 1000 μg/mL5 mL = 70 μg/mL

11400 μL x 1000 μg/mL5 mL = 80 μg/mL

12450 μL x 1000 μg/mL5 mL = 90 μg/mL

13500 μL x 1000 μg/mL5 mL = 100 μg/mL

c. Hasil pengukuran hasil derivatisasi baku asam traneksamat dengan OPA

menggunakan spektrofotometer UV

Kadar asamtraneksamat (µg/mL)

Absorbansi*

Rep I Rep II Rep III

1 0,026 0,034 0,0313 0,080 0,081 0,0805 0,137 0,135 0,13710 0,269 0,275 0,26420 0,533 0,543 0,52630 0,805 0,840 0,83140 1,141 1,109 1,05350 1,411 1,379 1,31360 1,650 1,672 1,65870 1,950 1,898 1,95280 2,190 2,211 2,15590 2,349 2,366 2,452100 2,518 2,624 2,629



85

d. Perhitungan persamaan kurva baku asam traneksamat dengan regresi linier

Replikasi I : y = 0,0262x + 0,0283

r = 0,9977

Replikasi II : y = 0,0266x + 0,0209

r = 0,9992

Replikasi III : y = 0,0269x + 0,0020

r = 0,9993

e. Kurva baku asam traneksamat


y = 0,0262x + 0,0283r = 0,9977

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 50 100 150

Abs

orba

nsi*

Kadar Asam Traneksamat (µg/ml)

Replikasi I


86



y = 0,0266x + 0,0209r = 0,9992

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 50 100 150

Abs

orba

nsi*


Replikasi II

y = 0,0269x + 0,0020r = 0,9993

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 50 100 150

Abs

orba

nsi*


Replikasi III


87

Lampiran 13. Pembuatan kurva baku asam traneksamat untuk menghitung LOD dan LOQ

a. Dari range linieritas kurva baku asam traneksamat, diambil 5 titik terendah

untuk memperoleh persamaan regresi kurva baku yang akan digunakan untuk

perhitungan LOD dan LOQ

Kadar asam traneksamat(µg/mL)

Absorbansi*

Rep I Rep II Rep III

3 0,080 0,081 0,0805 0,137 0,135 0,13710 0,269 0,275 0,26420 0,533 0,543 0,52630 0,805 0,840 0,831


b. Perhitungan persamaan kurva baku asam traneksamat dengan regresi linier

Replikasi I : y = 0,0267x + 0,0011

r = 0,99997

karena r paling bagus maka digunakan untuk perhitungan LOD dan LOQ

Replikasi II : y = 0,0280x - 0,0056

r = 0,9997

Replikasi III : y = 0,0275x - 0,0068

r = 0,9993


88

c. Kurva baku asam traneksamat untuk perhitungan LOD dan LOQ



y = 0,0267x + 0,0011r = 0,99997

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0 10 20 30 40

Abs

orba

nsi*


Replikasi I

y = 0,0280x - 0,0056r = 0,9997

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0 10 20 30 40

Abs

orba

nsi*


Replikasi II


89


y = 0,0275x - 0,0068r = 0,9993

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0 10 20 30 40

Abs

orba

nsi*


Replikasi III


90

Lampiran 14. Perhitungan LOD dan LOQ teoritis

Bobot OPA hasil penimbangan = 100,5 mg

a. Skema pembuatan larutan blangko (OPA dalam larutan dapar borat pH 8)

Timbang 100 mg OPA, masukkan dalam gelas Beaker.

↓

Tambahkan 2 mL metanol p.a. dan 100 µL merkaptoetanol p.a. Aduk hingga

OPA larut dan masukkan dalam labu ukur 200 mL.

↓

Tambahkan larutan dapar borat pH 8 hingga volume tepat 200 mL dan gojog

hingga homogen.

b. Pengukuran absorbansi larutan blangko

No. Absorbansi* Rata-rata SD CV

1 0,072

0,0697 0,002024 2,9048

2 0,0713 0,0694 0,075 0,0756 0,0697 0,0688 0,0699 0,0710 0,0711 0,0712 0,0713 0,06814 0,06715 0,067

c. Perhitungan SD dan CV blangko

SD =( )

= 0,002024

CV = = 2,9048


91

d. Perhitungan LOD teoritis

LOD = = ,, = 0,227 µg/mL

e. Perhitungan LOQ teoritis

LOQ = = ,, = 0,758 µg/mL


92

Lampiran 15. Perhitungan LOD dan LOQ praktis

a. Skema pembuatan


↓


↓



intermediet).

↓

Untuk LOD: pipet 2,27 µL larutan intermediet, masukkan dalam labu ukur 10

mL

Untuk LOQ: pipet 7,58 µL larutan intermediet, masukkan dalam labu ukur 10

mL

↓

Tambahkan larutan OPA pH 8 hingga volume tepat 10 mL

↓

Ukur absorbansi setelah 4 menit reaksi. Lakukan 5 kali replikasi untuk LOD

dan LOQ

b. Perhitungan kadar asam traneksamat untuk LOD dan LOQ


Kadar asam traneksamat dalam 50 mL aquades = 100 mg/50 mL

= 2 mg/mL

= 2000 µg/mL (Li)



5 mL x 2000 µg/mL = 10 mL x C2

C2 = 1000 µg/mL


93


12,27 μL x 1000 μg/mL10 mL = 0,227 μg/mL

27,58 μL x 1000 μg/mL10 mL = 0,758 μg/mL

c. Hasil pengukuran LOD dan LOQ praktis

LOD LOQKadar (µg/mL) 0,227 µg/mL 0,758 µg/mL

Absorbansi*

Rep I 0,083 0,098Rep II 0,078 0,097Rep III 0,084 0,096Rep IV 0,082 0,096Rep V 0,084 0,097

SD 0,00248998 0,00083666Rata-rata 0,0822 0,0968

CV 3,029 0,864* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA


94

Lampiran 16. Perhitungan akurasi dan presisi larutan baku asam traneksamat


Kadar asam traneksamat dalam 50 mL aquades =, , %= 2 mg/mL (Li)

a. Skema pembuatan



intermediet).

↓

Pipet 50; 150 dan 250 µL larutan intermediet asam traneksamat, masukkan

labu ukur 5 mL.

↓

Tambahkan larutan OPA pH 8 pada labu ukur tersebut hingga volume tepat 5

mL.

↓

Gojog campuran tersebut dan diamkan dalam suhu kulkas (20ºC).

↓

Ukur absorbansinya setelah 4 menit (terhitung setelah 45 detik penambahan

OPA) pada λ 334 nm. Lakukan 5 kali replikasi untuk masing-masing

konsentrasi.


95

b. Perhitungan akurasi dan presisi

Larutan asam traneksamat dengan kadar 10 µg/mL

Replikasike-

Absorbansi*Kadar asam

traneksamat terukur(µg/mL)

Kadar asamtraneksamat teoritis

(µg/mL)

Recovery(%)

1 0,294 9,9264 10 99,262 0,295 9,9632 10 99,633 0,300 10,1472 10 101,474 0,298 10,0736 10 100,745 0,300 10,1472 10 101,47

Rata-rata 10,0515SD 0,1028CV 1,02* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA

Contoh perhitungan kadar terukur

Persamaan kurva baku asam traneksamat yaitu y = 0,02717x + 0,0243

x = kadar terukur; y = absorbansi

y = 0,02717x + 0,0243

0,294 = 0,02717x + 0,0243

x = 9,9264 µg/mL

Demikian pula untuk perhitungan kadar terukur yang lain.

Contoh perhitungan % recovery

% recovery = 100%% recovery =

, // 100% = 99,26%

Demikian pula untuk perhitungan % recovery yang lain.


96


Replikasike-

Absorbansi*Kadar asamtraneksamat

terukur (µg/mL)


(µg/mL)Recovery (%)

1 0,837 29,9117 30 99,702 0,844 30,1693 30 100,563 0,838 29,9485 30 99,834 0,853 30,5005 30 101,675 0,843 30,1325 30 100,44

Rata-rata 30,13SD 0,2342CV 0,7773



Replikasi ke- Absorbansi*Kadar asamtraneksamat

terukur (µg/mL)


(µg/mL)Recovery (%)

1 1,376 49,7497 50 99,502 1,381 49,9337 50 99,873 1,376 49,7497 50 99,504 1,373 49,6393 50 99,285 1,375 49,7129 50 99,42

Rata-rata 49,7571SD 0,1085CV 0,2181* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA


97

Lampiran 17. Spektra larutan asam traneksamat (30 µg/mL) dalam serbuk kapsul tanpa

derivatisasi menggunakan OPA


98

Lampiran 18. Spektra hasil derivatisasi asam traneksamat dari sampel kapsul (30 µg/mL)


99

Lampiran 19. Penetapan kadar asam traneksamat dalam kapsul batch 1

a. Uji keseragaman bobot 20 kapsul

Bobot 20 kapsul = 7,1945 g

Kapsulno

Bobot kapsul + isi(g)

Bobot cangkang kapsul(g)

Bobot isi kapsul(g)

1 0,3692 0,0617 0,30752 0,3623 0,0618 0,30053 0,3618 0,0605 0,30134 0,3636 0,0603 0,30335 0,3544 0,0612 0,29326 0,3599 0,0614 0,29857 0,3408 0,0612 0,27968 0,3578 0,0626 0,29529 0,3544 0,0601 0,294310 0,3595 0,061 0,298511 0,3653 0,0606 0,304712 0,3541 0,062 0,292113 0,3587 0,062 0,296714 0,3559 0,0619 0,29415 0,3597 0,0612 0,298516 0,3612 0,0618 0,299417 0,3661 0,0611 0,30518 0,3634 0,0606 0,302819 0,3671 0,0623 0,304820 0,3627 0,0596 0,3031

Jumlah 5,973Rata-rata 0,29865

SD 0,006301838CV 2,110%

Kadar teoritis asam traneksamat dalam sampel sebesar 250 mg/kapsul.

Setiap 298,65 mg serbuk kapsul mengandung 250 mg asam traneksamat.

Kadar teoritis asam traneksamat dalam serbuk kapsul yaitu:

, 100% = 83,71% (b/b)


100

Serbuk kapsul yang harus ditimbang untuk mendapat asam traneksamat 100

mg yaitu: 100 ,= 119,5 mg

b. Data penimbangan sampel untuk 5 replikasi

Replikasi I

Bobot kertas : 0,1074 g

Bobot kertas + zat : 0,2269 g

Bobot kertas + sisa : 0,1075 g

Bobot zat : 0,1194 g

Replikasi II





Replikasi III





Replikasi IV






101

Replikasi V





c. Skema kerja optimasi penyarian pada penetapan kadar asam traneksamat dalam

sampel

Timbang kurang lebih saksama 119,5 mg serbuk kapsul yang telah

dihomogenkan dalam mortir

↓

Masukkan dalam gelas Beaker dan dilarutkan dengan aquades

↓

Masukkan dalam labu ukur 100,0 mL dan tambahkan aquades hingga volume

tepat 100,0 mL kemudian gojog hingga homogen

↓

Lakukan penyarian asam traneksamat menggunakan corong, kapas dan kertas

saring sebanyak 3 kali; 4 kali dan 5 kali

↓

Ambil 300 µL larutan sampel, masukkan dalam labu ukur 10 mL

↓

Tambahkan larutan OPA pH 8 hingga volume tepat 10,0 mL

↓

Ukur absorbansinya pada λ 334 nm setelah didiamkan di tempat dingin dan

gelap selama 4 menit


102

d. Hasil optimasi penyarian asam traneksamat

Tabel absorbansi hasil derivatisasi sampel asam traneksamat dengan OPA

Jumlah PenyaringanAbsorbansi*

% kadar asam traneksamatdalam serbuk kapsul (b/b)

Rep I Rep II Rep III Rep I Rep II Rep III

3 kali 0,854 0,890 0,828 85,252 88,951 82,5814 kali 0,853 0,881 0,823 85,149 88,026 82,0675 kali 0,802 0,862 0,811 79,909 86,074 80,834


Contoh perhitungan % kadar (b/b)



y = 0,02717x + 0,0243

0,854 = 0,02717x + 0,0243

x = 30,537 µg/mL

Bobot terukur = (30,537 µg/mL x 10 mL) x (100000 µL / 300 µL)

= 101791,2 µg

= 101,791 mg

Kadar asam traneksamat dalam serbuk kapsul =, , 100%

= 85,25% (b/b)

Demikian pula untuk perhitungan % kadar (b/b) yang lain.

e. Skema kerja penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel

Timbang kurang lebih 119,5 mg serbuk kapsul yang telah dihomogenkan

dalam mortir

↓


↓



↓


103


saring sebanyak 3 kali

↓


↓


↓



f. Hasil penetapan kadar asam traneksamat dalam serbuk kapsul

Replikasike-


terukur (µg/mL)

Bobot terukur(mg)

% Kadar(b/b)

I 0,854 30,537 101,79 85,25II 0,846 30,243 100,81 84,43III 0,850 30,390 101,30 84,84IV 0,859 30,721 102,40 85,77V 0,851 30,427 101,42 84,94

Rata-rata 85,05* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA




y = 0,02717x + 0,0243

0,854 = 0,02717x + 0,0243

x = 30,537 µg/mL


= 101791,2 µg

= 101,791 mg


= 85,25% (b/b)



104

Lampiran 20. Perhitungan akurasi dan presisi larutan baku asam traneksamat dalam

sampel serbuk kapsul batch 1

a. Perhitungan serbuk kapsul batch 1 untuk penimbangan

Kadar rata-rata asam traneksamat dalam serbuk kapsul batch 1 = 85,05% (b/b),

artinya setiap 100 mg serbuk kapsul mengandung 85,05 mg asam traneksamat.

Untuk mendapatkan 100 mg asam traneksamat dalam serbuk kapsul batch 1,

maka serbuk kapsul yang harus ditimbang yaitu sebesar:100 mg x 100 mg85,05 mg = 117,58 mg ≈ 117,6 mgb. Data penimbangan serbuk kapsul batch 1 untuk akurasi dan presisi

Rendah Sedang Tinggi

Bobot (g) Rep I Rep II Rep III Rep I Rep II Rep III Rep I Rep II Rep III

Kertas 0,1075 0,1076 0,1045 0,1075 0,1076 0,1045 0,1076 0,1076 0,1046Kertas + zat 0,2252 0,2253 0,2222 0,2253 0,2253 0,2222 0,2253 0,2253 0,2223Kertas + sisa 0,1076 0,1077 0,1045 0,1077 0,1076 0,1046 0,1077 0,1076 0,1046Zat 0,1176 0,1176 0,1177 0,1176 0,1177 0,1176 0,1176 0,1177 0,1177

c. Data penimbangan larutan baku asam traneksamat (10 mg/mL) untuk adisi

Replikasi I






Kadar asam traneksamat dalam 100 mL aquades =, , %= 9,978 mg/mL

Replikasi II






105



Replikasi III







d. Skema kerja akurasi dan presisi larutan asam traneksamat dalam sampel serbuk

kapsul batch 1

Timbang lebih kurang saksama 117,6 mg serbuk kapsul yang telah


↓

Untuk akurasi dan presisi kadar rendah: tambahkan 10,0 mL larutan baku asam

traneksamat (10 mg/mL).

Untuk akurasi dan presisi kadar sedang: tambahkan 20,0 mL larutan baku asam

traneksamat (10 mg/mL)

Untuk akurasi dan presisi kadar tinggi: tambahkan 30,0 mL larutan baku asam


↓


↓



↓


106



↓


↓


↓



↓

Lakukan 3 kali replikasi untuk setiap kadar (rendah, sedang dan tinggi)

sehingga didapatkan 9 data

e. Perhitungan akurasi dan presisi larutan asam traneksamat dalam sampel kapsul

batch 1

Larutan asam traneksamat dengan level rendah


teoritis (µg/mL)


terukur (µg/mL)

Recovery(%)

Rep I 0,576 19,98 20,305 101,63Rep II 0,567 20,00 19,974 99,87Rep III 0,575 20,01 20,269 101,29

Rata-rata 20,183SD 0,181CV 0,899


Contoh perhitungan kadar teoritis asam traneksamat dalam sampel yang telah

di adisi baku asam traneksamat

Replikasi I kadar rendah

Konsentrasi teoritis dalam aquades 100 mL

=( , , %) ,

= 1,998 mg/mL

= 1998 µg/mL


107

Ambil 100 µL ad OPA 10,0 mL

V1 x C1 = V2 x C2

100 µL x 1998 µg/mL = 10 mL x C2

C2 = 19,98 µg/mL




y = 0,02717x + 0,0243

0,576 = 0,02717x + 0,0243

x = 20,305 µg/mL




, /, / 100% = 101,63%


Larutan asam traneksamat dengan level sedang


teoritis (µg/mL)


terukur (µg/mL)

Recovery(%)


Rata-rata 29,642SD 0,056CV 0,190



108

Larutan asam traneksamat dengan level tinggi


teoritis (µg/mL)


terukur (µg/mL)

Recovery(%)


Rata-rata 40,217SD 0,265CV 0,660



109

Lampiran 21. Penetapan kadar asam traneksamat dalam kapsul batch 2

a. Uji keseragaman bobot 20 kapsul

Bobot 20 kapsul = 7,2832 g

Kapsulno

Bobot kapsul + isi(g)

Bobot cangkang kapsul(g)

Bobot isi kapsul(g)

1 0,3668 0,0606 0,30622 0,3658 0,0618 0,3043 0,3671 0,0618 0,30534 0,3651 0,0600 0,30515 0,3643 0,0624 0,30196 0,3640 0,0615 0,30257 0,3594 0,0618 0,29768 0,3687 0,0596 0,30919 0,3547 0,0619 0,292810 0,3683 0,0611 0,307211 0,3661 0,0613 0,304812 0,3696 0,0634 0,306213 0,3692 0,0638 0,305414 0,3518 0,0605 0,291315 0,3675 0,0615 0,30616 0,3684 0,0635 0,304917 0,3656 0,0612 0,304418 0,3550 0,0616 0,293419 0,3638 0,0615 0,302320 0,3660 0,0614 0,3046

Jumlah 6,055Rata-rata 0,30275

SD 0,005000579CV 1,652%

Kadar teoritis asam traneksamat dalam sampel sebesar 250 mg / kapsul.

Setiap 302,75 mg serbuk kapsul mengandung 250 mg asam traneksamat.

Kadar teoritis asam traneksamat dalam serbuk kapsul yaitu:

, 100% = 82,58% (b/b)


110

Serbuk kapsul yang harus ditimbang untuk mendapat asam traneksamat 100

mg yaitu: 100 ,= 121,1 mg

b. Data penimbangan sampel untuk 5 replikasi

Replikasi I





Replikasi II





Replikasi III





Replikasi IV






111

Replikasi V





c. Skema kerja penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel

Timbang kurang lebih saksama 121,1 mg serbuk kapsul yang telah


↓


↓



↓



↓


↓


↓




112

d. Hasil penetapan kadar asam traneksamat dalam serbuk kapsul

Replikasike-


terukur (µg/mL)

Bobot terukur(mg)

% Kadar(b/b)

I 0,838 29,948 99,83 82,43II 0,838 29,948 99,83 82,37III 0,834 29,801 99,34 82,03IV 0,836 29,875 99,58 82,16V 0,832 29,728 99,09 81,76

Rata-rata 82,15* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA




y = 0,02717x + 0,0243

0,838 = 0,02717x + 0,0243

x = 29,948 µg/mL


= 99828,242 µg

= 99,83 mg


= 82,43% (b/b)



113

Lampiran 22. Perhitungan akurasi dan presisi larutan baku asam traneksamat dalam

sampel serbuk kapsul batch 2

a. Perhitungan serbuk kapsul batch 1 untuk penimbangan

Kadar rata-rata asam traneksamat dalam serbuk kapsul batch 2 = 82,15% (b/b),

artinya setiap 100 mg serbuk kapsul mengandung 82,15 mg asam traneksamat.

Untuk mendapatkan 100 mg asam traneksamat dalam serbuk kapsul batch 2,

maka serbuk kapsul yang harus ditimbang yaitu sebesar:100 mg x 100 mg82,15 mg = 121,73 mg ≈ 121,7 mgb. Data penimbangan serbuk kapsul batch 2 untuk akurasi dan presisi

Rendah Sedang Tinggi

Bobot (g) Rep I Rep II Rep III Rep I Rep II Rep III Rep I Rep II Rep III

Kertas 0,1047 0,1048 0,1048 0,1048 0,1048 0,1048 0,1047 0,1048 0,1048Kertas + zat 0,2265 0,2266 0,2266 0,2266 0,2266 0,2266 0,2265 0,2266 0,2266Kertas + sisa 0,1048 0,1049 0,1048 0,1049 0,1048 0,1049 0,1048 0,1049 0,1049Zat 0,1217 0,1217 0,1218 0,1217 0,1218 0,1217 0,1217 0,1217 0,1217

c. Data penimbangan larutan baku asam traneksamat (10 mg/mL) untuk adisi

Replikasi I







Replikasi II







114


Replikasi III







d. Skema kerja akurasi dan presisi larutan asam traneksamat dalam sampel serbuk

kapsul batch 2

Timbang lebih kurang saksama 121,7 mg serbuk kapsul yang telah


↓

Untuk akurasi dan presisi kadar rendah: tambahkan 10,0 mL larutan baku asam

traneksamat (10 mg/mL).

Untuk akurasi dan presisi kadar sedang: tambahkan 20,0 mL larutan baku asam


Untuk akurasi dan presisi kadar tinggi: tambahkan 30,0 mL larutan baku asam


↓


↓



↓




115

↓


↓


↓



↓

Lakukan 3 kali replikasi untuk setiap kadar (rendah, sedang dan tinggi)

sehingga didapatkan 9 data

e. Perhitungan akurasi dan presisi larutan asam traneksamat dalam sampel kapsul

batch 2

Larutan asam traneksamat dengan level rendah


teoritis (µg/mL)


terukur (µg/mL)

Recovery(%)


Rata-rata 20,048SD 0,169CV 0,841


Contoh perhitungan kadar teoritis asam traneksamat dalam sampel yang telah

di adisi baku asam traneksamat

Replikasi I kadar rendah

Konsentrasi teoritis dalam aquades 100 mL

=( , , %) ,

= 1,9997 mg/mL

= 1999,7 µg/mL


116

Ambil 100 µL ad OPA 10,0 mL

V1 x C1 = V2 x C2

100 µL x 1999,7 µg/mL = 10 mL x C2

C2 = 19,997 µg/mL




y = 0,02717x + 0,0243

0,570 = 0,02717x + 0,0243

x = 20,085 µg/mL




, /, / 100% = 100,44%


Larutan asam traneksamat dengan level sedang


teoritis (µg/mL)

Kadar asamtraneksamat terukur

(µg/mL)

Recovery(%)


Rata-rata 29,961SD 0,239CV 0,799



117

Larutan asam traneksamat dengan level tinggi

Absorbansi*Kadar asam

traneksamat teoritis(µg/mL)


terukur (µg/mL)Recovery (%)


Rata-rata 39,824SD 0,502CV 1,261



118

Lampiran 23. Penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel serbuk kapsul batch 1

Replikasike-



(b/b)I 0,854 254,606 101,84II 0,846 252,151 100,86III 0,85 253,378 101,35IV 0,859 256,140 102,46V 0,851 253,685 101,47

Rata-rata 253,992 101,60 ± 0,595SD 0,595CV 0,586


Contoh perhitungan bobot rata-rata kapsul batch 1 Replikasi I

Kadar AT =, , 298,65 mg/kapsul

= 254,606 mg/kapsul

Kadar AT (%) =, 100%

= 101,84% (b/b)

Demikian pula untuk perhitungan kadar asam traneksamat yang lain


119

Lampiran 24. Penetapan kadar asam traneksamat dalam sampel serbuk kapsul batch 2

Replikasike-



(b/b)

I 0,838 249,571 99,828

II 0,838 249,365 99,746

III 0,834 248,344 99,337

IV 0,836 248,752 99,501

V 0,832 247,526 99,010Rata-rata 248,711 99,484 ± 0,329

SD 0,329CV 0,331


Contoh perhitungan bobot rata-rata kapsul batch 2 Replikasi I

Kadar AT =, , 302,75 mg/kapsul

= 249,571 mg/kapsul

Kadar AT (%) =, 100%

= 99,828% (b/b)

Demikian pula untuk perhitungan kadar asam traneksamat yang lain


120

Lampiran 25. Perhitungan standar deviasi slope dan intersep dari kurva baku untuk LOQ

dan standar deviasi slope dan intersep dari kurva adisi pada batch 1

Kurva baku asam traneksamat untuk perhitungan LOD dan LOQ


Kurva presisi akurasi menggunakan standar adisi pada batch 1

KadarAT

Kadar ATteoritis

(µg/mL)Rep I

Abs*

Kadar ATteoritis

(µg/mL)Rep II

Abs*

Kadar ATteoritis

(µg/mL)Rep III

Abs*

Rata-ratakadar AT

teoritis(µg/mL)

Rata-rataabs*

Rendah 19,98 0,576 20 0,567 20,01 0,575 19,996 0,573

Sedang 29,96 0,828 30,006 0,83 30,002 0,831 29,989 0,829

Tinggi 39,94 1,125 40,004 1,115 40,01 1,111 39,984 1,117Abs* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA

AT = asam traneksamat

y = 0,0267x + 0,0011r = 0,99997

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0 10 20 30 40

Abs

orba

nsi*


Replikasi I


121


Least Square Analysis membandingkan kurva LOQ dengan kurva adisi sampel

batch 1

1. Kurva Baku LOQ y = 0,0267x + 0,0011

x = kadar asam traneksamat (µg/mL)

y = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA/ = standar deviasi residual

Sb = standar deviasi slope

Sa = standar deviasi intersep − ( − )3 0,080 -10,6 112,365 0,137 -8,6 73,9610 0,269 -3,6 12,9620 0,533 6,4 40,9630 0,805 16,4 268,96∑ = 68 ∑ = 1,824 ∑( − ̅) = 509,2̅ = = 13,6 ; =

,= 0,3648

y = 0,0272x + 0,0234r = 0,9994

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50

Abso

rban

si*

Kadar asam traneksamat (µg/mL)

Presisi Akurasi Batch 1

Rep I

Rep II

Rep III

Rata-rata 3 rep

kurva baku LOQ

Linear (Rata-rata 3 rep)


122

Kurva Baku LOQ y = 0,0267x + 0,0011 | − | ( − )3 9 0,080 0,0812 0,0012 1,44 x 10-6

5 25 0,137 0,1346 0,0024 5,76 x 10-6

10 100 0,269 0,2681 0,0009 8,1 x 10-7

20 400 0,533 0,5351 0,0021 4,41 x 10-6

30 900 0,805 0,8021 0,0029 8,41 x 10-6∑ = 1434∑( − ) =

2,083 x 10-5

/ = ∑ ( )=

,= 2,635 x 10-3

Perhitungan standar deviasi slope (Sb)= /{∑( ̅) } =, { , } = 1,167 x 10-4

Nilai t (t-value) untuk derajat kebebasan n-2 = 3 dan tingkat kepercayaan 95%

yaitu 3,18, maka batasan nilai slope pada tingkat kepercayaan 95% yaitu

sebesar: = 0,0267 ± 3,18 × 1,167 × 10 = 0,0267 ± 0,000371Perhitungan standar deviasi intersep (Sa)= / ∑∑ ( ̅) = 2,635 × 10 × , = 2,635 × 10 × 0,5632= 1,977 x 10-3


yaitu 3,18, maka batasan nilai intersep pada tingkat kepercayaan 95% yaitu

sebesar: = 0,0011 ± 3,18 × 1,977 × 10 = 0,0011 ± 0,006282. Kurva adisi sampel kapsul batch 1 y = 0,0272x + 0,0234




123


Sa = standar deviasi intersep − ( − )19,996 0,573 -9,994 99,88029,989 0,829 -0,001 0,00000139,984 1,117 9,994 99,880∑ = 89,969 ∑ = 2,519 ∑( − ̅) = 199,760̅ = ,

= 29,990 ; =,

= 0,840

Kurva adisi sampel kapsul batch 1 y = 0,0272x + 0,0234| − | ( − )19,996 399,840 0,573 0,5673 0,0057 3,249 x 10-5

29,989 899,340 0,829 0,8391 0,0101 1,0201 x 10-4

39,984 1598,720 1,117 1,1110 0,006 3,6 x 10-5∑ = 2897,9∑( − ) =

1,705 x 10-4

/ = ∑ ( )=

,= 0,0131

Perhitungan standar deviasi slope (Sb)= /{∑( ̅) } =,{ , } = 9,269 x 10-4



sebesar: = 0,0272 ± 12,71 × 9,269 × 10 = 0,0272 ± 0,0118Perhitungan standar deviasi intersep (Sa)= / ∑∑ ( ̅) = 0,0131 ,× , = 0,0131 × 4,8356= 0,0288



sebesar: = 0,0234 ± 12,71 × 0,0288 = 0,0234 ± 0,3661


124

Lampiran 26. Perhitungan standar deviasi slope dan intersep dari kurva baku untuk LOQ

dan standar deviasi slope dan intersep dari kurva adisi pada batch 2

Kurva baku asam traneksamat untuk perhitungan LOD dan LOQ


Kurva presisi akurasi menggunakan standar adisi pada batch 2

KadarAT

Kadar ATteoritis

(µg/mL)Rep I

Abs*

Kadar ATteoritis

(µg/mL)Rep II

Abs*

Kadar ATteoritis

(µg/mL)Rep III

Abs*

Rata-ratakadar AT

teoritis(µg/mL)

Rata-rataabs*

Rendah 19,997 0,57 19,994 0,573 20 0,564 19,997 0,569

Sedang 29,996 0,838 29,998 0,832 29,986 0,845 29,993 0,838

Tinggi 39,995 1,094 39,986 1,104 39,98 1,121 39,987 1,106Abs* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA

AT = asam traneksamat

y = 0,0267x + 0,0011r = 0,99997

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0 10 20 30 40

Abs

orba

nsi*


Replikasi I


125


Least Square Analysis membandingkan kurva LOQ dengan kurva adisi sampel

batch 2

1. Kurva Baku LOQ y = 0,0267x + 0,0011




Sa = standar deviasi intersep − ( − )3 0,080 -10,6 112,365 0,137 -8,6 73,9610 0,269 -3,6 12,9620 0,533 6,4 40,9630 0,805 16,4 268,96∑ = 68 ∑ = 1,824 ∑( − ̅) = 509,2̅ = = 13,6 ; =

,= 0,3648

y = 0,0268x + 0,032r = 0,99999

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50

Abso

rban

si

Kadar asam traneksamat (µg/mL)

Presisi Akurasi Batch 2

Rep I

Rep II

Rep III

rata-rata 3 rep

Kurva baku LOQ

Linear (rata-rata 3 rep)


126

Kurva Baku LOQ y = 0,0267x + 0,0011 | − | ( − )3 9 0,080 0,0812 0,0012 1,44 x 10-6

5 25 0,137 0,1346 0,0024 5,76 x 10-6

10 100 0,269 0,2681 0,0009 8,1 x 10-7

20 400 0,533 0,5351 0,0021 4,41 x 10-6

30 900 0,805 0,8021 0,0029 8,41 x 10-6∑ = 1434∑( − ) =

2,083 x 10-5

/ = ∑ ( )=

,= 2,635 x 10-3

Perhitungan standar deviasi slope (Sb)= /{∑( ̅) } =, { , } = 1,167 x 10-4



sebesar: = 0,0267 ± 3,18 × 1,167 × 10 = 0,0267 ± 0,000371Perhitungan standar deviasi intersep (Sa)= / ∑∑ ( ̅) = 2,635 × 10 × , = 2,635 × 10 × 0,5632= 1,977 x 10-3



sebesar: = 0,0011 ± 3,18 × 1,977 × 10 = 0,0011 ± 0,006282. Kurva adisi sampel kapsul batch 2 y = 0,0268x + 0,032




127


Sa = standar deviasi intersep − ( − )19,997 0,569 -9,995 99,90029,993 0,838 0,001 0,00000139,987 1,106 9,995 99,900∑ = 89,977 ∑ = 2,513 ∑( − ̅) = 199,800̅ = ,

= 29,992 ; =,

= 0,838

Kurva adisi sampel kapsul batch 2 y = 0,0268x + 0,032| − | ( − )19,997 399,880 0,569 0,5679 0,0011 1,21 x 10-6

29,993 899,580 0,838 0,8358 0,0022 4,84 x 10-6

39,987 1598,960 1,106 1,1036 0,0024 5,76 x 10-6∑ = 2898,42∑( − ) =

1,181 x 10-5

/ = ∑ ( )=

,= 0,0034

Perhitungan standar deviasi slope (Sb)= /{∑( ̅) } =,{ , } = 2,4054 x 10-4



sebesar: = 0,0268 ± 12,71 × 2,4054 × 10 = 0,0268 ± 0,00306Perhitungan standar deviasi intersep (Sa)= / ∑∑ ( ̅) = 0,0034 ,× , = 0,0034 × 4,8355= 0,0074



sebesar: = 0,032 ± 12,71 × 0,0074 = 0,032 ± 0,0940


128

Lampiran 27. Uji signifikansi slope pada kurva LOQ dengan slope pada kurva adisi batch 1

dan batch 2

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

slope_loq .175 3 . 1.000 3 1.000

slope_adisi1 .175 3 . 1.000 3 1.000

slope_adisi2 .175 3 . 1.000 3 1.000

a. Lilliefors Significance Correction

Uji signifikansi slope pada kurva LOQ dengan slope pada kurva adisi batch 1

Independent Samples Test

Levene's

Test for

Equality of

Variances t-test for Equality of Means

F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error

Difference

95% Confidence Interval

of the Difference

Lower Upper

slope Equal

variances

assumed

3.749 .125-

.0734 .945

-

.000500000.006816100

-

.019424526.018424526

Equal

variances

not

assumed

-

.0732.004 .948

-

.000500000.006816100

-

.029771926.028771926

Nilai signifikansi slope kurva LOQ sebesar 0,945 dan nilai signifikansi

slope kurva adisi batch 1 sebesar 0,948. Kedua nilai tersebut > 0,05 sehingga

dapat dikatakan bahwa secara statistik, keduanya tidak berbeda signifikan.


129

Uji signifikansi slope pada kurva LOQ dengan slope pada kurva adisi batch 2


Levene's

Test for

Equality of


F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error

Difference

95% Confidence Interval

of the Difference

Lower Upper

slope Equal

variances

assumed

3.044 .156-

.0564 .958

-

.000100000.001779629

-

.005041043.004841043

Equal

variances

not

assumed

-

.0562.059 .960

-

.000100000.001779629

-

.007551377.007351377

Nilai signifikansi slope kurva LOQ sebesar 0,958 dan nilai signifikansi

slope kurva adisi batch 2 sebesar 0,960. Kedua nilai tersebut > 0,05 sehingga



130

Lampiran 28. Uji signifikansi intersep pada kurva LOQ dengan intersep pada kurva adisi

batch 1 dan batch 2

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

interseploq .175 3 . 1.000 3 1.000

intersep_adisi1 .175 3 . 1.000 3 1.000

intersep_adisi2 .175 3 . 1.000 3 1.000

a. Lilliefors Significance Correction

Uji signifikansi intersep pada kurva LOQ dengan intersep pada kurva adisi batch 1


Levene's

Test for

Equality

of


F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed

)

Mean

Differenc

e

Std. Error

Differenc

e

95% Confidence

Interval of the

Difference

Lower Upper

intersep_loq_

adisi1

Equal

variances

assumed

3.86

3

.12

1

-

.10

5

4 .921

-

.0223000

0

.2113990

3

-

.6092378

0

.5646378

0

Equal

variances not

assumed

-

.10

5

2.00

1.926

-

.0223000

0

.2113990

3

-

.9313641

4

.8867641

4

Nilai signifikansi intersep kurva LOQ sebesar 0,921 dan nilai signifikansi

intersep kurva adisi batch 1 sebesar 0,926. Kedua nilai tersebut > 0,05 sehingga



131

Uji signifikansi intersep pada kurva LOQ dengan intersep pada kurva adisi batch 2


Levene's

Test for

Equality

of


F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed

)

Mean

Differenc

e

Std. Error

Differenc

e

95% Confidence

Interval of the

Difference

Lower Upper

intersep_loq_

adisi2

Equal

variances

assumed

3.46

8

.13

6

-

.56

8

4 .600

-

.0309000

0

.0543919

1

-

.1819161

4

.1201161

4

Equal

variances not

assumed

-

.56

8

2.01

8.627

-

.0309000

0

.0543919

1

-

.2629564

0

.2011564

0

Nilai signifikansi intersep kurva LOQ sebesar 0,600 dan nilai signifikansi

intersep kurva adisi batch 2 sebesar 0,627. Kedua nilai tersebut > 0,05 sehingga



132

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Validasi Metode

Penetapan Kadar Asam Traneksamat dengan Agen

Penderivat O-Ftalaldehid secara Spektrofotometri UV”

memiliki nama lengkap Natalia Windari Rahardjo lahir

di Purwokerto, 21 Desember 1990. Anak pertama dari

pasangan Bpk. Drs. Mulyono Rahardjo dan Ibu Winarti

ini menempuh pendidikan TK di TK Santa Maria

Purwokerto, dan melanjutkan pendidikan SD di SD

Santa Maria Purwokerto. Penulis kemudian menempuh

pendidikan SMP di SMP Bruderan Purwokerto pada tahun 2002 dan SMA Negeri

1 Purwokerto pada tahun 2005.

Setelah lulus SMA, penulis melanjutkan pendidikan ke Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2008. Selama kuliah, penulis

mengikuti beberapa kegiatan fakultas yaitu panitia acara Pharmacy Performance

and Event Cup (PPEC) 2008, panitia Seminar “Herbal Medicine” 2008, peserta

Kampanye Informasi Obat (KIO), panitia Pharmacy Performance (PP) 2009,

panitia Pelepasan Wisuda 2010, panitia Temu Alumni Lustrum III tahun 2010,

anggota Cosmetic Study Club (CSC) 2010-2011 dan anggota Pengabdian

Masyarakat (PM) mengenai Penyuluhan Penggunaan Kosmetik Antioksidan tahun

2011.

Penulis juga sempat menjadi asisten untuk beberapa mata kuliah

praktikum, antara lain Kimia analisis 2010 dan 2011, Farmakognosi-Fitokimia I

2010 dan Kromatografi 2011.


Documents

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIrepository.usd.ac.id/17682/2/088114052_Full.pdf · PT. Ifars -Solo yang telah bersedia memberikan baku asam traneksamat