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Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Rompimiento celular
Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Productos Extracelulares-Antibióticos-Enzimas extracelulares-Muchos polisacáridos-Mayoría de aminoácidos
Productos Intracelulares-Mayoría de proteínas modificadas
genéticamente-Lípidos-Algunos antibióticos
BiomasaEsteroides
(Se extraen sin romper)
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Fermentación
Cosecha de células
Rompimiento Celular
Centrifugación, filtración con vacío,
filtración con membranas
Homogenización, molienda, lisis
(enzimática o química)
Centrifugación, filtración con vacío,
Etapas primarias
de recuperación
Remoción de restos celulares
Concentración y/o
fraccionamiento
Operaciones de alta
resolución
Operaciones finales
Producto
Centrifugación, filtración con vacío,
filtración con membranas
Precipitación, extracción, filtración con
membranas, evaporación
Cromatografía, cristalización
Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989
Studies on cell disruption and cell debrisremoval in downstream processing
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Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae
Antes de la ruptura celularDespués de 2 pasos a 1000 bar dando un
rompimiento celular de 95%
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Equipo de ruptura
Industria Alimentaria(Homogenización de la leche)
Industria de la Pintura(Reducción de Pigmentos)
Industria BiotecnológicaAplicación en …
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Método Técnica Principio Estrés
sobre el
producto
Costo Ejemplo
Químico Choque osmótico Ruptura osmótica de la membrana Suave Barato Ruptura de células de sangre
Digestión
enzimática
Rompimiento por digestión de la
pared celular
Suave Caro Micrococcus lysodeikticus tratado con lisozima
de huevo
Solubilización Detergentes solubilizan la
membrana celular
Suave Moderado-
caro
Sales biliares actuando sobre E.coli
Disolución de
lípidos
Solventes orgánicos se disuelven en
la pared celular y la desestabilizan
Moderado Barato Ruptura de levadura con tolueno
lípidos la pared celular y la desestabilizan
Tratamiento
alcalino
La saponificación de lípidos
solubiliza la membrana
Fuerte Barato
Mecánico Homogenización
(tipo navaja)
Células cortadas en una licuadora Moderado Moderado Tejido animal y células
Molido Ruptura celular por molido con
abrasivos
Moderado Barato
Ultrasonicación Células rotas con cavitación
ultrasónica
Fuerte Caro Suspensión de células a pequeña escala
Homogenización
(tipo orificio)
Se hace pasar células por un
pequeño orificio y se rompen por
estrés
Fuerte Moderado Tratamiento a gran escala de suspensión de
células excepto bacterias
Rompimiento en
molino de perlas
Se aplastan las células entre el
vidrio y perlas de acero
Fuerte Barato Tratamiento a gran escala de suspensión de
células y células de plantas
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Procariotes Gram –(E. coli produce la mayoría de las proteínas recombinantes)
Membrana externa(Proteínas y lipopolisacáridos)
Polipéptidoglucanos8 nm
Fuerza mecánica
Esquema de la pared celular de células procariotas
Procariotes Gram +
Polipéptidoglucanos
Espacio Periplasmático(Proteínas)
Membrana de plasma
8 nm
Polipéptidoglucanos
Espacio Periplasmático(Proteínas)
Membrana de plasma(Fosfolípidos, proteínas dispersas, iones metálicos)
Permeabilidad
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Dificultad de la ruptura
Esporas
Cocos gram -
Levaduras
Células vegetales
Bacilos gram +
Bacilos gram - y cocos
Micelios
Células animales
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Elección del método de ruptura
�Naturaleza de la fuente de la enzima
�Escala de la operación�Escala de la operación
�Velocidad del método de extracción
�Estabilidad del enzima
�Pureza requerida
�Costo del proceso
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Factor inactivante Fuente de
enzima
Frecuencia Modo de
contrarrestarlo
Calor Cualquiera Universal Enfriamiento
Frío Cualquiera Raro Calentamiento
Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento
Proteasa Mayoría Común Inhibidores de proteasas o frío
Productos oxidación de
fenoles
Plantas y hongos Bastante común Agentes reductores
Oxidación Cualquiera Común Agentes reductores
Dilución proteína Cualquiera Bastante común Concentración rápida
Pérdida de estabilidad Cualquiera Bastante común Restauración de ese factor
Inhibidores específicos Plantas y bacterias Raro Separación del inhibidor
Metales pesados Cualquiera Raro Agentes quelantes
Cambio de fase Cualquiera Común Mínima agitación
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Choque osmótico
1. Suspensión de células en solución tamponada hipertónica (sacarosa 20%)2. Equilibrio osmótico3. Centrifugación: concentración de las células4. Resuspensión en agua (4ºC)5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior celular
• Mayor sensibilidad en GRAM – (GRAM + alta presión osmótica interna)• Ventajas:
Extracción de enzimas del espacio periplasmático, simplificación de los procesos de purificación
• NO a gran escala:Grandes volúmenes de medio (400 L/10 kg pasta celular)Elevado número de pasos de centrifugaciónNecesidad de refrigeración
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Tratamiento con lisozima + EDTA
•Digestión de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4) glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopéptido
•Mayor susceptibilidad GRAM +•Combinación con EDTA: quelante del Ca2+
•Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina, antiobióticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationesHongos/levaduras: quitinasa/glucanasas
•Necesidad de choque osmótico•No empleo a gran escala:
Alto precio de la lisozimaEliminación de lisozima tras extracción
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Tratamiento con detergentes
Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana, debido a apertura de poros
Tipos:1. Iónicos: provoca desnaturalización proteica
Aniónicos: Lauril sulfato sódico, colato sódico, SDSCatiónicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonioCatiónicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonio
2. No iónicos: preservan estructura nativa e interacciones de la enzimaTween, Spam, Triton
Inconvenientes:Precipitación de proteínasNecesidad de eliminación (cromatografía, ultrafiltración)
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Tratamiento con álcalis
�Tratamiento de las células con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)
� Hidrólisis de la pared celular� Ventajas:
� Simpleza, barato� Fácil aplicación a gran escala� Fácil aplicación a gran escala
� Desventajas: � Tratamiento fuerte, es un ejemplo extremo de la solubilización (Saponificación de lípidos que se convierten a detergentes)� No selectivo� Aplicación SÓLO si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino
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Departamento de Biotecnología
�Método tradicional de ataque ( tolueno).
Disolventes orgánicos
�No se usan a gran escala.
�Inconvenientes:PrecioToxicidadDesnaturalización de proteínasInflamabilidad
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Homogeneización con abrasivos
•Mortero + abrasivo (cristal, albúmina, kieselgurh)•Dispositivos de funcionamiento continuo:
Agitador Mickle (agitador vibratorio)Dyno-mill (agitador de discos giratorios)
•Efectividad depende de:� Tipo y concentración de abrasivo� Tipo, concentración y edad de las células: levaduras >bacterias� Velocidad de agitación� Cantidad y flujo a través de la cámara� Temperatura� Dispositivo de discos
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Sonicación
•Aplicación de frecuencia superiores a 20kHz•Aparición de áreas de compresión/enrarecimiento/cavidades →colapso de cavidades →ondas de choque →daño celular•Aplicación continua o discontinua•Eficacia dependiente de:
Tipo de microorganismo: diversidadGram ->Gram +Gram ->Gram +Bacilos > CocospHTemperaturaFuerza iónica del medioTiempo de exposiciónDensidad de la célula
•Uso a pequeña escal, NO a gran escala:Elevados requerimientos de energíaDificultad de transmisión de la energíaProblemas de disipación del calor producido
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Congelación/Descongelación
•Formación y fusión de cristales de hielo � liberación de proteínas
•Combinación con otros métodos: congelación de sedimentos bacterianos
•Ventajas:•Ventajas:SimplicidadBajas temperaturas de trabajo
•NO a gran escala:Elevado tiempo de tratamientoResistencia de algunos microorganismosSensibilidad de las enzimas a congelación/descongelación
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Cizalla líquida
•Paso de la suspensión de células a elevada presión (>55MPa) a través de un orificio estrecho•Homogeneizador de Manto-Gaulin•Mecanismo:
Ruptura celular por caída brusca de presión y choque
•Modos de uso:Paso único, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminación de sustancia
•Efectividad depende de:Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM +Historia de la materia de partida:Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial)Congelación/descongelación
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Cizalla sólida
•Paso de células congeladas (-20ºC) a través de orificio
•Mecanismo:Agitación en presencia de abrasivo (cristales de hielo) + ruptura por cizalla líquidaruptura por cizalla líquidaFuerzas de cizalla: paso a través de orificio + desgarro por cristales de hielo
•No produce la desnaturalización de las enzimas
•NO a gran escala:Manejo complicado y costoso
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Choque osmótico: El cálculo del gradiente de presión se basa en el equilibrio químico
1c⋅⋅−=− TRPPie
Molino de Perlas (operación intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cinética de primer orden. El balance de masa de proteína liberada puede ser expresado mediante la ecuación:
( )MmMVRRk
dt
dRV −=
Integrando y re-arreglando
ktRR
R
m
m =−
ln
t
RR
R
m
m
−ln
kEjemplo 5.2
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Eficiencia de los Molinos de Perlas (operación continua): El número de etapas de un molino de perlas obtenido mediante experimentos de pulsos, puede ser empleado para calcular la eficiencia del rompimiento esperada. El balance de masa de proteína liberada (células rotas) considerando que el molino consta de N etapas tipo tanque perfectamente agitado en serie y que el rompimiento sigue una cinética de primer orden puede ser expresado mediante la ecuación:expresado mediante la ecuación:
( )�
VRRkFR
dt
dR
�
Vm
m
m
111 −+−=
Expresando la ecuación en función de un tiempo adimensional e integrando obtenemos
+=
�F
kV
�F
kV
R
R
m
m
m 1
1
Eficiencia de la etapa !!!
Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos:�
m
�m
m
�F
kV
RR
R
+=−
1 Ejemplo 5.3
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Homogeneizador de alta presión: La desintegración celular en un homogeneizador de alta presión a una presión fija puede ser descrita mediante una cinética de primer orden respecto al número de pasos, de tal manera que:
( )RRkd�
dRm−= '
Integrando obtenemos la ecuación:
�kRR
R
m
m 'ln =−
Se ha determinado experimentalmente que la constante k’ tiene una dependencia con la presión de la siguiente forma:
aPkk "'=
a
m
m�Pk
RR
R"ln =
−
Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cinética de rompimiento presenta una cierta dependencia no lineal con el número de pasos expresada mediante la ecuación:
ab
m
mP�k
RR
R"ln =
−Ejemplo 5.4
mRR −
Donde b es un exponente que varía con el tipo de célula y toma valores entre 0.28 y 1
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Chang and Su, 2006Kinetic model for simultaneous cell
disruption and aqueous two-phase
extraction
A = Am[1 − exp(−kt)]
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La Ruptura celular, cuando se están procesando cientos o miles de litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a
nivel laboratorioFactores claves son: Eficiencia y reproducibilidad
A nivel Industrial sólo se emplean los molinos de perlas agitados y los homogeneizadores a alta presión. El diseño de los molinos está basado en ecuaciones empíricas y en experimentos piloto.está basado en ecuaciones empíricas y en experimentos piloto.
GEA Liquid Processing cell rupture skid for biologic cell lysing. The homogenizer feature the high efficiency sharp profile rupture valve type R which enable cell disruption at lower pressures