Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Prof. dr. sc. Nada Oršolić
Zavod za animalnu fiziologiju
Pokusni modeli
Nužnost uporabe pokusnih životinja
• U istraživanju fizioloških procesa • U mikrobiološkim istraživanjima • U istraživanja rasta tumora i metastaza • U proizvodnja cjepiva protiv zaraznih bolesti • U istraživanje lijekova • U istraživanjima u području toksikologije • U istraživanju imunotoksičnost • U istraživanju karcinogena i mutagena • U neurofiziologiji i ponašanju životinja
• http://www.nih.gov/science/models/mouse/resources/hcc.html
• Emice website: http://emice.nci.nih.gov/
• Cancer Models Database: http://cancermodels.nci.nih.gov/
• Cancer Images Database: http://cancerimages.nci.nih.gov/
• http://www.jax.org/
Mišji modeli za tumore ljudi
Nužnost uporabe pokusnih životinja u biomedicinskim istraživanjima
• U biologiji, veterini i agronomiji znanstvena istraživanja uz uporabu pokusnih životinja temelje se na prikupljanju informacija za životinju ili životinjsku vrstu.
• Biomedicinska istraživanja pokusne životinje rabe u istraživanju: – lijekova (20-25%), – provjere valjanosti cjepiva (15-20%), – istraživanju toksičnosti različitih pripravaka (15-20%), – istraživanju karcinoma (10-15%) – 30% za druge svrhe: bazična medicinska istraživanja,
genetička istraživanja, dijagnoza, pokusne operacije, edukacija i dr.
Cjepiva-načelo aktivne imunizacije • Načelo aktivne imunizacije protiv velikih boginja uveo
Edward Jener prije 200 god.
• “živa atenuirana vakcina” prema uputama WHO (World Health Organisation)
• Cjepivo protiv brojnih bolesti
• Pojava “davnih” iskorjenjeni bolesti i pojava novih bolesti
• Pogodujući čimbenici: promjena ljudskog ponašanja, povećano kretanje ljudi, demografske promjene, iskorištavanje okoliša, smanjena pozornost na mogućnost zaražavanja, smanjen opseg istraživanja i nadzora zaraznih bolesti te mutacija virusa.
• broj životinja smanjen ali životinje su nezamjenjive u istraživanju kakvoće, valjanosti i neškodljivosti cjepiva (dobra laboratorijska praksa-rekombinantne vakcine)
Cijepljenje- aktivna imunizacije stečena umjetnim načinom
• Osnovni oblici specifične imunosti • Prema izvršnim (efektornim) mehanizmima djelovanja
– Humoralna imunost (posredovana protutijelima)
– Stanična imunost (posredovana stanicama)
• Prema načinu stjecanja – Aktivna imunost (stečena djelovanjem organizma)
• Stečena prirodnim načinom (preboljenje bolesti, izloženost infekciji
• Stečena umjetnim načinom (cjepljenje)
– Pasivna imunost (stečena prijenosom seruma) • Stečena prirodnim načinom (putem posteljice, kolostrum)
• Stečena umjetnim načinom (imunosni serumi)
– Adoptivna imunost (stečena prijenosom limfocita
Glavne komponente obrambenog
odgovora kralješnjaka
Napad patogenih
mikro-organizama
STEČENA (SPECIFIČNA) IMUNOST
Sporiji odgovor na specifične patogene mikroorganizme;
treća linije obrane
PRIROĐENA (NESPECIFIČNA) OTPORNOST Brzi odgovor na niz mikrobnih patogena
Vanjska obrana; prva linija obrane
Koža Mukozne membrane Izlučevine (sekreti)
Fagocitne stanice Antimikrobni proteini Upalna reakcija Stanice prirođene ubojice (NK stanice)
Humoralni odgovor (protutijela) Stanična imunost (citotoksični)
Unutrašnja obrana; druga linija obrane
Zajednički sastojak različitih sojeva bakterija
Epitopi karakteristični za pojedine sojeve bakterija
ADAPTIVNA IMUNOST
UROĐENA IMUNOST
Bakterija A Bakterija B Bakterija C Bakterija D
Precizno prepoznaje
bakterije pomoću
membranskih
receptora na
limfocitima koji se
specifično vežu na
epitope
karakteristične za
pojedine sojeve
bakterija
Grubo prepoznaje
bakterije pomoću
membranskih
receptora koji se vežu
na neke zajedničke
molekularne obrasce
tipične za različite
sojeve
mikroorganizama
Komunikacija stanica prirođene i stečene imunosti
IL5
IL13
IL2
IFNg
TNFb
IL4 IL10
IL10
IFNg
IL4
TH2 limfocit
IL12
IL18
TH1 limfocit
Prvenstveno reguliraju i potiču staničnu imunost
Prvenstveno reguliraju
i potiču humoralnu
imunost
B7.1 B7.2
CD40
TCR
CD4
TH0
CD40L
CD28 CTLA-4
MHC APC
Tpat
regulacija putem citokina
regulacija doticajem (kontaktom)
CTLA-4 IL-10 TGF-b
Treg
CD80/86
TCR MHC Treg
?
?
Tef
APC
?
?
IFNg IL2 Rast i diferencijacija u citotoksički T
Aktivacija
IL2 IFNg TNFb Aktivacija
EOZINOFIL
ENDOTEL
NEUTROFIL
CD8T
NK
B
MONOCIT
MAKROFAG IFNg IL2 TNFb
Fagocitoza
Stvaranje reaktivnih radikala kisika i dušik oksida
Ubijanje intracelularnih bakterija
Iskazivanje MHC molekula klase II
Iskazivanje FcR receptora
Prezentacija antigena
IFNg TNFb
Stvaranje reaktivnih kisikovih intermedijera i dušik oksida
Stvaranje katjonskih proteina i hidrolaza
Iskazivanje adhezijskih molekula
Mobilizacija i aktivacija leukocita
Iskazivanje MHC molekula klase II
IL5
Rast i diferencijacija
Aktivacija
Stvaranje IgA
IL4 IL13
Rast i diferencijacija
Aktivacija
Stvaranje IgE
ADCC sa IgE posredovan eozinofilima
TNFb IFNg
IL2
IFNg
TNFb
IFNg
TH1 limfocit
IL4
IL5
IL10
IL13
TH2 limfocit
IL10
polimorfonuklearni
neutrofili
MHC
+ Ag
IFN-g
Prirođena
imunost
antigen/
mz
Th0
makrofag
Humoralni
odgovor
IgE
imunokompleksi
citotoksičnost
medijatori
aktivacija
komplementa
B
IL-4
IL-4
IL-5
mastocit
Stečena
imunost
NK
stanica
Th2
Th1
eozinofil
mastocit
Stanični
odgovor makrofag
IFN-g
plazma B stanica
citotoksična
T stanica
IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13
IFN- g
Istraživanje lijekova
• uvođenje “meta“ dobivenih biotehnološkim inžinjeringom
• Završni dio postupka istraživanja novih lijekova i njegove
učinkovitosti i neškodljivosti mora biti proveden in vivo –rezultati in vitro nisu vjerodostojni
• De Boer i sur. (1997) istraživanje lijekova kroz krvno-moždanu barijeru
• Istraživanja na području toksikologije- in vitro modeli ne zadovoljavaju
• Imunotoksične tvari- prema učinku na imunološki sustav čovjeka i životinja djele se na: imunosupresivne, imunostimulativne ili imunosenzibilizirajuće
Istraživanje lijekova
• Combes (1997) –istraživanja in vivo na glodavcima-jedini prikladni model za prepoznavanje negenotoksični i genotoksični kancerogena
• Draizeov očni test (Draize rabbit eye irritation test) nezaobilazni je postupak u provjeri svih kozmetičkih proizvoda -složenost mehanizama koji uzrokuju iritaciju
• valjanost proizvoda u kozmetičkoj industriji, njihovu sigurnost i neškodljivost nemoguće potvrditi bez istraživanja in vivo.
Kemijska karcinogeneza
Indukcija
Aktivacija
Inicijacija
Stanica
Zloćudni tumor
Okoliš
Sustav P-450
Prekarcinogenik Karcinogenik
Zloćudni tumor
ORGANIZAM
Promotori Endogeni promotori
Glodavci (Rodentia)
Red Podred Porodica Rod Vrsta
Rodentia
Myomorpha
Muridae
Mus
Ratus
M. Musculus
R. Norvegicus (Norwegian rat)
Critcetidae
Mesocricetus
Meriones
M. Auratus (Syrian hamster)-hrčak
M. Unguculatus (gerbil)
Hysrticomorpha
Caviidae Cavia
C. Porcellus (guinea pig)-zamorac
Uporaba velikog broja životinja
• Sisavci 1800 vrsta (glodavci, kunić, pas, mačka, svinja, ovca, koza, primati).
• Glodavci čine 75-80% laboratorijskih životinja (miš, štakor, hrčak, zamorac, gerbil).
• Osim sisavaca rabe se i: ptice, gmazovi, vodozemci i ribe.
• Miš (Mus musculus) – više od 1000 genetički definirani srođenih miševa
Miš-kao pokusni model
Prednosti uporabe miša kao pokusnog modela: Mala životinja Dobro podnose život u
zatočeništvu Ima veliko leglo i kratko
generacijsko razdoblje Troškovi uzgoja relativno niski Brojni srođeni sojevi,
rasprostranjeni po cijelom svijetu, rezultati usporedivi
Dobivanje rezultati usporedivi, bez velikih varijabilnosti (stalna genetska podloga)
Nedostaci Mala veličina Kratki životni ciklus Fiziologija
Zašto uporabiti miša kao pokusni model
• Prednosti – Model za proučavanje sisavaca,
posebice njihovih specifičnih procesa kao što su: • Inaktivacija X kromosoma • Genomski ispis
– Mala veličina – Pripitomljenost – Kratki životni ciklus – Dobro proučena biologija – Jednostavna manipulacija i
stvaranje velikog broja potomaka – Mogućnost planiranja – Sekvencioniran genom i dobro
poznat – Mogućnost stvaranja
visokosrodnih sojeva
– Široki rang genetičke raznolikosti • Podsojevi • Srođeni sojevi
– a/kada se grane odvoje prije 40 generacije (između 20-40)-ostatak herterozigotnosti)
– b/razlike nastale mutacijom – c/genska razlika između grana
• Podlinije
– a/procesima rukovanja:hranjenja putem majke, presađivanje jajne stanice, umjetnim hranjenjem, presađivanjem jajnika ili pohranjivanjem u smrznutom stanju
– b/prenošenjem skupine drugom istraživaču
• Koizogeni, kongeni ili segregirajući srođeni sojevi
Pokusne životinje
• 1.Čisti sojevi životinja – visokosrođene životinje (sparivanje braće i sestara iz istog
legla kroz najmanje 20 generacija
– Singenične životinje
– Kongenični miševi- životinje koje se razlikuju samo u jednom kromosomskom lokusu ili regiji-dragocjen model za proučavanje tog gena
• 2. Životinje s posebnim genskim obilježjima
– Transgenični miševi
– Knock-out miševi (miševi s izbačenim genom)
• 3. Imunodeficijentni miševi
Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji
Soj Podsoj Osobitost
A A/ He A/J A/WySn
Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde
AKR AKR/J AKR/N AKR/Cum
Visoka pojavnost leukemija (Thy 1.2 alel u AKR/Cum, i Thy 1.1 alel u drugim podsojevima (ovi geni kodiraju površinske proteine stanica T)
BALB/c BALB/cj BALB/cAnN BALB/cBy
Osjetljivi na zračenje Uporaba u tehnologiji svaranja hibridoma Mnoge mijeloidne stanične linije su proizvedene u ovim miševima
CBA
CBA/J CBAH CBA/N
Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine u CBA/J Gen (xid) uzrokuje imunodeficijenciju vezano za X kromosom u CBA/N miševa
Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji (nastavak)
C3H C3H/He
C3H/HeJ
C3H/HeN
Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine
Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde u mnogim podsojevima (nositelji virusa koji prouzrokuje tumor mliječne žlijezde, prijenos preko mlijeka majke u potomstvo
C57BL/6 C57BL/6J
C57BL/6By
C57BL/6N
Visoka pojavnost hepatoma (tumor jetre) poslije zračenja
Visoka aktivnost komplementa
C57BL/10 C57BL/10J
C57BL/10ScSn
C57BL/10N
Bliski s C57BL/6 ali se razlikuju u najmanje 2 lokusa
Česti partner u pripremi kongenični miševa
Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji (nastavak)
C57BR C57BR/cdj
Učestali tumori hipofize i jetre
Rezistentan na x-zračenje
C57L C57L/J
C57LN
Osjetljivi na eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE)
Visoka frekvencija tumora hipofize i stanica mrežnice
C58 C58/J
C58/LwN
Visoka pojavnost leukemija
DBA/1 DBA/1J
DBA/1N
Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde
DBA/2 DBA/2J
DBA/2N
Slabi imunosni odgovor na neke antigene
Slabi imunosni odgovor na pneumokokne polisaharide tipa III
Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji (nastavak)
HRS HRS/J
Hairless (hr)gen obično u heterozigotnom stanju
NZB NZB/BINJ NZB/N
Visoka pojavnost autoimunih hemolitičkih anemija i nefritisa sličnom sistemskom lupusu eritematozusu (SLE) autoimune bolesti slične SLE u F1 generaciji križanih s NZW
NZW NZW/N SLE-tip autoimunostiu F1 generaciji križanih s NZW
P P/J
Visoka pojavnost leukemija
SJL SJL/J Visoka razina agresije i borbe to smti, posebice mužjaci
SWR SWR/J
Naginju razvoju autoimuni bolesti, posebice EAE
129 129/J 129/SvJ
Visoka pojavnost spontanih teratokarcinoma
NOD
C57BL/6
CBA
Agouti coat
Goli miš (nude mouse)
Genetički promjenjeni “zeleni miševi”
Dodatne kopije gena mogu nositi biljege genske aktivnosti, primjerice fluorofori koji svijetle u vidljivom dijelu spektra pod ultraljubičastim svjetlom; GFP-green fluorescent protein ili bakterijski protein lacZ čiji proizvod β-galaktozidaza mijenja boju supstrata x-gal u plavu
Zašto transgenične životinje
Za otkrivanje uloge pojedinih gena
Povećana ekspresija ciljnog gena, knock –out, knock-in, mutageneza
Za proučavanje genskih mutacija in vivo
Za razumjevanje kontrole genske ekspresije
Za proučavanje bolesti Transgenične životinje kao modeli
bolesti
Za genetičko obilježavanje organizma
Zeleni flourocentni protein
Za proizvodnju biofarmaceutika –Pharm animals
Primjerice, inzulin u kravljem mlijeku
Hormona rasta, interleukina, laktoferina……
Usporedba transgeničnih i knock-out miševa
Osobitosti Transgenični miševi Knockout miševa
Stanice koje primaju DNA
zigote Embrionalne matične stanice (ES)
Uporabljeni DNA konstrukti
Prirodni geni ili cDNA Mutirani geni
Način dostave Mikroinjekcija unutar zigote i implantacija unutar lažno gravidne majke
Transfer embrionalne matične stanice do blastocite i implantacija unutar lažno gravidne majke
Ishod Unos gena Gubljenje gena
Imunodeficijentni miševi-
• U imunolologiji su posebice zanimljivi različiti imunodeficijentni miševi, upravo zbog svojih nedostataka:
– nedostatne imunoreaktivnosti na određene antigene
– zbog nedostatka, T, B, NK stanica ili citokina
– neadekvatnog stromalnog okoliša.
• Primarna imunodeficijencija
– -životinje s urođenim nedostatkom određeni imunosnih stanica ili čimbenika imunosti (primjerice, goli miševi, SCID, CBA/N)
– -genetski modificirane životinje (trangeni ili knouck-out)
• Induciranoj imunodeficijenciji
– (obrada životinja s određenim protutijelima, toksičnim lijekovima, zračenjem, timektomija…)
• Koristi se kao modeli u imunološkim i onkološkim istraživanjima.
– Razumjeti ulogu imunološkog sustava u nekoj bolesti.
– Održavanje tumorskih staničnih linija
Gdje se koriste imunodeficijentni miševi?
Osobitosti imunodeficijentni miševa
Soj Osobitost CD-1 goli miš Dobiven prenosom gena golih miševa u CD-1
miša. Bez timusa, nedostatak stanica T. NU/NU Porijeklom od NIH, kongeničan s BALB/c
Bez timusa, nedostatak stanica T.
BALB/c goli miš Bez timusa, nedostatak stanica T. NIH-III miš Deficijentan u stanicama T, NK (bg mutacija), te B-
stanicama-neovisnim o stanicama T(xid mutacija) Fox chase SCID mouse Podrijetlo od SCID miša, posjeduje genetičku
autosomalnu mutaciju PrkdcSCID.
Imunodeficijencija u stanicama T i B. Fox chase SCID beige mouse Posjeduje genetičku autosomalnu mutaciju scid i
beige.
NOD SCID miš Životinje homozigotne za SCID mutaciju na NOD osnovi,oštećenu T i B limfocitnu funkciju i nedostatak NK funkcije i sposobnosti aktivacije aktivnosti komplementa. Ovaj model ne razvija tip 1 dijabetesa.
Osobitosti imunodeficijentni miševa Soj Osobitost
CNA/N B-imunodeficijentni miš, mutacija na kromosomu x, neadekvatna odgovornost na timus-neovisne antigeneTh-1, Th-2, nedostatak prekursora za proizvodnju IgG3 i IgM, broj C3 stanica manji u slezeni
W/Wv Genetički anemični miševi za praćenje ontogeneze i diferencijacije eritrocita, hematološki mikrookoliš normalan, matične stanice defektne
Sl/Sld Genetički defekt u mikrookolišu (stromi), važnom čimbeniku za diferencijaciju matičnih stanica, posebice proteoglikanske sastavnice stromalnog vanstaničnog matriksa.
NZB Spontano razvijaju autoimunosnu bolest sličnu sistemskom lupusu eritromatozosu. Imaju manjak supresorskih stanica T, nedostatak faktora rasta T i B stanica i IL-3
Nude-xid Imunodeficijencija u zrelim stanicama T i B.Normalan broj CFU-S ali nedostaju 2 rana pre B-stanična markera, osjetljivost na transformaciju sa Abelsonovim virusom leukemije i proizvodnja µ lanca (cµ)
Beige mouse
Komparacija imunodeficijentnih sojeva
Imunodeficijentni
sojevi Osobitosti
Dlaka Timus T-
stanice B-
stanice NK-
stanice Fiksacija
komplementa
CD-1 goli miš - - - + + +
NU/NU goli miš - - - + + +
BALB/c goli miš - - - + + +
NIH-III goli miš - - - - - +
Fox chase SCID
mouse + + - - + +
Fox chase SCID
beige mouse + + - - - +
NOD SCID miš + + - - - -
Goli štakor (Nude
rat) - - - + + +
Pokusni modeli
• I ako znanstveno istraživačka djelatnost nosi stupanj individualne slobode i kreativnosti, svaki istraživač nosi i stupanj osobne odgovornosti prema metodama rada i predmetu istraživanja. Točnije, svatko je u svom djelokrugu rada dužan raditi u sukladu s profesionalnim i etičkim normama i svojom
savješću!!!
Shematski prikaz pitanja
koja si svaki znanstvenik
mora postaviti prije nego
se odluči koristiti pokusne
životinje u svom
istraživanju.
Istraživanje na životinjama je temeljeno na metodama kritičke provjere teoretskih
počela i načela medicinske prakse!!!
• Istraživanja i rad s životinjama treba provesti u sukladu sa etičkim principima, koji su važeći u Republici Hrvatskoj (Pravilnik o uvjetima držanja pokusnih životinja, posebnim uvjetima za nastambe i vrstama pokusa, Narodne Novine br. 19/1999; Zakon o zaštiti životinja, Narodne novine br. 135/06) i prema Vodiču za držanje i korištenje laboratorijskih životinja (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, DHHS Publ. (NIH) # 86–23 1985).
Prilikom izbora modela treba voditi računa o:
• -pogodnosti modela kao analoga, • -mogućnosti transfera informacija • -genetskoj uniformnosti modela • -dosadašnjim saznanjima • -cijeni i pristupačnosti životinja • -mogućnosti generalizacije dobivenih rezultata • -lakoći i mogućnosti prilagodbe pokusnih tehnika • -ekološkim posljedicama pokusa • -etičkim posljedicama pokusa • -mogućnostima smještaja životinja • -veličini životinja • -potrebnom broju životinja • -spolu životinja • -dužini životnog vijeka životinja • -količini podataka koje je potrebno pokusima prikupiti • -starosti životinja broju potrebnih potomaka koje je moguće dobiti • -mogućim bolestima ili fiziološkim stanjima odabranih životinja koje bi mogle
utjecati na rezultate pokusa
Animal Models of Cardiovascular Disease
Miševi Štakori Hrčci
Okolišni zahtjevi
Temperatura (°C) 20-24 20-24 20-24
Relativna vlažnost (%) 50-60 60 50-60
Ventilacija /(promjene/sat) 15 10-15 10-15
Svjetlo/mrak (sati) 14/10 12-14/12-10 12-14/12-10
Minimalna veličina dna kaveza (cm2)
-jedna odrasla jedinka
-rasplodna životinja s mladima
-grupa (cm2/odrasla jedinka)
180
200
80
350
800
250
180
650
n/a
Minimalna visina kaveza (cm) 12 14 12
Okolišni zahtjevi i fiziološki parametri miševa, štakora i hrčkova
Miševi Štakori Hrčci
Opći fiziološki parametri
Težina odrasli (g)
-mužjak
-ženka
20-40
25-40
300-500
250-300
120-140
140-160
Životni vijek (godine) 1-2 2-3 2-3
Frekvencija srca (/min)
300-800 300-500 250-500
Frekvencija disanja (/min) 100-200 70-110 40-120
Tjelesna temperatura (°C)
36.5-38.0 37.5-38.5 37-38
Broj kromosoma (2n) 40 42 44
Površina tijela (cm2) 20 g:36 50 g:130
130 g:250
200 g:325
125 g:260
Okolišni zahtjevi i fiziološki parametri miševa, štakora i hrčkova
Miševi Štakori Hrčci
Opći fiziološki parametri
Unos vode (ml/100 g) 15 10-12
8-10
Pubertet (tjedni)
-Ženke
-mužjaci
5
-
6-8
-
4-6
7-9
Plodno doba (tjedni)
-Ženke
-mužjaci
8-10
8-10
12-16
12-16
6-8
10-12
Oestrus ciklus (dani) 4 (2-9) 4-5 4
Trajanje oestrusa (sati)
14 14 2-24
Trajanje trudnoće 19 (18-21) 21-23 15-17
Veličina legla
6-12 6-12 6-8
Težina kod rođenja (g)
Težina kod sisanja (g)
Prestanak sisanja (dani)
0.5-1.5
10
21-28
5
40-50
21
2-3
30-40
20-22
Miševi Štakori Hrčci
Krvni parametri
Krvni volumen (ml/kg) 70-80 60 80
Hemoglobin (g/100 ml) 10-17 14-20 10-18
Hematokrit (vol %) 39-49 36-48 36-60
Leukociti (x 1000/mm3) 5-12 6-17 3-11
Glukoza (mg/100 ml) 124-262 134-219 60-150
Okolišni zahtjevi i fiziološki parametri miševa, štakora i hrčkova
Pretvorba doze za životinje prema dozi za čovjeka na temelju površine tijela
Vrsta Težina (kg) Površina tijela
(m2)
Km
faktor
Čovjek
Odrasli
dijete
60
20
1,6
0,8
37,5
25
Pavijan 12 0,6 20
Pas 10 0,5 20
majmun 3 0,24 12
zec 1,8 0,15 12
zamorčić 0,4 0,05 8
Štakor 0,15 0,025 6
hrčak 0,08 0,02 5
miš 0,02 0,007 3
Vrijednosti na temelju podataka
iz FDA (nacrt smjernica ). Za
pretvaranje doza u mg / kg do
doze u mg/m2, pomnožite Km
vrijednosti
Doza ekvivalentna za čovjeka (mg/kg) = animalna doza (mg/kg) x (Animal Km/Čovjek Km)
1. Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research. (2002) Estimating the safe starting dose in clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers, U.S. Food and Drug Administration, Rockville, Maryland, USA
2. Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008 ;22(3):659-61.
3. Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers (U.S. Department of Health and Human Services,Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research -CDER), 2005,Pharmacology and Toxicology
4. STICKLER GB, PINKEL D.Calculation of nutritional allowances for infants and children on the basis of body surface. J Pediatr. 1958;53(4):464-6.
5. PINKEL D.The use of body surface area as a criterion of drug dosage in cancer chemotherapy. Cancer Res. 1958 18(7):853-6.
Doze: odnos čovjek -životinja
Animalni modeli koji se danas rabe u biomedicinskim istraživanjima
• S obzirom na način razvijanja promjenjene homeostaze/bolesti, animalni modeli koji se danas rabe u biomedicinskim istraživanjima podjeljeni su kako slijedi:
• 1. Inducirani (pokusni) modeli
• 2. Spontani (genetski) modeli
• 3. Modeli bolesti stvoreni ciljanom genetskom modifikacijom (transgenične i knock-out životinje)
• 4. Negativni modeli bolesti
• 5. “Orphan” model bolesti
Inducirani (pokusni) modeli
• Takvi modeli dobiju se primjenom kemijskih, fizičkih i bioloških tvari na zdrave životinje u cilju prouzrokovanja neke bolesti sličnih značajki bolesti nazočnih u ljudima.
• Smatra se da mali broj induciranih animalnih modela u potpunosti oponaša etiologiju (podrijetlo), tijek i patologiju ciljane bolesti u ljudi.
• Inducirani model dijabetesa
• Inducirani model osteoporoze
• Inducirani model psorijaze
• Inducirani model upalnih bolesti crijeva
Inducirani model dijabetesa
inducirani model dijabetesa I može se prouzročiti:
odstranjivanjem gušterače (pankreatektomijom)
injiciranjem preko 300 različitih dijabetogenih kemijskih spojeva
(aloksan, streptozotocin, vakor, ditizon, i 8-hidroksikvinolon).
različiti lijekovi (jatrogenI dijabetes).
Za dijabetes melitusa tipa II:
prekomjerno opterećenje organizma glukozom i masnim kiselinama (stvaranje slobodnih
kisikovih radikala i oštećenje stanica, te u konačnici njihovu neosjetljivost
na inzulin; hiperglikemija potiče pojačano lučenje inzulina i postupno
iscrpljenje β-stanica što rezultira njihovim propadanjem
Klasifikacija dijabetesa
• -oštećenje b-stanica vodi nedostatku inzulina (10-15%) Tip I dijabetesa
• -heterogen >85% ljudi Tip II
dijabetesa
• -šećerna bolest u trudnoći Gestacijski dijabetes
• primjerice, genetički, lijekovi, operacije infekcije
Drugi specifični oblici,
Inducirani animalni modeli bolesti za diabetes mellitus -tip 1
Tip
diabetesa Animalni
modeli bolesti Stvaranje
animalnih modela Primjeri
Tip 1
Inducirani
(pokusni
životinjski)
modeli
Dijabetes
prpouzročen u
zdravim
životinjama
Tvari s dijabetogenim
učinkom u eksperimentalnim
životinjama:
Aloksan
Streptozotocin
Vakor
Ditizon
8-hidroksikvinolon
Animalni model hiperglikemije; pankreaktomija, diabetogene tvari
Animalni model glikozurije (florizin, prirodni flavonoid ,sc) vezuje se za Na/glukoza
prijenosnike u proksimalnim tubulima bubrega i inhibira resorpciju glukoze-masivna
glikozurija i poliurija
Mehanizmi djelovanja aloksana i streptozotocina na β-stanica gušterače
Mehanizam aloksan-induciranih
reaktivnih kisikovih radikala u β-stanicama
gušterače štakora. GKa, GKi - glukokinaze
aktivna i neaktivna, HA • - aloksan radikali, [Ca2
+] unutarstanična koncentracija kalcija
Mehanizam streptozotocinom (STZ)-induciranog
oštećenja β-stanica gušterače štakora. MIT -
mitohondrije; XOD – ksantin oksidaze
Inducirani animalni modeli bolesti za diabetes mellitus –tip 2
Model Obese Non obese Dietom/prehranom inducirani
Pustinjski štakor (Sand rat)
C57/BL 6J miš
Ježasti miš (spiny mouse)
Kemiski inducirani GTG obrađeni obese miš (gold thioglukoza)
Male doze aloksana ili streptozotocina u odraslog štakora miša ili dr.
Neonatalni štakor induciran s STZ
Operacijski inducirani lezija ventromedialnog hipotalamusa dietom induciranog obese miša
Parcijalno ostranjivanje gušterače (pankreatomija) u psa, primata, svinje i štakora
Doze kemijski diabetogenih tvari u različitih vrsta
Diabetogena tvar Vrsta Doza (mg/kg)
Aloksan Štakor 40-200 (iv; ip)
Miš 50-200 (iv; ip)
Zec 100-150 (iv)
Pas 50-75 (iv)
Streptozotocin Štakor 35-65 (iv; ip)
Miš 100-200 (iv; ip)
Hrčak 50 (ip)
Pas 20-30 (iv)
Svinja 100-150 (iv)
Primati 50-150 (iv)
ß-st.
MHC-I
citoliza
Tip 1 dijabetesa
ß-Ag
ß-Ag
APC
-
+
+
+ +
T-Ly
Th2
Th1 Mø IL-2
IFN-g
IL-4 IL-10
IL-12 B7
ß-Ag
MHC-II
O2-
H2O2 NO
IL-1 TNF- TNF-b IFN-g
“imunološki signali"
Općenite značajke dijabetesa
Osmotski simptomi -žeđ i suha usta -učestalo uriniranje -učestalo uriniranje tijekom noći, -nedostatak sna -gubljenje na težini -malaksalost, -umor i smanjena proizvodnja energije -zamućeni vid -infekcije
Komplikacije nazočne kod dijabetesa
-oštećenja krvnih žila -srčani udar -smanjeni dotok kisika -oštećenje bubrega -gubitak osjetljivosti na podražaje -komplikacije s očima -ponavljjuće infekcije -slabo i sporo zacjeljivanje rana
Mikrovaskularne komplikacije
Komplikacije s očima Retinopatija Makulopatija Oštećenja bubrega Dijaliza Uzročnik smrti Smanjena provodljivost živaca Gubljenje osjeta Nastajanje čira (ulceracija)
Makrovaskularne komplikacije
-Miokardijalni infarkt -Hipertenzija -Srčani udar -Periferne vaskularne bolesti (ishemija donjih udova; nedostatak kisika zbog loše obskrbe krvlju) -Slabo zacjeljivanje rana -Visoka razina kolesterola
Druge komplikacije
• Akutne komplikacije-sekundarna hipoglikemija kao posljedica uzimanja lijekova
• Dijabetična ketoacidoza –tip I šećerne bolesti
• Drugi čimbenici
Inducirani model osteoporoze
ovarijektomijom,
primjenom agonista gonadotropin otpuštajućeg
hormona
antagonista estrogenskih receptora
inhibitora aromataze;
primjenom glukokortikoida
retinoične kiseline
tiroidni hormone,
antikonvulzivni lijekovi,
lijekovi u liječenju šećerne bolesti (Tiazolidinedioni),
lijekovi za liječenje gastointestinalnih bolesti
(inhibitori protonski pumpi),
inhibitori kalcineurina
Izravni i neizravni učinak glukokortikoida u indukciji
osteoporose i lomljivosti kosti
Osteoporoza i oksidativni stres
oksidativni stres potiskuje diferencijaciju osteoblasta,
Spojevi s aktivnim kisikom uključeni su u svaranje osteoklasta
Oksidativni stres uključen u potiče patogenezu metaboličkih koštani bolesti
Oksidativni stres smanjuje zacjeljivanje kostiju nakon frakture
Inducirani model psorijaze
Kemijski iritanati:
dekanol,
propionaldehid,
bromoheksan,
di-n-propil disulfid,
heksil salicilat i
Heptaldehid
primjenom TLR7/8 agonista imikvimoda .
Prednosti i nedostaci mišjih modela za psoriazu
• Pozitivna strana životinjskog modela je i izbjegavanje svih čimbenika koji mogu utjecati na patološke pokazatelje psorijaze, primjerice, dob, spol, životni uvjeti, životne navike, izloženost stresnim čimbenicima, uzimanje lijekova, klimatske i temperaturne promjene i drugo.
• Negativna strana: većina modela na miševima ne odražava kompleksnu patogenezu psorijaze, djelomično i zbog razlika između ljudske i mišje kože, poput debljine epidermisa, gustoće folikula dlaka, programa diferencijacije keratinocita i drugo
Danilenko D M Vet Pathol 2008;45:563-575
Ključni događaji u patogenezi psorijaze
Primjena termografije u procjeni upale
Filename: FLNM0033.SIT
Emissivity: 1,00
Background: 23,0
Date: 19.01.2011
Time: 1:52:14 PM
Circle 1
Emissivity 1,00
Avg Temp °C 35,8
Min Temp °C 34,3
Max Temp °C 36,5
Delta Ref. °C
Filename: FLNM0169.SIT
Emissivity: 1,00
Background: 23,0
Date: 21.01.2011
Time: 9:03:57 AM
Circle 1
Emissivity 1,00
Avg Temp °C 37,4
Min Temp °C 36,2
Max Temp °C 38,1
Delta Ref. °C
Di-n-Propil Disulfid + Kurkumin –
I-mjerenje
Di-n-Propil Disulfid + Kurkumin –
II-mjerenje
Di-n-Propil Disulfid + Kurkumin –
I-mjerenje
Di-n-Propil Disulfid + Kurkumin –
II-mjerenje
Inducirani model upalnih bolesti crijeva
Većina modela temelji se na:
• kemijskoj indukciji,
• prenosu imunoloških stanica
• ili ciljanju gena
• samo u nekim modelima bolest se javlja bez egzogene manipulacije.
Prema grešci u mukoznoj imunosti mišje modele možemo svrstani u tri kategorije najvažnije za početak bolesti:
• (1) nedostaci u epitelnoj cjelovitosti / propusnosti,
• (2) nedostaci u stanicama urođene imunosti I
• (3) nedostatci u stanicama adaptivnog imunosnog sustava.
Indukcija kolitisa na štakorskom modelu pomoću kemijskog iritanta:
• octena kiselina (AA),
• trinitrobenzen sulfonska kiselina (TNBS) i/ili
• natrij dekstran sulfata (DSS).
Upalne bolesti crijeva (engl. Inflammatory bowel disease, IBD)
Upalne bolesti obuhvaća dva različita patološka područja:
Crohnova bolest (engl. Crohn's disease, CD) i ulcerozni kolitis (engl. Ulcerous colitis, UC)
Inducirani pokusni modeli u autoimunim bolestima
Životinjski model Moguća bolest-ljudi Antigen Prenos
bolesti (T-
stanice)
Pokusno prouzročene autoimune bolesti
Miastenia gravis Miastenia gravis Acetilkolinski
receptor Da
Encefalomijelitis Multipla skleroza Mijelinski bazični
protein
Proteolipidni
protein
Da
Autoimuni artritis Reumatoidni artritis Mycobacterium
tuberculosis
(proteoglikan)
Da
Autoimuni
tiroiditis Hašimotov tiroiditis Tiroglobulin Da
Povezanost nekih autoimunoloških bolesti s prisutnošću određenih antigena MHC
Autoimuna bolest Povezana s prisutnošću
HLA-alela
Addisonova bolest DR3
Gravesova bolest B8/DR3
Pemphigus DR4
Hashimotova bolest DR5
Dijabetes ovisan o inzulinu DR3 i DR4
Myasthenia gravis DR3
Reumatoidni artritis DR4
Sjögrenov sindrom Dw3
Sustavni lupus erythematosus DR3
Spontani (genetski) modeli bolesti
• Spontani (genetski) modeli jesu najbolji pokazatelji razvoja patogeneze određene bolesti u životinjskim modelima a slični su ili se podudaraju s razvojem bolesti u ljudi.
• ovakvi sojevi imaju urođene poremećaje; nose genetske varijacije (mutacije) koje su podloga nizu bolesti u ljudi i životinja.
• Doberman Pincher - von Willebrands bolest NZW x NZB F1 - autoimuna bolest Hrčak, miš, zlatni retriver - mišićna distrofija BB štakor i NOD miš - šećerna bolest
Spontani Modeli (Prirodni)-model u kojem životinja naravno stječe bolest koja oponaša ljudsku bolest
Spontani (genetski) modeli za dijabetes tipa 1
Tip
diabete
sa
Animalni
modeli
bolesti
Stvaranje
animalnih
modela Primjeri
Tip 1 Spontani
(genetski)
modeli
Nasljedni
poremećaji slični
uvjetima
nastanka
dijabetesa u ljudi
Animalni modeli Tipa 1 diabetes
mellitus:
NOD (non-obese diabetic) mouse
BB (bio breeding) rat
LETL (Long Evans Tokushima
lean) štakor
New Zealand white rabbit
Keeshond pas (engl. Keeshond dog)
Kineski hrčak (engl.Chinese
hamster)
Celebes black ape (Macacca nigra)
Razaranje b-stanica Langerhansovih otočića gušterače u NOD miševa pomoću autoreaktivnih stanica T
Spontani (genetski) modeli za dijabetes tipa 2
Tip
diabetesa
Animalni
modeli
bolesti
Stvaranje animalnih
modela Primjeri
Tip 2 Spontani
(genetski)
modeli
Nasljedni poremećaji
slični uvjetima
nastanka dijabetesa u
ljudi
Animalni modeli of Tipa 2 diabetes mellitus:
Ob/Ob miš—monogenski model pretilosti
(nedostatak leptina),
db/db miš—monogenetski model pretilosti
(leptin resistentan),
Zucker (fa/fa) štakor—monogenetski model
pretilosti (leptin resistentan),
Goto Kakizaki štakor
KK miš
NSY miš
OLETF štakor
Israeli sand štakor
Mastima-hranjeni streptozotocin-obrađeni
štakor,
CBA/Ca miš
Diabetični Torri štakor
New Zealand obese miš
Spontani kolitis u knock-out (KO) i transgeničnih glodavaca
• Spontani kolitis u knock-out (KO) i transgeničnih glodavaca omogućuju pokusni modeli za proučavanje razvoja mukozne upale i upalnih bolesti crijeva.
• Genetski i okolišni čimbenici, osobito normalna crijevna flora, važni su čimbenici u razvoju upale
sluznice.
• Normalna homeostaza mukoze je poremećena – citokinskom neravnotežom, – ukidanjem oralne tolerancije, – promjenama u epitelnoj barijeri i – funkciji ili gubitaku imunoregulacijskih stanica.
1. Metabolička Sinteza vitamina
Stvaranje kratkolančanih masnih kiselina
2. Trofička Stimulacija epitelne proliferacije
angiogeneze i obnavljanja epitela
Citoprotektivni učinak
Stimulacija razvoja imunološkog sustava
3. Zaštitna Regulacija prirođene imunosti
Regulacija stečene imunosti
Kompetitivni učinak za patogene
Uloga crijevne flore
Utjecaj probiotika na:
• 1. Infektivni proljev • 2. Infekcija Helicobacterom pylori • 3. Upalne bolesti crijeva • 4. Karcinomi • 5. Opstipacija • 6. Alergije • 7. Kardiovaskularne bolesti • 8. Vaginitis uzrokovan bakterijama • 9. Vaginitis uzrokovan gljivicama • 10. Infekcije mokraćnih putova
Mehanizam kemopreventivnog učinka Laktobacilusa
Upalne bolesti crijeva u geneskih modificiranih (transgeničnih i knock-out) miševa
Mutant Abnormalnosti Organi zahvaćeni upalom
Transgenični štakor s genom za
ljudski HLA-B27/ β2m
Ag predočavanje Kolon, tanko crijevo, želudac,
zglobovi, koža
IL-2 i IL-2Rα KO miševi
Imunoregulacija, pogrešna
timusna selekcija Kolon
IL-10 KO miševi Imunoregulacija, (Th1 put) Kolon, tanko crijevo
TGF-β1 KO miševi
Imunoregulacija, Gastrointestinalni sustav i drugi
organi
TCR- KO miševi
Imunoregulacija, pogrešna
timusna selekcija Kolon
Gi2-deflcientni miševi G-proteinska transmembranska
signalizacija Kolon
N-kadherin transgenični miševi
Epitelna barijera
Tanko crijevo
Upalne bolesti crijeva u geneskih modificiranih (transgeničnih i knock-out) miševa
Mutant Abnormalnosti Organi zahvaćeni upalom
N-kadherin transgenični miševi
Epitelna barijera
Tanko crijevo
Keratin-8 KO miševi Epitelna barijera Kolon
IL-7 transgenični miševi Limfo-hematopoetske promjene Kolon
gp39 transgenični miševi Limfo-hematopoetske promjene,
pogrešna timusna selekcija Kolon, želudac i drugi organi
Višestruko otporni na lijek
(MDR) 1a KO miševi Narušena epitelna barijera Kolon
Wiskott-Aldrich sindrom protein
KO miševi Limfo-hematopoetske promjene
vezane za X gen Kolon
Stat3 (makrofagi i neutrofili) KO
miševa Th1 put Kolon
Transgenski miš s tirozin
kinazom virusa Herpes simplex
(ciljane astroglialne stanice)
Ablacija enteričkih glija stanica Tanko crijevo
Spontani pokusni modeli u autoimunim bolestima
Životinjski
model Moguća bolest-ljudi Antigen Prenos
bolesti (T-
stanice)
Spontane autoimune bolesti
Nonobese
dijabetični miš
(NOD)
Inzulin –ovisni
dijabetes Nepoznat Da
(NZBxNZW)F1
miš Sistemski lupus
eritematosuz (SLE) Nepoznat Da
Obese -pilići Hašimotov tiroiditis Tiroglobulin Da
Modeli bolesti stvoreni genetskom modifikacijom
• Zašto su potrebne transgenične životinje? • Za otkrivanje uloge pojedinih gena: a) knock–out (inaktivacija gena u
genomu ugradnjom strane DNA ili zamjena postojećeg gena mutiranom varijantom, b) knock-in mutageneza (uvođenje nove funkcije)
• Za proučavanje fenotipskih učinaka ekspresije transgena – proučavanja hormonskih gena, onkogena, gena uključenih u razvoj embrija i fetusa, gena važnih u imunosnom sustavu, virusnih gena, itd.
• Za proučavanje genskih mutacija in vivo • Novi modeli za testiranje mutagena • Pročavanje sposobnosti kloniranih gena da komplementiraju mutacije u
mišu • Za razumjevanje kontrole genske ekspresije • Za proučavanje bolesti (transgenične životinje kao modeli za razne ljudske
bolesti • Za genetičko obilježavanje organizma (zeleni flourocentni protein) • Za proizvodnju biofarmaceutika –Pharm animals (primjerice, inzulin u
kravljem mlijeku, hormona rasta, interleukina, laktoferina i dr.)
Modeli dijabetesa stvoreni genetskom modifikacijom
Tip 1 i Tip
2
‘knockout’ životinje
Tehnika ciljanog razaranja
gena (engl. Gene
targeting); proces u kojem
jedan gen može biti
poremećen u embrionalnoj
matičnoj stanici, a zatim
prenesen u liniju zametnih
stanica- „knockout”
životinje.
Genetičke „knockout” životinje za:
inzulinski receptor, PPARγ, GLUT4, IGF1
Tip 1 i Tip
2
Transgenične
životinje
Transgenične tehnike;
transgenik znači
uključivanje modificiranih
gena (transgenea) u
pronukleus zigote.Trans-
gen se nasumce ugrađuje u
genom domaćina, a neki
potomci će iskazati
promjenjeni gen.
Ugradnja novih gena kao što su inzulinski
receptori, IRS1, IRS2, glukokinaze, GLUT4,
c-mic, TNF i drugi.
Uloga ROS-a u aloksanom induciranom
uništenju β-stanica je potkrijepila zaključak
da su transgenični miševi s prekomjernom
ekspresijom antioksidansa zaštićeni od
aloksan induciranog dijabetesa.
Transgenične životinje kao modeli bolesti
• Miš glavni odabir
– Fiziologija slična ljudskoj
– Razvijena tehnologija
• Onkomiš-sadrži onkogen c-myc i dijelove mišjeg tumorskog virusa mliječnih žlijezda
– Model bolesti za rak dojke
• Transgenični miševi kao model za rak prostate
• Transgenični miševi kao model za Alzheimerovu bolest
• Transgenični miševi kao model teški kombinirani sindrom imunodeficijencije
Knock-out i transgenični miševi pomažu u razumjevanju genoma ljudi i njihove uloge u bolesti
Disease Mode Gene Technique
Cystic Fibrosis CFTR Gene-Targeted
Atherosclerosis Apo E, apo (a), Apo A-II Gene-targeted, Transgentic
anti-Atherosclerosis Gene Therapy Apo AI, Ape E, LDLR Transgenic
B-Thalassemia ß -globin Gene-Targeted
Sickle Cell Anemia ßs (and variants) Transgenic
Inflammatory Bowel Disease Interleukine-2, Interleukin-10 and T-cell Receptor ,ß ; MHC II Gene-Targeted
Severe Combined Immunodeficiency Disease Rag-1, Rag-2 Gene-Targeted
Muscluar dystrophy Gene Theraphy Dystrophin Transgenic
Alzheimers disease ß -amyloid Transgenic
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) neurofilament heavy chain Transgenic
Insulin Dependent Diabetes Mellitus interferon- Transgenic
Cancer many oncogenes and tumor supressor genes Transgenic
Transgenični ili delecijom izazvani mutanti u patogenezi psorijaze
• Najčeće rabljeni mišji modeli: • K5-Tie2 (prekomjerna izražajnost endotelial specifičnih
receptora tirozin kinaze u bazalnim keratinocitima), • imiquimod (topikalna primjena agonistaTLR receptora
imiquimod (IMQ) •
K14-AREG (prekomjerna izražajnost ljudskog amfiregulina u bazalnom epidermalnom sloju)
• K5-Stat3C (mutant s konstitutivno aktivnim prijenosom signala i aktivacijom transkripcijskog čimbenika 3 u bazalnim keratinocitima
• K5-TGFbeta1 (pojačana ekspresija latentnog oblika transformacijskog čimbenika rasta beta 1 u bazalnim keratinocitima
Psorijazne lezije u laboratorijskim miševima
Svaki model miša pokazuje crvenilo, pokrivenost s ljuskastim nakupinama kože s
makroskopskim značajkama sličnim s kliničkim oblikom psorijaze kod ljudi.
12-O-tetradekanoilforbol-13-acetatom–inducirana epidermalna hiperplazia u uhu K5.Stat3C transgeničnog miša
IL-23/Th17 igra važnu ulogu u patogenezi psorijaze; točni doprinosi IL-23 i IL-17
in vivo nejasni
K Stat3C transgenični miševi konstitutivno izražavaju aktivirani Stat3 unutar
keratinocita; životinje razvijaju oštećenja kože s histološkim i citokinskim profilom
sličnim psorijazi u ljudi. 5.Stat3C transgeničnog
Kontrola IgG Anti-IL-17A Anti-12/23p40 Anti-IL-23p19
Hipoteza citokinske hijerarhije za razvoj psorijaze
IL23
Th17
NK-22
X
Keratinocite Psoriatičke
promjene
Drugi članovi
IL-20 obitelji
(IL-20, 19,
22, 24, 26)
IL-22
IL-17
?
J Immunol 2011; 186:4481-4489
• U ovom modelu rabe se određene vrste, soj ili pasmina životinja u kojih se određena bolest ne pojavljuje.
• Ovakvi modeli se rabe u istraživanjima mehanizma otpornosti na određene bolesti.
Negativni modeli bolesti
• Oposum otporan na bjesnoću
• Rhesus majmuna otporne na hepatitis B
• Štakor (wood) imun na ugriza zmija
• Morski psi su otporni na rak
• Gerbili su otporni na zračenja
• zec ne može biti inficiran s gonorejom.
Negativni Modeli (non-model)-modeli gdje
određeni bolest ne može biti proizvedena
„Orphan“ model bolesti
• “Orphan“ model bolesti rabi se u opisu funkcionalnih
poremećaja koji se javlaju u životinja a nisu opisani u ljudi.
• Primjerice, spongiformna encefalopatija goveda (engl. Bovine spongiform encephalophaty, BSE) te virusna leukemija mačke (engl.Feline immunodeficientncy virus, FIV).
• Ukoliko se i u ljudi otkriju bolesti slične ovim opisanim u životinjama, spoznaje prikupljene u veterinarskoj medicine pomoći će u rasvjetljavanju etiologije, patogeneze i liječenja novootkrivene bolesti u ljudi.
Nespecifična otpornost – upalna reakcija
Ozljeda tkiva Fizička tvar
Kemijska tvar
Povećava kapilarna propusnost
(permeabilnost)
Oslobađanje tekućine
Povećan protok krvi
Širenje kapilare (dilatacija)
Privlačenje leukocita
Migracija leukocita na mjesto ozljede
Patogeni mikroorganizam
Sustavni odgovor
Groznica
Proliferacija leukocita
Temperatura Otok Osjetljivost Bol Crvenilo
Posrednici (medijatori) upalne reakcije
Bakterijska invazija
Ili oštećenje tkiva
Oslobađanje
histamina od
mastocita
Lokalna arterijska
vazodilatacija
Povećanje lokalne
propusnosti kapilara
Povećanje
krvnog dotoka u
Oštećeno tkivo
Lokalna
akumulacija
tekućina
crvenilo toplina otok bol
Povećanje plazmatskih
proteina; čimbenika
koagulacije u tkivu
Povećanje
fagocitoze
u tkivu
Fagocitna
sekrecija
Obrana protiv
stranih napadača;
popravak tkiva
Sustavni odgovori,
kao što je povećanje
temperature
Upala; shematski prikaz
Patogeni
Kemijski
signali
Krvna
kapilara
U tkivo ulaze
fagociti,
tekućina, i
faktori
grušanja krvi
Fagociti
Ozljeda tkiva, ispuštanje biološki
aktivnih tvari (histamina,
prostaglandina, itd)
Vazodilatacija, povećana
propusnost krvnih žila, migracija
fagocita u ozlijeđeno područje
Fagociti (makrofagi i neutrofili)
uklanjaju patogene i ostatke
oštećenog tkiva fagocitozom,
tkivo zacjeljuje
Podjela upalnih reakcija s obzirom na vremensko trajanje upale, vrstu etiološkog čimbenika, patološke značajke upalne reakcije i zahvaćenost tkiva upalom
Klasični životinjski upalni modeli
Kronična upala Pojavnost upalnih
medijatora Akutna upala
Model odgođenog tipa
preosjetljivosti (ovalbumin,
pikril klorid)
Arthusov tip neposredne preosjetljivosti (ovalbumin)
Model pasivne kožne anafilakse (ovalbumin)
Schultz-Daleova reakcija
Model akutne sustavne anafilakse (ovalbumin)
Model granuloma izazvanog potkožnom implantacijom (vata,
spužva, stakleni štapić)
Model propusnosti krvnih žila
Model upale poplućnice (histamin, bradikinin,
karagenin,prostaglandin, dekstran, turpentin)
Model kožnog granuloma
(krotonsko ulje, karagenin)
UV-eritem
Model adjuvantnog artritisa (Freudov adjuvant)
Model edema uške (oksazolon, krotonsko ulje, kantaridin, IL-1,
arahidonska kiselina, forbolni esteri)
Model edema šape (karagenin,formaldehid, dekstran,
albumin, kaolin)
Primjeri upalnih reakcija
akutne upala uške izazvana s PMA (forbol 12-miristat 13 acetat
pokusa oksazolonom izazvanog odgođenog tipa preosjetljivosti
kronične upale uške izazvane višestrukim nanošenjem oksazolona
pokusa liposaharidom (LPS) izazvane plućne neutrofilije
pokusa liposaharidom (LPS) izazvane endotoksemije
pokusa liposaharidom (LPS) izazvanog septičkog šoka
Adjuvants:
• tvari koje pomješane s antigenom i injicirane pojačavaju imunogeničnost antigena (lat. adjuve-pomoći)
• produžavaju vrijeme otpuštanja antigena
• pojačavaju kostimulatorne signale
• stvaraju formiranje granuloma
• stimuliraju nespecifičnu proliferaciju limfocita
Suvremeni životinjski upalni modeli
Atopičkog dermatitisa
KOBP-a Psorijaza
Model endotoksemije (LPS)
Model kroničnog dermatitisa (različite
vrste haptena)
Transplantacija psorijatične kože imunodeficijentnim
AGR129 miševima
Sepse
Modeli bronhitisa (sumporni dioksid,
virusi, bakterije)
Model dermatitisa u golokožih zamoraca izazvan
superantigenom
Modeli psorijaze nastali genetskim
injženjeringom
Model kroničnog iritantnog kontaktnog
dermatitisa (TPA)
Model odgođenog tipa preosjetljivosti
(ovalbumin)
Model dermatitisa u štakora izazvanog
nedostatkom magnezija
Model NC/Nga miševa
Model odgođenog tipa preosjetljivosti
(ovalbumin)
Modeli plućne hipertenzije (monokrotalin, kronična
hipoksija
Modeli atopičkog dermatitisa nastali
genetskim injženjeringom
Model pasivne kožne anafilakse (ovalbumin)
Modeli plućne fibroze (bleomicin, mikroorganizmi,
pesticid, azbest)
Modeli plućne neutrofilije (LPS, dim
cigarete)
Model emfizema pluća nastali genetskim
injženjeringom
Modeli emfizema pluća (elastaza, papain, dim
cigarete, dušični dioksid, endotoksini)
Model iakutne ozljede pluća (LPS, sadržaj
crijeva)
Modeli septičkog šoka (LPS, mikroorganizmi, feces,
crijevni sadržaj, zimozan)
Inducirani
Inducirani toksinima, virusima ili
zagađenjem
Injiciranje tumorskih stanica
u životinje
Topička primjena kemikalija koje
prouzrokuju tumor
Transplantacija spontanih tumora
Animalni modeli u tumorskoj imunologiji
Animalni modeli u tumorskoj
imunologiji
S obzirom na nastanak tumora, tumori mogu biti:
Spontani tumori
• idiopatski
• karcinogenom inducirani
• transgeni/knock-out životinje: p53, Rb, …
Transplantirani tumori
• Animalni tumori: Lewis-ov karcinom pluća, karcinom mliječne žlijezde miša, S 180 sarkom, Ehrlichov solidni i/ili asctični tumor
• Ljudski „ksenograft“ model: ljdske tumorske stanične linije imlantirane u imunodeficijentne životinje (primjerice, SCID miševa kao nositelja leukemijskih stanica ljudi)
• Transplantacija tkiva tumora ljudi u šupljine ili tkiva miševa
Ostali tumorski animalni modeli
Orthopic animalni modeli
• dobiju se implantacijom tumorskih stanica u ciljne organe.
• reproducira aspekte mikrookoliša tumora i oponaša niz važnih bioloških značajki progresije tumora, angiogeneze, metastaziranja i otpornosti stanica tumora na terapiju (rezistencija).
transgenični tumorski modeli,
• primjerice knock out miševi za p53 ili neki drugi tumor supresor gen kao i razvoj endogenih tumorskih stanica.
izlaganje životinja kroničnom stresu može potaknuti rast tumora i angiogenezu.
• Neuroendokrini stres
• utječe na rast i aktivnost malignog tkiva putem receptora za hormone na stanicama tumora (karcinom ovarija)
Različiti oblici upale i njena uloga u tumorogenezi
b i o c h e m i c a l pharma c o logy 7 2 ( 2 0 0 6 ) 1 6 0 5– 1 6 21
Veza između upale i razvoja karcinoma
Molekularni mehanizmi kemoprevencije kolorektalnog tumora prirodnim hranidbenim komponentama
Slijed pojava premalignih promjena
u intestinalnom tipu karcinoma
Karcinogeneza je stupnjevit proces nastanka tumora
Supresija metastaza
ISTRAŽIVANJE SPONTANOG METASTAZIRANJA
Supresija tumora
Proces metastaziranja
Primary malignant neoplasm
Angiogenesis Invasion/ transport
Tumor cell emboli (interactions with thrombocytes and other blood cells)
Transport
Adherence to capillary endothel
Extravasation
Establishment of
microenvironment
Proliferation
Metastases Design by dr. Zoran Tadić
Proizvodnja tumorskih stanica u plućima
Tumorska angiogeneza
Tumorska angiogeneza
Usporedba normalnih i
angiogeničnih krvnih žila
Normalno krvožilje s organiziranim venulama, arteriolama i kapilarima (A)
Tumorska mikrovaskulatura s nedostatkom konvencionalne hijerarhije
krvnih žila (B). Preuzeto iz: McDonald and Choyke, 2003
A B
Peritonealna karcinomatoza
Višestruko modulatorni učinak kemoterapeutski spojeva na imunološki sustav
Menard et al. Cancer Immunol Immunother (2008)57:1579-1587)
Proizvodnja monoklonskih protutijela
Antigen
Kultura stanica mijeloma
Izolacijastanicaslezene
Uzgoj stanica uselekcijskom mediju
Selekcija hibridnihstanica (hibridoma)
Selekcija stanica kojeproizvode željeno antitijelo
Uzgoj ustaničnojkulturi
Poticanjenastankatumora
M o n o k l o n s k aa n t i t i j e l a
Pokus o porijeklu limfocita
Test na odgovor limfocita T
Dani u kulturi1 3 5
Imunizacija antigenom A
Izolacija stanica izlimfnog čvoranakon 5 - 10 dana
Uzgojstanica santigenimaA i B
Mjerenjeproliferacijelimfocita T
bezantigena antigen A antigen B
antigen A
antigen B
bez antigena