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UNIVERSIDAD DE BURGOS

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y CIENCIA DE LOS

ALIMENTOS

EFECTO DE LA QUIMIOTERAPIA ANTINEOPLÁSICA

EN PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL

SOBRE BIOMARCADORES DEL ESTRÉS

OXIDATIVO Y DEL ESTADO REDOX PLASMÁTICO

REYES DE SANTIAGO ARTECHE

BURGOS 2010

Universidad de Burgos

Universidad de Burgos DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Dña. Pilar Muñiz Rodriguez, profesora titular de la Universidad de Burgos y D. Carlos

García Girón, Jefe del Servicio de Oncología Médica del Hospital General Yagüe, en su

calidad de directores de la tesis doctoral

Certifican

Que la memoria titulada “Efecto de la quimioterapia antineoplásica en pacientes

con cáncer colorrectal sobre biomarcadores del estrés oxidativo y del estado redox

plasmático” que presenta Dña. Reyes de Santiago Arteche, licenciada en Farmacia, ha

sido realizada bajo nuestra dirección y autorizamos su presentación para optar al Grado

de Doctor por la Universidad de Burgos.

Y para que así conste a los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en

Burgos, a 8 de Marzo de 2010.

Fdo. Dra. Pilar Muñiz Rodriguez Fdo. Dr. Carlos García Girón

Universidad de Burgos DEPARTAMENTO BIOTECNOLOGÍA Y CIENCIA DE LOS ALIMENT OS

SAGRARIO BELTRAN CALVO, CATEDRÁTICA DE LA UNIVERSIDAD DE

BURGOS, EN SU CALIDAD DE DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE

BIOTECNOLOGÍA Y CIENCIA DE LOS ALIMENTOS.

CERTIFICA

Que la memoria titulada “Efecto de la quimioterapia antineoplásica en pacientes

con cancer colorrectal sobre biomarcadores del estrés oxidativo y del estado redox

plasmático” que presenta Dña. Reyes de Santiago Arteche, Licenciada en Farmacia, ha

sido realizada bajo la dirección de la Dra. Pilar Muñiz Rodriguez, Profesora Titular de

Universidad de Burgos y el Dr. Carlos García Giron Jefe del Servicio de Oncología

Médica del Hospital General Yague y en representación del Consejo de Departamento,

autoriza su presentación para ser defendida como Tesis Doctoral.

Y para que así conste, y a los efectos oportunos, firmo el presente certificado en

Burgos, a 8 de Marzo de 2010.

Fdo. Sagario Beltran Calvo

AGRADECIMIENTOS

Quiero transmitir mi más sincero agradecimiento a quienes de una u otra forma han

colaborado en la elaboración de este trabajo.

A la Dra. Pilar Muñiz, por su tiempo, su paciencia y su dedicación. Porque es

infatigable y una gran científica e investigadora.

Al Dr. Carlos García Girón, por su apoyo y amabilidad, por sus conocimientos y

consejos que tan útiles han sido para la consecución de este trabajo.

Sin ellos, este trabajo, que es tan suyo como mío, no hubiera salido adelante.

A la Dra. Mª Jesús Coma, Jefa de la Unidad de Investigación del Hospital General

Yagüe, donde se ha realizado la parte experimental de este trabajo.

A Mónica Cavia, de la Unidad de Investigación del Hospital General Yagüe, por su

ayuda inestimable en la realización de la parte experimental de este trabajo.

A mis compañeras de la Unidad de Investigación, Marta, Yolanda, Carolina, Charo,

Silvia y Celia, por su apoyo, su escucha y los buenos ratos que hemos compartido.

A los médicos, enfermeras y todo el personal del Servicio de Oncología Médica del

Hospital General Yagüe, por su colaboración desinteresada en la realización de este

estudio, tanto en la selección de pacientes y extracción de muestras como en los

temas administrativos que me han facilitado en todo momento.

A los pacientes y donantes de sangre que han participado voluntariamente y que

han confiado en nosotros, porque sin ellos este estudio no hubiera sido posible.

Este trabajo ha sido realizado en la Unidad de Investigación del Hospital General

Yagüe de Burgos, y ha sido financiado por el proyecto del SACYL (GRS220/A/08) y

por Caja Burgos a través de las ayudas a la investigación clínica en las

convocatorias del 2007 y 2008.

A Eduardo y a Bruno

A mi familia

Gracias por formar parte de mi vida

INDICE GENERAL

1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA …………………………………………………….. 1

1.1. ESTRÉS OXIDATIVO………………………………………………………... 1

1.1.1. Estrategias celulares contra los radicales libres. Sistemas antioxidantes…………………………………………………………..... 11

1.1.1.1. Antioxidantes enzimáticos………………………………………… 14

1.1.1.2. Antioxidantes no enzimáticos…………………………………….. 21

1.1.1.2.1. Endógenos…………………………………………………….. 21

1.1.1.2.2. Antioxidantes presentes en el plasma……………………… 25

1.1.1.2.3. Exógenos. Antioxidantes presentes en la dieta…………… 27

1.2. CÁNCER COLORRECTAL………………………………………………….. 33

1.2.1. Factores de riesgo en cáncer colorrectal. Causalidad……………… 39

1.2.2. Marcadores tumorales………………………………………………….. 42

1.2.3. Tratamiento quimioterápico en cáncer colorrectal…………………... 46

1.3. ESTRÉS OXIDATIVO Y CÁNCER…………………………………………. 55

1.3.1. Mecanismos de carcinogénesis……………………………………….. 55

1.3.2. Señalización celular y cáncer………………………………………….. 58

1.3.3. Cáncer colorrectal y daño oxidativo a biomoléculas………………… 61

1.4. EVALUACIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO………………………………... 67

1.4.1. Capacidad antioxidante total…………………………………………… 67

1.4.2. Evaluación de los biomarcadores de estrés oxidativo………………. 68

1.4.3. Evaluación del estado redox…………………………………………… 70

2. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS …………………………………….. 73

2.1. HIPÓTESIS DE TRABAJO………………………………………………….. 73

2.2. OBJETIVOS…………………………………………………………………… 73

3. MATERIAL Y MÉTODOS ………………………………………………………… 75

3.1. MATERIAL…………………………………………………………………….. 75

3.1.1. Aparatos………………………………………………………………….. 75

3.2. POBLACIÓN DE ESTUDIO…………………………………………………. 76

3.2.1. Selección de pacientes…………………………………………………. 76

3.2.2. Tamaño de la muestra………………………………………………….. 77

3.2.3. Obtención de muestras y procesamiento…………………………….. 79

3.3. DETERMINACIONES ANALÍTICAS………………………………………... 80

3.3.1. Capacidad antioxidante total del plasma……………………………... 80

3.3.1.1. Determinación mediante el método FRAP……………………… 80

3.3.1.2. Determinación mediante el método ABTS……………………… 81

3.3.1.3. Determinación de polifenoles totales……………………………. 82

3.3.2. Determinación de nitrato y nitrito……………………………………… 83

3.3.3. Determinación de biomarcadores de daño oxidativo a biomoléculas…………………………………………………………….. 85

3.3.3.1. Daño oxidativo a lípidos…………………………………………… 85

3.3.3.1.1. Determinación de Hidroperóxidos………………………….. 85

3.3.3.1.2. Determinación de malondialdehido (MDA)………………… 86

3.3.3.2. Daño oxidativo a proteínas. Determinación grupos carbonilo… 88

3.3.4. Determinación del estado redox………………………………………. 89

3.3.4.1. Determinación de glutation reducido (GSH)……………………. 89

3.3.4.2. Determinación de la actividad tiorredoxina reductasa (TrxR)… 90

3.3.4.3. Determinación de los niveles de tiorredoxina (Trx)……………. 91

3.3.5. Otras determinaciones…………………………………………………. 92

3.3.5.1. Determinación de proteínas en plasma y en linfocitos………… 92

3.3.5.2. Determinaciones del laboratorio clínico de referencia…………. 93

3.4. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS………………………... 94

4. RESULTADOS…………………………………………………………………….. 95

4.1. ESTADÍSTICOS DESCRIPTIVOS INICIALES DE LAS MUESTRAS DE PACIENTES Y SUJETOS CONTROL……………………………….…….. 95

4.2. ESTUDIO COMPARATIVO DEL ESTADO OXIDATIVO SEGÚN EL TIPO DE CÁNCER……………………………………………………………. 101

4.2.1. Capacidad antioxidante total del plasma…………………………….. 101

4.2.2. Biomarcadores de óxido nítrico en plasma………………………….. 102

4.2.3. Biomarcadores de daño oxidativo a biomoléculas………………….. 103

4.2.4. Estado Redox…………………………………………………………… 107

4.3. ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL……………………………………………………………… 109

4.3.1. Estudio del estrés oxidativo asociado al cáncer colorrectal………... 109

4.3.1.1. Capacidad antioxidante total del plasma………………………... 110

4.3.1.2. Biomarcadores de óxido nítrico en plasma……………………… 111

4.3.1.3. Biomarcadores de daño oxidativo a biomoléculas……………... 112

4.3.1.4. Estado Redox………………………………………………………. 114

4.3.2. Estudio del estrés oxidativo asociado al tratamiento quimioterápico en pacientes con cáncer colorrectal………………………………….. 116

4.3.2.1. Estudio del estrés oxidativo en pacientes con cáncer colorrectal asociado al tratamiento quimioterápico…………….. 117

4.3.2.1.1. Capacidad antioxidante total del plasma…………………... 117

4.3.2.1.2. Biomarcadores de óxido nítrico en plasma………………... 118

4.3.2.1.3. Biomarcadores de daño oxidativo a biomoléculas………... 119

4.3.2.1.4. Estado Redox…………………………………………………. 121

4.3.2.2. Estudio del estrés oxidativo en pacientes con cáncer colorrectal asociado al tipo de tratamiento quimioterápico……. 124




4.3.2.2.4. Estado Redox…………………………………………………. 129

4.3.3. Estudio del estrés oxidativo asociado a metástasis en pacientes con cáncer colorrectal…………………………………………………. 132

4.3.3.1. Estudio del estrés oxidativo en cáncer colorrectal asociado a metástasis en un grupo de pacientes sin tratamiento quimioterápico…………………………………………………….... 132




4.3.3.1.4. Estado Redox…………………………………………………. 137

4.3.3.2. Estudio del estrés oxidativo en cáncer colorrectal asociado a metástasis en un grupo de pacientes en tratamiento quimioterápico……………………………………………….……... 139




4.3.3.2.4. Estado Redox…………………………………………………. 144

4.3.3.3. Estudio del estrés oxidativo en cáncer colorrectal asociado al tipo de metástasis en un grupo de pacientes en tratamiento quimioterápico………………………………………………………. 146




4.3.3.3.4. Estado Redox…………………………………………………. 151

4.3.4. Estudio del estrés oxidativo asociado a concentración de los marcadores tumorales CEA y Ca 19.9 en pacientes con cáncer colorrectal..……………………………………………………………….. 153

4.3.4.1. Estudio del estrés oxidativo en cáncer colorrectal asociado a concentración de CEA en un grupo de pacientes en tratamiento quimioterápico……………………………….……… 153




4.3.4.1.4. Estado Redox…………………………………………………. 158

4.3.4.2. Estudio del estrés oxidativo en cáncer colorrectal asociado a concentración de Ca 19.9 en un grupo de pacientes en tratamiento quimioterápico………………………………….…… 160




4.3.4.2.4. Estado Redox…………………………………………………. 165

4.3.5. Estudio del estrés oxidativo asociado a otras patologías en pacientes con cáncer colorrectal……………………………………..... 166

4.3.6. Estudio de las correlaciones entre marcadores de estrés oxidativo en pacientes con cáncer colorrectal…………………………………… 167

5. DISCUSIÓN………………………………………………………………………… 171

5.1. ESTUDIO COMPARATIVO DEL ESTADO OXIDATIVO SEGÚN EL TIPO DE CÁNCER……………………………………………………………. 174

5.2. ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL………………………………………………………………. 178

5.2.1. Estudio del estrés oxidativo asociado al cáncer colorrectal………………………...………………………………………. 179

5.2.2. Estudio del estrés oxidativo asociado al tratamiento quimioterápico en pacientes con cáncer colorrectal……………….………………….. 181

5.2.3. Estudio del estrés oxidativo asociado a metástasis en pacientes con cáncer colorrectal…………………………………………………... 188

5.2.4. Estudio del estrés oxidativo asociado a concentración de los marcadores tumorales CEA y Ca 19.9 en pacientes con cáncer colorrectal..……………………………………………………………….. 195

5.2.5. Estudio del estrés oxidativo asociado a otras patologías en pacientes con cáncer colorrectal....................................................... 198

5.2.6. Estudio de las correlaciones entre los diferentes marcadores de estrés oxidativo en pacientes con cáncer colorrectal………………... 199

6. CONCLUSIONES………………………………………………………………….. 203

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………………………….. 205

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Revisión Bibliográfica

1

1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1. ESTRÉS OXIDATIVO

El estrés oxidativo está implicado en varios procesos patológicos tales como

alteraciones cardiovasculares, desordenes neurológicos, diabetes, isquemias,

cáncer e incluso el propio envejecimiento (Dalle-Donne et al., 2006; Heistad et al.,

2009; Visconti and Grieco, 2009; Wells et al., 2009).

Estas alteraciones se pueden clasificar en dos grupos, por una parte estarían

las caracterizadas por variaciones en el estado redox y cambios en la tolerancia de

la glucosa, también denominado estrés oxidativo mitocondrial, relacionado con

enfermedades como el cáncer y la diabetes mellitus y por otra parte, estarían

implicados los desordenes caracterizados por condiciones inflamatorias oxidativas y

un aumento de la actividad de la NADPH oxidasa y/o xantina oxidasa inducido por

especies oxigénicas reactivas (ROS). Estas últimas estarían relacionadas con

procesos inflamatorios crónicos, arterioesclerosis e isquemias y reperfusiones.

El estrés oxidativo (EO) es el desequilibrio entre la producción de radicales

libres y las defensas antioxidantes a favor de los primeros (Sies, 1991). Así pues, el

estrés oxidativo puede originarse por un exceso de sustancias prooxidantes o

radicales libres, una deficiencia de agentes antioxidantes o por ambos factores a la

vez.

Los radicales libres son moléculas o fragmentos de moléculas que contienen

uno o más electrones desapareados en un nivel energético superior (Halliwell,

1996). Este desapareamiento electrónico proporciona propiedades paramagnéticas y

les confiere una alta e indiscriminada reactividad.

En los sistemas biológicos, además de los radicales libres se generan otras

especies químicas que por sí mismas no son reactivas pero en presencia de metales

de transición (hierro y cobre) u otros radicales generan radicales libres altamente

reactivos. Todos ellos se agrupan con el nombre de especies reactivas del oxígeno

(ROS) o del nitrógeno (RNS) (Bergendi et al., 1999; Miller et al., 1990).


2

Existen muchas clases de radicales libres, y como ya se ha mencionado,

destacan fundamentalmente los compuestos por oxígeno o nitrógeno (ERONs),

viniendo determinada la capacidad de cada especie por cuatro características

básicas como son: reactividad, especificidad, selectividad y difusibilidad. Entre los

más importantes, cabe destacar:

• Anión superóxido (O2˙¯). Se trata de una especie relativamente poco reactiva,

pero potencialmente tóxica, ya que puede iniciar reacciones que den lugar a

otros ROS que a su vez sí son muy reactivos (Fujita et al., 2009).

• Radical hidroxilo (˙OH). Es la especie más reactiva, con una vida media estimada

de alrededor de 10 -9 segundos (Liochev and Fridovich, 1994; Nguyen et al.,

2008). Su alta reactividad hace que su acción química quede reducida a la

estricta vecindad del lugar de producción.

• Radical peroxilo (ROO˙). Son probablemente los radicales más abundantes en

los sistemas biológicos, no siendo tan reactivos como otros ROS. Se originan a

partir de la adición del oxígeno a prácticamente cualquier radical hidrocarbonado.

Este radical tiene una vida media relativamente larga (del orden de segundos).

• Óxido nítrico (NO˙). Desde hace años se ha comenzado a prestar particular

atención a esta especie reactiva del nitrógeno, debido a su importante papel en la

señalización molecular de determinados procesos biológicos (Koshland, 1992; Li

et al., 2009). Juega un papel fundamental en la regulación del flujo sanguíneo

local, inhibe la agregación plaquetaria, es un neurotransmisor y es producido por

los macrófagos activados contribuyendo a la defensa inmunitaria primaria. NO˙

se sintetiza en los tejidos a partir de arginina mediante una reacción catalizada

por la óxido nítrico sintasa (Moncada and Palmer, 1991). En ambientes acuosos,

este radical tiene una semivida de pocos segundos, incrementando su estabilidad

hasta más de 15 segundos en ambientes con bajas concentraciones de oxígeno.

Además, es soluble en medios acuosos y lipídicos, lo que le confiere una elevada

difusibilidad tanto a través del citoplasma como de las membranas plasmáticas.

En el medio extracelular reacciona con oxígeno y agua formando los aniones

nitrito y nitrato.


3

• Peróxido de hidrógeno (H2O2). Aunque no es un radical libre como tal y su

capacidad oxidante es débil, en presencia de trazas de catalizadores metálicos

como el hierro o el cobre o de otros radicales libres puede dar lugar a la

formación del radical ˙OH. Cabe destacar el papel que juega como molécula

señalizadora (Du et al., 2006) gracias a sus propiedades bioquímicas, tales como

su relativa elevada vida media, su facilidad para difundir a través de las

membranas y su solubilidad, tanto en medios hidrófobos como en medios

acuosos (Droge, 2002b).

• Oxígeno singlete (1O2). Es una forma excitada del oxígeno molecular. Su vida

media es muy corta, alrededor 10-6 segundos, aunque depende de la naturaleza

de la matriz circundante.

• Peroxinitrito (NOO¯). Está en equilibrio con su ácido conjugado. En soluciones

neutras es un potente agente oxidante.

Las especies no radicales son de baja reactividad, pero en presencia de

metales de transición (hierro y cobre) pasan a radical hidroxilo, que es la especie

oxigénica más reactiva y tóxica, dada su elevada capacidad para reaccionar con las

distintas biomoléculas (lípidos, proteínas y ácidos nucleicos).

El anión superóxido (O2˙¯) es el mayor reductor, la simple adición de un protón

da lugar a la formación del radical hidroperóxido (HO2˙) convirtiéndose en un agente

oxidante muy activo, selectivo y específico. El O2˙¯ no es particularmente reactivo a

lípidos, glúcidos o ácidos nucleicos y exhibe reactividad limitada con determinadas

proteínas. Esta evidencia constata que el O2˙¯ reacciona con proteínas que

contienen metales en su grupo prostético. El radical hidroxilo (˙OH), sin embargo,

reacciona con cualquier molécula que tenga cerca, sin especificidad alguna.

Los tres componentes con mayor capacidad de difusión son el radical

superóxido, peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo, capaces de reaccionar con

moléculas que se encuentran alejadas del lugar de origen incluso con capacidad de

atravesar membranas celulares.


4

O2 O2

.- H2O2-

OH.-

H2O .-

e- e- e- e-

Figura 1 . Especies oxigénicas reactivas.

Junto a estos radicales existen otros derivados o centrados en átomos de

hidrógeno, carbono, nitrógeno, azufre, cloro, etc., que indiscutiblemente contribuyen

a la propagación y mantenimiento de nuevas reacciones que conducen a la

formación de radicales.

Los radicales libres pueden producirse a través de diversos procesos químicos,

tanto dentro como fuera del organismo. Atendiendo al origen de su producción, se

pueden clasificar las fuentes en exógenas y endógenas (Cadenas, 1989; Inoue et

al., 2003).

• Fuentes exógenas:

o Factores nutricionales y ambientales, como contaminantes aéreos

fotoquímicos, radiaciones ultravioleta (Zastrow et al., 2009), hiperoxia,

pesticidas, humo del tabaco (Carnevali et al., 2003), solventes, anestésicos e

hidrocarburos aromáticos.

o La irradiación de los organismos debido a las radiaciones electromagnéticas o

radiaciones de partículas.

o Muchos agentes antineoplásicos, tales como la adriamicina, bleomicina,

daunorrubicina, el oxaliplatino y algunos antibióticos(Kopetz et al., 2009;

Meynard et al., 2007). Algunos de los efectos de estas drogas se han

atribuido a su capacidad para reducir el oxígeno a superóxido, peróxido de

hidrógeno y radical hidroxilo.

Además, la producción de radicales libres se puede ver aumentada bajo ciertas

condiciones fisiopatológicas como la inflamación, la hiperoxia, el metabolismo de

algunas drogas, alteraciones renales, la exposición a radiaciones y el cáncer

(Il'yasova et al., 2008; Swaminathan and Shah, 2008).


5

• Fuentes endógenas:

Cabe destacar que una misma célula tiene potencialmente más de una fuente de

producción de radicales libres.

o Cadena de transporte electrónico mitocondrial. En los tejidos sanos una de las

principales fuentes de radicales libres son las mitocondrias, descrito hace ya

más de tres décadas por Loschen (Loschen et al., 1971) y constituyendo por

tanto, la principal fuente fisiológica de ROS (Le Bras et al., 2005). Esto se

debe a que estos orgánulos son responsables de más del 90% del consumo

de oxígeno celular y a que los radicales libres en los sistemas biológicos

proceden siempre, en último término, del metabolismo monovalente de la

molécula de oxígeno. Por otra parte, son muchas las patologías en las que se

ha descrito que la mitocondria genera radicales libres, siendo la causa del

estrés oxidativo que sufre la célula.

o Cadena de transporte electrónico del retículo endoplasmático y membrana

nuclear. Ambos sistemas de membranas contienen citocromos P450 que

pueden oxidar ácidos grasos insaturados y xenobióticos (Dostalek et al.,

2008). De hecho, los citocromos P450 son los más poderosos oxidantes in

vivo, aunque también pueden actuar como agentes reductores.

o Las células fagocitarias (neutrófilos, monocitos y eosinófilos) poseen diversas

enzimas (sistema de la NADPH oxidasa y óxido nitrito sintasa) como

mecanismo de defensa frente a los microorganismos, generando

directamente radical superóxido y óxido nítrico (Kirkham, 2007).

o Enzimas solubles y proteínas. Enzimas como xantina oxidorreductasa, aldehido

oxidasa, dihidroorotato deshidrogenasa, flavinprotein deshidrogenasa y

triptófano dioxigenasa, generan radicales libres durante su ciclo catalítico

(George and Struthers, 2009).

o Autooxidación de pequeñas moléculas. Existen en la célula una gran variedad

de componentes solubles, capaces de producir reacciones de oxidación-


6

reducción, tales como los tioles, hidroquinonas, catecolaminas, flavinas y

tetrahidropterinas.

o Reacción de Fenton-Haber-Weiss. Consistente en la reducción del H2O2 por

iones de metales de transición, sobre todo el ión ferroso (Fe2+) y el cuproso

(Cu+) y otros iones, para generar radicales hidroxilo (Leonard et al., 2004).

También a partir del peróxido de hidrógeno y en presencia del radical

superóxido puede formarse el radical hidroxilo, por la reacción de Haber-

Weiss (Liochev and Fridovich, 2002).

Cada célula está caracterizada por una concentración de electrones o también

denominado estadío redox, cuya oscilación determina un gran número de funciones

fisiológicas controladas por vías de señalización respondedoras a este nivel de

oxidorreducción (Trachootham et al., 2008). Este estado se mantiene con un

estrecho margen de variación, similar a la forma en que se regulan los niveles de

pH.

De esta forma, los radicales libres son por tanto necesarios para el buen

funcionamiento celular, pudiendo actuar en transducción de señales, activación

enzimática, síntesis de DNA y RNA, proliferación celular, modificaciones proteicas

post-transduccionales, diferenciación y apoptosis (England and Cotter, 2005; Poli et

al., 2004).

Sin embargo, no es importante sólo la existencia o no de estos radicales libres

como un aspecto meramente cualitativo, sino que es de especial importancia la

cantidad de éstos. Por ello, conviene destacar que una cantidad excesiva de alguna

especie concreta de radicales puede ser perjudicial para un determinado sistema

biológico, mientras que, por otra parte, hay situaciones en las que una cantidad

insuficiente de radicales libres es también indeseable, como puede ser el caso de

procesos de apoptosis celular (Wang and Yi, 2008).

No obstante, en la mayoría de los casos, niveles elevados de radicales libres

producen estrés oxidativo, induciendo un daño causado por la interacción de los

radicales libres con distintas macromoléculas biológicas, como lípidos, proteínas,


7

ácidos nucleicos y carbohidratos y generando reacciones en cadena de radicales

libres (Valko et al., 2004; Valko et al., 2006).

Se ha estimado que una célula humana está expuesta aproximadamente a 1,5

x 105 oxidaciones/día como consecuencia de la acción de los distintos tipos de

radicales libres (Beckman and Ames, 1997). La capacidad de cada radical o especie

oxigénica reactiva viene determinada, desde el punto de vista químico, por cuatro

características básicas como son: reactividad, especificidad, selectividad y

difusibilidad.

El proceso de ataque oxidativo a los lípidos se denomina peroxidación lipídica y

tiene lugar fundamentalmente sobre los ácidos grasos poliinsaturados (Cross et al.,

1987), provocando en las membranas de las que forman parte, una pérdida de

flexibilidad y de las funciones secretoras, así como la ruptura de los gradientes

iónicos transmembrana, asociándose principalmente con el daño vascular.

Esta es una reacción en cadena, teniendo lugar en tres fases, iniciación,

propagación y terminación (Figura 2) (Esterbauer et al., 1991; Girotti, 1998).

Figura 2 . Esquema de la peroxidación lipídica.

Así, esta peroxidación lipídica puede iniciarla el radical hidroxilo, el radical

hidroperoxilo y quizá el oxígeno singlete, pero no el radical superóxido o el peróxido

de hidrógeno, que son menos reactivos. El radical libre extrae un átomo de

hidrógeno de uno de los carbono metileno de la cadena del ácido graso, dejando un

electrón no apareado, con lo cual se genera un radical lipídico. Este radical lipídico

rápidamente sufre un reordenamiento molecular para producir un dieno conjugado


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que reacciona con el oxígeno molecular produciendo un radical hidroperoxilo. Este

radical puede a su vez extraer un átomo de hidrógeno de un carbono metileno de

otro ácido graso poliinsaturado para formar un nuevo radical lipídico y un

hidroperóxido lipídico. El radical lipídico entonces se combina con otra molécula de

oxígeno y continúa la reacción en cadena.

Los productos finales de este proceso de peroxidación lipídica son aldehidos,

gases hidrocarbonatos y varios residuos químicos, incluyendo el malondialdehido

(MDA) y el 4-hidroxi-2-nonenal (HNE). La peroxidación lipídica puede tener efectos

profundos sobre las funciones celulares, pues afecta a las membranas, produciendo

cambios en la fluidez, aumento de la permeabilidad, disminución del potencial de

membrana y finalmente su rotura.

Además, los productos de degradación pueden difundir lejos de su lugar de

producción y provocar edema celular, además de influir sobre la permeabilidad

vascular, inflamación y quimiotaxis. Asimismo, pueden alterar la actividad de

fosfolipasas e inducir la liberación de ácido araquidónico, con la subsiguiente

formación de prostaglandinas y endoperóxidos.

El malondialdehido, a su vez, puede reaccionar con lípidos y proteínas durante

la peroxidación lipídica para formar bases de Shiff conjugadas, productos

fluorescentes insolubles que se acumulan en el interior de lisosomas, formando el

pigmento de envejecimiento conocido con el nombre de lipofucsina, reconocido

marcador morfológico de envejecimiento ya que se acumula en los tejidos con la

edad (Hutter et al., 2007).

Por otra parte, mientras que las moléculas de MDA reaccionan con el DNA,

provocando diversas mutaciones genéticas, las de HNE son capaces de reaccionar

con proteínas provocando alteraciones importantes que afectan directamente a

diversas vías de señalización así como con proteínas implicadas directamente en

mecanismos de muerte celular (Awasthi et al., 2003).

La acción de los radicales libres sobre las proteínas puede ser reversible o

irreversible, dependiendo del objetivo y de la forma del daño oxidativo, ejerciéndose

fundamentalmente sobre los enlaces insaturados, los anillos aromáticos y los grupos


9

tiol (-SH). De esta forma, proteínas ricas en determinados aminoácidos (triptófano,

tirosina, fenilalanina, histidina, metionina y cisteína) pueden sufrir modificaciones

estructurales y funcionales. El triptófano, tirosina, histidina y cisteína son

particularmente sensibles a los ROS (Stadtman, 2004). Los grupos sulfhidrilo

pueden ser transformados en puentes disulfuro (S=S), produciéndose la inactivación

enzimática (si la proteína es un enzima). En otros casos, en los que las proteínas

son estructurales, como el colágeno, las fibrillas se pueden romper por el radical

superóxido e hidroperóxido, proceso que puede constituir el punto de partida para la

acción de proteasas y facilitar la pérdida de estructura de la triple hélice del

colágeno.

Como resultado de estas interacciones se produce un incremento de grupos

carbonilo de las cadenas laterales de los aminoácidos y un descenso de grupos tiol

en el entrecruzamiento entre cadenas peptídicas o en la fragmentación de enlaces

peptídicos. Esta oxidación puede dar lugar a una pérdida o modificación de la

actividad biológica de las proteínas y alterar su recambio, estando asociado con un

número de enfermedades relacionadas con el envejecimiento (Belonogov et al.,

2009; Bulteau et al., 2006; Danielson and Andersen, 2008; Davies, 1987; Stadtman,

1992, 2004).

Los radicales libres interaccionan con los glúcidos de forma variable. La

glucosa constituye un captador del radical superóxido y la manosa y el manitol son

eliminadores del radical hidroxilo. Sin embargo, los polisacáridos son

despolimerizados por los radicales libres (Monboisse et al., 1988), como el ácido

hialurónico y los proteinglicanos. Este daño oxidativo a los polisacáridos de función

estructural da lugar a procesos degenerativos como la artritis reumatoidea.

Por otra parte, se ha observado una relación directa entre los radicales libres y

el estrés oxidativo con la diabetes mellitus. Se postula que una anormal regulación

en el metabolismo de los peróxidos y los metales de transición colabora con el

establecimiento de la enfermedad, así como en las complicaciones que aparecen a

largo plazo (Oberley, 1988; Wei et al., 2009; Wolff, 1993).

Los radicales libres pueden reaccionar con todos los componentes del DNA. En

presencia de oxígeno, se forman radicales peroxilo por adición de oxígeno a las


10

bases o al azúcar del DNA. Las reacciones posteriores de los radicales formados en

el DNA dan lugar a un gran número de efectos, que incluyen rotura de cadenas,

sitios abásicos y modificación de bases. También se forman puentes cruzados DNA-

proteína (Cooke et al., 2003). Muchos de estos productos encontrados in vitro,

también aparecen en el DNA de tejidos animales tras el tratamiento con sustancias

que estimulan la generación de radicales libres. Según estudios realizados existe

una fuerte correlación entre daño al DNA producido por oxidación y cáncer, así como

la evolución de los diferentes estadios del proceso de carcinogénesis (Tsuzuki et al.,

2007).

El aumento de daño oxidativo es un proceso natural que en condiciones

fisiológicas normales produce una modificación en las bases siendo su relación de

1/130.000 bases en el DNA nuclear y 1/8.000 en el DNA mitocondrial (Inoue et al.,

2003; Richter et al., 1988). Esto se debe, sobretodo, a la cercanía que el DNA

mitocondrial tiene al lugar principal de generación de radicales libres en la célula

sana, la cadena de transporte mitocondrial. También se debe a que este DNA

carece de histonas y poliaminas que puedan protegerlo, y su capacidad de

reparación es mínima en relación con la del DNA nuclear. Como consecuencia de

todo esto, las delecciones y mutaciones del DNA mitocondrial también son mayores

que en el DNA nuclear.

Cuando un radical libre ataca una desoxirribosa del DNA se produce una

ruptura de la hebra. El número de productos del resultado de la oxidación de las

bases nitrogenadas del DNA por radicales libres supera la veintena. Entre ellas la 8-

hidroxi-desoxiguanina (8-OH-dG) (Figura 3) es la alteración que se observa con más

frecuencia (105 residuos de guanina en una célula normal), y es utilizado como

biomarcador de estrés oxidativo por ser capaz de reflejar pequeños cambios

oxidativos del daño al DNA (Floyd, 1990; Haghdoost et al., 2005). Además, su

importancia reside en su alto efecto mutagénico, ya que la 8-OH-dG durante la

replicación del DNA, se empareja con adenina en vez de hacerlo con citosina

(Cheng et al., 1992).


11

Figura 3 . Formación de la base modificada 8-hidroxiguanina.

Un daño moderado al DNA puede detener el ciclo celular o bien disparar

mecanismos de reparación para conservar la integridad del mismo, no obstante, si

este daño es excesivo, se pueden poner en marcha procesos que inducen apoptosis

y muerte celular (David et al., 2007).

Por todo lo señalado, el estrés oxidativo es considerado un factor etiológico

importante en muchos procesos patológicos del ser humano (Figura 4).

PROTEINASLIPIDOS DNA

ESPECIES OXIGENICAS REACTIVAS

PEROXIDACION DEGRADACION Y DESACTIVACION MUTACION

DAÑO A LAS MEMBRANAS Y COMPONENTES CELULARES,TALES COMO LAS LIPOPROTEIN AS

PROBLEMAS CARDIOVASCULARES CANCER Figura 4. Esquema del estrés oxidativo.

Así, se le ha relacionado con la insuficiencia renal crónica y algunas

enfermedades renales agudas, carcinogénesis, la arterioesclerosis, la hipertensión

arterial y enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas, el

desarrollo del síndrome de inmunodeficiencia adquirida, las complicaciones a largo

plazo de la diabetes, etc. (Valko et al., 2007).

1.1.1. Estrategias celulares contra los radicales l ibres. Sistemas

antioxidantes

Los organismos aeróbicos frente a la oxidación de las células y los tejidos han

desarrollado evolutivamente una serie de complejos antioxidantes que limitan la


12

actividad y la producción de ROS y RNS y mantienen el sistema bajo control

(Cadenas, 1997).

Una sustancia antioxidante es aquella que, a concentraciones relativamente

bajas, es capaz de competir con otros sustratos oxidables y, por tanto, retrasar o

inhibir la oxidación de dichos sustratos (Gutteridge and Halliwell, 1989). En esta

definición se engloban tanto los antioxidantes enzimáticos como los no enzimáticos.

No obstante, también hay que decir que existen sustancias que tienen poca

actividad específica antioxidante, pero que, a altas concentraciones, contribuyen

significativamente al potencial antioxidante de una célula o sistema. Ejemplos de

este último caso son los aminoácidos, péptidos y proteínas.

Un buen antioxidante debe tener capacidad para unirse específicamente a los

radicales libres, quelarse con los metales redox, interaccionar con otros

antioxidantes para su regeneración (Sies et al., 2005), tener un efecto positivo sobre

la expresión génica, estar en una concentración adecuada y suficiente en los tejidos

y fluidos biológicos y trabajar en medios acuosos y/o en dominios membranosos.

Esta serie de características se pueden resumir en que deben tener una

elevada efectividad, variabilidad operativa y versatilidad para poder combinarse con

una importante variedad de especies de radicales libres.

Los mecanismos de defensa que han desarrollado los organismos vivos

implican mecanismos preventivos que evitan la formación de los radicales libres,

mecanismos reparadores que son aquellos que reconocen el daño oxidativo y lo

reparan, defensas fisiológicas y defensas antioxidantes.

Las defensas antioxidantes se pueden clasificar en función de su naturaleza

como antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos y en función de su procedencia

como antioxidantes endógenos y exógenos (Figura 5).


13

O2.-

H2O2

H2O

Fe, CuOH .

Daño DNA y Proteínas

NO ONOO-

ROOH

ROO.

Vit E

Vit E . Vit C

Vit C .

GSH

GSSGROH

NADPH

NADP

Hexosas

GR(riboblavina)

GPx(Se)

GSSG

(Mg, Zn, Folato, Vit B12, riboflavina, niacina)

Sistema enzimáticoantioxidante

SOD(Cu/Zn, Mn)

Catalasa(Fe)GPx(Se)

UbiquinolAcido lipóico

Vitamina AVitamina CCarotenoidesFlavonoidesIsoflavonoidesEtc,

Licopenoββββ-caroteno

1O2

Activacióncarotenoides

“Scavengers”

O2Activación

Dienos conjugadosEpóxidosCarbonilos

O2.-

Sistemas reparadores

DIETA

Figura 5 . Esquema de la producción de ROS y mecanismos de defensa antioxidante.

Las estrategias de los antioxidantes incluyen tres niveles de actuación:

prevención, intercepción (secuestradores) y eliminación (Figura 6) (Sies, 1993).

ESTRÉS OXIDATIVO Suprimen la formación Preventivos de radicales RADICALES LIBRES Suprimen las fases de inico y propagación Secuestradores

OXIDACIÓN EN CADENA Reparadores Reparan el daño ENFERMEDAD

Figura 6 . Esquema del mecanismo de acción de los antioxidantes.

En el ámbito preventivo, evitan la formación de radicales libres como el radical

˙OH, son de naturaleza enzimática y constituyen la primera defensa del organismo

frente a ROS.

Los secuestradores, estabilizan los radicales libres, pueden ser endógenos

(glutation) o exógenos (vitaminas y polifenoles).


14

Por último, en la fase de eliminación y/o reparación actúan cuando las

biomoléculas ya han sufrido el daño, eliminándolas o reparándolas (glicosilasas de

ADN, fosfolipasas y proteasas).

Cuando se produce estrés oxidativo las células son capaces de inducir una

respuesta adaptativa por parte del organismo. Por una parte, habrá una activación

de la defensa antioxidante mediante la activación de factores de transcripción o bien

por la inducción inmediata de genes, dando lugar a la producción de las enzimas

antioxidantes. Por otra parte, habrá una represión del sistema productor de ROS,

mediante fundamentalmente la inhibición de la actividad mitocondrial.

Pero si finalmente se produce el desequilibrio entre ROS y los sistemas

antioxidantes, se puede condicionar la aparición de alteraciones funcionales y

estructurales a cualquier nivel del organismo. Hay que tener en cuenta que las

membranas biológicas son permeables a los oxidantes y sus metabolitos, lo que

hace que el lugar del “ataque “ oxidante pueda estar lejos del lugar donde se

originan los ROS, y el lugar de la acción antioxidante pueda estar lejos de ambos

(Ichikawa et al., 1993).

1.1.1.1. Antioxidantes enzimáticos

Las células disponen de enzimas específicas para la neutralización de diversas

especies reactivas, como son la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la

glutation peroxidasa (GPx). No obstante, las oxidorreductasas de grupos tioles y

disulfuros, como el sistema tiorredoxina y la glutarredoxina, también han adquirido

importancia en la prevención del estrés oxidativo celular.

Superóxido dismutasa (SOD)

De los antioxidantes enzimáticos la superóxido dismutasa (SOD) (EC 1.15.1.1)

fue la primera enzima en descubrirse por McCord y Fridovich en 1969. Está presente

en todas las células que utilizan en su metabolismo el oxígeno y está ausente en las

células anaerobias obligadas.


15

Constituye la primera defensa contra el radical superóxido, la cual lo transforma

en peróxido de hidrógeno. Esto es así porque la función fisiológica de la SOD es la

eliminación de los radicales superóxido producidos en las reacciones del

metabolismo aerobio (McCord and Fridovich, 1969).

2 O2•- + 2H+ H2O2 + O2

En el ser humano y otros mamíferos existen tres isoenzimas, pertenecientes a

la familia de las metaloproteínas (Landis and Tower, 2005), la CuZn-SOD, la Mn-

SOD y la ecSOD. La primera se localiza en el citosol, mientras que la segunda se

ubica en la matriz mitocondrial, y la tercera, que también es una CuZn-SOD, es

extracelular (Saitoh et al., 1994; Stralin et al., 1995).

La CuZn-SOD es una enzima homodimérica con un peso molecular de

aproximadamente 32 kDa (Desideri and Falconi, 2003). Cada subunidad contiene un

sitio activo en el que lleva unido los iones cobre y zinc.

La Mn-SOD, mitocondrial, es un homotetrámero con un peso de 88 KDa, que

contiene un átomo de manganeso por subunidad y durante la reacción tiene lugar la

oxidorreducción del manganeso.

La ecSOD es una glicoproteína tetramérica que contiene cobre y zinc en el

centro activo. Presenta alta afinidad por ciertos glicosaminoglicanos como la

heparina. Su regulación es principalmente en respuesta a la acción de las citoquinas

más que a una respuesta individual de los oxidantes celulares.

La concentración intracelular de la SOD citosólica es de 4-10 µM, mientras que

la intramitocondrial es de 20 µM, aunque varía según los tejidos.

Catalasa (CAT)

La enzima catalasa (EC. 1.11.1.6) se encuentra en las células aeróbicas

localizada en los peroxisomas. Es un tetrámero de un peso molecular de 240 KDa

con un cofactor férrico que debe estar unido al sitio activo de la enzima.

Presenta dos tipos de actividad (Aebi, 1984), actividad catalasa, facilitando la

descomposición del peróxido de hidrógeno para dar agua y oxígeno, y actividad


16

peroxidasa, que supone oxidación de dadores de hidrogeniones como el metanol,

etanol, ácido fórmico o fenoles, con el consiguiente consumo de peróxido.

2 H2O2 2 H2O + O2 Aunque realiza la misma función que la glutation peroxidasa (GPx), ésta última

tiene mayor afinidad por el H2O2, es decir, a bajas concentraciones, la GPx juega un

papel más importante que la catalasa.

Fisiológicamente la catalasa cumple un papel fundamental en la detoxificación

del agua oxigenada producida por algunas enzimas localizadas en los peroxisomas,

como la amino-oxidasa. La actividad catalasa varía enormemente en función del

tejido. Es muy alta en hígado y riñón y muy baja en el tejido conectivo.

Intracelularmente se localiza en los peroxisomas y en las mitocondrias, aunque en el

eritrocito se encuentra en la fracción soluble del citoplasma.

Glutation peroxidada (GPx)

Existen dos tipos de glutation peroxidasa, una independiente de selenio

(glutation-S-transferasa; GST EC 2.5.1.18) (Sheehan et al., 2001) y otra que es

selenio dependiente (GPx, EC 1.11.1.19). En humanos existen cinco glutation

peroxidasas dependientes de selenio (Brigelius-Flohe, 2006) (GPx1, GPx2, GPx3,

GPx4 y GPx6).

Todas las enzimas añaden dos electrones a los peróxidos reducidos para

formar selenoles (Se-OH). Las propiedades antioxidantes de las seleno enzimas

permiten la eliminación de peróxidos como potenciales sustratos para la reacción de

Fenton. Por tanto, esta enzima reduce el agua oxigenada o el hidroperóxido

orgánico a agua y alcohol respectivamente, y para ello utiliza en ambos casos el

glutation reducido (GSH) como donante de electrones, el cual está presente en las

células en altas concentraciones:

H2O2 + 2 GSH → 2 H2O +GSSG

ROOH + 2 GSH → ROH + H2O +GSSG

El selenio es fundamental para su actividad, de forma que el déficit de este

elemento en la dieta produce una drástica disminución de la glutation peroxidasa en


17

todos los tejidos. Es responsable de la eliminación del peróxido de hidrógeno en

lugares con baja concentración de catalasa o sin ella, encontrándose por tanto en el

citosol, en la matriz mitocondrial así como en la membrana celular, mientras que la

catalasa es más abundante en microsomas, peroxisomas y núcleo celular. En este

sentido, la GPx1, ampliamente expresada y distribuida, es el mayor “secuestrador”

de H2O2 y de hidroperóxidos lipídicos. Por otra parte, la GPx2 está altamente

expresada en el tracto gastrointestinal, mientras que la GPx6, recién descubierta,

está localizada fundamentalmente en la mucosa olfatoria y en tejidos embrionarios.

La GPx3 está localizada a nivel extracelular, y la GPx4, presente a nivel citosólico,

nuclear y mitocondrial es la mayor responsable de prevenir la oxidación de los

fosfolípidos de la membrana celular.

Esto hace ser a las GPx un importante mecanismo de protección celular contra

el daño oxidativo producido a lípidos de membrana, proteínas y ácidos nucleicos (Ji

et al., 1995).

La GPx necesita GSH para poder realizar su función, oxidándolo a glutation

oxidado (GSSG). Por ello, las células disponen de una vía capaz de regenerar este

GSH, catalizada por la enzima glutation reductasa (GR), la cual consume NADPH

para regenerar el glutation en su forma reducida (Figura 7). La GPx3, además puede

emplear otros sustratos (tiorredoxina o glutarredoxina) como dadores de electrones.

Figura 7 . Ciclo de oxidación-reducción del glutation.


18

La glutation reductasa tiene una distribución celular similar a la de la GPx. Por

tanto, aunque la GR no se considera una enzima antioxidante, hay que reconocer

que su función es esencial para el buen funcionamiento de la GPx.

Eficacia de la triada enzimática: SOD, Catalasa y GPx

La eficacia de esta triada enzimática reside en una triple acción defensiva que

disminuye la producción de estas especies oxigénicas, impide la interacción de éstas

entre sí, evitando dar lugar a especies de mayor reactividad, e impide la

peroxidación de las macromoléculas (Figura 8).

La SOD es la responsable de la reacción de dismutación del O2˙¯ a H2O2, que

en una reacción posterior catalizada por la catalasa o la glutation peroxidasa (GPx)

detoxificará formando H2O y O2. La catalasa se encuentra principalmente en los

peroxisomas, y su principal función es eliminar el H2O2 generado en la β-oxidación

de los ácidos grasos, mientras que la glutation peroxidasa degradará el H2O2

citoplasmático (Trachootham et al., 2008).

Figura 8. Mecanismo de acción de la triada enzimática.

Sistema Tiorredoxina

El sistema antioxidante tiorredoxina es uno de los mayores sistemas de control

redox que existe tanto a nivel de citoplasma celular como a nivel mitocondrial, siendo

su estructura y funcionalidad en ambas localizaciones muy similar.


19

Este sistema está compuesto por tres proteínas: la tiorredoxina, la tiorredoxina

reductasa y la tiorredoxina peroxidasa (Holmgren and Bjornstedt, 1995).

La tiorredoxina (Trx) es una oxidorreductasa que cataliza la reducción de

puentes disulfuro, con lo que juega un papel importante en la regulación del estado

redox de los tioles de las proteínas (Nakamura et al., 1997; Sen, 1998).

La tiorredoxina citoplasmática (Trx-1) posee una secuencia de aminoácidos en

el sitio catalítico que incluye dos residuos de cisteína en las posiciones 32 y 35.

Éstos pueden ser oxidados reversiblemente formando un puente disulfuro, el cual

puede ser a su vez reducido por la tiorredoxina reductasa citoplasmática (TrxR-1) en

presencia de NADPH (Zhong et al., 2000; Zhong and Holmgren, 2000). De esta

forma, la tiorredoxina interviene en la reparación de proteínas con grupos sulfhidrilo

(Holmgren, 1989; Starke et al., 1997), tal y como se describe en el esquema de

reacción:

Trx-(SH)2 + proteína-S2 → Trx-S2 + proteína-(SH)2

Trx-S2 + NADPH + H+ → Trx-(SH)2 + NADP+

En concreto, el sistema de la tiorredoxina está implicado en la prevención de la

oxidación y/o reparación de algunas enzimas metabólicas como la glucosa-6 fosfato

deshidrogenasa, la fosfofructo quinasa, la fosfoglicerato quinasa y la piruvato

quinasa (Starke et al., 1997), así como enzimas que forman parte de la familia de las

peroxirredoxinas y que son oxidadas por los radicales peróxido (Rhee et al., 2005).

La tiorredoxina reductasa es capaz además de regenerar el ascorbato, el cual

es un antioxidante no enzimático de gran importancia.

Por su parte, la tiorredoxina peroxidasa es una enzima citosólica capaz de

transformar el peróxido de hidrógeno y los alkilohidroperóxidos en agua y alcohol

(Netto and Stadtman, 1996), así como de limpiar los radicales tiilo de las células.

La tiorredoxina citoplasmática (Trx-1) además posee tres residuos adicionales

de cisteína en posiciones 62, 69 y 73. Estas cisteínas han sido relacionadas con

funciones estructurales, pero además ciertas modificaciones post-transduccionales


20

contribuyen a atribuirlas funciones relativas a procesos de regulación celular

(Haendeler, 2006).

De esta forma, la tiorredoxina, a través de mecanismos de regulación redox

posee control sobre factores de transcripción que intervienen en la proliferación y

muerte celular (Arner and Holmgren, 2000; Powis and Montfort, 2001; Tonissen and

Di Trapani, 2009). Así, la tiorredoxina es capaz de alcanzar el núcleo celular y

regular la actividad de varios factores de transcripción, incluyendo el NF-κB,

mediante reducción de un residuo de cisteína requerido para su unión al DNA. Este

factor controla la expresión de numerosos genes de estrés entre los que se

encuentran alguno con funciones antiapoptóticas (Shishodia and Aggarwal, 2002).

Otro factor de transcripción regulado por tiorredoxina es p53, el cual controla la

expresión de genes apoptóticos. Por tanto, cuando p53 es requerido para inducir

apoptosis en respuesta a un estimulo específico, se requiere la intervención de la

tiorredoxina. Este papel proapoptótico es directamente opuesto a otras funciones ya

descritas, y por lo tanto, para que en las células cancerígenas tome ventaja la

función antiapoptóticas de la tiorredoxina, el gen p53 suele estar inactivado (Arner

and Holmgren, 2006; Roos and Kaina, 2006).

Asimismo, la tiorredoxina es excretada al exterior celular (Soderberg et al.,

2000) donde interactúa con otros factores que estimulan el crecimiento celular e

intervienen en funciones de regulación de la inmunidad (Angelini et al., 2002) (Figura

9).

Figura 9. Mecanismo de acción del sistema tiorredoxina.


21

Por tanto, el sistema tiorredoxina, en un delicado equilibrio, puede dirigir a las

células hacia la apoptosis o bien protegerlas de la muerte celular. Esto es

particularmente relevante en el cáncer, donde el uso de las funciones

antiapoptóticas de este sistema puede proporcionar a las células cancerígenas una

importante ventaja protectora y funcional. Asimismo, en base a esto se han diseñado

y se plantean posibles estrategias terapéuticas cuyo objetivo es la alteración de los

niveles y funcionamiento de este sistema y en consecuencia promover la apoptosis

celular (Powis and Kirkpatrick, 2007; Sun and Rigas, 2008).

1.1.1.2. Antioxidantes no enzimáticos

1.1.1.2.1. Endógenos

Se agrupan en diversos tipos de moléculas, cuya acción defensiva dependerá,

en algunos casos, de una interacción directa sobre la especie reactiva para rendir

complejos estables o de menor reactividad, siendo por tanto, componentes que

reaccionan directamente con agentes oxidantes y los inutilizan. A tales antioxidantes

se les conoce como “scavengers”, y su papel es suicida. En otras ocasiones, los

antioxidantes actúan como moléculas coenzimáticas en la acción catalítica de

algunas enzimas.

Glutation

El glutation reducido (GSH) es la fuente más abundante de tioles no proteicos

en las células (más del 90%) (Masella et al., 2005; Meister and Anderson, 1983),

siendo el antioxidante celular no enzimático más importante. El GSH es el tripéptido

gamma-glutamil-cisteinilglicina.

Esta molécula tiene dos características estructurales fundamentales, las cuales

le proporcionan muchas de las propiedades biológicas. Por una parte, la presencia

del enlace peptídico en posición gamma lo hace resistente a las peptidasas

presentes en la célula, las cuales sólo actúan sobre los enlaces amino-acilo. Este

enlace gamma-glutamilo entre el glutamato y la cisteína sólo es hidrolizable por el

enzima gamma-glutamil transpeptidasa (GGT), presente en la membrana

plasmática. Por otra parte, la segunda característica estructural importante es la


22

presencia del grupo tilo de la cisteína, el cual se puede oxidar con otra molécula de

GSH dando lugar al glutation disulfuro u oxidado (GSSG), o con otros grupos tiólicos

como los residuos de cisteína de las proteínas (Pastore et al., 2003).

El contenido de GSH en los distintos tejidos varía dependiendo de la función

del tejido. Dado que es un tripéptido, tras su ingesta es degradado en el intestino

delgado, por lo que su contenido en la dieta no influye en sus niveles celulares.

La síntesis y degradación del GSH forma el ciclo del gamma-glutamilo. El GSH

es sintetizado en el hígado por la acción de dos enzimas, gamma-glutamil cisteína

sintetasa y la glutation sintetasa (Meister, 1983) y una vez formado es transportado a

los tejidos a través de la sangre.

Para llevar a cabo la reacción, la gamma-glutamil cisteína sintetasa requiere la

presencia de iones Mg2+, siendo la etapa limitante en la síntesis de GSH y es

inhibida por el glutation mediante un mecanismo de retroalimentación negativo. La

cisteína es el sustrato limitante de la reacción de síntesis del GSH, de forma que

aumentando la disponibilidad de cisteína mediante la administración de N-

acetilcisteína se aumenta la concentración intracelular de GSH (Anderson, 1997).

A continuación, la glutation sintetasa cataliza la unión de glicina a la gamma-

glutamil cisteína para lo que requiere iones K+ y ATP.

La degradación del GSH tiene lugar fuera de la célula y es llevada a cabo por la

gamma-glutamil transpeptidasa y por las dipeptidasas, las cuales están unidas a la

superficie externa de la membrana celular. Los sustratos para la degradación

pueden ser tanto el GSH, como el GSSG, como S-conjugados del GSH. La

transpeptidación requiere de la presencia de aminoácidos, obteniendo como

resultado gamma-glutamil aminoácidos, los cuales son transportados al interior

celular, donde son los sustratos de la enzima intracelular gamma-glutamil

ciclotransferasa, que da lugar a la 5-oxoprolina y el correspondiente aminoácido

libre. La 5-oxoprolina es transformada a glutamato por la 5-oxoprolinasa.

A su vez, la síntesis de GSH puede realizarse saltando la reacción de gamma-

glutamil cisteína sintetasa mediante la internalización a la célula de la gamma-


23

glutamil cistina extracelular, para ser reducida y formar cisteína y gamma-glutamil

cisteína. Éstas son sustrato para la gamma-glutamil cisteína sintetasa y para la

glutation sintetasa respectivamente (Anderson, 1997) (Figura 10).

Figura 10. Ciclo de síntesis y degradación del glutation.

Algunos autores han postulado que el ciclo del gamma-glutamilo es un sistema

de transporte de aminoácidos a través de la membrana (Cornell and Meister, 1976).

Sin embargo, el GSH es una sustancia que tiene otras funciones importantes, como

su papel como antioxidante, interactuando fácilmente con una amplia gama de

radicales libres cediendo un protón.

Una de las funciones antioxidantes más importantes del GSH es la eliminación

del peróxido de hidrógeno y los peróxidos orgánicos en la reacción catalizada por la

glutation peroxidasa (GPx) (Takebe et al., 2002), en la que dos moléculas de GSH

donan dos átomos de hidrógeno para dar lugar a glutation oxidado (GSSG), el cual

posteriormente es reducido por la glutation reductasa (GR) para restaurar el GSH

(Figura 11). De esta forma, la concentración de GSSG en la célula se mantiene a

niveles muy bajos (Schafer and Buettner, 2001).


24

Figura 11. Mecanismo de acción del glutation.

El GSH también está implicado en la reducción de varios antioxidantes

celulares, como por ejemplo el radical vitamina E y el radical semidehidroascorbato

(radical de la vitamina C).

Además, el GSH está implicado en la síntesis del DNA. En este proceso los

ribonucleótidos son transformados a desoxirribonucleótidos por la enzima

ribonucleótido reductasa. Los agentes reductores en esta reacción son la

tiorredoxina o la glutarredoxina (Holmgren, 1979), que es dependiente a su vez del

GSH.

La síntesis y degradación de las proteínas también se ven afectadas por el

GSH, de forma que las fases de iniciación y elongación del proceso de traducción

que tienen lugar en la síntesis proteica se inhiben cuando el GSH se oxida (Ochoa,

1983). Los responsables de la inhibición de la síntesis proteica pueden ser tanto la

depleción del GSH, como el incremento del GSSG, como ambos a la vez.

Por otra parte, el GSH contribuye al mantenimiento del estado redox celular, al

cual son sensibles las proteínas. Éstas cambian su función y conformación ante

variaciones en el estado redox, siendo más susceptibles de degradación cuando

éste es más oxidante (Droge, 2002a). Por tanto, y debido al cambio de conformación

que pueden sufrir algunas proteínas enzimáticas alterando su función, el GSH, en la

medida en que conserva los tioles proteicos, permite mantener la conformación y

regular la actividad de enzimas metabólicas importantes, evitando la formación de

disulfuros mixtos y puentes disulfuros.


25

El GSH está también implicado en otras funciones como la detoxificación de

xenobióticos, especialmente de sustancias electrófilas como epóxidos, alquenos y

metales pesados, como el caso de la metabolización del paracetamol (Vina et al.,

1980). Además, actúa como cofactor para algunas enzimas y es reservorio de

cisteína, ya que incluso a concentraciones no excesivamente altas, es tóxica para la

célula.

En varias etapas de la respuesta inmune es requerido el GSH, actuando a nivel

intracelular de las células T, consiguiendo aumentar la citotoxicidad de éstas

mediante mecanismos de activación, proliferación y diferenciación celular (Multhoff

et al., 1995). Diferentes estudios han mostrado como no sólo un aumento de la

concentración del GSH intracelular puede activar la citotoxicidad de estos linfocitos,

si no que una disminución de este tripéptido puede inhibir la activación celular,

suprimiendo sus funciones citotóxicas y aumentando su susceptibilidad (Hollins et

al., 2006).

El GSH juega un papel fundamental en el estado redox celular, del que también

dependen numerosos procesos de señalización celular. De esta forma, el GSH está

implicado en la regulación de la activación de varios factores de transcripción como

el factor nuclear NF-κB, con funciones antiapoptóticas (Lou and Kaplowitz, 2007), y

el factor AP-1, responsable de la activación de numerosos genes implicados en

proliferación y diferenciación celular y por tanto relacionados con carcinogénesis y

cáncer.

1.1.1.2.2. Antioxidantes presentes en el plasma

Los antioxidantes fundamentales presentes en el plasma son: bilirrubina, urato,

ascorbato, ceruloplasmina y ferritina.

Bilirrubina

La bilirrubina es un tetrapirrol lineal (unido a la albúmina) y producto final de la

degradación del grupo hemo. Es un antioxidante liposoluble y por tanto capaz de

inhibir la lipoperoxidación. Se le considera de gran importancia fisiológica como

antioxidante, sobre todo en el recién nacido en los que se ha visto que la


26

hiperbilirrubinemia neonatal reduce el daño oxidativo producido por la hiperoxia.

Como antioxidante, la bilirrubina rivaliza en las membranas con la vitamina E. Se

oxida a biliverdina al captar radicales hidroperóxido y éste finalmente se reduce para

dar la bilirrubina.

Ácido Úrico

El ácido úrico es el producto final del metabolismo de las purinas en el ser

humano y otros primates, ya que carecen de la enzima uricasa, la cual hace que

continúe la degradación hasta alantoína y urea. Como consecuencia de lo anterior,

el ser humano presenta una concentración plasmática de ácido úrico más de diez

veces superior a la encontrada en la mayoría de los mamíferos. El anión

monovalente urato es la forma en que se encuentra más del 99% del ácido úrico a

pH fisiológico.

La dieta puede ser una importante fuente de ácido úrico, ya que la ingestión de

purinas hace que éstas sean transformadas en ácido úrico por la xantina

oxidorreductasa presente en la mucosa intestinal, de forma que las purinas ingeridas

no aparecen en sangre, sino su derivado el ácido úrico.

Es por todo lo anterior por lo que el ácido úrico no parece que sea simplemente

un producto de desecho de una vía metabólica, si no todo lo contrario, ya que puede

funcionar como un antioxidante suicida clásico y como quelante de metales de

transición. Por su unión al hierro y/o cobre, el ácido úrico puede inhibir las

reacciones de oxidación catalizadas por metales sin que llegue a ser oxidado. El

urato es un eficaz eliminador de derivados del oxígeno muy reactivos y perjudiciales

como el radical hidroxilo y el superóxido e intermediarios oxigenados del hemo. El

urato es tan eficaz como el ascorbato como antioxidante. Es de interés que más del

30% de la capacidad antioxidante del plasma del hombre se debe al ácido úrico.

Así, se ha correlacionado positivamente la concentración de ácido úrico en

plasma de distintas especies con su esperanza de vida (Cutler, 1984) y a una

disminución en la incidencia de cáncer.


27

Queda claro por tanto que, algunos productos finales de las vías metabólicas

degradativas, como el urato y la bilirrubina, han evolucionado para ejercer una

acción beneficiosa en el organismo.

Proteínas secuestradoras de metales: Ferritina, ceruloplasmina y albúmina

Recordar que metales de transición como el hierro y el cobre implican

autooxidaciones y reacciones que conllevan la producción del radical hidroxilo desde

el superóxido, por eso es importante el papel de proteínas quelantes de metales

como antioxidantes preventivas, contribuyendo significativamente en la capacidad

antioxidante de los fluidos corporales.

La ceruloplasmina es una proteína que une el cobre en el plasma jugando un

papel importante como barrera en la generación de ROS en el flujo sanguíneo y

actuando por tanto como antioxidante. Su actividad bloquea el daño de oxidación a

lípidos, a proteínas y DNA, eliminando intermediarios reactivos como el peróxido de

hidrógeno.

La ferritina es la proteína de almacenamiento del hierro en los mamíferos,

actuando como antioxidante al prevenir la reacción de Fenton. Juega un papel muy

importante como antioxidante citoprotector del endotelio y protege del daño oxidativo

mediado por fagocitos.

La albúmina desempeñaría un papel en este contexto por su alta capacidad

para transportar cobre.

1.1.1.2.3. Exógenos: Antioxidantes presentes en la dieta

Ascorbato (ácido ascórbico o vitamina C)

La vitamina C o ácido ascórbico se considera uno de los antioxidantes

naturales más efectivos y menos tóxicos, y es el antioxidante extracelular más

importante (Carr and Frei, 1999; Kojo, 2004).

Es una vitamina hidrosoluble, y al contrario que la vitamina E, funciona mejor

en medios acuosos. A pH fisiológico la forma predominante es el anión ascorbato,


28

estando presente en todos los tejidos, pero es especialmente abundante en el tejido

adrenal.

La vitamina C como antioxidante tiene una doble importancia. En primer lugar

como agente antioxidante capaz de neutralizar los radicales superóxido (Hemila and

Wikstrom, 1985; Nishikimi, 1975), hidroxilo, oxígeno singlete (Bodannes and Chan,

1979) y lipohidroperóxido. Sin embargo, no es buen antioxidante frente al peróxido

de hidrógeno, potenciando de hecho su generación mediante la inhibición de la

catalasa. En segundo lugar, como agente fundamental en la regeneración de la

vitamina E (Machlin and Bendich, 1987; Packer et al., 1979) y el urato. Al reciclar la

vitamina E, se consume el ascorbato pasando a radical ascorbato, el cual puede ser

a su vez reciclado por la NADH semiascorbil reductasa o por tioles celulares como el

glutation o el ácido dihidrolipoico (Sevanian et al., 1985).

Este doble papel es posible gracias a la facilidad con la que cede dos

electrones dando lugar al dehidroascórbico. De esta forma, se combina con un

radical libre, dando como resultado que la vitamina pierda o de dos hidrógenos y un

par de electrones y se convierta en ácido dehidroascórbico. En consecuencia, el

radical libre se reduce. La conversión del ácido ascórbico a ácido dehidroascórbico,

es un proceso reversible y se ha postulado la existencia de una reductasa específica

para explicar la reacción opuesta. En este sentido, el ácido dehidroascórbico es

inestable y su presencia como tal se detecta solamente durante breves periodos de

tiempo. Constituye en sí mismo una molécula potencialmente tóxica que

metabolicamente puede revertir a ácido ascórbico o modificarse irreversiblemente en

un subproducto que se excreta por orina.

El incremento de los niveles celulares de vitamina C aumenta la protección

contra los radicales libres, sin embargo, en concentraciones altas, la vitamina C tiene

un efecto prooxidante en presencia de metales de transición como el Fe 3+ o el Cu 2+.

La acción prooxidante de la vitamina C reside en su capacidad para reducir el hierro

férrico o ferroso, el cual es un potente inductor de radicales, por lo que la utilización

de megadosis de vitamina C ha sido cuestionada por algunos autores.


29

Vitamina E

La vitamina E es el antioxidante más abundante en la naturaleza. El término

vitamina E aglutina al menos ocho isómeros estructurales de tocoferoles y

tocotrienoles. Entre ellos, el α–tocoferol es el más estudiado y el que tiene mayor

actividad antioxidante.

Debido a su alta liposolubilidad, la vitamina E se asocia a membranas ricas en

lípidos, como la membrana mitocondrial, la del retículo plasmático o la membrana

plasmática, protegiéndolas frente a la oxidación (Bisby and Parker, 1991). Aunque

habitualmente la cantidad de vitamina E en las membranas es baja, la

suplementación dietética puede aumentar su contenido.

Es considerado el principal antioxidante secuestrador de radicales lipofílicos in

vivo (Burton and Ingold, 1989; Pryor, 2000). La acción antioxidante de la vitamina E

reside en su capacidad para neutralizar los radicales superóxido, hidroxilo y

lipoperoxilo a formas menos reactivas, además de ser capaz de romper la reacción

en cadena de lipoperoxidación que ocurre en el daño oxidativo a las membranas

(Burton et al., 1990).

Su acción antioxidante viene dada por el grupo fenólico en posición 6, de forma

que el hidrógeno del grupo oxidrilo reacciona con los radicales. El grupo –OH del

anillo aromático de la vitamina puede experimentar reacciones de oxidación

perdiendo bien un electrón o un ión hidruro, en este caso la vitamina se convierte en

un radical libre relativamente estable que posteriormente puede sufrir una reacción

de oxidación que convierte el anillo central en un núcleo quinónico. Así, la vitamina E

se oxida y se inutiliza, haciéndose incapaz de llevar a cabo posteriores efectos

antioxidantes y junto con otros metabolitos se elimina por la orina.

Sin embargo, por su parte el radical vitamina E es reciclado a vitamina E a

costa de diversos antioxidantes, como el glutation o el ascorbato y esto es muy

importante, ya que regenera o ahorra vitamina E y también reduce el carácter

prooxidante del radical de vitamina E (Figura 12) (Abudu et al., 2004; Brigelius-Flohe

and Traber, 1999).


30

Figura 12. Mecanismo de acción de la vitamina E.

Otras posibilidades de eliminación del radical tocoferoxílico son las reacciones

con otro radical tocoferoxílico para dar lugar a un dímero. De esta forma protege a

las células de la peroxidación de membranas y su posterior degeneración, impide el

daño oxidativo de las lipoproteínas LDL, proteínas celulares y DNA (Topinka et al.,

1989).

Una dieta deficiente de vitamina E está relacionado con una reducción de la

actividad de catalasa hepática, GSH peroxidasa, y glutation reductasa, induce la

peroxidación lipídica en hígado y causa desordenes cardiovasculares y neurológicos

(Carr and Frei, 2000; Muller, 1990).

Carotenoides

Los carotenos son un conjunto de pigmentos aislados de plantas y algunos de

ellos como el alfa, beta y gamma carotenos son precursores de la vitamina A. Son

antioxidantes liposolubles situados principalmente en las membranas. Las

propiedades antioxidantes de los carotenoides residen en su estructura, formada por

largas cadenas de dobles enlaces conjugados. El carotenoide es modificado

químicamente en esta interacción y los productos resultantes son antioxidantes

menos activos. Esta disposición permite neutralizar diversos ROS, incluido el radical

superóxido y radicales peroxilo. De hecho, los carotenoides son capaces de reducir

la peroxidación lipídica provocada por los radicales libres (Young and Lowe, 2001).

El más frecuente e importante es el β-caroteno, que posee actividad

antioxidante (Krinsky, 1989) y se ha descrito como el más importante neutralizador

del oxígeno singlete aislado de la naturaleza.


31

Ácido α-lipoico

Se considera un antioxidante ideal o universal, que es absorbido por la dieta y

es antioxidante frente a un elevado número de radicales libres en medios lipídicos y

acuosos y puede ejercer su actividad mediante la capacidad de quelar metales de

transición.

Tras la ingesta el ácido α-lipoico se reduce a ácido dihidrolipoico (DHLA), el

cual es un potente antioxidante contra los radicales más importantes, además de

participar en el reciclaje de la vitamina C, proceso por el que el DHLA es convertido

en ácido α-lipoico (Packer, 1994).

Polifenoles

Los compuestos polifenólicos constituyen uno de los grupos más importantes

de metabolitos de origen vegetal presentes en la dieta. Dentro de los polifenoles, los

flavonoides constituyen el grupo más importante, descritos más de 4.000

compuestos y divididos en 13 clases. Todos ellos tienen en común una parte de

estructura difenilpropano consistente en dos anillos aromáticos unidos a través de

tres átomos de carbono formando un heterociclo oxigenado.

De unos años a esta parte ha aumento grandemente el interés por este tipo de

compuestos, particularmente por los flavonoides, debido a que su capacidad

antioxidante proporciona efectos beneficiosos en la salud, destacando su papel en el

tratamiento y prevención del cáncer así como en desordenes cardiovasculares y

neurodegenerativos (Rice-Evans, 2001; Schroeter et al., 2002).

Su actividad antioxidante resulta de una combinación de sus propiedades

quelantes de metales de transición y secuestradoras de radicales libres (Bravo,

1998). Esta capacidad antioxidante está relacionada con la rápida donación de un

átomo de hidrógeno al radical libre, formándose un compuesto intermedio fenoxi

radical.

No obstante, bajo determinadas condiciones, como por ejemplo una elevada

concentración de polifenoles, la presencia de metales redox como cobre y hierro y

un elevado pH, puede hacer que se comporten como agentes pro-oxidantes.


32

Tanto la naturaleza como la posición de los sustituyentes, así como el número

de grupos hidroxilos que conforman la estructura del polifenol, condicionan si a nivel

fisiológico actuará como un antioxidante o como un modulador de la actividad

enzimática o si por el contrario poseerá propiedades antimutagénicas o citotóxicas

(Galati and O'Brien, 2004).

Por otra parte, además cabe destacar el papel de los polifenoles inhibiendo

enzimas tales como oxidasas, lipooxigenasas, ciclooxigenasas, mieloperoxidasas,

NADPH oxidasas y xantina oxidasas, evitando así la generación de especies

reactivas del oxigeno in vivo, así como de hidroperóxidos orgánicos (Rice-Evans et

al., 1996; Rivero et al., 2005).

Por otra parte se ha podido conocer que también inhiben enzimas involucradas

indirectamente en los procesos oxidativos, como la fosfolipasa A2, al mismo tiempo

que estimulan otras con reconocidas propiedades antioxidantes, la catalasa y la

superóxido dismutasa. De esta forma los polifenoles interfieren en las reacciones de

propagación de radicales libres y en la formación del radical en sí.


33

1.2. CÁNCER COLORRECTAL

En términos absolutos, el cáncer es la primera causa de muerte en España,

con 96.499 muertes en el año 2005 (60.701 en hombres y 35.798 en mujeres), lo

que supuso el 30,3% de todas las defunciones de hombres y el 19,4% de las de las

mujeres, lo que es lo mismo, el cáncer fue la causa del fallecimiento de uno de cada

tres hombres y de una de cada cinco mujeres.

La edad media de los pacientes que fallecen por un cáncer es de 69,3 años

para los hombres y 69,7 para las mujeres.

Desde el año 2000, el cáncer ha pasado a ser la primera causa de muerte en

hombres para el conjunto de España y para las Comunidades Autónomas de

Aragón, Asturias, Cantabria, Castilla-León, Galicia, Madrid, Navarra, País Vasco y

La Rioja. En mujeres, aunque aún se sitúa en segundo lugar, después de las

enfermedades cardiovasculares, el cáncer presenta una tasa truncada ajustada

(para los grupos de edad de 35 a 64 años) 3 veces mayor que aquéllas, y provoca el

mayor número de años potenciales perdidos (Lopez-Abente et al., 2004), siendo la

más baja de Europa, y de las más bajas del mundo desarrollado (Levi et al., 2004).

El envejecimiento de la población, el incremento de la incidencia de muchos

tumores malignos y la mejor supervivencia de los enfermos de cáncer debida a los

avances diagnósticos y terapéuticos, han supuesto un aumento significativo de la

prevalencia.

A diferencia de lo que sucede con la mortalidad, no hay registro sistemático y

continúo de todos los nuevos casos de cáncer que aparecen anualmente en España.

Es decir, no hay un Registro de Cáncer de Población Nacional, aunque sí existen

varios registros de este tipo a nivel provincial o autonómico, que en conjunto reúnen

la incidencia de cáncer en alrededor del 25% de la población española. Estos datos

se recogen en una publicación (Cancer Incidence in Five Continents) editada cada 4-

6 años por la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer (IARC), organismo

dependiente de la OMS (Pisani et al., 2002). A partir de ellos, diversos autores

elaboran estimaciones de la incidencia del cáncer en toda España.


34

Según estas estimaciones, en el año 2002 se diagnosticarían en España

aproximadamente 162.000 nuevos casos de cáncer, 97.800 en hombres y 64.000 en

mujeres (razón de sexo 1,5:1). La incidencia global en España se puede considerar

media-alta para el sexo masculino y media-baja para el femenino.

El mayor número de pacientes con cáncer tienen entre 65 y 75 años. Entres los

30 y los 45 hay más mujeres que hombres entre los enfermos, debido sin duda a la

frecuencia del cáncer de mama en estas edades.

En cuanto a la supervivencia del cáncer en España, el estudio EUROCARE-3

(European Cancer Registry Study of Survival and Care of Cancer Patients) analizó

en el año 2003 la supervivencia de 1.800.000 adultos y 25.000 niños enfermos de

cáncer pertenecientes a 22 países europeos (Coleman et al., 2003; Sant et al.,

2003). Así, un 44% de los hombres y un 56,4% de las mujeres que sufren cáncer en

España sobreviven más de 5 años. La supervivencia ha mejorado aproximadamente

un 10% entre la década de los 80 y la de los 90, esperando que esta tendencia

continúe para la mayoría de los tumores. Dentro del contexto europeo, la

supervivencia del cáncer en España es comparable a la de los países más

desarrollados, situándose en casi todas las localizaciones por encima de la media

europea (Boyle and Ferlay, 2005a).

El cáncer colorrectal (CCR) es la enfermedad causada por un crecimiento

incontrolado que se produce en las células del colon y/o recto, con capacidad para

invadir órganos y tejidos y diseminarse a distancia, tercero en frecuencia entre los

hombres en países desarrollados (tras los tumores de pulmón y próstata), y el

segundo entre las mujeres (tras el cáncer de mama), con aproximadamente

1.000.000 de nuevos casos al año en todo el mundo (550.000 hombres y 470.000

mujeres), representando el 9,5% del total de los tumores, tratándose por tanto del

tumor más frecuente de todos en términos absolutos.

Se estima que en España se diagnostican al año unos 25.600 casos nuevos de

cáncer colorrectal (Lopez-Abente et al., 2004), lo que representa el 12,7% de los

tumores del sexo masculino (12.500 casos) y el 15% de los femeninos (9.500 casos)

(Figura 13). La incidencia en nuestro país se puede considerar alta en ambos sexos

y su tendencia es a aumentar, con más celeridad en el sexo masculino. Sin


35

embargo, en un contexto exclusivamente europeo, la incidencia en España se puede

considerar media-baja.

Figura 13 . Estimaciones de nuevos casos de cáncer en España año 2002.

La mayoría de los casos se diagnostican entre los 65 y los 75 años, con un

máximo a los 70, aunque se registran casos desde los 35-40 años, tal y como refleja

la figura 14.

Figura 14 . Distribución del cáncer colorrectal por grupos de edad.

En cuanto a datos de supervivencia, aproximadamente un 54% de los

pacientes que sufren cáncer colorrectal en España sobreviven más de cinco años,

sin tener en cuenta edad, tipo histológico o fase de la enfermedad.


36

En el caso de los hombres, la supervivencia se sitúa en torno al 53%, muy

similar a la de las mujeres (55%), siendo ligeramente superior a la media europea,

que se sitúa en torno al 50% a los cinco años, y próxima o superior a la de los

países más desarrollados, como Suiza, Francia o Alemania.

La supervivencia ha mejorado en la última década (44% para casos

diagnosticados entre 1980 y 1985, y 54% para los diagnosticados entre 1990 y

1994), y se espera que esta tendencia continúe.

El cáncer colorrectal fue la causa de aproximadamente 530.000 muertes en

todo el mundo en el año 2002, siendo la segunda causa de muerte por cáncer en los

países desarrollados, tanto entre los hombres (7,3% del total de fallecimientos por

tumores malignos), tras el cáncer de pulmón, como entre las mujeres (8,5% del total

de muertes por cáncer), tras el de mama (Boyle and Ferlay, 2005b).

En España, según datos del Área de Epidemiología Ambiental y Cáncer, en el

año 2005 fallecieron 12.917 personas por su causa, 7.461 hombres (el 12,3% de

todas las muertes por cáncer y el 3,7% del total de muertes) y 5.456 mujeres (el

15,2% de las muertes por cáncer y el 2,9% del total de muertes), siendo por tanto la

segunda causa de muerte por cáncer en España (Figuras 15 y 16).

Figura 15 . Mortalidad hombres por cáncer colorrectal en España año 2005.


37

Figura 16 . Mortalidad mujeres por cáncer colorrectal en España año 2005.

La mortalidad en España, comparada con el resto del mundo (Fernandez et al.,

2005), se puede considerar alta para ambos sexos. En los países desarrollados la

mortalidad por cáncer colorrectal comienza a descender desde los años 90,

probablemente debido a cambios en la dieta y en el estilo de vida, así como a

diagnósticos más precoces y mejores tratamientos. No obstante en los países

mediterráneos, y con ellos España, la mortalidad por este tumor sigue aumentando

entre los hombres españoles mientras permanece casi estable entre las mujeres

(2,6% de incremento anual entre los hombres y 0,8% entre las mujeres).

Respecto a la situación en Castilla y León, salvo datos relativos a mortalidad,

apenas existen datos y registros oficiales sobre incidencia y supervivencia tanto en

cáncer en general como en el caso del tumor colorrectal.

Atendiendo a los datos de mortalidad para el periodo 1996-2000, la tasa de

mortalidad por cáncer de colon en Castilla y León se sitúa tanto en hombres como

en mujeres en torno a la tasa media española, siendo bastante más inferior en

mujeres que en hombres (Figura 17), como ya se ha comentado con anterioridad.


38

Figura 17 . Tasa de mortalidad por cáncer de colon en España (años 1996-2000).

En Castilla y León, el cáncer colorrectal en el caso de los hombres, supone la

segunda causa de muerte por cáncer, al igual que la media española. Sin embargo,

en el caso de las mujeres, la muerte por cáncer colorrectal ocupa el primer puesto,

relegando a un segundo lugar al cáncer de mama, primera causa de muerte por

cáncer en España (Figura 18).

Figura 18 . Mortalidad por cáncer en Castilla y León año 2004 (mujeres y hombres).

A continuación se describen diferentes aspectos relacionados con el cáncer

colorrectal de relevancia para el desarrollo de la presente tesis doctoral.

Desde un punto de vista histológico, más del 90% de los tumores colorrectales

se originan en las glándulas, denominándose adenocarcinomas y atendiendo al

grado de diferenciación de las células, se pueden dividir en pobremente,

moderadamente y altamente diferenciado, siendo el más agresivo de los tres grados

el adenocarcinoma pobremente diferenciado.


39

Desde el punto de vista del estadío se pueden agrupar en cuatro clases o

grupos, donde generalmente el I son tumores pequeños sin afectación ganglionar ni

diseminación, el II cuando el tumor invade el tejido próximo, el III cuando hay mayor

invasión local y afectación de ganglios linfáticos, y el IV son casos en los que ya se

ha producido metástasis.

1.2.1. Factores de riesgo en cáncer colorrectal. Ca usalidad

Las diferencias observadas en la incidencia del cáncer colorrectal entre las

áreas geográficas, la evidencia del distinto riesgo generacional y la modificación de

la incidencia en los emigrantes, plantea una causalidad basada primordialmente en

factores medio ambientales, sociales y/o culturales.

Por otra parte, la multiplicidad de factores asociados al CCR y de las hipótesis

que las sustentan, hace imposible precisar en cada enfermo una causa suficiente.

Los factores asociados al CCR se pueden resumir en cuatro grupos: factores

biológicos (hereditarios, patología intestinal y otros); factores medioambientales o

sociales (de riesgo o de protección) (Levi, 1999); intervenciones médicas y factores

etiopatogénicos (Vines et al., 2003).

Factores biológicos

La herencia tiene escaso impacto en la incidencia poblacional (alrededor de un

5-10% de los casos de CCR) si bien existen casos con componentes hereditarios

como la poliposis adenomatosa familiar (0,01%) y el cáncer colorrectal hereditario no

polipósico (5-10%). No obstante, por su presentación antes de los 50 años y la

indefectible conversión en CCR en el 70 y el 100% de los portadores genéticos

respectivamente, ocasiona una importante pérdida de años potenciales de vida.

Además, el 50% de los descendientes de estos enfermos son portadores de las

anomalías genéticas.

Por otra parte, el CCR hereditario, que afecta solamente a parientes en primer

grado, sólo hijo o hermano, acumula el 20% de los casos de CCR, lo que puede

justificar el seguimiento sistemático preventivo en estas personas (Rustgi, 1994). Los


40

demás parientes tienen la misma probabilidad individual de padecer pólipos

adenomatosos, adenomas y cáncer que la población en general.

Por otro lado, los enfermos que han sido resecados padecen un segundo

cáncer colorrectal primario entre el 1,5 y 3% en los 5 primeros años del post-

operatorio.

El resto de los factores biológicos (diabetes, colecistectomía, otros cánceres

previos, etc.) tienen escasa repercusión epidemiológica, sin perjuicio del interés del

seguimiento clínico individual. Todo ello hace que el 40% de los cánceres

colorrectales que se registran lo sean en personas de alto riesgo, vinculado al

conjunto de factores biológicos, sin perjuicio de que en éstos concurran otros

factores no biológicos, en cuyos pacientes la carga genética representa un factor

componente sin carácter de causa ni suficiente ni necesaria.

Factores medioambientales

La intervención de la dieta constituye la hipótesis más sólida de la causalidad

(Greenwald et al., 2001). El consumo elevado de grasa total, colesterol, proteínas,

calorías, alcohol, tabaco y carne (fundamentalmente roja), y la dieta baja en calcio,

en fibra, en micronutrientes antioxidantes y en ácido fólico se asocian al incremento

de la incidencia del cáncer colorrectal. No obstante, una de las evidencias más

contrastadas sobre la dieta es el consumo alto en grasas/colesterol y la mayor

proporción de secreción de ácidos biliares en intestino pudiendo dar origen a la

formación de sustancias carcinogénicas.

La administración de fibra no ha tenido efecto protector en el adenoma

recurrente, lo que sugiere que la fibra vegetal es un marcador de otros factores

protectores que la acompañan contenidos en vegetales, frutas, legumbres y frutos

secos.

De esta forma, el consumo de estos alimentos, particularmente frutas y

verduras, son fuente de numerosos micronutrientes y cuyo consumo está

relacionado con un menor riesgo. Varios de estos micronutrientes, como el β-

caroteno (precursor de la vitamina A) (van Poppel and Goldbohm, 1995), la vitamina


41

E (Chan et al., 1999), la vitamina C (Ekstrom et al., 2000), el selenio (Finley et al.,

2000), el calcio, la vitamina D (Giovannucci, 2006; Ishihara et al., 2008) y el folato

(Potter, 1999) han sido objeto de numerosos estudios epidemiológicos que han

determinado a estos compuestos como protectores para altos consumidores de

estos alimentos frente a un bajo consumo. Asimismo, tanto los alimentos derivados

de verduras y frutas como integrales contienen multitud de compuestos polifenólicos

con probada actividad antioxidantes y por tanto, con capacidad para reducir el riesgo

de cáncer (Fleischauer et al., 2000; Fournier et al., 1998; Giovannucci, 1999; Kuroda

and Hara, 1999).

En cuanto a los estilos de vida, el consumo de alcohol y el hábito tabáquico se

asocian al incremento del CCR en varios estudios epidemiológicos (Baron et al.,

1998; Knekt et al., 1998) en tanto que la actividad física se manifiesta como

protectora. Sin embargo, esta asociación se encuentra sometida a factores de

confusión como es el sedentarismo y la dieta, el consumo de grasas y carne roja

(Tavani et al., 2000), la masa corporal (Berglund, 2002) y otros factores de estilos de

vida asociados a la propia actividad física, como el bajo consumo de tabaco y el

alcohol.

En cuanto al efecto beneficioso frente al CCR de determinados fármacos o

tratamientos, existen diversos estudios que otorgan un carácter preventivo a

determinados antiinflamatorios no esteroídicos, como por ejemplo la aspirina.

Asimismo, se ha puesto en evidencia el efecto protector en el CCR de los inhibidores

de la reductasa HMG-CoA (familia de las estatinas) que reducen los niveles de

colesterol, lo que corrobora a este lípido como factor de riesgo para el CCR e

inductor de adenomas.

Etiopatogenia

Los hallazgos en los estudios epidemiológicos aportan posibles hipótesis sobre

las causas que producen la patogenia de los diferentes agentes descritos. La

mayoría de los factores de riesgo asociados a determinados hábitos son causantes

de situaciones de estrés oxidativo, bien directamente por ser generadores de

especies reactivas oxidantes o de forma indirecta, ya que llevan consigo la baja


42

ingesta de nutrientes y micronutrientes con capacidad antioxidante como vitaminas,

polifenoles y/o metales que median en procesos de oxidorreducción.

De la revisión de los factores de riesgo o causalidad se concluye por tanto que,

si bien se ha evidenciado en los estudios epidemiológicos, tanto dietéticos, como de

estilos de vida y genéticos, ninguno de ellos justifica una posible intervención

preventiva individual o colectiva, más allá de la recomendación de una vida

saludable: dieta equilibrada, baja en grasas, por debajo del 20% de las calorías y

ejercicio físico con consumo de alcohol moderado y sin hábito tabáquico, por cuanto

no existe una causalidad de suficiente fuerza, coherencia, consistencia, dosis efecto,

ni plausibilidad que permita una intervención eficaz.

1.2.2. Marcadores tumorales. Indicadores de progres ión bioquímica de la

enfermedad

Clásicamente los marcadores tumorales se definen como “sustancias

sintetizadas y segregadas por la célula tumoral, con o sin acción biológica conocida,

que pasan a los líquidos biológicos donde pueden ser dosificadas, proporcionando

información acerca de la existencia de un proceso neoformativo”. En este concepto

se incluyen otras sustancias cuyo origen no es el tumor, sino el organismo en que

asienta y que representan la respuesta del huésped a la presencia de la neoplasia.

Los marcadores tumorales surgieron como una gran esperanza para el

diagnóstico del cáncer, pero el tiempo demostró que estas sustancias no se

encuentran presentes sólo en los pacientes afectos de tumores, sino también en

sujetos sanos, y no siempre son detectables en presencia de las neoplasias, siendo

variable su aparición en función de diversos factores. Esta baja sensibilidad

comporta un escaso valor de los marcadores en el cribado y diagnóstico de los

tumores malignos.

Por tanto, ningún marcador tumoral disponible alcanza el calificativo de

"marcador ideal", entendiéndose como tal, aquél que demuestre alta sensibilidad y

especificidad, fuerte relación entre sus valores y la cantidad de tumor presente y

cuya determinación resulte fácil y económica.


43

A pesar de todo, siguen desarrollando una labor fundamental, que es su

empleo como herramientas de monitorización del curso de la enfermedad

neoplásica. En general, hay presente una relación entre los valores del marcador y

la extensión de la enfermedad, lo que confiere a algunos de ellos utilidad en el

estadiaje y validez pronóstica (Bates, 1989; Bates and Longo, 1987).

Los marcadores tumorales pueden sugerir y apoyar la existencia de un cáncer,

pero ninguno de ellos puede por sí mismo, en ausencia de una prueba histológica

utilizarse como diagnóstico definitivo. La capacidad de los tumores para producir

marcadores tumorales es variable, por tanto no puede excluirse la presencia de un

cáncer porque los valores de un marcador determinado sean normales.

En el año 1996 la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO) publicó

por primera vez, una guía clínica sobre las recomendaciones del uso de marcadores

tumorales en el cáncer gastrointestinal (1996). En los años 2000 y 2006 se han

realizado posteriores revisiones y actualizaciones, estando ésta última vigente para

el manejo de los marcadores en la actualidad (Locker et al., 2006).

Los marcadores tumorales se pueden clasificar en diferentes grupos

atendiendo a diferentes criterios. Cabe destacar la que atiende a si son marcadores

tumorales asociados al tejido o bien si son sustancias de secreción. Así, los

marcadores tumorales tisulares son aquellos que se determinan en la propia célula

tumoral, por diversas técnicas, desde la inmunohistoquímica a técnicas de biología

molecular y que reflejan propiedades de la neoplasia relacionada con su propia

génesis, capacidad proliferativa, potencial metastático y susceptibilidad a la terapia.

En el caso del cáncer colorrectal cabe destacar la relevancia que está teniendo en

los últimos años la determinación del oncogen K-Ras y su influencia en el empleo de

determinados fármacos en su tratamiento, como es el caso de los anticuerpos anti

EFGR cetuximab y panitumumab, cuya eficacia de tratamiento queda limitada a

pacientes con tumores que tienen el oncogen K-Ras sin mutar (Amado et al., 2008).

Por otra parte, los marcadores tumorales de secreción son aquellas sustancias,

que aún con características moleculares y orígenes diversos, presentan una común

asociación con la malignidad. La dosificación de estos marcadores en los líquidos

biológicos tiene aplicaciones clínicas tanto en la detección (cribado, diagnóstico,


44

pronóstico) como en el manejo (seguimiento y monitorización del tratamiento) de los

pacientes con cáncer.

De entre los marcadores tumorales de secreción asociados a cáncer colorrectal

cabe destacar el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el antígeno Ca 19.9.

Antígeno carcinoembrionario (CEA)

Es una glicoproteína oncofetal descubierta por Gold y Freedman en 1965 (Gold

and Freedman, 1965), en pacientes con cáncer de colon. Sin embargo, el CEA no es

un marcador específico de tumor, sino más bien un marcador plasmático asociado a

tumor. Aparece sobreexpresado particularmente en adenocarcinomas de colon y

recto, especialmente en tumores bien diferenciados, pero pueden observarse

incrementos de la cifra de CEA en otros tumores como el cáncer de mama, pulmón,

páncreas, estómago, vejiga y tiroides, entre otros. Incluso pueden observarse

niveles discretamente elevados en ausencia de enfermedades malignas, por

ejemplo, en fumadores, pacientes con tuberculosis pulmonar, enfermedad

inflamatoria intestinal y en hepatopatías, ya que el CEA plasmático se aclara

normalmente a través del hígado.

Las mediciones de CEA se efectúan por radioinmunoanálisis y los niveles

pueden variar según la técnica empleada. Los valores normales habitualmente se

sitúan en torno a 5 ng/mL.

A pesar de las expectativas creadas inicialmente, su baja sensibilidad no le

confiere valor como técnica de screening, en línea con las recomendaciones

realizadas por el European Group on Tumor Markers (EGTM) (Duffy et al., 2003).

Los estudios realizados en los años 70 evidenciaron que la tasa de detección de

cáncer de colon en pacientes asintomáticos era inferior al 4%, con cifras de falsos

positivos inaceptables (Macdonald, 1999).

Por otra parte, a través de diversos estudios se ha podido determinar como el

valor preoperatorio del marcador es una importante variable con carácter pronostico

con importante significancia, incluso después de incluir el estadio y el grado de la

enfermedad en el modelo estadístico (Park et al., 1999a; Park et al., 1999b).


45

Aprovechando que el 85% de los pacientes con cáncer de colon y recto

diseminado presentan elevaciones séricas de CEA, se ha estudiado su valor como

monitor de la eficacia del tratamiento sistémico. Es frecuente observar elevaciones

de CEA en pacientes con progresión de la enfermedad durante el tratamiento

quimioterápico y descensos acompañando a la mejoría. Por lo que en general,

niveles elevados de CEA durante el tratamiento hace necesario reevaluar la

estrategia terapéutica abordada. No obstante, se debe tener mucha precaución a la

hora de interpretar los niveles de CEA durante las primeras de 4 a 6 semanas de un

nuevo tratamiento, especialmente en el caso de empleo de oxaliplatino (Sorbye and

Dahl, 2003, 2004). Además, el aumento de CEA asociado a quimioterapia puede

estar relacionado con alteraciones en las funciones hepáticas provocadas por los

fármacos que componen el tratamiento. Otras causas que elevan valores de CEA

incluyen gastritis, úlcera, diverticulitis, EPOC y otra serie de enfermedades de tipo

inflamatorio.

El área que mayor interés ha despertado en los últimos años ha sido el uso de

CEA en la monitorización de pacientes con cáncer de colon y recto tras resección

potencialmente curativa de su tumor primario. La elevación del marcador en este

contexto, en pacientes asintomáticos permite detectar la recidiva cinco meses antes

de que aparezcan los síntomas (Graham et al., 1998; Pietra et al., 1998).

Es sabido que la resección quirúrgica de las metástasis hepáticas (o

pulmonares), en pacientes bien seleccionados puede conseguir la curación en

aproximadamente un 25% de ellos y que un porcentaje no despreciable pueden ser

detectados a través de la monitorización del CEA (Nelson, 1995). Sin embargo,

todavía no se ha demostrado claramente que este procedimiento conduzca a un

aumento de la supervivencia con respecto a pacientes cuya recaída se detecta en

base a la clínica, aunque el debate sobre este tema está completamente abierto.

Un nivel elevado de CEA constituye una indicación para investigar la recaída,

pero nunca por sí solo para comenzar tratamiento sistémico. Por otra parte, un 30%

de las recaídas ocurren con niveles normales de CEA, sobre todo en tumores

indiferenciados.


46

Antígeno Ca 19.9

El Ca 19.9 es el marcador tumoral gastrointestinal más ampliamente estudiado

después del CEA. El análisis de Ca 19.9 detecta una mucina (glicoproteína) que

contiene el pentasacárido sialato de Lewis y que se encuentra sobreexpresada en

numerosos tipos de células tumorales. Los valores normales habitualmente se sitúan

en torno a 37 UI/mL.

Este marcador parece aportar poca información en la monitorización de

pacientes con carcinoma colorrectal (Ial'chenko et al., 1991). El Ca 19.9 también

puede estar elevado en otros adenocarcinomas como el gástrico, pulmonar,

pancreático o hepatobiliar, y en patología no tumoral de la vía biliar intra y

extrahepática o pancreática.

1.2.3. Tratamiento quimioterápico en cáncer colorre ctal

La quimioterapia consiste en la administración de fármacos con actividad

antitumoral, indicada como tratamiento complementario a la cirugía y/o para

controlar la enfermedad y aliviar los síntomas que produce. Ya no es discutible el

beneficio de la quimioterapia, sino que el dilema actual estriba en decidir cuál es el

mejor tratamiento quimioterápico que puede recibir un paciente en base a las

características que presenta, ya sea inherente a la neoplasia o al propio paciente.

Existen varios fármacos citostáticos con actividad antitumoral para las células

colorrectales (Wolpin and Mayer, 2008). Los principales son las fluoropirimidinas (5-

fluorouracilo y capecitabina), el oxaliplatino, el irinotecan, el cetuximab, el

panitumumab y el bevacizumab. Estos fármacos se pueden administrar solos o bien

combinar entre sí, formando esquemas de quimioterapia cuya eficacia y tolerancia

varían según sus componentes. La combinación de citotóxicos es hoy día un

concepto que parece incuestionable y necesario en el tratamiento del cáncer, si se

quiere obtener una mayor capacidad antitumoral con la mínima toxicidad y evitar en

la medida de lo posible la formación de resistencias.


47

5-Fluorouracilo (5-FU)

Tras el empleo de múltiples fármacos y combinaciones, el 5-FU se situó en la

década de los 70 como el fármaco más activo, y hoy día, tras haber potenciado su

eficacia con la modulación bioquímica (acompañado de ácido folínico) (1992) y con

la infusión continua frente a la administración en bolo (1998), sigue siendo el

citostático de elección en primera línea de tratamiento.

El 5-fluorouracilo, antineoplásico antimetabolito de la uridina (base pirimidínica),

incorpora un átomo de flúor en posición 5 en lugar de hidrógeno. Se han descrito, al

menos, tres vías diferentes por las que el 5-FU puede ejercer sus efectos

antineoplásicos. En primer lugar, mediante la inhibición de la timidilato sintetasa

(Sobrero et al., 2000), enzima esencial para la síntesis de la mayoría de los

nucleótidos de timidina, precursor necesario en la síntesis de DNA. En segundo

lugar, mediante la inhibición de la función del RNA y síntesis proteica y por último,

mediante su incorporación al DNA provocando su ruptura. Dado que tanto el DNA

como el RNA son esenciales para la división y el crecimiento celular, el efecto del 5-

FU provoca un crecimiento desequilibrado y la muerte celular.

Mediante la modulación bioquímica se ha aumentado la actividad antitumoral

del 5-FU gracias a la adicción en el tratamiento de otro fármaco que no tiene

actividad citotóxica intrínseca pero que ayuda a estabilizar el complejo formado por

la enzima y el fármaco, siendo el más empleado el ácido folínico (de Gramont et al.,

1997). La fluorodesoxiuridilato (FdUMP), metabolito del 5-FU se une a la timidilato

sintetasa en presencia del ácido folínico formando un complejo covalente y

produciendo por tanto la inhibición de dicha enzima (Berger and Hakala, 1984),

imprescindible para la síntesis del DNA. En este sentido, se ha postulado que la

cantidad de folato que hay presente en la mayoría de los tumores es insuficiente

para permitir una óptima citotoxicidad del 5-FU.

Capecitabina

Es la primera fluoropirimidina por vía oral, gracias a que posee una estructura

carbamato en su molécula, lo que permite que se absorba en el intestino con rapidez

como molécula intacta.


48

Desde hace varias décadas se han venido investigando diversos análogos del

5-FU con el fin de mejorar su índice terapéutico y la aceptación del tratamiento por

parte del enfermo. En este sentido, se han desarrollado las fluoropirimidinas orales

(Sharma and Saltz, 2000) que presentan mejores características farmacológicas. Por

una parte, su administración oral permite conseguir exposiciones prolongadas de 5-

FU, similares a las que se logran con infusiones continuas. Por otra parte, han

demostrado una eficacia terapéutica superior a la del 5-FU, ya que se consiguen

concentraciones intratumorales más elevadas debido a una mayor activación

selectiva en el tumor y una disminución de la exposición general, con la consiguiente

mejoría del perfil de seguridad.

La capecitabina se comporta como un profármaco del 5-FU. Para activarse

requiere tres enzimas, la primera localizada en el hígado y las otras dos,

principalmente en los tejidos tumorales (Figura 19). En la primera etapa la

capecitabina se hidroliza por la carboxilesterasa en el hígado y se convierte en el

producto intermedio 5´-desoxi-5-fluorocitidina (5´-DFCR). La siguiente etapa está

dirigida por la citidina-desaminasa, que es muy activa en el hígado y el tejido tumoral

y convierte la 5´-DFCR en el segundo producto intermedio, la 5´-desoxi-5-fluoruridina

(5´-DFUR) que tampoco es citotóxica. La timidina-fosforilasa, que muestra una

actividad significativamente mayor en el tejido tumoral que en el tejido normal,

convierte la 5´-DFUR en 5-FU en la etapa de conversión final, que culmina con la

liberación selectiva de 5-FU en el tejido tumoral, lo que reduce al mínimo la

exposición general al 5-FU (Pentheroudakis and Twelves, 2002a, b).

Figura 19 . Conversión enzimática de capecitabina en 5-FU.


49

Se han realizado diversos estudios con capecitabina en combinación con otros

agentes quimioterápicos, como el oxaliplatino y el irinotecan demostrando su

factibilidad y actividad (Twelves et al., 2001).

Oxaliplatino

El oxaliplatino es un fármaco antineoplásico perteneciente a una clase de

compuestos de platino en los que el átomo de platino está formando un complejo

con un 1,2-diaminociclohexano (DACH) y un grupo oxalato (Figura 20). Es un

análogo del cisplatino pero con patrones de actividad y toxicidad diferentes.

Figura 20 . Estructura química del oxaliplatino.

Los derivados hidratados resultantes de la biotransformación del oxaliplatino

interaccionan con el DNA formando puentes intra e intercatenarios que entrañan una

interrupción de la síntesis de DNA, causante de la actividad citotóxica y antitumoral.

Así, el oxaliplatino es hidrolizado previamente para formar un derivado hidratado que

ha perdido el grupo diamino ciclohexano. Posteriormente, este compuesto

intermedio reacciona principalmente con los ácidos nucleicos del DNA, mostrando

avidez por el nitrógeno en posición 7 de la guanina, formándose un enlace guanina-

guanina en la misma hebra del DNA o de la guanina-adenina entre dos hebras

diferentes. De esta forma se inhibe la replicación y transcripción del DNA,

produciéndose roturas y equivocaciones en la codificación (Raymond et al., 1998).

Parece que la formación de puentes platino-adenina-guanina es la estructura más

citotóxica desencadenando la muerte celular.

Numerosos estudios han puesto de manifiesto que el oxaliplatino también

podría interaccionar con otras moléculas y vías celulares aumentando así su

citotoxicidad (Tonissen and Di Trapani, 2009).


50

De esta forma, los compuestos de platino interaccionan con el sistema

tiorredoxina, causando una inhibición de tipo irreversible y con una elevada

especificidad de la tiorredoxina reductasa (Urig and Becker, 2006). La inhibición

enzimática que provocan estos compuestos se ha correlacionado con una

disminución de la supervivencia y viabilidad celular (Sasada et al., 1999), debido

principalmente al papel que juega el sistema tiorredoxina en los mecanismos de

apoptosis celular.

En otra serie de estudios, se ha puesto de manifiesto la diferente afinidad y

reactividad que muestran los distintos compuestos derivados del platino (oxaliplatino,

cisplatino y carboplatino) por la tiorredoxina reductasa y como ninguno de ellos es

capaz de inhibir la glutation reductasa (Witte et al., 2005), poniendo este hecho de

manifiesto la importancia del grupo selenol de la tiorredoxina reductasa para que se

produzca la inhibición por parte del oxaliplatino y del cisplatino. Asimismo, también

se ha demostrado como ninguno de estos compuestos es capaz de inhibir la

glutarredoxina, enzima encargada de regular el estado redox de los grupos sulfidrilo

de las proteínas (Arner et al., 2001).

Por otra parte, cabe destacar la elevada afinidad que tienen los derivados del

platino, a través de los átomos de azufre, por los residuos de metionina y cisteína

presentes en enzimas, receptores y otro tipo de proteínas, provocando

modificaciones tanto en su conformación como en su actividad y funciones, cuya

alteración contribuye a la inducción de apoptosis y muerte celular. Esta afinidad por

los grupos sulfidrilo es especialmente elevada en el caso del GSH (Jerremalm et al.,

2006), cuyo complejo, sí es capaz de inhibir la glutarredoxina, provocando una

alteración del estado redox, tanto por la propia disminución de GSH que se produce

como por la inhibición del sistema glutarredoxina.

En resumen, el oxaliplatino a través de los diferentes mecanismos descritos, es

capaz de alterar el sistema redox celular, y por tanto desencadenar procesos de

estrés oxidativo provocando apoptosis, necrosis y muerte celular. En este sentido,

no sólo hay que tener en cuenta los niveles elevados de estrés oxidativo que

provoca, sino también su capacidad para formar directamente ROS (Masuda et al.,

1994).


51

En monoterapia es un fármaco que ha demostrado una actividad similar al 5-

FU, sin embargo su mecanismo de acción es diferente, no habiéndose demostrado

resistencia cruzada y no siendo su toxicidad superponible, lo que le confiere un

sinergismo muy interesante para su combinación con el 5-FU y el ácido folínico (de

Gramont et al., 2000; Goldberg et al., 2004) mejorando el grado de respuesta y la

supervivencia.

Irinotecan

Compuesto antitumoral desarrollado a partir de la camptotecina, alcaloide

presente en un árbol de origen chino (Camptotheca acuminata), con potentes

efectos citotóxicos, debidos a la inhibición de la síntesis de RNA y DNA (específicos

de la fase S del ciclo celular) (Jaxel et al., 1989). El irinotecan es un profármaco, que

por acción de la enzima carboxilesterasa es transformado en la mayoría de los

tejidos en un metabolito activo (SN 38) que se ha revelado más activo y más

citotóxico que el propio irinotecan.

El SN 38 o el irinotecan actúan inhibiendo de forma selectiva la topoisomerasa

I, el enzima intranuclear implicado en el desenrollamiento de las hebras de DNA,

proceso previo a la replicación y transcripción del DNA. El enzima actúa uniéndose a

las regiones específicas de la cadena de DNA rompiendo una de las hebras del

DNA. Posteriormente, el enzima vuelve a soldar la cadena tras haberla desenrollado.

Grivich y cols observaron que en el tratamiento con irinotecan en combinación con 5-

FU se incrementaban los niveles de la enzima antioxidante superóxido dismutasa en

lineas de cultivo celular de cáncer de colon, sugiriendo por tanto que el mecanismo

de acción podría estar mediado por la generación de peróxido de hidrógeno

(Grivicich et al., 2005).

Se ha sugerido que las células neoplásicas presentan niveles de

topoisomerasa I superiores a los de las células normales (Laco et al., 2002), lo que

implicaría un cierto grado de selectividad citotóxica de estos agentes frente a las

células tumorales.


52

Diferentes estudios han puesto de manifiesto el beneficio en cuanto a tasa de

respuesta, tiempo a progresión y supervivencia derivada de la asociación del

irinotecan con el 5-FU y ácido folínico (Douillard et al., 2000; Saltz et al., 2000).

Fármacos anti-EGFR: Cetuximab y Panitumumab

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es un miembro de la

familia de receptores transmembrana con actividad tirosina quinasa para

transducción de señales intracelulares relacionadas con crecimiento, diferenciación y

supervivencia celular (Mendelsohn and Baselga, 2000). Este receptor se encuentra

sobreexpresado en numerosos tumores, incluyendo entre un 25-77% de los

cánceres colorrectales.

EGFR juega un papel fundamental en la carcinogénesis humana, ya que se

encuentra implicado en procesos relacionados con la progresión del ciclo celular,

inhibición de apoptosis, inhibición de la diferenciación celular, angiogénesis y

migración celular y metástasis (Hynes and Lane, 2005; Mendelsohn and Baselga,

2006).

El conocimiento de estos mecanismos moleculares implicados en la

patogénesis tumoral constituyen la base racional para una nueva generación

farmacológica que tiene como diana el EGFR.

El cetuximab es un anticuerpo IgG monoclonal quimérico cuya diana específica

es el dominio extracelular del EGFR. Este anticuerpo se une al EGFR bloqueando la

unión de sus ligandos naturales al receptor, lo que provoca la inhibición de su

función. Además induce la internalización de EGFR lo que puede conllevar una

disminución de los receptores disponibles en la superficie celular (Mendelsohn and

Baselga, 2000). También dirige a las células efectoras inmunitarias citotóxicas hacia

las células tumorales que expresan EGFR (citotoxicidad mediada por células

dependiente de anticuerpo, ADCC). Por otra parte, cuando la vía de señalización

mediada por EGFR es bloqueada por el cetuximab, se activan una amplia variedad

de mecanismos apoptóticos. Además, el bloqueo del EGFR también induce

mecanismos antimetastásicos, inhibe la expresión de factores angiogénicos por


53

parte de las células tumorales y provoca una reducción de la neovascularización

(Iqbal and Lenz, 2004).

La experiencia clínica ha puesto de manifiesto que los niveles de expresión de

EGFR, medidos mediante técnicas de inmunohistoquímica, no predice el beneficio

clínico del tratamiento con el cetuximab (Adams and Maughan, 2007; Chung et al.,

2005). Sin embargo, varios estudios han indicado que la presencia de mutación del

gen K-Ras que codifica para una pequeña proteína G, implicada en la transducción

de la señal del EGFR en sentido descendente, está asociado a una falta de

respuesta de los inhibidores de los EGFR (Benvenuti et al., 2007; Di Fiore et al.,

2007). Esto ha puesto de manifiesto el papel del oncogen K-Ras como marcador

para el tratamiento con inhibidores del EGFR.

Cabe destacar como entre un 30 y un 50% de los cánceres colorrectales tienen

mutado el gen K-Ras (Andreyev et al., 2001; Bos, 1989).

Diferentes estudios han demostrado el beneficio en cuanto a tasa de respuesta,

tiempo a progresión y supervivencia derivado de la asociación del cetuximab con

otros agentes quimioterápicos como el 5-FU, la capecitabina, el irinotecan o el

oxaliplatino entre otros (Jonker et al., 2007).

El panitumumab es un anticuerpo monoclonal recombinante totalmente

humano IgG, que al igual que el cetuximab se une con gran afinidad y especificad al

EGFR, desencadenando los mismos procesos que los descritos para el cetuximab.

De igual forma que el cetuximab, el estado del oncogen K-Ras es un factor

pronóstico para el tratamiento (Weber and McCormack, 2008).

Fármacos antiangiogénicos: Bevacizumab

La angiogénesis tumoral consiste en una serie de complejos pasos

consecutivos que llevan en último lugar a la formación de neovasos que suministran

sangre y nutrientes a la masa tumoral. Por tanto, se trata de un proceso esencial

tanto para el crecimiento del propio tumor como para el desarrollo de metástasis.

Son múltiples los procesos que regulan la angiogénesis, sin embargo se

considera que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) tiene un papel


54

central en la angiogénesis tumoral. Por otra parte, diferentes estudios han puesto de

manifiesto el papel que juegan en la respuesta angiogénica la hipoxia, la deprivación

de nutrientes, p53 así como diferentes ROS (North et al., 2005). Así, el estrés

oxidativo interviene en la angiogénesis a través de la activación del factor de

transcripción NF-κB, implicado en la regulación de la expresión de genes que

median procesos antiapoptóticos, de proliferación celular, metástasis y

angiogénesis. Además, también se ha podido comprobar el efecto de ROS en la

angiogénesis ya que activan alguno de los sistemas que intervienen en la expresión

de VEGF (Schafer et al., 2003).

El bevacizumab, es un anticuerpo monoclonal que se une al factor de

crecimiento del endotelio vascular (VEGF), factor clave de la vasculogénesis y la

angiogénesis (Fukumura et al., 2001), inhibiendo así la unión de éste a sus

receptores Flt-1 (VEGFR-1) y KDR (VEGFR-2), situados en la superficie de las

células endoteliales.

La neutralización de la actividad biológica del VEGF produce una regresión de

la vascularización de los tumores, normaliza la vasculatura residual del tumor e

inhibe la neovascularización tumoral, inhibiendo así el crecimiento del tumor y la

progresión de la enfermedad metastásica (Caprioni and Fornarini, 2007; Castro-

Carpeno et al., 2009).

Por último, cabe destacar el beneficio en cuanto a tasa de respuesta, tiempo a

progresión y supervivencia derivado de la asociación del bevacizumab con otros

agentes quimioterápicos como el 5-FU, la capecitabina, el irinotecan o el oxaliplatino

entre otros (Hurwitz et al., 2004).


55

1.3. ESTRÉS OXIDATIVO Y CÁNCER

1.3.1. Mecanismos de carcinogénesis

La carcinogénesis es un complejo proceso formado por varias secuencias que

permiten a la célula evolucionar desde un estado de salud a un estado precanceroso

para finalmente alcanzar un estadio inicial cancerígeno (Trueba et al., 2004). En este

sentido, existen varias teorías para explicar el proceso de carcinogénesis. Así, un

aumento de la síntesis del DNA y de la mitosis provocado por agentes no

genotóxicos podría inducir mutaciones en las nuevas células. Estas mutaciones

podrían ir expandiéndose a través de nuevas divisiones evolucionando de un estado

inicial preneoplásico a un estado neoplásico (Ames and Gold, 1990).

Otra teoría formula que existe un equilibrio entre proliferación y muerte celular.

Si el daño al DNA es demasiado grande existen importantes mecanismos que

eliminan selectivamente las células alteradas, proceso denominado apoptosis

(Hengartner, 2000). La proteína p53 juega un papel primordial en este proceso

(Oren, 2003), iniciando mecanismos que eliminan por ejemplo, las bases del DNA

oxidadas que puedan causar mutaciones. Si el daño celular es demasiado grande,

p53 pone en marcha los mecanismos de apoptosis, aunque procesos incontrolados

de apoptosis, también pueden ser dañinos para el organismo ya que provocarían la

muerte de células sanas (Hussain et al., 2003). Por tanto, existen sistemas de

regulación de la propia apoptosis consistiendo en factores proapoptóticos (p53)

como antiapoptosis.

En más de la mitad de los tipos de cánceres se han encontrado alteraciones en

vías por arriba o bien por abajo que afectan al funcionamiento del gen p53. Esto

indica que los procesos de carcinogénesis estarían causados por un desequilibrio

entre la proliferación celular y la muerte, estando a favor de la proliferación.

Estudios epidemiológicos y de experimentación animal han mostrado que el

proceso de carcinogénesis podría tener lugar en varias y diferentes etapas

caracterizadas por diversos mecanismos. De esta forma, cabe destacar el modelo

de carcinogénesis basado en la hipótesis de tres etapas consistentes en iniciación,

promoción y progresión.


56

Existen una serie de agentes denominados genotóxicos, normalmente

sustancias químicas que dañan directamente al DNA, provocando la aparición de

una mutación y/o una serie de cambios estructurales. Por otra parte, existiría otra

segunda categoría de agentes carcinogénicos no genotóxicos, cuyo papel en el

proceso carcinogénico no estaría mediado directamente a través de daño al DNA.

Estos compuestos modulan mecanismos de muerte y crecimiento celular.

De esta forma, el proceso de desarrollo de un cáncer estaría formado por la

acción acumulativa de múltiples eventos, pudiendo actuar ROS a varios niveles y en

todas las etapas (Klaunig and Kamendulis, 2004). Así, ROS puede inducir tanto

inestabilidad genómica, causada por daño al DNA como alteraciones en los

procesos de señalización celular relacionados con supervivencia, proliferación,

resistencia a apoptosis, angiogénesis y metástasis en células precancerosas y

cancerosas, promoviendo así la iniciación, promoción y progresión del cáncer, tal y

como se describe a continuación (Figura 21):

La iniciación implica una mutación del DNA no letal pero que produce una

alteración celular seguida por al menos un ronda de síntesis de DNA que permite

fijar el daño producido. En este punto, la célula es capaz de interrumpir

temporalmente su ciclo celular, reparar el daño y reanudar la división (Loft and

Poulsen, 1996). El daño al DNA puede ocurrir mediante la acción de ROS, como por

ejemplo radicales hidroxilo formados por la reacción de Fenton. Varios estudios han

revelado una interesante correlación entre el tamaño del tumor y la cantidad de 8-

OH-dG.

El estadio de promoción está caracterizado por la expansión de las células

iniciadas, produciéndose la proliferación celular y/o la inhibición de la apoptosis. El

resultado de este proceso es la formación de una lesión identificable y es dosis

dependiente, requiriendo por tanto la presencia continuada de un agente que

estimule la promoción. No obstante, es un proceso reversible. Muchos agentes

promotores poseen una fuerte capacidad inhibitoria de agentes celulares

antioxidantes como catalasas, glutation, SOD, etc. Mientras que un alto nivel de

estrés oxidativo es citotóxico para las células y detiene la proliferación induciendo la

apoptosis o incluso provocando necrosis, niveles bajos de estrés oxidativo pueden


57

estimular la división celular y por tanto estimular el crecimiento y promoción de un

tumor (Dreher and Junod, 1996).

La progresión es la tercera y última etapa del proceso de carcinogénesis. Esta

etapa implica cambios celulares y moleculares que ocurren desde un estado

preneoplásico hasta un estado neoplásico. Esta etapa es irreversible y está

caracterizada por la acumulación de daños genéticos que permiten evolucionar a la

célula de benigna a la malignidad.

Figura 21. Modelo de carcinogénesis y su relación con niveles de estrés oxidativo.

Una importante etapa en el crecimiento de cualquier tumor es la generación de

un nuevo sistema de suministro sanguíneo que alimente a las células malignas,

denominado angiogénesis (Carmeliet, 2000). Este proceso está regulado por el

supresor tumoral p53, ya que es capaz de activar genes que inhiben la

neovascularización y la represión de genes que activan el crecimiento vascular, y

por tanto intrínsecamente conectado con el desarrollo de metástasis.

Asimismo se ha podido comprobar el importante papel que juega ROS en la

neovascularización durante el crecimiento tumoral. Arbiser y colaboradores (Arbiser

et al., 2002) demostraron que RNS inducido por H2O2 aumentaba la expresión del

factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), provocando la promoción de los

mecanismos de vascularización y la rápida expansión de los tumores.

Por otra parte, en la mayoría de los tumores, se ha podido relacionar una

mayor capacidad metastásica con niveles elevados de ROS (Ishikawa et al., 2008;

Lim et al., 2005). Así, la administración exógena de ROS podría aumentar ciertos


58

estados metastáticos (Jing et al., 2002) mientras que el tratamiento con

antioxidantes podría atenuar la progresión metastásica (Ferraro et al., 2006).

Los linfocitos intratumorales en muchos de los procesos carcinogénicos atacan

a las células malignas produciendo su muerte. Sin embargo, monocitos y

macrófagos pueden ser inhibidos por ROS liberados por la NADPH oxidasa. Datos in

vitro sugieren que en ambientes con niveles de estrés oxidativo, determinadas

citoquinas, tales como la interleucina 2 (IL-2) o el interferon α (IFNα) provocan una

débil activación de las células T o de las natural killer, produciéndose por tanto

escape tumoral a la respuesta inmune (Mantovani et al., 2003).

1.3.2. Señalización celular y cáncer

Tal y como se ha venido describiendo, desde hace años se ha podido constatar

como ROS y RNS juegan un papel fundamental en la iniciación, promoción y

progresión de la carcinogénesis. Sin embargo, aún no están totalmente claros ni

definidos todos los procesos y mecanismos a través de los que median, a pesar de

que ya se conoce como los radicales libres a determinadas concentraciones juegan

un importante papel como reguladores en los procesos de comunicación y

señalización intra e intercelular, participando en cascadas que regulan distintas

funciones y vías metabólicas (Thannickal and Fanburg, 2000).

Estos procesos de transducción de señales permiten que determinada

información del exterior de la célula sea transmitida a varios elementos funcionales

del interior, cuyo objetivo final suele ser la expresión de determinados genes siendo

los factores de transcripción las proteínas encargadas de transmitir esta información

al núcleo celular. Este mecanismo de transducción es disparado por elementos

extracelulares tales como hormonas, factores de crecimiento, citoquinas,

neurotransmisores y ROS (Hensley et al., 2000).

Dado el papel de ROS en los mecanismos de señalización, es importante

considerar la influencia tanto del estado redox como de la concentración de estas

especies oxigénicas, ya que pueden provocar una respuesta positiva, traducido en

proliferación celular o bien una respuesta negativa produciéndose la muerte celular o

la detención de su crecimiento. De esta forma, mientras que elevadas


59

concentraciones de ROS causan muerte celular y necrosis, los efectos de ROS

sobre la proliferación ocurren exclusivamente a bajas o concentraciones transitorias

de estos radicales.

De esta forma y teniendo en cuenta que el crecimiento celular es el proceso

fundamental regulado a través de la transducción de señales, alteraciones en su

normal funcionamiento puede conducir a cáncer, quedando ampliamente

demostrado como ROS puede interferir en la expresión de varios genes así como en

las vías de transducción de señales, siendo ambas alteraciones fundamentales en

los procesos de carcinogénesis (Poli et al., 2004).

A modo de resumen en la figura 22 quedan reflejadas las vías de señalización

que son inducidas tanto por ROS como por otros metales productores de estrés

oxidativo.

Concretamente, una activación de Ras como consecuencia de ROS se ha

observado en distintos tumores (Dayan and Paine, 2001), cuya función natural es

regular los procesos de crecimiento oponiéndose a la apoptosis. Se han encontrado

mutaciones de Ras en un 30% de los cánceres de pulmón, piel, hígado y colon

(Vachtenheim, 1997).

Por otra parte, tanto especies reactivas de nitrógeno, el anión superóxido o

bien el peróxido de hidrógeno, pueden activar la cascada de las serin-treonin

Kinasas MAPK (Kyriakis and Avruch, 2001). Esta alteración en la regulación de las

MAPK es frecuente en carcinoma de mama y de cérvix. Dentro del grupo de las

MAPK destaca el equilibrio entre ERK y JNK, claves en la proliferación celular, de

forma que para inducir apoptosis es necesario que se produzca un aumento de JNK

y una disminución de ERK, influido directamente por el estado redox (Iles and

Forman, 2002).


60

Figura 22. Vías de señalización inducidas por ROS y metales.

Por otra parte, la activación de la vía de señalización de las protein quinasas

(MAPK) por parte de ROS, implica la activación de factores de transcripción, como

NF-κB y el factor AP-1, involucrados en el control de la expresión de determinados

genes, como los encargados de la reparación del daño al DNA, la detención de la

proliferación de células dañadas y la inducción de la apoptosis, mecanismos

directamente implicados en la iniciación y progresión tumoral.

Cabe destacar el papel del gen p53, cuya disrupción está asociada con más de

la mitad de todos los tipos de cáncer. La proteína p53 controla el ciclo celular y su

inactivación provoca un crecimiento celular de forma incontrolada (Polyak et al.,

1997). Por otra parte, existen trabajos que describen mutaciones en p53 causadas

por acción directa de ROS, provocando alteraciones directas en el control del ciclo

celular (Renzing et al., 1996). Asimismo, p53 está implicado como factor de

respuesta celular al estrés oxidativo (Wang et al., 2007).

ROS y determinados metales también pueden producir alteraciones en el

funcionamiento de los receptores y/o factores de crecimiento (EGFR, PDGF y

VEGF). Estas alteraciones se han asociado con el desarrollo de numerosos tipos de

cáncer (Drevs et al., 2003).

Además de los receptores ya mencionados, ROS también pueden activar

varias protein quinasas (PTKs) pertenecientes a la familia de las Src quinasas y de


61

Janus quinasas (JAK) (Abe and Berk, 1999; Esposito et al., 2003). Por ejemplo, el

peroxido de hidrógeno, el radial superoxido y otra serie de metales como el arsénico

o el Cromo (III) inducen la fosforilación de los residuos de tirosina de varias PTKs en

diferentes tipos de células (Simeonova and Luster, 2002). De esta forma, se ha

detectado sobreexpresión de Src en varios tipos de cáncer como en el caso

colorrectal. Las Src activadas que se encuentras unidas a las membranas celulares

son capaces de iniciar la cascada de señalización mediante la activación de las

MAPK y de las PI3K.

1.3.3. Cáncer colorrectal y daño oxidativo a biomol éculas

El cáncer colorrectal es uno de los mayores problemas de salud presente en

las sociedades desarrolladas, estando ampliamente demostrado que el periodo de

supervivencia aumenta cuando la enfermedad se diagnostica de forma precoz y no

está totalmente desarrollada (Arnold et al., 1995). Por tanto, es importante encontrar

nuevos y fiables marcadores capaces de proporcionar un diagnostico temprano de

esta patología.

El colon está constantemente expuesto a ROS y RNS provenientes de fuentes

tanto endógenas como exógenas (Stone and Papas, 1997). Así, es ampliamente

conocido que elevados niveles de estrés oxidativo están asociados a un mayor

riesgo de cáncer colorrectal (Blau et al., 1999) interviniendo en los procesos de

iniciación, promoción y/o progresión de la carcinogénesis (Figura 23).

Figura 23. Estrés oxidativo y carcinogénesis en el tracto gastrointestinal.

De esta forma, modificaciones en el material genético, resultantes del daño

oxidativo, representan el primer paso implicado en los procesos de mutagénesis,


62

carcinogénesis y envejecimiento, habiendo sido identificadas más de 100 productos

de oxidación del DNA. Además, se ha podido constatar como estas especies

reactivas están implicadas en los procesos de metástasis, migración celular y

angiogénesis (Wu, 2006).

Además de las especies oxigénicas reactivas (ROS), existen varios metales

redox, debido a su capacidad de generar radicales libres, o metales no-redox, pero

con capacidad para unirse a tioles, que también están implicados en los

mecanismos de carcinogénesis y envejecimiento (Pourahmad and O'Brien, 2001;

Santos et al., 2005; Stayner et al., 1996; Waalkes et al., 2004). Así, el estrés

oxidativo inducido por el hierro es considerado uno de los factores determinantes del

cáncer colorrectal (Valko et al., 2001).

Las alteraciones en el DNA implican ruptura de las hebras, modificaciones de

las bases púricas o pirimidínicas o bien de las desoxirribosas y alteraciones en el

proceso de entrecruzamiento de sus cadenas. Estos procesos se traducen en la

detención o inducción de la trascripción, inducción de las vías de transducción de

señales, replicación de los errores e inestabilidad genómica, todos ellos asociados a

la carcinogénesis (Marnett, 2000).

La alteración más ampliamente estudiada es la formación de la base

modificada 8-hidroxi-desoxiguanina (8-OH-dG). Esta lesión es importante ya que se

forma con relativa facilidad y es mutagénica, aspecto que le permite desempeñar un

importante papel como biomarcador de carcinogénesis (Haghdoost et al., 2005).

En este sentido, tanto el daño al DNA, las mutaciones y la alteración de la

expresión genómica tienen como común denominador el estrés oxidativo, asimismo

las diferentes etapas de los procesos carcinogénicos y apoptóticos (Valko et al.,

2004; Valko et al., 2001; Valko et al., 2006).

Además de ROS, especies reactivas nitrogenadas (RNS), tales como

peroxinitritos y el óxido de nitrógeno, han sido relacionadas con el daño al DNA

(Hehner et al., 2000). De la misma forma que con el oxígeno, el peroxinitrito es

capaz de formar la base modificada 8-nitroguanina. Esta modificación puede inducir


63

transversión de G:C a T:A. Mientras que la estabilidad de esta lesión en el DNA es

baja, en el RNA el compuesto nitrogenado formado es muy estable.

Además de los extensos estudios que existen sobre el papel del daño oxidativo

en el DNA nuclear en procesos neoplásicos, existen evidencias sobre la implicación

del daño oxidativo del DNA mitocondrial en dichos procesos, habiéndose encontrado

diversas mutaciones y alteraciones en la expresión de genes mitocondriales y en

regiones del DNA mitocondrial en varios tipos de cáncer (Shokolenko et al., 2003),

incluido el colorrectal.

El daño a lípidos, que media fundamentalmente a través de procesos de

peroxidación lipídica, también ha sido relacionado con mecanismos de

carcinogénesis (Cejas et al., 2004). Una vez formado el radical lipoperoxilo, éste

puede ser reorganizado mediante una reacción de ciclación para formar el producto

final de la peroxidación, llamado malondialdehido (MDA). Además de tratarse de un

producto mutagénico, se ha demostrado que el malondialdehido puede reaccionar

con las bases guanina, adenina y citosina del DNA (Marnett, 1999), pudiendo

provocar transversiones a timina (Fink et al., 1997; Mao et al., 1999). La

cuantificación del MDA está siendo empleado en la actualidad como indicador del

estado de peroxidación lipídica, de forma que niveles elevados de MDA se

relacionan con niveles de estrés oxidativo y procesos de carcinogénesis, respecto a

valores más bajos encontrados en sujetos controles sanos (Ahmad et al., 2008).

Cabe destacar que los productos resultantes de los procesos de peroxidación

lipídica también pueden inducir mecanismos de señalización intracelular

(Leonarduzzi et al., 2000), y por tanto modular funciones relacionadas con expresión

génica, proliferación celular y otros mecanismos de respuesta celular (Uchida, 2003).

El daño a proteínas causado por ROS y RNS, produce formación de grupos

carbonilo y como consecuencia alteraciones en su conformación y por tanto en sus

funciones biológicas, relacionadas con carcinogénesis y envejecimiento (Valko et al.,

2006). De esta forma, la cuantificación de los grupos carbonilos de las proteínas se

ha comenzado a emplear como biomarcador del daño a proteínas causado por

estrés oxidativo consecuencia de ROS y RNS. Además, en numerosos estudios se

han podido relacionar niveles elevados de este biomarcador con procesos de


64

carcinogénesis respecto a los valores determinados en sujetos controles sanos

(Ahmad et al., 2008; Di Giacomo et al., 2003).

Además del daño a DNA, lípidos y proteínas que se ha detectado en los

procesos de carcinogénesis consecuencia de la acción de ROS y RNS, diferentes

estudios han puesto de manifiesto como se ven afectadas otra serie de biomoleculas

que intervienen en el control del equilibrio redox, como el tripéptido GSH y su

especie oxidada GSSG, así como el sistema tiorredoxina.

La concentración de glutation reducido (GSH) en plasma refleja los niveles

presentes en los tejidos, de forma que una disminución en plasma de los niveles de

GSH puede ser un indicador de un estado patológico (Wlodek et al., 2006). Así, se

han medido en sangre de enfermos de cáncer de colon y mama los niveles de GSH

en relación con su estado oxidado, observándose concentraciones

significativamente inferiores respecto a grupos controles. Esta diferencia se hace

especialmente significativa cuando los estadios de cáncer son más avanzados

(Pastore et al., 2003). Estos hallazgos podrían justificarse por el incremento en la

generación de peróxidos, causando por tanto aumento del glutation oxidado.

En cuanto al sistema tiorredoxina existen evidencias experimentales que

muestran niveles elevados en pacientes con cáncer colorrectal respecto a sujetos

sanos (Lincoln et al., 2003). Además, tanto la tiorredoxina como la tiorredoxina

reductasa son secretadas al medio, pudiéndose detectar y cuantificar en el plasma

extracelular (Soderberg et al., 2000).

Así, resultados de varios estudios sugieren que la tiorredoxina tiene diferentes

funciones en las células tumorales dependiendo del estado del desarrollo del cáncer

(Tonissen and Di Trapani, 2009). En estadios iniciales, la tiorredoxina puede ser

beneficiosa, ya que actúa previniendo el cáncer gracias a su capacidad para

contrarrestar el estres oxidativo causado por muchas sustancias carcinogénicas. Sin

embargo, una vez que las células han iniciado el proceso cancerigeno, altos niveles

de tiorredoxina pueden ayudar al desarrollo de la enfermedad debido a su papel en

la promoción del crecimiento celular y sus funciones antiapoptóticas. En estadios

más avanzados de la enfermedad, la tiorredoxina puede estar implicada en los

procesos de angiogénesis y metástasis. De hecho, se ha podido comprobar como


65

interviene en la regulación de la expresión y en el funcionamiento del factor de

crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Welsh et al., 2002). Por otra parte, niveles

elevados de tiorredoxina se han asociado con resistencia a determinados fármacos

quimioterápicos incluido el cisplatino, el oxaliplatino (Kopetz et al., 2009; Sun and

Rigas, 2008) y el docetaxol (Kim et al., 2005).


66


67

1.4. EVALUACIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO

La determinación del estrés oxidativo medido como los niveles del estado

antioxidante y del daño oxidativo es esencial para poder valorar la implicación de

éste en la enfermedad, como el caso del cáncer colorrectal. Asimismo, sería

importante encontrar nuevos y fiables marcadores que pudieran proporcionar

información precoz sobre el diagnostico y evolución de la enfermedad.

Existen múltiples sustratos de oxidación y son también múltiples los efectos de

las defensas antioxidantes, poniendo esto en evidencia que la evaluación del estrés

oxidativo debe ser abordada desde diversos puntos de vista que permitan ofrecer

una imagen más global y completa de todos los aspectos implicados en ese

mecanismo defensivo. Por lo tanto, con un sólo método de medida no se puede

obtener toda la información deseada y se requiere un ensayo múltiple para generar

un perfil que comprenda el estado de la defensa antioxidante como la del daño

oxidativo (Hermans et al., 2007).

1.4.1. Capacidad Antioxidante Total

La finalidad es medir el potencial antioxidante total de una muestra biológica

como el plasma. Se medirá la contribución de todos los compuestos presentes en el

plasma. La captación de radicales es el principal mecanismo de acción de los

antioxidantes, lo que ha permitido desarrollar métodos en los que se mide la

capacidad antioxidante a través de la estabilización de radicales libres sintéticos

generados en medios acuosos o solventes orgánicos polares, como el metanol.

Aunque existen distintos métodos, los más utilizados son el ABTS y el FRAP.

El ensayo del ABTS se basa en la capacidad antioxidante del plasma para

estabilizar el radical ABTS.+ .(Miller and Rice-Evans, 1997). Se inicia la reacción por

adición de radicales peroxilo u otros oxidantes que generan el radical catión ABTS.+,

producto intensamente coloreado.

El método del FRAP se fundamenta en la capacidad del plasma de reducir un

compuesto de hierro (III) mediante compuestos antioxidantes formándose un

complejo fuertemente coloreado (Benzie and Strain, 1996).


68

Los polifenoles, compuestos con una elevada actividad antioxidante, tanto por

sus propiedades quelantes como su capacidad secuestradora de radicales libres, se

determinan mediante el procedimiento de Folin-Ciocalteau (Singleton and Esau,

1969), de forma que los compuestos fenólicos son oxidados por el reactivo de Folin-

Ciocalteau formándose un compuesto para su posterior determinación

espectrofotométrica.

1.4.2. Evaluación de los biomarcadores de estrés ox idativo

Los biomarcadores han sido usados para evaluar la eficacia antioxidante in

vitro, ex vivo e in vivo, y aportan información del daño a proteínas, aminoácidos,

lípidos o bases de DNA, el cual está relacionado con enfermedades específicas.

Conocer la implicación de los radicales libres en la patogénesis de distintas

enfermedades es extremadamente difícil, debido a la corta vida media de estas

especies y a la dificultad de técnicas suficientemente sensibles como para detectar

los radicales directamente en sistemas biológicos, por ello se hace necesario el

estudio de biomarcadores que suponen un reflejo de los cambios que se producen

en sistemas biológicos debidos al estrés oxidativo. Un biomarcador tiene que ser el

principal producto de modificación oxidativa que pueda estar implicado directamente

en el desarrollo de una enfermedad, un producto estable y no susceptible a

modificaciones durante el ensayo. Además tiene que ser medido por un ensayo que

sea específico, sensible, reproducible y robusto.

Además de la medida de diversos biomarcadores, se ha puesto a punto un

protocolo para determinar nitrato y nitrito como indicadores de niveles de óxido

nítrico, especie altamente inestable y por tanto difícilmente cuantificable, pero con un

importante papel en la señalización molecular de determinados procesos biológicos.

En el medio extracelular, el óxido nítrico reacciona con oxígeno y agua formando los

aniones nitrato y nitrito. El procedimiento para su cuantificación se basa en la

determinación colorimétrica de los nitritos con el reactivo de Griess, antes y después

de la conversión del nitrato a nitrito por la nitrato reductasa de Aspergillus (Moshage

et al., 1995).


69

Biomarcadores de la oxidación a lípidos

La medida directa de los productos de la oxidación endógena de los lípidos

resulta difícil, por lo que se han desarrollado diferentes métodos que evalúan este

daño a través de la determinación de las moléculas que lo causan o bien miden los

niveles de productos secundarios de oxidación como aldehidos o cetonas. El más

ampliamente usado es el que mide el malondialdehido (MDA) en presencia de ácido

tiobarbitúrico. La medida puede realizarse espectrofotométricamente o por

fluorescencia (Draper et al., 1993; Grotto et al., 2007; Janero, 1990).

En cuanto a una de las especies reactivas que causan daño a lípidos cabe

destacar los hidroperóxidos, como indicador de las especies reactivas generadoras

de daño a estas biomoléculas. El procedimiento para su determinación se basa en la

oxidación del ión ferroso por los hidroperóxidos lipídicos presentes en plasma y su

cuantificación espectrofotométrica posterior mediante un ensayo colorimétrico

acoplado (Nourooz-Zadeh et al., 1994).

Biomarcadores de la oxidación a proteínas

La oxidación proteica se define como una modificación covalente de una

proteína inducida por especies reactivas (Figura 24). Los cambios oxidativos en

proteínas pueden comportar diversas consecuencias en su función, como la

inhibición de la actividad enzimática, un incremento de la susceptibilidad a la

agregación y proteolisis, un aumento o disminución de la captación celular y una

alteración de la inmunogénesis.

Figura 24. Oxidación de las proteínas.

Esta oxidación origina la oxidación de los grupos sulfidrilo, de aminoácidos

como la metionina y cisteína que ven totalmente anulada su actividad biológica. La

oxidación de proteínas ha sido asociada con el envejecimiento y la severidad de

algunas patologías.


70

El más utilizado como biomarcador del daño oxidativo a proteínas es la

cuantificación de grupos carbonilo, donde además sus niveles están asociados con

distintas patologías (Berlett and Stadtman, 1997; Dean et al., 1997). Estos grupos

son producidos sobre las cadenas laterales de las proteínas cuando están oxidadas,

dando lugar a grupos químicos estables que son fácilmente detectables. Para ello se

derivatizan con el NDPH (2,4-dinitrofenilhidrazina) que lleva a la formación de un

derivado que puede ser detectado por distintos métodos como ELISA, Western-Blot

o por técnicas de HPLC o espectrofotometría a 373 nm de longitud de onda (Levine

et al., 1990).

Biomarcadores del daño al DNA

El DNA en el núcleo celular es un componente particularmente susceptible al

daño oxidativo por los ROS (Cerutti, 1985). El radical hidroxilo es responsable de la

oxidación de bases púricas y pirimidínicas, entre ellas la desoxiguanina (dG),

generando la base modificada 8-hidroxi-desoxiguanina (8-OHdG).

La relación de concentraciones entre 8-OHdG/dG, se considera un marcador

por excelencia del estado de daño oxidativo causado por los radicales libres sobre el

DNA. Las técnicas aplicadas para la cuantificación de esta base modificada puede

ser por HPLC utilizando detector electroquímico o por cromatografía de gases-

masas (GC-MS).

1.4.3. Evaluación del estado redox

En los sistemas biológicos se establece un dinámico equilibrio entre la

producción de las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno y una amplia variedad

de especies que se encargan de su neutralización, denominado estado redox.

Como indicadores del estado redox celular cabe destacar el sistema

antioxidante tiorredoxina, siendo uno de los mayores sistemas de control redox que

existe tanto a nivel de citoplasma celular como a nivel mitocondrial. Para su

determinación se valora por una parte, la actividad tiorredoxina reductasa, mediante

un ensayo acoplado y cuantificación espectrofotométrica de una especie

colorimétrica que se correlaciona con la actividad enzimática (Holmgren and


71

Bjornstedt, 1995), y por otra parte, se determina la tiorredoxina, a través de un kit de

ELISA (Kogaki et al., 1996; Nakamura et al., 1996).

El glutation se presenta como el antioxidante celular no enzimático más

importante, y por tanto, también es un indicador del estado redox. La determinación

de este tripéptido se realiza mediante la cuantificación espectrofotométrica del

complejo formado por el glutation y el clorodinitrobenceno mediante catálisis de la

enzima glutation-S-transferasa (Brigelius et al., 1983).


72

HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS

Hipótesis de trabajo y Objetivos

73

2. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS

2.1. HIPÓTESIS DE TRABAJO

La contribución del estrés oxidativo a la evolución del cáncer así como a la

respuesta de los agentes quimioterapéuticos es conocida y resulta evidente a juzgar

por los datos de la Revisión Bibliográfica.

Sin embargo, el análisis del estrés oxidativo como respuesta a distintos tipos de

tratamiento así como en los distintos estadios revela una gran discrepancia de

resultados, siendo la gran mayoría estudios in vitro. Esto junto con la falta de un

abordaje completo e integral en el que se valoren conjuntamente diferentes

biomarcadores del estrés oxidativo así como la falta de datos acerca de ciertos

parámetros, nos ha hecho plantear un estudio en el que hemos evaluado en

diferentes poblaciones de pacientes con cáncer colorrectal el estado antioxidante

total y parámetros de daño oxidativo y de estado redox en plasma y en linfocitos,

comparándolo con otras neoplasias, así como evaluando estos parámetros en

función del tratamiento quimioterápico y del grado y tipo de metástasis.

2.2. OBJETIVOS

En base a la hipótesis de trabajo planteada, se definen a continuación los

objetivos del trabajo relativos al desarrollo de la presente Tesis Doctoral:

1. Analizar las diferencias en capacidad antioxidante, estrés oxidativo y estado redox

en tres grupos de pacientes con neoplasia (cáncer colorrectal, cáncer gástrico y

linfoma) respecto a grupo de sujetos control.

2. Establecer en los pacientes con cáncer colorrectal las diferencias en los

parámetros de estrés oxidativo en función del tratamiento.

3. Evaluar la evolución del estrés oxidativo en función del grado y tipo de metástasis.

4. Establecer correlaciones y/o inferencias con los diferentes parámetros clínicos.

Hipótesis de trabajo y Objetivos

74

5. Consecuencia del análisis de los resultados obtenidos se valorará si alguno de los

parámetros estudiados se podría emplear como marcador de progresión del cáncer

colorrectal.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material y Métodos

75

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. MATERIAL

Los diferentes reactivos utilizados en las determinaciones analíticas, así como

su procedencia, serán reseñados en el apartado correspondiente a cada uno de los

métodos.

3.1.1. Aparatos

• Cromatógrafo líquido de alta resolución Waters Alli ance 2695 con

Detector Dual λ Absorbance Waters 2487

• Espectrofotómetro ultravioleta/visible Kontron instruments modelo Uvikon

922 con baño termostatizado (Kontron)

• Centrífugas :

� Centrífuga refrigerada Eppendorf 5702

� Centrífuga refrigerada Eppendorf 5415R

• Sonicador de células modelo Microson Ultrasonic cell disruptor

• Otros aparatos :

� Baño termostatizado de temperatura regulable SBS- BT21

� pHmetro Crison modelo micropH 2000

� Balanza Swiss Quality y microbalanza Precisa 62 A

� Sistema Millipore de filtración bajo vacío, equipados con filtros para

solventes y soluciones acuosas

� Agitadores magnéticos con calefacción

� Agitadores manuales de tubos Vórtex

� Congelador de -80 ºC modelo Revco

� Material habitual de laboratorio

Material y Métodos

76

3.2. POBLACIÓN DE ESTUDIO

Hemos planteado un estudio sobre 85 pacientes con cáncer colorrectal sin

tratamiento y tratados con quimioterapia, procedentes del Complejo Asistencial de

Burgos. Además, se ha contado con un pequeño grupo de población con cáncer

gástrico (12 pacientes) y otra población de sujetos con linfoma (16 pacientes), lo que

ha permitido realizar una aproximación al estudio del estrés oxidativo en ambos tipos

de patologías.

3.2.1. Selección de Pacientes

Se realizó entre pacientes con cáncer colorrectal pertenecientes al Servicio de

Oncología Médica del Hospital General Yagüe, del Complejo Asistencial de Burgos.

Se aceptaron como pacientes para ser incluidos en el estudio aquellos que cumplían

los siguientes criterios de inclusión:

a. Edad comprendida entre 40 y 85 años

b. Tener cáncer colorrectal en cualquiera de los estadios II, III y IV

c. Fueron incluidos en el estudio pacientes con cualquier patología de

base, así como con cualquier tratamiento farmacológico, enfermedades

concomitantes o anteriores, y estado y pronóstico actual

Los pacientes con cáncer colorrectal y en régimen quimioterápico han sido

agrupados en función de tres tratamientos tipo, con objeto de poder realizar el

estudio y el análisis comparativo de resultados de los diferentes parámetros medidos

(Tabla I).

Material y Métodos

77

Tabla I . Fármacos correspondientes a los tratamientos tipificados para el estudio.

TRATAMIENTO TIPO FÁRMACOS

TIPO 1 5-FU ó Capecitabina5-FU ó Capecitabina + Oxaliplatino ó Irinotecan

TIPO 2 5-FU ó Capecitabina + Oxaliplatino ó Irinotecan + Cetuximab ó Bevacizumab ó PanitumumabTIPO 3 Otros

CetuximabMitomicinaPemetrexedBevacizumabErlotinibIrinitecan + CetuximabCapecitabina + MitomicinaCisplatino + CetuximabBevacizumab + ErlotinibCetuximab + IrinotecanCapecitabina + Mitomicina + Bevacizumab

Se ha incluido también en el estudio un grupo control de sujetos sanos, con

similares características en cuanto a edad y sexo que el grupo objeto de estudio, y

en base a los requisitos mínimos establecidos para poder realizar la donación

voluntaria de sangre.

Tanto el grupo de pacientes como el grupo control de sujetos sanos dieron

consentimiento informado de la donación de su sangre para fines relacionados con

los trabajos de investigación realizados.

Asimismo para el estudio comparativo del estrés oxidativo en diferentes

neoplasias, se seleccionaron otros dos grupos de pacientes, uno formado por una

población con cáncer gástrico y otro grupo con linfoma.

3.2.2. Tamaño de la muestra

Constituida por un total de 85 pacientes con cáncer colorrectal estableciendo

como número de sujetos suficiente para la comparación de medias, así como para

realizar las diferentes agrupaciones atendiendo a determinadas características

poblacionales y realizar los estudios correspondientes. De este grupo, 15 pacientes

no habían comenzado el tratamiento quimioterápico o bien lo habían finalizado por lo

menos 6 meses antes de la toma de muestra para la realización del estudio. El

tamaño de muestra fue calculado para obtener una diferencia significativa entre los

grupos para cada parámetro analizado, con un grado de error alfa de 5%, un riesgo

beta de 0,1 y unas pérdidas estimadas del 10%.

Material y Métodos

78

Según los estudios planteados se han realizado distintas agrupaciones

poblacionales dando lugar a diferentes tamaños de muestra en función de las

características de los pacientes. En primer lugar, para el estudio del estrés oxidativo

asociado al cáncer colorrectal se ha considerado una población de enfermos con

CCR y sin tratamiento quimioterápico con un tamaño muestral de 15 pacientes. Por

otra parte, esta muestra también se ha empleado para el estudio del estrés oxidativo

asociado al tratamiento quimioterápico, contando además con un grupo formado por

70 pacientes en régimen terapéutico. Asimismo, esta población se ha dividido en

función del tipo de tratamiento (un 47% de los individuos en tratamiento T1, un 37%

en tratamiento T2 y un 16% en tratamiento T3), con objeto de estudiar como se ve

afectado el estrés oxidativo en cada uno de estos casos. Para el estudio del E.O.

asociado a metástasis, en una primera aproximación se ha tenido en cuenta el grupo

de pacientes que no estaba recibiendo tratamiento quimioterápico, de los cuales el

47% no presentaba enfermedad metastásica mientras que el 53% corresponde al

grupo de población con metástasis. Considerando el grupo de pacientes en

tratamiento quimioterápico, se ha estudiado el estrés oxidativo asociado a

metástasis y a su tipo. De esta forma se ha partido de una población formada por 30

pacientes y que no había desarrollado enfermedad metástasica y de otro grupo

compuesto por 40 pacientes con metástasis, de los cuales el 33% se corresponde a

pacientes con metástasis hepática, el 35% a no hepáticas y el 32% a hepáticas y

otras. Por último, para el estudio del estrés oxidativo asociado a concentración del

marcador carcinoembrionario se ha partido de un tamaño muestral de 38 y 32

pacientes para las concentraciones de CEA < 5 ng/mL y ≥ 5 ng/mL respectivamente,

y para el marcador Ca 19.9 se ha contado con un grupo de 44 y 26 pacientes para

las concentraciones de Ca 19.9 < 37 U/mL y ≥ 37 U/mL respectivamente.

Para el grupo control se seleccionaron 71 sujetos sanos que aceptaron

voluntariamente participar.

El grupo de pacientes con cáncer gástrico ha estado formado por 12 sujetos

mientras que se contaron con 16 pacientes para la realización del estudio de la

población con linfoma.

Material y Métodos

79

3.2.3. Obtención de muestras y procesamiento

A los pacientes seleccionados se les extrajo una sola y única muestra de

sangre para la realización del estudio. Se separaron 50 µL de sangre, añadiendo 50

µL de agua, se agitó y se incubó a 4 ºC durante 2 horas. Transcurrido este tiempo se

mezcló con 100 µL de cloroformo-etanol (1:1) y se centrifugó a 8.000 r.p.m. durante

30 minutos. El sobrenadante se transfirió a un eppendorf añadiendo 10 µL de ácido

perclórico (PCA) al 20% para cada 100 µL de sobrenadante, procediendo a su

conservación a -80 ºC. El resto de sangre se centrifugó a 8000 r.p.m. durante 6

minutos para la obtención de plasma. Éste se distribuyó en tubos eppendorf que se

mantuvieron guardados a -80 ºC hasta su utilización para la determinación de la

actividad antioxidante total (FRAP, ABTS y polifenoles), de biomarcadores de daño

oxidativo a lípidos (malondialdehido e hidroperóxidos) y a proteínas (grupos

carbonilo), de biomarcadores de niveles de óxido nítrico (nitratos y nitritos) y

evaluación del estado redox (tiorredoxina, y la enzima tiorredoxina reductasa).

Una vez separado el plasma, el precipitado se hemodiluyó con un volumen

equivalente de cloruro sódico al 0,9%. A continuación esta fracción se fue añadiendo

suavemente a otro tubo con 15 mL de Ficoll, y se centrifugó a 1.500 r.p.m. durante

20 minutos. El anillo de linfocitos se transfirió a otro tubo, se centrifugó a 1.800 r.p.m.

durante 6 minutos previo lavado con 50 mL de cloruro sódico al 0,9%, repitiendo tres

veces esta operación. El botón celular se resuspendió en 2 mL de PBS al 1%,

distribuyéndose posteriormente en tubos eppendorf que se mantuvieron guardados a

-80 ºC hasta su utilización para la determinación del malondialdehido y grupos

carbonilo de la fracción de linfocitos. A la alícuota para la determinación de GSH se

le añadieron 10 µL de PCA al 20%, se centrifugó a 8.000 r.p.m. durante 5 minutos

guardando el sobrenadante a -80 ºC, para también su posterior análisis y

cuantificación.

Material y Métodos

80

3.3. DETERMINACIONES ANALÍTICAS

3.3.1. Capacidad antioxidante total del plasma

3.3.1.1. Determinación mediante el método FRAP

Fundamento teórico: Para la determinación de la capacidad antioxidante total

del plasma se siguió el método del FRAP de Benzie y Strain (Benzie and Strain,

1996) que se fundamenta en la capacidad de reducir el complejo formado por el

hierro (III) y TPTZ (2,4,6-tris-2-piridil-s-triazina) hasta hierro (II)-TPTZ, mediante un

donante de electrones (antioxidante), formándose un compuesto de color azul que

presenta un máximo de absorción a 593 nm. La medida espectrofotométrica a esa

longitud de onda es proporcional a la capacidad reductora de la muestra.

Reactivos: Acetato de sodio (C2H3NaO2), ácido acético (CH3CO2H), tricloruro

férrico (FeCl3.H2O), sulfato de hierro (FeSO4-2H2O) y ácido clorhídrico (ClH) fueron

de Panreac y el TPTZ (2,4,6-tris-2-piridil-s-triazina) fue suministrado por Sigma-

Aldrich. El reactivo TPTZ se preparó mezclando 25 mL de tampón acetato sódico 0,3

M pH 3,6, 2,5 mL de tricloruro férrico 20 mM, 2,5 mL de una solución de TPTZ 10

mM y 3 mL de agua miliQ.

Metodología: Para las determinaciones, se incubaron durante 30 minutos a 37

ºC, 970 µL de reactivo TPTZ junto a 20 µL de muestra de plasma y 10 µL de tampón

acetato sódico 0,3 M. Trascurrido el tiempo se realizó la medida espectrofotométrica

a 593 nm, utilizando el tampón acetato para el blanco de lectura. Los resultados se

expresaron refiriéndoles a concentración de hierro (II), para lo que se realizó una

recta de calibrado a partir de una solución acuosa estándar de sulfato de hierro

(Figura 25).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 5 10 15 20 25 30 35

µM Fe 2+

Abs

orba

ncia

593

nm

Figura 25. Recta de calibrado a partir de una solución de sulfato de hierro.

Material y Métodos

81

3.3.1.2. Determinación mediante el método ABTS

Fundamento teórico: Para la determinación de la capacidad antioxidante total

se siguió el método del ABTS·+ de Miller y Rice-Evans (Miller and Rice-Evans, 1997)

modificado posteriormente por Pellegrini (Re et al., 1999), basado en la oxidación del

ABTS (sal diamonio 2,2ázinobis-(6-ácido sulfónico 3-etilbenzotiazolina)) por el

sulfato potásico para formar el radical ABTS·+, que es reducido en presencia de

antioxidantes donadores de hidrógeno.

Reactivos: Cloruro potásico (ClK), fosfato disódico (Na2HPO4) y fosfato

monopotásico (KH2PO4) fueron de Panreac; cloruro sódico (ClNa) fue suministrado

por Merck y ABTS (sal diamonio 2,2ázinobis-(6-ácido sulfónico 3-

etilbenzotiazolina)), persulfato potásico (K2S2O8) y TROLOX (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-

tetrametilcroman-2-carboxílico) suministrados por Sigma-Aldrich. La solución PBS

pH 7,4 se compuso de las siguientes sales: NaCl 137 mM, KC l 2,7 mM, Na2HPO4

4,3 mM y KH2PO4 1,4 mM. La preparación del reactivos ABTS·+ se realizó

mezclando una solución de ABTS en PBS 7 mM con una solución acuosa de

persulfato potásico 2,45 mM en una proporción 1:1. La mezcla se mantuvo a

temperatura ambiente y en oscuridad de 12 a 16 horas antes de usar y

posteriormente se diluye con PBS pH 7,4.

Metodología: La determinación de la actividad antioxidante total se realizó

espectrofotométricamente a 734 nm añadiendo alícuotas de las muestras problema

al reactivo del ABTS·+. Para las determinaciones, se midió la absorbancia de 960 µL

de ABTS·+, añadiendo a continuación 35 µL de PBS pH 7,4 y 5 µL de muestra de

plasma, leyendo a los 4 minutos de reacción. Como blanco se emplearon 995 µL de

tampón PBS pH 7,4 y 5 µL de plasma. Los resultados se expresaron como TEAC

(trolox equivalent antioxidant capacity), referido a su porcentaje de capacidad de

inhibición o bien como concentración de TROLOX. La recta de calibrado con

TROLOX se realizó a partir de una solución estándar de TROLOX en metanol. El

ajuste de la recta de calibrado se muestra a continuación (Figura 26).

Material y Métodos

82

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 5 10 15 20 25 30

mM TROLOX%

inhi

bici

on

Figura 26. Recta patrón de TROLOX.

3.3.1.3. Determinación de Polifenoles Totales

Fundamento teórico: La cantidad total de polifenoles en plasma se determinó

de acuerdo con el procedimiento de Folin-Ciocalteau descrito por Singleton

(Singleton and Esau, 1969) basado en la importante capacidad de oxidación que

poseen los polifenoles y su posible cuantificación a pH básicos (en torno a 10). De

esta forma, los polifenoles presentes en plasma son oxidados por el reactivo de

Folin-Ciocalteau formándose un compuesto que presenta un máximo de absorción a

750 nm. La medida espectrofotométrica a esa longitud de onda es proporcional a la

concentración de polifenoles presentes en la muestra.

Reactivos: Acido metafosfórico (HPO3) 33,5-36,5% fue de Fluka, el reactivo de

Folin-Ciocalteau, el carbonato sódico anhidro (Na2CO3) y el ácido gálico fueron

adquiridos en Panreac.

Metodología: Para las determinaciones se centrifugaron 300 µL de plasma a

12.000 g durante 5 minutos. A continuación, a 250 µL de sobrenadante se le

añadieron 50 µL de una solución de ácido metafosfórico 1,32 M preparado in situ, y

se centrifugó a 2.700 g durante 3 minutos, precipitándose las proteínas que

posteriormente pudieran interferir en el análisis. A 50 µL del sobrenadante y 50 µL

de H2O milliQ, se le añadieron 500 µL del reactivo de Folin-Ciocalteau diluido 1:10 y

400 µL de una solución de carbonato de sodio al 7,5%, dejándolo incubar a

temperatura ambiente durante 40 minutos. Transcurrido el tiempo de incubación se

midió la absorbancia a 750 nm, empleando como blanco 50 µL de H2O milliQ. Los

cálculos se realizaron a partir de la recta patrón de ácido gálico realizada en paralelo

exactamente en las mismas condiciones experimentales (Figura 27).

Material y Métodos

83

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

µg/mL acido galico

Abs

orba

ncia

750

nm

Figura 27. Recta patrón de ácido gálico.

3.3.2. Determinación de nitrato y nitrito

Fundamento teórico: Los nitritos y nitratos presentes en plasma se

cuantificaron según el procedimiento descrito por Moshage (Moshage et al., 1995),

basado en la determinación colorimétrica de los nitritos con el reactivo de Griess,

antes y después de la conversión del nitrato a nitrito por la nitrato reductasa de

Aspergillus. Puesto que la nitrato reductasa requiere FAD y NADPH para funcionar,

el exceso de NADPH, que interfiere con el color posterior, se elimina con la enzima

lactato deshidrogenasa que lo utiliza para la conversión del piruvato a lactato. El

nitrito reacciona con ácido sulfanílico y naftilamina (componentes del reactivo de

Griess) en medio ácido, formando un compuesto diazónico (p-sulfobenceno-azo-α-

naftil-amina) con una máximo de absorción a 540 nm y un coeficiente de extinción

de 39,5 x 103 M-1 cm-1.

Reactivos: Fosfato monopotásico (KH2PO4), fosfato dipotásico (K2HPO4),

hidróxido potásico (KOH), nitrito sódico (NaNO2), sulfato de zinc (ZnSO4 7H2O) y

piruvato sódico (NaC3H3O3) fueron de Panreac; hidróxido sódico (NaOH), nitrato

sódico (NaNO3), sulfanilamida (cristalina), N-(1-naftil) etilendiamina, FAD (flavin

adenin dinucleótido, sal disódica), NADPH (β-nicotinamin adenin dinucleótido

fosfato, forma reducida, sal tetrasódica) y ácido fosfórico (H3PO4) fueron de Sigma-

Aldrich; lactato deshidrogenasa (de músculo de conejo; 142 U/mg de proteína) fue

adquirida en Fluka y nitrato reductasa (de Aspergillus spp, cristalina; 10 U/mg de

proteína) fue de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania). Para la preparación del

reactivo de Griess se partió de la solución A (2 g/L de sulfanilamida en 50 g/L de

ácido fosfórico) y de la solución B (0,2 g/L de N-(1-naftil) etilendiamina). En el

momento de su utilización se mezclan ambas soluciones en partes iguales

Material y Métodos

84

obteniéndose una concentración final de 1 g/L de sulfanilamida, 0,1 g/L de N-(1-

naftil) etilendiamina y 25 g/L de ácido fosfórico.

Metodología: Para las determinaciones, 300 µL de plasma se incubaron

(volumen final de 510 µL) con 50 µL de una solución de NADPH, 510 µM en tampón

fosfato 50 mM pH 7,5, 10 µL de una solución de FAD 255 µM en tampón fosfato 50

mM pH 7,5 y 10 µL de nitrato reductasa (10 mg/mL en tampón fosfato 50 mM pH

7,5), completando con el mismo tampón hasta alcanzar volumen final. Tras incubar

las muestras durante 20 minutos a 37 ºC, se añadieron 30 µL de lactato

deshidrogenasa (0,2 mg/mL en tampón fosfato potásico 0,15 M, pH 7,5) y 30 µL de

piruvato sódico 0,2 M, prosiguiéndose con la incubación otros 5 minutos a 37 ºC

para oxidar el NADPH. Finalmente, las muestras fueron desproteinizadas con 30 µL

de sulfato de zinc (300 g/L) y centrifugadas (15.000 g, 5 minutos) tras 15 minutos a

0-4 ºC. 500 µL del sobrenadante se mezclaron en tubos eppendorf con 500 µL del

reactivo de Griess y, tras 15 minutos a temperatura ambiente, para el desarrollo del

color, se determinó la absorbancia a 540 nm. Los valores de absorbancia así

obtenidos representan la suma total de las contribuciones de nitrato y nitrito. Para la

determinación de nitrito se procesaron paralelamente otras muestras, siguiendo

exactamente el mismo procedimiento, pero omitiendo la adición de nitrato reductasa.

La concentración de nitrato se obtuvo por sustracción de la concentración de nitrito

de la total de nitrato + nitrito. Los resultados se expresaron en concentración de

nitratos y nitritos para lo cual se realizaron ambas curvas de calibrado con tubos

patrón que contenían cantidades conocidas de nitrito o nitrato (Figura 28).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0

µM Nitrito

Abs

orba

ncia

540

nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

µM Nitrato

Abs

orba

ncia

540

nm

Figura 28. Rectas de calibrado de nitrito y nitrato.

Material y Métodos

85

3.3.3. Determinación de biomarcadores de daño oxida tivo a biomoléculas

3.3.3.1. Daño a oxidativo a Lípidos

3.3.3.1.1. Determinación de Hidroperóxidos

Fundamento teórico: Para cuantificar la cantidad de Hidroperóxidos (ROOHs)

en plasma se siguió el método colorimétrico de Nourooz-Zadeh (Nourooz-Zadeh et

al., 1994). El procedimiento se basa en la oxidación del ión ferroso a férrico por

hidroperóxidos lipídicos (ROOHs) en condiciones ácidas. Los iones férricos

producidos en el ensayo se complejan con el indicador naranja de xilenol generando

un cromóforo con un coeficiente de extinción a 560 nm de 4,3 x 104 M-1 cm-1. En

muestras de plasma el procedimiento utiliza trifenilfosfina para obtener un control

interno, ya que destruye los ROOHs presentes en plasma, señalando de esta

manera la presencia de ión férrico no producido por los ROOHs. Por otra parte, el

metanol/H2SO4 que se adiciona al medio desnaturaliza las proteínas facilitando el

acceso de los ROOHs a los iones ferrosos, y el hidroxitolueno butilado funciona

como antioxidante. El límite de detección del procedimiento es de,

aproximadamente, 1 µM.

Reactivos: Sulfato ferroso amónico (Fe(NH4)2(SO4)2 6H2O), peróxido de

hidrógeno (H2O2), ácido sulfúrico (H2SO4) y metanol (grado HPLC) fueron de

Panreac; naranja de xilenol, hidroxitolueno butilado (BHT) y trifenilfosfina (TPP)

fueron suministrados por Sigma-Aldrich. Para la preparación de solución de FOX 2,

se disolvieron 9,8 mg de sulfato ferroso amónico hexahidratado en 10 mL de H2SO4

250 mM y la solución obtenida se mezcla con 90 mL de metanol (grado HPLC)

conteniendo 79,2 mg de BHT. Finalmente, y bajo agitación, se añaden 7,6 mg de

naranja de xilenol. Las concentraciones finales de todos los componentes en el

reactivo son: sulfato ferroso amónico 20 µM, naranja de xilenol 100 µM, H2SO4 25

mM y BHT 4 mM en 90% de metanol (v/v). Previamente a su uso se calibró su

funcionamiento frente a soluciones de H2O2 de concentración conocida.

Metodología: Se transfirieron alícuotas de 90 µL de plasma a tubos eppendorf

que contenían 10 µL de metanol o 10 µL de TPP 10 mM en metanol (tubos control) y

se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente antes de la adición de 900 µL del

Material y Métodos

86

reactivo de FOX 2. Tras incubar otros 30 minutos a temperatura ambiente para el

desarrollo de color, las muestras se centrifugaron a 15.000 g durante 10 minutos y

se determinó la absorbancia del sobrenadante a 560 nm. De acuerdo con el

procedimiento utilizado, la absorbancia a utilizar para el cálculo de la concentración

de ROOHs en las muestras de plasma se obtuvo por diferencia entre la media de los

tubos experimentales y la de los controles tratados con TPP. Los cálculos se

realizaron a partir de la recta patrón de H2O2 realizada en paralelo exactamente en

las mismas condiciones experimentales.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 10 12µM H2O2

Abs

orba

ncia

560

nm

Figura 29. Recta patrón de peróxido de hidrógeno.

3.3.3.1.2. Determinación de malondialdehido (MDA)

Fundamento teórico: Para cuantificar la cantidad de MDA se utilizó el método

desarrollado recientemente por Grotto (Grotto et al., 2007) para su determinación por

HPLC. El procedimiento se basa en la reacción del malondialdehido con el ácido

tiobarbitúrico (TBA) en medio ácido generando un complejo formado por

condensación de dos moléculas de TBA y MDA y la posterior determinación del

complejo por HPLC empleando un detector ultravioleta-visible. A pesar de que el

TBA reacciona con una elevada variedad de compuestos, como azúcares,

aminoácidos, bilirrubina y otra serie de aldehídos, la posterior determinación por

HPLC proporciona al procedimiento una elevada especificidad. Por otra parte la

etapa inicial de hidrólisis alcalina va a permitir determinar no sólo el MDA libre, sino

también el unido a la matriz de otras moléculas.

Reactivos: n-Butanol, ácido fosfórico (H3PO4), fosfato monopotásico (KH2PO4),

fosfato dipotásico (K2HPO4) fueron de Panreac; dodecil sulfato sódico (SDS) fue de

Fluka; hidróxido sódico (NaOH) y metanol (pureza HPLC) fueron de Merck y ácido

Material y Métodos

87

tiobarbitúrico (TBA) y 1,1,3,3- tetrametoxipropano (TMP) fueron adquiridos en

Sigma-Aldrich.

Metodología: Se transfirieron alícuotas de 75 µL de plasma a tubos eppendorf

que contenían 25 µL de agua milliQ y 25 µL de NaOH 3M y se incubaron 30 minutos

a 60 ºC antes de la adición de 125 µL de una solución de H3PO4 al 6% y 125 µL de

TBA al 0,8%, preparado in situ. Tras incubar 45 minutos a 90 ºC, se enfrió la mezcla

y se añadieron 50 µL de una solución de SDS al 10% y se extrajo con 300 µL de n-

butanol. Tras agitar y centrifugar a 3.000 g durante 10 minutos, se procedieron a

inyectar 50 µL de la fase superior al equipo HPLC para su posterior determinación.

En la determinación cromatográfica (HPLC) del MDA se utilizó una columna ODS 5

µm de dimensiones 0,46*25 cm. Se aplicó un flujo isocrático de 1 mL/min con una

fase móvil formada por tampón fosfato potásico 50 mM pH 6,8 y metanol al 35% y un

detector ultravioleta visible a una λ de 532 nm. Los compuestos a estudiar se

identificaron por su tiempo de retención y el área del pico obtenido fue directamente

proporcional a la concentración de MDA en la muestra que se calculó por

interpolación en la recta de regresión de las curvas de calibrado obtenida con los

tubos patrón de TMP que contenían cantidades conocidas y se realizadas en igual

condiciones (Figura 30). Para la determinación de MDA en linfocitos, se procedió a

lisar las células sonicando tres veces durante 5 segundos con una potencia de 4 w.

Del resultante se tomaron 75 µL para realizar la determinación, siguiendo el mismo

procedimiento que el descrito para las muestras de plasma.

0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

160.000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

pmol MDA

Are

a

Figura 30. Recta patrón de malondialdehido.

Material y Métodos

88

3.3.3.2. Daño a oxidativo a Proteínas. Determinación de grupos carbonilo

Fundamento teórico: El procedimiento utilizado, desarrollado por Levine

(Levine et al., 1990), se basa en la reacción equimolar de los grupos carbonilo con la

2,4-dinitrofenilhidrazina (DNFH) en condiciones ácidas. La DNFH unida a proteínas

se cuantifica espectrofotométricamente (ε = 21 x 103 M-1 cm-1) tras la separación de

las proteínas derivatizadas por precipitación con ácido, lavado y posterior

solubilización con guanidina.

Reactivos: Fosfato monosódico (NaH2PO4), fosfato disódico (Na2HPO4) y

guanidina (clorhidrato) fueron de Sigma-Aldrich; ácido clorhídrico fue de Merck;

acetato de etilo, ácido trifluoroacético y 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNFH) fueron

adquiridos en Fluka y etanol y ácido tricloroacético (TCA) fueron suministrados por

Panreac.

Metodología: Para las determinaciones, 15 µL de plasma se mezclaron en

tubos eppendorf con 500 µL de DNFH al 0,2% (p/v) en ácido clorhídrico 2 N

incubando la mezcla 1 hora a temperatura ambiente con agitación ocasional (vórtex).

A continuación se añadieron 500 µL de TCA al 20% (p/v) y se dejó durante 15

minutos a 0-4 ºC para permitir la precipitación de las proteínas, que se separaron por

centrifugación (6.000 g, 3 minutos), descartándose el sobrenadante. Para eliminar el

exceso de reactivo libre, se lavó el precipitado tres veces con 1 mL de una mezcla

de etanol: acetato de etilo (1:1), dejando 10 minutos antes de recuperar el

precipitado por centrifugación (6.000 g, 3 minutos), y despreciándose cada vez el

sobrenadante. Finalmente, la proteína se redisolvió mediante agitación en 1 mL de

una solución guanidina 6 M pH 2,3 en tampón fosfato sódico 20 mM pH 6,5, ajustado

con ácido trifluoroacético. Tras incubación a 37 ºC durante 30 minutos, se determinó

su absorción óptica a 373 nm frente a una solución de guanidina. Para cada muestra

analizada se procesó en paralelo un blanco tratado exactamente en las mismas

condiciones pero sin DNFH (sólo con ácido clorhídrico 2 N). Los cálculos del

contenido de carbonilos para cada muestra se realizaron por diferencia de

absorbancias entre el tubo experimental derivatizado con DNFH y su blanco

correspondiente de HCl, y se expresaron como nmoles de grupos carbonilo/mg de

proteína presente en el ensayo. Para la determinación de los grupos carbonilos en

Material y Métodos

89

linfocitos, se procedió a lisar las células sonicando tres veces durante 5 segundos

con una potencia de 4 vatios. Del resultante se tomaron 50 µL para realizar la

determinación, siguiendo el mismo procedimiento que el descrito para las muestras

de plasma.

3.3.4. Determinación del estado redox

3.3.4.1. Determinación de Glutation Reducido (GSH)

Fundamento teórico: Para la determinación de la concentración de glutation

reducido (GSH) se siguió el método de Brigelius (Brigelius et al., 1983), basado en la

determinación espectrofotométrica de la conjugación del GSH con el cloro 2,4-

dinitrobenceno (CDNB) (ε = 9,6 mM-1 cm-1). Esta reacción está catalizada por la

enzima glutation-S-transferasa (GS-T). El GS-DNB formado absorbe a 340 nm de

longitud de onda, siendo proporcional el cambio de extinción medido

espectrofotométricamente a la cantidad de GSH presente en la muestra.

Reactivos: Fosfato monopotásico (KH2PO4) y fosfato dipotásico (K2HPO4),

fueron suministrados por Panreac; cloro 2,4-dinitrobenceno (CDNB) fue de Fluka;

etanol puro fue de Merck; glutation-S-transferasa (GS-T) de equine liver (25 U/mg de

proteína) y ácido etilendiamino tetracético (EDTA) fue adquirido en Sigma-Aldrich.

Metodología: Para las determinaciones, 25 µL de plasma se mezclaron con

750 µL de tampón fosfato potásico 0,1 M, EDTA 1 mM pH 7 y 10 µL de CDNB 10

mM en etanol puro procediendo a determinar su valor de absorbancia. A

continuación se añadieron 5 µL de glutation-S-transferasa (1 mg/mL en tampón

fosfato potásico 0,1 M, EDTA 1 mM pH 7), siguiendo la reacción

espectrofotométricamente a 340 nm. La diferencia de absorbancia obtenida antes y

después de añadir la enzima es proporcional a la cantidad de GSH presente en la

muestra y se expresaron como µmoles/g de hemoglobina presente en el ensayo.

Para la determinación de GSH en linfocitos, se procedió a lisar las células sonicando

tres veces durante 5 segundos con una potencia de 4 w. Del resultante se tomaron

25 µL para realizar la determinación, siguiendo el mismo procedimiento que el

descrito para las muestras de plasma.

Material y Métodos

90

3.3.4.2. Determinación de la actividad Tiorredoxina Reductasa (TrxR)

Fundamento teórico: El ensayo de la actividad de la tiorredoxina reductasa en

plasma fue llevado a cabo usando una ligera modificación del método descrito por

Holmgren y Bjornstedt (Holmgren and Bjornstedt, 1995). El procedimiento se basa

en la catálisis llevada a cabo por el sistema tiorredoxina la cual reduce el grupo

disulfuro de la insulina y cuyo producto es utilizado como sustrato de un ensayo

acoplado para la determinación de la tiorredoxina reductasa. El consumo de NADPH

necesario para la catálisis enzimática, que es cuantificado mediante disminución de

absorbancia (λ= 412 nm), es proporcional a la actividad enzimática de la tiorredoxina

reductasa.

Reactivos: Tampón HEPES, ácido etilendiamino tetracético (EDTA), NADPH

(β-nicotinamin adenin dinucleótido fosfato, forma reducida, sal tetrasódica),

guanidina (clorhidrato), albúmina de suero bovino (BSA), tiorredoxina de E.coli (3

U/mg de proteína), ácido 5,5' ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB) y tiorredoxina

reductasa de E.coli (25 U/mg de proteína) fueron adquiridos en Sigma-Aldrich;

insulina humana fue de Boehringer Mannheim y tampón Tris-HCl fue de Panreac.

Para la preparación de la solución reactiva se mezclaron 200 µL del tampón HEPES

1 M, pH 7,6 con 40 µL de una solución de EDTA 0,2 M, 40 µL de una solución

NADPH con una concentración de 40 mg/mL y 500 µL de insulina 10 mg/mL.

Metodología: Para las determinaciones, las muestras de plasma diluidas 1:1

con agua milliQ se mezclaron con 40 µL de la solución reactiva, manteniendo los

eppendorf en hielo. A continuación se añadieron 10 µL de una solución 60 µM de

tiorredoxina de E.coli, completando con agua milliQ hasta un volumen final de 120

µL e incubando durante 20 minutos a 37 ºC. Tras añadir 750 µL de una solución que

para la reacción, formada por DTNB 0,4 mg/mL y guanidina 6 M en Tris-HCl 0,2 M,

pH 8, se determina la absorbancia a 412 nm. Como blanco se realiza la reacción en

ausencia de tiorredoxina, sustrato de la reacción. Para el cálculo de las

concentraciones de tiorredoxina reductasa (mU/mL), se realizó en las mismas

condiciones experimentales una recta patrón (Figura 31), para lo que se prepararon

soluciones a diferentes concentraciones de tiorredoxina reductasa procedente de

Material y Métodos

91

E.coli en Tris-HCl 50 mM pH 7,5 y EDTA 1 mM con BSA en una concentración de

100 µg/mL.

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0 5 10 15 20 25 30

mU/mL TrxR

Abs

orba

ncia

412

nm

Figura 31. Recta patrón de tiorredoxina reductasa.

3.3.4.3. Determinación de la concentración de Tiorr edoxina (Trx)

Fundamento teórico: Para la determinación de la concentración de

tiorredoxina se empleó un kit de ELISA, basado en el procedimiento desarrollado por

Kogaki (Kogaki et al., 1996) y Nakamura (Nakamura et al., 1996), el cual emplea dos

diferentes anticuerpos monoclonales contra dos diferentes epitopos de la

tiorredoxina humana. Por otra parte, estos anticuerpos no son capaces de reconocer

la tiorredoxina mitocondrial (TRx2) ni la tiorredoxina de origen no humana, lo que por

tanto les confiere una muy alta especificidad.

Reactivos: Kit de ELISA para la determinación de tiorredoxina humana fue

adquirido en Ebisu Build, Shimotsutsumi-cho, Kawabata Marutamachi, Sakyo-ku,

Kyoto 606-8396, Japan.

Metodología: Para las determinaciones, se añadieron en los pocillos cubiertos

con el anti-anticuerpo monoclonal de tiorredoxina humana 220 µL por pocillo de

muestra de plasma o bien 220 µL de los estándares proporcionados en el kit diluidos

1:10, dejando el micro plato en incubación durante 2 horas a temperatura ambiente.

Tras realizar un primer lavado con 300 µL/pocillo de solución, se añadieron 200

µL/pocillo de una solución compuesta por peroxidasa conjugada con anti-anticuerpos

monoclonales de tiorredoxina humana y se dejó incubar durante 2 horas a

temperatura ambiente. Tras llevar a cabo un segundo lavado se añadieron 100

µL/pocillo de una solución de reacción formada por el sustrato de la peroxidasa

Material y Métodos

92

unido a un cromóforo que permitirá el posterior desarrollo de color. Trascurridos 30

minutos de incubación a temperatura ambiente se añadieron 100 µL/pocillo de

solución de parada que además de finalizar la reacción enzimática permitió

estabilizar el desarrollo de color.

Por último se procedió a la lectura del micro plato a una densidad óptica de 450

nm, obteniendo la concentración de tiorredoxina en ng/mL presente en plasma por

interpolación con el resultado de la curva patrón obtenido a partir de los estándares

de reacción (Figura 32).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0 20 40 60 80 100 120 140

ng/mL Trx

Abs

orba

ncia

450

nm

Figura 32. Recta patrón de tiorredoxina.

3.3.5. Otras determinaciones

3.3.5.1. Determinación de Proteínas en plasma y en linfocitos

Fundamento teórico: La determinación de la concentración de proteínas

existentes en las muestras de plasma se realizó por el procedimiento de Lowry y

cols (Lowry et al., 1951). El método se basa en la propiedad que presentan los

compuesto con enlaces peptídicos de reaccionar en medio alcalino con sales de

cobre para dar un coloración violeta (reactivo de Biuret), en una primera reacción. En

una segunda reacción, el reactivo de Folin para fenoles (restos de tirosina y

triptófano) permite incrementar la sensibilidad del procedimiento.

Reactivos: Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O) fue suministrado

por Probus. El carbonato de sodio (Na2CO3), hidróxido de sodio (NaOH) y tartrato

sodio-potasio (C4H4KNaO6) fueron suministrados por Panreac. Albúmina de suero

bovino (BSA) y el reactivo de Folin-Ciocalteau fueron suministrados por Sigma-

Aldrich. El Reactivo A se compuso de 1 mL de una solución de Na2CO3 al 3% en

Material y Métodos

93

NaOH 0,1 M, 1 mL de CuSO4.5H2O al 2% y 98 mL de una solución de tartrato Na-K

al 4%. Asimismo, el Reactivo B se formó mediante dilución 1:1 del reactivo Folin-

Ciocalteau.

Metodología: Para las determinaciones, se añadieron 10 µL de una muestra

de plasma diluida en agua milliQ 1:4, 490 µl de agua milliQ y 2,5 mL del reactivo A.

Tras incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente se añadieron 250 µL del

reactivo B dejándolo reposar nuevamente durante 10 minutos, al final de los cuales

se determinó la absorbancia a 620 nm. La concentración de proteínas, expresado en

mg/mL de BSA, se realizó por interpolación de las absorbancias en una curva patrón

realizada con muestras a diferentes concentraciones de BSA (seroalbúmina bovina),

tal y como muestra la figura 33.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1

mg/mL BSA

Abs

orba

ncia

620

nm

Figura 33. Recta patrón para cuantificar proteínas.

Para la determinación de proteínas en linfocitos, se procedió a lisar las células

sonicando tres veces durante 5 segundos con una potencia de 4 vatios. Del

resultante se tomaron 25 µL para realizar la determinación, siguiendo el mismo

procedimiento que el descrito para las muestras de plasma.

3.3.5.2. Determinaciones del laboratorio clínico de referencia

A lo largo del presente estudio además se emplearon resultados de una serie

de parámetros clínicos cuyas medidas se realizaron en el Servicio de Análisis

Clínicos del Complejo Asistencial de Burgos.

Material y Métodos

94

3.4. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS

Los resultados de este trabajo han sido procesados con el paquete estadístico

de Stat Graphics. Se llevaron a cabo análisis comparativos ANOVA, y t de Student

con el fin de determinar las diferencias significativas entre las muestras a un nivel de

significación de α=0,05.

Los resultados obtenidos de la medición de los distintos parámetros en las

diferentes poblaciones se resumen en las tablas y/o en los gráficos que se presentan

en el apartado de Resultados. Los datos recogidos en las tablas corresponden al

valor promedio ± su desviación estándar. Las letras minúsculas y símbolos del test

de ANOVA en forma de superíndices se incluyen en las tablas y los gráficos. Dichas

letras indican los resultados del test después de realizar una comparación múltiple

de las medias de los tres valores ensayados en una misma muestra para una

variable determinada. Si dichos superíndices son distintos para una misma columna

en caso de las tablas y en el caso de los gráficos para una misma serie de

columnas, los valores correspondientes serán estadísticamente diferentes entre sí a

un nivel de significación de p<0,05. La secuencia en orden alfabético de letras como

superíndice corresponde al ordenamiento de menor a mayor del valor promedio de

las muestras.

Los símbolos (*) indican los resultados de t de Student. Así, (*), (**) o (***)

indican diferencias significativas a niveles de p<0,05, p<0,005 o bien p<0,0005,

respectivamente.

Para el análisis de las correlaciones entre las variables estudiadas se aplicaron

los contrastes de Pearson, Student y Snedecor a un nivel de significación de p<0,05.

RESULTADOS

Resultados

95

4. RESULTADOS

4.1. ESTADÍSTICOS DESCRIPTIVOS INICIALES DE LAS MUE STRAS DE

PACIENTES Y SUJETOS CONTROL

En la primera etapa del estudio se han establecido las características iniciales

de la población con cáncer colorrectal (CCR) y se comparó con un grupo control de

individuos sanos.

En la Tabla II se resumen las diferentes variables características de las

muestras correspondientes al grupo control, que tiene un tamaño muestral de 71

sujetos con una media de 55 años de edad. Debido a los requisitos básicos

establecidos para realizar la donación voluntaria de sangre en cuanto a edad y a

patologías de base, los individuos control no poseen enfermedad alguna, salvo un

tercio de sujetos que presenta algún tipo de lipidemias, alteración que no afecta al

manejo de los resultados de las mediciones realizadas en el estudio. En cuanto a

parámetros analíticos, sólo se ha obtenido el resultado correspondiente a

hemoglobina y proteínas totales, con un promedio dentro de los valores de

referencia.

Tabla II . Características poblacionales del grupo control.

PARÁMETRO CONTROL

Tamaño muestra 71Edad (años) 55 ± 3Sexo 51 H/ 20 MHipertensión 0%EPOC 0%Diabetes 0%Lipidemias 32%Parámetros analíticos

Hemoglobina (g/dL) 15,2 ± 1,1Proteínas totales (g/dL) 7,4 ± 0,4

En la Tabla III se resumen las características de la población con CCR, con un

tamaño muestral de 85 pacientes y una media de edad de 66 años cuya desviación

estándar es de ± 10 años, aproximándose a la edad media del grupo control. La

composición por sexos de ambos grupos también es similar (72% hombres en CCR

frente a un 77% de hombres en el grupo control).

Resultados

96

Tabla III . Características poblacionales del grupo de enfermos con CCR.

PARÁMETRO CCR

Tamaño muestra 85Edad (años) 66 ± 10Sexo 61 H/ 24 MPS-ECOG

0 34%1 62%2 2%3 1%

Hipertensión 39%EPOC 4%Diabetes 19%Lipidemias 27%Otras neoplasias anteriores 9%Estadío

II 12%III 32%IV 56%

Grado de diferenciaciónPobremente diferenciado 11%Moderadamente diferenciado 80%Altamente diferenciado 9%

Metástasis 56%Hepáticas 33%No hepáticas 31%Hepáticas y otras 35%

Parámetros analíticosLeucocitos (mill/mm3) 6,3 ± 2,6Hemoglobina (g/dL) 12,2 ± 1,6Creatinina (mg/dL) 0,9 ± 0,4Bilirrubina total (mg/dL) 0,8 ± 1,1Proteínas totales (g/dL) 7,0 ± 0,7Fosfatasa Alcalina (UI/L) 131 ± 162Lactato Deshidrogenasa (UI/L) 450 ± 493

Marcadores TumoralesCEA (ng/mL) 72 ± 184Ca 19.9 (UI/L) 251 ± 898

Tratamiento quirúrgico previo 93%Tratamiento radioterápico previo 11%Tratamiento quimioterápico previo 32%Tratamiento quimioterápico actual

Sin tratamiento 15Tratamiento 70Tipo 1 47%Tipo 2 37%Tipo 3 16%

Resultados

97

A diferencia del grupo control, tan sólo el 16% de la población con CCR no

tiene ninguna patología acompañando al proceso carcinogénico. Entre estas

enfermedades destaca la hipertensión arterial (HTA) (39%), seguida de lipidemias

(27%) y de diabetes (19%). Por otra parte, el 9% de los pacientes estudiados ya

habían desarrollado anteriormente algún proceso tumoral, sin relación alguna con el

cáncer colorrectal actual.

En cuanto al estadío, algo más de la mitad de los enfermos (56%) se

encuentran en un estado avanzado de la enfermedad, con algún tipo de metástasis

(33% hepáticas, 31% no hepáticas y 35% hepáticas y otras). Cabe destacar que el

80% de los carcinomas estudiados corresponden a un grado de diferenciación

moderado.

El valor promedio de los parámetros analíticos (leucocitos, creatinina, bilirrubina

total y proteínas totales) se encuentra dentro de los límites marcados por el

laboratorio de referencia, salvo en el caso de la hemoglobina, cuyo valor es

ligeramente inferior al referenciado. Respecto a los valores promedio de las enzimas

plasmáticas, fosfatasa alcalina y lactato deshidrogenasa, destacar que los resultados

presentan una dispersión muy elevada, con una desviación estándar superior al

100% del valor promedio. Esto también ocurre con el valor promedio de los

marcadores tumorales CEA y Ca 19.9, valores que además se encuentran muy por

encima de los límites de referencia.

Por otra parte, la mayoría de los pacientes (93%) han sido sometidos a algún

tipo de tratamiento quirúrgico previo relacionado con el proceso cancerígeno, y sólo

en un 11% de los casos han recibido radioterapia concomitante con el tratamiento

quimioterápico.

En cuanto al tratamiento quimioterápico, del grupo total, 15 pacientes (18%) no

habían comenzado el tratamiento quimioterápico o bien lo habían finalizado por lo

menos 6 meses antes de la toma de muestra. Los pacientes restantes, que

representan el 82% de la población estudiada, estaban recibiendo algún tipo de

tratamiento quimioterápico en el momento de la toma de muestra, agrupados según

descrito en el apartado de Material y Métodos.

Resultados

98

El 47% de los pacientes tratados recibieron algún tipo de fluoropirimidina (5-FU

o capecitabina) sola (7%) o bien junto a oxaliplatino o irinotecan (40%). En el 37% de

los pacientes, junto con la fluoropirimidina y el oxaliplatino o irinotecan se les

administró algún tipo de anticuerpo monoclonal (bevacizumab, cetuximab o

panitumumab). Un 16% de los pacientes recibieron otro tipo de tratamiento.

Por otro parte, se ha contado con un pequeño grupo de población con cáncer

gástrico (CG) y otra población de sujetos con linfoma (L), que nos ha permitido

realizar una aproximación al estudio comparativo del estrés oxidativo en los tres

tipos de enfermedad.

Respecto a la población con cáncer gástrico (Tabla IV), está compuesta por 12

sujetos, 7 hombres y 5 mujeres con un promedio de edad de 69 años. Como

patología de base cabe destacar la hipertensión, presente en un 42% de los

individuos que componen la población estudio. El 17% de los pacientes habían

padecido algún tipo de neoplasia anterior, no relacionada con el proceso actual.

Prácticamente el total de los enfermos (92%) presenta la enfermedad en un estadío

IV, y con un grado de diferenciación pobre y moderado (55% y 45%

respectivamente). Los valores promedio de los parámetros analíticos estudiados se

encuentran dentro de los límites marcados según laboratorio de referencia, menos la

hemoglobina, ligeramente inferior al valor marcado. Al igual que en la población con

CCR, los valores de tanto las enzimas plasmáticas como de los marcadores

tumorales presentan una elevada dispersión, mucho más acusado en el caso de los

marcadores tumorales, con una desviación estándar por encima del 100% del valor

promedio. Además, destacar que el valor promedio de la lactato deshidrogenasa, del

marcador CEA y del Ca 19.9 se encuentran fuera de los límites de referencia.

Resultados

99

Tabla IV . Características poblacionales del grupo enfermos con CG.

PARÁMETRO CG


0 8%1 75%2 17%

Hipertensión 42%EPOC 8%Diabetes 8%Lipidemias 0%Otras neoplasias anteriores 17%Estadío

II 8%III --IV 92%

Grado de diferenciaciónPobremente diferenciado 55%Moderadamente diferenciado 45%Altamente diferenciado --

Metástasis 92%Parámetros analíticos

Leucocitos (mill/mm3) 6,8 ± 5,1Hemoglobina (g/dL) 11,2 ± 1,8Creatinina (mg/dL) 0,9 ± 0,3Bilirrubina total (mg/dL) 0,7 ± 0,3Proteínas totales (g/dL) 6,8 ± 0,7Fosfatasa Alcalina (UI/L) 128 ± 65Lactato Deshidrogenasa (UI/L) 596 ± 426

Marcadores TumoralesCEA (ng/mL) 51 ± 111Ca 19.9 (UI/L) 308 ± 907

Respecto a la población estudiada con linfoma, (Tabla V) está compuesta por

16 pacientes (6 hombres y 10 mujeres), con un promedio de edad de 59 años. El

69% de la población presenta hipertensión y sólo un 6% han desarrollado otro

proceso neoplásico con anterioridad. El 69% de los pacientes presenta la

enfermedad en un estadío inicial, mientras que el 13% de la población tiene

desarrollada la enfermedad de forma más avanzada. Respecto a los parámetros

analíticos destacar que los valores promedios, salvo la hemoglobina, ligeramente por

debajo del valor de referencia, se encuentran dentro de los límites referenciados. En

cuanto a las enzimas plasmáticas, la fosfatasa alcalina se encuentra dentro de los

Resultados

100

valores de referencia, mientras que la lactato deshidrogenasa, con una dispersión

muy elevada, presenta un valor promedio por encima del límite. Por otra parte, el

promedio del marcador tumoral estudiado, Beta-2-microglobulina, presenta valores

normales y la velocidad de sedimentación de la sangre es ligeramente superior al

valor referenciado.

Tabla V . Características poblacionales del grupo de enfermos con linfoma.

PARÁMETRO LINFOMA


0 63%1 19%2 19%

Hipertensión 69%EPOC 6%Diabetes --Otras neoplasias anteriores 6%Estadío

I 69%II 6%III 13%IV 13%

Parámetros analíticosLeucocitos (mill/mm3) 6,6 ± 2,4Hemoglobina (g/dL) 12,0 ± 2,5Creatinina (mg/dL) 0,8 ± 0,2Bilirrubina total (mg/dL) 0,9 ± 0,3Proteínas totales (g/dL) 7,2 ± 0,9Fosfatasa Alcalina (UI/L) 95 ± 35Lactato Deshidrogenasa (UI/L) 576 ± 552

Marcadores TumoralesBeta-2 microglobulina (µg/L) 2.008 ± 477VSG (mm/hr) 20 ± 13

Resultados

101

4.2. ESTUDIO COMPARATIVO DEL ESTADO OXIDATIVO SEGÚN EL TIPO DE

CÁNCER

En una primera aproximación al estudio del estrés oxidativo en pacientes con

cáncer, se ha comparado el resultado promedio de los diferentes parámetros

medidos en los grupos de población estudiados, grupo control, pacientes con cáncer

colorrectal, con cáncer gástrico y con linfoma.

Los parámetros medidos, descritos en el apartado de material y métodos,

responden al análisis del estrés oxidativo en las diferentes poblaciones objeto de

estudio. Así, para realizar dicha valoración se ha dispuesto fundamentalmente de

cuatro tipos de datos. Por un lado, los que indican el estado antioxidante, medido

como capacidad antioxidante total del plasma, a través del método FRAP y ABTS y

la cuantificación de los polifenoles. En segundo lugar, estaría la determinación de los

niveles de nitrito y nitrato como indicadores de niveles de óxido nítrico. Continuando

con el estudio, se encuentran los datos indicadores del daño oxidativo a lípidos y

proteínas, enmarcando las determinaciones de diferentes biomarcadores

(hidroperóxidos, MDA y grupos carbonilo), tanto en plasma como en linfocitos, en el

caso del MDA y de los grupos carbonilo. Por último, se han englobado los

parámetros relacionados con el estado redox, determinación de glutation reducido,

tanto en plasma como en linfocitos, y cuantificación del sistema tiorredoxina

(tiorredoxina y tiorredoxina reductasa).

Los resultados obtenidos de la medición de los distintos parámetros en las

diferentes poblaciones se resumen en las tablas y/o en los gráficos que se presentan

a continuación.

4.2.1. Capacidad antioxidante total del plasma

La Tabla VI y la Figura 34 recogen el valor promedio junto con la desviación

estándar obtenidos de la determinación de los parámetros indicadores de la

capacidad antioxidante total del plasma.

Resultados

102

Tabla VI . Capacidad antioxidante total del plasma en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control.

Control CCR CG L

FRAP (mM Fe 2+) 0,879 ± 0,197b 0,718 ± 0,117a 0,701 ± 0,166a 0,684 ± 0,100a

ABTS (mM TROLOX) 3,37 ± 0,789b 2,38 ± 0,547a 2,69 ± 0,654a 2,38 ± 0,549a

Polifenoles (mM) 603 ± 105d 343 ± 81,4a 418 ± 95,1b 513 ± 81,1c

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. Filas con letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Los resultados muestran que la capacidad antioxidante del plasma es

significativamente más alta en el grupo control que en los pacientes con enfermedad

neoplásica. Así, el grupo control presenta un 22% más de capacidad antioxidante,

según el método FRAP, y un 42% más, según ABTS, respecto a la población con

CCR. Además, la población control tiene un 78% más de concentración de

polifenoles comparado con los enfermos colorrectales.

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

FRAP ABTS

FR

AP

(mM

Fe

2+)

AB

TS

(mM

TR

OLO

X)

CONTROL CCR CG LINFOMA

ba aa

b

aaa

A

0

100

200

300

400

500

600

700

Polifenoles

mM


d

bc

a

B

Figura 34 . Capacidad antioxidante total, medida mediante método FRAP y ABTS (A) y polifenoles (B) en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Por otra parte, no se encuentran diferencias significativas entre los tres tipos de

enfermedad, salvo en el caso de los polifenoles, donde se detectan niveles

significativamente diferentes en cada uno de los grupos poblacionales estudiados.

4.2.2. Biomarcadores de óxido nítrico en plasma

Los resultados de los niveles de nitrito y nitrato como indicadores de óxido

nítrico en plasma se muestran en la Tabla VII y en la Figura 35. La población con

cáncer colorrectal presenta unos valores promedio para el nitrito (3,38 ± 0,840) y el

nitrato (18,9 ± 4,22) significativamente superiores a los encontrados en la población

control (2,42 ± 0,479 y 13,3 ± 3,36, respectivamente).

Resultados

103

Tabla VII . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control.

Control CCR CG L

Nitrito (µM) 2,42 ± 0,479a 3,38 ± 0,840b 2,33 ± 0,165a 4,70 ± 1,06c

Nitrato (µM) 13,3 ± 3,36a 18,9 ± 4,22c 17,1 ± 3,58b,c 14,3 ± 2,22a,b


Con respecto a la población con cáncer gástrico y el resultado de la

determinación del nitrito, destacar que no se detectan diferencias significativas con

respecto al grupo control, pero sí con el resto de enfermos. En cuanto a la

concentración de nitrato, sí presenta diferencias significativas con el grupo control,

pero no con las otras dos poblaciones estudiadas.

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,022,525,0

Nitrito Nitrato

µµ µµM


a a

cb

a

b,c

a,b

c

Figura 35 . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

En relación a los pacientes con linfoma, en cuanto a la determinación del nivel

de nitrito, sí se detectan diferencias significativas respecto a los otros dos tipos de

cáncer estudiados así como con el grupo control, mientras que en el caso del nitrato,

sólo se presentan éstas con el grupo de pacientes CCR.

4.2.3. Biomarcadores de daño oxidativo a biomolécul as

a. Lípidos

Como parámetros indicativos del daño oxidativo a lípidos se han determinado

los niveles de MDA en plasma y en linfocitos así como la concentración de

hidroperóxidos en plasma.

Resultados

104

Los resultados en plasma muestran (Tabla VIII y Figura 36) que existe una

diferencia significativa en cuanto a los niveles de hidroperóxidos y MDA, medidos en

la población control con respecto a los tres grupos de enfermos. Así, el grupo con

CCR con respecto a los sujetos control, posee un porcentaje de incremento en los

niveles de hidroperóxidos de un 44% y de un 51% para el MDA y no muestra

diferencias significativas con los otros dos grupos de población, en el caso de los

hidroperóxidos pero sí con el resultado obtenido del MDA.

Tabla VIII . Concentración de indicadores del daño a lípidos medido en plasma en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control.

Control CCR CG L

Hidroperóxidos (µM) 4,03 ± 0,986a 9,18 ± 2,19b,c 8,06 ± 1,69b 9,67 ± 2,18c

MDA-plasma (nM) 101 ± 25,3a 198 ± 49,8c 165 ± 23,3b 229 ± 39,6d


En relación a los enfermos con cáncer gástrico y linfoma los resultados

muestran que existe diferencia significativa entre ambos grupos de población,

aunque los niveles promedio reflejan menor incremento que los detectados con

respecto al grupo control.

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

Hidroperoxidos

µµ µµM


a

b

cb,c

A

0

50

100

150

200

250

300

MDA plasma

nM


a

b

dc

B

Figura 36 . Indicadores del daño a lípidos, mediante medida de concentración de hidroperóxidos (A) y MDA (B) medidos en plasma en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

La determinación de MDA en linfocitos (Tabla IX y Figura 37), como

biomarcador del daño oxidativo a lípidos, refleja diferencias significativas entre el

control y los tres grupos de enfermos, no entre los pacientes con CCR y CG y sí

entre el grupo con linfoma y las otras dos poblaciones con enfermedad tumoral.

Asimismo, se detecta un incremento de un 56% en la población con cáncer

colorrectal respecto a los valores del grupo control.

Resultados

105

Tabla IX . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control.

Control CCR CG L

MDA-linfocitos (nM) 36,6 ± 9,09a 65,3 ± 16,3b 62,7 ± 15,3b 80,9 ± 11,4c


Estos resultados parecen indicar que el MDA, como biomarcador de daño a

lípidos, presenta mayor sensibilidad en plasma que en linfocitos.

0

50

100

150

200

250

300

MDA linfocitos

nM


ab cb

Figura 37 . Concentración de indicadores del daño a lípidos medido en linfocitos en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

b. Proteínas

Como parámetros indicativos del daño oxidativo a proteínas se han

determinado los niveles de grupos carbonilo (GC) en plasma y en linfocitos.

En el caso de la determinación en plasma (Tabla X y Figura 38), el resultado

muestra diferencias significativas entre los cuatro grupos de población estudiados.

Destacar que se detectan niveles de oxidación de las proteínas hasta 5 veces más

en los pacientes con cáncer colorrectal que en el grupo control.

Tabla X . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control.

Control CCR CG L GC-plasma (nmoles/mg proteína)

3,18 ± 0,779a 15,3 ± 3,42d 8,50 ± 2,07b 11,9 ± 2,89c


Resultados

106

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC plasma

nmol

es/m

g pr

otCONTROL CCR CG LINFOMA

a

b

c

d

Figura 38 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Por otra parte, al igual que en los resultados del daño a lípidos, se detecta

menor nivel de sensibilidad de este parámetro en linfocitos (Tabla XI y Figura 39)

que en plasma, ya que sólo se encuentran diferencias significativas entre el grupo

control y las poblaciones enfermas pero no entre ellas. Asimismo, el nivel de

oxidación encontrado entre la población con CCR y el grupo control es algo menor

(2,8 veces) que el detectado en las determinaciones realizadas en el plasma.

Tabla XI . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control.

Control CCR CG L GC-linfocitos (nmoles/mg proteína) 3,24 ± 0,819a 8,92 ± 2,25b 9,46 ± 2,14b 8,76 ± 1,63b


0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC linfocitos

nmol

es/m

g pr

ot


a

bbb

Figura 39 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Resultados

107

4.2.4. Estado Redox

Para el estudio del estado redox se midió la concentración del antioxidante no

enzimático glutation (GSH) tanto en plasma como en linfocitos, así como del sistema

tiorredoxina en plasma, formado por la tiorredoxina (Trx) y la enzima tiorredoxina

reductasa (TrxR).

En la Tabla XII y en la figura adjunta (Figura 40) se resumen los resultados del

estado redox en plasma.

Así, en el caso del GSH sólo se detectan cambios significativos entre la

población formada por los pacientes con CCR y el resto de grupos estudiados.

Sin embargo, la actividad tiorredoxina reductasa es significativamente menor

en el grupo control respecto a los tres grupos de enfermos. Este mismo

comportamiento se observa al analizar los resultados de medir la concentración de

la tiorredoxina, detectándose diferencias significativas entre los grupos estudiados,

salvo en el caso de la población con CG, que no muestra diferencias ni con el grupo

control ni con el CCR.

Tabla XII . Estado redox medido en plasma en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control.

Control CCR CG L GSH-plasma (µmoles/g Hb)

0,649 ± 0,119b 0,497 ± 0,126a 0,582 ± 0,060b 0,615 ± 0,129b

Trx (ng/mL) 40,1 ± 22,0a 59,1 ± 35,4b 64,8 ± 63,4a,b 131 ± 128c

TrxR (mU/mL) 5,54 ± 1,36a 6,61 ± 1,28b 6,61 ± 0,974b 6,44 ± 1,40b


Resultados

108

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

GSH plasma

µµ µµm

oles

/g H

b


b

bb

a

A

0

50

100

150

200

250

300

Trx

ng/m

L


a

a,b

c

b

B

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

TrxR

mU

/mL


ab bb

C

Figura 40 . Estado redox medido en plasma mediante concentración de GSH (A), Trx (B) y actividad TrxR (C) en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Respecto al resultado de las mediciones realizadas de GSH en linfocitos (Tabla

XIII y Figura 41), al igual que ocurre en plasma, sólo se detectan cambios

significativos entre la población formada por los pacientes con CCR y el resto de

grupos estudiados.

Tabla XIII . Estado redox medido en linfocitos en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control.

Control CCR CG L GSH-linfocitos (µmoles/g proteína)

6,04 ± 1,46b 3,23 ± 0,778a 5,65 ± 1,24b 5,65 ± 1,07b


0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

GSH linfocitos

µµ µµm

oles

/g p

rot


bb b

a

Figura 41 . Estado redox medido en linfocitos (concentración de GSH) en una población con cáncer colorrectal, gástrico o linfoma respecto al grupo control. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Resultados

109

4.3. ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES CON CÁNCER

COLORRECTAL

Para el estudio del estrés oxidativo en pacientes con cáncer colorrectal, se ha

contado con un total de 85 pacientes, los cuales han sido agrupados en base a

diferentes criterios con objeto de conformar las distintas poblaciones permitiendo

realizar un completo abordaje al estudio de la enfermedad respecto al estado de

estrés oxidativo que presentan. Así, en un primer caso, se ha estudiado el estado

oxidativo debido exclusivamente al proceso tumoral, para lo que se ha contado sólo

con los enfermos de cáncer colorrectal que no han recibido ningún tipo de

tratamiento quimioterápico o bien lo han finalizado por lo menos 6 meses antes de la

toma de muestra para el estudio. En un segundo escenario, se ha analizado la

relación existente entre el tratamiento quimioterápico y los niveles de estrés

oxidativo presentes en esta población. A continuación y en tercer lugar, se ha

estudiado el estado oxidativo en función de la presencia o no de metástasis, para

por último, empleando el nivel de los marcadores tumorales CEA y Ca 19.9 como

indicador de evolución de la enfermedad, se han analizado los niveles de estrés

oxidativo presentes en las poblaciones estudiadas de acuerdo al valor de estos

marcadores.

Para el desarrollo del estudio se han empleado los parámetros ya descritos en

el apartado de material y métodos, los cuales agrupados en cuatro tipos de datos

(capacidad antioxidante total del plasma, niveles de nitrito y nitrato, biomarcadores

de daño oxidativo a lípidos y proteínas y estado redox), permiten responder al

análisis del estrés oxidativo.

De igual forma que en el apartado anterior, los resultados obtenidos de la

medición de los diferentes parámetros se recogen en tablas y/o gráficos donde

también quedan reflejadas las diferentes significancias detectadas en base al

tratamiento estadístico realizado posteriormente de los resultados obtenidos.

4.3.1. Estudio del estrés oxidativo asociado al cán cer colorrectal

En un primer momento se ha hecho necesario conocer el nivel de estrés

oxidativo asociado sólo y exclusivamente al proceso tumoral, y no el producido

Resultados

110

además por otras causas, como pueden ser, fundamentalmente, los diferentes

tratamientos quimioterápicos, ya que, tal y como se ha descrito en el apartado de

revisión bibliográfica, muchos de los mecanismos de acción de este tipo de fármacos

están mediados o bien causan directa o indirectamente alteraciones en los niveles

de oxidación. Por tanto, en este estudio, se ha contemplado un grupo de pacientes

con cáncer colorrectal, pero que todavía no han comenzado el tratamiento

quimioterápico o bien lo han finalizado al menos 6 meses antes de la toma de

muestra, comparando sus niveles de estrés respecto a un grupo de sujetos control.

El análisis de estos resultados permitirá evaluar si el desarrollo de la enfermedad

afecta a los niveles de estrés oxidativo.

4.3.1.1. Capacidad antioxidante total del plasma

En la Tabla XIV y la Figura 42 se recogen el valor promedio obtenido de la

determinación de los parámetros indicadores de la capacidad antioxidante total del

plasma.

Tabla XIV . Capacidad antioxidante total del plasma en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control.

Control CCR sin tratamiento

p

FRAP (mM Fe 2+) 0,879 ± 0,197 0,748 ± 0,048 0,0129*

ABTS (mM TROLOX) 3,37 ± 0,789 2,56 ± 0,506 <0,0005***

Polifenoles (mM) 603 ± 105 404 ± 29,2 <0,0005***

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. * y *** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,0005 respectivamente cuando se compara CCR sin tratamiento vs control.

Los resultados muestran que existe una capacidad antioxidante

significativamente menor en la población con cáncer colorrectal respecto al grupo de

sujetos control. Cuando se emplea para su determinación el método ABTS, esta

diferencia se hace especialmente significante (p<0,0005), siendo un 32% mayor en

los sujetos control.

Resultados

111

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

FRAP ABTS

FR

AP

(mM

Fe

2+)

AB

TS

(mM

TR

OLO

X)

CONTROL CCR SIN TRATAMIENTO

*

***

A

0

100

200

300

400

500

600

700

Polifenoles

mM


***

B

Figura 42 . Capacidad antioxidante total del plasma mediante método FRAP y ABTS (A) y polifenoles (B) en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control. * y *** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,0005 respectivamente.

4.3.1.2. Biomarcadores de óxido nítrico en plasma


nítrico en plasma se muestran en la Tabla XV y en la Figura 43.

Tabla XV . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control.


p

Nitrito (µM) 2,42 ± 0,479 3,16 ± 0,522 <0,0005***

Nitrato (µM) 13,3 ± 3,36 16,7 ± 2,47 <0,0005***

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005 cuando se compara CCR sin tratamiento vs control.

La población con cáncer colorrectal presenta unos valores promedio para el

nitrito (3,16 ± 0,522) y el nitrato (16,7 ± 2,47) significativamente superiores

(p<0,0005) a los encontrados en la población control (2,42 ± 0,479 y 13,3 ± 3,36,

respectivamente).

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,022,525,0

Nitrito Nitrato

mM


***

***

Figura 43 . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.

Resultados

112

4.3.1.3. Biomarcadores de daño oxidativo a biomoléc ulas

a. Lípidos


en plasma los niveles de MDA y la concentración de hidroperóxidos mientras que en

linfocitos sólo se ha procedido a cuantificar el MDA.

Los resultados en plasma muestran (Tabla XVI y Figura 44) que existe una

diferencia muy significativa (p<0,0005) en cuanto a los niveles de hidroperóxidos y

MDA, medidos en el grupo con cáncer colorrectal respecto a la población control.

Así, el grupo con CCR, posee un porcentaje de incremento en los niveles de

hidroperóxidos de un 90% y de un 62% para el MDA, con respecto a los sujetos

control.

Tabla XVI . Concentración de indicadores del daño a lípidos medido en plasma en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control.


p

Hidroperóxidos (µM) 4,03 ± 0,986 7,67 ± 1,13 <0,0005***

MDA-plasma (nM) 101 ± 25,3 164 ± 30 <0,0005***


0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

Hidroperoxidos

mM


***

A

0

50

100

150

200

250

300

MDA

nM


***

B

Figura 44 . Indicadores del daño a lípidos, mediante medida de concentración de hidroperóxidos (A) y MDA (B) medidos en plasma en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.

La determinación de MDA en linfocitos (Tabla XVII y Figura 45), como

biomarcador del daño oxidativo a lípidos, refleja diferencias altamente significativas

(p<0,0005) entre los pacientes CCR sin tratamiento y el grupo control, con una

concentración dos veces superior al grupo control.

Resultados

113

Tabla XVII . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control.


p

MDA-linfocitos (nM) 36,6 ± 9,09 72,5 ± 16,6 <0,0005***


0

50

100

150

200

250

300

MDA

nM


***

Figura 45 . Indicadores del daño a lípidos medidos en linfocitos en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.

b. Proteínas



Tanto en el caso de la determinación en plasma (Tabla XVIII y Figura 46) como

en linfocitos (Tabla XIX y Figura 47), los resultados muestran diferencias altamente

significativas (p<0,0005) entre la población con cáncer colorrectal y el grupo control.

Tabla XVIII . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control.


p

GC-plasma (nmoles/mg proteína) 3,18 ± 0,779 13,7 ± 2,02 <0,0005***


Resultados

114

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC

nmol

es/m

g pr

otCONTROL CCR SIN TRATAMIENTO

***

Figura 46 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.

Tabla XIX . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control.


p

GC-linfocitos (nmoles/mg proteína) 3,24 ± 0,819 6,60 ± 1,45 <0,0005***


0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC

nmol

es/m

g pr

ot


***

Figura 47 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.

Destacar que en el caso del plasma, la concentración de grupos carbonilo de la

población con cáncer es cuatro veces superior al grupo control, y sólo 2 veces

cuando la determinación se realiza en linfocitos.

4.3.1.4. Estado Redox

Para el estudio del estado redox se midió la concentración del tripéptido

glutation (GSH), tanto en plasma como en linfocitos, y de la tiorredoxina (Trx).

Además, se estudió la actividad de la enzima tiorredoxina reductasa (TrxR).

Resultados

115

En la Tabla XX y en la figura adjunta (Figura 48) se resumen los resultados del

estado redox en plasma. Así, en el caso del GSH se detectan cambios muy

significativos (p<0,0005) entre los dos grupos estudiados (0,649 ± 0,119 y 0,496 ±

0,092 en el grupo control y en la población con cáncer, respectivamente).

Tabla XX . Estado redox medido en plasma en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control.


p

GSH-plasma (µmoles/g Hb)

0,649 ± 0,119 0,496 ± 0,092 <0,0005***

Trx (ng/mL) 40,1 ± 22,0 68,70 ± 54,5 0,0015**

TrxR (mU/mL) 5,54 ± 1,36 5,71 ± 1,07 0,6567

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. ** y *** indican diferencias significativas con p < 0,005 y p < 0,0005 respectivamente cuando se compara CCR sin tratamiento vs control.

En cuanto al sistema tiorredoxina, no se encuentran diferencias significativas

de la actividad de la enzima tiorredoxina reductasa en el grupo CCR respecto al

grupo control, pero sí cuando el estudio se refiere a la concentración de tiorredoxina.

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

GSH

mm

oles

/g H

b


***

A

0

25

50

75

100

125

150

Trx

ng/m

L


**

B

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

TrxR

mU

/mL


C

Figura 48 . Estado redox medido en plasma mediante concentración de GSH (A), Trx (B) y actividad TrxR (C) en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control. ** y *** indican diferencias significativas con p < 0,005 y p < 0,0005 respectivamente.

Resultados

116


XXI y Figura 49), al igual que ocurre en plasma, se detectan cambios muy

significativos (p<0,0005) entre la población formada por los pacientes con CCR con


Tabla XXI . Estado redox medido en linfocitos en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control.


p

GSH-linfocitos (µmoles/g proteína) 6,04 ± 1,46 4,15 ± 0,401 <0,0005***


0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

GSH

mm

oles

/g p

rot


***

Figura 49 . Estado redox medido en linfocitos en una población con cáncer colorrectal sin tratamiento respecto a grupo control. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.

4.3.2. Estudio del estrés oxidativo asociado al tra tamiento quimioterápico

en pacientes con cáncer colorrectal

Algunos de los fármacos o tratamientos antineoplásicos empleados en el

cáncer colorrectal basan su mecanismo de acción en cambios en los niveles de

oxidación provocando la puesta en marcha de diferentes procesos que

desencadenan apoptosis o bien detienen la promoción y la progresión de la

enfermedad carcinogénica. Por otra parte, otros fármacos, aunque su mecanismo de

acción no está directamente vinculado a estrés oxidativo, de forma indirecta

producen también cambios en el estado redox.

Por todo esto, se ha hecho necesario estudiar cómo afecta a los niveles de

estrés oxidativo el tratamiento quimioterápico, así como comprobar si existen

diferencias entre el empleo de un tipo de fármacos u otros.

Resultados

117

4.3.2.1. Estudio del estrés oxidativo en pacientes con cáncer colorrectal

asociado al tratamiento quimioterápico

En esta primera parte, se ha abordado el estudio de cómo puede afectar al

estrés oxidativo el tratamiento quimioterápico, para lo que se ha contado con una

población con cáncer colorrectal sin tratamiento quimioterápico y otro grupo que sí

está recibiendo quimioterapia. De esta forma, se pueden estudiar los niveles de

estrés que son causados sólo y exclusivamente al tratamiento, ya que ambas

poblaciones parten de un nivel de oxidación similar debido a la enfermedad.

4.3.2.1.1. Capacidad antioxidante total del plasma

La Tabla XXII y la figura adjunta (Figura 50) recogen el valor promedio obtenido

de la determinación de los parámetros indicadores de la capacidad antioxidante total

del plasma.

Tabla XXII . Capacidad antioxidante total del plasma asociado al tratamiento en una población con CCR.

CCR Sin Tratamiento

CCR Con Tratamiento

p

FRAP (mM Fe 2+) 0,748 ± 0,048 0,689 ± 0,110 0,0463*

ABTS (mM TROLOX) 2,56 ± 0,506 2,27 ± 0,487 0,0482*

Polifenoles (mM) 404 ± 29,3 329 ± 83,0 0,0014**

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. * y ** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,005 respectivamente cuando se compara CCR con tratamiento vs sin tratar.


significativamente mayor en el grupo de sujetos sin tratamiento respecto a la

población en tratamiento. Destacar que esta mayor capacidad, aun siendo

significativa, es de un 10%, cuando se valora a través del método FRAP y de un

12% empleando el método ABTS.

Resultados

118

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

FRAP ABTS

FR

AP

(mM

Fe2

+)A

BT

S (m

M T

RO

LOX

)

CCR SIN TRATAMIENTO CCR CON TRATAMIENTO

*

*

A

0

100

200

300

400

500

600

700

Polifenoles

mM


**

B

Figura 50 . Capacidad antioxidante total del plasma mediante método FRAP y ABTS (A) y polifenoles (B) asociado al tratamiento en una población con CCR. * y ** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,005 respectivamente.

4.3.2.1.2. Biomarcadores de óxido nítrico en plasma


nítrico en plasma se muestran en la Tabla XXIII y en la Figura 51.

Tabla XXIII . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado al tratamiento en una población con CCR.

CCR Sin Tratamiento

CCR Con Tratamiento

p

Nitrito (µM) 3,16 ± 0,522 3,59 ± 0,768 0,0432*

Nitrato (µM) 16,7 ± 2,47 19,4 ± 4,39 0,0225*

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. * indica diferencias significativas con p < 0,05 cuando se compara CCR con tratamiento vs sin tratar.

La población en tratamiento quimioterápico presenta unos valores promedio

para el nitrito (3,59 ± 0,768) y el nitrato (19,4 ± 4,39) significativamente superiores a

los encontrados en los enfermos de CCR que todavía no han comenzado el

tratamiento (3,16 ± 0,522 y 16,7 ± 2,47, respectivamente)

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,022,525,0

Nitrito Nitrato

mM


*

*

Figura 51 . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado al tratamiento en una población con CCR. * indica diferencias significativas con p < 0,05.

Resultados

119

4.3.2.1.3. Biomarcadores de daño oxidativo a biomoléculas

a. Lípidos



linfocitos sólo se ha cuantificado el MDA.

Los resultados en plasma muestran (Tabla XXIV y Figura 52) que existen

diferencias significativas en cuanto a los niveles de hidroperóxidos y MDA, entre los

dos grupos de población. Así, el grupo sin tratamiento, en base a los valores de los

biomarcadores, presentaría menor daño lipídico que los pacientes que están en

régimen quimioterápico.

Tabla XXIV . Concentración de indicadores del daño a lípidos medido en plasma asociado al tratamiento en una población con CCR.

CCR Sin Tratamiento

CCR Con Tratamiento

p

Hidroperóxidos (µM) 7,67 ± 1,13 9,51 ± 2,24 0,0026**

MDA-plasma (nM) 164 ± 30,0 205 ± 50,3 0,0116*


0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

Hidroperoxidos

mM


**

A

0

50

100

150

200

250

300

MDA

nM


*

B

Figura 52 . Indicadores del daño a lípidos, mediante medida de concentración de hidroperóxidos (A) y MDA (B) medidos en plasma asociado al tratamiento en una población con CCR. * y ** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,005 respectivamente.

Sin embargo, al determinar la concentración de MDA en linfocitos (Tabla XXV y

Figura 53), se encuentra un resultado contrario al que cabría esperar, ya que en este

caso, la mayor concentración de MDA está presente en el grupo de enfermos sin

tratar.

Resultados

120

Tabla XXV . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado al tratamiento en una población con CCR.

CCR Sin Tratamiento

CCR Con Tratamiento

p

MDA-linfocitos (nM) 72,5 ± 16,6 60,6 ± 13,6 0,0316*


0

50

100

150

200

250

300

MDA

nM


*

Figura 53 . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado al tratamiento en una población con CCR. * indica diferencias significativas con p < 0,05.

b. Proteínas



Tanto en el caso de la determinación en plasma (Tabla XXVI y Figura 54) como

en linfocitos (Tabla XXVII y Figura 55), los resultados muestran diferencias

significativas entre el grupo de pacientes sin y con tratamiento.

Tabla XXVI . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado al tratamiento en una población con CCR.

CCR Sin Tratamiento

CCR Con Tratamiento

p

GC-plasma (nmoles/mg proteína) 13,8 ± 2,02 16,0 ± 3,34 0,0164*


Resultados

121

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC

nmol

es/m

g pr

otCCR SIN TRATAMIENTO CCR CON TRATAMIENTO

*

Figura 54 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado al tratamiento en una población con CCR. * indica diferencias significativas con p < 0,05.

Destacar que en linfocitos se detectan mayores diferencias de concentración

de grupos carbonilo (42% de incremento) y con mayor nivel de significancia

(p<0,0005) frente al 16% de incremento detectado en plasma (p=0,0164).

Tabla XXVII . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado al tratamiento en una población con CCR.

CCR Sin Tratamiento

CCR Con Tratamiento

p

GC-linfocitos (nmoles/mg proteína) 6,60 ± 1,45 9,37 ± 2,13 <0,0005***

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005 cuando se compara CCR con tratamiento vs sin tratar.

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC

nmol

es/m

g pr

ot


***

Figura 55 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado al tratamiento en una población con CCR. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.

4.3.2.1.4. Estado Redox

Para el estudio del estado redox se midió en plasma y en linfocitos la

concentración del glutation (GSH) y solo en plasma el sistema tiorredoxina, formado

por la tiorredoxina (Trx) y la tiorredoxina reductasa (TrxR).

En la Tabla XXVIII y en la figura adjunta (Figura 56) se resumen los resultados

del estado redox en plasma. Así, en el caso del glutation se detectan cambios

Resultados

122

significativos (p=0,0388) entre los dos grupos estudiados (0,496 ± 0,092 y 0,423 ±

0,119 en pacientes sin y con tratamiento, respectivamente).

Tabla XXVIII . Estado redox medido en plasma asociado al tratamiento en una población con CCR.

CCR Sin Tratamiento

CCR Con Tratamiento

p

GSH-plasma (µmoles/g Hb)

0,496 ± 0,092 0,423 ± 0,119 0,0388*

Trx (ng/mL) 68,7 ± 54,5 51,8 ± 24,7 0,0382*

TrxR (mU/mL) 5,71 ± 1,07 6,81 ± 1,24 0,0020**


En cuanto al sistema tiorredoxina, también se encuentran diferencias

significativas tanto en la tiorredoxina como en la tiorredoxina reductasa en la

población de pacientes tratados respecto al grupo sin tratar.

Así, los pacientes que se encuentran en tratamiento poseen un 20% más

actividad enzimática de la tiorredoxina reductasa que los que no están sometidos a

quimioterapia.

En el caso de la tiorredoxina los niveles de concentración son mayores en la

población que no está en tratamiento. No obstante, destacar que el nivel de

significancia es de p=0,0382 y la dispersión de los datos alta (68,7 ± 54,5 y 51,8 ±

24,7 para el grupo de población sin tratar y los pacientes en tratamiento,

respectivamente), por lo que la interpretación de este resultado debe realizarse con

cierta precaución.

Resultados

123

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

GSH

mm

oles

/g H

b


*

A

0

25

50

75

100

125

150

Trx

ng/m

L


*

B

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

TrxR

mU

/mL


**

C

Figura 56 . Estado redox medido en plasma mediante concentración de GSH (A), Trx (B) y actividad TrxR (C) asociado al tratamiento en una población con CCR. * y ***indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,005 respectivamente.

Respecto a las mediciones realizadas de GSH en linfocitos (Tabla XXIX y

Figura 57), al igual que ocurre en plasma, se detectan cambios muy significativos

(p<0,0005) entre el grupo de pacientes sin tratar (4,15 ± 0,401) y los tratados (3,01 ±

0,675).

Tabla XXIX . Estado redox medido en linfocitos asociado al tratamiento en una población con CCR.

CCR Sin Tratamiento

CCR Con Tratamiento

p

GSH-linfocitos (µmoles/g proteína) 4,15 ± 0,401 3,01 ± 0,675 <0,0005***

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005 cuando se compara CCR con tratamiento vs sin tratar.

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

GSH

mm

oles

/g p

rot


***

Figura 57 . Estado redox medido en linfocitos asociado al tratamiento en una población con CCR. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.

Resultados

124

4.3.2.2. Estudio del estrés oxidativo en pacientes con cáncer colorrectal

asociado al tipo de tratamiento quimioterápico

En esta segunda parte, se ha abordado el estudio de cómo se ven afectados

los niveles de estrés oxidativo en función del tipo de tratamiento quimioterápico, y

que grupo de fármacos confieren menor o mayor estrés o bien median y utilizan la

oxidación en su mecanismo de acción.

Así, para la realización de este análisis, se han agrupado los tratamientos que

habitualmente se emplean en el tratamiento del cáncer colorrectal en tres grupos, tal

y como recoge la Tabla III. De esta forma, el grupo T1 estaría formado por los

pacientes que están recibiendo fluoropirimidinas (5-fluorouracilo o capecitabina)

solas (7% de la población en tratamiento) o bien acompañadas de oxaliplatino o

irinotecan (40% de la población en tratamiento).

En el grupo T2 (37% de población en tratamiento) estarían encuadrados los

pacientes que junto a algún tipo de fluoropirimidina y oxaliplatino o irinotecan están

siendo tratados con alguno de los anticuerpos monoclonales, bien anti-EGFR

(cetuximab o panitumumab) o anti-VEGF (bevacizumab). Por último, existe un grupo

de pacientes que están recibiendo un tipo de tratamiento que no responde a ninguno

de los criterios establecidos anteriormente, por lo que se han agrupado bajo el

epígrafe de T3 u otros tratamientos. En este grupo (16% de los tratamientos) hay una

gran heterogeneidad, fundamentada en la existencia de algún efecto adverso o

toxicidad a los tratamientos más habituales, tipo de metástasis menos común,

requiriendo otro tipo de fármacos o idiosincrasia o resistencia individual que

condiciona la diferente prescripción.

Por último, para el correcto análisis de los resultados se ha contado con un

grupo de pacientes, denominado T0, que actúa como control ya que no ha recibido

ningún tipo de tratamiento.

Resultados

125


La Tabla XXX y la Figura 58 adjunta recogen el valor promedio obtenido de la


plasma.

Tabla XXX . Capacidad antioxidante total del plasma asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR.

T0 T1 T2 T3 FRAP (mM Fe 2+)

0,748 ± 0,048b 0,677 ± 0,082a 0,659 ± 0,111a 0,759 ± 0,163b

ABTS (mM TROLOX) 2,56 ± 0,506b 2,20 ± 0,423a 2,09 ± 0,475a 2,80 ± 0,636b

Polifenoles (mM) 404 ± 29,3c 331 ± 78,1a,b 303 ± 57,4a 363 ± 101b,c



significativamente mayor en el grupo de sujetos sin tratamiento respecto a la

población con tratamiento tipo T1 y T2. Sin embargo, el grupo T3 se comporta de la

misma forma que los pacientes sin tratar.

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

FRAP ABTS

FR

AP

(mM

Fe2

+)A

BT

S (m

M T

RO

LOX

)

CCR SIN TRATAMIENTO CCR TRATAMIENTO TIPO 1CCR TRATAMIENTO TIPO 2 CCR TRATAMIENTO TIPO 3

A

b a ba

ba

b

a

0100200300400500600700

Polifenoles

mM

CCR SIN TRATAMIENTO CCR TRATAMIENTO TIPO 1

CCR TRATAMIENTO TIPO 2 CCR TRATAMIENTO TIPO 3

ca

b,ca,b

B

Figura 58 . Capacidad antioxidante total del plasma mediante método FRAP y ABTS (A) y polifenoles (B) asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

En cuanto a la concentración de polifenoles, el grupo de los pacientes T1 y T2

difiere significativamente de los pacientes sin tratar, pero T3 muestra una

concentración de polifenoles intermedia entre T0 y T1, no significativamente

diferente, pero que le posiciona en un nivel intermedio de oxidación.

Resultados

126



nítrico en plasma se muestran en la Tabla XXXI y en la Figura 59.

Tabla XXXI . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR.

T0 T1 T2 T3

Nitrito (µM) 3,16 ± 0,522a 3,65 ± 0,573b 3,84 ± 0,975b 3,61 ± 0,275a,b

Nitrato (µM) 16,7 ± 2,47a 20,0 ± 3,58b 21,2 ± 4,19b 21,7 ± 3,34b


Al igual que en el estudio de la capacidad antioxidante, los niveles de nitrito y

nitrato son significativamente diferentes en el caso de la población sometida al

tratamiento T1 y T2 respecto a los pacientes sin tratar. Asimismo, el grupo de

pacientes T3 se posiciona de nuevo en un nivel intermedio, de forma que tiene una

concentración intermedia de nitrito, a pesar de no ser significativa la diferencia ni con

el grupo T1 y T2 ni con el T0. Sin embargo, al estudiar la concentración de nitrato, sí

existen diferencias con el grupo de los pacientes sin tratar.

0,03,06,09,0

12,015,018,021,024,027,030,0

Nitrito Nitrato

mM


a b a,bb

a

b bb

Figura 59 . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.


a. Lípidos



linfocitos sólo se ha cuantificado la concentración de MDA.

Resultados

127

Los resultados en plasma indican (Tabla XXXII y Figura 60) que la

concentración de hidroperóxidos aumenta de forma significativa según el tipo de

tratamiento (T0, T1 y T2). Sin embargo, el grupo de pacientes T3, con una

concentración intermedia, no presenta ninguna diferencia significativa con ninguno

de los tipos de población.

Tabla XXXII . Concentración de indicadores del daño a lípidos medido en plasma asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR.

T0 T1 T2 T3 Hidroperóxidos (µM) 7,67 ± 1,13a 8,94 ± 2,06b 10,5 ± 2,32c 9,02 ± 1,98a,b,c

MDA-plasma (nM) 164 ± 30,0a 212 ± 54,3b 208 ± 30,5b 214 ± 45,0b


0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

Hidroperoxidos

mM


a

c

a,b,cb

A

0

50

100

150

200

250

300

MDA plasma

nM


a

bbb

B

Figura 60 . Indicadores del daño a lípidos, mediante medida de concentración de hidroperóxidos (A) y MDA (B) medidos en plasma asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Por otra parte, al estudiar la concentración de MDA, en el caso del plasma, sólo

se presentan diferencias significativas entre el grupo de pacientes sin tratar con

respecto al conjunto de los grupos en tratamiento, mientras que en linfocitos (Tabla

XXXIII y Figura 61) las diferencias de concentración no resultan significativas en

ninguno de los grupos estudiados.

Tabla XXXIII . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR.

T0 T1 T2 T3 MDA-linfocitos (nM) 72,5 ± 16,6a 63,4 ± 14,2a 62,7 ± 19,1a 50,7 ± 3,69a


Resultados

128

0

50

100

150

200

250

300

MDA linfocitosnM


a aa

a

Figura 61 . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

b. Proteínas



En el caso de la determinación en plasma (Tabla XXXIV y Figura 62) los

resultados muestran que existen diferencias significativas entre la población de los

pacientes sin tratar y el grupo T1 y T2 en su conjunto, pero de nuevo T3 se posiciona

en un nivel intermedio, sin mostrar diferencias significativas ni con T0 ni con T1,

aunque sí con T2.

Tabla XXXIV . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR.

T0 T1 T2 T3 GC-plasma (nmoles/mg proteína) 13,8 ± 2,02a 17,0 ± 2,53b,c 17,3 ± 2,79c 15,1 ± 4,00a,b


0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC plasma

nmol

es/m

g pr

ot


a

ca,bb,c

Figura 62 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Resultados

129

Al realizar el estudio en linfocitos (Tabla XXXV y Figura 63), se detecta como

se produce un incremento en la concentración de GC según el tipo de tratamiento

(T0, T1 y T2) y que este incremento lleva asociado diferencias significativas entre un

grupo y otro.

Tabla XXXV . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR.

T0 T1 T2 T3 GC-linfocitos (nmoles/mg proteína) 6,60 ± 1,45a 8,73 ± 1,93b 9,92 ± 2,27c 10,4 ± 1,90c


Por otra parte, el grupo de pacientes T3 es el que tiene mayor nivel de

oxidación, en cuanto a concentración de grupos carbonilo se refiere, presentando

diferencias significativas con el grupo T0 y T1 pero no con la población enmarcada en

el grupo T2.

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC linfocitos

nmol

es/m

g pr

ot


a

c cb

Figura 63 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.



concentración del glutation (GSH) y en plasma el sistema tiorredoxina, formado por

la tiorredoxina (Trx) y la tiorredoxina reductasa (TrxR).

En la Tabla XXXVI y en la figura adjunta (Figura 64) se resumen los resultados

del estado redox en plasma.

Resultados

130

Tabla XXXVI . Estado redox medido en plasma asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR.

T0 T1 T2 T3 GSH-plasma (µmoles/g Hb)

0,496 ± 0,092b 0,576 ± 0,139c 0,414 ± 0,105a 0,336 ± 0,099a

Trx (ng/mL) 68,7 ± 54,5b 45,2 ± 20,2a 45,5 ± 17,4a 60,2 ± 29,3a,b

TrxR (mU/mL) 5,71 ± 1,07a 6,89 ± 1,04b 6,83 ± 1,56b 6,51 ± 0,96a,b


Así, en el caso del GSH la población que está recibiendo el tratamiento T1

presenta la mayor concentración del tripéptido antioxidante (0,576 ± 0,139), seguido

de la población sin tratar (0,496 ± 0,092) y del grupo T2 (0,414 ± 0,105), siendo esta

diferencia significativa entre estos tres grupos de población. Por último, la población

de pacientes T3, presenta el menor valor de concentración (0,336 ± 0,099), sin

presentar diferencias significativas con el grupo T2.

En cuanto al sistema tiorredoxina, al igual que ocurre en el apartado anterior

(CCR sin y con tratamiento), es en la población T0 donde se detectan los niveles

más elevados (68,7 ± 54,5), siendo esta diferencia significativa al comparar con los

grupos T1 (45,2 ± 20,2) y T2 (45,5 ± 17,4) y no con T3 (60,2 ± 29,3). Las poblaciones

T1 y T2 no muestran cambios significativos ni entre ellas ni con la población T3.

Asimismo, la tiorredoxina reductasa presenta los mayores niveles de actividad

en las poblaciones T1 (6,89 ± 1,04) y T2 (6,83 ± 1,56), presentando cambios

significativos respecto al grupo de pacientes sin tratar (5,71 ± 1,07). De nuevo, la

población T3 (6,51 ± 0,96) no presenta diferencias significativas con ninguno de los

tres grupos estudiados.

Resultados

131

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

GSH plasma

mm

oles

/g H

b


ba

a

c

A

0

25

50

75

100

125

150

Trx

ng/m

L


b

a

a,b

a

B

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

TrxR

mU

/mL


a

ba,bb a,b

C

Figura 64 . Estado redox medido en plasma mediante concentración de GSH (A), Trx (B) y actividad TrxR (C) asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.


XXXVII y Figura 65), sorprende que no siga el mismo comportamiento que en

plasma, ya que en este caso, el grupo que presenta la mayor concentración de GSH

es el de los pacientes sin tratar, seguido del grupo T1 y T2, mostrando diferencias

significativas entre estos tres grupos de población. Por otra parte, la población T3 no

presenta cambios significativos con ninguno de los grupos de los pacientes en

tratamiento, aunque sí con la población T0.

Tabla XXXVII . Estado redox medido en linfocitos asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR.

T0 T1 T2 T3 GSH-linfocitos (µmoles/g proteína) 4,15 ± 0,401c 3,21 ± 0,694b 2,76 ± 0,631a 2,93 ± 0,536a,b


Resultados

132

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

GSH linfocitos

mm

oles

/g p

rot


c

a a,bb

Figura 65 . Estado redox medido en linfocitos asociado al tipo de tratamiento en una población con CCR. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

4.3.3. Estudio del estrés oxidativo asociado a metá stasis en pacientes con

cáncer colorrectal

A lo largo de la revisión bibliográfica se ha ido plasmando como los procesos

de metástasis y el estrés oxidativo pueden estar estrechamente relacionados, por lo

que en el desarrollo de este trabajo ha merecido especial atención el estudio de

ambos fenómenos y su interrelación en los pacientes con cáncer colorrectal.

4.3.3.1. Estudio del estrés oxidativo en cáncer col orrectal asociado a

metástasis en un grupo de pacientes sin tratamiento

quimioterápico

Para el inicio de este estudio, se ha hecho relevante conocer si la metástasis

por sí misma, está asociada a alteraciones de los niveles de estrés, para lo que se

ha contado con dos grupo de pacientes, uno con metástasis (M1) y otro grupo sin

metástasis (M0), que todavía no han comenzado ningún tipo de tratamiento

quimioterápico, y por tanto no han contado con una causa adicional importante que

pueda también afectar a sus niveles de oxidorreducción celular.


La Tabla XXXVIII y la figura adjunta (Figura 66) recogen el valor promedio

obtenido de la determinación de los parámetros indicadores de la capacidad

antioxidante total del plasma.

Resultados

133

Tabla XXXVIII . Capacidad antioxidante total del plasma asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico.

M0 M1 p

FRAP (mM Fe 2+) 0,786 ± 0,046 0,715 ± 0,008 0,0009**

ABTS (mM TROLOX) 2,87 ± 0,613 2,28 ± 0,088 0,0189*

Polifenoles (mM) 430 ± 23,3 385 ± 14,1 0,0007**

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. * y ** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,005 respectivamente cuando se compara población con metástasis vs sin metástasis.


significativamente mayor en el grupo de sujetos sin metástasis respecto a la

población con metástasis. Destacar que esta capacidad antioxidante es un 10%

mayor, cuando se valora a través del método FRAP (p=0,0009) y de un 26% cuando

es empleando el método ABTS, aunque con un menor nivel de significancia

(p=0,0189).

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

FRAP ABTS

FR

AP

(mM

Fe2

+)A

BT

S (m

M T

RO

LOX

)

CCR SIN TRATAMIENTO M0 CCR SIN TRATAMIENTO M1

**

*

A

0

100200

300400

500600

700

Polifenoles

mM

CCR SIN TRATAMIENTO M0CCR SIN TRATAMIENTO M1

**

B

Figura 66 . Capacidad antioxidante total del plasma mediante método FRAP y ABTS (A) y polifenoles (B) asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico. * y ** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,005 respectivamente.

La concentración de polifenoles en el grupo de pacientes sin metástasis es un

12% mayor respecto a la población con metástasis.



nítrico en plasma se muestran en la Tabla XXXIX y en la Figura 67.

Resultados

134

Tabla XXXIX . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico.

M0 M1 p

Nitrito (µM) 2,72 ± 0,452 3,54 ± 0,114 <0,0005***

Nitrato (µM) 14,4 ± 1,53 18,7 ± 0,485 <0,0005***

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005 cuando se compara población con metástasis vs sin metástasis.

La población con metástasis presenta unos valores promedio para el nitrito

(3,54 ± 0,114) y el nitrato (18,7 ± 0,485) significativamente superiores a los

encontrados en los enfermos de CCR sin metástasis (2,72 ± 0,452 y 14,4 ± 1,53,

respectivamente).

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,022,525,0

Nitrito Nitrato

mM

CCR SIN TRATAMIENTO M0 CCR SIN TRATAMIENTO M1

***

***

Figura 67 . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.


a. Lípidos




Los resultados en plasma muestran (Tabla XL y Figura 68) que existen


dos grupos de población. Así, el grupo sin metástasis, en base a los valores de los

biomarcadores, presentaría menor daño lipídico que los pacientes que tienen algún

tipo de metástasis.

Resultados

135

Tabla XL . Concentración de indicadores del daño a lípidos medido en plasma asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico.

M0 M1 p

Hidroperóxidos (µM) 6,95 ± 1,34 8,30 ± 0,161 0,0140*

MDA-plasma (nM) 120 ± 18,8 166 ± 35,2 0,0462*

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. * indica diferencias significativas con p < 0,05 cuando se compara población con metástasis vs sin metástasis.

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

Hidroperoxidos

mM


*

A

0

50

100

150

200

250

300

MDA

nM


*

B

Figura 68 . Indicadores del daño a lípidos, mediante medida de concentración de hidroperóxidos (A) y MDA (B) medidos en plasma asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico. * indica diferencias significativas con p < 0,05.

Sin embargo, al evaluar el daño a lípidos en linfocitos (Tabla XLI y Figura 69) a

través de la concentración de MDA, no se encuentran diferencias significativas en

ambos grupos de población.

Tabla XLI . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico.

M0 M1 p

MDA-linfocitos (nM) 65,9 ± 19,2 80,5 ± 9,13 0,1552

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. p > 0,05 indica que no existen diferencias significativas cuando se compara población con metástasis vs sin metástasis.

0

50

100

150

200

250

300

MDA

nM


Figura 69 . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico. p > 0,05 indica que no existen diferencias significativas.

Resultados

136

b. Proteínas



Tanto en el caso de la determinación en plasma (Tabla XLII y Figura 70) como

en linfocitos (Tabla XLIII y Figura 71), los resultados muestran diferencias

significativas entre los grupos de población estudiados.

Tabla XLII . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico.

M0 M1 p GC-plasma (nmoles/mg proteína) 12,1 ± 1,46 15,2 ± 0,991 <0,0005***


0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC

nmol

es/m

g pr

ot


***

Figura 70 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.

Destacar que las diferencias detectadas tanto en plasma como en linfocitos,

son similares en cuanto a incremento de concentración de GC (26% y 28%,

respectivamente), pero el nivel de significancia que presenta en plasma es mucho

mayor (p<0,0005).

Tabla XLIII . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico.

M0 M1 p GC-linfocitos (nmoles/mg proteína) 5,69 ± 1,58 7,27 ± 0,942 0,0374*

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. * indica diferencias significativas con p < 0,05 cuando se compara población con metástasis vs sin metástasis.

Resultados

137

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC

nmol

es/m

g pr

ot


*

Figura 71 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico. * indica diferencias significativas con p < 0,05.



concentración del glutation (GSH) y en plasma la tiorredoxina (Trx) y la tiorredoxina

reductasa (TrxR).

En la Tabla XLIV y en la figura adjunta (Figura 72) se resumen los resultados

del estado redox en plasma. Así, en el caso del GSH se detectan cambios altamente

significativos (p<0,0005) entre los dos grupos estudiados (0,587 ± 0,064 y 0,428 ±

0,024 en pacientes sin y con metástasis, respectivamente).

Tabla XLIV . Estado redox medido en plasma asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico.

M0 M1 p GSH-plasma (µmoles/g Hb)

0,587 ± 0,064 0,428 ± 0,024 <0,0005***

Trx (ng/mL) 40,4 ± 22,2 115 ± 66,4 0,0439*

TrxR (mU/mL) 6,41 ± 1,13 5,21 ± 0,553 0,0298*

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. * y *** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,0005 respectivamente cuando se compara población con metástasis vs sin metástasis.


significativas en ambos parámetros para los dos grupos de población. Así, los

pacientes que presentan metástasis poseen una concentración de tiorredoxina hasta

casi 3 veces mayor que la población M0. En el caso de la tiorredoxina reductasa, y

contrario a lo que cabría esperar, es el grupo el grupo M0 el que tiene mayor

actividad enzimática.

Resultados

138

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

GSH

mm

oles

/g H

b


***

A

0255075

100125150175200

Trx

ng/m

L


*

B

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

TrxR

mU

/mL


*

C

Figura 72 . Estado redox medido en plasma mediante concentración de GSH (A), Trx (B) y actividad TrxR (C) asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico. * y *** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,0005 respectivamente.


XLV y Figura 73), al igual que ocurre en plasma, se detectan cambios muy

significativos (p<0,0005) entre el grupo de pacientes sin (4,52 ± 0,275) y con

metástasis (3,87 ± 0,183).

Tabla XLV . Estado redox medido en linfocitos asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico.

M0 M1 p GSH-linfocitos (µmoles/g proteína) 4,52 ± 0,275 3,87 ± 0,183 <0,0005***


0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

GSH

mm

oles

/g p

rot


***

Figura 73 . Estado redox medido en linfocitos asociado a metástasis en una población con CCR sin tratamiento quimioterápico. *** indica diferencias significativas con p < 0,0005.

Resultados

139


metástasis en un grupo de pacientes en tratamiento

quimioterápico

Una vez conocido como el estrés oxidativo y los procesos metastáticos están

íntimamente relacionados, se ha continuado con el estudio contando, en este caso,

con una población de pacientes con CCR en tratamiento quimioterápico, analizando

cómo se ven afectados los niveles de oxidación en los grupos sin y con metástasis



La Tabla XLVI y la figura adjunta (Figura 74) recogen el valor promedio

obtenido de la determinación de los parámetros indicadores de la capacidad

antioxidante total del plasma.

Tabla XLVI . Capacidad antioxidante total del plasma asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Control M0 M1

FRAP (mM Fe 2+) 0,879 ± 0,197c 0,742 ± 0,129b 0,655 ± 0,092a

ABTS (mM TROLOX) 3,37 ± 0,789c 2,49 ± 0,547b 2,04 ± 0,398a

Polifenoles (mM) 603 ± 105c 364 ± 86,9b 305 ± 71,4a



significativamente menor en el grupo de pacientes sin y con metástasis respecto al

grupo de sujetos control, mostrándose también diferencias significativas entre las

dos poblaciones con CCR.

Resultados

140

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

FRAP ABTS

FR

AP

(mM

Fe

2+)

AB

TS

(mM

TR

OLO

X)

CONTROL CCR TRATAMIENTO M0 CCR TRATAMIENTO M1

cb a

c

ba

A

0

100

200

300400

500

600

700

Polifenoles

mM

CONTROL CCR TRATAMIENTO M0CCR TRATAMIENTO M1

c

ba

B

Figura 74 . Capacidad antioxidante total del plasma mediante método FRAP y ABTS (A) y polifenoles (B) asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Así, utilizando el método FRAP, se observa que respecto a la población control,

existe un descenso de la capacidad antioxidante de un 19% en el grupo de

pacientes sin metástasis y de un 34% en el grupo M1. Asimismo, cuando se emplea

el método ABTS, esta diferencia se hace todavía más acusada, ya que se detectan

descensos respecto a la población control de un 35%, en el caso del grupo M0 y

hasta de un 65% cuando la población estudiada corresponde a pacientes con

metástasis.



nítrico en plasma se muestran en la Tabla XLVII y en la Figura 75.

Tabla XLVII . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Control M0 M1

Nitrito (µM) 2,42 ± 0,479a 2,72 ± 0,658b 4,01 ± 0,583c

Nitrato (µM) 13,3 ± 3,36a 15,5 ± 2,19b 22,5 ± 2,94c


Las poblaciones con CCR presentan concentraciones tanto de nitrito como de

nitrato significativamente superiores al grupo control. Además, esta diferencia de

concentración también se hace significativa entre las dos poblaciones con CCR. El

incremento de concentración respecto al grupo control, en el caso del nitrito, es de

un 12% en la población M0 y de un 66% para el grupo M1. Asimismo, el incremento

detectado para el nitrato, es de un 16% para la población sin metástasis y de un

69% para el grupo M1.

Resultados

141

0,03,06,09,0

12,015,018,021,024,027,030,0

Nitrito Nitratoµµ µµ

M

CONTROL CCR TRATAMIENTO M0 CCR TRATAMIENTO M1

a b c

a b

c

Figura 75 . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.


a. Lípidos




Los resultados en plasma muestran (Tabla XLVIII y Figura 76) que existen

diferencias significativas en cuanto a los niveles de hidroperóxidos, entre los dos

grupos con CCR (M0 y M1) y a su vez respecto al grupo control.

Tabla XLVIII . Concentración de indicadores del daño a lípidos medido en plasma asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Control M0 M1

Hidroperóxidos (µM) 4,03 ± 0,986a 8,74 ± 2,00b 10,1 ± 2,25c

MDA-plasma (nM) 101 ± 25,3a 216 ± 44,1b 196 ± 54,1b


Resultados

142

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

Hidroperoxidos

µµ µµM


a

bc

A

0

50

100

150

200

250

300

MDA plasma

nM


a

b b

B

Figura 76 . Indicadores del daño a lípidos, mediante medida de concentración de hidroperóxidos (A) y MDA (B) medidos en plasma asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Sin embargo, al medir concentración de MDA, solo se detectan cambios

significativos con la población control, tanto en plasma como en linfocitos (Tabla

XLIX y Figura 77) y no entre los dos grupos de pacientes con CCR.

Tabla XLIX . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Control M0 M1

MDA-linfocitos (nM) 36,6 ± 9,09a 62,8 ± 14,4b 61,5 ± 16,7b


0

50

100

150

200

250

300

MDA linfocitos

nM


ab b

Figura 77 . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

b. Proteínas



Tanto en el caso de la determinación en plasma (Tabla L y Figura 78) como en

linfocitos (Tabla LI y Figura 79), los resultados muestran diferencias significativas

entre los grupos de población estudiados.

Resultados

143

Tabla L . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Control M0 M1 GC-plasma (nmoles/mg proteína) 3,18 ± 0,779a 15,0 ± 3,48b 17,9 ± 2,82c


0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,022,5

GC plasma

nmol

es/m

g pr

ot


a

bc

Figura 78 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Destacar que las diferencias detectadas son mayores en plasma que en

linfocitos, en cuanto a incremento de concentración de GC respecto al grupo control.

Así, en plasma se detectan incrementos de concentración de hasta casi 5 veces

para el grupo M0 y de hasta de 5,6 veces para la población M1. Sin embargo, las

diferencias detectadas en linfocitos son 2,7 veces para M0 y 3 veces mayores para la

población M1.

Tabla LI . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Control M0 M1 GC-linfocitos (nmoles/mg proteína) 3,24 ± 0,819a 8,81 ± 2,02b 9,81 ± 2,13c


Resultados

144

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC linfocitos

nmol

es/m

g pr

otCONTROL CCR TRATAMIENTO M0CCR TRATAMIENTO M1

a

bc

Figura 79 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.


Para el estudio del estado redox se midió la concentración del glutation (GSH)

tanto en plasma como en linfocitos y en plasma se cuantificó la tiorredoxina (Trx) y la

tiorredoxina reductasa (TrxR).

En la Tabla LII y en la figura adjunta (Figura 80) se resumen los resultados del

estado redox en plasma. Cabe destacar como sólo se detectan diferencias

significativas cuando hay metástasis, es decir, los cambios de concentración de los

parámetros indicadores del estado redox no son significativos entre la población

control y el grupo M0, pero sí con la población M1.

Tabla LII . Estado redox medido en plasma asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Control M0 M1 GSH-plasma (µmoles/g Hb)

0,649 ± 0,119b 0,596 ± 0,114b 0,364 ± 0,093a

Trx (ng/mL) 40,1 ± 22,0a 46,3 ± 20,0a 72,0 ± 26,7b

TrxR (mU/mL) 5,54 ± 1,36a 5,88 ± 0,505a 7,15 ± 1,22b


Así, en el caso del GSH el grupo control presenta la concentración mayor

(0,649 ± 0,119), seguido de M0 (0,596 ± 0,114) y por último de la población M1 (0,364

± 0,093).

En cuanto al sistema tiorredoxina, por una parte, la tiorredoxina presenta en el

grupo de pacientes M1 los mayores niveles de concentración, mientras que la

Resultados

145

tiorredoxina reductasa, y de forma contraria a lo que cabría esperar de acuerdo a los

resultados del estudio anterior, también presenta en la población M1 los mayores

niveles de actividad.

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

GSH plasma

µµ µµm

oles

/g H

b


bb

a

A

0

25

50

75

100

125

150

Trx

ng/m

L


a a

b

B

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

TrxR

mU

/mL


a a

b

C

Figura 80 . Estado redox medido en plasma mediante concentración de GSH (A), Trx (B) y actividad TrxR (C) asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.


LIII y Figura 81) sí se detectan cambios significativos entre las tres poblaciones

estudiadas, de forma que la mayor concentración se encuentra en el grupo control

(6,04 ± 1,46), seguido de M0 (3,40 ± 0,582) y por último del grupo de pacientes M1

(2,68 ± 0,572).

Tabla LIII . Estado redox medido en linfocitos asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Control M0 M1 GSH-linfocitos (µmoles/g proteína) 6,04 ± 1,46c 3,40 ± 0,582b 2,68 ± 0,572a


Resultados

146

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

GSH linfocitos

µµ µµm

oles

/g p

rot


c

ba

Figura 81 . Estado redox medido en linfocitos asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

4.3.3.3. Estudio del estrés oxidativo en cáncer col orrectal asociado al

tipo de metástasis en un grupo de pacientes en trat amiento

quimioterápico

Por último, se ha realizado el análisis del estrés oxidativo asociado al tipo de

metástasis en una población con CCR y en tratamiento quimioterápico. Para ello, los

tipos de metástasis se han clasificado en tres grupos, hepáticas, la más

comúnmente asociada al CCR, no hepáticas y hepáticas más otras, asociadas éstas

últimas a estadios más avanzados de la enfermedad.


La Tabla LIV y la Figura 82 adjunta recogen el valor promedio obtenido de la


plasma.

Tabla LIV . Capacidad antioxidante total del plasma asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

M0 M1

hepáticas M1

no hepáticas M1

hepáticas + otras FRAP (mM Fe 2+)

0,742 ± 0,129b 0,736 ± 0,094a,b 0,673 ± 0,124a,b 0,653 ± 0,142a

ABTS (mM TROLOX) 2,49 ± 0,547b 2,42 ± 0,501a,b 2,16 ± 0,369a,b 2,08 ± 0,696a

Polifenoles (mM) 364 ± 86,9b 279 ± 64,6a 294 ± 51,8a 297 ± 32,5a



significativamente menor en el grupo de pacientes cuya metástasis está en un

Resultados

147

estado más avanzado. Los pacientes con metástasis hepática y no hepática se

encontrarían en una situación intermedia entre el grupo M0 y el de los pacientes con

metástasis hepáticas y otras, sin que estas diferencias sean significativas ni entre

ellos, ni entre los dos estados extremos, en el caso de la valoración de la capacidad

antioxidante por el método FRAP y el ABTS. En cuanto a la concentración de

polifenoles, solo se detectan diferencias significativas con respecto a la población sin

metástasis.

0,00,51,01,52,02,53,03,54,0

FRAP ABTS

FR

AP

(mM

Fe

2+)

AB

TS

(mM

TR

OLO

X)

CCR TTO. M0 CCR TTO. M hepáticasCCR TTO. M no hepáticas CCR TTO. M hepáticas + otras

b a,b aa,b

b

a,baa,b

A

0100200300400500600700

Polifenolesm

M

CCR TTO. M0 CCR TTO. M hepáticas

CCR TTO. M no hepáticas CCR TTO. M hepáticas + otras

b

a aa

B

Figura 82 . Capacidad antioxidante total del plasma mediante método FRAP y ABTS (A) y polifenoles (B) asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.



nítrico en plasma se muestran en la Tabla LV y en la Figura 83.

Tabla LV . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

M0 M1

hepáticas M1

no hepáticas M1

hepáticas + otras

Nitrito (µM) 2,72 ± 0,658a 3,91 ± 0,375b 3,85 ± 0,445b 4,30 ± 0,808b

Nitrato (µM) 15,5 ± 2,19a 23,2 ± 3,14b 21,9 ± 3,40b 22,5 ± 2,18b


Las poblaciones con metástasis presentan concentraciones tanto de nitrito

como de nitrato significativamente superiores al grupo sin metástasis. A pesar de

que los niveles de concentración de estas especies varían según el tipo de

metástasis, no se detectan diferencias significativas entre los diferentes tipos

estudiados.

Resultados

148

0,03,06,09,0

12,015,018,021,024,027,030,0

Nitrito Nitratoµµ µµ

M


a b bb

a

b bb

Figura 83 . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.


a. Lípidos




Los resultados relativos a la concentración de hidroperóxidos en plasma

muestran (Tabla LVI y Figura 84) que sólo existe diferencia significativa cuando el

tipo de metástasis corresponde a un estado de enfermedad más avanzado.

Tabla LVI . Concentración de indicadores del daño a lípidos medido en plasma asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

M0 M1

hepáticas M1

no hepáticas M1

hepáticas + otras Hidroperóxidos (mM) 8,74 ± 2,00a 9,72 ± 1,39a 8,64 ± 1,65a 11,9 ± 2,35b

MDA-plasma (nM) 216 ± 44,1a 193 ± 60,8a 194 ± 60,1a 202 ± 44,6a


Resultados

149

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

Hidroperoxidos

µµ µµM


a a

b

a

A

0

50

100

150

200

250

300

MDA plasma

nM


a a aa

B

Figura 84 . Indicadores del daño a lípidos, mediante medida de concentración de hidroperóxidos (A) y MDA (B) medidos en plasma asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

En cuanto a los niveles de MDA, medidos tanto en plasma como en linfocitos

(Tabla LVII y Figura 85), no se detectan diferencias significativas entre ninguna de

las poblaciones estudiadas.

Tabla LVII . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

M0 M1

hepáticas M1

no hepáticas M1

hepáticas + otras MDA-linfocitos (nM) 62,8 ± 14,5a 54,3 ± 9,09a 53,2 ± 5,12a 58,5 ± 11,9a


0

50

100

150

200

250

300

MDA linfocitos

nM


aa aa

Figura 85 . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

b. Proteínas



Tanto en el caso de la determinación en plasma (Tabla LVIII y Figura 86) como

en linfocitos (Tabla LIX y Figura 87), los resultados muestran diferencias

Resultados

150

significativas entre la población sin metástasis o bien con metástasis hepáticas

respecto a los pacientes pertenecientes a los grupos con metástasis no hepáticas o

con un mayor avance de la enfermedad (hepáticas + otras).

Tabla LVIII . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

M0 M1

hepáticas M1

no hepáticas M1

hepáticas + otras GC-plasma (nmoles/mg proteína) 15,0 ± 3,48a 14,5 ± 2,84a 17,9 ± 3,93b 18,0 ± 2,20b


0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,022,525,0

GC plasma

nmol

es/m

g pr

ot


a

bb

a

Figura 86 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Tabla LIX . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

M0 M1

hepáticas M1

no hepáticas M1

hepáticas + otras GC-linfocitos (nmoles/mg proteína) 8,81 ± 2,02a 8,57 ± 1,76a 10,8 ± 1,69b 10,5 ± 2,13b


0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,022,525,0

GC linfocitos

nmol

es/m

g pr

ot

CCR TTO. M0 CCR TTO. M hepáticas

CCR TTO. M no hepáticas CCR TTO. M hepáticas + otras

ab b

a

Figura 87 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

Resultados

151



concentración del glutation (GSH) y en plasma la tiorredoxina (Trx) y la tiorredoxina

reductasa (TrxR).

En las Tabla LX y en la figura adjunta (Figura 88) se resumen los resultados del

estado redox en plasma.

Tabla LX . Estado redox medido en plasma asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

M0 M1

hepáticas M1

no hepáticas M1

hepáticas + otras GSH-plasma (µmoles/g Hb)

0,596 ± 0,114c 0,432 ± 0,127b 0,331 ± 0,070a 0,347 ± 0,055a,b

Trx (ng/mL) 46,3 ± 20,0a 57,3 ± 22,0a 61,0 ± 15,0a 87,7 ± 31,9b

TrxR (mU/mL) 5,88 ± 0,505a 7,03 ± 0,950b 6,96 ± 0,721b 6,50 ± 0,450b


Respecto al GSH en plasma, se detectan cambios significativos entre la

población M0 y los grupos de pacientes que presentan diferentes tipos de

metástasis. No obstante, la diferente concentración de GSH existente de un tipo de

metástasis a otra, no es significativa entre el grupo de pacientes con enfermedad

más avanzada (metástasis hepática + otras) con respecto a las poblaciones con

metástasis hepática o no hepática.

En cuanto a la tiorredoxina, el grupo con metástasis hepática + otras presenta

la concentración más elevada (87,7 ± 31,9) y es el único que tiene diferencias

significativas con respecto al resto de poblaciones estudiadas.

Por otra parte, el grupo sin metástasis (M0) presenta el menor valor de

actividad de la tiorredoxina reductasa, siendo esta diferencia significativa respecto al

resto de grupos estudiados.

Resultados

152

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

GSH plasma

µµ µµmol

es/g

Hb


c

a a,b

b

A

0

25

50

75

100

125

150

Trx

ng/m

L


aa

b

a

B

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

TrxR

mU

/mL


a

bb

b

C

Figura 88 . Estado redox medido en plasma mediante concentración de GSH (A), Trx (B) y actividad TrxR (C) asociado a metástasis respecto a grupo control en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.


LXI y Figura 89) se detectan cambios significativos entre los grupos M0 (3,40 ±

0,582), la población con metástasis no hepáticas (2,86 ± 0,624) y los pacientes con

metástasis hepáticas + otras (2,31 ± 0,258). La población formada por el grupo de

pacientes con metástasis hepáticas (2,59 ± 0,492) no presenta diferencias con las

otras dos poblaciones con metástasis pero sí con el grupo M0.

Tabla LXI . Estado redox medido en linfocitos asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

M0 M1

hepáticas M1

no hepáticas M1

hepáticas + otras GSH-linfocitos (µmoles/g proteína) 3,40 ± 0,582c 2,59 ± 0,492a,b 2,86 ± 0,624b 2,31 ± 0,258a


Resultados

153

0,0

1,3

2,5

3,8

5,0

GSH linfocitos

µµ µµm

oles

/g p

rot


cb

aa,b

Figura 89 . Estado redox medido en linfocitos asociado al tipo de metástasis en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. Filas con letras distintas indican diferencias significativas con p < 0,05.

4.3.4. Estudio del estrés oxidativo asociado a conc entración de los

marcadores tumorales CEA y Ca 19.9 en pacientes con cáncer

colorrectal

A continuación se recoge el estudio realizado sobre las diferencias existentes

en los niveles de estrés oxidativo entre dos poblaciones con cáncer colorrectal,

sometidas a tratamiento quimioterápico, y con concentraciones igual o mayor y

menor, respectivamente, del límite patológico de dos de los marcadores tumorales

más ampliamente empleados en la monitorización de esta enfermedad, CEA y Ca

19.9. El análisis de estos resultados permitirá evaluar como se relaciona la

concentración de los marcadores tumorales, como indicadores de evolución de

enfermedad, con el nivel de estrés oxidativo existente en los grupos de población

con CCR.


concentración de CEA en un grupo de pacientes en tr atamiento

quimioterápico

En el caso del estudio correspondiente al marcador CEA (antígeno

carcinoembrionario) se ha contado con un grupo de pacientes con cáncer colorrectal

y en régimen quimioterápico, los cuales se han clasificado en dos poblaciones,

tomando para ello el límite marcado por el laboratorio de referencia, valor a partir del

cual se sospecha de la existencia de algún proceso patológico (≥ 5 ng/mL),

fundamentalmente de tipo tumoral.

Resultados

154


La Tabla LXII y la figura adjunta (Figura 90) recogen el valor promedio obtenido

de la determinación de los parámetros indicadores de la capacidad antioxidante total

del plasma.

Tabla LXII . Capacidad antioxidante total del plasma asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

CEA < 5 ng/mL CEA ≥ 5 ng/mL p

FRAP (mM Fe 2+) 0,767 ± 0,100 0,679 ± 0,126 0,0037**

ABTS (mM TROLOX) 2,57 ± 0,330 2,23 ± 0,430 0,0025**

Polifenoles (mM) 342 ± 65,5 303 ± 53,0 0,0266*

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. * y ** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,005 respectivamente cuando se compara población con CEA ≥ 5 ng/mL vs CEA < 5 ng/mL.


significativamente mayor en el grupo de sujetos cuya concentración de CEA es

menor de 5 ng/mL respecto a la población con valores mayores de marcador.

0,00,51,01,52,02,53,03,54,0

FRAP ABTS

FR

AP

(mM

Fe

2+)

AB

TS

(mM

TR

OLO

X)

CCR TRATAMIENTO CEA < 5 ng/MlCCR TRATAMIENTO CEA >= 5 ng/Ml

**

**

A

0

100

200

300400

500

600

700

Polifenoles

mM


*

B

Figura 90 . Capacidad antioxidante total del plasma mediante método FRAP y ABTS (A) y polifenoles (B) asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. * y ** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,005 respectivamente.

Destacar que esta mayor capacidad antioxidante es similar (incremento de en

torno a un 15%), cuando se valora a través del método FRAP (p=0,0037) que

cuando es empleando el método ABTS (p=0,0025), y con parecidos niveles de

significancia. Asimismo, la concentración de polifenoles en el grupo de pacientes con

CEA menor es un 13% mayor respecto a la población con valores de CEA ≥ 5

ng/mL.

Resultados

155



nítrico en plasma se muestran en la Tabla LXIII y en la Figura 91.

Tabla LXIII . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

CEA < 5 ng/mL CEA ≥ 5 ng/mL P

Nitrito (µM) 3,19 ± 0,801 3,64 ± 0,826 0,0349*

Nitrato (µM) 18,1 ± 3,60 20,5 ± 4,66 0,0273*

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. * indica diferencias significativas con p < 0,05 cuando se compara población con CEA ≥ 5 ng/mL vs CEA < 5 ng/mL.

La población con niveles más altos de marcador tumoral (≥ 5 ng/mL) presenta

unos valores promedio para el nitrito (3,64 ± 0,826) y el nitrato (20,5 ± 4,66)

significativamente superiores a los encontrados en los enfermos de CCR con

concentraciones inferiores a 5 mg/mL (3,19 ± 0,801 y 18,1 ± 3,60, respectivamente).

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,022,525,0

Nitrito Nitrato

µµ µµM


*

*

Figura 91 . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. * indica diferencias significativas con p < 0,05.


a. Lípidos


en plasma los niveles de MDA y la concentración de hidroperóxidos, mientras que en


Resultados

156

Los resultados en plasma muestran (Tabla LXIV y Figura 92) que existen


dos grupos de población.

Tabla LXIV . Concentración de indicadores del daño a lípidos medido en plasma asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.


Hidroperóxidos (µM) 8,83 ± 1,86 10,0 ± 2,23 0,0215*

MDA-plasma (nM) 191 ± 44,4 222 ± 52,6 0,0226*


Así, el grupo cuya concentración de CEA es menor que 5 ng/mL, presentaría

menor daño lipídico que los pacientes que tienen valores del marcador tumoral por

encima del límite referenciado.

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

Hidroperoxidos

µµ µµM


*

A

0

50

100

150

200

250

300

MDA

nM


*

B

Figura 92 . Indicadores del daño a lípidos, mediante medida de concentración de hidroperóxidos (A) y MDA (B) medidos en plasma asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. * indica diferencias significativas con p < 0,05.

Al evaluar el daño a lípidos en linfocitos (Tabla LXV y Figura 93) a través de la

concentración de MDA, también se encuentran diferencias significativas entre los

dos grupos estudiados.

Tabla LXV . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.


MDA-linfocitos (nM) 55,2 ± 8,48 67,5 ± 14,1 0,0299*


Resultados

157

Destacar que el incremento de concentración de MDA medido entre las dos

poblaciones estudiadas es mayor en linfocitos (22%) que en plasma (16%), aunque

el nivel de significancia es similar en ambos medios.

0

50

100

150

200

250

300

MDA

nM


*

Figura 93 . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. * indica diferencias significativas con p < 0,05.

b. Proteínas



Tanto en el caso de la determinación en plasma (Tabla LXVI y Figura 94) como

en linfocitos (Tabla LXVII y Figura 95), los resultados muestran diferencias

significativas entre los grupos de población estudiados.

Tabla LXVI . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

CEA < 5 ng/mL CEA ≥ 5 ng/mL p GC-plasma (nmoles/mg proteína) 14,1 ± 2,92 16,6 ± 3,31 0,0036**

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. ** indica diferencias significativas con p < 0,005 cuando se compara población con CEA ≥ 5 ng/mL vs CEA < 5 ng/mL.

0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC

nmol

es/m

g pr

ot


**

Figura 94 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. ** indica diferencias significativas con p < 0,005.

Resultados

158

Destacar que las diferencias detectadas son mayores en plasma (18%) que en

linfocitos (13%), en cuanto a incremento de concentración de GC, y además en

plasma esta diferencia presenta mayor nivel de significancia.

Tabla LXVII . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

CEA < 5 ng/mL CEA ≥ 5 ng/mL p GC-linfocitos (nmoles/mg proteína) 8,86 ± 1,83 10,0 ± 2,32 0,0374*


0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC

nmol

es/m

g pr

ot


*

Figura 95 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. * indica diferencias significativas con p < 0,05.


Para el estudio del estado redox se midió la concentración del glutation (GSH),

tanto en plasma como en linfocitos, y en plasma se valoró el sistema tiorredoxina,

formado por la tiorredoxina (Trx) y la tiorredoxina reductasa (TrxR).

En la Tabla LXVIII y en la figura adjunta (Figura 96) se resumen los resultados

del estado redox en plasma.

Tabla LXVIII . Estado redox medido en plasma asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

CEA < 5 ng/mL CEA ≥ 5 ng/mL p GSH-plasma (µmoles/g Hb)

0,550 ± 0,110 0,443 ± 0,108 0,0039**

Trx (ng/mL) 45,8 ± 19,2 66,0 ± 31,2 0,0042**

TrxR (mU/mL) 7,21 ± 1,28 6,47 ± 1,05 0,0145*

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. * y ** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,005 respectivamente cuando se compara población con CEA ≥ 5 ng/mL vs CEA < 5 ng/mL.

Resultados

159

Así, en el caso del GSH se detectan cambios significativos (p=0,0039) entre los

dos grupos estudiados (0,550 ± 0,110 y 0,443 ± 0,108 en pacientes con CEA menor

de 5 ng/mL y con CEA mayor o igual que 5 ng/mL, respectivamente).

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

GSH

µµ µµmol

es/g

Hb


**

A

0

25

50

75

100

125

150

Trx

ng/m

L


**

B

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

TrxR

mU

/mL


*

C

Figura 96 . Estado redox medido en plasma mediante concentración de GSH (A), Trx (B) y actividad TrxR (C) asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. * y ** indican diferencias significativas con p < 0,05 y p < 0,005 respectivamente.


significativas en ambos parámetros para los dos grupos estudiados. Así, los

pacientes que tienen valores de CEA iguales o por encima de 5 ng/mL, poseen una

concentración de tiorredoxina mayor (66,0 ± 31,2) que la población con valores más

bajos de marcador (45,8 ± 19,2). En el caso de la tiorredoxina reductasa, es el grupo

con valores bajos de CEA (< 5 ng/mL) el que presenta mayor actividad enzimática.


LXIX y Figura 97), al igual que ocurre en plasma, se detectan cambios significativos

(p=0,0342) entre el grupo de pacientes con CEA menor de 5 ng/mL (3,10 ± 0,594) y

el grupo de población con concentraciones de marcador por encima de los límites de

referencia (2,75 ± 0,543).

Resultados

160

Tabla LXIX . Estado redox medido en linfocitos asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

CEA < 5 ng/mL CEA ≥ 5 ng/mL p GSH-linfocitos (µmoles/g proteína) 3,10 ± 0,594 2,75 ± 0,543 0,0342*


Cabe destacar, que la diferencia detectada, en cuanto a incremento de

concentración de GSH es, además de más significativa, más acusada en el caso de

las mediciones realizadas en plasma (24%) respecto al resultado obtenido en

linfocitos (13%).

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

GSH

µµ µµmol

es/g

pro

t


*

Figura 97 . Estado redox medido en linfocitos asociado a concentración de CEA en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. * indica diferencias significativas con p < 0,05.


concentración de Ca 19.9 en un grupo de pacientes e n

tratamiento quimioterápico

En el caso del estudio correspondiente al marcador Ca 19.9, se ha contado con

un grupo de pacientes con cáncer colorrectal y bajo tratamiento quimioterápico,

clasificándoles en dos poblaciones, tomando para ello el límite marcado por el

laboratorio de referencia, valor a partir del cual se sospecha de la existencia de

algún proceso patológico (≥ 37 U/mL), fundamentalmente de tipo tumoral.


La Tabla LXX y la Figura 98 adjunta recogen el valor promedio obtenido de la


plasma.

Resultados

161

Tabla LXX . Capacidad antioxidante total del plasma asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Ca 19.9 < 37 U/mL Ca 19.9 ≥ 37 U/mL p

FRAP (mM Fe 2+) 0,714 ± 0,132 0,706 ± 0,121 0,8311

ABTS (mM TROLOX) 2,37 ± 0,569 2,31 ± 0,534 0,6684

Polifenoles (mM) 321 ± 73,3 332 ± 82,2 0,5596

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. p > 0,05 indica que no hay diferencias significativas cuando se compara población con Ca 19.9 ≥ 37 U/mL vs Ca 19.9 < 37 U/mL.

Los resultados muestran que no existe diferencia en cuanto a capacidad

antioxidante, en base a los resultados de los parámetros medidos, entre ambos

grupos de población.

0,00,51,01,52,02,53,03,54,0

FRAP ABTS

FR

AP

(mM

Fe

2+)

AB

TS

(mM

TR

OLO

X)

CCR TTO. Ca 19.9 < 37 U/L CCR TTO. Ca 19.9 >= 37 U/L

A

0

100

200

300400

500

600

700

Polifenoles

mM

CCR TTO. Ca 19.9 < 37 U/LCCR TTO. Ca 19.9 >= 37 U/L

B

Figura 98 . Capacidad antioxidante total del plasma mediante método FRAP y ABTS (A) y polifenoles (B) asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.



nítrico en plasma se muestran en la Tabla LXXI y en la Figura 99.

Tabla LXXI . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Ca 19.9 < 37 U/mL Ca 19.9 ≥ 37 U/mL p

Nitrito (µM) 3,09 ± 0,744 3,82 ± 0,695 <0,0005***

Nitrato (µM) 18,3 ± 4,22 21,5 ± 4,00 0,0051**

Los resultados están expresados en media ± desviación estándar. ** y *** indican diferencias significativas con p < 0,005 y p < 0,0005 respectivamente cuando se compara población con Ca 19.9 ≥ 37 U/mL vs Ca 19.9 < 37 U/mL.

La población con concentración de Ca 19.9 superior al límite referenciado (≥ 37

U/mL) presenta unos valores promedio para el nitrito (3,82 ± 0,695) y el nitrato (21,5

Resultados

162

± 4,00) significativamente superiores a los encontrados en los enfermos de CCR con

concentraciones inferiores a 37 U/mL (3,09 ± 0,744 y 18,3 ± 4,22, respectivamente).

0,03,06,09,0

12,015,018,021,024,027,030,0

Nitrito Nitrato

µµ µµM

CCR TTO. Ca 19.9 < 37 U/L CCR TTO. Ca 19.9 >= 37 U/L

***

**

Figura 99 . Concentración de indicadores de óxido nítrico en plasma asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. ** y *** indican diferencias significativas con p < 0,005 y p < 0,0005 respectivamente.


a. Lípidos


en plasma los niveles de MDA y la concentración de hidroperóxidos, mientras que en


Los resultados en plasma muestran (Tabla LXXII y Figura 100) que las

diferencias de concentración detectadas no son significativas en cuanto a los niveles

de hidroperóxidos y MDA, entre los dos grupos de población.

Tabla LXXII . Concentración de indicadores del daño a lípidos medido en plasma asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Ca 19.9 < 37 U/mL Ca 19.9 ≥ 37 U/mL p

Hidroperóxidos (µM) 9,21 ± 2,30 9,79 ± 1,72 0,2868

MDA-plasma (nM) 200 ± 47,9 213 ± 54,4 0,3877


Resultados

163

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

Hidroperoxidos

µµ µµM


A

0

50

100

150

200

250

300

MDA

nM


B

Figura 100 . Indicadores del daño a lípidos, mediante medida de concentración de hidroperóxidos (A) y MDA (B) medidos en plasma asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Al evaluar el daño a lípidos en linfocitos (Tabla LXXIII y Figura 101) a través de

la concentración de MDA, tampoco se encuentra que la diferencia sea significativa

entre los dos grupos estudiados.

Tabla LXXIII . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Ca 19.9 < 37 U/mL Ca 19.9 ≥ 37 U/mL p

MDA-linfocitos (nM) 59,0 ± 12,9 72,2 ± 19,4 0,0646


0

50

100

150

200

250

300

MDA

nM


Figura 101 . Concentración de MDA como indicador del daño a lípidos medido en linfocitos asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

b. Proteínas



Tanto en el caso de la determinación en plasma (Tabla LXXIV y Figura 102)

como en linfocitos (Tabla LXXV y Figura 103), los resultados muestran que las

Resultados

164

diferencias detectadas no son significativas entre los grupos de población

estudiados.

Tabla LXXIV . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Ca 19.9 < 37 U/mL Ca 19.9 ≥ 37 U/mL p GC-plasma (nmoles/mg proteína) 15,3 ± 3,43 16,2 ± 3,83 0,3120


0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC

nmol

es/m

g pr

ot


Figura 102 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en plasma asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Tabla LXXV . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Ca 19.9 < 37 U/mL Ca 19.9 ≥ 37 U/mL p GC-linfocitos (nmoles/mg proteína) 9,19 ± 2,01 9,67 ± 2,31 0,3835


0,02,55,07,5

10,012,515,017,520,0

GC

nmol

es/m

g pr

ot


Figura 103 . Concentración de GC como indicador del daño a proteínas medido en linfocitos asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Resultados

165



concentración del glutation (GSH), y en plasma se cuantificó el sistema tiorredoxina,

formado por la tiorredoxina (Trx) y la tiorredoxina reductasa (TrxR).

En las Tablas LXXVI y LXXVII y en las figuras adjuntas (Figura 104 y Figura

105) se resumen los resultados del estado redox en plasma y en linfocitos.

Tabla LXXVI . Estado redox medido en plasma asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Ca 19.9 < 37 U/mL Ca 19.9 ≥ 37 U/mL p GSH-plasma (µmoles/g Hb)

0,532 ± 0,135 0,454 ± 0,114 0,0630

Trx (ng/mL) 50,3 ± 20,0 51,6 ± 24,1 0,8385

TrxR (mU/mL) 6,93 ± 1,18 6,59 ± 1,33 0,2723


Así, en el caso del GSH no se detectan cambios significativos entre los dos

grupos estudiados, tanto en plasma como en linfocitos.

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

GSH

µµ µµmol

es/g

Hb


A

0

25

50

75

100

Trx

ng/m

L


B

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

TrxR

mU

/mL


C

Figura 104 . Estado redox medido en plasma mediante concentración de GSH (A), Trx (B) y actividad TrxR (C) asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Resultados

166

Por otra parte, en cuanto al sistema tiorredoxina, no se encuentran diferencias

significativas ni en la tiorredoxina ni en la actividad de la tiorredoxina reductasa para

los dos grupos de población clasificados en función de la concentración del

marcador tumoral Ca 19.9.

Tabla LXXVII . Estado redox medido en linfocitos asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico.

Ca 19.9 < 37 U/mL Ca 19.9 ≥ 37 U/mL p GSH-linfocitos (µmoles/g proteína) 3,04 ± 0,691 2,94 ± 0,659 0,5780


0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

GSH

µµ µµmol

es/g

pro

t


Figura 105 . Estado redox medido en linfocitos asociado a concentración de Ca 19.9 en una población con CCR en tratamiento quimioterápico. p > 0,05 indica que no hay diferencias significativas.

4.3.5. Estudio del estrés oxidativo asociado a otra s patologías en

pacientes con cáncer colorrectal

Con objeto de conocer que niveles de estrés se podrían asociar a una

determinada patología de base, se ha planteado el estudio inferencial en dos grupos

de población con CCR y en tratamiento quimioterápico con y sin una serie de

enfermedades tales como hipertensión arterial (HTA), enfermedad pulmonar

obstructiva crónica (EPOC), lipidemia, diabetes y otras neoplasias anteriores. Por

otra parte, a través de este estudio también se podría poner de manifiesto que parte

del estrés oxidativo que presentan los pacientes con cáncer colorrectal podría ser

debido a estas patologías de base y no sólo a la neoplasia estudiada.

Los resultados de este estudio se recogen la Tabla LXXVIII, donde quedan

reflejadas sólo las enfermedades junto con los parámetros de estrés oxidativo que

muestran diferencias significativas entre las dos poblaciones estudiadas.

Resultados

167

Tabla LXXVIII . Estudio del estrés oxidativo asociado a patologías de base en pacientes con CCR y en tratamiento quimioterápico.

ABTS MDA-linfocitos

GC-plasma

GC-linfocitos

Trx GSH-linfocitos

HTA -- p=0,0048 p=0,0190 p=0,0418 p=0,0308 p=0,0199

Lipidemias p=0,0459 -- -- p=0,0253 --

Valores de p < 0,05 indican diferencias significativas cuando se compara población con HTA o lipidemia vs sin dicha enfermedad.

Cabe destacar que los pacientes con EPOC, diabetes o que han tenido con

anterioridad otra neoplasia diferente del CCR, no presentan diferencias en ninguno

de los parámetros asociados a estrés oxidativo respecto al grupo de población que

no ha tenido ninguna de estas patologías.

Los pacientes que tienen alguna alteración en su perfil lipídico respecto a los

que no, solo presentan diferencias significativas en su capacidad antioxidante,

medida a través del método ABTS y en los niveles de tiorredoxina.

Asimismo, el grupo de pacientes con HTA respecto a la población sin esta

enfermedad presenta diferencias significativas en cuanto se refiere al daño oxidativo

a lípidos (MDA-linfocitos), daño oxidativo a proteínas (GC-plasma y linfocitos) y

estado redox (Trx y GSH-linfocitos), siendo además la HTA la enfermedad que

presenta mayores diferencias de estrés respecto a las otras patologías estudiadas.

4.3.6. Estudio de las correlaciones entre los difer entes marcadores de

estrés oxidativo en pacientes con cáncer colorrecta l

La relación entre los cambios en los diferentes parámetros analizados en este

estudio se evalúa mediante el establecimiento de correlaciones paramétricas. La

tabla LXXIX resume las correlaciones biparamétricas estadísticamente significativas

del grupo control y de los pacientes con cáncer colorrectal.

Cuando se analizan las correlaciones obtenidas entre el grupo control y el de

los pacientes con cáncer colorrectal, destacan los resultados obtenidos al analizar

los marcadores de capacidad antioxidante total y el estado redox como el GSH o el

sistema tiorredoxina Trx/TrxR, así como las detectadas al estudiar el biomarcador de

daño a proteínas en ambos grupos de población.

Resultados

168

Tabla LXXIX . Correlaciones biparamétricas entre los diferentes marcadores de estrés oxidativo en grupo control y en pacientes con cáncer colorrectal.

Valores de la parte superior de la celda corresponden al coeficiente de correlación a un nivel de significancia de p<0,05, dato recogido en la inferior de la misma. ns indica que la correlación no es significativa.

F

RA

P

AB

TS

P

F

Nitr

itos

N

itrat

os

HP

M

DA

G

C

GS

H

TRx

Trx

R

GC

(l)

GS

H(l)

M

DA

(l)

FR

AP

-

ns

0.24

1 0.

043

0.35

1 0.

016

ns

ns

ns

ns

0.57

0 0.

001

0.28

2 0.

04

ns

ns

ns

-0.4

54

0.00

6 A

BT

S

ns

- 0.

418

0.00

1 ns

ns

ns

ns

-0

.363

0.

007

ns

0.33

2 0.

006

0.30

1 0.

028

-0.4

78

0.01

5 ns

ns

PF

ns

ns

-

ns

ns

ns

ns

-0.3

27

0.00

5 ns

ns

ns

ns

ns

ns

Nitr

itos

-0.2

50

0.03

1 ns

-0

.302

0.

009

- ns

ns

0.

283

0.04

0 ns

ns

ns

ns

0.

387

0.02

1 ns

0.

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OLO

RR

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L

Resultados

169

En el grupo control los parámetros de capacidad antioxidante FRAP y ABTS se

correlacionan positivamente con el marcador de antioxidantes exógeno polifenoles.

Cuando se compara con los marcadores del estado redox observamos que FRAP se

correlaciona de forma directa con ambos tioles, GSH y Trx, y el ABTS se

correlaciona con la Trx y la TrxR, pero no con el GSH. Sin embargo, en los pacientes

con CCR no se obtuvieron correlaciones entre estos grupos.

En relación a las correlaciones entre capacidad antioxidante total medida por el

método FRAP y los nitritos, como biomarcador de óxido nítrico, se obtuvo una

correlación directa en el grupo control, estableciendo una relación entre la capacidad

reductora del plasma y los niveles de óxido nítrico. Sin embargo, en el grupo de

pacientes con CCR, se establece una relación inversa y mucho más estrecha entre

la capacidad antioxidante total, a través de los tres parámetros ABTS, FRAP y

polifenoles, y los niveles de óxido nítrico.

En lo que respecta al daño oxidativo a biomoléculas, destacan los resultados al

estudiar las correlaciones establecidas entre los GC, como indicador de daño a

proteínas, y los diferentes parámetros de estrés oxidativo. Asimismo, en el grupo

control, los GC de plasma se correlacionan negativamente con los resultados de las

medidas realizadas de la capacidad antioxidante a través del método ABTS y con los

polifenoles asi como con los tioles GSH y Trx encargados del estado redox. Por otra

parte, se establece una correlación positiva con los indicadores de daño a

biomoléculas de linfocitos, tanto con los GC como con el MDA. Sin embargo, en el

grupo de pacientes con CCR, sólo se establecen correlaciones negativas con los

parámetros indicadores de capacidad antioxidante FRAP y ABTS y positivas con el

marcador MDA de daño a lípidos en plasma, pero no con los parámetros del estado

redox.

En lo que respecta a las correlaciones establecidas para el marcador de daño a

proteínas (grupos carbonilo) en linfocitos de la población control, se establece una

relación negativa con el ABTS pero positiva con otros marcadores de daño oxidativo

plasmático como son nitritos, hidroperóxidos y grupos carbonilo de proteínas

plasmáticas. Resultados similares para el indicador de daño a lípidos, MDA, donde

la correlación es negativa con el marcador de capacidad antioxidante plasmático

Resultados

170

FRAP y positiva con marcadores de daño oxidativo nitritos y grupos carbonilo

plasmático. Sin embargo, en los pacientes con CCR no se obtuvieron correlaciones

entre estos grupos.

En cuanto al estado redox y biomarcadores de daño oxidativo, solo se

establece correlación en los grupos carbonilo, siendo inversa con ambas moléculas

tiólicas, GSH y Trx en sujetos control, que nuevamente no se observa en el grupo de

pacientes, donde sin embargo, las correlaciones directas se observan entre

hidroperóxidos y el sistema Trx/TrxR.

Por otra parte, el GSH presente en linfocitos, que no se correlaciona en sujetos

control, si va a ser un marcador importante en enfermos con CCR, ya que se

correlaciona positivamente con polifenoles y negativamente con otros marcadores

de daño oxidativo como los de óxido nítrico, los hidroperóxidos como indicadores de

daño a lípidos y los grupo carbonilo como biomarcadores de daño a las proteínas

presentes en linfocitos.

DISCUSIÓN

Discusión

171

5. DISCUSION

El cáncer colorrectal representa uno de los mayores problemas de salud

presente en las sociedades desarrolladas, estando ampliamente demostrado la

estrecha relación existente entre los niveles de estrés oxidativo y los mecanismos de

inicio, promoción y progresión de la carcinogénesis (Rainis et al., 2007),

consecuencia de la constante exposición de ROS por parte de las células

intestinales. Es bien conocido que el estrés oxidativo está asociado no solo con la

iniciación sino también con la promoción y progresión del cáncer. La anormal

producción de oxidantes celulares o del desequilibrio del sistema control de

antioxidantes ha sido asociado a mutaciones inducidas por el daño oxidativo al DNA,

así como modificaciones de la expresión génica. Algunas señales de transducción

son también activadas por ROS y llevan a la transcripción de genes implicados en la

regulación del crecimiento celular (Valko et al., 2006).

En base a la bibliografía revisada queda evidenciada la relación entre el estrés

oxidativo y los diferentes procesos carcinogénicos. Pero el papel del estrés oxidativo

en el cáncer es complejo ya que son múltiples las variables que pueden influir, no

solo en el desarrollo si no también en la progresión y tratamiento del mismo. Por

eso, en este trabajo se ha abordado el estudio del estrés oxidativo en pacientes con

cáncer colorrectal, por ser uno de los de más incidencia en los paises desarrollados,

estratificando el estudio en base a aquellas fases en las cuales es sabido que está

implicado el estrés oxidativo.

La ausencia de la existencia de estudios in vivo que revelen si existen

diferencias en el nivel de estrés oxidativo entre diferentes neoplasias, nos ha llevado

a realizar un primer estudio comparativo del estrés oxidativo en pacientes con

cáncer colorrectal, con otros de menor incidencia en la población burgalesa como

son el cáncer gástrico y un cáncer hematológico como el linfoma. Asimismo, varios

estudios han propuesto como el estrés oxidativo provocado por ROS, también está

implicado en los mecanismos de metástasis (Wu, 2006), tales como migración,

invasión de células tumorales y angiogénesis.

Discusión

172

Finalmente, y como parte central de este trabajo de investigación, nos hemos

planteado también estudiar la relación entre estrés oxidativo y fármacos

quimioterápicos. Son muchos los estudios, principalmente in vitro, que muestran

esta relación (Rigas and Sun, 2008), ya que varios de los fármacos que forman parte

de los diferentes grupos de tratamiento median parte de su mecanismo de acción a

través de procesos redox, causando variaciones en los niveles del estrés oxidativo.

Es sabido que el estrés oxidativo asi como el estado redox celular determina la

eficacia de ciertos agentes anticancerígenos cuyo mecanismo de acción puede ser

modificado en función del estado celular o incluso por la presencia de antioxidantes

(Arrigo, 1999; Valko et al., 2006). Antioxidantes como el GSH o la TRx, median la

respuesta de los tratamientos quimioterapéuticos, la depleción de GSH incrementa

la apoptosis inducida por cisplatino o por 5-fluoruacilo en células de carcinoma de

colon y hepatocarcinoma. Grivich y cols observaron que en el tratamiento con

irinotecan en combinación con el 5-fluorouracilo se incrementaban los niveles de la

enzima antioxidante superóxido dismutasa en células de carcinoma de colon HT-29

humano (Grivicich et al., 2005). También el estado redox puede modificar la acción

de otro tipo de anticancerígenos como son los antiangiogénicos. Así estudios in vitro

han demostrado un aumento de la eficacia de anticuerpos monoclonales como el

bevacizumab (Avastin), o el cetuximab (Erbitux) en combinación con otros fármacos

antioxidantes (Brown et al., 2005).

Por tanto, con objeto de realizar un estudio completo y exhaustivo se ha

determinado la capacidad antioxidante total, el daño a biomoléculas y la evaluación

del estado redox, a través de la medida de diferentes parámetros. Para ello se han

empleado los valores promedio resultantes de la medición de diferentes parámetros

enmarcados en los siguientes tres grandes grupos, capacidad antioxidante total,

daño a biomoléculas y estado redox.

La valoración de la capacidad antioxidante total se considera la acción conjunta

de todos los antioxidantes presentes en el plasma, aportando un dato integral frente

a los datos de medidas individuales de antioxidantes. Por lo tanto, la acción

sinérgica de los diferentes compuestos que tengan capacidad antioxidante

(endógenos como exógenos) está asegurada y da una idea del desequilibrio entre

antioxidantes y oxidantes. Los antioxidantes pueden ser endógenos, resultado del

Discusión

173

metabolismo como del ácido úrico, bilirrubina, albúmina, tioles, etc., o provenientes

de fuentes exógenas introducidas en el organismo por una dieta rica en

antioxidantes como las vitaminas y los polifenoles, que contribuyen al refuerzo de la

capacidad antioxidante endógena. Son muchas las evidencias que muestran la

importancia de la capacidad antioxidante total del plasma y sus modificaciones en

situaciones de estrés oxidativo asociado a diferentes patologías. Por eso, en este

estudio se ha abordado la determinación de la capacidad antioxidante total en

plasma aplicando tres técnicas, la del ABTS como indicador de la capacidad

estabilizadora de radicales libres, el FRAP como indicador del poder reductor, y la

cuantificación de polifenoles totales como indicador de la contribución de

compuestos antioxidantes presentes en la dieta.

Asimismo, niveles elevados de ROS y RNS producen un daño causado por la

interacción de los radicales libres con distintas macromoléculas biológicas, como

lípidos y proteínas, habiendo sido relacionado dicho daño con mecanismos de

carcinogénesis (Ahmad et al., 2008; Cejas et al., 2004). Sin embargo, debido a la

vida media tan corta de estas especies reactivas, se hace necesario valorar el daño

a estas macromoléculas mediante el empleo de biomarcadores, que supongan un

reflejo de las consecuencias del estrés oxidativo en los sistemas biológicos vivos.

De particular relevancia para el daño tisular destaca el daño oxidativo a lípidos,

la peroxidación lipídica. El proceso de peroxidación lipídica engloba una serie de

reacciones en cascada entre cuyos productos se encuentran hidroperóxidos y

aldehidos, para los cuales existen diferentes ensayos para su cuantificación. La

ausencia de un único marcador de peroxidación hace necesario el utilizar varios

marcadores, por lo que en el presente estudio se han cuantificado los niveles de

MDA y de hidroperóxidos lipídicos. Las proteínas son también susceptibles del daño

oxidativo por ROS o RNS, y los productos formados como consecuencia de su

oxidación son químicamente muy diversos. Entre las modificaciones originadas

resultado de su oxidación una de las más comunes es la aparición de grupos

carbonilo (Levine et al., 1990) siendo su acumulación considerado un marcador de

daño oxidativo a proteínas en diferentes patologías (Valko et al., 2006).

Discusión

174

Además, como prooxidante se han evaluado los niveles de óxido nítrico,

producto de la acción de las óxido nítrico sintasas sobre la arginina, con importantes

acciones vasodilatadoras, antiproliferativas, antitumorales, etc. (Lowenstein et al.,

1994) que cuando se encuentra a concentraciones elevadas puede interaccionar con

radicales como el superóxido y generar el radical peroxinitrito. Alteraciones en la

síntesis y niveles elevados de óxido nítrico han sido constatados en diferentes

patologías como el caso de pacientes con cáncer (Dincer et al., 2006; Halliwell,

1999). Dado que el NO es un compuesto lábil, éste se suelen cuantificar a través de

la medida de sus metabolitos finales nitrito y/o nitrato. In vivo, casi todo el nitrito es

oxidado a nitrato, por lo que ambos guardan una relación variable. En el presente

estudio se ha cuantificado tanto nitrito como nitrato en plasma como indicadores de

la concentración de óxido nítrico.

Por último, la determinación de concentración de GSH (en plasma y linfocitos) y

la valoración del sistema tiorredoxina (Trx/TrxR) en plasma, permite evaluar el

estado redox, el cual juega un papel crucial en la evolución de las células tumorales

así como en el mecanismo de acción de determinados tratamientos quimioterápicos

(Ceccarelli et al., 2008).

5.1. ESTUDIO COMPARATIVO DEL ESTADO OXIDATIVO SEGÚN EL TIPO DE

CÁNCER

En este primer apartado se analizarán los resultados obtenidos del estudio del

estrés oxidativo de un grupo de pacientes con cáncer colorrectal comparándolos con

los de una población con cáncer gástrico y otra con linfoma respecto a sujetos

control.

Los cánceres gastrointestinales así como los linfomas son los más frecuentes

en los países desarrollados. Los procesos inflamatorios presentes en ambos tipos de

cánceres producen un estrés oxidativo por radicales libres derivados del oxígeno

(ROS) y del nitrógeno (RNS). Este proceso de inflamación juega un papel importante

en la carcinogénesis al generar compuestos carcinogénicos responsables del daño a

distintas biomoléculas como lípidos, proteínas y DNA, causando la activación de la

proliferación celular (Choi et al., 2002; Halliwell, 1999).

Discusión

175

En base a los resultados obtenidos en el desarrollo de este estudio, se puede

constatar que en cualquiera de los tres tipos de neoplasias estudiadas (CCR, CG y

linfoma) hay alteración de los niveles de estrés de oxidativo respecto al grupo de

sujetos control, afectando tanto a la capacidad antioxidante total como al estado

redox quedando reflejado a través de los biomarcadores que indican daño a

biomoléculas.

No obstante, destacar que se detectan diferencias en cuanto a la significancia

de los valores promedio de algunos parámetros medidos entre las distintas

neoplasias (CCR y CG) y linfoma. Sin embargo, estudiando detalladamente todos y

cada uno de los resultados obtenidos, merece la pena destacar una serie de

aspectos, que se comentan a continuación.

El papel del estado antioxidante del organismo relacionado con el tracto

gastrointestinal, es un área de estudio emergente en el campo del estrés oxidativo.

La importancia de este estudio radica en que los antioxidantes presentes en los

alimentos, son absorbidos a través del tracto gastrointestinal al resto del organismo.

Así, diferentes estudios epidemiológicos han mostrado una relación inversa entre el

consumo de frutas y vegetales y algunos tipos de cáncer (van Duijnhoven et al.,

2009). Uno de los posibles mecanismos de ese efecto es la capacidad antioxidante

de compuestos bioactivos como son los polifenoles. Los resultados obtenidos

muestran que la diferencia en cuanto a concentración de polifenoles en linfoma es

de un 85% respecto a población control, sin embargo en el grupo de pacientes con

CG y CCR este valor es de un 70 y 50% respectivamente. Este descenso

significativamente marcado en comparación con el resto de neoplasias, puede ser

debido a que los pacientes con CCR pueden tener alterados parte de los

mecanismos de absorción de estos compuestos, bien por la propia enfermedad y/o

por la cirugía a la que han sido sometidos. Así, determinados estudios constatan

como parte de los polifenoles de la dieta escapan a su absorción en el intestino

delgado, para posteriormente y previa transformación por parte de la microflora

intestinal, presente fundamentalmente en la región colónica, entrar en la circulación

enterohepática (Blaut et al., 2003).

Discusión

176

Uno de los principales RNS, el cual es liberado por fagocitos que median en la

respuesta inflamatoria, es el óxido nítrico (NO), un radical libre que se relaciona con

diferentes tipos de cáncer, destacando los gastrointestinales (Cerutti and Trump,

1991). De los resultados obtenidos, observamos que la concentración de nitrito en la

población con cáncer gástrico es similar al valor que presenta el grupo control y

significativamente diferente a las otras dos neoplasias. Estos resultados discrepan

con lo observado por otros autores donde han detectado concentraciones elevadas

de nitrito y nitrato, productos finales de NO, en pacientes con CG respecto a

controles. Además, estos niveles se han correlacionado con el grado de la

enfermedad así como con una mayor concentración de VEGF (Dincer et al., 2006).

Esto no ocurre con el nitrato, cuya concentración no presenta diferencias

significativas con las otras dos poblaciones con enfermedad y sí con el grupo

control, en consonancia con lo descrito en la bibliografía revisada.

En cuanto al daño oxidativo a lípidos y proteínas, existen numerosos trabajos

que relacionan concentraciones elevadas de los biomarcadores de daño a

biomoléculas, tales como hidroperóxidos, MDA y GC, con los tres tipos de cáncer

estudiados (Brink et al., 2009; Di Giacomo et al., 2003; Eissa and Esmaeel, 2008;

Khanzode et al., 2003; Morabito et al., 2004), tal y como muestran los resultados

obtenidos en nuestro estudio. Además, en este caso, cabe destacar como el linfoma

es la neoplasia que presenta de forma significativa el mayor daño oxidativo a lípidos,

medido a través de los dos biomarcadores analizados (hidroperóxidos y MDA en

plasma y linfocitos), aspecto no descrito hasta la fecha. Esto podría marcar la

existencia de un hecho diferencial respecto a otras neoplasias pudiendo estar

vinculado al propio mecanismo carcinogénico, abriendo así nuevas expectativas en

la búsqueda de dianas terapéuticas.

Sin embargo, en cuanto al daño a proteínas, es el cáncer colorrectal la

neoplasia que presenta la concentración de GC en plasma significativamente mayor,

alcanzando valores de hasta 5 veces más concentración que el grupo control.

Destacar cómo los valores de GC detectados en plasma son significativamente

diferentes entre las tres enfermedades, aspecto que no se detecta en linfocitos,

cuyas diferencias no son significativas entre ellas, pero sí respecto al control.

Discusión

177

En cuanto al estado redox, entre las principales especies o sistemas

antioxidantes estudiados destaca el glutation, tiol tripeptídico (Estrela et al., 2006), y

el sistema tiorredoxina, formado por la tiorredoxina y la tiorredoxina reductasa,

jugando un papel fundamental en la regulación redox de multitud de procesos

intracelulares (Valko et al., 2006).

Diversos estudios han reflejado como en pacientes con CCR hay una menor

concentración del tripéptido estudiado respecto a sujetos control, debido al

importante papel que juega en los procesos de detoxificación carcinogénica, tal y

como muestran los resultados obtenidos en este estudio (Di Giacomo et al., 2003).

En los casos de CG y de los pacientes con linfoma, también existen trabajos que

reflejan una menor concentración en los pacientes con neoplasia respecto al grupo

control (Meyer et al., 1998), a pesar de que en este trabajo, aun obteniendo

diferencias, éstas no son significativas. Por otra parte, el análisis del GSH en

linfocitos muestra el mismo comportamiento que el detectado en plasma, para todos

los grupos estudiados respecto a la población control.

Por otra parte, en cuanto al sistema tiorredoxina, se ha encontrado una mayor

actividad del sistema antioxidante, reflejado de forma significativa tanto en la

tiorredoxina como en la tiorredoxina reductasa, en los tres tipos de cáncer respecto

al grupo control. Esto puede responder a un mecanismo compensatorio al

incremento de estrés oxidativo presente en los tres grupos de enfermedad y avalado

por trabajos que recogen el mismo comportamiento de los sistemas antioxidantes

celulares (Evens et al., 2008; Noda et al., 2000; Rainis et al., 2007), junto con la

evidencia de que en el caso del sistema tiorredoxina es secretado al plasma tanto

por las células cancerígenas como por las no tumorales (Soderberg et al., 2000).

Cabe destacar la elevada concentración de tiorredoxina detectada en los

pacientes con linfoma, lo cual responde a la elevada variabilidad individual que tiene

este parámetro, reflejado en la alta desviación estándar que presenta en la mayoría

de los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo.

Se puede concluir, en base a los resultados discutidos en este estudio que los

pacientes con cáncer presentan un nivel de estrés oxidativo significativamente

mayor que el grupo control. Sin embargo, apenas se detectan diferencias

Discusión

178

significativas entre los diferentes tipos de neoplasias. No obstante, merece la pena

destacar la baja concentración de polifenoles en pacientes con CCR así como el

mayor daño a lípidos en el grupo con linfoma respecto a las otras neoplasias

estudiadas.

5.2. ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES CON CÁNCER

COLORRECTAL

A lo largo de la revisión bibliográfica realizada y del desarrollo de este trabajo,

ha quedado claramente evidenciada la estrecha relación existente entre el cáncer y

el estrés oxidativo, y más concretamente en el caso del cáncer colorrectal, objeto

principal de estudio en esta Tesis Doctoral.

No obstante, son muchos los parámetros que reflejan el estado oxidativo y en

la mayoría de los trabajos revisados hasta la fecha no están estudiados de forma

conjunta e integral, de forma que se permita alcanzar un abordaje completo y global

del estrés oxidativo en este tipo de enfermedad. Además, no sólo la propia

enfermedad, sino los diferentes tratamientos quimioterápicos así como el grado de

avance de la misma, se relacionan con diferentes estados de estrés oxidativo,

aspectos no estudiados con el detalle necesario para establecer nuevas líneas de

trabajo encaminadas a proporcionar estrategias terapéuticas alternativas así como

marcadores indicadores del estado y evolución de la enfermedad.

Por tanto, a lo largo de la discusión planteada en este apartado, se recogerá el

análisis de los resultados del estudio del estrés oxidativo en pacientes con cáncer

colorrectal, abordando en un primer apartado el estrés asociado exclusivamente a la

enfermedad, para continuar con la discusión de cómo podrían influir los diferentes

tipos de tratamiento quimioterápicos en el estrés oxidativo. Por otra parte, se

realizará el análisis de cómo el grado y tipo de metástasis se relacionan con el nivel

y el estado redox celular. Destacar el estudio de resultados realizado en base a

valores de los marcadores tumorales y otra serie de parámetros clínicos, para por

último analizar el resultado de las correlaciones realizadas entre los diferentes

parámetros de estrés oxidativo.

Discusión

179

5.2.1. Estudio del estrés oxidativo asociado al cán cer colorrectal

En una primera aproximación al estudio del estrés oxidativo en pacientes con

cáncer colorrectal se ha hecho necesario conocer el nivel de estrés asociado sólo y

exclusivamente a la enfermedad y no el derivado de otra serie de variables

fundamentalmente consecuencia del tratamiento quimioterápico. En base a esta

premisa, se ha planteado si se detectarían diferencias significativas en el grado de

estrés y en el estado redox en un grupo de pacientes con CCR pero sin haber

estado sometidos a tratamiento quimioterápico y cuya enfermedad se encuentre en

estadíos iniciales respecto a población control. Aunque el tamaño muestral que ha

reunido estas características es pequeño, los resultados indican que efectivamente

aunque en menor grado, sigue existiendo una diferencia significativamente

importante entre el grupo con CCR y el control.

La primera barrera que dispone el organismo para combatir el estrés oxidativo

es la capacidad antioxidante del plasma. Los resultados de este trabajo dejan claro

que tanto la capacidad antioxidante del plasma para estabilizar radicales mediante la

transferencia de protones (método ABTS), como por la capacidad reductora (método

FRAP) está significativamente disminuida en los pacientes con CCR, lo que

desequilibra la balanza a favor de los prooxidantes. Tal y como se ha comentado en

el primer apartado, la disminución observada en el nivel de polifenoles totales,

quizás sea una de las causas principales que contribuye a la disminución de la

capacidad antioxidante total plamática en este grupo de enfermos. La contribución

del contenido de polifenoles sobe el inicio y evolución del CCR no está estudiado,

sin embargo diferentes estudios epidemiológicos apoyan la idea de que existe una

relación inversa entre consumo de polifenoles y cáncer de colon (van Duijnhoven et

al., 2009).

Cabe destacar como se detectan incrementos significativos en cuanto a los

niveles de oxido nítrico en plasma y al de biomarcadores de oxidación de proteínas y

de lípidos, en plasma y en linfocitos. Respecto a las posibles elevaciones del nitrito y

nitrato (hiperproducción de NO) puede ser debido a la liberación de NO como

consecuencia de los procesos inflamatorios implicados en el desarrollo del proceso

Discusión

180

de carcinogénesis (Weitzman and Gordon, 1990) lo que conllevaria un incremento

de estrés oxidativo.

Por otra parte, cabe destacar que los biomarcadores (GC y MDA) que indican

daño a proteínas y a lípidos medidos en cada uno de los apartados desarrollados en

la Tesis Doctoral muestran mayor concentración en plasma que en linfocitos. Estos

resultados están de acuerdo con lo observado por otros autores que detectaron

incrementos en los niveles de proxidación lipídica tanto en plasma como en tejido de

enfermos con CCR (Hendrickse et al., 1994). Desde el punto de vista del posible

empleo de alguno de estos parámetros como indicador de evolución de enfermedad,

esto sería muy positivo, ya que sería el plasma el medio elegido para la

cuantificación de estos parámetros con posible valor diagnóstico y/o como

indicadores de progresión, con ventajas sustanciales respecto a otros medios, por su

facilidad para obtención, manipulación, requiriendo asimismo de técnicas de medida

con menor sensibilidad. Por último, en el caso de los grupos carbonilo se detecta el

doble de incremento de concentración en plasma que en linfocitos, comparando el

grupo de pacientes con CCR respecto a población control, indicando por tanto que el

estrés oxidativo asociado a la enfermedad produciría mayor daño a las proteínas

plasmáticas y/o a las liberadas a plasma que a las que se encuentran en los

linfocitos o bien que los mecanismos de reparación y/o compensación son mayores

o más eficaces en las células del sistema inmune. Hasta ahora, y en base a la

bibliografía consultada no se conoce ningún trabajo que estudie y/o justifique las

diferencias detectadas entre los niveles de oxidación entre el plasma y los linfocitos,

sin embargo la profundización de este aspecto podría sentar las bases para el inicio

de una nueva estrategia terapéutica basado en una diferente especificidad en cuanto

a oxidación de proteínas en diferentes medios biologicos.

Analizando el estado redox, y tal y como viene recogiendo la bibliografía

(Soderberg et al., 2000), se ha detectado un aumento del sistema tiorredoxina en los

pacientes con CCR respecto al grupo control, cuya función principal podría estar

encaminada a compensar el estrés oxidativo presente en este grupo de población.

No obstante, en el caso de la tiorredoxina reductasa, aún presentando mayor

concentración no hay diferencia significativa entre los grupos estudiados, pudiendo

indicar que alguno de los mecanismos antioxidantes compensatorios podría ponerse

Discusión

181

en marcha en situaciones con mayor nivel de estrés oxidativo, como por ejemplo en

presencia de fármacos antineoplásicos o estados más avanzados de la enfermedad.

Esta aproximación estadística apoya las premisas planteadas al inicio de este

apartado, permitiendo concluir que el simple estado de enfermedad neoplásica

colónica está asociado a un mayor nivel de estrés oxidativo respecto a sujetos

control y que el sistema tiorredoxina podría presentar mayor actividad a mayor nivel

de oxidación, aspecto que será defendido en base a otra serie de resultados

experimentales discutidos a lo largo de los siguientes apartados.

En cuanto a los niveles de GSH medidos en el estudio, éstos fueron

significativamente menores en los pacientes con cáncer colorrectal que en el grupo

control, a diferencia de lo observado con la Trx. Diversos autores han obtenido

similares resultados, en los que se detecta disminución de los niveles de GSH en

varios tipos de cáncer (Fiaschi et al., 2005; Sanchez et al., 2006). Estas diferencias

detectadas entre los dos tipos de tioles, Trx y GSH, podría ser debido, tal y como ha

propuesto Mansego y colaboradores (Mansego et al., 2007), a que la Trx podría ser

activada por un aumento crónico de los niveles de estrés oxidativo, resultando por

otra parte un mayor consumo de GSH provocado por las elevadas concentraciones

de especies reactivas oxigénicas.

5.2.2. Estudio del estrés oxidativo asociado al tra tamiento quimioterápico

en pacientes con cáncer colorrectal

La quimioterapia en el cáncer tiene como objetivos retrasar la aparición de

síntomas en el paciente asintomático, aumentar el periodo de supervivencia libre de

la enfermedad en los pacientes tratados y aumentar la supervivencia global frente a

los pacientes no tratados con una toxicidad aceptable para el paciente. En la

actualidad, para el tratamiento del cáncer se aplican fármacos de forma

individualizada o en combinación, cuyo mecanismo de acción es la inducción de

apoptosis celular, inhibición de la angiogénesis e inhibición de factores de

crecimiento celular. La eficacia de estos fármacos está relacionada con el estado

antioxidante y el estado redox celular y en algunos casos los efectos citotóxicos de

los fármacos están mediados de forma directa o indirecta por las especies reactivas

oxidantes.

Discusión

182

En este sentido, se ha estudiado el estrés oxidativo asociado al tratamiento

quimioterápico, para lo cual se ha partido de un grupo de población con CCR sin

tratamiento y otro en régimen quimioterápico, y con un nivel de estrés oxidativo

similar en cuanto al asociado a la enfermedad. Es cierto que a nivel individual los

pacientes pertenecientes a cada uno de los grupos de población presentan niveles

de estrés diferentes debido al grado de avance o de estadío en el se encuentra la

enfermedad, sin embargo, ambas poblaciones en su conjunto presentan un

porcentaje de individuos similar en cuanto a grado de metástasis o estadío (53% de

individuos con metástasis en el grupo de pacientes sin tratar y 57% en la población

en tratamiento) haciendo que se pueda asumir que el incremento de estrés oxidativo

entre ambas poblaciones esté asociado al tratamiento quimioterápico.

Según el análisis de los resultados basado en el estudio estadístico de las

medidas de los diferentes parámetros realizadas en las dos poblaciones, y tal y

como se conoce desde hace años (Masuda et al., 1994; Miyajima et al., 1997), el

tratamiento quimioterápico produce un significativo aumento del estrés oxidativo en

la población en tratamiento quimioterápico respecto al grupo de pacientes no

tratados. Este aumento de estrés oxidativo se ve reflejado en la disminución de la

capacidad antioxidante así como en el daño a lípidos y proteínas, tal y como

muestran las elevadas concentraciones de MDA y GC, provocando así cambios en

el estado redox tales como la disminución del nivel de Trx a pesar de que la

actividad de la TrxR sea mayor en la población de pacientes en tratamiento.

En el caso de algunos fármacos quimioterápicos, el incremento del estado

oxidativo está causado de una forma indirecta dado que interfieren con

determinados mecanismos compensatorios del estrés oxidativo (Sun and Rigas,

2008; Tonissen and Di Trapani, 2009). Sin embargo, en otros casos, además y

asociado a su mecanismo de acción se produce liberación de ROS, como anión

superóxido y peróxido de hidrógeno, vinculado al mecanismo farmacodinámico de

algunos compuestos derivados del platino y del irinotecan (Grivicich et al., 2005;

Masuda et al., 1994; Masuda et al., 2001). No obstante, el estudio del estrés

oxidativo asociado al tratamiento quimioterápico es mucho más complejo, ya que

según la eficacia del tratamiento, la población de células tumorales irá

disminuyendo, provocando que el balance neto del estado oxidativo no sólo dependa

Discusión

183

del tratamiento, sino de la eficacia y respuesta del mismo, así como del grado y

estadío de la enfermedad.

No obstante, según los resultados obtenidos, si se compara el incremento de

estrés oxidativo asociado al tratamiento respecto al derivado exclusivamente al

desarrollo de la propia enfermedad, se puede comprobar cómo en este último caso

dicho incremento es casi el doble respecto al incremento experimentado entre la

población en tratamiento frente al grupo sin tratar, lo que lleva a pensar que el

desarrollo de la enfermedad en si misma es causa de más estrés que el debido

exclusivamente al tratamiento quimioterápico, o bien, la eficacia del mismo hace

disminuir el nivel de estrés en el grupo de pacientes tratados, disminuyendo por

tanto el incremento de oxidación mostrado. Sin embargo, atendiendo a valores

absolutos es en la población de pacientes en tratamiento donde se sigue

encontrando mayor concentración de los parámetros indicadores de estrés oxidativo,

a pesar de los incrementos detectados.

Es sabido que la eficacia del tratamiento en algunos casos está determinada

por el estado antioxidante celular. Por un lado, si la acción de la droga neoplásica

está mediada por ROS, los antioxidantes pueden interferir en su actividad

disminuyendo su eficacia. Sin embargo, si los ROS que se generan son

responsables de su efecto adverso, en este caso un estado antioxidante reduciría la

severidad de tales efectos sin interferir con la actividad de las drogas

antineoplásicas. Por lo tanto es importante evaluar el estado antioxidante como

consecuencia del tratamiento.

En la actualidad está asumido que durante el tratamiento con agentes

quimioterápicos el estado antioxidante está disminuido. A pesar de ello, no hay

trabajos que hayan evaluado como la capacidad antioxidante del plasma, primera

defensa del organismo, se ve afectada durante el tratamiento quimioterápico. Los

resultados muestran que el estado antioxidante en los pacientes con tratamiento

quimioterapéutico está disminuido, observándose una disminución del casi 50% de

los niveles de polifenoles totales comparado con grupos de individuos sanos. Esta

disminución está relacionada con el incremento de los niveles de daño oxidativo

observado en lípidos y proteínas.

Discusión

184

Por otra parte, en el caso del biomarcador de daño a proteínas y de GSH se ha

observado mayor significancia en las diferencias detectadas de los resultados

medidos en linfocitos que en las mediciones realizadas en el plasma, lo cual pondría

de manifiesto una mayor implicación por parte de los linfocitos en respuesta al

tratamiento quimioterápico. Resultados obtenidos por Rainis y colaboradores (Rainis

et al., 2007) indican una posible contribución de linfocitos activados, presentes en

mayor proporción en tejidos neoplásicos, al estrés oxidativo y por tanto una mayor

implicación en la posible defensa contra el daño tisular.

Diversos estudios han puesto de manifiesto como determinados fármacos

citostáticos, como el oxaliplatino, son capaces de inhibir la tiorredoxina reductasa

mediante la unión a la selenocisteína presente en el centro activo del enzima (Witte

et al., 2005). La inhibición de la TrxR permite la acumulación de la tiorredoxina

oxidada provocando condiciones celulares que promueven la apoptosis. Sin

embargo, en base a los resultados obtenidos, este efecto no es detectado, ya que la

población sometida a tratamiento quimioterápico presenta en su conjunto mayor

actividad de la tiorredoxina reductasa respecto al grupo de pacientes sin tratar. Esto

puede ser debido, por una parte, a que prácticamente la mitad (40%) de la población

en régimen quimioterápico no está siendo tratada con ningún derivado del platino y

por otra parte, a pesar de que pueda existir inhibición, ésta no es suficiente como

para compensar los niveles elevados de actividad asociados al estrés oxidativo

derivado del propio proceso neoplásico y aumentado en parte por el empleo de

fármacos quimioterápicos, tal y como ha quedado reflejado a lo largo de la discusión

de resultados. No menos importante es el hecho de que se ha detectado

sobreexpresión de tiorredoxina reductasa en algunos tipos de cáncer (Lincoln et al.,

2003), caracterizados por su alta capacidad proliferativa, un bajo índice de

apoptosis, un elevado potencial metastático y alta resistencia a los agentes

antitumorales, resultado un fenotipo tumoral agresivo, pudiendo formar parte alguno

de ellos de la población objeto de estudio.

Sin embargo, en el caso de la tiorredoxina, los resultados obtenidos muestran

menor concentración en la población sometida a régimen quimioterápico respecto al

grupo sin tratar. Por una parte, esta disminución asociada a los fármacos

antineoplásicos podría llevar a pensar que el tratamiento muestra determinada

Discusión

185

eficacia en el conjunto de la población, dado que los niveles de Trx se acercan a los

del grupo control. Por otra parte, este efecto también podría ser debido a que la

tiorredoxina es fuertemente oxidada por ROS, derivados de la propia enfermedad o

bien consecuencia del tratamiento.

El estado redox celular en algunos tipos de cáncer, como el caso del CCR,

puede determinar la eficacia de ciertos agentes anticancerígenos. De esta forma se

ha relacionado al sistema tiorredoxina con la resistencia a citostáticos (Yokomizo et

al., 1995). Asimismo, recientes estudios han puesto de manifiesto la posible relación

entre el receptor tirosina quinasa Src, asociado con proliferación celular, progresión

tumoral y metástasis, y el mecanismo de resistencia al tratamiento con oxaliplatino

(Kopetz et al., 2009). Por otra parte, a pesar del importante papel detoxificador que

presenta el glutation, cuando éste se encuentra en concentraciones altas puede

aumentar la resistencia a la quimioterapia en determinados tipos de tumores

(Balendiran et al., 2004; Estrela et al., 2006). De esta forma, poder conocer en

detalle las condiciones en las que el sistema tiorredoxina o el glutation generan

resistencia a determinados agentes quimioterápicos, ayudaría a definir la mejor

estrategia terapéutica o bien añadir algún agente modulador que permitiera

minimizar o eliminar este tipo de resistencia. En este sentido, ya existen diversos

estudios que plantean una estrategia terapéutica basado en agentes prooxidantes,

tales como inhibidores del sistema tiorredoxina o sustancias encaminadas a

disminuir la concentración del GSH (Cabello et al., 2007; Wang and Yi, 2008).

En cuanto al estudio del estrés oxidativo asociado al tipo de tratamiento

quimioterápico empleado, se han agrupado a los pacientes en cuatro poblaciones en

base al tipo de tratamiento al que están siendo sometidos. En primer lugar, la

población T0 agrupa a pacientes que no estaban recibiendo ningún tratamiento

quimioterápico, actuando como grupo control para el análisis de estos resultados. El

grupo T1 está formado por los pacientes que estaban recibiendo algún fármaco de la

familia de las fluoropirimidinas (5-fluorouracilo o capecitabina) y/u oxaliplatino o

irinotecan (47% de la población en tratamiento). Los pacientes que a este esquema

quimioterápico se les ha añadido un anticuerpo monoclonal anti-EGFR (cetuximab o

panitumumab) o anti-VEGF (bevacizumab) han sido agrupados bajo el epígrafe T2

(37% de la población en tratamiento). Por último, el grupo T3 está formado por

Discusión

186

pacientes cuyo tratamiento no responde a ninguno de los criterios descritos

anteriormente (16% de la población en tratamiento) (Tabla I), presentando una

elevada variabilidad en cuanto a fármacos, estadío y tipo y grado de metástasis.

En líneas generales, tal y como era de esperar, los pacientes tratados con

cualquier tipo de fármaco presentan más nivel de estrés que el grupo de pacientes

sin tratar. No obstante, la población formada por el conjunto de tratamientos

englobados bajo el epígrafe T3 presenta un comportamiento en cuanto a estado de

oxidación intermedio entre las otras poblaciones en régimen quimioterápico y el

grupo sin tratamiento. En este sentido, destacar que no se detectan diferencias

significativas en la mayoría de los parámetros medidos respecto al grupo sin tratar,

sin quedar claramente demostrado si puede existir o no mayor daño a lípidos y

proteínas, así como alteraciones del sistema tiorredoxina. Sin embargo, a diferencia

del resto de parámetros, sí se ha detectado una disminución significativa de la

concentración de GSH, tanto en plasma como en linfocitos, respecto al grupo T0,

poniendo de manifiesto una vez más, el importante papel detoxificador que tiene

esta molécula y la elevada sensibilidad que presenta a cambios en el nivel de

oxidación (Ballatori et al., 2009). La elevada heterogeneidad que conforman los

diferentes tratamientos así como los distintos estadios neoplásicos que presentan

los pacientes que componen la muestra justifica este posicionamiento intermedio en

el estado de oxidación del grupo de pacientes T3.

Por otra parte, respecto al GSH medido en plasma en el grupo de pacientes T1,

se han detectado concentraciones significativamente mayores respecto al grupo sin

tratar y al resto de los pacientes tratados. En principio, dado que la población T1

presenta mayor estrés oxidativo que el grupo sin tratar, cabría esperar un

comportamiento contrario, en base al papel antioxidante y detoxificador que tiene

esta molécula. Sin embargo, al estudiar en detalle las características de la población

T1, se observa que un 72% de los pacientes no presentan metástasis, frente al 47%

de los pacientes sin tratar. Este hecho podría llevar a pensar, que a pesar de que el

grupo T1 presenta en su conjunto un mayor estado oxidativo, asociado a la

enfermedad y al tratamiento quimioterápico, de alguna forma el GSH se podría

relacionar con los procesos metastásicos, mostrando una mayor concentración en

los pacientes sin metástasis. En este sentido, el valor de concentración de GSH que

Discusión

187

presenta la población T1 (0,576±0,139 µmoles/g Hb) es similar al promedio obtenido

en un grupo de pacientes sin tratar y sin metástasis (0,587±0,064 µmoles/g Hb),

pero significativamente menor respecto al grupo de sujetos control (0,649±0,119

µmoles/g Hb), sugiriendo de nuevo que la concentración de GSH podría estar más

condicionada a la metástasis que al tratamiento quimioterápico. El análisis en

conjunto de los datos de GSH de los pacientes tratados no habría permitido detectar

este aspecto, dado que se han compensado unos valores con otros. En el resto de

los grupos de sujetos tratados (T2 y T3), la presencia de pacientes con metástasis es

mayoritaria, asociado por tanto a niveles de GSH significativamente menores al

grupo T0, tal y como cabría esperar.

Continuando con la discusión de los resultados de los demás parámetros de

estrés oxidativo asociados al tipo de tratamiento, no se encuentran diferencias

significativas entre el grupo de pacientes T1 y T2, cuya diferencia estriba en la

adicción de un anticuerpo monoclonal al esquema terapéutico, en lo que se refiere a

capacidad antioxidante, niveles de nitritos y MDA. Sin embargo, sí se observan

niveles significativamente más altos de hidroperóxidos y de GC en linfocitos en

pacientes sometidos al tratamiento T2. Estos niveles más elevados de

hidroperóxidos lipídicos, productos primarios transitorios y deleteros derivados del

ataque a lípidos por parte de radicales hidroxilo e hidroperoxilo, se asocian a

pacientes clinicamente complicados, quedando evidenciado el estado metastático en

esta serie de pacientes. En general esto confirma, de acuerdo a la bibliografía

descrita (Veronese and O'Dwyer, 2004), que el mecanismo de acción de los

anticuerpos anti-EGFR (cetuximab o panitumumab) o anti-VEGF (bevacizumab) no

media a través de estrés oxidativo, a pesar de que si se ha relacionado a ROS con

una mayor expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (North et al.,

2005).

En una aproximación al estudio de cómo se vería afectado el estrés oxidativo

por el empleo de un fármaco cuyo mecanismo de acción esté mediado a través de

ROS (oxaliplatino e irinotecan), se ha realizado el estudio estadístico de dos

poblaciones, una de ellas tratadas solo con fluoropirimidinas (7% de los pacientes

tratados) y otra junto con oxaliplatino o irinotecan (40% de los pacientes tratados).

Los resultados obtenidos de este estudio no han sido recogidos en el apartado de

Discusión

188

resultados, dado que al ser el tamaño de muestra de los pacientes tratados sólo con

fluoropirimidinas muy pequeño y la diferencia muestral con el otro grupo de

pacientes muy grande, imposibilita la inferencia de los resultados. No obstante,

desde un punto de vista descriptivo sí pone de manifiesto determinados efectos

asociados al empleo de estos dos fármacos que merece la pena destacar.

En primer lugar, la población tratada con fluoropirimidinas junto con oxaliplatino

o irinotecan presenta mayor estrés oxidativo, en cuanto se refiere a menor

capacidad antioxidante, mayor daño a lípidos y proteínas y mayor concentración de

los biomarcadores de óxido nítrico. Este hecho, ampliamente documentado

(Grivicich et al., 2005; Masuda et al., 2001), vuelve a poner de manifiesto que el

mecanismo de acción tanto del oxaliplatino como del irinotecan está asociado al

estrés oxidativo.

En segundo lugar, en cuanto al sistema tiorredoxina, cabe destacar que la

actividad de la tiorredoxina reductasa es muy similar en ambas poblaciones

(6,89±1,04 mU/mL en la población tratada con fluoropirimidinas y 6,83±1,56 mU/mL

en el grupo tratado junto con oxaliplatino o irinotecan). Esto podría poner de

manifiesto que parte de la tiorredoxina reductasa estaría inhibida por el oxaliplatino,

tal y como está descrito en numerosos trabajos (Tonissen and Di Trapani, 2009;

Witte et al., 2005), habiendo pasado este efecto inadvertido al analizar la población

en su conjunto.

5.2.3. Estudio del estrés oxidativo asociado a metá stasis en pacientes con

cáncer colorrectal

Recientemente se ha puesto de manifiesto como las especies reactivas

oxigénicas causantes del estrés oxidativo están implicadas en el desarrollo de

metástasis (Nishikawa, 2008; Wu, 2006), complejo proceso que incluye transición

epitelial-mesenquimal (EMT), migración, invasión de células tumorales y

angiogénesis. La transición epitelial-mesenquimal es un programa de desarrollo

celular que se caracteriza por la pérdida de adhesión celular, la represión de la

expresión de E-cadherina (glicoproteína transmembrana mediadores de la adhesión

célula-célula), y aumento en la movilidad celular. La EMT es esencial para

Discusión

189

numerosos procesos de desarrollo, sin embargo, también está asociado a la

metástasis tumoral.

Inicialmente, las células del tumor primario muestran transición epitelial-

mesenquimal y migración en los tejidos circundantes, para posteriormente y gracias

a la remodelación de la matriz extracelular realizada por las metaloproteasas de

matriz (MMP), facilitar la intravasación de las células tumorales en la circulación. Las

células tumorales que sobrevivan en sangre pueden entonces extravasarse llegando

a órganos distales y finalmente proliferar causando un tumor secundario, soportado

además por mecanismos angiogénicos facilitando su crecimiento (Eyries et al.,

2004). Toda esta serie de procesos están mediados gracias a importantes vías de

tansducción de señales, cuyas cascadas de señalización han sido estrechamente

relacionadas con ROS (Matsuzawa and Ichijo, 2005). Por tanto, esto pondría de

manifiesto la estrecha relación existente entre los procesos de metástasis y el estrés

oxidativo (Radisky et al., 2005; Storz, 2005), aspectos que tendremos lugar a

profundizar en la discusión de resultados desarrollada a continuación.

En este sentido, se inicia el estudio contando con dos poblaciones (una sin y

otra con metástasis) que no están en tratamiento quimioterápico, de forma que se

pueda asociar el estrés oxidativo detectado exclusivamente a metástasis. A lo largo

de la revisión bibliográfica realizada, no se han encontrado estudios que pongan de

manifiesto un análisis concreto y detallado de la relación existente entre el estrés

oxidativo y los procesos metastáticos a través de la medición de diferentes

parámetros, no obstante, es ampliamente aceptado la estrecha relación existente

entre ambos procesos. De hecho, existen varios datos experimentales que sugieren

que la concentración de ROS varía durante el proceso de metástasis y que estas

especies reactivas son generadas en los tejidos tumorales por las células

cancerígenas (Szatrowski and Nathan, 1991).

De acuerdo a los resultados mostrados, se detecta mayor nivel de estrés

oxidativo en los pacientes con metástasis respecto a la población que no la ha

desarrollado. De nuevo este hecho es reflejado a través de los resultados obtenidos

en todos y cada uno de los parámetros indicadores de estrés oxidativo empleados,

tales como los relacionados con la capacidad antioxidante total y los asociados a

Discusión

190

daño a proteínas y lípidos, cobrando especial relevancia la elevada significancia en

cuanto se refiere a la oxidación de las proteínas detectado en plasma, aspecto ya

destacado en apartados anteriores de la presente discusión. En cuanto a la

concentración de MDA medida en linfocitos, no se muestran diferencias significativas

entre ambas poblaciones, pudiendo ser debido a que valores tan elevados no

permiten detectar diferencias, seguramente por estar en niveles próximos a

umbrales de máxima oxidación.

Respecto al estado redox, en lo que se refiere a GSH, tal y como se anticipó al

explicar el comportamiento de este tripéptido en los pacientes T1 (tratados con

fluoropirimidinas y/u oxaliplatino o irinotecan), se detectan concentraciones mayores

en la población sin metástasis, aspecto asociado a menor estrés oxidativo y por

tanto menor consumo de GSH por parte de ROS.

Asimismo, la población con metástasis presenta mayor concentración de

tiorredoxina, estando asociada a mayor estrés oxidativo y de acuerdo con los

resultados ya discutidos a lo largo de este trabajo.

La diferencia detectada entre los dos tipos de tioles, principales agentes

detoxificadores de ROS, estaría causado por un mayor consumo de GSH y la

activación de la Trx provocada por un aumento de los niveles de estrés oxidativo

(Lincoln et al., 2003), puesto de manifiesto en la población de los pacientes con

metástasis.

En cuanto a la tiorredoxina reductasa, los resultados obtenidos indican menor

actividad en los pacientes con metástasis respecto a la población sin metástasis y a

su vez al grupo de sujetos control. En principio no se ha encontrado hasta la fecha

ningún estudio experimental que apoye este hecho. Así, en los resultados obtenidos

a lo largo de este trabajo y soportados en base a otros estudios experimentales

recogidos en la bibliografía revisada, la actividad tiorredoxina reductasa se ve

aumentada según se generan estados de mayor estrés oxidativo, asociados bien a

la propia enfermedad cancerígena, al tratamiento quimioterápico, o bien al desarrollo

del proceso metastásico.

Discusión

191

Dado que el nivel de estrés oxidativo está determinado por el balance de la

generación de ROS y los sistemas detoxificadores, cambios en alguno de estos

sistemas provocan como resultado un aumento o disminución del estrés. Por otro

lado, parte de los mecanismos asociados a metástasis están promovidos por ROS y

el incremento de estas especies oxigénicas, que podrían poner en marcha y

promocionar la migración y progresión tumoral, son generadas a partir de diferentes

fuentes, tales como las propias células tumorales y/o a partir del tratamiento

quimioterápico (Pelicano et al., 2004). Esto pone de manifiesto el interés que supone

conocer la diferencia existente en cuanto a nivel de estrés oxidativo, entre dos

grupos de población sometidos a quimioterapia pero en dos estados distintos de

enfermedad, es decir, sin y con metástasis, y la diferencia respecto a un grupo de

sujetos sanos o control.

En primer lugar, destacar que las diferencias detectadas a través de los

resultados mostrados por los parámetros medidos estarían fundamentalmente

asociadas al grado de avance de la enfermedad, ya que el porcentaje de pacientes

tratados con oxaliplatino o irinotecan, fármacos especialmente relacionados con

incrementos de estrés oxidativo, en las poblaciones con CCR es similar (80% en el

población sin metástasis y 75% en el grupo con metástasis).

En base a los resultados obtenidos, se observa como la capacidad antioxidante

disminuye de forma significativa a medida que progresa la enfermedad. Asimismo, la

concentración de nitrito y nitrato, como biomarcadores de óxido nítrico, aumenta

significativamente según se produce un mayor avance del CCR. En cuanto a la

concentración de MDA medida en plasma y en linfocitos, al igual que ya ocurría en el

análisis anterior, no se muestran diferencias significativas entre ambas poblaciones

con CCR, pudiendo ser debido a que valores tan elevados no permiten detectar

diferencias, seguramente por estar en niveles próximos a umbrales de máxima

oxidación. Sin embargo, el aumento significativo de la concentración de

hidroperóxidos no daría lugar a dudas del mayor daño a lípidos detectado en el

grupo de pacientes con metástasis respecto al resto de grupos estudiados. Por otra

parte, en línea con los resultados ya mostrados, también se detecta mayor estado

oxidativo de las proteínas en la población con metástasis, volviendo a ser el medio

Discusión

192

plasmático donde se muestra la mayor concentración de GC y el mayor incremento

respecto a grupo control.

El análisis del conjunto de resultados sugiere por tanto, que existe mayor estrés

oxidativo en la población con metástasis respecto al grupo de pacientes con menor

grado de enfermedad. Tal y como Szatrowski y colaboradores ya habían puesto de

manifiesto, las células tumorales son fuente de ROS, sustancias capaces de mediar

en las diferentes etapas necesarias para que se produzca la migración y

proliferación de la enfermedad metastásica.

En este sentido es fundamental conocer el estado de los sistemas

detoxificadores, encargados de disminuir la concentración de ROS y por tanto

decisivos en el avance de la enfermedad. En cuanto al GSH, al aumentar el estado

oxidativo y por tanto el estado metastático, se detecta mayor consumo, reflejado

tanto en plasma como en linfocitos. Cabe destacar que las concentraciones de GSH

obtenidas de las mediciones realizadas tanto en plasma como en linfocitos en el

grupo de pacientes con metástasis y en tratamiento quimioterápico (0,364±0,093

µmoles/g Hb y 2,68±0,572 µmoles/g proteína respectivamente), son las más bajas

detectadas a lo largo de todos los estudios realizados en la Tesis Doctoral. Estos

valores corresponden al grupo de pacientes que presentan mayor nivel oxidativo,

asociado a la participación de varias variables ya estudiadas y vinculadas a

incrementos de ROS, tales como la propia enfermedad tumoral, el tratamiento

quimioterápico y el desarrollo de metástasis y por tanto, relacionados con estados de

mayor demanda detoxificadora del organismo.

En relación al sistema tiorredoxina, el efecto sobre la tiorredoxina y la

tiorredoxina reductasa no es tan marcado como en el caso del GSH, a pesar de

presentar las mismas condiciones de estrés oxidativo al tratarse de los mismos

grupos de población. Esto es debido a que este sistema redox es especialmente

complejo, dado que los factores o sustancias que intervienen en su control producen

en muchos casos efectos opuestos en cuanto a su activación o aumento de

concentración. Este complicado balance hace difícil predecir el comportamiento en

base al estado oxidativo y hasta la fecha no existen estudios que aborden desde tan

diferentes perspectivas el estado redox asociado a diferentes estados oxidativos.

Discusión

193

En el caso de la tiorredoxina, se detecta de forma significativa mayor

concentración en la población con metástasis tumoral (72,0±26,7 ng/mL), tal y como

cabría esperar y de acuerdo a los trabajos postulados con anterioridad (Lincoln et

al., 2003). Sin embargo, no es en esta población en la que se detecta la mayor

concentración de Trx medida en los diversos estudios realizados en este trabajo, si

no que este valor corresponde a la población con metástasis pero sin tratamiento

quimioterápico (115±66,4 ng/mL). Este hecho valida la premisa de cómo el

tratamiento afecta directamente a la tiorredoxina, ya que su empleo en un grupo de

pacientes con metástasis supone un descenso drástico en la concentración de esta

especie antioxidante (Sun and Rigas, 2008), tal y como muestran los resultados

obtenidos.

Por otra parte, la tiorredoxina reductasa también presenta de forma significativa

mayor actividad en el grupo de pacientes con metástasis. Asimismo, es también en

esta población donde se ha encontrado la mayor actividad detectada en los

diferentes estudios planteados en el desarrollo de este trabajo, tal y como ya había

sido postulado con anterioridad.

Por tanto, el comportamiento del sistema tiorredoxina toma especial relevancia

ya que elevadas concentraciones de ambas sustancias han sido relacionadas con

un bajo nivel de apoptosis y un elevado potencial metastático, convirtiéndose en uno

de los principales objetivos terapéuticos propuestos en la actualidad.

Por último, y en lo referente al estudio del estrés oxidativo asociado a

metástasis, se ha abordado el análisis a partir de las diferentes localizaciones

metastásicas. Dado que prácticamente la totalidad de los pacientes son intervenidos

quirúrgicamente, de forma que se realiza una exéresis total de los trayectos y vías

linfáticas correspondientes al segmento intestinal en que asienta el cáncer, queda la

vía hemática como el principal camino de migración celular. De esta forma, la

metástasis más comúnmente asociada al cáncer colorrectal es la hepática, gracias a

mecanismos de metástasis hemática a través de la vena mesentérica y la porta

hasta alcanzar el hígado. No obstante, también pueden existir otras localizaciones

como el pulmón, las suprarrenales, huesos, riñones, peritoneo y cerebro,

fundamentalmente.

Discusión

194

En cuanto a los resultados obtenidos en el estudio, destacar que no se

detectan diferencias especialmente marcadas entre un tipo de metástasis y otro,

aunque sí se puede asociar menor capacidad antioxidante en el grupo de pacientes

con un mayor avance de enfermedad, es decir, aquellos con metástasis hepática y

en otra serie de localizaciones.

Asimismo, en el caso de los biomarcadores de óxido nítrico, también se detecta

un comportamiento similar, de forma que no existen diferencias significativas entre

los tres grupos de pacientes con enfermedad metastásica, a pesar de que los

valores de concentración de nitrito y nitrato apuntan a un mayor estrés asociado a

los pacientes con mayor progresión tumoral.

Los resultados de los parámetros indicadores del daño a lípidos, el MDA no

refleja diferencias significativas entre las distintas poblaciones ni respecto al grupo

de pacientes sin metástasis, tal y como ya se había puesto de manifiesto con

anterioridad. Esto podría ser debido a que un estado oxidativo tan elevado como se

detecta en base a los valores obtenidos, impediría reflejar las diferencias entre un

grupo y otro. Sin embargo, los niveles de hidroperóxidos marcan la diferencia en

estadios más avanzados, mostrándose nuevamente como un biomarcador asociado

a estadíos de enfermedad avanzada.

Por otra parte, en lo que respecta al daño a proteínas, sí se detecta de forma

significativa un mayor estado de oxidación en el grupo de pacientes con mayor

grado metastático respecto a los pacientes que presentan sólo metástasis hepática,

consecuencia por tanto del alto nivel oxidativo asociado al grado de avance de la

enfermedad.

En cuanto al estado redox, en primer lugar destacar que la concentración de

GSH es menor a medida que progresa la enfermedad. Además, los grupos de

población con metástasis no hepática y con metástasis hepática y otras, son los que

presentan, tanto en plasma como en linfocitos, el menor valor de concentración de

GSH detectado a lo largo de los diferentes estudios realizados. Esto hecho vuelve a

sugerir que estos dos grupos de población se encuentran en elevados niveles de

estrés oxidativo y por tanto requieren un mayor consumo de GSH.

Discusión

195

El sistema tiorredoxina muestra el comportamiento esperado, de forma que se

asocia mayor concentración de Trx y mayor actividad de TrxR a las poblaciones con

mayor grado de enfermedad, a pesar de que las diferencias mostradas no son

significativas en la mayoría de los casos.

En base a los resultados obtenidos, no parece claro que se pueda asociar de

forma directa un estado oxidativo a un tipo u otro de metástasis, a pesar de que los

datos pueden sugerir, aunque de forma no significativa en la mayoría de los casos,

que el menor estado oxidativo se asocia con metástasis hepática, alcanzándose el

mayor nivel de estrés en los pacientes que presentan metástasis múltiples incluidas

las hepáticas y por tanto un mayor grado de enfermedad. La población con

metástasis no hepática, se posiciona habitualmente en una situación intermedia

entre estos dos últimos grupos, lo que indicaria un estado intermedio de estrés y por

tanto de enfermedad neoplásica. En este sentido, destacar que no se han

encontrado estudios experimentales realizados a este respecto, que puedan ayudar

a corroborar los datos obtenidos en este estudio.

5.2.4. Estudio del estrés oxidativo asociado a conc entración de los

marcadores tumorales CEA y Ca 19.9 en pacientes con cáncer

colorrectal

Los marcadores tumorales surgieron como una gran esperanza para el

diagnóstico del cáncer, pero su baja especificidad y/o sensibilidad y su variable

aparición en función de diferentes factores demostró que no alcanzaban las

expectativas que albergaban. No obstante, siguen desarrollando una labor

fundamental como herramientas de monitorización del curso de la enfermedad

neoplásica. Por tanto, resulta interesante estudiar si se puede establecer algún tipo

de relación entre el valor alcanzado del marcador tumoral y el estrés oxidativo y por

tanto de forma indirecta con el grado de avance de la enfermedad.

Los marcadores tumorales empleados de forma más habitual en la

monitorización del cáncer colorrectal son el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el

antígeno Ca 19.9 (Ca 19.9). Sin embargo, la Sociedad Americana de Oncología

Clínica (ASCO) recoge en su guía sobre recomendaciones de uso de los

marcadores tumorales (Locker et al., 2006) que no existen datos suficientes para

Discusión

196

recomendar el marcador Ca 19.9 en screening, diagnóstico, estadiaje, supervivencia

o monitorización del tratamiento en pacientes con cáncer colorrectal.

No obstante y con objeto de poder o no confirmar los hechos clínicos respecto

al empleo de estos dos marcadores tumorales, se ha procedido a estudiar si existen

diferencias en cuanto al estado oxidativo entre dos poblaciones con cáncer

colorrectal, sometidas a tratamiento quimioterápico pero con mayor o menor

concentración del límite establecido como patológico de los marcadores tumorales

CEA y Ca 19.9.

En lo que respecta al antígeno carcinoembrionario, sí se detectan diferencias

significativas en todos y cada uno de los parámetros estudiados entre las dos

poblaciones con CCR. Así, el grupo de pacientes que presenta una concentración de

CEA ≥ 5 ng/mL tiene asociado un mayor estado oxidativo respecto a la población

cuyo marcador se encuentra por debajo del límite marcado como patológico según

laboratorio de referencia. El análisis de correlaciones entre los diferentes parámetros

de estrés oxidativo y estado redox con los niveles de CEA establecen sólo una

correlación positiva entre este marcador tumoral y la TRx (0,5286, p< 0,005).

Este hecho vuelve a poner de manifiesto, que a pesar de las limitaciones

existentes en el empleo de este marcador tumoral (Chau et al., 2004; Macdonald,

1999; Palmqvist et al., 2003), si que existe un determinado nivel de asociación entre

su concentración y el estado oxidativo y por ende del grado de progresión o

presencia de enfermedad tumoral colorrectal.

Por otra parte, según ASCO, CEA es el marcador de elección para la

monitorización de los pacientes durante el tratamiento quimioterápico, aconsejando

su medida al inicio del tratamiento y cada de uno a tres meses durante el periodo

que el paciente esté tratado. Sin embargo, Sorbye y colaboradores (Sorbye and

Dahl, 2003, 2004) observaron que se pueden producir incrementos puntuales de la

concentración de CEA durante las primeras de 4 a 6 semanas del inicio de una

nueva terapia, especialmente con el empleo del oxaliplatino, pudiendo estar

producido por cambios en la función hepática.

Discusión

197

A la vista de este hecho y con objeto de validar las conclusiones derivadas de

los datos empleados en el análisis realizado, se ha hecho otro estudio sin tener en

cuenta los pacientes tratados con oxaliplatino, con objeto de verificar si los valores

de CEA empleados podían estar distorsionados por el empleo de este fármaco,

obteniendo sin embargo, que las diferencias mostradas entre las dos poblaciones

estudiadas siguen siendo muy similares, poniendo por tanto de manifiesto que los

valores de CEA que se han utilizado no se habían visto afectados por el empleo del

oxaliplatino en su tratamiento quimioterápico.

En lo referente al marcador tumoral Ca 19.9, sólo se establecen diferencias

significativas entre las dos poblaciones estudiadas (Ca 19.9 < 37 U/mL y Ca 19.9 ≥

37 U/mL) en el caso de los biomarcadores de óxido nítrico. Este aspecto podría

indicar la posibilidad de que este marcador se encuentre vinculado de alguna forma

al óxido nítrico. Dado que este marcador se emplea en otra serie de procesos

carcinogénicos como el cáncer gástrico o pancreático (Steinberg, 1990; Tempero et

al., 1987), patologías asociadas con niveles elevados de óxido nítrico, estos

resultados abren una nueva vía de trabajo con objeto de estudiar si existe algún tipo

de asociación entre este marcador y el óxido nítrico o sus derivados nitrito y nitrato.

A pesar de no estar descrito en la literatura científica, el estudio de las

diferencias de los niveles de oxidación sin tener en cuenta los pacientes tratados con

oxaliplatino muestra el mismo resultado que el obtenido al estudiar las dos

poblaciones en tratamiento quimioterápico.

Estos resultados contribuyen a reforzar la idea ya existente de la baja utilidad

del marcador Ca 19.9 en cuanto a evolución y progresión de enfermedad, dado que

en base a los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo, progresión

corresponde a mayor grado de estrés oxidativo, asociación que no ha quedado

puesta de manifiesto en este estudio. Asimismo se demuestra que valores de mayor

concentración de CEA, asociados a progresión de enfermedad, se relacionan con

mayor grado de estrés, corroborando de nuevo como el nivel oxidativo también

puede ser un adecuado marcador en cuanto a inicio, promoción y progresión de

enfermedad neoplásica colorrectal.

Discusión

198

5.2.5. Estudio del estrés oxidativo asociado a otra s patologías en

pacientes con cáncer colorrectal

Desde hace varios años, diversos estudios han puesto de manifiesto como el

estrés oxidativo también está relacionado con otra serie de enfermedades tales

como hipertensión arterial, diabetes, lipidemias y EPOC (Valko et al., 2007). En este

sentido, como parte del estudio del estrés oxidativo asociado al cáncer colorrectal,

resulta necesario conocer no sólo si parte de este estrés puede ser debido a estas

patologías de base, sino también cómo estas enfermedades pueden conferir niveles

de estrés adicionales a esta serie de pacientes.

A pesar de que dichas patologías han sido asociadas a estrés oxidativo, los

resultados de los estudios realizados no muestran este efecto ni en los pacientes

con EPOC, ni con diabetes, ni en los que ya han desarrollado otro tipo de neoplasia

con anterioridad.

Por otra parte, los pacientes que presentan alguna alteración en su perfil

lipídico respecto a los que no, apenas muestran alguna diferencia significativa,

traduciéndose por tanto en que ambas poblaciones presentan similares niveles de

estrés.

Sin embargo, el grupo de población con hipertensión arterial presenta mayor

nivel de estrés oxidativo respecto al grupo sin HTA, explicitado a través de

determinados parámetros relacionados con el daño oxidativo a lípidos y a proteínas

y en lo que se refiere al estado redox, evidencias recogidas en diversos trabajos ya

publicados con anterioridad (Kukreja and Hess, 1992; Molavi and Mehta, 2004). No

obstante, a pesar de presentar cierto grado de significancia, la diferencia de estrés

oxidativo entre ambas poblaciones no es suficientemente relevante como para que

distorsione los resultados que han sido asociados al cáncer colorrectal y al

tratamiento quimioterápico durante el desarrollo de este trabajo. Además, en

cualquier caso, la distribución de los pacientes con HTA es muy homogénea en

cualquiera de los grupos de población establecidos en los diferentes estudios

realizados.

Discusión

199

Asimismo, la ausencia o la baja significancia de estrés mostrada en las

poblaciones con esta serie de patologías de base puede ser debido a que el fuerte

estrés asociado al proceso neoplásico junto con el tratamiento quimioterápico

enmascara los menores niveles de estrés que se relacionan con esta serie de

enfermedades.

5.2.6. Estudio de las correlaciones entre los difer entes marcadores de

estrés oxidativo en pacientes con cáncer colorrecta l

Para finalizar el desarrollo de la presente Tesis Doctoral se ha considerado

interesante el estudio de como se relacionan entre sí los diferentes parámetros

indicadores del estrés oxidativo tanto en el grupo de sujetos control como en los

pacientes con cáncer colorrectal así como el diferente comportamiento de las

correlaciones establecidas entre ambos grupos de población. El análisis en detalle

de las diferentes correlaciones que se establezcan podría permitir concluir si alguno

de los parámetros estudiados destaca como un mejor biomarcador para el estudio

del estrés oxidativo asociado al cáncer colorrectal.

En primer lugar, tal y como cabía esperar en el grupo de sujetos control, la

correlación positiva que se establece entre la capacidad antioxidante total del

plasma con las moléculas encargadas del mantenimiento del equilibrio redox pone

de manifiesto el importante papel que juegan estos compuestos antioxidantes en el

nivel oxidativo celular (Di Giacomo et al., 2003). Asimismo, debido posiblemente a

los cambios que se producen en las moléculas de GSH y del sistema tiorredoxina en

pacientes con cáncer colorrectal y asociados a la propia enfermedad no se

obtuvieron correlaciones entre el estado redox y la capacidad antioxidante total.

El diferente comportamiento de las correlaciones establecidas entre los

indicadores de óxido nítrico y la capacidad antioxidante total de plasma entre el

grupo de sujetos control y de los enfermos con CCR, sugiere de nuevo la estrecha

asociación que se establece entre las especies reactivas derivadas del nitrógeno

(RNS) y una menor capacidad antioxidante asociada al propio proceso

carcinogénico (Mocellin, 2009).

Discusión

200

Por otra parte, cabe destacar como los grupos carbonilo, indicadores del daño

oxidativo a las proteínas, se postulan como un buen biomarcador para el estudio del

estrés oxidativo tanto en sujetos control como en pacientes con cáncer colorrectal,

dado que se correlaciona de forma significativa con la capacidad antioxidante total,

con el daño oxidativo y sólo en el caso de sujetos control con el estado redox. Esta

falta de correlación entre los GC y los parámetros encargados del equilibrio redox

detectado en la población de enfermos podría ser debida a los importantes cambios

que se producen en la molécula antioxidante GSH y en el sistema tiorredoxina

asociado al desarrollo de la enfermedad colorrectal, tal y como se ha ido recogiendo

en los diferentes apartados del presente trabajo (Mansego et al., 2007). El empleo

de los grupos carbonilo medidos en plasma como indicador de estrés oxidativo, ya

ha sido puesto de manifiesto a lo largo de la discusión de resultados, dado que en

los pacientes con CCR respecto al grupo control se detecta un fuerte y marcado

incremento de la concentración de este parámetro, requiriendo de técnicas de

medida con menor sensibilidad con respecto a las necesarias para la cuantificación

de otro tipo de parámetros y/o medios biológicos estudiados en este trabajo.

El incremento de estrés oxidativo presente en la población con cáncer

colorrectal vuelve a reflejarse en el daño detectado en las estructuras lipídicas, a

través de la cuantificación de los hidroperóxidos (Di Giacomo et al., 2003). De esta

forma, se observa que este parámetro se correlaciona de forma inversa con la

capacidad antioxidante total y de forma positiva con el sistema tiorredoxina, lo que

sugiere que el incremento de estrés oxidativo puede desencadenar la activación y

puesta en marcha de los sistemas compensatorios del daño oxidativo molecular.

En cuanto al estado redox y los biomarcadores de daño oxidativo, la

correlación negativa que se establece entre los grupos carbonilo y los tioles

antioxidantes en el grupo de sujetos control, pone de nuevo de manifiesto que un

mayor estrés oxidativo, reflejado a través del incremento en la oxidación de

proteínas, lleva asociado una disminución de las moléculas antioxidantes

encargadas de reestablecer el equilibrio redox. Asimismo, también se establece una

correlación directa entre los parámetros indicadores de la capacidad antioxidante

total FRAP y ABTS y la tiorredoxina, indicando una vez más el importante papel que

juega en el mantenimiento óptimo en el estado redox. Sin embargo, cuando los

Discusión

201

niveles de estrés oxidativo son mayores, estando asociados a la enfermedad

carcinogénica, no se establece la misma respuesta fisiológica, ya que el complejo

mecanismo de la propia enfermedad así como de otra serie de factores

intervinientes en el estrés oxidativo como el tratamiento quimioterápico, hace que no

se establezcan de forma significativa correlaciones con los parámetros del estado

redox, reflejando por tanto la ruptura del equilibrio, dejando de contribuir a su

reestablecimiento (Arner and Holmgren, 2006).

Por otra parte, el GSH medido en linfocitos, que no se correlaciona en la

población de sujetos control, si va a ser un marcador importante en enfermos con

cáncer colorrectal. El hecho de que en la población de pacientes el GSH se

correlacione negativamente con marcadores de daño oxidativo, como son los

nitritos, nitratos, hidroperóxidos y grupos carbonilo de linfocitos, corrobora los

resultados previamente obtenidos en los estudios realizados, en los que se ha

discutido que un mayor estrés oxidativo conlleva un mayor consumo de GSH como

mecanismo compensatorio de los niveles de oxidación celular (Balendiran et al.,

2004).

Discusión

202

CONCLUSIONES

Conclusiones

203

6. CONCLUSIONES

Las conclusiones más relevantes alcanzadas en este trabajo son las que se indican

a continuación:

1. Antioxidantes que se pueden ver influidos por la dieta como polifenoles y GSH

están significativamente disminuidos en pacientes con cáncer colorrectal en

comparación con otras neoplasias. Los niveles de MDA y GC fueron

significativamente diferentes entre las distintas neoplasias, pudiéndose

establecer como marcadores diferenciales de estrés oxidativo.

2. Nuestros resultados confirman plenamente la referida existencia de mayor

estrés oxidativo y cambios en el estado redox plasmático en pacientes con

cancer colorrectal como muestran la disminución de la capacidad antioxidante

e incremento de biomarcadores.

3. El tratamiento con quimioterapia, independientemente del tipo de tratamiento,

se relaciona directamente con un mayor estrés oxidativo en plasma,

caracterizado por un descenso significativo del estado antioxidante y un

incremento significativo de los biomarcadores de daño oxidativo.

4. Los tratamientos que combinan anticuerpos monoclonales como el cetuximab

o bevacizumab, resulta en un incremento del estrés oxidativo plasmático con

mayor daño a lípidos y proteínas, asociado a una disminución de los niveles

de GSH plasmático.

5. Los pacientes con metástasis tienen mayor estrés oxidativo que los que no

tienen metástasis, con niveles significativamente más altos de GC y de

hidroperóxidos lipídicos. El estado antioxidante se ve disminuido en función

del avance de la enfermedad.

6. El estado redox plasmático, medido como niveles de Trx y GSH podría ser un

buen biomarcador del estado metastásico y de la respuesta a los tratamientos

quimioterapéuticos.

Conclusiones

204

7. Los grupos carbonilos e hidroperóxidos son los biomarcadores de daño

oxidativo más sensibles a cambios en el avance de la enfermedad.

8. La tiorredoxina se establece como un posible biomarcador indicador de la

evolucion de la enfermedad, tal y como muestra su correlación positiva con el

marcador tumoral CEA.

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ABREVIATURAS

ABREVIATURAS

ABTS: sal diamonio 2,2ázinobis-(6-ácido sulfónico 3-etilbenzotiazolina)

ASCO: Sociedad Americana de Oncología Clínica

CAT: Catalasa

CCR: Cáncer colorrectal

CEA: Antígeno carcinoembrionario

CG: Cáncer gástrico

DACH: 1,2-diaminociclohexano

EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico

EMT: Transición epitelial-mesenquimal

EO: Estrés oxidativo

EPOC: Enfermedad pulmonar obstructiva crónica

ERNs: Especies reactivas del nitrógeno

EROs: Especies reactivas del oxígeno

ERONs: Especies reactivas del oxígeno o nitrógeno

5-FU: 5- fluorouracilo

GC: Grupos carbonilo

GGT: Gamma-glutamil transpeptidasa

GPx: Glutation peroxidada

GR: Glutation reductasa

GSH: Glutation reducido

GSSG: Glutation disulfuro u oxidado

GST: Glutation-S-transferasa

H2O2: Peróxido de hidrógeno

HO2˙: Radical hidroperóxido

HNE: 4-Hidroxi-2-nonenal

HTA: Hipertensión arterial

L: Linfoma

NO˙: Oxido nítrico

NOO¯: Peroxinitrito

MDA: Malondialdehido

MMP: Metaloproteasas de matriz

O2˙¯: Anión superóxido 1O2: Oxígeno singlete

˙OH: Radical hidroxilo

8-OH-dG: 8-hidroxi-desoxiguanina

PS-ECOG: Performance status (calidad de vida del paciente) según criterios de

Eastern Cooperative Oncologic Group

PTKs: Protein quinasas

RNS: Especies de nitrógeno reactivas

ROO˙: Radical peroxilo

ROS: Especies oxigénicas reactivas

SOD: Superóxido dismutasa

TROLOX: Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico

Trx: Tiorredoxina

TrxR: Tiorredoxina reductasa

VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular

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