PËRDORIMI I INSTRUMENTEVE MODERNE PËR DIAGNOSTIKIMIN … · Mero D. (201. 7): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave që shkaktojnë infeksione në

REPUBLIKA E SHQIPËRISË

UNIVERSITETI I TIRANËS

FAKULTETI I SHKENCAVE TË NATYRËS

DEPARTAMENTI I BIOTEKNOLOGJISË

PROGRAMI I STUDIMIT BIOTEKNOLOGJI BIMORE

DISERTACION Për marrjen e gradës:

Doktor i Shkencave

PËRDORIMI I INSTRUMENTEVE MODERNE PËR

DIAGNOSTIKIMIN E FITOPLAZMAVE QË

SHKAKTOJNË INFEKSIONE NË BIMËT E MOLLËVE

(AP) DHE LEPTONEKROZËN E KUMBULLËS (PLN)

Kandidati:

Msc. Desareda Mero

Udhëheqës shkencor

Prof. Dr. Ariola Bacu

Prof. Dr. Margarita Hysko

Tiranë 2017

Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave

që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)

ii

REPUBLIKA E SHQIPERISË

UNIVERSITETI I TIRANËS

FAKULTETI I SHKENCAVE TË NATYRËS

DEPARTAMENTI I BIOTEKNOLOGJISË

PROGRAMI I STUDIMIT BIOTEKNOLOGJI BIMORE

DISERTACION

Paraqitur nga

Msc. Desareda MERO

Udhëhequr nga

Prof. Dr. Ariola Bacu

Prof. Dr. Margarita Hysko

Për marrjen e gradës

DOKTOR I SHKENCAVE

Tema: ―Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin

e fitoplazmave që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve

(AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)‖

Mbrohet më; _____/ _____/ _____ para jurisë;

1.______________________________________Kryetar

2.______________________________________Anëtar (Oponent)

3.______________________________________Anëtar (Oponent)

4.______________________________________Anëtar

5.______________________________________Anëtar



iii

© 2017 Desareda MERO

Të gjitha të drejtat e rezervuara. Asnjë pjesë e këtij disertacioni nuk lejohet të

riprodhohet, të ruhet në një sistem përsëritës apo të transmetohet në çfarëdo mënyre

(elektronike, mekanike, fotokopje, regjistrim apo ndonjë mënyrë tjetër), pa lejen

paraprake të autorit.



iv

Dedikuar familjes sime!



v

Falenderime

Realizimi i këtij punimi nuk ka qënë aspak i thjeshtë, por pa mbështetjen dhe

kontributin e shumë personave do të ishte i pamundur!

Në rradhë të parë dua të falenderoj udhëheqëset e mia për ndihmën e pakursyer që

më kanë ofruar:

Prof. Dr. Ariola Bacu (Grazhdani) së cilës i jam mirënjohëse për kohën e

gjatë që më ka kushtuar, sqarimet shkencore, ndihmën në laborator, saktësinë

dhe korrektesën me të cilën më ka mësuar të punoj dhe e them me bindje se pa

përkushtimin e saj ky punim nuk do të kishte këtë formë.

Prof. Dr. Margarita Hysko (Nano) së cilës i jam mirënjohëse për mundësinë

që më dha për realizimin e kësaj teme pranë Fakultetit të Shkencave të

Natyrës, për angazhimin, konsultimet, këshillat e çmuara, frymëzimin dhe

motivimin e vazhdueshëm.

Falenderime dhe mirënjohje për gjithë stafin e Departamentit të Bioteknologjisë për

mbështetjen, dashamirësinë dhe pozitivitetin që më kanë përcjellë. Falenderoj Mirën

për ndihmën dhe këshillat e vyera gjatë realizimit të eksperimenteve pranë

Laboratorit të Bioteknologjisë Molekulare, Fakulteti i Shkencave të Natyrës,

Universiteti i Tiranës.

Një falenderim i veçantë për Prof. Asoc. Dr. Gjergji Mero i cili më ka inkurajuar,

mbështetur dhe më ka ndihmuar duke më vënë në dispozicion mjetet dhe duke më

krijuar kushtet e përshtatshme për realizimin e eksperimenteve në laboratorin e

Biologjisë, Fakulteti i Shkencave Natyrore dhe Humane, Universiteti Fan.S.Noli,

Korçë.

Falenderoj kolegët dhe studentët e mi që më janë gjendur pranë në çdo moment

nevoje, gjatë gjithë kohës të realizimit të punimit.

Dhe të fundit por jo më pak të rëndësishmit janë familjarët e mi të cilët meritojnë

gjithë falenderimet e botës.

Falenderoj gjithë të afërmit e mi dhe familjen e bashkëshortit tim për

inkurajimin dhe mbështetjen e vazhdueshme.

Falenderoj bashkëshortin tim të dashur për durimin, mirëkuptimin, kurajon

dhe ndihmën e dhënë gjatë gjithë kohës.

Falenderoj vëllain tim të mrekullueshëm dhe dy prindërit e mi të shtrenjtë që

më kanë ofruar mbështetje dhe dashuri pa kushte në çdo moment. Jam krenare

për ju!

Ju faleminderit!



vi

PASQYRA E LËNDËS

Falenderime .................................................................................................................. v

LISTA E SHKURTIMEVE ....................................................................................... ix

LISTA E TABELAVE ................................................................................................. x

PARATHËNIE ......................................................................................................... xvii

KAPITULLI I............................................................................................................... 2

KONSIDERATA TEORIKE ...................................................................................... 2

1.1 Të dhëna të përgjithshme ...................................................................................... 3

1.1.1 Morfologjia .................................................................................................... 3

1.1.2 Përcaktimi i fitoplazmave .............................................................................. 4

1.1.3 Pozicioni filogjenetik i fitoplazmave ............................................................. 4

1.2 Fitoplazmat dhe sëmundjet e lidhura me to .................................................... 6

1.2.1 Transmetimi dhe përhapja e sëmundjeve të fitoplazmave ............................. 7

1.2.2 Aspekte të epidemiologjisë së fitoplazmave ................................................. 8

1.2.3 Sëmundjet fitoplazmatike dhe rëndësia e tyre ekonomike ............................ 9

1.2.4 Disa fitoplazmoza të rëndësishme të drufrutorëve ...................................... 10

1.2.4.1 Apple proliferation ................................................................................ 10

1.2.4.2 Plum Leptonecrosis ............................................................................... 11

1.3. Menaxhimi dhe kontrolli i sëmundjeve fitoplazmatike ............................... 13

1.3.1. Strategjia e parandalimit ............................................................................. 13

1.3.2. Kontrolli i insekteve vektorë ...................................................................... 13

1.3.3. Strategjia e menaxhimit .............................................................................. 14

1.3.4. Perspektivat për kontrollin e sëmundjeve fitoplazmatike ........................... 14

1.4. Gjenomika dhe mekanizmi i patogjenitetit ................................................... 15

1.4.1. Gjenet që përfshihen në ndërveprimet e fitoplazmave me strehuesit e tyre

.............................................................................................................................. 17

1.5. Përhapja e fitoplazmozave në vendin tonë dhe në rajon ............................. 18

1.5.1 Përhapja në Shqipëri .................................................................................... 18

1.5.2 Përhapja në Kosovë ..................................................................................... 19

1.5.3 Përhapja në Greqi ........................................................................................ 19

1.5.4 Përhapja në Bullgari .................................................................................... 19

1.5.5 Përhapja në Rumani ..................................................................................... 20

1.5.6 Përhapja në Serbi ......................................................................................... 20

1.5.7 Përhapja në Itali ........................................................................................... 20

1.5.8 Përhapja në Turqi ......................................................................................... 21

1.6. Metodat për zbulimin dhe identifikimin e fitoplazmave ............................. 21

1.6.1. Metoda e bazuar në simptoma, simptomatologjia ...................................... 21

1.6.2. Izolimi i fitoplazmave në bimët test ........................................................... 24

1.6.3. Mikroskopia ................................................................................................ 25

1.6.3.1 Mikroskopia me dritë (ngjyrimi Diene) ................................................ 25

1.6.3.2 Mikroskopia me fluoreshencë (ngjyrimi DAPI) ................................... 25



vii

1.6.3.3 Mikroskopia me imunofluoreshencë..................................................... 27

1.6.3.4 Mikroskopia elektronike ....................................................................... 27

1.6.4. Histokimia .................................................................................................. 27

1.6.5. Imunologjia ................................................................................................. 28

1.6.5.1 Antitrupat monoklonale ........................................................................ 28

1.6.5.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ................................. 29

1.6.5.3 Dot Blot Immunoassay ......................................................................... 29

1.6.6. Biologjia molekulare .................................................................................. 29

1.6.6.1 Hibridizimi i acideve nukleike .............................................................. 30

1.6.6.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) ....................................................... 31

1.6.6.3 Real-Time PCR për zbulim universal të fitoplazmave ......................... 31

1.6.6.4 Restriction Length Fragment Polymorphism (RFLP)........................... 32

1.6.6.5 Nested PCR, RFLP bazuar në gjenin 16S rADN .................................. 32

1.6.6.6 PCR, RFLP bazuar në operonin proteinik ribozomal ........................... 34

1.6.6.7 T-RFLP për zbulim dhe identifikim ..................................................... 35

1.6.6.8 Heteroduplex Mobility Assay (HMA) .................................................. 36

1.6.6.9 Analiza e polimorfizmit të konformacionit një vargor për diferencimin

e shtameve fitoplazmatike (SSCP).................................................................... 37

1.6.6.10 Microarrays për zbulim dhe identifikim universal.............................. 37

KAPITULLI II ........................................................................................................... 39

MATERIALE DHE METODA ................................................................................ 39

2.1 Materiali bimor i analizuar ............................................................................. 39

2.1.1 Llojet e bimëve, plantacionet ....................................................................... 39

2.1.2 Metoda e marrjes së mostrave ..................................................................... 42

2.2 Metodat e diagnostikimit ................................................................................. 45

2.2.1 Vlerësimi i plantacioneve në bazë të simptomave....................................... 45

2.2.2 Metoda e ngjyrimit DAPI ............................................................................ 46

2.2.2.1 Protokolli i metodës së ngjyrimit DAPI................................................ 47

2.2.3 Metoda të bazuara në PCR .......................................................................... 48

2.2.3.1 Protokolli i ekstraktimit të ADN-së të pasuruar në fitoplazma............. 49

2.2.3.2 Shumëfishimi me PCR i rajoneve specifike fitoplazmatike ................. 51

2.2.3.3 Përzgjedhja e mostrave të ADN-së për shumëfishimin e rajoneve

specifike ............................................................................................................ 52

2.2.4 Analizimi i Rezultateve ............................................................................... 53

KAPITULLI III ......................................................................................................... 54

REZULTATE DHE DISKUTIME ........................................................................... 54

3.1 Rezultatet e vlerësimit simptomatologjik ....................................................... 54

3.1.1 Plantacioni Bitinckë ..................................................................................... 54

3.1.2 Plantacioni Korçë.........................................................................................573.1.3 Plantacioni Turan ......................................................................................... 60

3.1.4 Plantacioni Cangonj ..................................................................................... 65

3.1.5 Plantacioni Dvoran ...................................................................................... 68

3.1.6 Plantacioni Zëmblak .................................................................................... 71

3.2 Rezultatet e teknikës së ngjyrimit DAPI ........................................................ 75



viii

3.2.1 Plantacioni Bitinckë ..................................................................................... 75

3.2.2 Plantacioni Korçë ........................................................................................ 78

3.2.3 Plantacioni Turan ......................................................................................... 80

3.2.4 Plantacioni Cangonj ..................................................................................... 83

3.2.5 Plantacioni Dvoran ...................................................................................... 86

3.2.6 Plantacioni Zëmblak .................................................................................... 89

3.3 Rezultatet e vlerësimit me anë të PCR-së....................................................... 93

3.3.1 Amplifikimi i ADN-së ribozomale specifike të fitoplazmave ..................... 93

PËRFUNDIME ........................................................................................................ 100

REKOMANDIME ................................................................................................... 102

LITERATURA ......................................................................................................... 103

SHTOJCA ................................................................................................................. 123

LISTA E PUBLIKIMEVE ...................................................................................... 136

PËRMBLEDHJE ..................................................................................................... 138

ABSTRACT .............................................................................................................. 138



ix

LISTA E SHKURTIMEVE

ADN Acidi dezoksiribonukleik

AP Apple Proliferation

ARN Acidi ribonukleik

bp Base pairs

BSA Bovine serum albumin

C Citozinë

Ca. Candidatus

CABI Centre for Agriculture and Biosciences International

CP Clover Proliferation

CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DAS ELISA Double Antibody Sandwich ELISA

dd Double distilled

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

dsADN Double-stranded ADN

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EPPO European and Mediterranean plant protection organization

ESFY European Stone Fruit Yellows

Fig Figura

G Guaninë

HIV Human immunodeficiency virus

HMA Heteroduplex Mobility Assay

ICSB International Committee of Systematic Bacteriology

IRPCM International Research Programme on Comparative Mycoplasmology

kb Kilo base pairs

MLOs Mycoplasmalike organisms

OD Optical density

OY-M Onion yellows phytoplasma

PCR Polymerase chain reaction

PD Pear decline

PLN Plum leptonecrosis



x

PVPP Polyvinylpyrrolidone

PWB Potato witches' broom phytoplasma

PYLR Peach yellow leaf roll

rADN ADN ribozomale

rARN ARN ribozomale

RFLP Restriction fragment length polymorphism

RIA Radioimmunoassay

rpm Revolutions per minute

RYD Rice yellow dwarf

ssADN Single-stranded ADN

SSCP Single-strand conformation polymorphism

TAE Tris acetic acid EDTA (buffer)

TBE Tris borate EDTA (buffer)

TRF Terminal restriction fragments

Taq Thermus aquaticus

T-RFLP Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism

U Unit

UV Ultraviolet

32P Fosfor 32

LISTA E TABELAVE

Tabela 1.1 Klasifikimi i fitoplazmave sipas Wei et al., 2007. (*lloji i shtamit në

anglisht) (Dickinson et al., 2013). ................................................................................. 6

Tabela 1.2 Primerat specifikë për amplifikimin e rajonit 16Sr ADN tek fitoplazmat

(Duduk et al., 2013). .................................................................................................... 33

Tabela 1.3 Primerat e bazuar në gjenet rp, gjysëmuniversale, 16Sr grup-specifikë dhe

16Sr nëngrup-specifikë të dizenjuar për amplifikimin e një pjese të operonit rp të

fitoplazmave (Martini and Lee, 2013). ........................................................................ 35

Tabela 2.1 Primerat e përzgjedhur, zona që njohin dhe sekuencat e tyre (Ahrens and

Seemuller, 1992; Lorenz et al., 1995; Duduk et al., 2013). ......................................... 52

Tabela 2.2 Protokolli i ciklimit për shumëfishim duke përdorur primerat fU5/rU3;

fO1/rO1; fCPD/rCPD................................................................................................... 52

Tabela 2.3 Protokolli i ciklimit për shumëfishim duke përdorur primerat fCAP/rCAP.

...................................................................................................................................... 52

Tabela 2.4 Kategoritë e mostrave të zgjedhura për shumëfishimin me anë të PCR të

rajoneve fitoplazmatike. ............................................................................................... 53



xi

LISTA E FIGURAVE

Figura 1.1 Krahasimi i madhësisë së gjenomës të fitoplazmave dhe baktereve të

ndryshme. Është treguar madhësia e gjenomës të Mesorhizobium loti, Escherichia coli

K-12 MG1655, Staphylococcus aureus subsp. aureus N315, ―Ca. P. asteris‖ OY-M

strain dhe Mycoplasma genitalium G37. Oshima et al. (2013). .................................. 15 Figura 1.2 Mikrografi elektronike (majtas) dhe harta e gjenomës së fitoplazmave

(djathtas). (Majtas) Fitoplazmat (pjesëzat rrethore) janë afërsisht 1 e 10 milionta e

metrit në madhësi, vetëm 1/10 e virusit gjigand të njohur si pandoravirus. (Djathtas)

Gjenoma e fitoplazmave përbëhet afërsisht nga 870,000 çifte bazash, dhe ka rreth 1/3

apo 1/4 e numrit të gjeneve të pandoravirus. © 2016 Laboratory of Plant Pathology,

Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo. .......... 17 Figura 1.3 Paraqitje diagramatike e operonit rARN të një fitoplazme (Smart et al.,

1996). ........................................................................................................................... 18 Figura 1.4 Fruta të vogla (në të djathtë) me bishta të gjatë, të infektuara me

fitoplazma. Loschi. DBADP, University of Udine, Italy.

http://www.cabi.org/compendia/cpc/ ........................................................................... 22 Figura 1.5 Rozetë e gjetheve, Alberto Loschi http://www.fitoplasmi.it/index1.htm.. 23 Figura 1.6 Lule me numër shumë të madh petalesh. Loschi, University of Udine,

Italy. ............................................................................................................................. 23

Figura 1.7 Gjethe molle e shëndetshme (majtas), gjethe molle (klorotike) e infektuar

nga fitoplazmat (djathtas). Biologische Bundesanstalt für Land-und Forstwirtschaft,

Institut für Pflanzenschutz im Obstbau Archive. ......................................................... 23 Figura 1.8 Gjethe molle e shëndetshme (djathtas), krahasuar me gjethe molle të

prekura nga fitoplazma (majtas). Gjethet e infektuara paraqiten me ndajgjethëza

shumë të mëdha. www.bugwood.org. .......................................................................... 23 Figura 1.9 ―Fshesa e shtrigës‖, Biologische Bundesanstalt für Land-und

Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenschutz im Obstbau Archive. www.bugwood.org.

...................................................................................................................................... 23 Figura 1.10 Ilustrim skematik i hapave të ndryshme të ngjyrimit DAPI, për

diagnostikimin e mostrave të prekura nga fitoplazmat. ©Francisco Beluzan. ............ 26

Figura 2.1 Plantacioni Bitinckë, majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në

terren.............................................................................................................................40

Figura 2.2 Plantacioni Korçë. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga

terreni. .......................................................................................................................... 40 Figura 2.3 Plantacioni Turan. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në

terren. Foto D. Mero. ................................................................................................... 40 Figura 2.4 Plantacioni Cangonj. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në

terren. ........................................................................................................................... 41 Figura 2.5 Plantacioni Dvoran. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga

terreni. Foto nga D.Mero. ............................................................................................ 41 Figura 2.6 Plantacioni Zëmblak. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga

terreni. .......................................................................................................................... 42 Figura 2.7 Ilustrim i mënyrës së shënimit të kampioneve; Druri 2, plantacioni

Zëmblak (majtas), Druri 1 Bitinckë (djathtas). Foto D. Mero. .................................... 42 Figura 2.8 Grumbullimi i mostrave; a. kategoria gjethe, druri 9, plantacioni Zëmblak,

b. kategoria trung, druri 1, plantacioni Korçë, c. kategoria kërcell, druri 10,



xii

plantacioni Bitinckë, d. kategoria rrënjë, druri 3, plantacioni Zëmblak........... 43Figura 2.9 Gjatë grumbullimit të materialit bimor, kategoria gjethe (Plantacioni

Turan). .......................................................................................................................... 44 Figura 2.10 Mostrat e transportuara në laboratorin e Bioteknologjisë Molekulare,

FSHN, UT, a. kategoria kërcell, b. kategoria trung, c. kategoria rrënjë, d. kategoria

gjethe. ........................................................................................................................... 45 Figura 2.11 Formulari për vlerësimin simptomatologjik të bimëve. .......................... 46 Figura 2.12 a. Mikroskopi me fluoreshencë, b. mostrat e transportuara në laborator c.

mjetet e punës d. momente gjatë punës për realizimin e metodës DAPI. ................... 48 Figura 2.13 Vëzhgimi i imazhit të prerjeve të ngjyrosura me ngjyruesin fluoreshent

DAPI në kompjuter. ..................................................................................................... 48 Figura 2.14 Pamje nga puna për ekstraktimin e ADN. Laboratori i Bioteknologjisë

Molekulare, FSHN, UT................................................................................................ 50 Figura 2.15 Matja e sasisë dhe cilësisë së mostrave të ADN në spektrofotometër. Laboratori i Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT. ................................................ 51 Figura 2.16 Pamje nga puna në laborator për realizimin e PCR-së, elektroforezës së

produkteve të shumëfshimit dhe vizualizimit të produkteve në transiluminator.

Laboratori i Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT. ................................................ 51 Figura 3.1 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Bitinckë gjatë vitit 2014. ............................................................. 54 Figura 3.2 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Bitinckë gjatë vitit 2015. ............................................................. 55 Figura 3.3 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Bitinckë gjatë vitit 2016. ............................................................. 56

Figura 3.4 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Bitinckë. Nga

e majta në të djathtë: a. fruta me përmasa të vogla, përdredhje e gjetheve, b. degë

paralele në formën e fshesës, c. prani e insekteve. Fotot D.Mero. .............................. 56 Figura 3.5 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e

plantacionit Bitinckë për tre vitet (2014, 2015, 2016). ................................................ 57 Figura 3.6 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Korçë gjatë vitit 2014. ................................................................ 58 Figura 3.7 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Korçë gjatë vitit 2015. ................................................................ 58 Figura 3.8 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Korçë gjatë vitit 2016. ................................................................ 59 Figura 3.9 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Korçë. Nga e

majta në të djathtë: a. rritje e çrregullt, gjethe klorotike, b. lule e çrregullt, c. rozeta, d.

përdredhje e gjetheve. Fotot D.Mero. .......................................................................... 59 Figura 3.10 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e

plantacionit Korçë për tre vitet (2014, 2015, 2016). .................................................... 60 Figura 3.11 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Turan gjatë vitit 2014.................................................................. 61 Figura 3.12 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Turan gjatë vitit 2015.................................................................. 61 Figura 3.13 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Turan gjatë vitit 2016.................................................................. 62 Figura 3.14 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Turan. Nga

e majta në të djathtë: a. rritje e çrregullt, gjethe klorotike, b. prani e insekteve, c.



xiii

rozeta, d. përdredhje e gjetheve, gjethe të vogla të pazhvilluara, gjethe klorotike. Fotot

D.Mero. ........................................................................................................................ 62 Figura 3.15 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e

plantacionit Turan për tre vitet (2014, 2015, 2016). .................................................... 63 Figura 3.16 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Bitinckë,

Korçë, Turan, gjatë vitit 2014. ..................................................................................... 63 Figura 3.17 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Bitinckë,

Korçë, Turan, gjatë vitit 2015. ..................................................................................... 64 Figura 3.18 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Bitinckë,

Korçë, Turan, gjatë vitit 2016. ..................................................................................... 65 Figura 3.19 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Cangonj gjatë vitit 2014. ............................................................. 65 Figura 3.20 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Cangonj gjatë vitit 2015. ............................................................. 66 Figura 3.21 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Cangonj gjatë vitit 2016. ............................................................. 66 Figura 3.22 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni Cangonj.

Nga e majta në të djathtë: a. gjethe klorotike, b. degë paralele në formën e fshesës, c.

prani e insekteve. Fotot D.Mero. ................................................................................. 67 Figura 3.23 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e

plantacionit Cangonj për tre vitet (2014, 2015, 2016). ................................................ 67 Figura 3.24 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Dvoran gjatë vitit 2014. .............................................................. 68 Figura 3.25 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Dvoran gjatë vitit 2015. .............................................................. 69 Figura 3.26 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Dvoran gjatë vitit 2016. .............................................................. 69 Figura 3.27 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni Dvoran.

Nga e majta në të djathtë: a. gjethe klorotike, b. degë paralele në formën e fshesës, c.

përdredhje e gjetheve dhe fruta të pazhvilluar. Fotot D.Mero. .................................... 70 Figura 3.28 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e

plantacionit Dvoran për tre vitet (2014, 2015, 2016)................................................... 70 Figura 3.29 Paraqitja e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e

plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2014. ......................................................................... 71 Figura 3.30 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2015. ............................................................ 71 Figura 3.31 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në

drurët e plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2016. ............................................................ 72 Figura 3.32 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni

Zëmblak. Nga e majta në të djathtë: a. prani e insekteve, b. rozeta, rritje e çrregullt, c.

zverdhje dhe përdredhje e gjetheve. Fotot D.Mero. ..................................................... 72 Figura 3.33 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e

plantacionit Zëmblak për tre vitet (2014, 2015, 2016). ............................................... 73 Figura 3.34 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Cangonj,

Dvoran, Zëmblak gjatë vitit 2014. ............................................................................... 73 Figura 3.35 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Cangonj,

Dvoran, Zëmblak gjatë vitit 2015. ............................................................................... 74 Figura 3.36 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Cangonj,

Dvoran, Zëmblak gjatë vitit 2016. ............................................................................... 74



xiv

Figura 3.37 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Bitinckë

për vitet 2015, 2016. .................................................................................................... 76 Figura 3.38 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të mollëve ngjyrosur me

DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive.

Fotot D. Mero............................................................................................................... 76 Figura 3.39 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 5 e ngjyrosur me

DAPI, parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero. ..... 77 Figura 3.40 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Bitinckë

për vitin 2015. .............................................................................................................. 77 Figura 3.41 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit

Bitinckë, viti 2015. ....................................................................................................... 77 Figura 3.42 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Bitinckë


Bitinckë, viti 2016. ....................................................................................................... 78 Figura 3.44 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Korçë



Fotot D. Mero............................................................................................................... 79 Figura 3.46 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Korçë

për vitin 2015. .............................................................................................................. 79 Figura 3.47 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit Korçë,

viti 2015. ...................................................................................................................... 79 Figura 3.48 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Korçë

për vitin 2016 ............................................................................................................... 80 Figura 3.49 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit Korçë,

viti 2016. ...................................................................................................................... 80 Figura 3.50 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Turan




DAPI, parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero. ..... 82 Figura 3.53 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Turan

për vitin 2015. .............................................................................................................. 82 Figura 3.54 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit Turan,

viti 2015. ...................................................................................................................... 82 Figura 3.55 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Turan

për vitin 2016. ............................................................................................................ 83 Figura 3.56 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit Turan,

viti 2016. ...................................................................................................................... 83 Figura 3.57 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Cangonj

për vitet 2015, 2016. .................................................................................................... 83 Figura 3.58 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur

me DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive.

Fotot D. Mero............................................................................................................... 84



xv

Figura 3.59 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 6 e ngjyrosur me

DAPI, parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero. ..... 85 Figura 3.60 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Cangonj


Cangonj, viti 2015. ....................................................................................................... 85 Figura 3.62 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Cangonj

për vitin 2016 ............................................................................................................... 86 Figura 3.63 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit

Cangonj, viti 2016. ....................................................................................................... 86 Figura 3.64 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Dvoran

për vitet 2015, 2016. .................................................................................................... 87 Figura 3.65 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur



DAPI, parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero. ..... 88 Figura 3.67 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Dvoran


Dvoran, viti 2015. ........................................................................................................ 88 Figura 3.69 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Dvoran


Dvoran, viti 2016. ........................................................................................................ 89 Figura 3.71 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin

Zëmblak për vitet 2015, 2016. ..................................................................................... 90 Figura 3.72 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur



DAPI, parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero. ..... 91 Figura 3.74 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin

Zëmblak për vitin 2015. ............................................................................................... 91 Figura 3.75 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit

Zëmblak, viti 2015. ...................................................................................................... 91 Figura 3.76 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin

Zëmblak për vitin 2016. ............................................................................................... 92 Figura 3.77 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit

Zëmblak, viti 2016. ...................................................................................................... 92 Figura 3.78 Amplifikimi i ADN-së ribozomale specifike të fitoplazmave duke

përdorur çiftin e primerave fU5/rU3. ........................................................................... 93 Figura 3.79 Amplifikimi i ADN-së specifike ribozomale të fitoplazmave nga mostrat

e mollës duke përdorur çiftin e primerave fU5/rU3. Fragmenti i pritshëm është 850bp.

...................................................................................................................................... 93 Figura 3.80 Zbulimi i fitoplazmave bazuar në çiftin e primerave fO1/rO1; Fragmenti

i pritshëm 1050bp. ....................................................................................................... 94 Figura 3.81 Zbulimi i fitoplazmave bazuar në çiftin e primerave fO1/rO1; mostrat 16-

18; Fragmenti i pritshëm 1050bp. ................................................................................ 94



xvi

Figura 3.82 Çifti i primerave fCPD/rCPD amplifikoi mostrat 1-15 nga e djathta në të

majtë duke dhënë fragmentin e pritshëm 1850bp. Mostrat 4, 7, 8, 10, 11, 13, 14 janë

të infektuara. ................................................................................................................ 94 Figura 3.83 Çifti i primerave fCPD/rCPD amplifikoi mostrat 1-15 nga e djathta në të

majtë duke dhënë fragmentin e pritshëm 1850bp. Mostrat 23/27 janë të infektuara. .. 94 Figura 3.84 Çifti i primerave jo ribozomalë fCAP/rCAP amplifikoi fragmentin e

pritshëm vetëm në dy raste 19/23. Produktet e tjera ishin me dimensione jo specifike

~ 200bp. ....................................................................................................................... 95 Figura 3.85 Çifti i primerave jo ribozomalë fCAP/rCAP nuk amplifikoi fragmentin e

pritshëm në asnjë prej mostrave. Produktet e tjera ishin me dimensione jo specifike ~

200bp............................................................................................................................ 95 Figura 3.86 Paraqitja grafike e rezultateve të katër çifteve të primerave në dedektimin

e fitoplazmave. ............................................................................................................. 96 Figura 3.87 Paraqitja grafike e rezultateve të dy metodave për dedektimin e

fitoplazmave për 28 mostra. ......................................................................................... 96 Figura 3.88 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e

fitoplazmave për mostrat 1-7. ...................................................................................... 97 Figura 3.89 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e

fitoplazmave për mostrat 8-14. .................................................................................... 97 Figura 3.90 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e

fitoplazmave për mostrat 15-21. .................................................................................. 98 Figura 3.91 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e

fitoplazmave për mostrat 22-28. .................................................................................. 98



xvii

PARATHËNIE

Fitoplazmat janë përgjegjëse për një sërë sëmundjesh të bimëve të përhapura në të

gjithë botën (Lee et al., 2000). Disa prej sëmundjeve, veçanërisht ato të bimëve

drunore, janë letale (Marcone, 2010). Fitoplazmat si parazitë obligativë, janë adaptuar

për të jetuar në floemën e bimëve dhe në insekte. Përhapja e fitoplazmave varet nga

transmetimi me anë të vektorëve Hemipterë që ushqehen në floemë, pasi në

përgjithësi janë të paafta për të kaluar në mënyrë direkte në farat e bimëve apo në

vezët e insekteve (Maixner, 2010). Për mekanizmat me anë të të cilëve fitoplazmat

induktojnë sëmundje tek bimët si edhe mbi arsyet e reagimeve të ndryshme të bimëve

strehuese ndaj infeksioneve fitoplazmatike, dihet pak (Marcone, 2010). Fitoplazmat

dallojnë nga specificiteti për strehuesit, që është zakonisht më i lartë për vektorët sesa

për bimët strehuese (Lee et al., 1998). Arsyet e këtij specificiteti nuk janë të

mirëkuptuara ende, por ekzistenca e llojeve bimore rezistente dhe variacioni i

përqëndrimit të fitoplazmave në bimë të ndryshme strehuese, tregojnë se ndjeshmëria

e bimëve nuk ka të bëjë vetëm me inokulimin specifik nga vektorët, por është e lidhur

me ndërveprime komplekse të fitoplazmave me bimët strehuese (Maixner, 2010).

Kështu, fitoplazmat e grupeve të ndryshme filogjenetike, shfaqin dallime të

konsiderueshme për sa i përket strehuesve bimorë dhe vektorëve (Weintraub and

Beanland, 2006). Zverdhja, zvogëlimi i frutave, përdredhja e gjetheve, vireshenca e

luleve janë simptomat më të zakonshme të lidhura me fitoplazmat, megjithëse në disa

raste infeksionet janë asimptomatike (Lorenz et al., 1995). Të kuptuarit e plotë të

sistemeve epidemiologjike në mjaft raste pengohet nga mungesa e të dhënave mbi

epidemiologjinë e fitoplazmave. Për më tepër duhet treguar kujdes që të shmangen

përfundimet e nxituara mbi etiologjinë e sëmundjeve të caktuara fitoplazmatike, pasi

mund të jenë të përfshirë edhe patogjenë të tjerë (Danet et al., 2003; Streten et al.,

2005). Studimet e etiologjisë dhe epidemiologjisë së sëmundjeve të shkaktuara nga

fitoplazmat varen nga përdorimi i teknikave të besueshme, të ndjeshme për

dedektimin e patogjenëve në bimët dhe insektet strehuese (Firrao et al., 2007;

Maixner, 2010).

Organizmat Mykoplazmatike (MLOs) janë Mollicutes që nuk rriten në kulturë,

dedektimi i të cilave fillimisht kryhej me anë të mikroskopisë elektronike dhe teknikës

së bazuar në fluoreshencë, falë përdorimit të fluorokromit të ADN-së 4'-6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI) (Cieslinska and Kruczynska, 2011). Asnjëra prej metodave

nuk lejonte diferencimin e mikroorganizmave. Për më tepër, përshtatshmëria e

përdorimit të tyre varej nga përqëndrimi i MLO-ve në indin e floemës. Teknika DAPI

është mjaft më e ndjeshme, por e kufizuar në kushtet e sasive të vogla të MLO-ve, çka

zakonisht ndodh në strehuesit drunorë. Sipas Cieslinska and Kruczynska, (2011) është

bërë progres në zbulimin e MLO-ve duke përdorur metoda serologjike dhe

hibridizimet ADN/ADN. Sipas Bonnet et al., 1990; Doyle and Doyle, 1990 për

zbulimin e MLO-ve shkaktarë të Apple Proliferation (AP) në bimët asimptomatike të

mollës, hibridizimet me probe të shënuara rezultuan më të ndjeshme sesa DAPI kur

materiali bimor i analizuar ishte rrënja. Megjithatë, ende nuk dihet nëse kjo metodë

është më e ndjeshme sesa metoda e ngjyrimit DAPI (Cieslinska and Kruczynska,

2011). Metodat molekulare duhen përdorur për diagnozën dhe karakterizimin e

përqëndrimit të fitoplazmave në floemën e bimëve të infektuara, të cilat mund të

variojnë përgjatë sezoneve dhe në bimë të ndryshme, dhe janë mjaft të ulëta në

strehuesit drunorë. (Lorenz et al., 1995). Në mënyrë që të përftohet ADN e

fitoplazmave me cilësi të kënaqshme, janë përdorur një sërë protokollesh ekstraktimi.



xviii

Fitoplazmat e bimëve kanë gjenomë të vogël nga 530 në 1350 kb (Marcone et al.,

1999). Diagnoza rutinë e tyre bazohet në PCR, duke përdorur primera që lidhen me

rajone specifike të operonit ribozomal për grupe filogjenetike të caktuara. Gjithashtu,

janë analizuar lokuse gjenetike me synim diferencimin dhe karakterizimin e shtameve të afërta të fitoplazmave (Arnaud et al., 2007; Marcone et al., 2010). Bimët drunore

shpesh kërkojnë teknika të posaçme për të rritur ndjeshmërinë, si përdorimin e nested-

PCR ose real-time PCR (Maixner, 2010). Fitoplazmat për të cilat janë të

disponueshme rajonet 16S rADN janë klasifikuar tashmë në 20 grupe kryesore

filogjenetike. Bazuar në të dhënat molekulare të marra nga përdorimi i RFLP-së mbi

produktet e shumëfishimit me PCR të ADN-së ribozomike, hibridizimet me probe të

shënuara apo krahasimet serologjike, edhe më tepër fitoplazma u janë bashkuar këtyre

grupeve. Një total prej 75 fitoplazmash janë të dallueshme ndërmjet Mollicuteve

fitopatogjenike të analizuara në nivel molekular (Duska Delic, 2012). Për shkak të

natyrës shumë të ruajtur të 16S rADN, mjaft shtame fitoplazmatike të dallueshme

biologjikisht ose ekologjikisht, që mund të konsideroheshin si përfaqësues të

taksoneve të reja, nuk u klasifikuan si të tilla. Në këtë rast, veçori biologjike unike

shtesë si specificiteti i antitrupave, variacioni i strehuesve, specificiteti i vektorëve

transmetues, si edhe kritere të tjera molekulare (gjene) janë të nevojshme për

specifikime të mëtejshme (Carraro et al., 1998). Për të kaluar vështirësitë në

identifikimin e fitoplazmave për shkak të përqëndrimeve të ulëta, janë zhvilluar

protokolle të bazuara në hibridizime (PCR/dot blot) ose metoda serologjike

(PCR/ELISA) për të rritur ndjeshmërinë dhe specificitetin. Protokollet e Real time-

PCR mund të përmirësojnë gjithashtu ndjeshmërinë e metodave të bazuara në PCR

(Lorenz et al., 1995). Rajoni 16SrADN është shumë i ruajtur dhe vërehet

heterogjenitet i sekuencës së interoperonit 16S-23S rARN që përdoret si mjet

suplementar për të dhënë informacion shtesë mbi karakterizimin e shtameve (Carraro

et al., 1998).

Në këtë studim, për herë të parë është vlerësuar prania e fitoplazmave në kultivarë të

mollës dhe kumbullës në rrethin e Korçës, një nga rajonet kryesore të kultivimit të

dru-frutorëve në vend. Metodat e përdorura ishin vlerësimi bazuar në simptoma

(simptomatologjia), mikroskopia fluoreshente me ngjyrimin DAPI dhe shumëfishimi

specifik i rajoneve gjenomike fitoplazmatike me anë të PCR-së. Rezultatet flasin për

prani të fitoplazmave dhe shpjegojnë avantazhet dhe disavantazhet e përdorimit të

çdonjërës metodë.



xix

QËLLIMI

Zbulimi i fitoplazmave në mollë dhe kumbulla nëpërmjet mikroskopisë me

fluoreshencë dhe shumëfishimit të fragmenteve gjenike specifike (PCR),

stabilizimi i metodikave të përdorura dhe ngritja e konsideratave mbi efikasitetin e

këtyre metodave në raport me faktorët ndikues në to.

OBJEKTIVAT

Zbulimi i fitoplazmave në bimët e mollëve dhe të kumbullave nëpërmjet

vlerësimit të simptomave, mikroskopisë me fluoreshencë me ngjyrimin DAPI

dhe shumëfishimit të fragmenteve gjenike specifike (PCR).

Krahasimi i rezultateve të verifikimit të pranisë së infeksioneve bazuar në

simptomatologji, mikroskopinë fluoreshente me ngjyrimin DAPI, PCR dhe

ngritja e konsideratave mbi avantazhet dhe disavantazhet e përdorimit të

çdonjërës.

Stabilizimi i metodikës së përdorimit të mikroskopisë me fluoreshencë me

ngjyruesin DAPI për dedektimin e fitoplazmave në mostra biologjike nga

gjethet dhe rrënjët e drurëve të mollës dhe kumbullës.

Stabilizimi i metodikës së shumëfishimit të fragmenteve gjenike specifike

ribozomale për fitoplazmat në mostra biologjike nga gjethet, rrënjët, trungjet,

kërcejtë e drurëve të mollës dhe kumbullës.

Qartësimi i faktorëve që ndikojnë në rezultatet e diagnostikimit të

infeksioneve fitoplazmatike në mollë dhe kumbulla.



2

KAPITULLI I

KONSIDERATA TEORIKE

HYRJE

Fitoplazmat janë prokariotë pa mur qelizor, të cilët shumohen në floemë dhe

transmetohen nga njëra bimë tek tjetra nëpërmjet insekteve të familjes Cicadellidae

(Sinha and Chiykowski, 1967; Purcell, 1982). Ato rriten në gypin tretës, hemolimfë,

gjendrat e pështymës dhe brënda qelizave në organe të ndryshme të trupit të insekteve

vektorë (Purcell, 1982). Sot, mendohet se fitoplazmat shkaktojnë më shumë se 300

sëmundje në specie të ndryshme të bimëve duke përfshirë pemët frutore, pyjet, pemët

dekorative, barërat, perimet, lulet dhe kulturat bujqësore (McCoy et al., 1989).

Ashpërsia dhe natyra e simptomave të sëmundjes varen nga bima dhe nga agjenti

fitoplazmatik. Disa bimë mund të mos shfaqin simptoma për vite me rradhë, madje

edhe kur përqëndrimi i fitoplazmave në inde është i lartë. Në raste të tjera, bimët

shkatërrohen shumë shpejt dhe vdesin megjithëse përqëndrimi i fitoplazmave në to

është shumë i vogël. Simptomat e sëmundjes variojnë nga bima në bimë dhe

përfshijnë zverdhje, ―xhuxhëri‖, vireshencë, zhvillim jo normal të luleve në struktura

gjethore, proliferim, ―fshesën e shtrigës‖, venitje deri në rënie (Kollar et al., 1990).

Kohët e fundit bazuar tek teknikat e biologjisë molekulare, është bërë progres i

rëndësishëm në zbulimin, identifikimin dhe studimin filogjenetik të fitoplazmave.

Madhësia e gjenomës së fitoplazmave varion nga 450 në 1180 kb (Davis et al., 1990;

Neimark and Kirkpatrick, 1991; Lim and Sears, 1991; Sears and Kirkpatrick, 1994).

Një shumëllojshmëri e teknikave molekulare, duke përfshirë analizën e plotë të

sekuencës 16S rADN, sekuencës specifike 16S-23S rADN dhe reaksionin zinxhir të

polimerizimit (PCR) me primera specifike, janë përdorur për ekzaminimin e shtameve

të ndryshme të fitoplazmave (Deng and Hiruki, 1990a, b, c, 1991a, b; Lee et al.,

1993b; Namba et al., 1993b; Gundersen et al., 1994a, b; Seemuller et al., 1994).

Njëmbëdhjetë grupe të ndryshme të gjenomave 16S rARN të fitoplazmave dhe më

shumë se 25 nëngrupe janë identifikuar në bazë të rezultateve të analizës RFLP të

ADN-së ribozomale (16S rADN) të shumëfishuar nëpërmjet PCR-së (Gundersen et al., 1994b, 1996; Lee et al., 1993b).

Ndërkohë, metodat e kontrollit duket se variojnë në mënyrë të konsiderueshme nga

një sëmundje tek tjetra, në varësi të tipit të patogjenit, bimës strehuese, ndërveprimit

ndërmjet patogjenit dhe bimës dhe shumë faktorëve të tjerë (Agrios, 2004). Studime

më të detajuara pritet të zbulojnë lidhjen midis strukturës së gjeneve dhe funksionit

për të mundësuar kontrollin e sëmundjes.

Me qëllim avancimin në këtë fushë të kërkimit nevojiten njohuri bazë rreth

epidemiologjisë, mekanizmit të patogjenitetit të fitoplazmave, ndikimit të faktorëve të

mjedisit në sëmundje, zhvillimit të simptomave dhe natyrës rezistente/tolerante të

bimëve strehuese. Kontrolli i shpërthimit të epidemive të sëmundjeve fitoplazmatike

teorikisht mund të kryhet me kontrollin e vektorëve, duke eleminuar patogjenin nga

bimët e infektuara të kulturave meristematike ose me përdorimin e antibiotikëve apo

kimikateve të tjera (Bertaccini, 2007).

Zhvillimi i disa teknikave molekulare kohët e fundit ka çuar në lindjen e linjave të

reja të kërkimit në fushën e fitoplazmologjisë. Kështu, është zbuluar se infeksioni



3

fitoplazmatik mund të sjellë prodhimin e proteinave mbrojtëse, rritjen e komponimeve

fenolike dhe mbiprodhimin e peroksidit të hidrogjenit në bimët strehuese (Junquera et

al., 2004; Musetti et al., 2000; 2005).

Sëmundjet fitoplazmatike të pemëve frutore në Europë përfshijnë tre çrregullime

ekonomikisht të rëndësishme: Apple Proliferation (AP), Pear Decline (PD) dhe

European Stone Fruit Yellows (ESFY). Raportime të kontrollit ndër vite për praninë e

këtyre infeksioneve në rajone të ndryshme të Europës flasin për prani, por nuk japin statistika të detajuara. Raportimet mbi praninë e fitoplazmave në Shqipëri adresojnë

kontrolle në tetë rrethe të ndryshme të Shqipërisë Juglindore dhe Qëndrore ku u

vërrejtën simptoma të European stone fruit yellows, Apple proliferation, Pear decline

dhe Grapevine yellows (Myrta et al., 2003).

1.1 Të dhëna të përgjithshme

Fitoplazmat, të njohura më parë si ―Mycoplasma-like organisms‖ ose MLOs, janë

baktere të specializuara, parazitë të detyruar të indeve floematike bimore dhe të disa

llojeve të insekteve. Fitoplazmat mendohet se kanë rrjedhur nga bakteret gram

pozitive dhe i përkasin gjinisë ―Candidatus Phytoplasma‖ të klasës Mollicutes

(IRPCM, 2004). Ato nuk mund të shumohen in vitro. Janë pleomorfike duke qënë se

ju mungon muri qelizor, kanë një diameter më të vogël se 1 mikrometër dhe gjenoma

shumë të vogla (680-1,600 kb). Gjenomat e fitoplazmave ndryshojnë shumë në

madhësi kur krahasohen me gjenomat e paraardhësve të tyre (baktere me mur qelizor

në grupin Bacillus/Clostridium). Fitoplazmave u mungojnë disa rrugë biosintetike për

sintezën e komponentëve të rëndësishëm për mbijetesën e tyre dhe ata mund ti

sigurojnë këto substanca nga bimët apo insektet ku parazitojnë (Bai et al., 2006).

1.1.1 Morfologjia

Mollicutes janë prokariotë. Ata janë mikroorganizma njëqelizorë, materiali gjenetik i

të cilëve (ADN) nuk është i rrethuar nga membrana, ndaj nuk është i organizuar në një

bërthamë. Qelizat e këtyre mikroorganizmave kanë citoplazëm ku janë të zhytura

ribozomet (70S) dhe ADN-ja. Citoplazma tek Mollicutes është e rrethuar vetëm nga

membrana plazmatike, ndryshe nga bakteret ku është e rrethuar nga membrana

plazmatike dhe muri qelizor gjithashtu (Agrios, 2004). Fitoplazmat mund të bëhen të

dukshme në materialet e infektuara me anë të mikroskopisë. Morfologjia e tyre shpesh

është përshkruar si pleomorfike (marrin forma të ndryshme; rrethore, filamentoze) me

diametër më pak se 1 µm (Lee et al., 2000). Duke qënë se rritja në kulturë in vitro

akoma nuk është bërë e mundur, kërkohet personel i kualifikuar në përdorimin e

teknikave, të cilat përfshijnë rajonizimin dhe fiksimin e ndjekur nga mikroskopia me

fluoreshencë me ngjyrimin DAPI apo dhe mikroskopia elektronike. Kohët e fundit

janë zhvilluar metoda të marrjes të bioimazheve duke përdorur ngjurues fluoreshentë

vitalë dhe mikroskopinë konfokale me lazer me skanim për të bërë të dukshme

fitoplazmat in situ (Christensen et al., 2004).



4

1.1.2 Përcaktimi i fitoplazmave

Fitoplazmat (më herët të quajtura organizma të ngjashme me mykoplazmat) i përkasin

klasës Mollicutes. Fitoplazmat rriten dhe riprodhohen vetëm në indet e gjalla të

bimëve strehuese. Ndryshe nga shumica e mykoplazmave humane dhe shtazore,

fitoplazmat nuk mund të rriten në terrene artificiale, duke përfshirë edhe terrenin ku

rriten të gjitha mykoplazmat tipike (Lee and Davis, 1992). Duke qënë së këta

patogjenë nuk rriten in vitro dhe janë të ―pakapshëm‖ tek bimët ku strehoen, njohuritë

në lidhje me karakteristikat e tyre biologjike janë të kufizuara (Christensen et al.,

2005). Kjo pamundësi e ka bërë të vështirë përcaktimin e statusit taksonomik të

fitoplazmave, me metodat tradicionale të aplikuara për prokariotët që rriten në terrene

artificiale. Aktualisht, për shkak të zhvillimit të teknikave molekulare është bërë i

mundur identifikimi i fitoplazmave duke u bazuar tek sekuenca e nukleotideve të

gjenit 16S rARN (Gundersen et al., 1994; Lim and Sears, 1989; Namba et al., 1993;

Sawayanagi et al., 1999; Seemüller et al., 1994). Antitrupat specifikë, probet e ADN-

së, profilet e RFLP-së dhe analizat e gjenit 16S rARN, janë përdorur gjerësisht dhe

kanë qenë shumë të dobishme për zbulimin dhe identifikimin e patogjenëve tek bimët

e dyshuara. Gjithashtu këto teknika kanë dhënë kontribut të rëndësishëm në grupimin,

klasifikimin e patogjenëve si dhe kontrollin e sëmundjeve (Agrios, 2004). Kohët e

fundit, për më tepër, është realizuar sekuencimi i gjenomave të plota të disa

fitoplazmave (Bai et al., 2006; Oshima et al., 2004; Christensen et al., 2005). Metodat

molekulare dhe proçedurat dedektuese të ndjeshme, të cilat u zhvilluan në dekadën e

kaluar, premtuan përparime të mëdha në diagnostikimin e sëmundjeve të shkaktuara

nga fitoplazmat dhe kanë lehtësuar karakterizimin e tyre (Davies and Clark, 1992;

Firrao et al., 1996).

1.1.3 Pozicioni filogjenetik i fitoplazmave

Fitoplazmat kanë diverguar nga eubakteret gram pozitive dhe i përkasin gjinisë

Phytoplasma brenda klasës Mollicutes dhe rendit Acholeplasmatales. Aktualisht

fitoplazmat janë në statusin Candidatus që përdoret për bakteret të cilat nuk mund të

kulturohen in vitro. Kohët e fundit, analizat filogjenetike bazuar në 16S rARN dhe

proteinat ribozomale të sekuencës së gjeneve kanë zbuluar se fitoplazmat formojnë

një grup të madh diskret, monofiletik, brenda klasës Mollicutes (Gundersen et al.,

1994). Grupet taksonomike të fitoplazmave bazohen në ndryshimet e madhësisë së

fragmenteve të prodhuara nga tretja e sekuencës të gjenit 16SrARN (RFLP) ose nga

krahasimi i sekuencave të ADN-së nga rajonet ndarëse 16S/23S (Hodgetts et al.,

2007).

Klasifikimi i fitoplazmave ka qënë i vështirë për një kohë të gjatë sepse për këtë grup

mungojnë karakteristika të qëndrueshme morfologjike (fenomeni i pleomorfisë që

përmendëm më lart) dhe se ato nuk kultivohen in vitro si bakteret. Vështirësitë për të

përdorur karakteristika morfologjike, biokimike dhe fiziologjike si kritere krahasimi

kanë bërë që studiuesit të hezitojnë për t‘i dhënë atyre një taksonomi të qartë dhe

raporte filogjenetike me mikroorganizmat e tjerë të ngjashëm me to.

Në vitet 1972-1973, duke u bazuar në studimet mbi grupin e sëmundjeve të

―zverdhjeve bimore‖, shkaktarët e tyre u klasifikuan në dy grupe: (i) spiroplazma,

organizma në formë spirale ose helike dhe të kultivueshme në kulturë in vitro; (ii)



5

mykoplazma, organizma që nuk kishin formë helike dhe që nuk kultivohen në

substrate artificiale, duke bërë të pamundur plotësimin e 4 postulateve të Koch për

identifikimin e patogjenëve bimorë.

Në vitin 1993, Komiteti Ndërkombëtar i Bakteriologjisë Sistematike (ICSB,

International Committee of Systematic Bacteriology) nëpërmjet Nënkomitetit për

Mollicutes vendosi të pranojë propozimin e B.C. Kirkpatrick dhe B.B. Sears, për

zëvendësimin e emrit të mykoplazmave të bimëve nga MLO në fitoplazma. Me këtë

rast u formuluan edhe kriteret specifike që duhet të plotësojnë mikroorganizmat për tu

klasifikuar si fitoplazma:

- mikroskopia elektronike me transmetim duhet të evidentojë formën e tyre

pleomorfike dhe mungesën e murit qelizor;

- të gjenden në tubat kribrozë të floemës dhe të jenë të lidhura me sëmundje me

simptoma si dobësim i përgjithshëm, zverdhje dhe/ose anomali të zhvillimit të

organeve, sidomos të luleve;

- ato transmetohen në natyrë nga cikadet, psillat, etj., që janë insekte që

ushqehen në floemën e bimëve strehuese;

- ato janë rezistente ndaj penicilinës, por janë shumë të ndjeshme ndaj

tetraciklinës;

- gjenoma e tyre është e vogël (530-1350 kb) dhe përbërja e binomit G

(guaninë) + C (citozinë) është e vogël dhe përfaqëson afro 23-29% të bazave

totale;

- analiza e sekuencave duhet të provojë që janë të lidhura filogjenetikisht me

Mollicutes të tjerë.

Vetëm përdorimi i biologjisë molekulare dhe rradhitjes së sekuencave nukleotidike,

nga fillimi i viteve ‗90, arriti të kapërcejë këto vështirësi duke siguruar kritere të reja

shkencore për klasifikimin e fitoplazmave. Analiza PCR/RFLP e fragmenteve të

veçanta të konservuara gjatë evolucionit të këtij grupi (gjenit 16S rARN) mundësoi

ndarjen e fitoplazmave në grupe ribozomike (16Sr) dhe identifikimin e shumë

nëngrupeve të tyre. Njohuritë e fituara në studimet gjenomike të fitoplazmave kanë

evidentuar qartë se taksonomia e bazuar vetëm në analizën e gjenit 16S rRNA nuk

ishte e mjaftueshme për të diferencuar fitoplazmat me ngjashmëri të lartë. Për këtë

qëllim sot përdoren sekuenca të tjera gjenomike që kodifikojnë proteina ribozomike si

rpL22 dhe rpS3, translokazën e membranës SecY dhe faktorin e zgjatjes së

traduksionit Tu, që japin informacione më të thelluara për klasifikimin dhe

taksonominë e fitoplazmave. Dhjetëvjeçari i parë i viteve 2000 u karakterizua nga

interesi në rritje për studimet e fitoplazmave. Për t‘u përmendur është krijimi i grupit

të parë studimor për fitoplazmat (International Phytoplasmologist Working Group), i

cili tani mblidhet rregullisht dhe kontribuon për grumbullimin dhe përhapjen e

njohurive mbi fitoplazmat. Ecuria e shpejtë e kërkimit në fushën e fitoplazmave bën

që klasifikimi i mësipërm të jetë provizor dhe sigurisht që do të pasurohet në të

ardhmen me specie të reja (Susuri L.R., and Myrta A., 2012).



6

Tabela 1.1 Klasifikimi i fitoplazmave sipas Wei et al., 2007. (*lloji i shtamit në anglisht)

(Dickinson et al., 2013).

Gr.16Sr Specia Candidatus Lloji i shtamit Numri në

bankën gjenetike

Shpërndarja

gjeografike

I-A Ca. Phytoplasma asteris Aster yellows witches‘ broom NC_007716 Amerika e Veriut,

Europë

I-B Ca. Phytoplasma asteris Onion yellows NC_005303 Në të gjithë globin I-C Ca. Phytoplasma asteris Clover phyllody AF222065 Amerike e Veriut,

Europë

I-D Ca. Phytoplasma asteris Paulownia witches‘ broom AY265206 Azi I-E Ca. Phytoplasma asteris Blueberry stunt AY265213 Amerika e Veriut

I-F Ca. Phytoplasma asteris Apricot chlorotic leaf roll AY265211 Spanjë

II-A Peanut witches‘ broom L33765 Azi

II-B Ca. Phytoplasma aurantifolia Lime witches‘ broom U15442 Gadishulli Arabik

II-C Cactus witches‘ broom AJ293216 Azi, Afrikë

II-D Ca. Phytoplasma australasiae* Papaya yellow crinkle YI0097 Australi III-A Ca. Phytoplasma pruni* Western X disease L04682 Amerika e Veriut

III-B Clover yellow edge AF189288 Amerikë, Azi, Europë

IV-A Ca. Phytoplasma palmae* Coconut lethal yellowing AF498307 Karaibe, Florida IV-B Ca. Phytoplasma palmae* Phytoplasma sp. LfY5(PE65) Oaxaca AF500334 Meksikë

IV-D Ca. Phytoplasma palmae* Carludovica palmate leaf yellowing AF237615 Meksikë

V-A Ca. Phytoplasma ulmi Elm yellows AY197655 Amerika e Veriut, Europë

V-B Ca. Phytoplasma zizphi Jujube witches‘ broom AB052876 Azi V-C Ca. Phytoplasma vitis* Alder yellows AY197642 Europë

V-G Jujube witches‘ broom related AB052879 Azi

VI-A Ca. Phytoplasma trifolii Clover proliferation AY390261 Amerika e Veriut, Europë

VII-A Ca. Phytoplasma fraxini Ash yellows AF092209 Amerika e Veriut

VIII-A Ca. Phytoplasma luffae* Loofah witches‘ broom AF353090 Taivan

IX-A Pigeon-pea witches‘ broom AF248957 Amerikë

IX-D Ca. Phytoplasma phoenicium Almond witches‘ broom AF515636 Lindje e Mesme

X-A Ca. Phytoplasma mali Apple proliferation AJ542541 Europë X-C Ca. Phytoplasma pyri Pear decline AJ542543 Europë

X-D Ca. Phytoplasma spartii Spartium witches‘-broom X92869 Europë

X-F Ca. Phytoplasma prunorum European stone fruit yellows AJ542544 Europë

XI-A Ca. Phytoplasma oryzae Rice yellow dwarf AB052873 Azi, Afrikë, Europë

XII-A Ca. Phytoplasma solani* Stolbur AJ964960 Europë

XII-B Ca. Phytoplasma australiense Australian grapevine yellows L76865 Australi

XII-C Strawberry lethal yellows AJ243045 Australi XII-D Ca. Phytoplasma japonicum Japanese hydrangea phyllody AB010425 Japoni

XII-E Ca. Phytoplasma fragariae Strawberry yellows DQ086423 Europë

XIII-A Mexican periwinkle virescence AF248960 Meksikë, Florida

XIV-A Ca. Phytoplasma cynodontis Bermudagrass whiteleaf AJ550984 Azi, Afrikë

XV-A Ca. Phytoplasma brasiliense Hibiscus witches‘ broom AF147708 Brazil XVI-A Ca. Phytoplasma graminis Sugar cane yellow leaf AY725228 Kubë

XVII-A Ca. Phytoplasma caricae Papaya bunchy top AY725234 Kubë

XVIII-A Ca. Phytoplasma americanum Potato purple top wilt DQ174122 Amerika e Veriut

XIX-A Ca. Phytoplasma castanae Chestnut witches‘ broom AB054986 Japoni XX-A Ca. Phytoplasma rhamni Buckthorn witches‘ broom X76431 Gjermani

XXI-A Ca. Phytoplasma pini Pine shoot proliferation AJ632155 Spanjë

XXII-A Ca. Phytoplasma cocosnigeriae* Coconut lethal decline Y14175 Mozambik, Afrikë

XXIII-A Buckli valley grapevine yellows AY083605 Australi

XXIV-A Sorghum bunchy shoot AF509322 Australi

XXV-A Weeping tea witches‘ broom AF521672 Australi XXVI-A Sugar cane Phytoplasma D3T1 AJ539179 Mauritius

XXVII-A Sugar cane Phytoplasma D3T2 AJ539180 Mauritius

XXVIII-A Derbid Phytoplasma AY744945 Kubë XXIX-A* Ca. Phytoplasma allocasuarinae Allocasuarina muelleriana

phytoplasma

AY135523 Australi

XXX-A* Ca. Phytoplasma cocstanzaniae* Tanzanian lethal decline X80117 Tanzani

1.2 Fitoplazmat dhe sëmundjet e lidhura me to

Prania e fitoplazmave është shoqëruar me një numër të gjerë sëmundjesh që prekin

bimët në mbarë botën. Simptomat që shfaqin bimët e infektuara variojnë në bazë të



7

bimës bujtëse, shtamit fitoplazmatik dhe faktorëve mjedisorë. Ndër simptomat e

vërrejtura bëjnë pjesë ndryshimi i ngjyrës së gjetheve në të verdhë ose lejla, petalet në

ngjyrë të gjelbër, shndërrimi i organeve lulore në struktura gjethore, Witches‘ broom,

humbje e vitalitetit e deri në vdekje të bimës.

Sëmundjet fitoplazmatike mund të zvogëlojnë në mënyrë të konsiderueshme rritjen

dhe prodhimin ose të reduktojnë dobinë e bimës apo produktit bimor. Bimët e

shëndetshme rriten dhe funksionojnë në maksimumin e potencialit të tyre gjenetik.

Megjithatë, bimët konsiderohen të infektuara kur ato janë të prekura negativisht nga

një agjent shkaktar i sëmundjes i cili pengon zhvillimin e tyre normal dhe funksionet

fiziologjike (Agrios, 2004). Diagnoza korrekte e shkaktarit të sëmundjes është një hap

thelbësor për të ndërtuar një strategji të përshtatshme për menaxhimin e sëmundjes

bimore. Zakonisht hapi i parë përfshin përcaktimin e shkakut të mundshëm të

sëmundjes: nëse sëmundja është shkaktuar nga një agjent infektiv (patogjen) ose nga

një faktor mjedisor. Sëmundjet e bimëve shkaktohen nga faktorë pa jetë (abiotikë, jo

parazitë, jo infektivë, jo patogjenë) dhe agjentë të gjallë (biotikë, parazitë, infektivë,

patogjenë) gjithashtu. Në anën tjetër, sëmundjet bimore grupohen duke u bazuar tek

agjenti shkaktar i përfshirë (sëmundje të defiçencës, sëmundje kërpudhore, sëmundje

bakteriale, sëmundje virale, sëmundje fitoplazmatike, etj), pjesa bimore e prekur ose

lloji i simptomave (Agrios, 2004).

Ndryshimet karakteristike të brendshme ose të jashtme që shfaq bima si reagim ndaj

agjentit që shkakton sëmundje, quhen simptoma. Patologjia bimore është studimi i

patogjenëve; faktorëve të mjedisit që shkaktojnë sëmundje tek bimët, metodave të

parandalimit ose kontrollit të sëmundjeve dhe reduktimit të dëmit që ato shkaktojnë.

Sëmundjet e pakontrolluara të bimëve mund të sjellin prodhim më të vogël ushqimor,

çmime më të larta të ushqimeve ose ushqime me cilësi të ulët (Agrios, 2004). Gjatë

dekadave të fundit, shkencëtarët e patologjisë bimore molekulare gjithashtu kanë

krijuar një seri të re të mjeteve dhe teknikave të cilat përdoren për zbulimin dhe

identifikimin e patogjenëve edhe kur ata janë në numër të vogël ose të përzier me

patogjenë të tjerë me të cilët lidhen ngushtësisht. Mjete të tilla përfshijnë dedektimin

me antitrupa monoklonalë, llogaritjen e përqindjes së hibridizimit të acideve nukleike

të tyre dhe përcaktimin e sekuencave të nukleotideve të acideve nukleike të

patogjenëve. Që nga mesi i viteve 1980, fragmente të ADN-së, të quajtura probe,

komplementare me segmente specifike të acideve nukelike të mikroorganizmave, janë

shënuar me izotope radioaktive ose flurorofore dhe janë përdorur gjerësisht për

zbulimin dhe identifikimin e patogjenëve të bimëve (Agrios, 1997; Soufi Z, 2012).

1.2.1 Transmetimi dhe përhapja e sëmundjeve të fitoplazmave

Në natyrë fitoplazmat transmetohen përmes vektorëve (insekte, etj), dukuri e cila

ndodh në masë. Insektet i mbartin fitoplazmat duke u ushyer me bimët e infektuara

dhe i transmetojnë tek bimët e shëndetshme pas një periudhe latente gjatë së cilës

fitoplazmat lëvizin dhe shumohen në trupin e vektorit. Insektet që i mbartin, mbeten

shpesh burim infeksioni gjatë gjithë ciklit jetësor të tyre. Vektorët e fitoplazmave i

përkasin rendit Hemiptera dhe përbëhen nga tre grupe taksonomike kryesore:

leafhopper (Auchenorrhyncha: Cicadellidae), planthopper (Auchenorrhyncha:

Fulgoromorpha), dhe psillat (Sternorrhyncha: Psyllidae) (Weintraub and Beanland,

2006; Ploaie, 1981). Këto insekte kanë një metabolizëm dhe mënyrë të ushqyeri, e



8

cila favorizon transmetimin e fitoplazmave. Ato janë hemimetabolikë, ndaj ashtu si të

rriturit edhe larvat zotërojnë të njëjtën mënyrë të ushqyeri, për rrjedhojë që të dy janë

të aftë ti transmetojnë fitoplazmat. Për më tepër, ata kryesisht ushqehen me lëndët e

gjendura në floemë duke përdorur një mekanizem thithës jo destruktiv, i cili

parandalon dëmtimin e indit përçues dhe eliminon mundësinë e induktimit të një

përgjigjeje mbrojtëse (Dickinson et al., 2013).

Identifikimi i saktë i specieve të insekteve vektorë të përfshira në transmetimin e

fitoplazmave është një kusht kryesor për të menaxhuar në mënyrë sa më të mirë

përhapjen e tyre dhe ngritjen e planeve të veprimit për parandalim. Taksonomia e

vektorëve të fitoplazmave tradicionalisht është bazuar në karakterisikat morfologjike.

Zakonisht morfologjia e jashtme e trupit mundëson identifikimin deri në nivel familje

dhe gjinie, ndërkohë që morfologjia gjenitale përdoret për të përcaktuar speciet.

Fatkeqësisht identifikimi i tipareve dalluese është shpesh i vështirë dhe kërkon

eksperiencë. Një eksperiencë e tillë zotërohet vetëm nga një numër i vogël

specialistësh entomologë të fokusuar në klasa specifike insektesh. Për më tepër

taksonomia në nivel specie është kryesisht e bazuar në morfologjinë gjenitale të

individëve të rritur meshkuj, dukuri e cila vështirëson identifikimin e individëve në

fazë rinore dhe atyre femra (Bosco and Tedeschi, 2013).

1.2.2 Aspekte të epidemiologjisë së fitoplazmave

Fitoplazmat përhapen më së shumti nëpërmjet insekteve të familjes Cicadellidae

(leafhoppers), Fulgoridae (planthoppers) dhe Psyllidae, të cilat ushqehen tek indet e

floemës të bimëve të infektuara duke marrë fitoplazmat dhe duke i transmetuar ato tek

bimët fqinje ku ato ushqehen. Për këtë arsye gama e strehuesve të fitoplazmave varet

nga insektet vektorë. Fitoplazmat përmbajnë një proteinë të madhe antigjenike që

përbën shumicën e proteinave sipërfaqësore të qelizës. Kjo proteinë është zbuluar se

ndërvepron me komplekset e mikrofilamenteve të muskujve të zorrës së hollë të

insekteve dhe mendohet se është e rëndësishme në transmetimin e infeksionit (Suzuki

et al., 2006; Hoshi et al., 2007). Fitoplazmat mund të dimërojnë tek insektet vektorë

ose në bimët shumëvjeçare; ato mund të kenë ndikime të ndryshme tek strehuesit e

tyre specifikë (Christensen et al., 2005). Fitoplazmat gjenden në shumicën e organeve

të insekteve vektorë. Ato hyjnë në trupin e insekteve nëpërmjet rostrumit, lëvizin

përmes zorrës së hollë dhe kalojnë në hemolimfë. Prej aty ato vazhdojnë të

kolonizojnë gjendrat e salivës (pështymës), një proçes i cili mund të zgjatë disa javë.

Koha midis proçesit të thithjes së fitoplazmave nga insektet vektorë dhe arritjes së

përqëndrimit infektiv në gjendrat e pështymës (mundësia për tu transmetuar) quhet

periudha latente. Disa transmetime të fitoplazmave në insekte janë raportuar si

transovariale (transmetimi i patogjenëve nëpërmjet organizmave) të tilla si për

kombinimet Scaphoideus titanus/aster yellows (Danielli et al., 1996; Alma et al.,

1997); Hishimonoides sellatiformis/mulberry dwarf (Kawakita et al., 2000),

Matsumuratettix hiroglyphicus (Matsumura)/sugarcane white leaf (Hanboonsong et

al., 2002) dhe Cacopsylla melanoneura (Tedeschi et al., 2006). Fitoplazmat dhe disa

viruse që infektojnë bimët mund të transmetohen nga bimët e infektuara tek ato të

shëndetshme nëpërmjet kuskutave (Cuscuta sp.). Transmetimi eksperimental i

fitoplazmave nga bimët e infektuara tek ato të shëndetshme të të njëjtës specie ose të

specieve të ndryshme, mund të realizohet në laborator ose në serë. Kohët e fundit

është marrë në studim mundësia e transmetimit të fitoplazmave nëpërmjet farave. Pas



9

dyshimeve të para lidhur me përhapjen epidemiologjike të coconut lethal yellowing

(Cordova et al., 2003) studime të tjera mbi kulturat e alfalfa (Medicago sativa L.) të

prekura ashpërsisht nga fitoplazmat, verifikojnë mundësinë e transmetimit të

fitoplazmave nëpërmjet farave (Khan et al., 2002a; Botti and Bertaccini, 2006a).

Fitoplazmat mund të përhapen gjithashtu nëpërmjet shumimit vegjetativ siç është

shartimi i një bime të shëndetshme me një pjesë nga bima e infektuar, mikroshumimi

apo edhe mënyra të tjera që përdoren për shumimin e gjermoplazmës të bimës duke

shmangur shumimin seksual. Fitoplazmat janë në gjendje të lëvizin nëpërmjet gypave

shoshë të floemës nga burimi drejt pjesëve të tjera (Christensen et al., 2004). Disa

studime kanë treguar shpërndarje të pabarabartë të fitoplazmave tek bimët strehuese

(Seemüller et al., 1984) dhe një luhatje sezonale të popullatave të patogjenit tek drurët

strehues. Në përgjithësi, niveli i fitoplazmave është i ulët në rrënjë dhe mesatar në

kërcej. Përqëndrimi më i lartë është gjendur tek organet burimore (gjethe të

maturuara) rreth 40 herë më i lartë së në rrënjë. Përqëndrimi i lartë i fitoplazmave në

rajonet burimore tregon se fitoplazmat shumohen më shpejt aty. Është raportuar një

variacioni në sasinë e ADN-së së fitoplazmave midis bimëve individuale të shartuara

me material nga një bimë prindërore e infektuar (Christensen et al., 2004). Për drurët

gjetherënës, mendohet që fitoplazmat zhduken nga pjesët ajrore të pemës gjatë dimrit

dhe jetojnë në sistemin rrënjor, për të rikolonizuar më pas kërcejtë dhe gjethet në

pranverë (Seemüller et al., 1984, Guthrie et al., 1998). Prania e fitoplazmave në

dimër, në pjesët ajrore të kultivarëve të dardhës dhe specieve të gjinisë Prunus është

raportuar nga Errea et al. (2002) dhe Jarausch et al. (1999b).

1.2.3 Sëmundjet fitoplazmatike dhe rëndësia e tyre ekonomike

Fitoplazmat janë të lidhura me sëmundjet e bimëve në qindra specie bimore të

ndryshme duke përfshirë shumë ushqime të rëndësishme, perime, fruta, bimë

zbukuruese dhe drurë të tjerë (Ahrens et al., 1993; Andersen et al., 1998; Davis et al.,

1998; Errampalli et al., 1991; Zreik et al., 1995). Lista e sëmundjeve që shkaktohen

nga fitoplazmat vazhdon të rritet. Shumë sëmundje të reja janë identifikuar vitet e

fundit, ose sëmundje të njohura janë lidhur me fitoplazmat si shkaktarë të tyre.

Fitoplazma të caktuara kanë përhapje gjeografike të ndryshme si sëmundja Citrus

Huanglongbing e cila lidhet me fitoplazmën aster yellows në Kinë (16SrI) (Chen et

al., 2008) dhe me fitoplazmën pigeon pea witches’ broom (16SrIX) në Brazil

(Teixeira et al., 2009). Shumë nga bimët e kultivuara janë të prekura nga infeksionet

fitoplazmatike jo vetëm në vendet ku bujqësia nuk është ende e zhvilluar, por

gjithashtu edhe në vendet që njihen si të avancuara në këtë drejtim, ku këta patogjenë

janë duke ndikuar ashpërsisht tek bimët barishtore dhe ato drunore gjithashtu

(Bertaccini, 2007). Infeksionet fitoplazmatike janë faktorët kryesorë limitues për

prodhimin e shumë kulturave bimore në gjithë botën. Për shembull, fitoplazma aster

yellows kontribuon në humbjet e mëdha ekonomike të shumë perimeve (p.sh. sallata

jeshile, karota dhe selino) dhe bimëve zbukuruese (p.sh. gladiola, hydrangea, China

aster, dhe purple coneflower) në Amerikën e Veriut dhe disa pjesë të Europës. Peach

yellows dhe X-disease gjatë viteve 90 kanë ndikuar në humbjen e prodhimit të

pjeshkëve dhe qershive në Amerikë. Në disa rajone të Lindjes së Mesme, agrumet

preken nga sëmundjet fitoplazmatike të tilla si lime witches‘ broom, që pothuajse po

eleminon prodhimin tradicional të limonit në Oman dhe në Iran. Rice yellow dwarf

prek kulturat e orizit në rajone të ndryshme të Azisë Juglindore; potato witches‘



10

broom dhe maize bushy stunt janë përgjegjës për humbjen e prodhimit të patates dhe

misrit, respektivisht në Amerikën Qëndrore dhe atë të Jugut. Sweet potato witches‘

broom dhe sëmundje të lidhura me të janë përgjegjëse për humbjen e prodhimit të

patates së ëmbël në Azi dhe Australi, cassava witches‘ broom për humbjen e

kulturave të cassava në Amerikën e Jugut; grapevine yellows influencon ashpërsisht

prodhimin e rrushit në Europë dhe Australi. Pear decline, Apple proliferation,

European stone fruit yellows dhe sëmundje të tjera reduktojnë prodhimin dhe cilësinë

e frutave të freskëta në Europë; sëmundjet e bimëve bishtajoreve të tilla si peanut

witches‘ broom, sesame dhe soybean phyllody shkaktojnë humbjen e këtyre kulturave

në Azi. Në anën tjetër, edhe pyjet gjithashtu dëmtohen rëndë nga sëmundjet e lidhura

me fitoplazmat si paulownia witches‘ broom, coconut lethal yellowing, dhe mulberry

dwarf që reduktojnë praninë e këtyre specieve drunore në kontinente të ndryshme.

Elm yellows ose witches‘ broom është një sëmundje, e cila pothuajse ka eleminuar të

gjitha plantacionet e reja dhe ato të vjetra në Europë dhe në Amerikën e Veriut; tek

bimë të veçanta të cilat i mbijetuan epidemisë të rëndë të sëmundjes dutch elm disease

u shkatërruan nga infeksione fitoplazmatike pasuese (Sinclair et al., 1996; Bertaccini,

2007). Për shkak të këtyre sëmundjeve, transporti i shumë specieve bimore të prekura

duhet të ndalohet në nivel ndërkombëtar nga rregullat e karantinës (Lee et al., 2000;

Bertaccini, 2007).

1.2.4 Disa fitoplazmoza të rëndësishme të drufrutorëve

Sëmundjet fitoplazmatike të pemëve frutore në Europë përfshijnë tre çrregullime

ekonomikisht të rëndësishme: Apple Proliferation (AP), Pear Decline (PD) dhe

European Stone Fruit Yellows (ESFY).

1.2.4.1 Apple proliferation

Sëmundja: Fshesa e mollës (Apple proliferation)

Shkaktari: Fitoplazma e fshesës së mollës

Specia: Candidatus Phytoplasma mali

Grupi filogjenetik: Apple proliferation

AP njihet vetëm në Europë dhe për herë të parë është identifikuar në Trentino rreth

viteve 50 (Rui, 1950). Ndikimi më i madh në bujqësi lidhet me faktin se bimët e

infektuara vazhdojnë të vegjetojnë duke prodhuar fruta të vegjël dhe të

papërshtatshëm për shitje. Kultivarët e mollës të cilët preken janë pothuajse të gjithë

ata që gjenden në zonat kryesore të rritjes të mollëve në Europë (Minoiu and Craciun,

1983; Bliefernicht and Krczal, 1995, Marcone et al., 1996a; Seemüller et al., 1998).

Këtu mund të përmendim Golden Delicious dhe Renetta e Kanadasë shartuar mbi

nënshartesa të ndryshme. Kohët e fundit sëmundja është raportuar edhe në Shqipëri

dhe Kosovë por nuk njihet shkalla e përhapjes së saj (Susuri dhe Myrta, 2012).

Apple proliferation është një nga sëmundjet fitoplazmatike më të rëndësishme të

mollës, që prek pothuajse gjithë kultivarët, duke reduktuar madhësinë (rreth 50%),

peshën (nga 63-74%), cilësinë e frutit, si dhe ul energjinë e pemës duke e bërë atë më

të prekshme nga sëmundjet mykotike. Sëmundja u zbulua gjithashtu edhe tek



11

gjenotipet rezistente ndaj sëmundjeve kërpudhore të mollës (Loi et al., 1995). Apple

proliferation është raportuar vetëm nga rajoni EPPO. Molla është mbartësi kryesor i

―Ca. P. mali‖. Kultivarët ndryshojnë në reagim por shumica, duke përfshirë fidanët,

janë të ndjeshëm. Sëmundja mund të shihet tek kultivarët ose nënshartesat si edhe tek

Malus i egër apo i kultivuar. Gjithashtu ―Ca. P. mali‖ është gjendur tek lajthia

(Corylus spp.) (Marcone et al., 1996b), qershia (Prunus avium), kajsia (P. armeniaca)

dhe kumbulla (P. domestica) (Mehle et al., 2007). Simptoma më tipike e shkaktuar

nga ―Ca. P. mali‖ është ―fshesa e shtrigës‖ në fund të degëve. Tek pemët e infektuara,

gjethet janë më të vogla dhe më të dhëmbëzuara, zakonisht me ndajgjethëza të mëdha.

Frutat janë më të vegjël, të rrafshuar dhe me bisht të gjatë. Skuqja e herët e gjethes

është një indikacion i saktë për praninë e sëmundjes. Vëzhgimet fushore të realizuara

në plantacionet me mollë në Italinë verilindore dhe veri-perëndimore zbuluan se C.

melanoneura është insekti më i përhapuri (Alma et al., 2000; Tedeschi et al., 2002).

Përhapja e fitoplazmave në pemë nuk është konstante përgjatë vitit. Në dimër numri i

fitoplazmave zvogëlohet për shkak të degjenerimit të gypave shoshë. Ato

përqëndrohen më tepër tek rrënjët dhe gjatë periudhës Prill-Maj, ripushtojnë gjithë

pjesët e tjera të bimës duke arritur pikun në verën e vonë ose vjeshtën e herët

(Seemüller et al., 1984a and b). Modeli i shpërndarjes të fitoplazmave në pemë varet

gjithashtu nga temperatura. Në Francë, fitoplazmat mund të gjenden gjithandej në

temperatura nga 21-25°C, duke shkaktuar simptoma; nga 29-32°C simptomat

frenohen dhe fitoplazmat gjenden vetëm në rrënjë, por ripushtojnë kërcejtë kur

bimëzat rruhen në një temperaturë më të ulët. Kur një pemë inokulohet me një syth të

infektuar, simptomat e para do shfaqen gjatë vitit pasardhës, më së shumti tek degët e

reja. Kur kryhet tek nënshartesat, agjenti shkaktar prodhon simptoma në rritjen e parë

të kalemave. Infeksioni duket se lokalizohet më së shumti tek rrënjët. Edhe pse në

Europë sëmundja AP prek shumicën e varieteteve të pemëve të mollës, ajo shkaktohet

nga një patogjen relativisht homogjen që është i lidhur ngushtësisht me fitoplazmat që

shkaktojnë ESFY (Duduk B, 2009).

1.2.4.2 Plum Leptonecrosis

Sëmundja: Nekroza e kumbullës (Plum leptonecrosis)

Shkaktari: Fitoplazma e zverdhjes evropiane e bërthamorëve

Specia: Candidatus Phytoplasma prunorum

―Candidatus Phytoplasma prunorum‖ është një patogjen prokariot i rëndësishëm që

infekton bërthamorët e Europës. Ai njihet që shkakton disa çrregullime të Prunus spp.

me impakt të fuqishëm në ekonomi, të cilat referohen si European stone fruit yellows

(ESFY) (Lorenz et al., 1994; Seemüller and Foster, 1995; Seemüller et al., 1998a).

Ky organizëm është ngushtësisht i lidhur me patogjenë të rëndësishëm të dru

frutorëve si agjentët shkaktarë të apple proliferation (AP), pear decline (PD) dhe

agjentët e peach yellow leaf roll (PYLR). Së bashku formojnë një grup të ndryshëm

filogjenetik, grupin AP ose 16SrX. Ashtu si fitoplazmat e dru frutorëve të tjerë të

grupit AP, ―Ca. P. prunorum‖ shfaq një specificitet të lartë për strehuesin. Në natyrë,

ky patogjen është raportuar se infekton vetëm specie të gjinisë Prunus dhe

transmetohet nga një specie insekt vektor, Cacopsylla pruni (Psyllidae) (Carraro et

al., 1998a; Weintraub and Beanland, 2006). Gjithashtu ―Ca. P. prunorum‖ përfshin



12

shtame të cilat paraqesin ndryshime të mëdha përsa i përket virulencës (Kison and

Seemüller, 2001). ―Candidatus Phytoplasma prunorum‖ është një patogjen prokariot

që infekton bërthamorët në Europë dhe njihet se shkakton apricot chlorotic leaf roll të

kajsisë (Prunus armeniaca), leptonekrozën e kumbullës Japoneze (P. salicina), yellows dhe decline të pjeshkës (P. persica), kumbullës europiane (P. domestica),

bajames (P.dulcis) dhe qershisë (P. serrulata). Humbjet më të mëdha ekonomike janë

rregjistruar tek plantacionet e kajsisë dhe kumbullës Japoneze, ku niveli i infeksionit tek kultivarët e prekur mund të jetë mbi 50% dhe plantacionet bëhen joproduktivë tetë

deri në dhjetë vjet mbas mbjelljes. ESFY është bërë një pengesë e madhe për

prodhimin e suksesshëm të kajsisë në gjithë Europën Qëndrore dhe disa shtete të

Europës Jugore. Për shkak të rëndësisë ekonomike ―Ca. P. prunorum‖ është një prej

fitoplazmave të studiuara më intensivisht. Studimet molekulare duke përdorur

hibridizimin Southern blot, restriction fragment length polymorphism (RFLP) dhe

analizën e sekuencës të ADN-së ribozomale (rADN) dhe jo ribozomale të

shumëfishuar nëpërmjet PCR, treguan se ―Ca. P. prunorum‖ është një organizëm

relativisht homogjen në të gjithë Europën (Ahrens et al., 1993; Lorenz et al., 1994;

Kison et al., 1997; Jarausch et al., 1998a, 2000a; Seemüller et al., 1998b; Seemüller

and Schneider, 2004). Ky patogjen është filogjenetikisht i lidhur me agjentët

shkaktarë të apple proliferation (AP), pear decline (PD), dhe peach yellow leaf roll

(PYLR), shkaktarët e sëmundjeve më të mëdha të drufrutorëve gjetherrënës, të cilët

janë pjesëtarë të një grupi të ndryshëm filogjenetik, grupit AP ose 16SrX, brenda

bashkësisë të fitoplazmave (Seemüller et al., 1998a; IRPCM, 2004; Seemüller and

Schneider, 2004). Agjenti i ESFY është dukshëm i ndryshëm nga X-disease

phytoplasma, një patogjen i rëndësishëm i Amerikës së Veriut dhe nga ―Ca. P.

phoenicium‖ që infekton Prunus spp. në Azi dhe shtetet e Afrikës së Veriut. Agjenti i

ESFY gjithashtu dallon nga disa shtame të ndryshme të fitoplazmave që janë

transmetuar nga pemët e kajsive, qershive dhe kumbullave Japoneze të infektuara tek

strehuesi eksperimental Catharanthus roseus (periwinkle). Këta shtame janë pjesëtarë

edhe të grupit të fitoplazmave aster yellows, the stolbur ose X-disease (Ahrens et al.,

1993; Lorenz et al., 1994; Seemüller et al., 1998a; Marcone et al., 1999a). ―Ca. P.

prunorum‖ njihet se ndodh në shumicën e Europës qëndrore e jugore dhe gjithashtu

në Anglinë e veriut dhe atë juglindore (Seemüller et al., 1998a, 1998b; Davies and

Adams, 2000; Topchiiska et al., 2000; Delic´ et al., 2008; Laimer and Bertaccini,

2008). Ajo gjithashtu është raportuar në Turqi dhe Azerbajxhan (Jarausch et al.,

2000a; Sertkaya et al., 2005; Danet et al., 2007). Ka mundësi që ky patogjen të jetë i

pranishëm kudo ku rriten dru frutorët bërthamorë në Europë si dhe në shtetet jo

Europiane (Seemüller and Foster, 1995).

Fitoplazmat EFSY prodhojnë sindroma të sëmundjeve komplekse, të tilla si çelja e

hershme e sytheve, përdredhja e gjetheve, kloroza e gjetheve, deformimi i frutave,

nekroza e floemës dhe deri tek rrënia e pemës së kumbullës (Carraro et al., 1998). Në

Iran, kohët e fundit janë zbuluar fitoplazmat që i përkasin grupeve 16SrII dhe

16SrXII, me simptoma të tilla si gjethe të vogla, përdredhje e gjetheve, rozeta dhe

zverdhje (Zirak et al., 2009). Të dhënat tregojnë se Prunus spp. janë tepër të ndjeshme

ndaj një numri linjash fitoplazmash me diversitet gjenetik dhe kanë përhapje

gjeografike të gjerë (Gámez-Jiménez et al., 2009).



13

1.3. Menaxhimi dhe kontrolli i sëmundjeve fitoplazmatike

Metodat e kontrollit variojnë në mënyrë të konsiderueshme nga një sëmundje tek

tjetra, në varësi të tipit të patogjenit, bimës strehuese, ndërveprimit ndërmjet

patogjenit dhe bimës dhe të shumë faktorëve të tjerë (Agrios, 2004). Shumica e

sëmundjeve serioze të kulturave bimore shfaqen tek disa bimë në një zonë, vit mbas

viti, përhapen shpejt dhe është shumë e vështirë ti luftosh, mbasi ato kanë filluar të

zhvillohen. Prandaj, pothuajse të gjitha metodat e kontrollit kanë për qëllim mbrojtjen

e bimëve më tepër se kurimin e tyre mbasi janë infektuar (Agrios, 2004). Në

kontrollin e sëmundjeve fitoplazmatike, shqetësimi kryesor është më tepër

parandalimi se trajtimi, për arsye se nuk ka kurë të njohur për këto lloj infeksionesh.

Megjithatë, bimët e infektuara ose indet në fazën e fjetjes mund të ―çlirohen‖ nga

fitoplazmat nëpërmjet trajtimit me nxehtësi (Soufi Z, 2012).

1.3.1. Strategjia e parandalimit

Të shumosh nëpërmjet farave ose nëpërmjet bimëve të painfektuara me fitoplazma, do

të thotë të zgjedhësh materialin për shumim nga burime të njohura, pa sëmundje

fitoplazmatike ose të indeksuara si të tilla. Eleminimi i barërave të këqinj dyvjeçarë,

shumëvjeçarë që shërbejnë si strehues dhe çrrënjosja e bimëve të infektuara sa më

herët të jetë e mundur është tepër e rëndësishme. Kështu largimi i bimëve të

infektuara me fitoplazma, eleminon burimin e infeksionit. Prandaj zbulimi dhe

diagnoza e hershme, e shpejtë, e ndjeshme dhe specifike e fitoplazmave është shumë e

rëndësishme për strategjitë parandaluese efektive, në veçanti sepse fitoplazmat mund

të kenë një periudhë latente të gjatë. Gjithësesi, strategjia më premtuese për të

shmangur fitoplazmat është identifikimi ose zhvillimi i varieteteve bimore rezistente

(Welliver, 1999). Me qëllim avancimin në këtë fushë të kërkimit nevojiten njohuri

bazë rreth epidemiologjisë, mekanizmit të patogjenitetit të fitoplazmave, ndikimit të

faktorëve të mjedisit në sëmundje, zhvillimit të simptomave dhe natyrës

rezistente/tolerante të bimëve strehuese.

1.3.2. Kontrolli i insekteve vektorë

Kur patogjeni futet ose përhapet nëpërmjet insektit vektor, kontrolli i vektorit është aq

i rëndësishëm dhe ndonjëherë më i lehtë se kontrolli i vetë patogjenit. Në rastin e

viruseve, fitoplazmave dhe baktereve shumë të vogla, insektet përbëjnë agjentin më të

rëndësishëm të përhapjes. Kontrolli i insekteve ka qënë i dobishëm në kontrollin e

përhapjes së sëmundjeve vetëm kur është kryer brenda zonës dhe tek bimët në të cilat

insektet kanë dimëruar apo janë ushqyer para se të hyjnë në kulturat bimore. Kontrolli

i sëmundjeve të tilla duke vrarë insektet vektorë me insekticide, pasi ata kanë hyrë tek

kulturat bimore, nuk është i mjaftueshëm. Për këtë arsye, në rastet kur njihet insekti

vektor dhe periudha e shfaqjes së tij është e njohur, programet e përdorimit të

insekticideve mund të rezultojnë të vlefshme kur praktikohen drejt insekteve të cilët

nuk janë vendosur ende në bimë. Në mënyrë tipike insekticidet kanë vlerë të limituar

duke qenë se insektet vektorë migrojnë dhe mund të transmetojnë fitoplazmat para se

insekticidet ti vrasin ata (Agrios, 2004).



14

1.3.3. Strategjia e menaxhimit

Duke qenë se fitoplazmave u mungon muri qelizor, ato janë rezistente ndaj

antibiotikëve të cilët bashkëveprojnë me murin qelizor si penicilina, ndërsa antibiotikë

të tjerë me mënyra alternative veprimi si tetraciklina mund të pengojnë rritjen e tyre

(bakteriostatik ndaj fitoplazmave). Prandaj, lehtësimi i simptomave të sëmundjes

mund të arrihet eksperimentalisht duke injektuar antibiotikun tetraciklinë, por pa

përdorimin e vazhdueshëm të antibiotikut, simptomat e sëmundjes do rishfaqen

përsëri (Davis et al., 1968). Përveç kësaj, trajtimi me antibiotikë është i kushtueshëm

dhe kërkon kohë. Kështu, strategjia më e mirë është aplikimi i një programi eleminimi

efiçient. Si konkluzion, e vetmja mënyrë dinamike për të kontrolluar infeksionin

fitoplazmatik ka qënë përdorimi i materialeve të pastra, të garantuara ose gjetja e

varieteteve bimore rezistente, tolerante ndaj insekteve vektorë të fitoplazmave.

1.3.4. Perspektivat për kontrollin e sëmundjeve fitoplazmatike

Kontrolli i shpërthimit të epidemive të sëmundjeve fitoplazmatike teorikisht mund të

kryhet me kontrollin e vektorëve, duke eleminuar patogjenin nga bimët e infektuara të

kulturave meristematike apo me përdorimin e antibiotikët ose kimikate të tjera

(Bertaccini, 2007). Tani, kontrolli i insekteve vektorë duke përdorur pesticidet është

mjeti i zgjedhur për të limituar shpërthimin e sëmundjeve fitoplazmatike. Përveç

kushteve të mjedisit, efiçienca e kësaj qasjeje është shumë larg nga ajo që ne duam

dhe sëmundjet fitoplazmatike vazhdojnë të jenë epidemike në vende të ndryshme të

botës, pavarësisht nga përdorimi i madh i trajtimeve me insekticide (Firrao et al.,

2007). Nga ana tjetër, heqja e burimeve të inokulimit është e mjaftueshme në rastin e

sëmundjeve të shkaktuara nga Mollicutes, të përhapura nga vektorët monofagë të cilët

ushqehen tek bimët e prekura.

Në mënyrë të ngjashme, është më e lehtë të kontrollosh insektet monofagë që

riprodhohen tek bima e prekur se insektet që realizojnë ciklin e tyre tek bimët e egra.

Gjithashtu, është i mundur kontrolli i bimëve të infektuara nëpërmjet antibiotikëve ose

duke stimuluar prodhimin e antitrupave specifikë. Në njërën anë përdorimi i

antibiotikëve është shumë i kushtueshëm, pak i lejuar ose i ndaluar në disa shtete, jo

gjithmonë efiçient kur aplikohet për një kohë të gjatë dhe në anën tjetër prodhimi i

bimëve transgjenike thjesht për të prodhuar antitrupa kundër këtyre patogjenëve është

ende shumë larg (Le Gall et al., 1998; Chen and Chen, 1998; Bertaccini, 2007).

Hulumtimet e fundit po hedhin dritë mbi disa aspekte të biologjisë së fitoplazmave

dhe marrëdhënieve me strehuesit. Ndërhyrja në kolonizimin e fitoplazmave të trupit të

insektit ose thithja e nutrientëve të tyre në floemën e bimës është objektivi kryesor për

mbrojtjen e bimëve pa përdorimin e përbërjeve toksike.



15

Figura 1.1 Krahasimi i madhësisë së gjenomës të fitoplazmave dhe baktereve të ndryshme.

Është treguar madhësia e gjenomës të Mesorhizobium loti, Escherichia coli K-12 MG1655,

Staphylococcus aureus subsp. aureus N315, ―Ca. P. asteris‖ OY-M strain dhe Mycoplasma

genitalium G37. Oshima et al. (2013).

Identifikimi i barrierave për kolonizimin e fitoplazmave në trupin e insektit është

parakusht për zhvillimin e strategjive të zhvillimit për reduktimin e infeksionit të

popullatave të vektorëve. Nga ana tjetër, thithja e nutrientëve të fitoplazmave nga

floema e bimës mund të jetë objektivi për reduktimin e shumëfishimit të patogjenit

dhe shprehjen e simptomave tek strehuesit e tyre. Shpresohet se këto risi do të çojnë

në mbrojtjen e bimëve pa përdorimin e përbërësve toksikë (Firrao et al., 2007).

Prandaj një mënyrë e vërtetë për të kontrolluar infeksionet fitoplazmatike është

parandalimi i shpërthimit të epidemive duke prodhuar material të pastër ose duke

gjetur varietete rezistente ndaj fitoplazmave (Dai et al., 1997; Carraro et al., 1998;

Kison and Seemüller, 2001; Jarausch et al., 1999a; 2007; Seemüller et al., 2007).

Njohuritë rreth mekanizmit të rezistencës të strehuesve ndaj fitoplazmave janë

gjithashtu të pakta njësoj si strategjitë efektive të menaxhimit të këtyre sëmundjeve.

Përpjekjet për identifikimin e gjermoplazmës që kodon rezistencën natyrale të

Mollicutes dhe inkorporimin e gjeneve të tilla nëpërmjet programeve të seleksionit

ose rritjes vazhdojnë tek disa bimë dhe pemë përfshirë pemët frutore (Thomas and

Hassan, 1992; Ponnuswami and Irulappan, 1993; Thomas and Mink, 1998; Seemüller

et al., 1992; 1998b; 1998c; Sinclair et al., 1997a; b). Kjo mund të përfshijë

rezistencën ndaj vetë patogjenit ose ndaj insektit vektor. Proteinat e lidhura me

mbrojtjen e bimës, të njohura për gjendjen e tyre aktive në përgjigjen e strehuesit ndaj

invazionit nga tipe të tjerë të patogjenëve, mund të ndodhin ndaj infeksioneve të

Mollicutes. Konfirmimi i kësaj hipoteze do të kërkojë demonstrimin se përbërja është

në vendin e duhur në kohën e duhur dhe është e pranishme në përqëndrime efektive

(Garnier et al., 2001). Çelësi për të mbajtur këto sëmundje nën kontroll është testimi

rigoroz i materialit bimor dhe monitorimi i rregullt i insekteve vektorë.

1.4. Gjenomika dhe mekanizmi i patogjenitetit

Simptomat e shkaktuara nga fitoplazmat në bimë sugjerojnë interferencë të

mekanizmave të sinjalizimit bimor dhe/ose të metabolizmit të hormoneve. Studimet

fiziologjike kanë treguar reduktim të niveleve të niseshtesë në rrënjët e pemëve

frutore të infektuara me fitoplazma, nga gjysëm deri në një të tretën e sasisë normale,

dhe grumbullimin e niseshtesë dhe karbohidrateve të tjera në gjethe. Eksperimentet e



16

bazuara në shënimin radioaktiv kanë konfirmuar se transporti i lëndëve të formuara

gjatë fotosintezës nga fidanët drejt rrënjëve dhe nga gjethet e vjetra drejt të rejave

është i pabarabartë në bimët e infektuara nga fitoplazmat. Studimet metabolike në

Madagaskar periwinkle kanë treguar një grumbullim në gjethe të metabolitëve të

lidhur me biosintezën e fenilpropanoideve dhe metabolitëve sekondarë terpenoidikë

së bashku me grumbullimin e sukrozës, glukozës, glicinës, polifenoleve, dhe acidit

suksinik (Choi YH et al., 2004). Niveli i sheqerit njihet gjithashtu si një faktor i

rëndësishëm në rregullimin e tranzicionit lulor dhe studimet mbi shprehjen e gjeneve

në domatet e infektuara me fitoplazmën stolbur (që shkakton simptoma si vireshencë

dhe phyllody), kanë treguar se shprehja e gjeneve që kontrollojnë identitetin e

meristemës së lulesave është shumë e rregulluar, ndërsa gjenet që janë përfshirë në

zhvillimin e meristemës dhe identitetin e luleve janë më pak të rregulluara (Pracos P

et al., 2006). Për të fituar njohuri të mëtejshme në mekanizmat mbi patogjenezën e

fitoplazmave, janë ndërmarrë projekte të sekuencimit të gjenomës dhe janë

identifikuar gjenet që lidhen me patogjenitetin. Këto projekte të sekuencimit kanë

përfshirë izolimin e ADN-së së pastër të fitoplazmave nga bimët e infektuara/insektet

vektorë duke përdorur kolonat e gradientit me CsCl ose xhel elektroforezën në fushë

pulsuese. Analiza e sekuencave të gjenomit ka zbuluar se që të katër gjenomat e

sekuencuara të fitoplazmave nuk kanë gjene për proçese të rëndësishme metabolike.

Këtu përfshihen rrugët për biosintezën e shumë aminoacideve, acideve yndyrore dhe

nukleotideve çka dëshmon se fitoplazmat duhet ti importojnë të gjitha këto nga

bujtësit e tyre (Tran-Nguyen et al., 2008; Kube M et al., 2008). Përmasat e vogla të

gjenomit dhe tendencat e dukshme në drejtim të evolucionit reduktiv tek fitoplazmat

sugjerojnë nivele çuditërisht të larta të përsëritjeve brënda gjenomit të sekuencave të

cilat janë të një rëndësie të lartë.

Përshtatja në mjedise të reja jep një shpjegim se përse një organizëm me një gjenomë

kaq të vogël përmban përsëritje të shumta të gjeneve. Është e njohur se shumë baktere

patogjenë të bimëve përdorin sistemet e sekretimit të tipit III dhe IV për të pompuar

efektorë dhe faktorë të patogjenezës në qelizat bimore. Është konfirmuar se

fitoplazmat sekretojnë peptide të vogla në floemë, të cilat më pas janë në gjendje të

migrojnë në qeliza të tjera bimore për të ndikuar në shprehjen e gjeneve. Një pjesë e

këtyre gjeneve kohët e fundit janë shprehur në bimë transgjenike dhe kanë treguar se

sillen si proteinat efektore, duke ndërvepruar me faktorët e transkriptimit në bimët

strehuese për të rezultuar në simptomat klasike të fitoplazmave të tilla si vireshenca,

phyllodia, njolla kafe etj. Gjithashtu është pohuar se metilimi epigjenetik i ADN-së së

bimëve mund të përfshihet në rregullimin (down-regulation) e gjeneve përgjegjëse për

zhvillimin lulor (Pracos P et al., 2006).



17

Figura 1.2 Mikrografi elektronike (majtas) dhe harta e gjenomës së fitoplazmave (djathtas).

(Majtas) Fitoplazmat (pjesëzat rrethore) janë afërsisht 1 e 10 milionta e metrit në madhësi,

vetëm 1/10 e virusit gjigand të njohur si pandoravirus. (Djathtas) Gjenoma e fitoplazmave

përbëhet afërsisht nga 870,000 çifte bazash, dhe ka rreth 1/3 apo 1/4 e numrit të gjeneve të

pandoravirus. © 2016 Laboratory of Plant Pathology, Graduate School of Agricultural and

Life Sciences, The University of Tokyo.

1.4.1. Gjenet që përfshihen në ndërveprimet e fitoplazmave me strehuesit

e tyre

Zhvillimi i disa teknikave molekulare kohët e fundit ka çuar në krijimin e linjave të

reja të kërkimit në fushën e fitoplazmologjisë. Teknika të shumëllojshme si p.sh PCR,

që lehtëson zbulimin e shprehjes së gjeneve të ndryshme, po aplikohen në laboratorë

të ndryshëm për investigimin e biologjisë së Mollicuteve, patogjenë në mjedise të

ndryshme, të tilla si bimët apo insektet strehuese. Infeksioni fitoplazmatik mund të

çojë në prodhimin e proteinave mbrojtëse, rritje të komponimeve fenolike dhe

mbiprodhim të peroksidit të hidrogjenit tek bimët strehuese (Junquera et al., 2004;

Musetti et al., 2000; 2005). Duke përdorur metodën ARN differential display, Smart et

al., (1996) kanë njohur gjenet e Arabidopsis të rregulluara si pasojë e infeksionit me

yellows phytoplasma. Gjithashtu, Jagoueix-Eveillard et al., (2001) kanë izoluar gjene

të ndryshëm nga periwinkle të infektuara nga Spiroplasma citri dhe ―Candidatus

Phytoplasma aurantifolia‖. Tetë prej tyre kishin homologji me gjenet që kodojnë

proteinat e përfshira në fotosintezë, transportin e sheqernave, përgjigjen ndaj stresit

ose rrugët e përfshira në sintezën e fitosterolit. Ata kanë treguar se një gjen që

kodonte proteinat e induktuara nga patogjeni, domethënë një kinazë e asociuar me

murin qelizor, aktivizohej nga infeksioni S. citri. Tek Arabidopsis spp., ky gjen

induktohet gjithashtu nga acidi salicilik dhe përfshihet në përgjigjen mbrojtëse të

bimës. Tek A. thaliana, mutacioni i gjenit të transketolazës ndikon në shprehjen e disa

gjeneve fotosintetike dhe në prodhimin e pigmentit. Kështu, inhibimi i gjenit të

transketolazës mund të jetë përgjegjës për shtypjen e gjenit të përfshirë në fotosintezë.

Prania e gjeneve specifike për translokim është raportuar gjithashtu tek disa

fitoplazma (Kakizawa et al., 2001). Një homolog i një transportuesi aminoacidesh

është gjetur se rregullohet mbas infeksionit të Prunus armeniaca me ―Candidatus

Phytoplasma prunorum‖, duke mbështetur efektin e fitoplazmave në transportin e



18

aminoacideve. Për më tepër, tre gjene rregullohen tek bimët strehuese të infektuara

me këto fitoplazma; një gjen që kodon një proteinë të shokut nga nxehtësia (HSP70),

një gjen që kodon një metalothioneinë dhe një homolog i sekuencës së shprehur tag

673, klon i P.armeniaca. Metalothioneinat janë proteina që kanë karakteristika

oksido-reduktuese, aftësi të fuqishme për tu lidhur me metalet dhe prodhohen si

pasojë e stresit ndaj metaleve të rënda. Kjo mund të induktojë gjithashtu prodhimin e

HSP70, gjë që ndodh edhe gjatë rritjes nën kushte ekstreme të temperaturës

(Carginale et al., 2004). Fitoplazmat janë zbuluar edhe tek indet e lules gjithashtu.

Infektimi i bimëve të domates nga fitoplazma stolbur indukton anomali tipike të lules

si hipertrofi të nënpetlave, vireshencë, zhvillim jo normal të pjesëve të lules në

struktura gjethore si dhe gonxhe të mëdha. Të dhënat kanë treguar se keqformimet e

lules të domates të infektuar me fitoplazmën stolbur janë të lidhura me çrregullimet e

hershme që ndodhin në shprehjen e gjeneve kyçe për zhvillimin e lules (duke

përfshirë LeDEF, LeWUS dhe TAG1). Duke qënë se fitoplazmat nuk vendosen në

meristema, ato ka mundësi të ndryshojnë zhvillimin e lules nëpërmjet sinjaleve të

distancave të largëta, si bllokimi i translokimit të sheqernave në floemë, ose

hipermetilimi i gjenomës së bimës nëpërmjet aktivizimit të mekanizmave mbrojtës të

bimës (Pracros et al., 2006). Tek bimët dhe kafshët, proçesi i metilimit të citozinës

është i njohur për rregullimin e shprehjes së gjeneve në mënyrë epigjenike. Studimet

kanë treguar se gjenet mund të rregullohen rastësisht kur numri i citozinave të

metiluara është shumë më i madh krahasuar me statusin normal të metilimit të gjenit.

Figura 1.3 Paraqitje diagramatike e operonit rARN të një fitoplazme (Smart et al., 1996).

1.5. Përhapja e fitoplazmozave në vendin tonë dhe në rajon

1.5.1 Përhapja në Shqipëri

Në tetë rrethe të ndryshme të Shqipërisë Juglindore dhe Qëndrore janë studiuar

pemishte dhe vreshta për praninë e sëmundjeve fitoplazmatike. Janë vërrejtur

simptoma të European stone fruit yellows, apple proliferation, pear decline dhe

grapevine yellows. Mostrat e grumbulluara nga bimët e dyshuara janë testuar në



19

laborator. Si rezultat 5 pemë frutore (kajsia, myrobalan dhe kumbulla) rezultuan të

infektuara me European stone fruit yellows, 5 pemë të mollëve të infektuara me apple

proliferation dhe 1 pemë dardhe e infektuar me pear decline. Këto janë raportimet e

para të sëmundjeve fitoplazmatike në Shqipëri. Pra për apple proliferation dhe plum

leptonecrosis ka të dhëna që ato ekzistojnë por nuk ka informacion në lidhje me

shkallën e përhapjes së tyre (Myrta, A. et al., 2003).

1.5.2 Përhapja në Kosovë

Në vjeshtën e vitit 2005 është realizuar një studim në lidhje me përhapjen e

fitoplazmave në dru frutorët në Kosovë. Simptomat e vëzhguara ishin të ngjashme me

ato të apple proliferation, pear decline dhe European stone fruit yellows. Prania e

―Candidatus Phytoplasma mali‖ (EPPO A2 list), ―Candidatus Phytoplasma pyri‖

(EPPO A2 list) u zbulua në 6 drurë të mollëve dhe 3 drurë të kumbullave përkatësisht.

―Candidatus Phytoplasma prunorum‖ nuk u zbulua. Ky përbën raportin e parë të

apple proliferation dhe pear decline në Kosovë (Myrta, A. et al., 2006).

1.5.3 Përhapja në Greqi

Studime mbi përhapjen e apple proliferation në Greqi janë bërë kryesisht në zonën e

malit Pelion që dallohet për kultivimin e mollëve. Ky rajon për shumë vite ka pasur

probleme për arsye të përhapjes së apple proliferation. Varieteti i studiuar ka qënë

Starking Delicious. Prania e ―Candidatus phytoplasma mali‖ është provuar duke

përdorur analizat PCR/RFLP dhe sekuencimin gjithashtu. Plantacione të infektuara

me Apple proliferation janë zbuluar edhe në Attiki (Avlona); Ditiki Makedonia

(Kastoria), Peloponnisos (Artemissio Arkadia, Daras Arkadia, Korinthos, Mana

Korinthia, Tripoli Arkadia), Thessalia (Agia Larissa). Studime në Greqi janë bërë

edhe në lidhje me përhapjen e plum leptonecrosis ku sëmundja ka rezultuar e

pranishme në plantacione të kumbullave në Kozan, Imathia dhe prefekturën e

Korinthit. Gjendja e përhapjes të apple proliferation dhe plum leptonecrosis në Greqi

mund të përshkruhet si e pranishme por me përhapje të kufizuar (Rumbou A, et al.,

2011; Holevas, C.D., et al., 2000; Rumbos, I.C.; Bosabalidis, A.M, 1985; Syrgianidis,

G. D. 1989).

1.5.4 Përhapja në Bullgari

Në vitet 1965, 1966 dhe 1968 pemë të kultivarëve Golden Delicious, Starking

Delicious dhe Red Delicious, janë testuar për praninë e sëmundjeve fitoplazmatike.

Situata e vlerësuar sipas EPPO në bazë të informacioneve të vitit 1993 e përshkruan

gjendjen e fitoplazmave si të pranishme në vend, por me përhapje të kufizuar.

Teknika e përdorur për zbulimin e fitoplazmave ka qënë PCR. ―Candidatus

Phytoplasma mali‖ dhe ―Candidatus Phytoplasma prunorum‖ janë zbuluar në mostrat

e marra nga pesë zona të ndryshme. Për arsye të aplikimit të masave fitosanitare, është

vëzhguar se përhapja e apple proliferation në 2009 dhe 2010 ishte reduktuar krahasuar

me 2007, 2008 dhe në 2011 nuk ishte identifikuar asnjë rast pozitiv. Situata lidhur me

praninë e European stone fruit yellows paraqitej ndryshe, pasi infeksioni u zbulua në

2009, 2010, 2011 dhe 2013. Ca. P. mali është raportuar e pranishme tek strehuesit dhe



20

vektorët në pesë rajone gjeografikisht të ndryshme, në Bullgari (Etropolska, A. et al.,

2007, 2015).

1.5.5 Përhapja në Rumani

Të dhëna nga CABI Disease map 761 (1998), e përshkruajnë situatën e përhapjes të

Apple proliferation si të pranishme, por pa raportime të detajuara. Të dhënat e marra

nga vlerësimi i EPPO në bazë të informacionit të vitit 2012, e përshkruajnë situatën e

përhapjes të Plum leptonecrosis si të pranishme, por me përhapje të kufizuar.

Phytoplasma prunorum është e përhapur në zonën Bukuresht–Ilfov, Jug-Lindje

(Steffeck R. et al., 2012).

1.5.6 Përhapja në Serbi

Gjendja aktuale e vlerësuar nga EPPO në bazë të informacioneve të vitit 2006 e

përshkruan infeksionin apple proliferation si të pranishëm, por me përhapje të

kufizuar. Gjatë viteve 2003-2005 vëzhgime intensive janë realizuar në zona të

ndryshme të Serbisë për të verifikuar praninë e fitoplazmave në pemët frutore që

shfaqnin simptoma. Për zbulimin dhe përcaktimin e identitetit të fitoplazmave u

përdorën analizat PCR/RFLP. Mostrat me origjinë nga pemët e mollëve, që shfaqnin

simptoma rezultuan të infektuara me apple proliferation (16SrX-A) (Duduk, B. et al.,

2008).

1.5.7 Përhapja në Itali

Gjendja e vlerësuar sipas EPPO bazuar në informacionet e vitit 2013 e përshkruan

infeksionin apple proliferation si të pranishëm dhe me përhapje të gjerë. Apple

proliferation është e përhapur kryesisht në Italinë e Veriut (Emilia-Romagna,

Lombardia, Piemonte, Trentino-Alto Adige, Valle d'Aosta, Veneto), por është gjendur

gjithashtu në Jug (Basilicata).

Sëmundja është shpërndarë në gjithë Valle d‘Aosta. Në pemtoret e vjetra, përhapja e

sëmundjes mund të arrijë 100%. Drurët janë vëzhguar për simptoma tipike ose janë

testuar kur ato nuk shfaqnin simptoma. Drurët e infektuar janë shkatërruar dhe kur

infeksioni është përhapur në 25% të plantacionit i gjithë plantacioni është shkatërruar.

Në rajonin e Friuli-Venezia Giulia, një rajon i Italisë, ku apple proliferation (AP)

njihet që është e përhapur, përdoren gjerësisht varietete të cilat janë rezistente ndaj

sëmundjeve më të zakonshme. Kultivarët më të rëndësishëm janë Florina, Prima dhe

Priscilla. Këto varietet janë kultivuar sipas rregjimeve të bujqësisë organike, duke

mos përdorur insekticide. Rezultatet e fituara në dy plantacione gjatë një periudhe

vëzhgimi 7 vjeçar, tregojnë se të tre varietetet ishin të prekura nga AP. Florina

shfaqte shkallë të lartë infeksioni të AP, ndërkohë Priscilla ishte varieteti më i

ndjeshëm. Identifikimi i sëmundjes u bazua në shprehjen e simptomave, teknikën

fluoreshente DAPI, mikroskopinë elektronike dhe PCR. Modeli i shpërhapjes natyrore

të AP nuk ishte uniform, pemët e prekura ishin në linjë ose të grumbulluara në disa

pika të pemtoreve. Kjo mund të dëshmojë për praninë e një vektori jo shumë të

lëvizshëm (Loi et al., 1995)



21

1.5.8 Përhapja në Turqi

Gjendja e vlerësuar nga EPPO në bazë të informacioneve të vitit 2008 e përshkruan

infeksionin apple proliferation si të pranishëm, por pa detaje. EPPO Reporting Service

(2009) raporton praninë e Phytoplasma mali tek mostrat nga pemtoret e Adana

(Rajoni Mesdhetar) dhe Nigde (Anatolia qëndrore). Gjatë verës dhe vjeshtës të viteve

2005 dhe 2006 janë realizuar vëzhgime dhe analiza në Isparta, Yalova dhe Ankara për

të përcaktuar gjendjen e përhapjes së ―Candidatus Phytoplasma mali‖ në Turqi. 201

mostra simptomatike dhe josimptomatike u analizuan me anë të DAS-ELISA,

ngjyrimit fluoreshent DAPI dhe polymerase chain reaction (PCR) e ndjekur nga

analiza RFLP. Mbështetur tek rezultatet, disa drurë të mollëve u identifikuan si të

infektuar me ―Ca. P. mali‖ ndërkohë rezultatet e RFLP treguan se nuk kishte

diferenca ndërmjet izolateve (Canik D., Ertunc F., (2007). Në Turqi, 17 plantacione

me drurë mollësh janë analizuar nga gushti në shtator 2004, për praninë e Apple

proliferation, përkatësisht në Adana (6 plantacione), Mersin (3 plantacione) dhe Nigde

(8 plantacione) (Sertkaya G., 2008).

1.6. Metodat për zbulimin dhe identifikimin e fitoplazmave

Zbulimi, identifikimi i kujdesshëm dhe i saktë është një kusht paraprak i

domosdoshëm për karakterizimin e patogjenit dhe kontrollin e suksesshëm të

sëmundjeve të bimëve. Diagnoza e sëmundjeve të lidhura me fitoplazmat është një

nga aspektet më të vështira në fushën e kërkimit shkencor të sëmundjeve të bimëve, si

rezultat i pamundësisë për të rritur in vitro këta patogjenë. Diagnoza fillestare e

sëmundjeve të bimëve të lidhura me fitoplazmat, është bërë duke u mbështetur

fillimisht në mikroskopinë elektronike, ngjyrosjen e ADN-së të elementëve përçues të

bimëve të infektuara dhe karakteristikat biologjike, duke përfshirë marrëdhëniet e

insekteve vektorë, gamën e bujtësve dhe simptomatologjinë (McCoy et al., 1989).

Megjithatë këto metoda marrin kohë, kërkojnë përkushtim, janë të komplikuara dhe

shpesh çojnë në konkluzione jo të sakta. Zhvillimet e fundit të teknologjisë

molekulare kanë ndihmuar në një zhvillim domethënës, të shpejtë dhe të saktë të

zbulimit, identifikimit dhe klasifikimit të fitoplazmave (Wang, 1997).

1.6.1. Metoda e bazuar në simptoma, simptomatologjia

Para se të zhvilloheshin teknikat molekulare zbulimi i sëmundjeve fitoplazmatike ishe

shumë i vështirë, për faktin se fitoplazmat nuk mund të rriten in vitro. Në atë periudhë

u përdorën gjerësisht teknika diagnostikuese të tilla si vëzhgimi i simptomave,

transmetimi nëpërmjet insekteve apo kuskutave tek bimët strehuese, shartimi si dhe

mikroskopia elektronike nëpërmjet të cilës vëzhgoheshin seksione shumë të holla të

indeve të floemës. Zhdukja e simptomave në disa raste mbas trajtimit me antibiotikë

(p.sh tetraciklinë) siguroi fakte shtesë për të ndihmuar diagnozën e mikroogranizmave

prokariotë si agjentë të disa sëmundjeve bimore (Doi et al., 1967; Lee and Davis,

1992). Shtamet e fitoplazmave u identifikuan dhe diferencuan sipas karakteristikave

biologjike, të tilla si ngjashmëria e simptomave tek bimët e infektuara, bimët

strehuese dhe llojet e insekteve vektorë (Chiykowski, 1991; Errampalli et al., 1991;

Lee and Davis, 1992). Përcaktimi i karakteristikave biologjike është tepër i lodhshëm,

kërkon kohë dhe shpesh rezultatet janë kontradiktore. Një simptomë e zakonshme që

https://gd.eppo.int/reporting/article-155

https://gd.eppo.int/reporting/article-155



22

shkaktohet nga infeksionet fitoplazmatike është phyllodia, prodhimi i strukturave të

ngjashme me gjethet në vend të luleve.

Provat e ndryshme sugjerojnë se fitoplazmat ―nxjerrin nga kontrolli‖ gjenin e

përfshirë në formimin e lules (Pracros et al., 2006). Simptoma të tjera si zverdhja e

gjetheve, mendohet se shkaktohen nga prania e fitoplazmave në floemë, duke ndikuar

në funksionin e tufave përçuese dhe në ndryshimin e transportit të karbohidrateve.

Fotosinteza, në veçanti fotosistemi II, bllokohet në shumë bimë të infektuara me

fitoplazma. Këto bimë të infektuara shpesh shfaqin zverdhje e cila shkaktohet nga

shpërbërja e klorofilit dhe karatenoideve, biosinteza e të cilave bllokohet (Bertamini

and Nedunchezhian, 2001). Shprehja e induktuar e gjeneve të sucrose synthase dhe

alcohol dehydrogenase I tek bimët e infektuara të plantacioneve të rrushit është

demostruar kohët e fundit (Hren et al., 2009). Bimët e infektuara me fitoplazma

shpesh preken nga vireshenca; zhvillimi i luleve të gjelbra si rezultat i humbjes së

pigmentit në qelizat që formojnë petalet (Lee et al., 2000). Një simptomë tjetër e

përshkruar është steriliteti i luleve. Shumë bimë të infektuara nga fitoplazmat marrin

pamjen e shkurres ose të ―fshesës së shtrigës‖ si rezultat i ndryshimeve të rrugëve

normale të rritjes që shkaktohen nga infeksioni.

Shumica e bimëve shfaqin dominancë apikale por infeksioni fitoplazmatik mund të

shkaktojë shumim anësor (sqetullor) të kërcejve (Lee et al., 2000) dhe një zvogëlim të

madhësisë së ndërnyjeve. Fitoplazmat mund të shkaktojnë shumë simptoma të tjera

jospecifike të cilat shfaqen si rezultat i stresit që kalon bima. Simptomat e

infeksioneve fitoplazmatike në disa raste mund të jenë të dobishme për prodhimin

komercial. Infeksionet fitoplazmatike prodhojnë shumë filiza sqetullorë të cilët

mundësojnë prodhimin e luleve poinsettia (lulja e Krishtlindjes) të cilat kanë më

shumë se një lule dhe madhësi të reduktuar, gjë që lejon rritjen e tyre në vazo

(Bertaccini et al., 1996; Lee et al., 1997a).

Figura 1.4 Fruta të vogla (në të djathtë) me bishta të gjatë, të infektuara me fitoplazma.

Loschi. DBADP, University of Udine, Italy. http://www.cabi.org/compendia/cpc/

http://www.cabi.org/compendia/cpc/



23

Figura 1.9 ―Fshesa e shtrigës‖, Biologische Bundesanstalt für Land-und Forstwirtschaft,

Institut für Pflanzenschutz im Obstbau Archive. www.bugwood.org.

Figura 1.5 Lule me numër shumë të

madh petalesh. Loschi, University of

Udine, Italy.

Figura 1.7 Gjethe molle e shëndetshme

(djathtas), krahasuar me gjethe molle të

prekura nga fitoplazma (majtas). Gjethet e

infektuara paraqiten me ndajgjethëza

shumë të mëdha. www.bugwood.org.

Figura 1.8 Gjethe molle e shëndetshme (majtas), gjethe molle (klorotike) e

infektuar nga fitoplazmat (djathtas).

Biologische Bundesanstalt für Land-und

Forstwirtschaft, Institut für

Pflanzenschutz im Obstbau Archive.

Figura 1.6 Rozetë e gjetheve, Alberto

Loschi

http://www.fitoplasmi.it/index1.htm

http://www.bugwood.org/



24

Ky grup patogjenësh, në varësi të karakteristikave të tyre, të bimëve strehuese dhe të

kushteve të mjedisit ku gjendet bima strehuese, mund të shkaktojë një kuadër

simptomatik të gjerë, i cili është shpesh i ngjashëm me atë të shkaktuar nga viruset.

Kuadri simptomatologjik i fitoplazmozave lidhet me mënyrën e dyfishtë me të cilën

fitoplazmat veprojnë mbi bimën strehuese:

- Grumbullimi i madh i tyre në floemë dhe sidomos pranë poreve të pllakave

kribroze, bëhet pengesë për kalimin e sheqernave nga gjethet në pjesët e tjera

të bimës. Ky fenomen bën të grumbullohet amidon në gjethe dhe të shfaqen

simptoma si ndryshimi i ngjyrës së gjethes në të verdhë (simptomë kjo mjaft e

përhapur nga ku marrin emrin disa fitoplazmoza) dhe të kuqe, gjethet janë më

të trasha, të përkulura dhe të rrotulluara nga poshtë. Vërrehen gjithashtu edhe

simptoma të tjera si nekroza të kufizuara në nervurat e gjethes, në fruta dhe në

rrënjë; trashje e lëvores dhe strukturë sfungjerore e saj; zhvillim i dobët i

bimëve që mund të paraqitet edhe me forma xhuxhërie. Shpesh kuadrit të

fitoplazmozave në fushë i bashkangjiten edhe probleme të mungesës së

lëndëve ushqyese dhe simptomat e shkaktuara nga ato.

- Prishja e ekuilibrit hormonal të bimës, që shfaqet me anomali zhvillimi të saj

deri në keqformimin e organeve bimore. Deformimet ose keqformimet prekin

gjethet ose lulet, ka vonesa në çeljen e sythave në drufrutorë (kemi edhe raste

çelje të parakohshme në dimër si në rastin e ―zverdhjes europiane të

bërthamorëve‖) ose në lulëzim. Simptoma tipike të këtij grupi janë ngjyra e

gjelbër e luleve ose ―vireshenca‖ dhe kthimi i petaleve të luleve në gjethe ose

―fillodia‖. Simptoma të tjera janë rritja e parregullt e bimës në formë kaçube

ose fshesë nga shkurtimi i ndërnyjeve. Në pemët frutore të infektuara nga

fitoplazmat mund të vërehen lule jashtë stinës së pranverës (p.sh. gjatë dimrit),

sterilitet i luleve dhe mungesë prodhimi. Në raste të prekjeve të rënda disa

fitoplazma mund të shkaktojnë edhe tharjen e degëve apo të gjithë bimës,

tharje që shpesh përshpejtohet edhe nga kushtet e pafavorshme të mjedisit.

Kohët e fundit në disa fitoplazmoza është vërejtur fenomeni ―recovery‖ ku bimët e

sëmura në natyrë gradualisht humbasin simptomat dhe vazhdojnë të prodhojnë

normalisht në vite.

Simptoma të ngjashme me ato të fitoplazmozave që përshkruhen më sipër shkaktohen

në natyrë shpesh edhe nga viruset, prandaj diagnostikimi i tyre, veç eksperiencës së

gjatë fushore kërkon domosdoshmërisht konfirmim me analiza laboratorike.

Një specie bimore shumë e dobishme në studimin e fitoplazmave dhe

simptomatologjisë së tyre është Catharantus Roseus. Duke qënë shumë e ndjeshme

ndaj infeksionit të fitoplazmave është përdorur si bimë indikatore për zbulimin e

pranisë së tyre në bimë asimptomatike, për aftësinë që ka në diferencimin e

simptomave të shkaktuara nga fitoplazma të ndryshme (Susuri L.R., and Myrta A.G

2012).

1.6.2. Izolimi i fitoplazmave në bimët test

Fitoplazmat mund të transmetohen dhe të konservohen në bime test si p.sh. meneksha

(Catharanthus roseus G. Doni), që nëse infektohet paraqet simptoma zverdhjeje ose

vireshence, fillodi, fshesë, lule të vogla, etj. Transmetimi bëhet me anë të bimës së



25

kuskutës, që siguron një urë lidhjeje dhe transmetimi ndërmjet bimës së infektuar dhe

bimës test. Kjo metodë është përdorur në të kaluarën për transmetimin e fitoplazmave

nga drufrutorët në bimë barishtore për të mundësuar studimin e tyre.

Veç izolimit në bimë barishtore, fitoplazmat e drufrutorëve diagnostikohen edhe

nëpërmjet indeksimit (shartimit) në bimë indikatore drunore edhe pse kjo nuk është

një metodë shumë e përdorur, pasi fitoplazmat nuk janë të përhapura rregullisht në

bimët strehuese drunore dhe testet mund të japin rezultate të pasakta (Susuri L.R., and

Myrta A., 2012).

1.6.3. Mikroskopia

1.6.3.1 Mikroskopia me dritë (ngjyrimi Diene)

Teknikat e mikroskopisë me dritë edhe pse jo të dizenjuara drejtpërdrejt për

vizualizimin e fitoplazmave në brendësi të indit mbartës, janë përdorur me sukses si

një metodë paraprake për diagnostikim duke verifikuar praninë e fitoplazmave në

bimët që kanë shfaqur simptoma. Ato përbëjnë hapin e parë drejt të kuptuarit të

ndërlidhjes së simptomave me praninë e fitoplazmave në bimë. Për më tepër metodat

e mikroskopisë me dritë janë të shpejta dhe më pak të kushtueshme krahasuar me

metodat e mikroskopisë elektronike. Duke përdorur mikroskopinë me dritë, janë

përdorur mjaft teknika të ngjyrimit për identifikimin dhe lokalizimin e fitoplazmave

në indet e infektuara, të aplikuara këto në prerje të holla të përgatitura me dorë. Ky tip

dedektimi është efikas vetëm në rastin kur përqëndrimi i patogjenëve është i lartë në

qeliza, p.sh. mund të përdoret me sukses në materiale bimore barishtore.

Ngjyrimi Diene u zhvillua fillimisht si një ngjyrim specifik për vizualizimin e

kolonive të mykoplazmave të kultivuara në siperfaqe agari. Me kalimin e kohës filloi

të përdorej si një ngyrues direkt në gypat shoshë të bimëve mbartëse (Wei W. et al.,

2008), teknikë kjo e aplikuar në prerjet me dorë ose me mikrotom me ngrirje të indeve

bimore të infektuara me fitoplazma ose spiroplazma. Kjo teknikë ngjyrimi përbën një

test paraprak të shpejtë dhe të thjeshtë për analizimin e kampioneve bimore të

mbledhura. Duke ndjekur këtë teknikë ngjyrimi, gypat shoshë të kolonizuara nga

fitoplazmat mund të identifikohen si grupime qelizash të çregullta të ngyrosura

fortësisht, të para këto në mikroskop me dritë. Proçedura është e një rëndësie

diagnostike pasi indet e floemës me prejardhje nga bimët e infektuara me fitoplazma

do të ngjyrosen në blu të errët ndërkohë që ksilema do të ngyroset në bojëqjelli dhe

korteksi në blu të çelët. Ngjyrimi është specifik për sëmundje të caktuara të

shkaktuara nga Mollicutes dhe nuk ngjyros indet e shëndetshme apo mostrat e

infektuara nga patogjenë të tjerë bimorë.

1.6.3.2 Mikroskopia me fluoreshencë (ngjyrimi DAPI)

Teknikat e bazuara në shumëfishimin e fragmenteve gjenike specifike janë gjërësisht

të përdorura për zbulimin dhe identifikimin e fitoplazmave, por kostoja e lartë dhe

nevoja e një personeli të mirë trajnuar për të zhvilluar proçedurën, limitojnë aplikimin

e këtyre teknikave pasi në shumë laboratorë (edhe në ato të vëndeve në zhvillim)

mungojnë. Në këtë këndvështrim teknikat e shpejta, të thjeshta dhe jo të kushtueshme

janë tepër të vlerësura për zbulimin e fitoplazmave. Për këto arsye teknika si ngjyrimi



26

me 4‘,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) janë përdorur shpesh për diagnostikim të

shpejtë dhe ekonomik të fitoplazmave. Ngjyrimi fluoreshent DAPI është cilësuar si

më specifik krahasuar me ngjyrimin Diene. Gjenomat e sekuencuara të disa

fitoplazmave kanë treguar një përmbajtje të lartë të bazave AT që korenspondon me

një përmbajtje të ulët të GC e cila varion nga 21% (p.sh. ―Candidatus Phytoplasma

mali‖) deri në 28% (p.sh. ―Candidatus Phytoplasma asteris‖) (Hogenhout, 2010).

Figura 1.10 Ilustrim skematik i hapave të ndryshme të ngjyrimit DAPI, për diagnostikimin e

mostrave të prekura nga fitoplazmat. ©Francisco Beluzan.

Kjo veçori krijon mundësinë e aplikimit gjërësisht të teknikave të ngjyrimit si ajo e

DAPI-t (një ngjyrues fluoreshent i cili ka aftësinë të depërtojë lehtësisht membranën

qelizore dhe të lidhet fort me rajonet e ADN-së të pasura me AT). Ndërveprimi i

DAPI-t me ADN-në ka qënë subjekt i shumë studimeve që në momentin që kjo

përbërje aromatike u sintetizua për herë të parë. Fillimisht u sintetizuan një sërë

përbërjesh diamidine më qëllim përdorimin e tyre si agjentë tripanocidë, megjithatë

veçoritë unike spektrale të DAPI-t çuan në përdorimin e tij më tepër si një shënues i

ADN-së sesa si një medikament. Tashmë përdoret gjërësisht në mikroskopinë me

fluoreshencë. Në fitopatologji është përdorur veçanërisht për zbulimin e fitoplazmave

dhe spiroplazmave në specie të ndryshme bimore, të raportuara këto në mjaft studime.

Në qoftë se vëzhgojmë preparatet e ngjyrosura me DAPI, qelizat e floemës në

materialet e infektuara shfaqen më të shndritshme krahasuar me pamjen tipike të

bërthamave në qelizat parenkimatike. Në indet e infektuara zakonisht fitoplazmat

shfaqen si njolla të ndriçuara në gypat shoshë të floemës, dukuri e cila nuk vërehet në

indet e shëndetshme. Ngjyrimi me DAPI është cilësuar si një teknikë e shpejtë dhe e

saktë për lokalizimin e fitoplazmave në gypat shoshë të floemës dhe në pjesë të

ndryshme të bimës (kryesisht gjethe dhe rrënjë) (Andrade and Arsimendi, 2013).



27

1.6.3.3 Mikroskopia me imunofluoreshencë

Ngjyrimi imunofluoreshent indirekt, i kombinuar zakonisht me teknikën ELISA, është

përdorur gjerësisht për zbulimin e fitoplazmave në inde (Lin and Chen, 1986;

Lherminier et al., 1989; Caudwell et al., 1990; Sinha and Chiykowski, 1990). Edhe

pse antiserumet poliklonalë mund të përdoren si një qasje për zbulimin e fitoplazmave

tek indet e infektuara, për identifikimin dhe diferencimin e tyre ata nuk tregojnë

specificitet të lartë (da Rocha et al., 1986). Në kontrast, antitrupat monoklonalë lidhen

specifikisht me fitoplazmat në seksionet e gypave shoshë të bimëve të infektuara (Lin

and Chen, 1986). Avantazhet e mikroskopisë me imunofluoreshencë janë,

ndjeshmëria, specificiteti dhe thjeshtësia. Mikroskopia me imunofluoreshencë mund

të jetë e dobishme për zbulimin e shpërhapjes brendaqelizore të fitoplazmave në

nivelin e mikroskopisë me dritë (Hiruki, 1988a).

1.6.3.4 Mikroskopia elektronike

Lidhja e fitoplazmave me sëmundjet e bimëve, kohët e fundit është zbuluar nga

vëzhgimi i fitoplazmave në indet bimore nëpërmjet mikroskopisë elektronike me

transmision. Fitoplazmat në seksione shumë të holla, duken si qeliza prokariote me

forma nga ato rrethore deri tek filamentozet, me diameter nga 175 deri në 400 nm dhe

të rrethuara nga një membranë e vetme (Chen and Hiruki, 1977; Waters and Hunt,

1980; McCoy, 1983). Në shumicën e bimëve barishtore, fitoplazmat mund të

vëzhgohen në të gjitha organet si rrënjë, filiza, lule, fruta dhe gjethe. Megjithatë, tek

bimët drunore, është më i vështirë vëzhgimi i fitoplazmave (McCoy et al., 1989). Për

arsye se patogjenë të tjerë bakterialë, me mur qelizor (përfshirë organizmat e

ngjashme me rikeciet dhe organizmat e ngjashme me bakteret) jetojnë në floemën e

bimëve, ndaj nevojitet ekzaminim i kujdesshëm i mikrografive elektronike dhe

njëkohësisht rekomandohen fort seksionet gjysëm të trasha (Chen et al, 1989).

Megjithëse mikroskopia elektronike siguron një metodë direkte për zbulimin e

fitoplazmave, karakteristikat morfologjike ofrojnë një ndihmesë shumë të vogël në

identifikimin e këtyre organizmave, duke qënë se ka numër të lartë të organizmave të

ngjashme në ekstraktet bimore të papërpunuara (Wolanki and Maramorosch, 1970).

1.6.4. Histokimia

Disa fluorokrome si akridina portokalli, bromuri i ethidiumit e të tjera, nuk lidhen në

mënyrë specifike me ADN-në. Ato formojnë një kompleks i cili shfaq fluoreshencë

dhe përdoret në mënyrë rutine për zbulimin e fitoplazmave në kulturat qelizore (Chen,

1977; DelGuidice and Hopps, 1978; Steiner et al., 1982; McGarrity et al., 1983).

Ngjyruesi Hoechst 33258 është përdorur për ekzaminimin e qelizave të infektuara me

fitoplazma dhe spiroplazma (Steiner et al., 1982, 1983) dhe gjithashtu për dedektimin

e fitoplazmave dhe spiroplazmave në gjendrat e salivës të insekteve vektorë

(Markham and Alivizatos, 1983). DAPI (4‘-6‘-diamidion-2-phenylindole) lidhet

specifikisht me rajonet e pasura me adenina dhe timina të ADN-së me origjina të

ndryshme (Russel et al., 1975). Ngjyrimi DAPI është përdorur gjerësisht për zbulimin

e fitoplazmave në indet bimore të infektuara (Seemuller, 1976; Hiruki, 1988a, b, c).

Përdorimi i DAPI-t si një fluorokrom, siguroi një teknikë me ndjeshmëri të lartë për



28

dedektimin e fitoplazmave në seksionet e bimëve barishtore (Hiruki and da Rocha,

1984, 1986) dhe ato drunore gjithashtu (Hiruki, 1981). Megjithëse ngjyrimi është një

metodë e thjeshtë, e shpejtë për diagnozën e infeksioneve fitoplazmatike, gjithashtu

edhe për seleksionimin e mostrave të painfektuara nga një numër i madh i mostrave të

dyshuara me infeksion fitoplazmatik, ai nuk bën të mundur diferencimin e

fitoplazmave, duke qënë se nuk është specifik. Megjithatë, kjo është më pak e

rëndësishme kur mostra është marrë nga insekte apo bimë të infektuara për qëllime

eksperimentale, ku aplikohen kontrolle të vazhdueshme, por nuk është shumë e

përshtashme për analizimin e insekteve apo bimëve nga koleksionimi fushor.

1.6.5. Imunologjia

Aplikimi i teknikave imunologjike ka rezultuar i dobishëm për analizimin e

antigjenëve të fitoplazmave dhe për zhvillimin e metodave të shpejta për

diagnostikimin e sëmundjeve (Sinha, 1974; Caudwell et al., 1983; Clark et al., 1983;

Sinha and Benhamou, 1983; Kirkpatrick and Garrott, 1984; Lin and Chen, 1985a, b,

c, 1986; Hobbs et al., 1987; Chen and Jiang, 1988; Clark et al., 1989; Jiang et al.,

1989, Hsu et al., 1990; Shen and Lin, 1993). Preparate pjesërisht të purifikuara

(organizma intakte ose fraksione të membranës) si imunogjenë, antiserume dhe

antitrupa monoklonalë janë përdorur për disa lloje të ndryshme fitoplazmash (Chen

and Jiang, 1988; Boudon-Padieu et al., 1989; Clark et al., 1989; Errampalli et al.,

1989; Jiang et al., 1989; Schwartz et al., 1989; Garnier et al., 1990; Hsu et al., 1990;

Chang and Chen, 1991; Shen and Lin, 1993).

1.6.5.1 Antitrupat monoklonale

Antitrupat poliklonalë shpesh kanë përqëndrim relativisht të ulët dhe reagojnë me

antigjenët nga bimët e shëndetshme ose insektet vektorë edhe pse antiserumet e

përgatitur nga fitoplazmat e purifikuara nga insektet kanë reagim më të vogël me

antigjenët e bimëve të shëndetshme (Chen and Jiang, 1990). Për këtë arsye,

antiserumet poliklonalë nuk janë të dobishëm për diferencimin e fitoplazmave (Lee

and Davis, 1992). Antitrupat monoklonalë të prodhuar nëpërmjet teknikës hibridoma

janë jospecifikë, secili reaksion vetëm me një epitop, të antigjenit të përzgjedhur.

Specificiteti dhe ndjeshmëria e lartë e antitrupave monoklonalë kanë përmirësuar

ndjeshëm besueshmërinë e teknikave imuno-dedektuese. Antitrupat monoklonalë janë

veçanërisht të ndjeshëm për diferencimin e shtameve të fitoplazmave të lidhura

ngushtë (Lin and Chen, 1985a, b, 1986; Chen and Jiang, 1988; Clark et al., 1989;

Jiang et al., 1989; Sears et al., 1989; Garnier et al., 1990; Guo et al., 1991; Shen and

Lin, 1993). Disavantazhi i antitrupave monoklonalë është njëspecificiteti i tyre i

njohjes të një epitopi të vetëm, p.sh: antitrupi homogjen monoklonal njeh vetëm një

sit (epitop) në kompleksin imunogjen. Prandaj, nëse një epitop i veçantë ndahet mes

imunogjenëve të ndryshëm, është e pamundur të dallohen imunogjenët. Kështu, disa

antitrupa monoklonalë në disa raste mund të dështojnë në diagnostikimin e bimëve që

shfaqin simptoma të lidhura me fitoplazmat (Lin and Chen, 1986; Hiruki, 1988b).



29

1.6.5.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Teknika ELISA, e zhvilluar për zbulimin e antigjenëve viralë në seksionet e indeve,

ka një ndjeshmëri të krahasueshme me atë të teknikës radioimmunoassay (RIA)

(Nakane and Pierce, 1966; Engvall and Perlmann, 1971). ELISA është e dobishme për

shqyrtimin e një numri të madh të mostrave (Clark et al., 1978). Është përdorur

gjerësisht në shqyrtimet në terren të viruseve bimore dhe spiroplazmave. ELISA është

përdorur për analizimin e fitoplazmave (Sinha and Benhamou, 1983; Jiang et al.,

1988). Aplikime të hershme, duke përdorur antiserumet poliklonalë të përgatitur nga

fitoplazma pjesërisht të purifikuara, treguan se antitrupat poliklonalë nuk mund të

dallojnë lehtësisht disa shtame të fitoplazmave (Sinha and Benhamou, 1983; Sinha

and Chiykowski, 1984). Megjithatë, me kontrollet e duhura, të cilat duhet të

përfshihen në teste të tilla si crossabsorbing antiserume me ekstrakte bimore të

shëndetshme, antiserumet poliklonale zbuluan në mënyrë të qartë antigjenë specifikë

të sëmundjes, në bimët e infektuara. Në shumicën e rasteve, diferencuan në mënyrë

efektive fitoplazma të largëta nga njëra-tjetra (Sinha, 1988; Clark et al., 1989;

Errampalli et al., 1989). Kombinimi i ELISA-s dhe mikroskopisë imunofluoreshente

duke përdorur antitrupa monoklonalë ka përmirësuar në masë të madhe specificitetin

dhe ndjeshmërinë e ELISA-s për zbulimin dhe diferencimin e fitoplazmave (Lin and

Chen, 1985b; Clark et al., 1989). ELISA që përdor antitrupat monoklonalë specifikë

për fitoplazmat është aplikuar gjithashtu në dedektimin e fitoplazmave në insektet

vektorë (Boudon-Padieu et al., 1989).

1.6.5.3 Dot Blot Immunoassay

Dot Blot Immunoassay është përdorur për dedektimin e spiroplazmave (Chen et al.,

1989) dhe kohët e fundit përdorimi i saj është shtrirë në diagnostikimin e infeksioneve

fitoplazmatike (Boudon-Padieu et al., 1989; Hsu et al., 1990). Ndjeshmëria e dot blot

immunoassay është e rendit 1.5 herë më e lartë se ajo e ELISA-s indirekte (Hsu et al.,

1990). Një proçedurë më e thjeshtuar blotting, në të cilën një prerje e indeve të freskët

shtypet direkt në membranat e nitrocelulozës, u zhvillua për dedektimin e viruseve

bimore dhe fitoplazmave (Lin et al., 1990). Ekzaminimi i indeve të ngjyrosur (sipas

kësaj teknike imunologjike) të kategorisë gjethe, zbuloi se antigjenët e fitoplazmave

në gjethe ishin të kufizuar në qelizat e floemës të nervurave kryesore dhe të atyre

sekondare. Dot Blot Immunoassay është aplikuar gjithashtu edhe për dedektimin e

fitoplazmave tek insektet vektorë (Garnier, 1990).

1.6.6. Biologjia molekulare

Zhvillimet e fundit të teknikave të ADN-së rekombinante kanë lejuar progresin në

drejtim të zbulimit dhe identifikimit të fitoplazmave. Që nga klonimi i parë i probeve

të ADN-së nga insekti vektor Colladonas montanus, raportuar nga Kirkpatrick et al.,

(1987), fragmente të tjera ADN-je janë klonuar nga të paktën 20 shtame fitoplazmash:

sëmundja Western X (Kirkpatrick et al., 1987; Lee et al., 1991b), Maryland aster

yellows (Lee et al., 1988a), apple proliferation (Kollar et al., 1990), clover

proliferation (Deng and Hiruki, 1990b), zverdhja letale e palmës (Harrison et al., 1992), etj.



30

Përdorimi i fragmenteve të klonuara të ADN-së të fitoplazmave si probe në

hibridizimin ADN-ADN, siguron një dedektim me ndjeshmëri të lartë dhe specifik të

fitoplazmave në bimët e infektuara ose indet e insekteve (Kirkpatrick et al., 1987,

1900; Davis et al., 1988, 1990b, 1991; Lee and Davis 1988; Lee et al., 1988b, 1990a;

Deng and Hiruki, 1990b, c). Aplikimi i parë i suksesshëm i polymerase chain reaction

(PCR) në studimin e fitoplazmave, siguroi dedektimin më sensitiv të fitoplazmave

(Deng and Hiruki, 1990a). Artikuj të shumtë kanë raportuar zbulimin dhe

identifikimin e fitoplazmave nëpërmjet PCR (Ahren and Seemuller, 1992; Schaff et

al., 1992; Lee et al., 1993a, b, 1994; Davis and Lee, 1993; Schneider et al., 1993;

Gundersen et al., 1994a, b, 1996). Kombinimi i PCR me teknika biologjike,

molekulare si RFLP (restriction length fragment polymorphism) HMA (heteroduplex

mobility assay), sekuencimi i ADN-së etj, lejon klasifikimin gjenetik të fitoplazmave.

Diagnostikimi i fitoplazmave me test molekular mund të kalojë në fazat e mëposhtme:

- ekstraktimi i ADN-së gjenomike totale të mostrës që analizohet;

- shumëfishimi i ADN-së së patogjenit me primera universalë ose specifikë për

fitoplazma (PCR);

- identifikimi i grupit të fitoplazmës me teknikat molekulare si RFLP, nested-

PCR me primera specifikë për grupe të veçantë fitoplazmash, ose dot-blot

hybridization.

1.6.6.1 Hibridizimi i acideve nukleike

ADN-ja e klonuar e fitoplazmave, ose komplementarja e saj ARN-ja (Lee et al.,

1988b) me probe të shënuara, 32

P ose biotinë joradioaktive (Deng and Hiruki, 1990d)

është përdorur gjerësisht në hibridizimin dot-blot dhe Southern-blot, për zbulimin dhe

identifikimin e fitoplazmave tek bimë dhe insektet vektorë (Kirkpatrick et al., 1987,

1990; Davis et al., 1988, 1990a. b, 1991; Lee et al., 1988a, b, 1991a, b; Sears et al.,

1989; Bertaccini et al., 1990a, b; Bonnet et al., 1990; Kollar et al., 1990; Deng and

Hiruki, 1990c, 1991b; Chen and Chang, 1991; Hibben et al., 1991; Nakashima et al.,

1991; Chen et al., 1992; Shaw et al., 1993). Një numër probesh me prejardhje nga

fitoplazma të caktuara, janë përdorur për zbulimin e lidhjeve ndërmjet tyre. Në bazë të

hibridizimit dot-blot dhe Southern-blot, fitoplazmat e clover proliferation dhe potato

witches’ broom janë të lidhura ngushtësisht me njëra-tjetrën, por janë të ndryshme nga

fitoplazmat e aster yellows dhe clover phyllody (Deng and Hiruki, 1990b, c, d, 1991a,

b).

Studimet në lidhje me hibridizimin kanë treguar se fitoplazmat me origjina

gjeografike të ndryshme, ndajnë homologji të lartë të sekuencës të nukleotideve me

njëra-tjetrën. Ndërsa me mykoplazma të tjera të rritura në terrene artificiale kanë

homologji relativisht më të ulët (Davis et al., 1988, 1990a, b; Lee and Davis, 1988,

Lee et al., 1988b, 1990a; Nakashima et al., 1993).

Disa grupime të veçanta të gjenomave të shtameve të ndryshme janë realizuar në bazë

të analizave të hibridizimit dot-blot, Southern-blot dhe RFLP (Lee and Davis, 1988;

Lee et al., 1988a, 1990b, 1991b; Kuske et al., 1991a, b).



31

1.6.6.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR), fillimisht e parashtruar në një artikull nga Kleppe et

al., (1971) dhe e zhvilluar si një teknikë në mesin e viteve 1990 (Mullis et al., 1986;

Saiki et al., 1985, 1986), siguron një metodë shumë të ndjeshme për dedektimin e

ADN-së. Kjo teknikë mundëson kopjimin e një molekule të vetme të ADN-së, më

shumë se 1 miliard herë për disa orë. Numri i aplikimeve të PCR-së ka erdhur duke u

rritur në mënyrë eksponenciale, ashtu si dhe reaksioni i PCR-së. Kohët e fundit,

teknika e PCR-së është përdorur gjerësisht për dedektimin dhe klasifikimin e

fitoplazmave. Zbulimi i fitoplazmave nëpërmjet PCR-së është të paktën 100 deri në 1

milion herë më i ndjeshëm se zbulimi nëpërmjet metodës së hibridizimit dot-blot

(Deng, 1991; Chen et al., 1993). Testet e PCR-së të cilat përdorin primera universalë

të dizenjuar në bazë të sekuencës së 16S rADN-së, janë përdorur në mënyrë efektive

për zbulimin dhe identifikimin e një koleksioni të gjerë të fitoplazmave, të njohura

dhe të panjohura nga bimë të ndryshme dhe insektet vektorë (Deng and Hiruki, 1991a;

Ahrens and Semuller, 1992, Lee et al., 1993b; Namba et al., 1993; Schneider et al.,

1993; Wang et al., 1994; Pollini et al., 1996). Megjithatë, çiftet e primerave

universalë nuk aplikohen të vetme për studime epidemiologjike, ku një sëmundje e

caktuar është e lidhur me më shumë se një tip fitoplazme (Ceranic-Zagorac and

Hiruki, 1996). Çiftet e primerave specifikë, janë aplikuar për zbulimin e infeksioneve

të shkaktuara nga fitoplazma të ndryshme në një bimë të vetme (Deng and Hiruki

1990a; Lee et al., 1994; Namba et al., 1993b). Një teknikë PCR-je e modifikuar, e

quajtur recycled PCR, u zhvillua gjithashtu për të bërë të mundur dedektimin e

fragmenteve të ADN-së specifike të Mollicutës dhe fragmenteve të grupeve specifike

të fitoplazmave si banda të shumëfishta (Namba et al., 1993b). Për shkak të

përqëndrimit relativisht të ulët (Kollar et al., 1990) dhe shpërndarjes jo të rregullt të

fitoplazmave tek bimët bujtëse, një shumëfishim i vetëm në disa raste dështon të

dedektojë fitoplazmat nga bimët frutore dhe ato dekorative. Nested PCR, siguroi

specificitet më të lartë dhe rriti ndjeshmërinë e dedektimit mbi dhjetë herë, duke lejuar

zbulimin e lehtë të fitoplazmave nga të gjitha bimë e infektuara dhe insektet vektorë

(Gundersen and Lee, 1996). Për më tepër, shumëfishimi i fragmenteve specifike dhe

jospecifike nga bimët e shëndetshme mund të realizohet duke përdorur primera nga

gjeni 16S rARN (Deng and Hiruki, 1991a; Ahrens and Seemuller, 1992; Yoshikawa

et al., 1994; Nakamura et al., 1996). Përdorimi i primerave të dizenjuar në bazë të

sekuencave të nukleotideve të gjeneve të proteinave ribozomale, nuk realizon

shumëfishim të fragmenteve jospecifike dhe siguron dedektim më të besueshëm të

fitoplazmave (Yoshikawa et al., 1994; Nakamura et al., 1996). Përmbledhtas,

ndjeshmëria e dedektimit tregohet nëpërmjet kësaj renditje: nested PCR > direct PCR

> riboprobet e ARN-së > probet e dsADN-së > probet e oligonukleotideve >

antitrupat monoklonalë > antiserumet poliklonalë > ngjyrimi i ADN-së. Është e

dukshme se PCR-ja siguron dedektimin më të ndjeshëm të fitoplazmave.

1.6.6.3 Real-Time PCR për zbulim universal të fitoplazmave

Zbulimi me anë të Real-time PCR-së bazohet në matjen e fluoreshencës së emetuar

gjatë shumëfishimit. Dy lloje kryesore molekulash janë përdorur: agjentët insertues

ose probet fluorogjenike. SYBR e Gjelbër® është një agjent insertues i përdorimit

rutinë; megjithatë, ai lidhet në mënyrë jo specifike tek të gjithë amplikonet dhe në



32

këtë mënyrë ndikon fuqishëm në saktësinë e përcaktimit të sasisë dhe mund të çojë në

rezultate false pozitive. Probet fluorogjenike të tilla si probet TaqMan®, sigurojnë një

shkallë më të lartë specificiteti pasi ata kërkojnë jo vetëm hibridizim të probeve, por

edhe të probit TaqMan® në template. Duke qënë se përqëndrimi i fitoplazmave mund

të ndryshojë në mënyrë domethënëse gjatë sezonit dhe në inde të ndryshme të bimëve,

përcaktimi sasior i fitoplazmave mund të jetë i rëndësishëm. Gjithashtu, përcaktimi

sasior është i rëndësishëm në analizimin e bimëve për rezistencën kundër

fitoplazmozave. Nga ana tjetër, përcaktimi i sasisë nuk është gjithmonë esencial në

programet e indeksimit për fitoplazmat ose në testet diagnostikuese. Kur përcaktimi

sasior është i nevojshem, stadet e hollimit të përqëndrimeve të njohura duhet të

aplikohen në mënyrë paralele (Christensen et al., 2013).

1.6.6.4 Restriction Length Fragment Polymorphism (RFLP)

Aplikimet e hershme të RFLP-së për diferencimin dhe klasifikimin e fitoplazmave

ishin të kombinuara me hibridizimin dot ose Southern. Organizimi shumë i ngjashëm

i gjenomave të fitoplazmave PWB dhe CP, u identifikua nga analiza RFLP dhe

hibridizimi dot (Deng and Hiruki, 1991b; Lee et al., 1991a). Një studim krahasues i

grapevine flavescence doree dhe European grapevine yellows nëpërmjet RFLP-së dhe

probeve të biotiniluara të ADN-së, zbuloi se këto dy sëmundje ndanin disa rajone

homologe të sekuencës së ADN-së, por ishin të ndryshme nga njëra-tjetra (Davis et

al., 1992). Pesëmbëdhjetë fitoplazma të izoluara nga Amerika e Veriut dhe Europa u

studiuan gjithashtu nga analiza RFLP dhe u klasifikuan në tre grupe të ndryshme

gjenotipike (Lee et al., 1991a). Që prej përfshirjes së PCR-së në studimet rreth

fitoplazmave, analiza RFLP e 16S rADN-së së shumëfishuar nëpërmjet PCR-së, u

aplikua gjerësisht për identifikimin dhe klasifikimin e një game të gjerë të

fitoplazmave (Lee et al., 1993b; Namba et al., 1993b; Schneider et al., 1993;

Seemuller et al., 1994; Gundersen et al., 1994a, b, 1996; Ceranic-Zagorac and Hiruki,

1996). Njëmbëdhjetë grupe të ndryshme të 16S rADN dhe më shumë se 25 nëngrupe

janë identifikuar duke përdorur këtë metodë (Lee et al., 1993b; Gundersen et al.,

1994b, 1996). Megjithatë, fitoplazmat e lidhura më ngushtësisht nuk mund të

diferencohen nga analiza e fragmentit 16S rADN, për shkak të natyrës së tyre tejet

konservative (Lee et al., 1992b, 1993b; Griffiths et al., 1994a). Gjenet e proteinave

ribozomale, kanë një potencial më të madh për të zbuluar ndryshimet midis shtameve

të lidhura ngushtë (Gundersen et al., 1996). Studime të mëtejshme mbi profilet e

RFLP-së së sekuencave të gjeneve të proteinave ribozomale të fitoplazmave që janë

shumëfishuar nëpërmjet PCR-së, do të zbulojnë në një nivel më të hollësishëm

ndryshimet midis çdo grupi fitoplazmash.

1.6.6.5 Nested PCR, RFLP bazuar në gjenin 16S rADN

Identifikimi i fitoplazmave në nivel grupi aktualisht kryhet me anë të analizimit të

gjenit 16S rADN duke përdorur PCR/RFLP. Skema e parë e klasifikimit të

fitoplazmave është bazuar në analizimin me anë të RFLP-së të produkteve të 16S

rARN të shumëfishuara me anë të PCR-së, duke siguruar një mjet të besueshëm për

diferencimin e një koleksioni të gjerë të fitoplazmave (Lee et al., 1998). Ky sistem

lejoi klasifikimin e fitoplazmave në 19 grupe dhe më shumë se 40 nëngrupe dhe është



33

cilësuar si sistemi më i plotë dhe i pranuar më gjerësisht i klasifikimit deri tani.

Zbulimi në nivel ndjeshmërie të lartë dhe të saktë të këtyre mikroorganizmave është

parakusht për menaxhimin e sëmundjeve të shoqëruara me praninë e fitoplazmave.

Pas zbulimit të tyre, fitoplazmat kanë qenë të vështira për tu dedektuar për shkak të

përqëndrimit të tyre të ulët në bimët bujtëse, sidomos tek dru-frutorët, si dhe

shpërndarjes së tyre të çrregullt në gypat shoshë të bimëve të infektuara (Berges et al.,

2000). Janë zhvilluar mjaft primera të projektuar bazuar në sekuencen e 16S rADN-së

që janë universale për fitoplazmat ose specifikë për grupe të veçanta, ato mund të

përdoren në kombinime të ndryshme në sisteme të thjeshta, nested ose semi-nested

për zbulimin rutinë te fitoplazmave, si dhe për identifikimin e fitoplazmave të reja ose

bujtësve të rinj (Duduk et al., 2013). Përpjekjet për të përmirësuar proçedurat

diagnostike kanë për qëllim të zhvillojnë metoda të shpejta, ekonomike dhe efektive.

Ndjeshmëria nuk është një çështje në vetvete, pasi protokollet e tanishme të Nested

PCR-së janë jashtëzakonisht të ndjeshëm. Arritja e niveleve të larta të ndjeshmërisë

pa rrezikun e rezultateve të rreme pozitive që mund të shoqërojnë nested PCR-në

është tepër e rëndësishme. Megjithatë, për shkak të natyrës shumë kompakte të

gjeneve 16S rARN dhe të pranisë jo të pazakontë të sekuencës heterogjene të

interoperonit të 16S rADN-së, janë zhvilluar disa mjete shtesë për analizimin

filogjenetik dhe diferencimin më të mirë të shtameve. Diferencimi i fitoplazmave në

mënyrë rutinë është i bazuar në sekuencat e gjeneve 16S rARN, dhe është kryer me

anë të RFLP-së të sekuencave të shumëfishuara të ADN-së përmes PCR-së duke

përdorur 17 enzima restriksioni (endonukleaza) (Lee et al., 1998). Kjo proçedurë

lejon identifikimin e shumicës së fitoplazmave në nivel grupi/nëngrupi 16Sr, çka e

bën të rëndësishme për qellime të epidemiologjisë dhe karantinave. Duke qenë se

karakteristikat e dokumentuara të profileve të RFLP të çdo fitoplazme ruhen (për të

dy amplikonet R16F2/R16R2 dhe P1/P7), fitoplazmat e panjohura mund të

identifikohen duke krahasuar profilet e tyre me ato të fitoplazmave të njohura, pa

pasur nevojë për të analizuar të gjitha fitoplazmat referencë në të njëjtën kohë. Në

disa raste, mostra mund të përmbajë fitoplazma me prani të sekuencave heterogjene të

interoperonit të 16S rADN-së ose fitoplazma të përziera. Profilet e RFLP-së do të

shfaqen të pazakonta, dhe madhësia në total e gjithë fragmenteve do të jetë më e

madhe se ajo e amplikonit të pritshëm. Në rastin e infeksioneve të përziera është i

rekomanduar përdorimi i primerave specifikë, kur janë të disponueshëm.

Tabela 1.2 Primerat specifikë për amplifikimin e rajonit 16Sr ADN tek fitoplazmat (Duduk et

al., 2013). Primeri Specificiteti 16S Sekuenca 5’-3’ Pozicioni

P1 Universal AAGAATTTGATCCTGGCTCAGGATT 16S rADN

P7 Universal CGTCCTTCATCGGCTCTT 28S rADN

RO Universal GAATACCTTGTTGTTACGACTTAACCCC 16S rADN

P3 Universal GGATGGATTCACCTCCTT 16S rADN

P4 Universal GAAGTCTGCAACTCGACTTC 16S rADN

P5 Universal CGGCAATGGAGGAAACT 16S rADN

R16F2n Universal GAAACGACTGCTAAGACTGG 16S rADN

R16R2 Universal TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 16S rADN

F1 Universal AAGACGAGGATAACAGTTGG 16S rADN



34

B6 Universal TAGTGCCAAGGCATCCACTGTG 1S

R16mF2 Universal CATGCAAGTCGAACGGA 16S rADN

R16mR2 Universal CTTAACCCCAATCATCGA 16S rADN

P1A Universal AACGCTGGCGGCGCGCCTAATAC 16S rADN

16Sr-SR Universal GGTCTGTCAAAACTGAAGATG 1S

P7A Universal CCTTCATCGGCTCTTAGTTGC 28S rADN

Pc399 Universal AACGCCGCGTGAACGATGAA 16S rADN

Pc1694 Universal ATCAGGCGTGTGCTCTAACC IS

fU5 Universal CGGCAATGGAGGAAACT 16S rADN

rU3 Universal TTCAGCTACTCTTTGTAACA 16S rADN

PA2f Universal GCCCCGGCTAACTATGTGC 16S rADN

PA2r Universal TTGGTGGGCCTAAATGGACTC 1S

M1(758F) Universal GTCTTTACTGACGC 16S rADN

M2(1232R) Universal CTTCAGCTACCCTTTGTAAC 16S rADN

SN901601 Universal GTTTGATCCTGGCTCAGGATT 16S rADN

SN910502 Universal AACCCCGAGAACGTATTCACC 16S rADN

R16(I)F1 I, II, XII, XV TAAAAGACCTAGCAATAGG 16S rADN

R16(I)R1 I, II, XII, XV CAATCCGAACTAAGACTCT 16S rADN

R16(III)F2 III AAGAGTGGAAAAACTCCC 16S rADN

R16(III)R1 III TTCGAACTGAGATTGA 16S rADN

R16(V)F1 V TTAAAAGACCTTCTTCGG 16S rADN

R16(V)R1 V TTCAATCCGTACTGAGACTACC 16S rADN

R16(X)F1 X GACCCGCAAGTATGCTGAGAGATG 16S rADN

R16(X)R1 X CAATCCGAACTGAGAGTCT 16S rADN

fO1 X CGGAAACTTTTAGTTTCAGT 16S rADN

rO1 X AAGTGCCCAACTAAATGAT 16S rADN

1.6.6.6 PCR, RFLP bazuar në operonin proteinik ribozomal

Deri tani, janë identifikuar 31 grupe 16Sr dhe më shumë se 100 nëngrupe 16Sr.

Megjithatë, për shkak të natyrës së tij të konservuar, gjeni 16s rARN shpesh nuk

mund të përdoret i vetëm për të bërë dallimin mes shtameve të lidhura ngushtë, por

ekologjikisht të veçanta. Kjo nënvizon nevojën për të kërkuar markerë të tjerë që

lejojnë diferencimin më të detajuar të shtameve të lidhur ngushtë. Disa gjene më pak

të konservuar, duke përfshirë edhe gjenet e proteinave ribozomale (rp), janë të

përshtatshëm si markerë molekularë plotësues për diferencim më të detajuar të

shtameve (Lee et al., 2010). Gjenet e proteinave ribozomale (rp) janë më variabël se

gjenet 16S rARN dhe kanë më shumë karaktere informative filogjenetikë, të cilat në

thelb rritin fuqinë diferencuese të klasifikimit të shtameve fitoplazmatike brenda një

grupi të caktuar 16Sr. Studimet e mëparshme për diferencimin e fitoplazmave në

grupet 16SrI dhe 16SrV treguan se analiza e sekuencave gjenike rp jo vetëm që

identifikoi qartë nëngrupet që janë në përputhje me nëngrupet 16Sr por identifikoi

edhe brenda disa nëngrupeve, shtame të tjera të dallueshme që nuk mund të

identifikohen nga analiza e sekuenca gjenike shumë të konservuara 16S rARN.



35

Përkatësisht dhjetë dhe dymbëdhjetë nëngrupe RFLP-je janë të diferencuara në bazë

të sekuenca gjenike të proteinave ribozomale në shtamet fitoplazmatike 16SrI dhe

16SrV. Shumica e shtameve të tjera të identifikuara kanë veti të veçanta biologjike

dhe ekologjike (Lee et al., 1998).

Tabela 1.3 Primerat e bazuar në gjenet rp, gjysëmuniversale, 16Sr grup-specifikë dhe 16Sr

nëngrup-specifikë të dizenjuar për amplifikimin e një pjese të operonit rp të fitoplazmave

(Martini and Lee, 2013).

1.6.6.7 T-RFLP për zbulim dhe identifikim

Terminal restriction fragment length polymorphism analysis (T-RFLP) është një

teknikë e zhvilluar për herë të parë në vitin 1997 për profilizimin e komuniteteve

mikrobiale bazuar në vendndodhjen e siteve të restriksionit enzimatik brenda një

sekuence ADN-je (Liu et al., 1997). Kjo teknikë kombinon PCR-në me një primer të

shënuar me fluoreshencë, tretjen me enzima restriksioni duke përfshirë një ose më

Çifti i primerave Sekenca (5’ -3’) Vendndodhja Madhësia e

produktit

(bp)

Specificiteti

rpF1/rpR1 GGACATAAGTTAGGTGAATTT

ACGATATTTAGTTCTTTTTGG

rpsS

rplP

1,245-1,389 16SrI, III-V, VII-

IX, XIII

rp(I)F1A/rp(I)R1A TTTTCCCCTACACGTACTTA

GTTCTTTTTGGCATTAACAT

rpsS

rpsC/rplP

1,200 16SrI

rp(I-A)F1/rp(I-A)R1 CAAGAGCTAAAGGTTCTGGC

GAGGGCGCCTGTTAGGGTTA

rplV

rpsC

800 16SrI-A

rp(I-B)F1/rp(I-B)R2 AAGAGCTAAAGGTTCTGGT

GAGGGCGTCTGTTAGGAGTG

rplV

rpsC

800 16SrI-B

rpL2F3/rp(I)R1A TCCTTGGGGYAAAAAAGCTC


rplB

rpsC/rplP

1,600 16SrI, III-VII, IX,

X, XII, XIII, XVIII

rpF1C/rp(I)R1A ATGGTDGGDCATAARTTAGG


rpsS

rpsC/rplP

1,212-1,386 16SrI, II-VII, IX,

X, XII, XIII, XVIII

rp(II)F1/rp(II)R1 GCTCTTACTCGTAAAYATGTAGT

TTACTTGATTTTCTGGTTTTGA

rpsS

rpsC

1,200 16SrII

rp(II)F/rp(I)R1A ACTTATTCTCGTGATACTAG


rpsS

rpsC/rplP

1,390 16SrII

rp(II)F2/rp(I)R1A ATGGTAGGTTATAAATTAGG


rpsS

rpsC/rplP

1,290 16SrII

rp(III)F1/rp(III)R1 TTAGAGAAGGCATTAAAC

CTCTTTCCCCATCTAGGACG

rpsS

rpsC

1,200 16SrIII

rp(V)F1/rpR1 TCGCGGTCATGCAAAAGGCG


rpsS

rplP

1,200 16SrV

rp(V)F2/rpR1 TTGCCTCGTTTATTTCCGAGAGCTA


rplV

rplP

950 16SrV

rp(V)F1A/rp(V)R1A AGGCGATAAAAAAGTTTCAAAA

GGCATTAACATAATATATTATG

rpsS

rplP

1,200 16SrV

rp(VI)F2/rp(VI)R2 GGTTGTTGATTTAATTCGTGGTC

CCAGATATTCGTCTAGTATCAGAA

rplV

rpsC

1,000 16SrVI

rp(VIII)F2/rp(VIII)R2 AGTTGTCGATTTAATTCGTGGCA

CAGCAGATATTTGTCTAGTATCTGCG

rplV

rpsC

1,000 16SrVII, VIII

rp(IX)F2/rp(IX)R2 GCACAAGCTATTTTAATGTTTACACCC

CAAAGGGACTAAACCTAAAG

rplV

rpsC

800 16SrIX

rpAP15f2/rp(I)R1A CTCCTAAATCAGCTTCAAGT

TTCTTTTTGGCATTAACAT

rplV

rpsC/rplP

1,036 16SrX-A

rpAP15f/rpAP15r AGTGCTGAAGCTAATTTGG

TGCTTTTTATAGCAAAAGGTT

rplV

rpsC

920 16SrX-A

rpStolF/rpStolR CGTACAAAATAATCGGGAGA

CGAAACAAAAGGTTTACGAG

rplB

rpsC

1,372 16SrXII-A

rpStolF2/rpStolR AAACTTGGTCACGTAGTTCC

CGAAACAAAAGGTTTACGAG

rplP

rpsC

1,253 16SrXII-A



36

shumë enzima, dhe ndarjen e fragmenteve me një sekuencator automatik të ADN-së

nëpërmjet elektroforezës me rezolucion të lartë, për të lejuar zbulimin e produkteve

fluoreshente të shënuara me ngjyrues, të quajtura terminal restriction fragments

(TRFs). Vetëm kohët e fundit me përdorimin në masë të Real-time PCR-së është bërë

teknikë rutinë për analizim, çka demonstron se ekstraktimi i ADN-së ka qenë i

suksesshëm dhe se përgatitja e ADN-së mbështet shumëfishimin me anë të PCR-së.

Duke qënë se ky është një hap vital, nga të dy teknikat, si nga ajo konvencionale dhe

Real-time PCR-ja, zakonisht kërkohet që të kryhen dy teste individuale. Një avantazh

kryesor i T-RFLP-së është se në një reaksion të vetëm një sërë primerash

shumëfishojnë si ADN-në bimore dhe atë fitoplazmatike, dhe gjenerohen TRF të cilat

përfaqësojnë si bimën dhe fitoplazmat. Kjo do të thotë konfirmim të lehtë dhe të

shpejtë të mungesës së rezultateve negative të rreme dhe arrihet duke konfirmuar

cilësinë e ADN-së dhe mungesën e inhibitorëve. Mungesa e TRF-ve si të bimëve dhe

të fitoplazmave tregon ose prani të inhibitorëve ose ADN jo të amplifikueshme, dhe

përjashton në këtë mënyrë mostrat me rezultate të rreme negative. Po aq e

rëndësishme sa zbulimi i rezultateve negative të rreme është edhe problemi i

rezultateve false pozitive. Duke përdorur T-RFLP-në, kjo e metë është eliminuar pasi

çdo grup 16Sr prodhon TRFs të cilat janë të veçanta dhe karakteristike me

kombinimin e dy enzimave të restriksionit. Nëse TRF të tjerë do të ishin të pranishëm,

atëherë kjo do të tregonte ose prani të një grupi të ri fitoplazmatik ose një specie të

mundshme jo target, duke identifikuar një mostër të mundshme me rezultat të rremë

pozitiv. Për të krijuar TRF korrekte për një grup të caktuar, duhet të përcaktohet

sekuenca 23S rARN, dhe më pas tretja me enzimat e dhëna mund të kryhet për të

parashikuar përmasat e TRF-ve. Kjo mundëson zhvillim të vazhduar të teknikës

paralel me zbulimin e llojeve të reja të fitoplazmave (Hodgetts J. and M. Dickinson,

2013). Kjo teknikë synon 23S rARN-në, një gjen në shumë kopje. Ky synim siguron

primera që janë universalë për të gjitha fitoplazmat e njohura deri më tani, megjithatë

ka një nivel mesatar të ndjeshmërisë. Ndjeshmëria e T-RFLP-së varion ndërmjet asaj

të PCR-së konvencionale dhe Real-time PCR-së. Kombinimi i gjithë këtyre faktorëve

(ndjeshmërisë, zbulimit universal, zbulimit të rezultateve negative të rreme dhe atyre

false pozitive) e bëjnë T-RFLP-në një mjet i cili është veçanërisht i përshtatshëm për

situata të tilla si p.sh screening, ku për një numër të madh mostrash kërkohet

screening dhe konfirmim i grupit fitoplazmatik 16Sr. Në disa situata kjo mund të jetë

më e përshtatshme se Real-time PCR-ja pasi identifikon fitoplazmat në një hap të

vetëm. T-RFLP ka gjithashtu aftësinë për të zbuluar një sërë infeksionesh që

përfshijnë praninë e fitoplazmave nga grupe të ndryshme filogjenetike pasi ato mund

të dedektohen në të njëjtin analizim. Megjithatë T-RFLP është më pak e përshtatshme

për identifikimin e një grupi të ri fitoplazmatik, ku teknikat të cilat bartin nivelet më të

larta të ndjeshmërisë do të ishin më të përshtatshme (Hodgetts J. and M. Dickinson,

2013).

1.6.6.8 Heteroduplex Mobility Assay (HMA)

Heteroduplex mobility assay (HMA), u zhvillua fillimisht për zbulimin dhe

vlerësimin e divergjencave gjenetike midis shtameve të virusit të imunodefiçencës

humane (HIV) (Delwart et al., 1993). HMA është një mjet shqyrtimi i ri, i shpejtë, i

thjeshtë dhe është i aftë jo vetëm të bëjë dallimin ndërmjet shtameve të veçanta, por

edhe të sigurojë konkluzione të besueshme në lidhje me marrëdhëniet filogjenetike të



37

shtameve të mikroorganizmave. HMA bazohet në vëzhgimin e heteroduplekseve të

ADN-së të formuara midis fijeve teke të nukelotideve të ndryshme, që kanë një

lëvizshmëri të reduktuar në xhelin poliakrilamid nën kushte jodenatyruese.

Lëvizshmëria e tyre është proporcionale me shkallën e divergjencës së tyre.

Heteroduplekset krijohen nga çiftimi i bazave midis fijeve teke komplementare me

prejardhje nga molekula të ndryshme dupleks prindërore gjatë rikombinimit gjenetik.

Sekuencat e panjohura të ADN-së mund të krahasohen me sekuenca standarde

reference. Sekuenca gjenetike e varianteve të zakonshme ose të rralla, mund të

përcaktohet më mirë nga përzgjedhja e bazave sesa nga bazat e rastësishme.

Gjithashtu, analiza heterodupleks mund të përdoret për gjurmimin e sekuencave të

varianteve brenda mostrave individuale, (Delwart et al., 1994) duke ndihmuar në

zbulimin e lidhjeve epidemiologjike midis mostrave individuale. Kohët e fundit,

HMA është përdorur për zbulimin dhe diferencimin e fitoplazmave (Zhong and

Hiruki, 1994; Ceranic-Zagorac and Hiruki, 1996; Cousin et al., 1997). Të gjitha

rezultatet për diferencimin e fitoplazmave nga HMA ishin në përputhje me rezultatet e

fituara nga PCR-ja dhe në veçanti nga analiza RFLP. Hapi i dytë i RFLP-së mbas

shumëfishimit me PCR për klasifikimin e fitoplazmave, mund të shmanget nga HMA.

Është demostruar se HMA siguron diferencim të ndjeshëm të fitoplazmave ndërkohë

që metodat e tjera si RFLP-ja nuk aplikoheshin për diferencimin midis fitoplazmave

të lidhura shumë ngushtë me njëra-tjetrën (Ceranic-Zagorac and Hiruki, 1996; Cousin

et al., 1997). Natyrisht, HMA e kombinuar me PCR-në do të jetë një metodë shumë e

thjeshtë, e shpejtë, e ndjeshme dhe e sigurt për dedektimin dhe klasifikimin e

shtameve dhe grupeve të ndryshme të fitoplazmave (Wang, 1997).

1.6.6.9 Analiza e polimorfizmit të konformacionit një vargor për

diferencimin e shtameve fitoplazmatike (SSCP)

Analiza Single-strand conformation polymorphism (SSCP) është një nga metodat më

të thjeshta teknikisht për zbulimin e shpejtë të ndryshimeve të nukleotideve në çdo

sekuencë të caktuar të ADN-së. Teknika është e bazuar në lëvizshmërinë e

ndryshueshme elektroforetike të fragmenteve një vargore të ADN-së (ssADN) që

kanë struktura të ndryshme primare (Orita et al., 1989). Zakonisht fragmentet e ADN-

së, të shumfishuara me anë të PCR-së, i nënshtrohen denatyrimit kimik dhe/ose me

ngrohje dhe më pas elektroforezës në xhel poliakrilamid jo-denatyrues. Fijet një-

vargore të ADN-së me strukturë parësore të veçantë çojnë në konformacione të

ndryshme si rezultat i vetë-komplementaritetit dhe ndërveprimeve ndërmolekulare.

Në kushte të përshtatshme elektroforetike, ssADN të ndryshme migrojnë me shpejtësi

të ndryshme, dhe mundësojnë zbulimin e pranisë të mutacioneve. Megjithatë, saktësia

e kësaj metode në zbulimin e zëvendësimeve nukleotidike është vlerësuar në

intervalin 80-95% (Ravnik et al., 1994).

1.6.6.10 Microarrays për zbulim dhe identifikim universal

Microarrays janë mjete të fuqishme për identifikimin dhe diferencimin e

mikroorganizmave duke përfshirë edhe patogjenët bimorë. Si test mund të kryhet në

mënyrë paralele për shumë organizma, shembujt përfshijnë microarrays për zbulimin

e nematodëve, kërpudhave, baktereve, fitoplazmave dhe viruseve. Shumica e arrays të



38

ADN-së për zbulimin e patogjenëve janë të bazuara në probet oligonukleotidike të

fiksuara në pllaka xhami, duke lejuar analizimin e një mostre në çdo pllakë

(Nicolaisen et al., 2013). Faktor kyç në zhvillimin e mikroarrays është dizenjimi i

probeve. Hartimi i probeve fillon me identifikimin e rajonit më të përshtatshëm të

synuar për dizenjimin e probit. Duke qënë se PCR-ja përdoret më shpesh për

amplifikimin e ADN-së së synuar, rajoni me interes i ADN-së duhet të jetë lehtësisht i

shumëfishueshëm për të gjitha shtamet dhe duhet të përmbajë mjaftueshëm ndryshime

për diferencim në nivelin e dëshiruar.



39

KAPITULLI II

MATERIALE DHE METODA

2.1 Materiali bimor i analizuar

2.1.1 Llojet e bimëve, plantacionet

Studimi është realizuar në periudhën kohore Prill 2012 - Tetor 2016. Materiali i

përdorur për zbulimin e fitoplazmave është grumbulluar nga dy gjini të ndryshme të

familjes Rosaceae, mollë (Malus domestica) dhe kumbulla (Prunus domestica).

Gjithsej janë përzgjedhur mostra nga gjashtë plantacione, përkatësisht tre me mollë

(plantacionet Bitinckë, Korçë, Turan) (fig 2.1; 2.2; 2.3) dhe tre me kumbulla

(plantacionet Cangonj, Dvoran, Zëmblak) (fig 2.4; 2.5; 2.6).

Plantacioni Bitinckë ka 150 rrënjë mollë, të gjitha kultivarë Idared me moshë 14

vjeçare.

Figura 2.1 Plantacioni Bitinckë, majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në terren.

Foto D. Mero.



40

Plantacioni Korçë ka 1500 rrënjë mollë të kultivarëve të ndryshëm, me mosha të

ndryshme. Varietetet e zgjedhura për studim janë Gloden Delicious, Rennete dhe

Starking Delicious.

Figura 2.2 Plantacioni Korçë. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga terreni. Foto

nga D.Mero.

Plantacioni Turan ka 375 rrënjë mollë të kultivarëve Golden Delicious dhe Starking

Delicious me moshë 8 vjeçare.

Figura 2.3 Plantacioni Turan. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në terren. Foto

D. Mero.



41

Plantacioni Cangonj ka 200 rrënjë kumbulla kultivarë Tropojane dhe Iliria, me moshë

7 vjeçare.

Figura 2.4 Plantacioni Cangonj. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në terren.

Foto D. Mero.

Plantacioni Dvoran ka 420 rrënjë kumbulla, kultivarë Tropojane dhe Iliria me mosha

të ndryshme.

Figura 2.5 Plantacioni Dvoran. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga terreni.

Foto nga D.Mero.



42

Plantacioni Zëmblak ka 200 rrënjë kumbulla kultivarë Tropojane dhe Iliria, me

moshë 14 vjeçare.

Figura 2.6 Plantacioni Zëmblak. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga

terreni. Foto nga D.Mero.

2.1.2 Metoda e marrjes së mostrave

Tek secili prej plantacioneve janë përzgjedhur dhjetë bimë në një kuadrat prej 100

bimësh, pra gjithësej 30 drurë të mollëve dhe 30 drurë të kumbullave. Përzgjedhja e

përfaqësuesve është bërë në mënyrë rastësore duke u bazuar tek skemat X, Y, Z, W.

Drurët u identifikuan me numra nga 1-10, të cilët u shënuan në trungun e bimëve me

ngjyrues rezistent (fig 2.7) dhe njëkohësisht në fletore u ruajtën numrat, përbri të

cilëve u vendosen karakteristikat dhe koordinatat për tu siguruar që do të zgjedhim të

njëjtat bimë.

Figura 2.7 Ilustrim i mënyrës së shënimit të kampioneve; Druri 2, plantacioni Zëmblak

(majtas), Druri 1 Bitinckë (djathtas). Foto D. Mero.



43

Në varësi të llojit të teknikës së përdorur për dedektim, u përcaktua periudha e marrjes

së mostrave dhe lloji i materialit bimor. Për dedektimin e fitoplazmave nëpërmjet

mikroskopisë me fluoreshencë u grumbullua material bimor i kategorisë gjethe gjatë

periudhës së pranverës dhe rrënjë gjatë periudhës së dimrit. Për dedektimin në bazë të

metodave molekulare materiali i grumbulluar është i katër kategorive të ndryshme:

rrënjë dhe trung, grumbulluar në vjeshtën e vonë dhe dimër, kërcell dhe gjethe,

grumbulluar në pranverën e vonë dhe verë (Seemüller et al., 1984, etj) (fig 2.8).

Figura 2.8 Grumbullimi i mostrave; a. kategoria gjethe, druri 9, plantacioni Zëmblak, b.

kategoria trung, druri 1, plantacioni Korçë, c. kategoria kërcell, druri 10, plantacioni Bitinckë,

d. kategoria rrënjë, druri 3, plantacioni Zëmblak.

Gjatë grumbullimit u patën parasysh disa kritere duke ditur se mënyra e grumbullimit

të materialit bimor ndikon drejtpërdrejt në rezultatin e analizave (Scot C. Nelson and

Brian C. Bushe., 2006).

a. Nga e gjithë bima grumbullohen 5 mostra të secilës prej kategorive në 5 vende

të ndryshme (karakteristika kryesore e infeksionit të shkaktuar nga fitoplazmat

është përhapja jo e rregullt në të gjithë bimën; një mostër e vetme mund të

japë rezultat të gabuar).

b. Mos kontaminimi i bimëve nga njëra-tjetra gjatë marrjes së mostrave është

shumë i rëndësishëm (mjetet ndihmëse për grumbullimin e materialit, mbas

marrjes së tij nga njëra bimë tek tjetra, janë dezinfektuar).

c. Pjesët e vdekura të bimës nuk duhet të grumbullohen (fitoplazmat ushqehen

nga indi i floemës dhe nëse qelizat e tij do jenë të vdekura, fitoplazmat nuk do

jenë më të lokalizuara tek ajo pjesë).



44

d. Mbas grumbullimit shumë e rëndësishme është ruajtja në kushte të caktuara

(mostrat nuk duhet të ekspozohen ndaj diellit pasi ndodh dehidratimi i tyre).

e. Paketimi dhe transporti (mostrat futen në qese plastike ku janë shënuar numri i

drurit, data e grumbullimit, kategoria e materialit bimor, emri i plantacionit

dhe transportohen brenda 24 orësh drejt laboratorit në termobokseve me

temperaturë 4C) (fig 2.9).

Figura 2.9 Gjatë grumbullimit të materialit bimor, kategoria gjethe (Plantacioni Turan).

Materiali bimor i grumbulluar, në varësi të kategorisë plotësoi kushtet e mëposhtme:

1. Gjethe - të plota, me bisht, duke qënë se përdoren nervurat kryesore të tyre.

2. Kërcell - të rinj sepse lehtësojnë proçesin e grirjes dhe mundësia që të ketë

prani fitoplazmash në to është më e madhe.

3. Trung - mostrat e trungut merren në mënyrë vertikale deri në thellësinë e

floemës, me qëllim mos dëmtimin e bimës.

4. Rrënjë - të reja pasi tek ato ka përqëndrim më të madh të fitoplazmave dhe

ofrojnë lehtësi gjatë proçesit të grirjes (fig 2.10).



45

Figura 2.10. Mostrat e transportuara në laboratorin e Bioteknologjisë Molekulare, FSHN,

UT, a. kategoria kërcell, b. kategoria trung, c. kategoria rrënjë, d. kategoria gjethe.

2.2 Metodat e diagnostikimit

2.2.1 Vlerësimi i plantacioneve në bazë të simptomave

Vlerësimi i plantacioneve në bazë të simptomave u krye sipas Scot C. Nelson and

Brian C. Bushe., 2006. Për vlerësimin simptomatologjik u patën parasysh kushtet si

vijojnë.

a) Para marrjes së materialit e gjithë bima vrojtohet për simptoma (e njëjta bimë

mundet të jetë e prekur nga një ose disa infeksione njëkohësisht).

b) Gjatë vëzhgimit të materialit bimor, fotografimi dhe mbajtja e shënimeve luan

rol thelbësor (një përshkrim sa më i detajuar i karakteristikave të bimës

shërben për kuptuar më mirë problemin).

c) Bimët vëzhgohen në të gjitha stinët (shenjat më karakteristike shfaqen në

verën e vonë ose në mesin e vjeshtës).

d) Bimët vëzhgohen për simptoma të dukshme përgjatë disa viteve (simptomat

shfaqen në mënyrë jo të rregullt, disa bimë mund të shfaqin simptomat tipike

të fitoplazmave vetëm një herë).

e) Gjatë periudhës aktive të bimëve, ato vëzhgohen dhe vlerësohen për praninë e insekteve (insektet janë vektorët kryesorë për përhapjen e infeksioneve fitoplazmatike).



46

f) Për çdo bimë plotësohet formulari me datën dhe karakteristikat në momentin e

vëzhgimit.

Figura 2.11. Formulari për vlerësimin simptomatologjik të bimëve.

2.2.2 Metoda e ngjyrimit DAPI

Materiali bimor i përdorur është i kategorisë gjethe. U provua zbulimi i fitoplazmave

edhe në materialin bimor me origjinë nga rrënja por teknika rezultoi jo e suksesshme.

Gjethet e grumbulluara u transportuan brenda 60 minutave në laborator. Gjithësej u

analizuan 600 mostra, përkatësisht 5 mostra nga secili prej 10 drurëve të çdo

plantacioni (gjithësej 6 plantacione). Analiza u përsërit për 2 vite njëri mbas tjetrit.

Metoda e mikroskopisë fluoreshente me ngjyruesin DAPI u realizua në laboratorin e

Biologjisë, Fakulteti i Shkencave Natyrore dhe Humane, Universiteti ―Fan. S. Noli‖,

Korçë.



47

2.2.2.1 Protokolli i metodës së ngjyrimit DAPI

1. Materiali bimor i përdorur ishin gjethe të freskëta me bisht, 5 gjethe për

çdo trung x 10 pemë për plantacion x 6 plantacione.

2. Metodika e realizimit të ngjyrimit DAPI u krye sipas Andrade, 2013 me disa modifikime të vogla.

Metoda:

1. Solucioni stok është holluar në përqëndrimin e punës (1x); është marrë 100 l

e solucionit stok (1,000x) dhe është shtuar 100 ml H2O i distiluar. Solucioni i

punës është ruajtur në 4C.

2. Materiali bimor, është prerë në gjatësi 1 cm dhe është vendosur në ujë të

distiluar.

3. Mostrat janë zhytur në glutaraldehid dhe janë fiksuar për 20 min.

4. Mostrat janë hequr nga solucioni i glutaraldehidit dhe janë shpëlarë me bufer

KH2PO4 0,1M, pH 6,9 për 5 min. Mostrat janë kaluar në bufer të freskët

KH2PO4, 0,1 M, pH 6,9.

5. Janë bërë prerje tërthore me bisturi nga mostrat e fiksuara.

6. Seksionet e mostrave janë vendosur në ngjyruesin DAPI (1x solucioni i punës)

për 25 min.

7. Seksionet janë hequr nga ngjyruesi dhe janë vendosur në ujë të distiluar në

mënyrë që të largohej ngjyruesi i tepërt.

8. Menjëherë seksionet janë vendosur mbi lamë dhe sipër i është vendosur

lamela.

9. Preparatet janë vëzhguar me mikroskop me fluoreshencë me zmadhimet 10x,

40x dhe 100x.



48

Figura 2.12. a. Mikroskopi me fluoreshencë, b. mostrat e transportuara në laborator c. mjetet

e punës d. momente gjatë punës për realizimin e metodës DAPI.

Figura 2.13. Vëzhgimi i imazhit të prerjeve të ngjyrosura me ngjyruesin fluoreshent DAPI në

kompjuter.

2.2.3 Metoda të bazuara në PCR

Diagnostika molekulare e pranisë së infeksionit fitoplazmatik u bazua në

shumëfishimin specifik të rajoneve ribozomale dhe jo-ribozomale të ADN-së së



49

pasuruar fitoplazmatike të ekstraktuar prej mostrave bimore. Kjo kategori analizash u

krye pranë Laboratorit të Bioteknologjisë Molekulare të Departamentit të

Bioteknologjisë, FSHN, UT.

2.2.3.1 Protokolli i ekstraktimit të ADN-së të pasuruar në fitoplazma

ADN u ekstraktua nga kategoritë e mostrave gjethe, kërcell, trung dhe rrënjë, sipas

protokollit të pasurimit me ADN fitoplazmatike të përshkruar nga Seemuller et al.,

1994.

Metoda:

1. 1.5g material bimor (gjethe, kërcell, trung, rrënjë) është coptuar imët në një

havan të ftohtë i cili përmbante 8 ml bufer për grirje (4 ose -20C).

2. Është inkubuar në akull për 10-20 min.

3. Është shtuar edhe 5 ml bufer i freskët dhe është vazhduar përsëri grirja në

havan (shtimi i rërës së kuarcit ndihmon bluarjen) deri sa të jetë bluar i gjithë

materiali.

4. Homogjenati është transferuar në tuba falkon 15 ml të cilët janë mbajtur në

akull deri sa janë bërë gati të gjitha mostrat të cilat janë vendosur më pas për

centrifugim në 4C në 2000 g (1320 rpm).

5. Supernatanti është filtruar dhe është ricentrifuguar në 4C në 14600 g (9727

rpm)

6. Pelleti është tretur në 1.5 ml bufer ekstraktimi të ngrohtë (60C) dhe është

inkubuar në 60C për 30 min.

7. Lizati është ekstraktuar në volum të njëjtë kloroform-izoamilalkool (24:1)

8. Pas centrifugimit shtresa ujore është precipituar me 2/3 e volumit izopropanol

(-20C) dhe është centrifuguar në 14600 g (9727 rpm).

9. Pelleti është shpëlarë në etanol 70%.

10. Tubat janë centrifuguar për 5 min në 14000 rpm.

11. Tubat janë tharë në vakum, dhe pelleti është tretur në 100 µl H2O.

12. Është shtuar RNA-zë 1µl dhe mostrat janë inkubuar për 30 min në 37C.

13. Është shtuar 100 µl kloroform/izoamilalkool (24:1).


15. Është marrë shtresa ujore.

16. Është shtuar kloroform/izoamilalkool (24:1) sa shtresa ujore.

17. Tubat janë cenrifuguar për 5 min në 14000 rpm.

18. Është marrë shtresa ujore.

19. Është shtuar 200 µl ETOH 100% (-20C).


21. Pelletit i është shtuar 200 µl ETOH 70% (-20C).


23. Tubat janë tharë dhe janë tretur në 100 µl TE.

Gjithsej u realizuan 240 ekstraktime, përkatësisht për dhjetë drurë nga çdo plantacion

(gjashtë plantacione), nga katër kategoritë e ndryshme të materialit bimor (rrënjë,

trung, kërcell, gjethe).



50

Pas ekstraktimit të ADN-së fitoplazmatike u analizua cilësia dhe sasia e saj në

spektrofotometër. Në disa raste mostrat, pas matjeve të sasisë dhe cilësisë, u

riprecipituan dhe ripastruan sipas Sambrook, et al., 1989.

Metoda:

1. Është shtuar 100 µl fenol pH=8.

2. Tubat janë vendosur në vortex për 1 min.

3. Janë centrifuguar për 5 min në 14000 rpm.

4. Është marrë shtresa ujore 100 µl.

5. Është shtuar 50 µl fenol (pH=8)

6. Tubat janë vendosur në vortex për 1 min.


8. Është marrë shtresa ujore 100 µl.

9. Është shtuar 250 µl EtOH 100%.

10. Është shtuar 10 µl NaOAc 3M.

11. Tubat janë vendosur në -20C për 1 orë.

12. Tubat janë centrifuguar për 10 min në 4C në 14000 rpm.

13. Pelleti është tretur në 50 µl TE.

Figura 2.14 Pamje nga puna për ekstraktimin e ADN. Laboratori i Bioteknologjisë

Molekulare, FSHN, UT.



51

Figura 2.15 Matja e sasisë dhe cilësisë së mostrave të ADN në spektrofotometër.

Laboratori i Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT.

Mostrat me cilësinë më të mirë (OD 1.6-2) u përzgjodhën për tju nënshtruar PCR-së me primerat specifikë. Produktet e PCR-së u veçuan në elektroforezë në xhel agarozë

1,5%. Imazhet e fragmenteve të ADN-së u bënë të dukshme në transiluminator UV.

2.2.3.2 Shumëfishimi me PCR i rajoneve specifike fitoplazmatike

PCR u realizua në një volum total prej 40 l që përmbante: 100-200 ng ADN

shabllon, 0,5 M nga secili primer, 100M të katër dNTPs (deoksinukleotid

trifosfateve), 0,2 U Taq polimerazë goldstar dhe 1 X PCR buffer.

Figura 2.16. Pamje nga puna në laborator për realizimin e PCR-së, elektroforezës së

produkteve të shumëfshimit dhe vizualizimit të produkteve në transiluminator. Laboratori i

Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT.



52

Tabela 2.1 Primerat e përzgjedhur, zona që njohin dhe sekuencat e tyre (Ahrens and

Seemuller, 1992; Lorenz et al., 1995; Duduk et al., 2013).

Primeri Target Sekuenca e primerit (5’-3’)

fU5 16S rADN CGG CAA TGG AGG AAA CT

rU3 16S rADN TTC AGC TAC TCT TTG TAA CA

fO1 16S rADN CGG AAA CTT TTA GTT TCA GT

rO1 16S rADN AAG TGC CCA ACT AAA TGA T

fCAP Insert AT67 GGT TAC TCA CGA TCA AGA AG

rCAP Insert AT67 GTC CCA TCT ATT TTA GAG GC

fCPD Fragmenti PD67 CCA TAG CGA ATG TTT AAA AC

rCPD Fragmenti PD67 CAG TGC GAA AAT TGG TTA AT

Tabela 2.2 Protokolli i ciklimit për shumëfishim duke përdorur primerat fU5/rU3; fO1/rO1;

fCPD/rCPD.

95C 4‘

95C 30‖

35 cikle 51C 75‖

72C 90‖

72C 5‘

4C Infinit

Tabela 2.3 Protokolli i ciklimit për shumëfishim duke përdorur primerat fCAP/rCAP.

95C 4‘

95C 30‖

35 cikle 56C 75‖

72C 90‖

72C 5‘

4C Infinit

2.2.3.3 Përzgjedhja e mostrave të ADN-së për shumëfishimin e rajoneve

specifike

Bazuar në rezultatet e sasisë dhe cilësisë së ADN-së të ekstraktuar u përzgjodhën

mostrat më të mira prej të cilave mund të shumëfishohej me anë të PCR-së rajoni

target.



53

Meqënëse në kategori të ndryshme të mostrave në plantacione të ndryshme pati

variacion të cilësisë së ADN-së, përveç përzgjedhjes së mostrave më të mira u krye

edhe bashkimi i mostrave të së njëjtës kategori nga e njëjta pemë me synim

zvogëlimin e numrit të reaksioneve fillestare të analizuara.

Tabela 2.4 Kategoritë e mostrave të zgjedhura për shumëfishimin me anë të PCR të rajoneve

fitoplazmatike.

Nr Plantacioni Kategoria Lloji Varieteti

1. Korçë Kërcell Mollë Golden delicious

2. Korçë Kërcell Mollë Starking delicious

3. Korçë Kërcell Mollë Golden delicious

4. Korçë Kërcell Mollë Rennet

5. Korçë Rrënjë Mollë Starking delicious

6. Korçë Trung Mollë Starking delicious

7. Korçë Trung Mollë Rennet

8. Korçë Trung Mollë Golden delicious

9. Korçë Gjethe Mollë Golden delicious

10. Korçë Gjethe Mollë Rennet



13. Turan Kërcell Mollë Starking delicious

14. Turan Kërcell Mollë Starking delicious

15. Turan Kërcell Mollë Golden delicious

16. Turan Gjethe Mollë Starking delicious

17. Turan Gjethe Mollë Starking delicious

18. Turan Gjethe Mollë Golden delicious

19. Turan Gjethe Mollë Golden delicious

20. Bitinckë Kërcell Mollë Idared

21. Bitinckë Kërcell Mollë Idared

22. Bitinckë Gjethe Mollë Idared

23. Bitinckë Gjethe Mollë Idared

24. Dvoran Trung Kumbull Tropojane

25. Dvoran Gjethe Kumbull Iliria

26. Cangonj Gjethe Kumbull Tropojane

27. Cangonj Gjethe Kumbull Iliria

28. Cangonj Gjethe Kumbull Tropojane

2.2.4 Analizimi i Rezultateve

Analiza e rezultateve u krye bazuar në të dhënat e marra nga vlerësimi i simptomave,

imazhet e mostrave të ngjyrosura me DAPI dhe ato të elektroforezës në xhel agarozë.

Rezultatet e simptomatologjisë u analizuan me anë të programit Microsoft Office

Excel 2007; Imazhet e ngjyrimit DAPI u përpunuan për të dhënë rezolucion maksimal

me anë të mikroskopit me fluoreshencë L3201LED të pajisur me kamera MOTICAM

352, që mundësoi veçimin e indeve ku fluoreshenca vinte për shkak të fitoplazmave

krahasuar me ato të indeve përreth. Të dhënat e marra nga elektroforeza e

fragmenteve të shumëfishuara të ADN u bënë të dukshme në transiluminatorin UV

dhe u përdorën për të ndërtuar paraqitje grafike me anë të Microsoft Office Excel

2007.



54

KAPITULLI III

REZULTATE DHE DISKUTIME

3.1 Rezultatet e vlerësimit simptomatologjik

Simptomat e Apple proliferation mund të variojnë në varësi të bimës dhe të periudhës

që kjo sëmundje ka qënë e pranishme në të. Disa degë në një pemë të infektuar mund

të duken normale dhe të prodhojnë fruta normalisht, ndërkohë disa degë të tjera mund

të jenë të prekura dhe të shfaqin simptomat e kësaj sëmundjeje. Përveç kësaj,

simptomat mund të zhduken për një ose disa vite dhe mund të shfaqen sërish pas

ndonjë krasitje ose shartimi të rëndë (Kollar et al., 1990). Temperatura gjithashtu ka

një impakt të dukshëm në zhvillimin e simptomave të sëmundjes, temperaturat më

optimale për zhvillimin e sëmundjes janë nga 21-24ºC.

3.1.1 Plantacioni Bitinckë

Gjatë viteve 2014-2016 në plantacionin Bitinckë janë vërrejtur 9 lloje të simptomave

të shpërndara jo njëtrajtësisht në të gjithë drurët. Llojet e simptomave dhe shpërndarja

e tyre në drurë gjatë 3 viteve është paraqitur tek figurat e mëposhtme.

Gjatë vitit 2014 është vënë re që simptomat më të përhapura tek drurët e plantacionit

Bitinckë ishin unazimi apo përdredhja e gjetheve (në 8 pemë), frutat me përmasa të

vogla (në 7 pemë) dhe prania e insekteve (në 6 pemë). Ndërkohë dy prej simptomave

të përcaktuara në formularin e vlerësimit simptomatologjik mungojnë dhe nuk

shfaqen tek asnjë prej drurëve. Këto dy simptoma janë lule e çrregullt dhe gjethet e

kuqerremta në të gjithë kurorën. Simptoma e parë konsiderohet si një prej

simptomave më të rralla që mund të gjendet tek plantacionet e mollëve të infektuara

me fitoplazma (Susuri and Myrta, 2012; Kunze, 1989).

Figura 3.1 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e

plantacionit Bitinckë gjatë vitit 2014.



55

Gjatë vitit 2015, ka pasur ndryshime të vogla në lidhje me përhapjen e simptomave në

drurë të ndryshëm. Gjatë këtij viti simptomat më të përhapura kanë qënë prania e

insekteve (në 8 pemë), unazimi apo përdredhja e gjetheve (në 8 pemë) dhe gjethet

klorotike (në 7 pemë).



Nëse krahasojmë llojet e simptomave që shfaqen më shpesh gjatë dy viteve vihet re që

dy prej simptomave janë të njëjta. Përdredhja e gjetheve dhe prania e insekteve janë

dy simptomat më të përhapura në plantacionin Bitinckë. Ndërkohë 1 nga 3 simptomat

më të përhapura nuk paraqitet e njëjtë gjatë këtyre dy viteve. Në vitin 2014 shfaqeshin

me dendur frutat me përmasa të reduktuara ndërsa në vitin 2015, gjethet klorotike.

Mungesa e simptomave lule e çrregullt dhe gjethe të kuqerremta mbetet e njëjtë edhe

në vitin 2015.

Gjatë vitit 2016 në plantacionin Bitinckë vihen re ndryshime në krahasim me vitet

paraardhëse. Simptomat më të përhapura janë unazimi i gjetheve (në 8 pemë), sytha

sqetullorë paralelë (në 8 pemë) dhe fruta me përmasa të vogla (në 8 pemë). Ajo çfarë

dallohet është rishfaqja si simptomë më e përhapur e frutave me përmasa të vogla.

Gjatë vitit 2016 një simptomë tjetër ka përhapjen më të madhe, sythat sqetullorë

paralelë në formën e fshesës. Kjo përbën simptomën më tipike të Apple proliferation.



56



Në figurën e mëposhtme janë paraqitur disa nga llojet e simptomave të vëzhguara në

plantacionin Bitinckë gjatë tre viteve (2014, 2015, 2016).

Figura 3.4 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Bitinckë: a. fruta me

përmasa të vogla, përdredhje e gjetheve, b. degë paralele në formën e fshesës, c. prani e

insekteve. Fotot D.Mero.

Figura e mëposhtme paraqet ecurinë e simptomave gjatë tre viteve të studimit të tyre.

Në vite të ndryshme, numri i simptomave që shfaqin drurë të caktuar është i

ndryshëm. Kjo dallohet tek shumica e drurëve me përjashtim të drurëve 2 dhe 7, të

cilët kanë të njëjtin numër simptomash gjatë të tre viteve. Kjo është në përputhje me

karakteristikat e shfaqjes së simptomave të sëmundjeve fitoplazmatike, të cilat mund

të mos shfaqen për një periudhë të caktuar e të rishfaqen sërish mbas një apo dy vitesh

(Kunze, 1989).



57

Figura 3.5 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e plantacionit

Bitinckë për tre vitet (2014, 2015, 2016).

Katër janë format e mënyrës të ndryshimit të numrit të simptomave gjatë 3 viteve.

Rasti i parë është ai i drurëve 1, 3, 4, në të cilët numri i simptomave gjatë viteve 2014,

2015 është i njëjtë dhe në vitin pasardhës (2016) rritet. Rasti i dytë është ai i drurëve 5

dhe 10 në të cilët numri i simptomave në vitin 2014 ka qënë më i lartë se ai në vitin

2015 dhe ky numër rritet përsëri në vitin 2016. Rasti i tretë është ai i drurëve 6 dhe 9,

në të cilët numri i simptomave vjen duke u rritur me kalimin e viteve. Rasti i fundit

është ai i drurit 8 ku numri i simptomave në vitin 2014 ka qënë më i ulët se në vitin

2015 dhe ulet përsëri në vitin 2016.

3.1.2 Plantacioni Korçë

Studimi i plantacionit të Korçës për vitet 2014, 2015, 2016 identifikoi 10 lloje të

simptomave të shpërndara në drurët e marrë në shqyrtim. Figurat e mëposhtme

paraqesin më hollësisht llojet e simptomave për çdo dru, për tre vitet e studimit.

Nga figura 3.6 dallohet që simptomat më të përhapura në Plantacionin Korçë janë

gjethet klorotike (në 8 pemë), unazimi i gjetheve (në 7 pemë), prania e insekteve (në 6

pemë), fruta me përmasa të vogla (në 6 pemë) dhe sytha sqetullorë paralelë (në 6

pemë).

Ndryshe nga plantacioni Bitinckë ku dy simptomat (lule e çrregullt dhe gjethe të

kuqerremta) nuk shfaqeshin, në plantacionin Korçë vetëm në një nga drurët është

gjetur lule e çrregullt, ndërsa simptoma gjethe të kuqerremta vazhdon të mos shfaqet

tek asnjë nga drurët e analizuar.



58

Figura 3.6 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët

e plantacionit Korçë gjatë vitit 2014.

Në vitin 2015 simptomat më të përhapura janë përsëri gjethe klorotike (në 8 pemë),

unazim i gjetheve (në 7 pemë), frut me përmasa të vogla (në 7 pemë) dhe prani e

insekteve (në 7 pemë). Ndërkohë simptoma sytha sqetullorë paralelë ka përsëri

shkallë të lartë përhapje, të njëjtë me atë të vitit 2014.


plantacionit Korçë gjatë vitit 2015.

Në plantacionin Korçë gjatë vitit 2016, tre janë llojet e simptomave më të përhapura

madje me të njëjtën denduri. Këto simptoma janë të njëjta me ato të viteve të kaluara

dhe përfshijnë gjethet klorotike (në 7 pemë), unazimin e gjetheve (në 7 pemë) dhe



59

praninë e insekteve (në 7 pemë). Ajo çka shihet nga figura 3.8 krahasuar me figurat që

paraqesin llojet e simptomave të viteve paraardhëse (fig 3.6 dhe fig 3.7) është fakti se

disa simptoma shfaqen me të njëjtin intensitet gjatë të tre viteve. Këtu mund të

përmendim zverdhjen e gjetheve, zvogëlimin e gjetheve dhe lulen e çrregullt.


plantacionit Korçë gjatë vitit 2016.

Në figurën e mëposhtme janë paraqitur disa nga llojet e simptomave të vëzhguara

gjatë 3 viteve në plantacionin Korçë.

Figura 3.9 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Korçë. Nga e majta

në të djathtë: a. rritje e çrregullt, gjethe klorotike, b. lule e çrregullt, c. rozeta, d. përdredhje e

gjetheve. Fotot D.Mero.



60

Edhe në plantacionin Korçë ka disa modele të përhapjes së simptomave në të njëjtët

drurë gjatë viteve të ndryshme. Modeli i parë është ai i drurëve 1, 2, 9, 10, në të cilët

numri i simptomave paraqitet i njëjtë gjatë dy viteve dhe më pas rritet. Modeli i dytë

është ai i drurëve 6 dhe 8, në të cilët numri i simptomave gjatë vitit 2014 është më i

lartë se numri i simptomave në vitet pasardhëse. Modeli i tretë është ai i drurëve 4 dhe

5 në të cilët numri i simptomave është më i ulët në vitin 2014 dhe vazhdon duke u

rritur në dy vitet pasardhëse. Modeli i katër dhe i pestë janë modele ku bëjnë pjesë

drurët 3 dhe 7 përkatësisht. Numri i simptomave të drurit 3 është më i ulët gjatë vitit

2014, vijon duke u rritur në 2015 dhe në vitin 2016 arrin përsëri në nivelin e vitit

2014. Ndërsa druri 7 ka të njëjtin nivel të numrit të simptomave gjatë të tre viteve.

Figura e mëposhtme paraqet mënyrën e përhapjes së simptomave në drurë të

ndryshëm gjatë tre viteve.


Korçë për tre vitet (2014, 2015, 2016).

3.1.3 Plantacioni Turan

Gjatë tre viteve të vëzhgimit të plantacionit Turan gjithësej janë identifikuar 9 lloje të

simptomave.

Gjatë vitit 2014 plantacioni Turan ka pasur numër më të madh të katër llojeve të

simptomave. Kështu përmendim: praninë e insekteve (në 8 drurë), rozeta (në 6 drurë),

sytha sqetullorë paralelë (në 6 drurë) dhe gjethe klorotike (në 6 drurë). Ajo që bie në

sy është mungesa e dy kategorive të simptomave, përkatësisht lule të çrregullta dhe

gjethe të kuqerremta. E njëjta situatë paraqitej edhe për plantacionin Bitinckë.



61


e plantacionit Turan gjatë vitit 2014.

Gjatë vitit 2015 simptomat më të përhapura kanë qënë: prania e insekteve (në 7

drurë), unazim i gjetheve (në 7 drurë), rozeta (në 6 drurë), sytha sqetullorë paralelë

(në 6 drurë) dhe gjethe klorotike (në 6 drurë).


e plantacionit Turan gjatë vitit 2015.

E njëjta situatë për plantacionin Turan vazhdon edhe për vitin 2016, me të njëjtat

kategori të simptomave më të përhapura; rozeta (në 8 drurë), unazim i gjetheve (në 8

drurë), prani e insekteve (në 7 drurë), sytha sqetullorë paralelë (në 7 drurë) dhe gjethe

klorotike (në 7 drurë).



62


plantacionit Turan gjatë vitit 2016.

Në figurën e mëposhtme janë paraqitur disa nga llojet e simptomave të vëzhguara

gjatë tre viteve në plantacionin Turan.

Figura 3.14 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Turan. Nga

e majta në të djathtë: a. rritje e çrregullt, gjethe klorotike, b. prani e insekteve, c.

rozeta, d. përdredhje e gjetheve, gjethe të vogla të pazhvilluara, gjethe klorotike.

Fotot D.Mero.

Figura e mëposhtme paraqet ecurinë e simptomave gjatë 3 viteve për plantacionin

Turan. Me përjashtim të drurit 5 i cili ka të njëjtin numër simptomash gjatë të 3



63

viteve, gjithë drurët e tjerë kanë një model të ndryshëm shpërndarje nga viti në vit.

Modeli i parë i përhapjes është ai i drurëve 1, 3, 4, 9, 10, të cilët kanë pasur një numër

të lartë të simptomave gjatë vitit 2014, më pas numri i simptomave është ulur dhe ka

vazhduar me ngritje në vitin 2016. Modeli i dytë është ai i drurëve 2, 6, 8 të cilët gjatë

viteve 2014-2015 kanë numër të njëjtë të simptomave dhe ky numër rritet gjatë vitit

2016. Modeli i tretë është ai i drurit 7 i cili ka numër më të vogël të simptomave vitin

e parë dhe ky numër rritet gjatë dy viteve pasardhëse. Edhe ky rast është në

mbështetje të mënyrës të shfaqjes të simptomave gjatë viteve.


Turan për tre vitet (2014, 2015, 2016).

Figurat e mëposhtme tregojnë krahasimin e simptomatologjisë të tre plantacioneve të

mollëve në secilin prej viteve të vëzhgimit.

Figura 3.16 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Bitinckë, Korçë,

Turan, gjatë vitit 2014.



64

Ajo që vihet re nga figura 3.16 është se të tre plantacionet gjatë vitit 2014 kanë patur

pak a shumë të njëjtin numër simptomash. Kështu 3 është numri minimal i

simptomave që ka plantacioni Bitinckë, numër ky që korrespondon me numrin

minimal të simptomave që kanë edhe dy plantacionet e tjera, ai i Korçës dhe i Turanit.

Ndërkohë 6 është numri maksimal i simptomave që shfaqin drurët e plantacionit

Bitinckë dhe Turan. Ndërsa plantacioni Korçë dallohet për numër më të ulët të

simptomave për pemë.

Gjatë vitit 2015 vihet re se ulet numri i simptomave minimale për pemë në

plantacionin Turan ndërsa gjendja për plantacionet e tjera mbetet e njëjtë. Në lidhje

me shfaqjen e numrit më të madh të simptomave për dru vihet re se plantacioni

Bitinckë ka numër më të lartë të simptomave për dru (7 simptoma), numër ky që është

rritur nga viti paraardhës. Për plantacionin Korçë dhe Turan gjendja mbetet e njëjtë.



Ndryshe nga vitet e kaluara, ku plantacioni Turan dallohej për numrin më të ulët të

simptomave për pemë, gjatë vitit 2016 vihet re një rritje e numrit të këtyre

simptomave duke arritur në 7 simptoma për dru.



65



3.1.4 Plantacioni Cangonj

Nga studimi i plantacionit Cangonj gjatë vitit 2014 është vënë re që vazhdon e njëjta

situatë përsa i përket dy kategorive të simptomave; lule e çrregullt dhe gjethe të

kuqerremta në të gjithë kurorën, ato mungojnë.

Simptomat më të përhapura në drurët e këtij plantacioni gjatë vitit 2014 kanë qënë:

gjethet klorotike (në 9 pemë), prania e insekteve (në 6 pemë) dhe frutat me përmasa të

vogla (në 5 pemë).


plantacionit Cangonj gjatë vitit 2014.



66

Gjatë vitit 2015 situata në lidhje me shprehjen e simptomave paraqitet e ndryshme në

krahasim me vitin paraardhës. Vihet re se krahas simptomave (lule e çrregullt dhe

gjethe të kuqerremta në të gjithë kurorën) të cilat pothuajse mungojnë në të gjitha

plantacionet e analizuara deri tani, formimi i rozetave nuk gjendet në asnjë nga drurët

e plantacionit Cangonj, gjatë vitit 2015. Ndërkohë kategoritë e simptomave më të

përhapura vazhdojnë të mbeten po ato që shfaqeshin në vitin 2014; gjethet klorotike,

prani e insekteve dhe frutat me përmasa të vogla.



Në plantacionin Cangonj, gjatë vitit 2016, dy janë simptomat më të përhapura; gjethe

klorotike (në 8 pemë) dhe prani e insekteve (në 6 pemë). Situata në lidhje me

simptomat të cilat mungojnë paraqitet e njëjtë me atë të vitit 2014.





67


plantacionin Cangonj gjatë viteve 2014, 2015, 2016.

Figura 3.22 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni Cangonj. Nga e

majta në të djathtë: a. gjethe klorotike, b. degë paralele në formën e fshesës, c. prani e

insekteve. Fotot D.Mero.

Nga krahasimi i numrit të simptomave për secilin dru gjatë tre viteve, nëpërmjet

paraqitjes grafike shihet qartë që ky numër pëson luhatje nga viti në vit me përjashtim

të drurëve 1, 2, 4, 6 në të cilët numri i simptomave mbetet i njëjtë në vite. Kjo nuk

nënkupton që domosdoshmërisht edhe kategoritë e simptomave që këta drurë shfaqin

të jenë të njëjta përgjatë tre viteve.


Cangonj për tre vitet (2014, 2015, 2016).

Nga figura 3.23 vihen re edhe disa modele të tjera të përhapjes të simptomave. Kështu

modeli i parë është ai i drurëve 5 dhe 9, të cilët gjatë vitit 2014 kanë pasur numër më



68

të vogël të simptomave në krahasim me vitet pasardhëse, të cilët nëse i krahasojmë

me njëri tjetrin kanë të njëjtin numër simptomash. Modeli i dytë është ai i drurëve 3,

8, të cilët dallohen për numër të barabartë të simptomave në vitin 2014 dhe 2015, e

gjatë vitit 2016 ky numër ulet. Ndërkohë drurët e ngelur, druri 7 dhe 10 kanë modele

të kundërta përsa i përket mënyrës të përhapjes së simptomave në vite. Kështu, druri 7

gjatë vitit 2014 ka numër më të lartë të simptomave dhe gjatë viteve pasardhëse ky

numër ulet, ndërsa druri 10 përfaqëson modelin e kundërt, që do të thotë: dy vitet e

para numri i simptomave të shfaqura është i njëjtë dhe gjatë vitit 2016 ky numër është

rritur.

3.1.5 Plantacioni Dvoran

Nga figura 3.24 është i dukshëm fakti që plantacioni Dvoran gjatë vitit 2014, dallohet

për 3 kategori të simptomave më të përhapura. Këto simptoma janë: gjethet klorotike

(në 9 pemë), ndajgjethëzat e mëdha (në 7 pemë) dhe unazim i gjetheve (në 5 pemë).

Në këtë rast simptomat që nuk janë vëzhguar në asnjë pemë janë të njëjta me ato të

shumicës së plantacioneve të tjera ndër vite por në rastin konkret vihet re edhe

mungesa e zverdhjes së gjetheve.


plantacionit Dvoran gjatë vitit 2014.

Gjatë vitit 2015 simptomat më të përhapura janë po të njëjta me ato të vitit 2014,

madje janë të përhapura me të njëjtën frekuencë. Edhe gjatë vitit 2015 nuk është

vëzhguar lule e çrregullt, gjethe të kuqeremta në të gjithë kurorën dhe zverdhje e

gjetheve.



69



Gjatë vitit 2016, të gjithë drurët e plantacionit Dvoran shfaqin gjethe klorotike, që

përbën edhe një nga simptomat më të përhapura bashkë me ndajgjethëzat e mëdha (në

8 pemë), praninë e insekteve (në 5 pemë) dhe unazimin e gjetheve (në 5 pemë).

Simptomat që nuk shfaqen tek asnjë prej drurëve janë të njëjta edhe për këtë vit.





70

Në figurën e mëposhtme janë paraqitur disa nga llojet e simptomave të vëzhuara gjatë

tre viteve në plantacionin Dvoran.

Figura 3.27 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni Dvoran. Nga e

majta në të djathtë: a. gjethe klorotike, b. degë paralele në formën e fshesës, c. përdredhje e

gjetheve dhe fruta të pazhvilluar. Fotot D.Mero.

Nga figura e krahasimit të numrit të simptomave për secilin dru gjatë tre viteve vihet

re se vetëm druri 5 ka të njëjtin numër në vite të ndryshme. Modelet e tjera të

ndryshimit të përhapjes së simptomave janë: modeli i parë ku bëjnë pjesë druri 1, 6, 9

në të cilët numri i simptomave gjatë viteve 2014-2015 është i njëjtë dhe vazhdon të

rritet në vitin 2016. Modeli i dytë është ai i drurëve 3, 8, 10, në të cilët numri i

simptomave gjatë vitit 2014 është më i ulët se dy vitet pasardhëse. Ndërkohë drurët 2,

4, 7 kanë secili modele të veçanta në lidhje me mënyrën e ndryshimit të përhapjes së

simptomave.


Dvoran për tre vitet (2014, 2015, 2016).



71

3.1.6 Plantacioni Zëmblak

Gjendja e plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2014 është e ngjashme me atë të

plantacionit Dvoran në lidhje me kategoritë e simptomave që nuk shfaqen tek asnjë

pemë. Ndërsa simptomat më të përhapura janë prania e insekteve (në 7 pemë) dhe

unazimi i gjetheve (në 6 pemë).

Figura 3.29 Paraqitja e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e

plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2014.

Gjatë vitit 2015 në lidhje me simptomat që nuk shfaqen tek asnjë dru dhe simptomat

më të përhapura gjendja është e njëjtë. Ndryshimi i vetëm është ai i frekuencës së

përhapjes së simptomës unazim i gjetheve (në 7 pemë).


e plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2015.



72

Në vitin 2016, simptomave të cilat nuk shfaqeshin në vitet paraardhëse, u shtohet një

kategori tjetër që është ajo e zvogëlimit të gjetheve, simptomë kjo që nuk shfaqet tek

asnjë prej drurëve të analizuar të plantacionit Zëmblak.


e plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2016.


plantacionin Zëmblak për tre vite 2014, 2015, 2016.

Figura 3.32 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni Zëmblak. Nga e

majta në të djathtë: a. prani e insekteve, b. rozeta, rritje e çrregullt, c. zverdhje dhe përdredhje

e gjetheve. Fotot D.Mero.

Figura e mëposhtme (fig 3.33) dëshmon për modelet e ndryshme të përhapjes së

simptomave gjatë 3 viteve në drurët e plantacionit Zëmblak. Kështu me përjashtim të



73

drurëve 3, 6, të cilët kanë të njëjtin numër simptomash në vite (por jo

domosdoshmërisht të njëjtat kategori të simptomave), drurët e tjerë kanë shpërhapje

sipas modeleve të ndryshme. Modeli i parë është ai i drurëve 8 dhe 9, tek të cilët

numri i simptomave gjatë dy viteve të para të studimit ka qënë i njëjtë dhe gjatë vitit

2016, është rritur. Modeli i dytë është ai i drurëve 5 dhe 10, tek të cilët numri i

simptomave nga viti në vit është në rritje. Ndërkohë katër drurët e tjerë, përkatësisht

druri 1, 2, 4 dhe 7 kanë modele të veçanta të mënyrës së ndryshimit të simptomave në

vite.


Zëmblak për tre vitet (2014, 2015, 2016).

Nga figura e paraqitjes grafike të nivelit të simptomave për secilin prej drurëve të

plantacioneve Cangonj, Dvoran, Zëmblak për vitin 2014, ajo që bie në sy është se

plantacioni Cangonj shfaq numrin më të ulët të simptomave (1-4). Plantacionet e tjera

kanë shtrirje më të harmonizuar të simptomave, plantacioni Dvoran ka numrin

minimal të simptomave 2 për çdo dru ndërsa numrin maksimal 5. Plantacioni

Zëmblak ka numrin minimal të simptomave për dru 2 dhe numrin maksimal 4.

Figura 3.34 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Cangonj, Dvoran,

Zëmblak gjatë vitit 2014.



74

Figura e mëposhtme paraqet qartësisht luhatjet e numrit të simptomave nga druri në

dru brenda të njëjtit plantacion për vitin 2015. Plantacioni Cangonj ka numrin

minimal të simptomave për dru 1 dhe numrin maksimal 5. Plantacioni Dvoran ka

numrin minimal të simptomave 1 për secilin dru dhe numrin maksimal 4. Ndërsa

plantacioni Zëmblak numrin minimal të simptomave për dru e ka 1 dhe numrin

maksimal 4.



Gjatë vitit 2016 nga krahasimi i figurave 3.35 dhe 3.36 vihet re që për disa drurë të

plantacioneve të ndryshme, numri i simptomave për dru ka ndryshuar. Kështu

plantacioni Cangonj ka numrin minimal dhe numrin maksimal të simptomave për dru

përkatësisht 1 dhe 5, plantacioni Dvoran 2 dhe 5 dhe plantacioni Zëmblak 3 dhe 4.





75

Bimët e infektuara me fitoplazma shfaqin simptoma të ndryshme. Problemet e lidhura

me faktorët që kontrollojnë ekuilibrin normal të rritjes çojnë në zverdhje, zhvillimin e

strukturave të ngjashme me gjethet në vend të luleve, sterilitet të luleve dhe

proliferimin e sytheve anësore duke formuar pamje të ngjashme me ato të fshesës,

zgjatjes anormale dhe astenisë (Bertaccini, 2007). Të tjera simptoma të hasura

zakonisht janë zhvillimi i reduktuar i pjesëve të caktuara ose gjithë bimës; deformime

ose keqformime të gjetheve ose luleve; vonesat në çeljen e sytheve ose në lulëzim;

zverdhja dhe skuqja e gjetheve jashtë sezonit. Është fakt se të gjitha këto simptoma

shpesh shkaktohen edhe nga viruset, ndaj diagnoza e tyre pavarësisht eksperiencës

fushore, kërkon analiza laboratorike (Susuri and Myrta, 2012).

Nisur nga sa më sipër, në këtë studim një nga tre metodat e përdorura për evidentimin

e pranisë së infeksioneve fitoplazmatike ishte simptomatologjia. Rezultatet tregojnë se

thuajse të gjithë drurët, në të gjashtë plantacionet, kanë një model të ndryshëm

shpërndarje të simptomave nga viti në vit. Simptoma të caktuara u shfaqën për një

periudhë kohe, u zhdukën për një ose dy vite dhe u rishfaqën sërish. Gjatë viteve

2014-2016 në plantacionin e Bitinckës u vërrejtën 9 lloje të simptomave, në

plantacionin e Korçës 10 lloje të simptomave, dhe në plantacionin e Turanit 9 lloje të

simptomave. Për plantacionet me kumbulla numri i simptomave të vëzhguara ka qënë

përkatësisht 9 lloje të simptomave për plantacionin Cangonj, 8 lloje për plantacionin

Dvoran dhe 8 lloje për plantacionin Zëmblak. Një prej simptomave të përcaktuara në

formularin e vlerësimit të simptomave (gjethe të kuqerremta në të gjithë kurorën)

mungoi dhe nuk u shfaq tek asnjë prej drurëve gjatë tre viteve të marrjes së mostrave.

Bazuar në të dhënat tona, pothuajse të gjithë drurët, në të gjashtë plantacionet, kanë

një model të ndryshëm shpërndarje të simptomave nga viti në vit. Ky fakt përbën një

disavantazh të simptomatologjisë.

Përcaktimi i simptomave është tepër i lodhshëm, kërkon kohë dhe shpesh rezultatet

janë kontradiktore. Pavarësisht vlerësimit tre vjeçar të plantacioneve duke u bazuar

tek simptomatologjia, nuk mund të përcaktojmë gjendjen reale të plantacioneve për

arsye se simptoma të njëjta apo të ngjashme me ato të shkaktuara nga fitoplazmat,

mund të jenë pasojë e karencës nutricionale, apo infeksioneve të tjera kërpudhore,

bakteriale dhe virale.

3.2 Rezultatet e teknikës së ngjyrimit DAPI

3.2.1 Plantacioni Bitinckë

Për ndërtimin e grafikëve të cilët paraqesin rezultatet e teknikës së ngjyrimit DAPI,

janë përdorur matrica me vlerat 0 dhe 1, përkatësisht për mungesën dhe praninë e

infeksionit. Nga figura 3.37 shihet se teknika e ngjyrimit DAPI në vitin 2016 ka

identifikuar 10 nga 10 drurët si pozitivë për infeksionet fitoplazmatike ndërkohë për

vitin 2015 vetëm 7 nga 10 drurët. Kjo mund të shpjegohet me modelin jo të rregullt të

përhapjes së fitoplazmave në kurorë. Kështu mund të ndodhë që asnjë nga mostrat e

grumbulluara nga 5 vënde të ndryshme të kurorës mos ketë qënë e infektuar

pavarësisht se infeksioni mund të ketë ekzistuar në bimë. Mundësia e dytë është që

përqëndrimi i fitoplazmave në inde të ketë qënë i vogël dhe intensiteti i fluoreshencës

ka qënë tepër i ulët. Ky rezultat mund të shpjegohet edhe me hipotezën që gjatë vitit

2015, infeksioni mund të mos ketë qënë i pranishëm në këto drurë dhe është përhapur



76

gjatë vitit 2016 nëpërmjet insekteve vektorë duke qënë se numri i tyre ka qënë i lartë

në plantacionin Bitinckë.

Figura 3.37 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Bitinckë për

vitet 2015, 2016.

Në figurën e mëposhtme (Fig 3.38 a, b, c, d, e, f) janë paraqitur pamjet e prerjeve

tërthore të disa prej drurëve të plantacionit Bitinckë që janë identifikuar si pozitivë

ndaj infeksionit fitoplazmatik. Me shigjeta janë treguar grupime të fitoplazmave të

cilat shfaqin fluoreshencë të lartë.

Figura 3.38 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të mollëve ngjyrosur me DAPI,

parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive. Fotot D. Mero.



77

Në figurën e mëposhtme paraqitet pamja e prerjes tërthore të një mostre negative për

praninë e fitoplazmave.

Figura 3.39 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 5 e ngjyrosur me DAPI, parë

me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero.

Krahasimi i figurave të mëposhtme (fig 3.40 dhe fig 3.41) me njëra tjetrën na

ndihmon të kuptojmë nëse ekziston një lidhje midis dy metodave të përdorura për

zbulimin e fitoplazmave. Vihet re që ka një lidhje midis numrit të simptomave dhe

teknikës DAPI, kjo për arsye se teknika DAPI ka rezultuar negative në zbulimin e

infeksionit fitoplazmatik, përkatësisht tek drurët që kanë pasur numrin më të vogël të

simptomave (druri 1, 4, 5). Kjo mund të jetë një e dhënë që tre llojet e simptomave që

janë vëzhguara tek këta drurë nuk janë specifike të fitoplazmave por mund të

shkaktohen edhe nga infeksione të tjera bakteriale, virale apo karenca nutricionale.

Gjithashtu ky rezultat mund të shpjegohet me përqëndrimin e vogël të fitoplazmave

në indet e gjetheve dhe në këtë mënyrë nuk është shfaqur fluoreshencë.

Figura 3.40 Paraqitja grafike e rezultateve

të teknikës DAPI për plantacionin Bitinckë

për vitin 2015.

Figura 3.41 Paraqitja grafike e numrit të

simptomave për drurët e plantacionit

Bitinckë, viti 2015.



78

Nga krahasimi i figurës 3.42 me figurën 3.43 evidentohet që fitoplazmat e gjithë

drurëve kanë shfaqur fluoreshencë me teknikën DAPI ndërkohë që numri i

simptomave për secilin dru është mesatar (nga 4 deri në 6).

3.2.2 Plantacioni Korçë

Nga figura 3.44 shihet se metoda e ngjyrimit DAPI ka rezultuar pozitive për të gjithë

drurët e plantacionit Korçë gjatë dy viteve.

Figura 3.44 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Korçë për vitet

2015, 2016.

Në figurën e mëposhtme (fig 3.45 a, b, c, d, e, f) janë paraqitur pamje të prerjeve

tërthore të bishtave të gjetheve të mollëve të cilat kanë rezultuar pozitive ndaj

infeksionit fitoplazmatik. Me shigjetë tregohen grupimet e fitoplazmave.


të teknikës DAPI për plantacionin

Bitinckë për vitin 2016.

Figura 3.43 Paraqitja grafike e numrit të

simptomave për drurët e plantacionit

Bitinckë, viti 2016.



79

Figura 3.45 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të mollëve ngjyrosur me DAPI, parë në

mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive. Fotot D. Mero.

Nga krahasimi i figurës 3.46 me figurën 3.47 vihet re që të gjitha mostrat kanë

rezultuar pozitive me teknikën DAPI dhe në lidhje me simptomatologjinë minimumi i

simptomave që shfaq secili dru është 3, ndërsa numri maksimal i simptomave për dru

është 6.

Nga krahasimi i figurës 3.48 me figurën 3.49 vihet re që metoda DAPI ka rezultuar

pozitive tek të gjithë drurët e plantacionit Korçë gjatë vitit 2016, ndërsa përsa i përket


të teknikës DAPI për plantacionin Korçë

për vitin 2015.

Figura 3.47 Paraqitja grafike e numrit

të simptomave për drurët e plantacionit

Korçë, viti 2015.



80

simptomave vihet re një nivel mesatar i tyre për çdo dru. Numri minimal i

simptomave për dru është 3 dhe ai maksimal 4.

Nga vlerësimi i gjëndjes së plantacionit Korçë nëpërmjet mikroskopisë fluoreshente

me ngjyrimin DAPI rezulton se në të dy vitet e studimit, situata paraqitet e njëjtë, të

gjitha mostrat e gjetheve kanë rezultuar të infektuara.

3.2.3 Plantacioni Turan

Figura e mëposhtme (fig 3.50) paraqet efektivitetin e teknikës së ngjyrimit DAPI në

zbulimin e mostrave të infektuara me fitoplazma në plantacionin Turan për dy vitet

2015, 2016. Në vitin 2015, 8 nga 10 drurët kanë rezultuar të infektuar ndërsa në vitin

2016, kanë rezultuar të infektuar të gjithë drurët. Ky rezultat mund të shpjegohet me

përhapjen jo sistemike të infeksionit, që do të thotë se mostrat që janë analizuar nuk

kanë qenë të infektuara pavarësisht se infeksioni mund të ketë ekzistuar në bimë.

Gjithashtu ky rezultat mund të shpjegohet me hipotezën se gjatë vitit 2015 këta drurë

nuk kanë qënë të infektuar dhe infeksioni është transmetuar gjatë vitit 2016 nga pemë

të tjera fqinje, nëpërmjet insekteve vektorë. Mundësia e tretë është që teknika e

ngjyrimit DAPI mund të mos ketë arritur të zbulojë infeksionin në mostrat me origjinë

nga drurët 9, 10 edhe për arsye të përqëndrimit të ulët të fitoplazmave në indet e

floemës.

Figura 3.48 Paraqitja grafike e

rezultateve të teknikës DAPI për

plantacionin Korçë për vitin 2016.

Figura 3.49 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit

Korçë, viti 2016.



81

Figura 3.50 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Turan për

vitet 2015, 2016.


tërthore të bishtave të gjetheve të mollës të cilat kanë rezultuar pozitive. Intensiteti i

fluoreshencës ndryshon nga një mostër tek tjetra në varësi të përqëndrimit të

fitoplazmave në këto inde.

Figura 3.51 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të mollëve ngjyrosur me DAPI,




82

Në figurën e mëposhtme (fig. 3.52) është paraqitur pamja e prerjes tërthore të bishtit

të gjethes së drurit 9 në Plantacionin Turan, e cila ka rezultuar negative për praninë e

fitoplazmave.

Figura 3.52 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 9 e ngjyrosur me DAPI,

parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero.

Nga krahasimi i figurës 3.53 me figurën 3.54 vihet re një lidhje ndërmjet

simptomatologjisë dhe metodës DAPI. Kështu drurët 9 dhe 10 që kanë rezultuar

negativë për praninë e infeksionit fitoplazmatik, shfaqin një numër më të vogël të

simptomave krahasuar me drurët e tjerë. Duke qënë se me metodën DAPI drurët 9 dhe

10 kanë rezultuar negativë, mendohet se simptomat që ata shfaqnin mund të jenë

pasojë e infeksioneve të tjera bakteriale, virale apo karencës nutricionale.


të teknikës DAPI për plantacionin Turan

për vitin 2015.



Turan, viti 2015.



83

Nga krahasimi i figurës 3.55 me figurën 3.56 vihet re që të gjitha mostrat kanë

rezultuar pozitive me teknikën DAPI, ndërsa përsa i përket simptomave, drurët

shfaqnin një nivel simptomash relativisht të lartë, nga 4 deri në 7 simptoma për pemë.

3.2.4 Plantacioni Cangonj

Figura e mëposhtme (fig 3.57) paraqet efektivitetin e teknikës DAPI në zbulimin e infeksionit fitoplazmatik në drurët e kumbullave të plantacionit Cangonj. Vihet re që

situata paraqitet e njëjtë për të dy vitet. Vetëm 1 nga 10 drurët ka rezultuar jo i

infektuar si për vitin 2015, ashtu edhe për atë 2016. Duke qënë se është i njëjti dru i

cili rezulton jo i infektuar në të dy vitet mund të themi që mungesa e infeksionit

fitoplazmatik në të konfirmohet.

Figura 3.57 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Cangonj

për vitet 2015, 2016.

Figura 3.55 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për

plantacionin Turan për vitin 2016.


Turan, viti 2016.



84


tërthore të bishtave të gjetheve me origjinë nga drurë të ndryshëm të kumbullave. Me

shigjeta tregohet prania e fitoplazmave në formën e pikave të cilat fluoreshojnë.

Figura 3.58 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur me

DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive. Fotot D.

Mero.

Në figurën 3.59 është paraqitur pamja e prerjes tërthore të bishtit të gjethes të drurit 6

në plantacionin Cangonj. Të gjitha mostrat e kategorisë gjethe me origjinë nga drurit 6

kanë rezultuar negative për praninë e fitoplazmave.



85



Nga krahasimi i figurës 3.60 me figurën 3.61 vihet re një lidhje midis metodës të

ngjyrimit DAPI dhe simptomatologjisë. Kështu në vitin 2015 vetëm një nga drurët ka

rezultuar jo i infektuar me fitoplazma. Nëse vëzhgojmë me kujdes numrin e

simptomave që manifeston druri që ka rezultuar i painfektuar nëpërmjet metodës

DAPI, vemë re që ka numrin më të vogël të simptomave në krahasim me gjithë drurët

e tjerë të plantacionit Cangonj. Përderisa me metodën e mikroskopisë fluoreshente

druri 6 rezultoi i painfektuar atëherë mendohet se dy simptomat që ai ka shfaqur gjatë

vitit 2015, mund të jenë si pasojë e sëmundjeve të tjera të bimëve.


plantacionin Cangonj për vitin 2015.


Cangonj, viti 2015.



86

I njëjti konkluzion del edhe nga krahasimi i figurave që paraqesin të dhënat e dy

metodave të përdorura për dedektim për vitin 2016. Druri 6 ka numrin më të vogël të

simptomave në krahasim me drurët e tjerë dhe këto simptoma mund të mos

shkaktohen nga prania e fitoplazmave. Mungesa e infeksionit fitoplazmatik tek druri 6

rezulton nga teknika e ngjyrimit DAPI për dy vite njëri mbas tjetrit.

3.2.5 Plantacioni Dvoran

Figura e mëposhtme (fig 3.64) paraqet rezultatet e teknikës së ngjyrimit DAPI për

drurët e plantacionit Dvoran për vitet 2015, 2016. Nga figura vihet re se në vitin 2015, vetëm dy nga 10 drurët (druri 4 dhe 5) kanë rezultuar negativë për praninë e

infeksioneve të shkaktuara nga fitoplazmat. Ndërsa në vitin 2016, vetëm një prej

drurëve rezulton i pa infektuar, përkatësisht druri 5. Për drurin 5 situata mbetet e

njëjtë për të dy vitet ndërsa për drurin 4 ndryshon. Ky ndryshim mund të jetë pasojë e

grumbullimit të mostrave jo të infektuara, ndërkohë që bima ka qënë e infektuar, duke

na çuar në një rezultat fals negativ. Mund të jetë tregues i mungesës së infeksionit në

vitin 2015 dhe shfaqjes së tij në vitin pasardhës si pasojë e përhapjes nëpërmjet

insekteve vektorë nga drurët e tjerë. Hipoteza e tretë që sqaron rezultatet e metodës së

ngjyrimit DAPI për drurin 4 është ajo që shpjegon rezultatin negativ si pasojë e

përqëndrimit të ulët të fitoplazmave në qelizat e floemës.


plantacionin Cangonj për vitin 2016


Cangonj, viti 2016.



87

Figura 3.64 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Dvoran

për vitet 2015, 2016.


tërthore të bishtave të gjetheve të drurëve të kumbullave në plantacionin Dvoran, të

cilat kanë rezultuar pozitive për praninë e fitoplazmave. Prania e fitoplazmave

tregohet nëpërmjet shigjetave.

Figura 3.65 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur me

DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive. Fotot D.

Mero.



88

Në figurën e mëposhtme paraqitet pamja e prerjes tërthore të bishtit të gjethes të drurit

5 të kumbullave të plantacionit Dvoran. Mostrat e gjetheve të marra nga ky dru kanë

rezultuar negative për praninë e fitoplazmave.



Nga krahasimi i rezultateve të metodës të ngjyrimit DAPI dhe simptomatologjisë

(figura 3.67 dhe 3.68) për plantacionin Dvoran vihet re që ekziston një lidhje ndërmjet

tyre. Kështu drurët 4 dhe 5, të cilët kanë numrin më të vogël të simptomave kanë

rezultuar negativë për praninë e fitoplazmave me teknikën e ngjyrimit DAPI.

Rrjedhimisht këto simptoma të cilat shfaqen tek druri 4 dhe 5, ose janë pasojë e

sëmundjeve të tjera të bimëve, ose drurët 4 dhe 5 kanë qënë të infektuar por

përqëndrimi i fitoplazmave tek qelizat e floemës ka qënë tepër i vogël për të shfaqur

fluoreshencë.


të teknikës DAPI për plantacionin Dvoran

për vitin 2015.



Dvoran, viti 2015.



89

Situata e mësipërme sqarohet nga krahasimi i figurës 3.69 dhe figurës 3.70. Vihet re

që në plantacionin Dvoran në vitin 2016, vetëm një nga drurët ka rezultuar negativ me

metodën e ngjyrimit DAPI, druri 5 i cili ka edhe numrin më të vogël të simptomave.

Pra mungesa e infeksionit të shkaktuar nga prania e fitoplazmave konfirmohet për dy

vitet njëri mbas tjetrit. Nuk mund të themi të njëjtën gjë për drurin 4, i cili në vitin

2015 është identifikuar si negativ ndërsa në vitin 2016 pozitiv për praninë e

fitoplazmave. Nëse krahasojmë dy figurat (fig 3.68 dhe fig 3.70) që paraqesin numrin

e simptomave për drurët e plantacionit Dvoran në dy vite ajo që vihet re është se gjatë

vitit 2016 druri 4 shfaq numër më të madh simptomash në krahasim me vitin 2015.

Ky rezultat përputhet edhe me rezultatin e teknikës së ngjyrimit DAPI dhe na shpie në

përfundimin që tek druri 4, në vitin 2015, infeksioni mund të ketë ekzistuar por

përqëndrimi i fitoplazmave ka qënë i vogël ose 5 pikat e kurrorës nga ku është marrë

materiali bimor nuk kanë pasur infeksion (edhe pse ai mund të ketë qënë i panishëm

në bimë) për shkak të natyrës josistemike të përhapjes së infeksionit.

3.2.6 Plantacioni Zëmblak

Figura 3.71 paraqet rezultatet e teknikës DAPI për drurët e plantacionit Zëmblak në

dy vitet; 2015, 2016. Në vitin 2015 vetëm një nga drurët paraqitet negativ për praninë

e fitoplazmave, ndërkohë gjatë vitit 2016 të gjithë drurët kanë rezultuar të infektuar.



plantacionin Dvoran për vitin 2016.



Dvoran, viti 2016.



90

Figura 3.71 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Zëmblak

për vitet 2015, 2016.

Në figurën e mëposhtme (fig. 3.72 a, b, c, d, e, f) janë paraqitur pamje të prerjeve

tërthore të bishtave të gjetheve të drurëve të ndryshëm të kumbullave në plantacionin

Zëmblak. Mostrat e mëposhtme kanë rezultuar pozitive për praninë e fitoplazmave,

grupimet e të cilave janë treguar nëpërmjet shigjetave.

Figura 3.72 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur me DAPI,




91

Në figurën e mëposhtme (fig. 3.73) është paraqitur pamja e prerjes tërthore të bishtit

të gjethes të drurit 1 në plantacionin Zëmblak, e cila ka rezultuar negative për praninë

e fitoplazmave.

Figura 3.73 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 1 e ngjyrosur me DAPI, parë

me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero.

Për të kuptuar situatën analizojmë figurat e mëposhtme të cilat paraqesin gjëndjen e

plantacionit Zëmblak sipas dy metodave të vlerësimit, ngyrimit DAPI dhe

simptomatologjisë.


Zëmblak, viti 2015.

Figura 3.74 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Zëmblak

për vitin 2015.



92

Duket qartësisht që midis figurës 3.74 dhe asaj 3.75 ekziston një lidhje. Kështu druri 1

i identifikuar si negativ për praninë e infeksionit në vitin 2015, paraqet numrin më të

ulët të simptomave (vetëm 1). Edhe në këtë rast (duke marrë parasysh edhe figurat e

mëposhtme) ka dy interpretime; infeksioni mund të ketë qënë i pranishëm por

përqëndrimi i fitoplazmave ka qënë vogël ose mostrat e analizuara nuk kanë qënë të

infektuara pavarësisht se infeksioni mund të ketë ekzistuar në bimë. Kjo e fundit vjen

si pasojë e përhapjes së çrregullt të infeksionit të shkaktuar nga fitoplazmat.

Gjatë vitit 2016 me metodën e ngjyrimit DAPI të gjithë drurët kanë rezultuar të

infektuar. Nëse vemë re edhe figurën që paraqet grafikisht numrin e simptomave, ajo

që bie në sy është se druri 1 gjatë këtij viti manifeston numër më të madh të

simptomave në krahasim me vitin paraardhës. Kjo mbështet edhe njëherë

interpretimet e mësipërme.

Ndërkohë që simptomatologjia ofron informacion mbi praninë e sëmundjeve në faza

të avancuara, ngjyrimi DAPI mund të ndihmojë në identifikimin e tyre në stade më të

hershme. Sidoqoftë, për të qënë një metodë e suksesshme, ka nevojë për një

përqëndrim të caktuar të fitoplazmave në indet e analizuara. Rezultoi se përqëndrimi

më i përshtatshëm për dedektimin me ngjyruesin DAPI ishte ai i gjetheve. Metoda e

ngjyrimit DAPI rezultoi jo e suksesshme në rrënjë. Rezultatet provuan se suksesi i

ngjyrimit DAPI për dedektimin e fitoplazmave tek molla dhe kumbulla varet nga

sezoni i marrjes së mostrave dhe pozicioni i marrjes në çdo pemë, çka shton bindjen

tonë se pavarësisht ndjeshmërisë kjo metodë ka disavantazhe që mund të kalohen

vetëm falë përdorimit të metodave të njëkohshme të dedektimit, të kategorisë

molekulare.



plantacionin Zëmblak për vitin 2016.



Zëmblak, viti 2016.



93

3.3 Rezultatet e vlerësimit me anë të PCR-së

3.3.1 Amplifikimi i ADN-së ribozomale specifike të fitoplazmave

Çifti i parë i primerave të përdorur është fU5/rU3, i cili duke u bazuar tek Ahrens dhe

Seemuller 1993; Duduk et al., 2013 është dizenjuar për dedektimin universal të

fitoplazmave. Ashtu sikurse shihet në figurën 3.78 fragmenti i pritur u amplifikua tek

të gjitha mostrat e mollëve, të cilat paraqiten nga e majta në të djathtë: 1-4 Korça

kërcell; 5-Korça rrënjë; 6-8 Korça trung; 9-12 Korça gjethe; 13-15-Turan kërcell.

K 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

850bp

Figura 3.78 Amplifikimi i ADN-së ribozomale specifike të fitoplazmave duke përdorur çiftin e primerave fU5/rU3.

Në figurën e mëposhtme (fig 3.79) janë paraqitur rezultatet e shumëfishimit për

mostrat 16-28, respektivisht 16-19 Korça gjethe (mollë); 20-21 Bitinckë kërcell

(mollë); 22-23 Bitinckë gjethe (mollë); 24 Dvoran trung (kumbull); 25-Dvoran gjethe

(kumbull); 26-28 Cangonj gjethe (kumbull).

K 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16

850bp

Figura 3.79 Amplifikimi i ADN-së specifike ribozomale të fitoplazmave nga mostrat e

mollës duke përdorur çiftin e primerave fU5/rU3. Fragmenti i pritshëm është 850bp.

Duke u mbështetur në figurat 3.78 dhe 3.79, 20 nga 28 mostrat janë të infektuara,

prej të cilave 2 nga 5 mostra të kumbullave.

Në figurën 3.80 tregohen rezultatet e shumëfishimit të rajonit specifik ribozomal duke

përdorur çiftin e primerave fO1/rO1, të dizenjuar për zbulimin e gjithë fitoplazmave

të European fruit tree sipas Lorenz et al., 1995; Duduk et al., 2013. Mostrat janë

emërtuar njësoj si në figurën 3.78.

Ashtu si duket në figurën e mëposhtme (fig 3.80), të gjitha mostrat janë të infektuara

dhe mostrat 4/11 kanë një bandë të dyfishtë të amplifikuar, gjë e cila mund të jetë

tregues i infeksionit nga dy shtame të fitoplazmave njëkohësisht.



94

M 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Figura 3.80 Zbulimi i fitoplazmave bazuar në çiftin e primerave fO1/rO1; Fragmenti

i pritshëm 1050bp.

Nga figura 3.81 shikojmë se të gjitha mostrat janë të infektuara dhe mostrat 20/22/27

kanë një bandë të dyfishtë të amplifikuar, gjë e cila mund të jetë tregues i infeksionit

nga dy shtame të fitoplazmave njëkohësisht.

28 27 26 25 24 M 23 22 21 20 19 18 17 16 M

Figura 3.81 Zbulimi i fitoplazmave bazuar në çiftin e primerave fO1/rO1; mostrat

16-18; Fragmenti i pritshëm 1050bp.

Në figurat 3.82 dhe 3.83 janë paraqitur rezultatet e amplifikimit të rajonit ribozomal

nëpërmjet çiftit të primerave fCPD/rCPD, të dizenjuar nga Lorenz et al., (1995) për

zbulimin e fitoplazmave të pear decline (PD).

M 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M


majtë duke dhënë fragmentin e pritshëm 1850bp. Mostrat 4, 7, 8, 10, 11, 13, 14 janë të

infektuara.

Nga rezultatet duket se jo të gjitha mostrat kanë dhënë rezultat pozitiv; vetëm 7 nga

15 mostrat e gjetheve dhanë fragmentin specifik. Ky rezultat është në përputhje me

autorë të tjerë, të cilët kanë raportuar se në disa raste nuk është marrë produkt nga

pemët e mollëve.

M K 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 M


majtë duke dhënë fragmentin e pritshëm 1850bp. Mostrat 23/27 janë të infektuara.



95

Nga figura 3.83 duket se vetëm dy nga 13 mostrat rezultuan të infektuara me

fitoplazma. Përkatësisht mostrat 23 dhe 27.

Çifti i katër i primerave të përdorura në këtë studim ishte çifti jo ribozomal

fCAP/rCAP. Rezultatet e amplifikimit të treguara në figurën 3.84 qartësojnë se ka

amplifikim specifik vetëm tek mostrat 19 dhe 23, mostrat e tjera nuk kanë dhënë

produkt edhe pse fragmenti gjenomik nga i cili primerat janë dizenjuar mund të

hibridizohet me ADN-në e fitoplazmave të PD dhe ESFY (Lorenz et al., 1995).

M 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 M

Figura 3.84 Çifti i primerave jo ribozomalë fCAP/rCAP amplifikoi fragmentin e

pritshëm vetëm në dy raste 19/23. Produktet e tjera ishin me dimensione jo specifike ~

200bp.

Duke konsideruar faktin se të gjitha mostrat janë të infektuara (rezultate nga

përdorimi i primerave fO1/rO1) dalim në konkluzionin se çifti i primerave

fCAP/rCAP zbuloi infeksionin vetëm në dy nga mostrat e analizuara që i përkisnin

mollëve.

15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Figura 3.85 Çifti i primerave jo ribozomalë fCAP/rCAP nuk amplifikoi fragmentin e

pritshëm në asnjë prej mostrave. Produktet e tjera ishin me dimensione jo specifike ~ 200bp.

Rezultatet e amplifikimit specifik të fragmenteve të gjeneve të fitoplazmave treguan

se fU5/rU5 dhe fO1/rO1 rezultuan të suksesshme në mollë dhe kumbulla, fCPD/rCPD

vetëm në një pjesë të mostrave, ndërsa çifti fCAP/rCAP rezultoi i pasuksesshëm

krahasuar me të tjerët.

Rezultatet e mara nga gel elektroforeza janë përdorur për të ndërtuar paraqitjen

grafike që tregohet në figurën 3.86. Nga figura duket qartësisht se një nga çiftet e

primerave përkatësisht fO1/rO1 ka rezultuar i suksesshëm në 100% të mostrave, pra

ka arritur të zbulojë praninë e fitoplazmave në të gjitha mostrat. Çifti i dytë fU5/rU5

identifikoi praninë e fitoplazmave në 71% të mostrave. Çifti i tretë i primerave fCAP/

rCAP ka identifikuar praninë e fitoplazmave në 9 prej mostrave ose 32% të tyre. Çifti

i katër i primerave fCPD/rCPD ka rezultuar efiçient vetëm në 2 prej mostrave ose 7%

të tyre.



96

Figura 3.86 Paraqitja grafike e rezultateve të katër çifteve të primerave në dedektimin

e fitoplazmave.

Nga figura 3.87 duket qartë se si simptomatologjia ashtu edhe teknika e ngjyrimit

DAPI kanë arritur të dedektojnë infeksionin fitoplazmatik në të gjitha mostrat.

Figura 3.87 Paraqitja grafike e rezultateve të dy metodave për dedektimin e fitoplazmave

për 28 mostra.

Figurat e mëposhtme paraqesin rezultatet e tre teknikave të përdorura për dedektimin

e fitoplazmave për 28 mostrat.

Nga figura 3.88 vihet re se vlerësimi nëpërmjet simptomave, metoda e ngjyrimit

DAPI dhe çiftet e primerave fU5/rU3, fO1/rO1 kanë arritur të zbulojnë infeksionin në

100% të mostrave (1-7). Çifti fCPD/rCPD i primerave nuk ka dedektuar infeksionin

në asnjë prej mostrave dhe çifti fCAP/rCAP në 3 prej 7 mostrave të paraqitura në

figurën e mëposhtme.



97

Figura 3.88 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e fitoplazmave

për mostrat 1-7.

Nga figura 3.89 vihet re se situata e mostrave 8-14 është e njëjtë me situatën e përshkruar më sipër për mostrat 1-7, me përjashtim të çiftit të primerave fCAP/rCAP i

cili në këtë rast ka arritur të dedektojë infeksionin fitoplazmatik në 4 nga 7 mostra

gjithësej.

Figura 3.89 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e

fitoplazmave për mostrat 8-14.



98

Nga figura 3.90 vihet re se për mostrat 15-21 vlerësimi nëpërmjet simptomave,

metoda e ngjyrimit DAPI dhe çifti i primerave fO1/rO1 kanë arritur të zbulojnë

infeksionin në 100% të mostrave (15-21). Çifti i primerave fU5/rU3 zbuloi

infeksionin në 4 nga 7 mostra, çifti i primerave fCPD/rCPD zbuloi infeksionin në 1

nga 7 mostra dhe çifti fCAP/rCAP në asnjë prej mostrave.


për mostrat 15-21.

Situata e mostrave 22-28, rezultatet e të cilave janë paraqitur grafikisht në figurën

3.91 është e ngjashme me mostrat 15-21 përsa i përket simptomatologjisë, metodës së

ngjyrimit DAPI dhe çiftit të primerave fO1/rO1, të cilat arritën të zbulojnë infeksionin

në 100% të mostrave. Ndërkohë çifti i primerave fCPD/rCPD zbuloi infeksionin

vetëm në një nga mostrat dhe çiftet e primerave fU5/rU3; fCAP/rCAP, dedektuan

infeksionin në 2 nga 7 mostrat.


për mostrat 22-28.



99

Për dedektimin e fitoplazmave përdoren një sërë teknikash laboratorike, ndër të cilat

ato të bazuara në PCR janë duke shërbyer gjithnjë e më shumë si metoda rutinë, pasi

në 20 vitet e fundit janë përshtatur për ti dedektuar këta patogjenë si në drurët edhe në insektet vektorë. Suksesi i PCR-së për dedektimin e fitoplazmave në materialin bimor

varet kryesisht nga ekstraktimi i materialit gjenetik cilësor, i pasuruar me ADN

fitoplazmatike, çka përbën një objektiv jo të thjeshtë (Firrao et al., 2007). Sasia e

ADN-së fitoplazmatike përbën më pak se 1% të ADN-së së ekstraktuar nga indet

bimore sipas Bertaccini et al., 2007. Me synim rritjen e këtij përqëndrimi një numër

autorësh kanë përdorur metoda të ndryshme, të cilat janë bazuar në shtimin e një faze

të protokollit standard me synim pasurimin me fitoplazma. Kjo proçedurë u përdor

edhe në studimin tonë duke ndjekur protokollin e pasurimit të Kirkpatrick et al.,

(1987) e të pasuar nga një sërë kërkuesish ndër vite. Rezultatet treguan se pavarësisht

pasurimit, gjethet rezultuan indi më i përshtatshëm krahasuar me rrënjët, kercejtë dhe

trungjet, jo vetëm për shkak të butësisë dhe lehtësisë së ekstraktimit, por kryesisht

pasi përqëndrimi i fitoplazmave në to ishte me i lartë.

Sipas raportimeve, diagnostika e bazuar në PCR mbështetet në përdorimin e

primerave specifikë të tipit me spektër të gjerë (broad-spectrum), të cilët në rastin e

fitoplazmave janë në gjendje të lidhen me rajone të mirëruajtura të gjenomave

fitoplazmatike (Firrao et al., 2007; Lorenz et al., 1995; etj). Ndër rajonet e përdorura

për këtë qëllim janë ato të 16S rADN. Për shkak të natyrës shumë të ruajtur të këtij

fragmenti, dedektimi i shtameve të fitoplazmave të ndryshme nga pikëpamja

biologjike ose ekologjike, të cilat mund të përfaqësojnë taksone të reja, është e

pamundur të realizohet vetëm bazuar në të. Në këto raste, nevojitet përdorimi i

veçorive biologjike si antitrupat specifikë, variacioni i bimëve strehuese, specifika të

transmetimit, apo kritere të tjera molekulare (Luigi Carraro et al., 1998).

Në këtë studim u përdorën katër çifte primerash specifikë (me spektër të gjerë) të

krijuar fillimisht nga Lorenz et al., (1995); Dy prej tyre ribozomalë: fU5/rU3 i hartuar

për detektim universal të fitoplazmave, dhe fO1/rO1 i dizenjuar për dedektimin e

fitoplazmave europiane të dru-frutorëve me sekuencë homologe për gjithë shtamet

fitoplazmatike të kategorisë AP (por që përmbante disa baza të ndryshme nga shtame

të kategorive të tjera të fitoplazmave) (Duduk et al., 2013); dhe dy të tjerë jo-

ribozomalë: fCAP/rCAP të hartuar pas sekuencimit të fragmentit AT67 të

kromozomit të shtamit AT të fitoplazmave; dhe çifti fCPD/rCPD i hartuar për të

dedektuar fitoplazmat e grupit PD.

Çifti fO1/rO1 i primerave të spektrit të gjerë mundën të identifikojnë infeksionin në

100% të mostrave; fU5/rU3 në 71% të mostrave, fCPD/rCPD rezultoi i vlefshëm për

32% të mostrave, ndoshta për shkak të veçorive të shtameve specifikë lokalë, ndërsa

fCAP/rCAP vetëm në 7% të rasteve. Një nga arsyet e mos amplifikimit të pjesës më të

madhe të mostrave mund të jetë prania e shtameve lokale që i përkasin një kategorie

të ndryshme nga AP.



100

PËRFUNDIME

Për herë të parë u përdorën njëkohësisht tre metoda të bazuara në simptoma,

mikroskopinë me fluoreshencë dhe shumëfishimin e ADN-së ribozomale dhe

jo-ribozomale specifike, për të zbuluar praninë e infeksioneve fitoplazmatike

në mollë e kumbulla në vendin tonë.

Falë këtij punimi u plotësuan formularët e vlerësimit të simptomave për një

periudhë tre vjeçare për gjashtë plantacione të rrethit të Korçës. Gjatë viteve

2014-2016 në plantacionin e Bitinckës u vërrejtën 9 lloje të simptomave, në

plantacionin e Korçës 10 lloje të simptomave, dhe në plantacionin e Turanit 9

lloje të simptomave. Për plantacionet me kumbulla numri i simptomave të

vëzhguara ka qënë përkatësisht 9 lloje të simptomave për plantacionin

Cangonj, 8 lloje për plantacionin Dvoran dhe 8 lloje për plantacionin

Zëmblak.

Një prej simptomave të përcaktuara në formularin e vlerësimit simptomatik

(gjethe të kuqerremta në të gjithë kurorën) nuk shfaqet në asnjë prej drurëve

gjatë tre viteve të marrjes së mostrave. Simptomat më të përhapura në

plantacionet e mollëve ishin përdredhje e gjetheve, degë paralele në formë

fshese në plantacionin Bitinckë, gjethet klorotike në plantacionin Korçë,

përdredhje e gjetheve dhe formim i rozetave në plantacionin Turan. Në

plantacionet me kumbulla, gjethe klorotike në plantacionin Cangonj dhe

plantacionin Dvoran dhe përdredhje e gjetheve dhe prani e madhe e insekteve

në plantacionin Zëmblak.

Simptoma të caktuara u shfaqën për një periudhë kohe, u zhdukën për një ose

dy vite dhe u rishfaqën sërish. Bazuar në të dhënat tona, thuajse të gjithë drurët,

në të gjashtë plantacionet, kanë një model të ndryshëm shpërndarje të

simptomave nga viti në vit. Ky fakt përbën një disavantazh të

simptomatologjisë.

Ndërkohë që simptomatologjia ofron informacion mbi praninë e sëmundjeve

në faza të avancuara, ngjyrimi DAPI mund të ndihmojë në identifikimin e tyre

në stade më të hershme.

600 mostra bimore që përfaqësonin 5 paralele x nga 2 kategori (gjethe, rrënjë)

x 10 drurë x 6 plantacione u analizuan për dy vjet për të zbuluar praninë e

fitoplazmave dhe për të vlerësuar efiçencën e mikroskopisë me fluoreshencë

me ngjyrimin DAPI

Rezultoi se përqëndrimi më i përshtatshëm për detektimin me DAPI ishte ai

i gjetheve. Përdorimi i metodës DAPI tek rrënjët rezultoi jo i suksesshëm.

Numri i drurëve që rezultuan të infektuar me fitoplazma nëpërmjet metodës të

ngjyrimit DAPI për vitin 2015 për çdo plantacion ishte: për plantacioninBitinckë 7 drurë, për plantacionin Korçë 10 drurë, për plantacionin Turan 8

drurë, për plantacionin Cangonj 9 drurë, për plantacionin Dvoran 8 drurë dhe

për plantacionin Zëmblak 9 drurë. Gjatë vitit 2016 situata paraqitet e

ndryshme për disa nga plantacionet. Numri i drurëve që rezultuan të infektuar

me fitoplazma nëpërmjet metodës të ngjyrimit DAPI për vitin 2016 për çdo

plantacion ishte: për plantacionin Bitinckë 10 drurë, për plantacionin Korçë 10



101

drurë, për plantacionin Turan 10 drurë, për plantacionin Cangonj 9 drurë, për

plantacionin Dvoran 9 drurë dhe për plantacionin Zëmblak 10 drurë.

Rezultatet provuan se suksesi i simptomatologjisë dhe metodës DAPI për

dedektimin e fitoplazmave tek molla dhe kumbulla varet nga sezoni i marrjes

së mostrave, pozicioni i marrjes në çdo pemë dhe përqëndrimi i fitoplazmave

në indet e analizuara.

1200 mostra bimore që përfaqësonin 5 paralele x nga 4 kategori (rrënjë,

kërcej, trung, gjethe) x 10 drurë x 6 plantacione u analizuan për të zbuluar

praninë e fitoplazmave dhe për të vlerësuar efiçencën e metodës molekulare.

Përdorimi i metodës së shumëfishimit të fragmenteve specifike ribozomale

dhe jo-ribozomale të fitoplazmave bazuar në PCR, rezultoi me vlerë për të

plotësuar të dhënat e marra nga dy kategoritë e tjera të metodave. Në këtë

studim u përdorën katër çifte primerash specifikë (me spektër të gjerë); dy prej

tyre ribozomalë: fU5/rU3 i hartuar për dedektim universal të fitoplazmave, dhe

fO1/rO1 i dizenjuar për dedektimin e fitoplazmave europiane të dru-frutorëve

me sekuencë homologe për gjithë shtamet fitoplazmatike të kategorisë AP (por

që përmbante disa baza të ndryshme nga shtame të kategorive të tjera të

fitoplazmave); dhe dy të tjerë jo-ribozomalë: fCAP/rCAP të hartuar pas

sekuencimit të fragmentit AT67 të kromozomit të shtamit AT të fitoplazmave;

dhe çifti fCPD/rCPD i hartuar për të dedektuar fitoplazmat e grupit PD.

Kategoria e primerave të dizenjuar bazuar në 16SrADN ofroi efiçencën më të

lartë të dedektimit (100%) për çdo kategori materiali biologjik (rrënjë, kërcell,

trung dhe gjethe) të analizuar.

Në disa raste produkti i shumëfishuar rezultoi në dy fragmente të përafërta, që

mund të shpjegohet me praninë e njëkohshme të dy shtameve të fitoplazmave

njëkohësisht.

Në praktikën e këtij studimi evidentuam gjithashtu se suksesi i metodës PCR

ishte i ndërvarur nga cilësia e ADN-së të pasuruar për MLO nga inde të

ndryshme. Rezultatet tona provojnë se falë pasurimit me MLO, u izolua jo

vetëm material gjenetik nga gjethet, por edhe nga indet e tjera dhe u përdor për

të dedektuar infeksionet, ndonëse gjethet dhanë rezultatin më të mirë.

Përdorimi i të tre metodave do të ofronte një rezultat më të besueshëm duke

marrë në konsideratë avantazhet dhe disavantazhet e çdonjërës.



102

REKOMANDIME

Për shkak të kompleksitetit të patologjive të shkaktuara nga fitoplazmat dhe

mekanizmave ende të pashpjeguar mirë të patogjenitetit të tyre, rekomandojmë

se çelësi për të mbajtur këto sëmundje nën kontroll është testimi rigoroz i

materialit bimor dhe monitorimet e rregullta të insekteve vektorë.

Meqënëse, ka një shpërndarje të pabarabartë të fitoplazmave dhe luhatje

sezonale të popullatave të patogjenit tek drurët strehues, si edhe një nivel më

të ulët të tyre në rrënjë dhe mesatar në kërcej, rekomandojmë se indet më me

vlerë per dedektimin e tyre janë gjethet.

Falë larmisë se metodave serologjke dhe molekulare që janë në zhvillim të

përditshëm, sugjerojmë vijimin e punës tonë për studimin e fitoplazmave në

detaje edhe më të thelluara në mënyrë që të mund të kuptojmë jo vetëm se si

këto organizma interesante mbijetojnë dhe replikohen në bimë dhe insekte, por

edhe të mund të zhvillojmë metodika të përshtatshme dhe me kosto efektive të

kontrollit të sëmundjeve kryesore që ato shkaktojnë në bimë.

Për suksesin e diagnostikimit ka rëndësi edhe mënyra e marrjes së mostrës për

analiza. Zakonisht preferohet të merren mostra në periudhën kur simptomat

shprehen qartë duke marrë pjesët simptomatike të bimës, pasi shpesh bimët e

infektuara nga fitoplazmat nuk janë simptomatike në të gjithë kurorën.

Megjithatë, përdorimi i të tre metodave të trajtuara në këtë studim do të

ofronte një rezultat më të besueshëm, duke marrë në konsideratë avantazhet

dhe disavantazhet e çdonjërës. Një metodë e përshtatshme për vlerësimin në

vijim të këtyre situatave mund të jetë RFLP.

Nëse PCR do të ishte metoda e zgjedhjes për dedektimin e fitoplazmave,

sugjerojmë përdorimin e kombinuar të primerave të dizenjuar në bazë të

16SrADN-së dhe atyre të bazuar në sekuencat e gjeneve koduese të proteinave

ribozomale, të cilët realizojnë shumëfishim vetëm të fragmenteve specifike

dhe ofrojnë dedektim të besueshëm.

Në vijim të punës për stabilizimin e metodikave të dedektimit të fitoplazmave

në mollë dhe kumbulla bazuar në PCR, rekomandojmë mbështetjen financiare

të kërkimit për evidentimin e shtameve lokale të fitoplazmave, të cilat mund të

klasifikohen në përputhje me rregullat ndërkombëtare dhe të kontribuojnë në

skemën e parandalimit të efekteve me pasoja ekonomike të këtyre

infeksioneve.



103

LITERATURA

1. Agrios, G. N. (1997): Plant pathology (4th ed. Academic Press, San Diego,

USA).

2. Agrios, G. N. (2004): Plant pathology (5th ed. Academic Press, San Diego,

USA).

3. Ahrens, U., and Seemüller, E. (1992): Detection of DNA of plant pathogenic

mycoplasmalike organisms by a polymerase chain reaction that amplifies a

sequence of the 16s rRNA gene. Phytopathology 82, 828-832.

4. Ahrens U., Lorenz K.H., Seemueller E. (1993): Genetic diversity among

mycoplasmalike organisms associated with stone fruit diseases. Molecular

Plant-Microbe Interactions, 6: 686-691.

5. Alma A., Bosco D., Danielli A., Bertaccini A., Vibio M., Arzone A. (1997):

Identification of phytoplasmas in eggs, nymphs and adults of Scaphoideus

titanus Ball reared on healthy plants. Insect Molecular Biology, 6: 115-121.

6. Alma A., Navone P., Visentin C., Arzone A., Bosco D. (2000): Rilevamento

di fitoplasmi di Apple proliferation in Cacopsylla melanoneura (Forster)

(Homoptera Psyllidae). Petria, 10(2):141-142.

7. Andersen M.T., Beever R.E., Gilman A.C., Liefting L.W., Balmori E., Beck

D.L., Sutherland P.W., Bryan G.T., Gardner R.C., Forster R.L.S. (1998):

Detection of phormium yellow leaf phytoplasma in New Zealand flax

(Phormium tenax) using nested PCRs. Plant Pathology, 47:188-196.

8. Andrade Nancy M. and Arismendi Nolberto L. (2013): DAPI Staining and

Fluorescence Microscopy Techniques for Phytoplasmas. In: Dickinson M.,

Hodgetts J., editors. Methods in molecular biology 938 springer protocols,

phytoplasma methods and protocols. Nottingham, Springer New York

Heidelberg Dordrecht London. p115-117.

9. Arnaud G., Malembic-Maher S., Salar P., Maixner M., Marcone C, Boudon-

Padieu E., Foissac X. (2007): Multilocus sequence typing confirms the close

genetic interrelatedness between three distinct ―Flavescence dorée‖

phytoplasma strain clusters and group 16SrV phytoplasmas infecting

grapevine and alder in Europe. Applied and Environmental Microbiology, 73:

4001-4010.

10. Bai, X., Zhang, J., Ewing, A., Miller, S. A., Radek, A., Schevchenko D.,

Tsukerman, K., Walunas, T., Lapidus, A., Campbell, J. W., Hogenhout, S. A.

(2006): Living with genome instability: the adaptation of phytoplasmas to

diverse environments of their insect and plant hosts. Journal of Bacteriology

188, 3682-3696.

11. Berges R, Rott M, Seemüller E (2000): Range of phytoplasma concentration

in various plant hosts as determined by competitive polymerase chain reaction.

Phytopathology 90: 1145–1152.

12. Bertaccini, A., Davis, R.E., and Lee, 1.-M. (1990a): Distinctions arnong

mycoplasmalike organisrns (MLOs) in Gladiolus, Ranunculus, Brassica, and

Hydrangea through detection with nonradioactive cloned DNA probes.

Phytopathol. Medit. 29, 107-113.



104

13. Bertaccini, A., Davis, R.E., Lee, LM., Conti, M., Dally, E.L., and Douglas,

S.M. (1990b): Detection of chrysanthemum yellows mycoplasrnalike

organism by dot hybridization and Southem blot analysis. Plant Dis. 74,4043.

14. Bertaccini A., Bellardi M.G., Vibio M. (1996): Virus diseases of ornamental

shrubs. X. Euphorbia pulcherrima Willd. Infected by viruses and

phytoplasmas. Phytopathologia mediterranea, 35: 129-132.

15. Bertaccini A. (2007): Phytoplasmas: diversity, taxonomy, and epidemiology.

Frontieres in Bioscience, 12: 673-689.

16. Bertamini M., Nedunchezhian N. (2001): Effect of phytoplasma, stolbur-

subgroup (Bois noir-BN)] of photosynthetic pigments, saccarides, ribulose-

1,5-bisphosphate carboxylase, nitrate and nitrite reductases and photosynthetic

activities in field-grow grapevine (Vitis vinifera L. cv Chardonnay) leaves.

Photosynthetica, 39(1): 119-122.

17. Bliefernicht K., Krczal G. (1995): Epidemiological studies on apple

proliferation disease in Southern Germany. Acta Horticulturae, 386: 444-447.

18. Bonnet, F., Saillard, C., Kollar, A., Seemüller, E., Dosba, F., Bové J.M. 1990.

Molecular probes for the apple proliferation MLO. Zentralbl. Bactenol. Suppl.

20, 908-909.

19. Bosco D. and R. Tedeschi. (2013): Insect Vector Transmission Assays. In:

Dickinson M., Hodgetts J., editors. Methods in molecular biology 938 springer

protocols, phytoplasma methods and protocols. Nottingham, Springer Neë

York Heidelberg Dordrecht London. P73-74.

20. Botti S., Bertaccini A. (2006a): Phytoplasma infection trough seed

transmission: further observations. 16th International Congress of the IOM,

Cambridge, UK, 9-14 July 76: 113.

21. Boudon-Padieu, E., Lame, J., and Caudweii, A. (1989): ELISA and dot-blot

detection of flavescence doree-ML0 in individual leaniopper vectors during

latency and inoculative state, Curr. Microbiol. 19, 357-364.

22. Canik D, Ertunc F. (2007): Distribution and molecular characterization of

apple proliferation phytoplasma in Turkey. Bulletin of Insectology 60(2), 335-

336.

23. Carginale V., Maria G., Papasso C, Ionata E., La Cara F., Pastore M.,

Bertaccini A., Papasso A. (2004): Identification of genes expressed in

response to phytoplasmal infection in leaves of Prunus armeniaca L. by

messenger RNA differential display. Gene, 12(332): 29-34.

24. Carraro L., Loi N., Ermacora P., Osler R. (1998): High tolerance of European

plum varieties to plum leptonecrosis. European Journal of Plant Pathology,

104: 141-145.

25. Carraro L., Osler R., Loi N., Ermacora P., Refatti E., (1998a): Transmission of

European stone fruit yellows phytoplasma by Cacopsylla pruni. Journal of

Plant Pathology 80: 233-239.

26. Caudwell, A, Meignoz, R, Kuszaia, C., Schneider, C., Lame, J., Fleury, H.,

and Boudon, E. (1983): Serological purification and visualization in electron

microscope of the grapevine flavescence doree (FD) pathogen (MLO) in

diseased plants and infectious vector extracts. Yale J. Biol. Med. 56,936-937.

27. Caudwell, A., Boudon-Padieu, Eo, Lhenninier, JO, Schwartz, Y., and

Meignoz, P. (1990): Current spread of the grapevine yellows and

charactenzation rnethods for the ML0 pathogen. Zentralbl. Bacteriol. Suppl.

20, 916-918.



105

28. Ceranic-Zagorac, P., and Hiruki, C. (1996): Comparative molecular studies on

aster yellows phytoplasmas. Acta Horticulturae 432, 226-276.

29. Chang, CJ., and Chen, T.A. (1991): Utilization of monoclonal antibodies

against elm yellows mycoplasmalike organisms in detection of elm yellows

disease. Phytopathology 81, 121.

30. Chen, J., and Chang, CJ. (1991): Plasmid-like DNAs with a mycoplasma-like

organism (MLO) and their seasonal occurrence. Phytopathology 81,1169.

31. Chen, J., Chang, CJ.. Jarret, R., and Gawel, N. (1992): Isolation and cloning of

DNA fragments fkom mycoplasmalike organism associated with walnut

witches'-broom disease. Phytopathology 82, 306-309.

32. Chen J., Pu X., Deng X, Liu S., Li H., Civerolo E. (2008): A phytoplasma

closely related to the pigeon pea witches'-broom phytoplasma (16SrIX) is

associated with citrus huanglongbing symptoms in the state of São paulo,

Brazil. Phytopathology, 98(9): 977-984.

33. Chen, K.H., Guo, J.R., Wu, X.Y., Loi, N., Carraro, L., Guo, Y.H., Chen,

YOD., Osler, Re, Pearson, R., and Chen, TA. (1993): Cornparison of

monoclonal antibodies, DNA probes, and PCR for detection of the grapevine

yellows disease agent. Phytopathology 83,9 15-922.

34. Chen, T.A., and Jiang, X.F. (1988): Monoclonal antibodies against the maize

bushy stunt agent. Can. J. Microbiol. 34,6- 11.

35. Chen, T.A., Lei, J.D, and Lin C.P. (1989): Detection and identification of

plant and insect mollicutes. In: The Mycoplasmas, vol. 5. p. 393-424. R.F.

Whitcomb and J.G. Tully (ed.), Acadernic Press, New York.

36. Chen, T.A.9 and Jiang, Y.P. (1990): Progress in the detection of plant

mycoplasmalike organisms by using monoclonal and polyclonal antibodies.

Zentralbl. Baktenol. Suppl. 20,270-275.

37. Chen, T.R. (1977): In situ detection of mycoplasma contamination in ce11

cultures by fluorescent Hoechst 33258 stain. Exp. CeU Res. 104,255-262.

38. Chen Y.D., Chen T.A. (1998): Expression of engineered antibodies in plants: a

possible tool for spiroplasma and phytoplasma disease control.

Phytopathology, 88: 1367-1371.

39. Chen, WH., and Hiruki, Ce (1977): Effect of dark treatment on the

ultrastructure of aster yellows agent in situ. Phytopathology 67, 32 1-324.

40. Cieslinska, M., & Kruczynska, D. (2011): Molecular detection of

phytoplasmas infecting Apple trees in Poland. Bulletin of Insectology,

64(Supplement), S73–S74.

41. Chiykowski L.N. (1991): Vector-pathogen-host plant relationships of clover

phyllody mycoplasmalike organism and the vector leafhopper Paraphlepsius

irroratus. Canadian Journal of Plant Pathology, 13: 11-18.

42. Choi YH et al (2004): Metabolic discrimination of Catharanthus roseus leaves

infected by phytoplasma using 1 H-NMR spectroscopy and multivariate data

analysis. Plant Physiol 135: 2398–2410.

43. Christensen N.M., Nicolaisen M., Hansen M., Schultz A. (2004): Distribution

of phytoplasmas in infected plants as revealed by real time PCR and

bioimaging. Molecular Plant–Microbe Interactions, 17: 1175-1184.

44. Christensen, N. M., Axelsen, K. B., Nicolaisen, M., Schulz, A. (2005):

Phytoplasmas and their interactions with hosts.Trends in Plant Science 10,

526-535.



106

45. Christensen N. Meyn, H. Nyskjold, and M. Nicolaisen, (2013): Real-Time

PCR for Universal Phytoplasma Detection and Quantification. In: Dickinson

M., Hodgetts J., editors. Methods in molecular biology 938 springer protocols,



46. Clark, M.F., Flegg, C.L., Bar-Joseph, M., and Rottem, S. (1978): The

detection of ―Spiroplasma citri” by enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA). Phytopathology 92,332-337.

47. Clark, M.F., Barbara, DJ., and Davis, D.L. (1983): Production and

characteristics of antisera of ―Spiroplasma citri” and clover phyllody-

associated antigens derived from plants. Ann. Biol. 103,251-259.

48. Clark, M.F., Morten, A., and Buss, S.L. (1989): Preparation of mycoplasma

immunogens from plants and a cornparison of polyclond and monoclonal

antibodies made against primula yellows MLO-associated antigens. Am. Appl.

Biol. 114, 111- 124.

49. Cordova I., Jones P. Harrison N.A., Oropeza C. (2003): In situ detection of

phytoplasma DNA in embryos from coconut palms with lethal yellowing

disease. Molecular Plant Pathology, 4: 99-108.

50. Cousin, M.T., Roux, J., Boudon-Padieu, E., Berges, R., Seemüller, E., and

Sniki, C. (1997): Use of heteroduplex mobility analysis (HMA) for

differentiating phytoplasma isolates causing witches'-broom disease on

Populus nigra cv Ltalica and stolbur or big bud symptoms on tomato. J.

Phytopathol. (in press).

51. Da Rocha, A., Ohki, S.T., and Hiruki, C. (1986): Detection of mycoplasmalike

organisms in situ by indirect immunofluorescence rnicroscopy.

Phytopathology, 76, 864-868.

52. Dai Q., He F.T., Liu P.Y. (1997): Elimination of phytoplasma by stem culture

from mulberry plants (Morus alba) with dwarf disease. Plant Pathology, 46:

56-61.

53. Danet, J.L.; Foissac, X.; Zreik, L.; Salar, P.; Verdin, E.; Nourrisseau, J.G.;

Garnier, M. (2003): ―Candidatus Phlomobacter fragariae‖ is the prevalent

agent of marginal chlorosis of strawberry in french production fields and is

transmitted by the planthopper Cixius wagneri (China). Phytopathology 93,

644-649.

54. Danet J.-L., Bonnet P., Jarausch W., Carraro L., Skoric D., Labonne G.,

Foissac X. (2007): Imp and secY, two new markers for MLST (multilocus

sequence typing) in the 16SrX phytoplasma taxonomic group. Bulletin of

Insectology 60: 339-340.

55. Danielli A., Bertaccini A., Alma A., Bosco D., Vibio M., Arzone A. (1996):

May evidence of 16SrI-group-related phytoplasmas in eggs, nymphs and

adults of Scaphoideus titanus Ball suggest their transovarial transmission?

IOM Letters, 4: 190-191.

56. Davies, D. L, Clark, M. F. (1992): Production and characterization of

polyclonal and monoclonal antibodies against peach yellow leaf roll MLO-

associated antigens. Acta Horticulturae 309, 275-283

57. Davis, M.J., Tsai, J.H., Cox, R.L., Mcdaniel, L.L., and Harrison, N.A. (1988):

Cloning of chromosomal and extrachromosomal DNA of the mycoplasmalike



107

organism that causes maize bushy stunt disease. Mol. Plant-Microbe Interact.

1, 295-302.

58. Davis, M J., Konai, M., and Bak, W.-C. (1990): Electrophoretic separation of

chromosomal DNA of mycoplasmalike organisms. IOM Letters, the 8th IOM

Congress 1,23 1-232.

59. Davis, R.E., Whitcomb, R.F., Steere, R. L. (1968): Remission of aster yellows

disease by antibiotics. Science 161, 793-794.

60. Davis, R.E., Lee, I.-M., Douglas, SaM, and Dally E.L. (1990a): Molecular

cloning and detection of chromosomal and extrachromosomal DNA of the

mycoplasmalike organism (MLO) associated with linle leaf disease in

periwinkle (Catharanthus roseus). Phytopathology 80,789-793.

61. Davis, R.E., Lee, I.-M., Douglas, S.M., Dally, E.L., and DeWitt, ND. (1990b):

Development and use of cloned nucleic acid hybridization probes for disease

diagnosis and detection of sequence homologies among uncultured

mycoplasmalike organisrns (MLOs). Zentralbl. Bakteriol. Suppl. 20,303-307.

62. Davis, R.E., Sinclair, W.A., Lee, LM., and DaUy, E.L. (1991): Cloned DNA

probes specific for detection of a mycoplasmalike organisrn associated with

ash yellows. Mol. Plant-Microbe Interact. 5, 163-169.

63. Davis, R.E., Dally, E.L., Bertaccini, A., Credi, R., Osler, R., Savino, V.,

Refatti, R., DiTerüzzi, B., Barba, M., and Lee, LM. (1992): RFLP analyses

and dot hybridizations of chromosornal DNA distinguish two mycoplasmaiike

organisms (MLOs) associated with grapevine yellows disease. Phytopathology

82, 242.

64. Davis, RE., and Lee, LM. (1993): Cluster-specific polymerase chain reaction

amplification of 16s rDNA sequences for detection and identification of

mycoplasmalike organisms. Phytopathology 83, 1008-1011.

65. Davis R.E., Jomantiene R., Dally E.L., Wolf T.K. (1998): Phytoplasmas

associated with grapevine yellows in Virginia belong to group 16SrI, subgroup

A (tomato big bud phytoplasma subgroup), and group 16SrIII, new subgroup

I. Vitis, 37: 131-137.

66. Davies D.L., Adams A.N. (2000): European stone fruit yellows phytoplasmas

associated with a decline disease of apricot in southern England. Plant

Pathology 49: 635-639.

67. Del Giudice, R-A., and Hopps, H.E. (1978): Microbiological methods and

fluorescent microscopy for direct dernonstration of mycoplasma infection of

cell cultures. In: Mycoplasma Infection of Ceil Cultures, p. 57-59, GJ.

McGarrity, D.G. Murphy and W.W. Nichols (ed.), Academic Press, New

York.

68. Delic´ D., Martini M., Ermacora P., Carraro L., Myrta A. (2008):

Identification of fruit tree phytoplasmas and their vectors in Bosnia and

Herzegovina. Acta Horticulturae 781: 429-434.

69. Delwart, E.L., Shpaer, E.G., Louwagie, J., McCutchan, F.E., Grez, M.,

Rubsamen-Weigrnann, H., and Mullins, J.I. (1993): Genetic relationships

determined by a DNA heteroduplex mobility assay: analysis of Hiv-1 env

genes. Science 262, 1257-1261.

70. Delwart, E.L., Sheppard, H.W., Walker, B.D., Goudsmit, J., and Mullins, J.I.

(1994): Tracking HIV evolution in vivo using a DNA heteroduplex mobility

assay. J. Virol. 68,6672-6683.



108

71. Deng, S., and Hiruki, C. (1990a): Enhanced detection of a plant pathogenic

mycoplasmalike organism by polymerase chain reaction. Proc. Japan. Acad.

66B,140-144.

72. Deng, S., and Hiruki, C. (1990b): Molecular cloning and detection of DNA of

the mycoplasmalike organisms associated with clover proliferation. Can. J.

Plant Pathol. 12, 383-388.

73. Deng, S., and Hiruki, C. (1990c): The use of cloned DNA probes for diagnosis

of nonculturable plant Mollicutes. Proc. Japan Acad. 66,58-6 1.

74. Deng, S., and Hiruki, C. (1990d): Use of Biotinylated DNA probes for the

detection and differentiation of mycoplasmalike organisms. Can. J. Plant

Pathol. 12,333.

75. Deng, S. (1991): Molecular diagnosis and charactenzation of mycoplasmalike

organisms associated with clover proliferation. Ph.D. Thesis. University of

Alberta. Edmonton, Canada.

76. Deng, S., and Hiruki, C. (1991a): Amplification of 16s rRNA genes from

culturable and non-cdturable mollicutes. J. Microbiol. Methods 14,53-61.

77. Deng, S., and Hiruki, C. (1991b): Genetic relatedness between two

nonculturable mycoplasmalike organisms reveaied by nucleic acid

hybridization and polymerase chain reaction. Phytopathology 8 1, 1475-1479.

78. Dickinson M., Tuffen M., and Hodgetts J. (2013): The Phytoplasmas: An

Introduction. In: Dickinson M., Hodgetts J., editors. Methods in molecular

biology 938 springer protocols, phytoplasma methods and protocols.

Nottingham, Springer New York Heidelberg Dordrecht London. p1-14, p47-

48

79. Doi, Y., Teranaka, M., Yora, K., Asuyama, H. (1967): Mycoplasma- or PLT

group-like microorganisms found in the phloem elements of plants infected

with mulberry dwarf, potato witches‘ broom, aster yellows or paulownias

witches broom. Annuals of the Phytopathologicial Society of Japan 33, 259-

266.

80. Doyle JJ, Doyle JL (1990): Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus

12: 13-15.

81. Duduk, B., Ivanović, M., Paltrinieri, S. and Bertaccini, A. (2008):

Phytoplasmas infecting fruit trees in Serbia. Acta Hort. (ISHS) 781:351-358

82. Duduk, B. (2009): Molecular characterization of phytoplasmas detected in

agronomically relevant crops in Serbia. Ph.D. Thesis. Università di Bologna,

Italy.

83. Duduk B., Paltrinieri S., Lee I., and A. Bertaccini. (2013): Nested PCR and

RFLP Analysis Based on the 16S rRNA Gene. In: Dickinson M., Hodgetts J.,

editors. Methods in molecular biology 938 springer protocols, phytoplasma

methods and protocols. Nottingham, Springer New York Heidelberg

Dordrecht London.p159-162.

84. Duska Delic (2012): Polymerase Chain Reaction for Phytoplasmas Detection,

Polymerase Chain Reaction, Dr Patricia Hernandez-Rodriguez (Ed.), InTech,

DOI: 10.5772/37728.

85. Engvall, E-, and Perlmann, P. (1971): Enzyme-linked immunosorbent assay,

ELISA. iII. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labeled anti-

irnrnunogiobulin in antigen-coated tubes. J. Immun01 109, 129-135.



109

86. Errampalli, D., Fletcher, J., and Sherwood, J.L. (1989): Production of

monospecific polyclonal an tibodies against the aster yellows mycoplasmalike

organisms (AY MLO) of Oklahoma. Phytopathology 79, 1137.

87. Errampalli D., Fletcher J., Claypool P.L. (1991): Incidence of yellows in

carrot and lettuce and characterization of mycoplasmalike organism isolates in

Oklahoma. Plant Disease, 75: 579-584.

88. Errea P., Aguelo V., Hormaza J. (2002): Seasonal variations in detection and

transmission of pear decline phytoplasma. Journal of Phytopathology, 150:

439-443.

89. Etropolska A, Laginova M. (2012): Monitoring distribution of fruit tree

phytoplasmas in Bulgaria from 2007 until 2011. Abstract of a paper presented

at the 22nd International Conference on virus and other graft transmissible

diseases of fruit crops (Rome, 2012-06-03/08), p 108.

90. Etropolska, A., W. Jarausch, B. Jarausch and g. trenchev. (2015): Detection of

European fruit tree phytoplasmas and their insect vectors in important fruit-

growing regions in Bulgaria. Bulg. J. Agric. Sci., 21: 1248–1253.

91. Firrao, G., Smart, C. D., Kirkpatrick, B. C. (1996): Physical map of the

western X disease phytoplasma chromosome. Journal of Bacteriology 178,

3985-3988.

92. Firrao G., Garcia Chapa M., Marzachì C. (2007): Phytoplasmas: genetics,

diagnosis and relationships with the palnt and insect host. Frontiers

Bioscience, 12: 1352-1375.

93. Gámez-Jiménez C, Romero-Romero J L, Santos-Cervantes M E, Leyva-López

N E, Méndez-Lozano J. (2009): Tomatillo (Physalis ixocarpa) as a natural new

host for Tomato yellow leaf curl virus in Sinaloa, Mexico. Plant Disease, 93,

545-545.

94. Garnier, M., Martin-Gros, G., Iskra, M., Zreik, L., Gandar, J., Fos, A., and

Bové, J.M. (1990): Monoclonal antibodies against the MLOs associated with

tomato stolbur and clover phyllody . Zentralbl. Bakteriol. Suppl. 20,263-269.

95. Garnier M., Foissac X., Gaurivaud P., Laigret F., Renaudin J., Saillard C.,

Bové J.M. (2001): Mycoplasmas, plants, insect vectors: a matrimonial

triangle. C.R. Acad. Sci., 324: 923–928.

96. Griffiths, H.M., Gundersen, D.E., Sinclair, W.A., Lee, LM., and Davis, R.E.

(1994a): Mycoplasmalike organisms from milkweed, goldenrod. and spirea

represent two new 16s rRNA subgroups and three new strain subclusters

related to X-disease. Can. J. Plant Pathol. 16,225-260.

97. Gundersen, D. E., Lee, I-M., Rehner, S. A., Davis, R. E., Kingsbury, D. T.

(1994): Phylogeny of mycoplasmalike organisms (phytoplasmas): a basis for

their classification. Journal of Bacteriology 176, 5244-5254.

98. Gundersen, D.E., Lee, LM., Chang, C J., and Davis, R.E. (1994a): RFLP

analysis of ribosomal protein genes reveal strain diversity in ML0 16s rRNA

groups 1 and m. Phytopathology 84, 1128.

99. Gundersen, D.E., Lee, 1.-M., Rehner, S.A., Davis, RE., and Kingsbury, DOT.

(1994b): Phylogeny of mycoplasmalike organisms (phytoplasmas); a bais for

their classification. J. Bacteriol. 176,5244-5254.

100. Gundersen D.E., and Lee, LM. (1996): Ultrasensitive detection of

phytoplasmas by nested-PCR assay using two universal primer pairs.

Phytopathol. Medit. 35, 144-151.



110

101. Gundersen, D.E., Lee, LM., Schaff, D.A., Harrison, N.A., Chang, CJ.,

Davis, R.E., and Kingsbury, D.T. (1996): Genomic diversity and

differentiation among phytoplasma strains in 16s rRNA groups I (aster

yellows and related phytoplasmas) and DI (X-disease and related

phytoplasmas). Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 64-75.

102. Guo, J.R., Chen, TA., and Loi, N. (1991): Production of monoclonal

antibodies against flavescence doree mycopalsmalike organisrn.

Phytopathology 81, 1210.

103. Guthrie J.N., White D.T., Walsh K.B., Scott P.T. (1998):

Epidemiology of phytoplasmaassociated papaya diseases in Queensland,

Australia. Plant Disease, 82: 1107-1111.

104. Hanboonsong Y, Choosai C, Panyim S, Damak S. (2002): Transovarial

transmission of sugarcane white leaf phytoplasma in the insect vector

Matsumuratettix hiroglyphicus (Matsumura). Insect Molecular Biology, 11:

97-103.

105. Harrison, N.A., Bourne, CM., Cox, R.L., Tsai, JJ., and Richardson,

P.A. (1992): DNA probes for detection of mycoplasmalike organisms

associated with lethal yellowing disease of palms in Horida. Phytopathology

82, 216-224.

106. Hibben, CR,, Sinclair, W.A., Davis, RE., and Alexander, J.H.III.

(1991): Relatedness of mycoplasma-like organisms associated with ash

yellows and lilac witches‘ broom. Plant Dis. 75, 1227-1230.

107. Hiruki, C. (1981): Fluorescence microscopy in diagnosis of tree

diseases associated with mycoplasma-like organisms (MLO). Proc. WIWXO

World Con. Div. 2, 317-322.

108. Hiruki, Ca, and da Rocha, A. (1984): The use of fluorescent DNA

binding agent, 4', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI), for detecting

mycoplasma infections in Vincarosea. Can. J. Plant Pathol. 6,262,

109. Hiruki, C., and da Rocha, A. (1986): Histochemical diagnosis of

mycoplasma infections in Catharanthus roseus by means of fluorescent DNA

binding agent, 4',6'-diamidino-2-phenylindole 2HC1 (DAPI). Can. J. Plant

Pathol. 8, 185-188.

110. Hiruki, C. (1988a): Fluorescence rnicroscopy of yeliows diseases

associated with plant mycoplasrnalike organisms. In: Mycoplasma Diseases of

Crops: Basic and Applied Aspects, p. 51-76, K. Maramorosch and S.P.

Raychaudhuri (ed.), Springer-Verlag, New York.

111. Hiruki, C. (1988b): Rapid and specific detection methods for plant

mycoplasmas. In: Mycoplasma Diseases of Crops: Basic and Applied Aspects,

p. 77-101, K. Mararnorosch and S. P. Raychaudhuri (ed.), Springer-Verlag,

New York Inc.

112. Hiruki, C. (1988c): Immunofluorescence microscopy of yellows

diseases associated with plant mycoplasmalike organisrns. In: Tree

Mycoplasmas and Mycoplasma Diseases, p. 193-203, C. Hiruiki (ed.)

University of Alberta Press, Edmonton, Alberta.

113. Hobbs, H.A., Reddy, D.V.R., and Reddy, A.H. (1987): Detection of a

mycoplasma-like organism in peanut plants with witches ' -broom using

indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Plant Pathol. 36, 164-

167.



111

114. Hodgetts, J., Ball, T., Boonham, N., Mumford, R., Dickinson, M.

(2007): Use of terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)

for identification of phytoplasmas in plants. Plant Pathology 56, 357-365.

115. Hodgetts J. and M. Dickinson. (2013): T-RFLP for Detection and

Identification of Phytoplasmas in Plants. In: Dickinson M., Hodgetts J.,

editors. Methods in molecular biology 938 springer protocols, phytoplasma

methods and protocols. Nottingham, Springer New York Heidelberg

Dordrecht London.p233-234.

116. Hogenhout SA, Šeruga MM. (2010): Phytoplasma genomics, from

sequencing to comparative and functional genomics—what have we learnt?

In: Weintraub PG, Jones P (eds) Phytoplasmas: genomes, plant hosts and

vectors. CABI Publishing, Oxfordshire, pp 19–36.

117. Holevas, C.D.; Chitzanidis, A.; Pappas, A.C.; Tzamos E.C.; Elena, K.;

Psallidas, P.G.; Alivizatos, A.S.; Panagopoulos, P.E.; Kyriakopoulou P.E.;

Bem, F.P.; Lascaris, D.N.; Velissariou, D.E; Vloutoglou, I.; Analytis, S.C.;

Paplomatas, E.J.; Asprogoumos, J.S.; Varveri, C. (2000): Disease agents of

cultivated plants observed in Greece from 1981 to 1990. Annales de l'institut

phytopathologique Benaki 19(1), 1-96.

118. Hoshi A., Ishii Y., Kakizawa S., Oshima K., Namba S. (2007): Host-

parasite interaction of phytoplasmas from a molecular biological perspective.

Bulletin of Insectology, 60(2): 105-107.

119. Hren I.M., Ravnikar M., Brzin J., Ermacora P., Carraro L., Bianco

P.A., Casati P., Borgo M., Angelini E., Rotter A., Gruden K. (2009): Induced

expression of sucrose synthase and alcohol dehydrogenase I genes in

phytoplasma-infected grapevine plants grown in the field. Plant Pathology,

58(1): 170-180.

120. Hsu, H.T., Lee, I.-M., Davis, R.E., and Wang, Y.C. (1990):

Immunization for generation of hybridoma antibodies specifically reacting

with plants infected with a mycoplasrnalike organism (MLO) and their use in

detection of ML0 antigens. Phytopathology 80,946-950.

121. IRPCM PHytoplasma/spiroplasma working team – phytoplasma

taxonomy group. (2004): ―Candidatus Phytoplasma‖, a taxon for the wall-less,

non-helical prokaryotes that colonize plant phloem and insects.- International

Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 1243- 1255.

122. Jagoueix-Eveillard S., Tarendau F., Guolter K., Danet J.L., Bové J.M.,

Garnier M. (2001): Catharanthus roseus genes regulated differentially by

mollicute infections. Molecular Plant-Microbe Interactions, 14: 225-233.

123. Jarausch W., Lansac M., Saillard C., Broquaire J.M., Dosba F.

(1998a): PCR assay for specific detection of European stone fruit yellows

phytoplasmas and its use for epidemiological studies in France. European

Journal of Plant Pathology 104: 17-27.

124. Jarausch W., Lansac M., Bliot C., Dosba F. (1999a): Phytoplasma

transmission by in vitro graft inoculation as a basis for a preliminary screening

method for resistance in fruit trees. Plant Pathology, 48: 283-287.

125. Jarausch W., Lansac M., Dosba F. (1999b): Seasonal colonization

pattern of European stone fruit yellows phytoplasma in different Prunus

species detected by specific PCR. Journal of Phytopathology, 147: 47–54.

126. Jarausch W., Saillard C., Broquaire J.M., Garnier M., Dosba F.

(2000a): PCR-RFLP and sequence analysis of a non-ribosomal fragment for



112

genetic characterization of European stone fruit yellows phytoplasmas

infecting various Prunus species. Molecular and Cellular Probes 14: 171-179.

127. Jarausch W., Bisognin C., Schneider B., Grando S., Velasco R.,

Seemüller E. (2007): Breeding of apple rootstocks resistant to ―Candidatus

Phytoplasma mali‖. Bulletin of Insectology, 60(2): 299-300.

128. Jiang, Y.P., Lei, J.D., and Chen, T.A. (1988): Purification of aster

yellows agent from diseased lettuce using afinity chromatography .

Phytopathology 78, 828-831.

129. Jiang, Y.P., Chen, T.A., Chiykowski, L.N., and Sinha, R.C. (1989):

Production of monoclonal antibodies to peach eastem X-disease agent and

their use in disease detection. Cm. J. Plant Pathol. 1 1, 325-33 1.

130. Junquera A. Bedendo I., Pascholati S. (2004): Biochemical changes in

cron plants infected by the maize bushy stunt phytoplasmas. Physiological

Molecular Plant Pathology, 65:181-185.

131. Kakizawa S., Oshima K., Kuboyama T., Nishigawa H., Jung

H.Y.,Sawayanagi T., Tsuchizaki T., Miyata S., Ugaki M., Namba S. (2001):

Cloning and expression analysis of phytoplasma protein translocation genes.

Molecular Plant Microbe Interactions, 14: 1043–1050.

132. Kawakita H., Saiki T., Wei W., Mitsuhasi W., Watanabe K., Sato M.

(2000): Identification of mulberry dwarf phytoplasmas in genital organs and

eggs of the leafhopper Hishimonoides sellatiformis. Phytopathology, 90: 909-

914.

133. Khan A.J., Botti S., Paltrinieri S., Al-Subhi A.M., Bertaccini A.

(2002a): Phytoplasmas in alfalfa seedlings: infected or contaminated seeds?

IOM, Vienna, July 07-12 2002: 6.

134. Kirkpatrick, B.C., and Garrot, D.G. (1984): Detection of western X-

disease mycoplasma-like organisms by enzyme-linked irnmunosorbent assay.

Phytopathology 74.825.

135. Kirkpatrick, B. C., Stenger, D.C., Morris, TJ., and Purcell, A.H.

(1987): Cloning and detection of DNA from a nonculnirable plant pathogenic

mycoplasmalike organisms. Science, 238, 197-200.

136. Kirkpatrick, B.C., Fisher, GA., Fraser, J.D., and Purceli, A.H. (1990):

Epidemiological and phylogenetic studies on westem X-disease

mycoplasmalike organisms. Zentralbl. Baktenol. Suppl. 20,288-297.

137. Kirkpatrick, and B. B. Sears. (1993): Oral verviews on the general

status of the classification of uncultivable phytopathogenic mycoplasmalike

organisms (MLOs). International Journal of Systematic Bacteriology

International Union of Microbiological Societies.p. 394-397.

138. Kison H., Kirkpatrick B.C., Seemüller E. (1997): Genetic comparison

of the peach yellow leaf roll agent with European fruit tree phytoplasmas of

the apple proliferation group. Plant Pathology, 46: 538-544.

139. Kison H, Seemüller E. (2001): Differences in strain virulence of the

European stone fruit yellows phytoplasma and susceptibility of stone fruit

trees on various rootstocks to this pathogen. Journal of Phytopathology, 149:

533-541.

140. Kleppe, K, Ohtsuka, E., Kleppe, R., Moiineux, I., and Khorana, H.G.

(1971): Studies on polynucleotides: repair replication of short synthetic DNAs

as catalyzed by DNA polyrnerases. J. Mol. Biol. 56,341-361.



113

141. Kollar, A., Seernüller, E., Bonnet, F., Saiilard, Ce, and Bové, J.M.

(1990): Isolation of the DNA of various plant pathogenic mycoplasmalike

organisms from infected plants. Phytopathology 80,233-237.

142. Kube M., et al. (2008): The linear chromosome of the plant-pathogenic

mycoplasma ―Candidatus Phytoplasma mali‖. BMC Genomics 9:306.

143. Kunze, L. (1989): Apple proliferation. Pages 99-113 in: Virus and

Viruslike Diseases of Pome Fruits and Simulating Noninfectious Disorders. P

R. Fridlund, ed. Cooperative Extension College of Agriculture and Horne

Economics, Washington State University, Pullmann, WA, USA.

144. Kuske, CR., Kirkpatrick, B.C., and Seemüller, E. (199la):

Differentiation of virescence MLOs using westem aster yellows mycoplasma-

like organism chromosomal DNA probes and restriction fiagrnent length

polymorphism analysis. J. Gen. Microbiol. 137,153-159.

145. Kuske, CR., Kirkpatrick, B.C., Davis, J.M., and Seemüller, E. (199lb):

DNA hybridization between westem aster yellows mycoplasma-like organisrn

plasmids and extrachromosomal DNA from other plant pathogenic

mycoplasma-like organisms. Mol. Plant-Microbe Interact. 4,75-80.

146. Laimer M., Bertaccini A. (2008): European stone fruit yellows. In:

Harrison N.A, Rao G.P., Marcone C. (eds.). Characterization, Diagnosis and

Management of Phytoplasmas, pp. 73-92. Studium Press, LLC, Houston,

Texas, USA.

147. Le Gall F., Bové J.M., Garnier M. (1998): Engineering of a single-

chain variable-fragment (scFv) antibody specific for the stolbur phytoplasma

(mollicute) and its expression in Escherichia coli and tobacco plants. Applied

and Environmental Microbiology, 64: 4566-4572.

148. Lee, 1.-M., Davis, R.E., and DeWitt, N.D. (1988a): Molecular cloning

and screening by a new method for DNA fragments from elm yellows (EY)

and tomato big bud (BB) mycoplasmalike organisms (MLOs). Phytopathology

78, 1602.

149. Lee, LM., and Davis, R.E. (1988): Detection and investigation of

genetic relatedness among aster yelIows and other rnycoplasmalike organisms

by using cloned DNA and RNA probes. Mol. Plant-Microbe Interact. 1, 303-

310.

150. Lee, 1.-M., Davis, R.E., Hammond, R., and Kirkpatrick, B.C. (1988b):

Cloned riboprobe for detection of a mycoplasmalike organism (MLO).

Biochem. Biophys. Res. Commun. 155, 443-448.

151. Lee, 1.-M., Davis, RE., and De Witt, N.D. (1990a): Nonradioactive

screening method for isolation of disease-specific probes to diagnose plant

disease caused by mycoplasrnalike organisms. Appl. Environ. Microbiol. 56,

1471-1475.

152. Lee, 1.-M., Davis, R.E., and Hiniki, C. (1990b): Beet leaf-hopper

transmitted virescent and clover proliferation mycoplasmalike organisms

(MLOs): two distinct strain types. Phytopathology 80,958.

153. Lee, 1.-M., Davis, RE., and Eruki, C. (1991a): Genetic relatedness

among clover proliferation mycoplasmalike organisms (MLOs) and other

MLOs investigated by nucleic acid hybridization and restriction fragment

length polymorphism analyses. Appl. Environ. Microbiol. 57, 3565-3569.



114

154. Lee, 1.-M., Gundersen D.E., Davis, R.E., and Chiykowski, L.N.

(1991b): Peach Xdisease mycoplasmalike organisrn (MLO) genomic strain

cluster. Phytopathology 81, 1169.

155. Lee, I.-M., and Davis, RE. (1992): Mycoplasmas which infect plants

and insects. In: Mycoplasrnas: Molecular Biology and Pathogenesis, p. 379-

390. J. Manilaff, R.N. McElhaney, L.R. Rinch, and J.B. Baseman (ed.),

American Society for Microbiology, Washington, D.C.

156. Lee, LM., Davis, RE., Sinclair, W.A., DeWitt, ND., and Conti, M.

(1993a): Genetic relatedness of mycoplasmalike organisms detected in (IImus

spp. in USA and Italy by means of DNA probes and polymerase chain

reaction. Phytopathology 83, 829-833.

157. Lee, LM., Hammond, R.W., Davis, R.E., and Gundersen, D.E.

(1993b): Universal amplification and analysis of pathogen 16s rDNA for

classification and identification mycoplasmalike organisrns. Phytopathology

83, 834-842.

158. Lee, 1.-M., Gundersen, D.E., Hammond, R.W., and Davis R.E. (1994):

Use of mycoplasmaiike organisrn (MLO) group-specific oligonucleotide

primers for nested-PCR assays to detect mixed-ML0 infections in a single host

plant. Phytopathology 84,559-566.

159. Lee I.-M., Klopmeyer M., Bartoszyk I.M., Gundersen-Rindal D.E.,

Chou T., Thomson K.L., Eisenreich R. (1997a): Phytoplasma induced free-

branching in commercial poinsettia cultivars. Nature Biotechnology, 15: 178-

182.

160. Lee I-M et al., (1998): Revised classification scheme of phytoplasmas

based an RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein gene sequences.

Int J Syst Bacteriol 48:1153–1169.

161. Lee, I. M., Gundersen-Rindal, D. E., Davis, R. E. (2000):

Phytoplasma: Phytopathogenic Mollicutes. Annual Review of Microbiology

54, 221-255.

162. Lee I-M, Zhao Y, Davis RE. (2010): Prospects of multiple gene-based

systems for differentiation and classification of phytoplasmas. In: Weintraub

PG, Jones P (eds). Phytoplasmas: genomes, plant hosts and vectors. CAB

International, Wallingford, pp 51–63.

163. Lherminier, J., Terwisscha Van Scheltinga, T., Boudon-Padieu, E., and

Caudwell, A. (1989): Rapid immunofluorescent detection of the grapevine

flavescence doree mycoplasmalike organisrn in the salivary glands of the

leafhopper Euscelidius variegatus KBM. Phytopathol. 2. 125,353-360.

164. Lim, P.O., and Sears, B.B. (1989): 16s rRNA sequence indicates that

plant-pathogenic mycoplasmalike organisrns are evolutionarily distinct fiom

animal mycoplasmas. J. Bacteriol. 17 1,590 1-5906.

165. Lim, P.O., and Sears, BB. (1991): The genome size of a plant-

pathogenic mycoplasmalike organism resembles those of animal

mycoplasmas. J. Bacteriol. 173,2128-2130.

166. Lin, C.P., and Chen, T.A. (1985a): Monoclonal antibodies against corn

stunt spiroplasma. Cm J. Microbiol. 3 1,900-904.

167. Lin, C.P., and Chen, T.A. (1985b): Monoclonal antibodies against the

aster yellows agent. Science 227, 1233- 1235.

168. Lin, C.P., and Chen, T.A. (1985c): Production of monoclonal

antibodies against ―Spiroplasma citri”. Phytopathology 75,848-85 1.



115

169. Lin, C.P., and Chen, T.A. (1986): Comparison of monoclonal

antibodies and polyclonal antibodies in detection of the aster yellows

mycoplasmalike organism. Phytopathology 76,45-50.

170. Lin, NS., Hsu, Y.E., and Hsu, H.T. (1990): Lmmunological detection

of plant viruses and a mycoplasma-like organism by direct tissue blotting on

nitrocellulose membranes. Phytopathology 80,824-828.

171. Liu W-T et al., (1997): Characterization of microbial diversity by

determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes

encoding 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 63:4516–4522.

172. Loi N., Carraro L., Musetti R., Firrao G., Osler R. (1995): Apple

proliferation epidemics detected in scab-resistant apple trees. Journal of

Phytopathology, 143: 581-584.

173. Lorenz K.-H., Dosba F., Poggi Pollini C., Llácer G., Seemüller E.

(1994): Phytoplasma diseases of Prunus species in Europe are caused by

genetically similar organisms. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und

Pflanzenschutz 101: 567-575.

174. Lorenz, K. H.; Schneider, B.; Ahrens, U.; Seemuller, E. (1995):

Detection of the apple proliferation and pear decline phytoplasmas by PCR

amplification of ribosomal and non-ribosomal DNA . Phytopathology 85, 771-

776 .

175. Maixner M. (2010): Phytoplasmas epidemiological systems with

multiple plant hosts. In: Phytoplasmas: Genomes, Plant Hosts and Vectors

(P.G. Weintraub, P. Jones, ed.), CABI Publishing, Wallingford, UK, 213‒232.

176. Martini M. and I. Lee. (2013): PCR and RFLP Analyses Based on the

Ribosomal Protein Operon. In: Dickinson M., Hodgetts J., editors. Methods in

molecular biology 938 springer protocols, phytoplasma methods and

protocols. Nottingham, Springer New York Heidelberg Dordrecht

London.p173-175.

177. Marcone C., Ragozzino A., Del Serrone P., Aloj B., Barba M.,

Seemüller E. (1996a): Detection of apple proliferation and pear decline in

Southern Italy. Petria, 6: 149-157.

178. Marcone C., Ragozzino A., Seemüller E. (1996b): Association of

phytoplasmas with the decline of European hazel in southern Italy. Plant

Pathology, 45: 857-863.

179. Marcone C., Hergenhahn F., Ragozzino A., Seemüller E. (1999a):

Dodder transmission of pear decline, European stone fruit yellows, rubus

stunt, picris echioides yellows and cotton phyllody phytoplasmas to

periwinkle. Journal of Phytopathology 147: 187-192.

180. Marcone C., Neimark H., Ragozzino A., Lauer U., Seemüller E.

(1999): Chromosome sizes of phytoplasmas composing major phylogenetic

groups and subgroups. Phytopathology, 89(9): 805-810.

181. Marcone C., Jarausch B., Jarausch W. (2010): ―Candidatus

Phytoplasma prunorum‖, the causal agent of European stone fruit yell.

182. Markham, P.G. and A.S. Alivizatos. (1983): The transmission of corn

stunt spiroplasma by natural and experimental vectors. In Proceedings

international maize virus disease colloq. Workshop, Gordon et al., eds. Ohio

State Univ., OARDC, Wooster, Ohio. Pp. 56-61.



116

183. McCoy, R.E. (1983): Wall-free prokaryotes of plants and invertebrates.

In: The Prokaryotes, vol. 2, p. 2238-2246. M.P. Starr, H. Stolp, H.G. Truper,

A. Bolows and HG. Schlegel (ed.), Springer-Verlag, New York Inc.

184. McCoy, R.E., CaudweU, A., Chang, CJ., Chen, T.A., Chiykowski,

L.N., Cousin, M.T., Dale de Leeuw, G.T.N., Golino, D.A., Hackett, KJ.,

Erkpatrick, B.C., Manvitz, R., Petzold, A., Shina, R.H., Sugiura, M.,

Whitcomb, R.F., Yang, I.L., Zhu, B.M., and Seemuller, E. (1989): Plant

diseases associated with mycoplasmaiike organisms. In: The Mycoplasmas,

vol. 5, p. 545-560, R.F. Whitcomb and J.G. TuUy (de.), Academic Press, New

York.

185. McGarrity, GJ., Steiner, T., and Vanaman, V. (1983): Detection of

mycoplasmal infection of ceil cultures by DNA fluorochrome staining. In:

Methods in Mycoplasmology, vol. II Diagnostic Mycoplasmology, p. 183-

190, J.G. Tully and S. Razin (ed.), Academic Press, New York.

186. Mehle N., J. Brzin J., Boben J., Hren M., Frank J., PetrovičN., Gruden

K., Dreo T., Žežlina I., Seljak G., Ravnikar M. (2007): First report of

'Candidatus Phytoplasma mali' in Prunus avium, P. armeniaca and P.

domestica. Plant Pathology, 56(4): 721.

187. Minoiu N., Craciun C. (1983): Electron microscopy detection of apple

rubbery wood pathogens and colbalt-therapy of infected fruit trees. Acta

Horticulturae, 130: 313-315.

188. Mullis, KB., Faioona, F., Scharf, SJ., Saiki, R.K., Horn, G.T.9 and

Erlich, R.A. (1986): Specific enzymatic amplification of DIVA in vitro: the

polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 5 1,263-

273.

189. Musetti R., Favali A., Pressacco L. (2000): Histopathology and

polyphenol content in plants infected by phytoplasmas. Cytobios, 102: 133-

147.

190. Musetti R., Sanita‘ Di Toppi L., Martini M., Ferrini F., Loschi A.,

Favali M.A., Osler R. (2005): Hydrogen peroxide localization and antioxidant

status in the recovery of apricot plants from European Stone Fruit Yellows.

European Journal of Plant Pathology, 112: 53-61.

191. Myrta, A.; Ermacora, P.; Stamo, B.; Osler, R. (2003): First report of

phytoplasma infections in fruit trees and grapevine in Albania. Journal of Plant

Pathology, 85(1), p 64.

192. Myrta A, Martini M, Susuri L, Susuri HS, Carraro L. (2006): First

report of apple proliferation and pear decline phytoplasmas in Kosovo. Journal

of Plant Pathology 88(1), 121-125.

193. Nicolaisen M., Nyskjold H., and A. Bertaccini. (2013): Microarrays for

Universal Detection and Identification of Phytoplasmas. In: Dickinson M.,

Hodgetts J., editors. Methods in molecular biology 938 springer protocols,



194. Nakamura, E., Yoshikawa, N., Takahashi, T, Nahashi, N., Kubono, T.,

and Shoji, T. (1996): Evaluation of primer pairs for the reliable diagnosis of

paulownia witches' -broom disease using a polymerase chain reaction. Plant

Dis. 80, 302-305.



117

195. Nakane, P.K., and Pierce, G.G. (1966): Enzyme-labeled antibodies:

preparation and application for the localization of antigens. J. Histochem.

Cytochem. 14,929-931.

196. Nakashima, K., Kato, S., Iwanami, S., and Murata, N. (1991): Cloning

and detection of chromosomal and extrachromosomal DNA from

mycoplasmalike organisms that cause yeilow dwarf disease of rice. Appl.

Environ. Microbiol. 57, 3570-3575.

197. Nakashima, K., Kato, S., Iwanami, S., and Murata, N. (1993): DNA

probes reveal relatedness of rice yellow dwarf mycoplasmalike organisms

(MLOs) and distinguish them from other MLOs. Appl. Environ. Microbiol.

59, 1206- 1212.

198. Namba, S., Oyaizu, H., Kato, S., Iwanami, S., and Tsuchizaki, T.

(1993b): Phylogenetic diversity of phytopathogenic mycoplasmalike

organisrns. Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 46 1-467.

199. Neimark, H.C., and Kirkpatrick, B.C. (1991): Isolation and

characterization of fulllength chromosomes from non-culhirable plant-

pathogenic mycoplasma-like organisms. Mol. Microbiol. 7,2 1-28.

200. Orita M et al., (1989): Detection of polymorphisms of human DNA by

gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc Natl

Acad Sci USA 86:2766–2770.

201. Oshima, K., Kakizawa, S., Nishigawa, H., Jung, H. Y., Wei, W.,

Suzuki, S., Arashida, R., Nakata, D., Miyata, S., Ugaki, M., Namba, S. (2004):

Reductive evolution suggested from the complete genome sequence of a plant-

pathogenic phytoplasma. Nature Genetics 36, 27-29.

202. Oshima K, Maejima K, Namba S. (2013): Genomic and evolutionary

aspects of phytoplasmas. Front Microbiol 4:230.

203. Ploaie PG. (1981): Mycoplasmalike organisms and plant diseases in

Europe. In: Maramorosch K, Harris KF, editors. Plant Diseases and Vectors:

Ecology and Epidemiology. Academic Press. pp. 61–104.

204. Pollini, P.C., Bissani, R., Giumchedi, L., and Vindimian, E. (1996):

First report of phytoplasma infection in olive trees (Olea europea L.). J.

Phytopathol. 144, 109-Ill.

205. Ponnuswami V., Irulappan I. (1993): Genetic assessment of resistance

in egg plant inter varietal crosses to little leaf disease. South Indian

Horticulture, 41: 179-181.

206. Pracros P., Renaudin J., Eveillard S., Mouras A., Hernould M. (2006):

Tomato flower abnormalities induced by stolbur phytoplasma infection are

associated with changes of expression of floral development genes. Molecular

Plant-microbe Interactions, 19(1): 62-68.

207. Purcell, A.R. (1982): Insect vector relationships with prokaryotic plant

pathogens. Ann. Rev. Phytopathol. 20,397-4 17.

208. Ravnik-Glavač M, Glavač D, Dean M. (1994): Sensitivity of single-

strand conformation polymorphism and heteroduplex method for mutation

detection in the cystic fibrosis gene. Hum Mol Genet 3:801–807.

209. Rui D. (1950): Una malattia inedita: la virosi a scopazzi del melo.

Humus, 6(11): 7-10.



118

210. Rumbos, I.C.; Bosabalidis, A.M. (1985): Mycoplasma-like organisms

associated with declined plum trees in Greece. Zeitschrift für

Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz 92, 47-54. As plum decline.

211. Rumbou A, Adamopoulos I, Schneider B, Kube M, Rumbos I. (2011):

Diversity of phytoplasma population causing small fruiting in the apple

orchards of the Pelion mountain (Greece). Phytopathogenic Mollicutes 1(1),

21-25.

212. Russel, W.C., Newman, C., and Willianmson, D.H. (1975): A simple

cytochemical technique for demonstration of DNA in cells infected with

mycoplasrnas and viruses. Nature 253,46 1-462.

213. Saiki, RD., Scharf, S., Saloona, F., Mullis, K., Horn, G., Erlich, HA.,

and Arnheim, N. (1985): Enzymatic amplification of -globin genomic

sequences and restriction site analy sis for diagnosis of sicMe ce11 anemia.

Science 230, 1350-1354.

214. Saiki, R.K., Bugawan, T.L., Horn, G.T., Mullis, KB., and Erlich, H.A.

(1986): Analysis of enzymatically amplified -globin and HLA-DQ DNA

with allelespecific oligonucleotide probes. Nature (Lond.) 324, 163- 166.

215. Sambrook J, Fritschi EF and Maniatis T. (1989): Molecular cloning: a

laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

216. Sawayanagi, T., Horikoshi, N., Kanehira, T., Shinohara, M.,

Bertaccini. A., Cousin, M.-T., Hiruki, C., Namba, S. (1999): ‗Candidatus

Phytoplasma japonicum‘, a new phytoplasma taxon associated with Japanese

Hydrangea phyllody. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 1275-1285.

217. Schaff, D.A., Lee, LM., and Davis, R.E. (1992): Sensitive detection

and identification of mycoplasmalike organisms by polymerase chah reaction.

Biochem. Biophys. Res. Comm 186, 1503-1509.

218. Schneider, B., Ahrens, U, Kirkpatrick, B.C., and Seemüller, E. (1993):

Classification of plant-pathogenic mycoplasmalike organisms using

restriction-site analysis of PCR-amplified 16s rDNA. J. Gen. Microbiol.

137,219-527.

219. Schwartz, Y., Boudon-Padieu, E., Grange, J., Meignoz, R., and

Caudwell, A. (1989): Monoclonal antibodies to the mycoplasmalike organism

(MLO) responsible for grapevine fiavescence doree. Res. Microbiol. 140,3 1

1-324.

220. Scot C. Nelson and Brian C. Bushe. (2006): Soil and Crop

Management. July SCM-14 UH-CTAHR. Collecting Plant and Insect Samples

for Problem Diagnosis SCM-14.

221. Sears, B.B., Lim, P.-O., Holland, N., Kirkpatrick, B.C., and

Klomparens, K.L. (1989): Isolation and characterization of DNA from a

mycoplasmalike organism. Mol. Plant-Microbe Interact. 2, 175- 180.

222. Sears, B.B., and Kirkpatrick, B.C. (1994): Unveiling the evolutionary

relationships of plant pathogenic mycoplasmalike organisrns. Amer. Soc.

Microbiol. News 60, 307- 3 12.

223. Seemüller, E. (1976): Fluoreszenzoptischer direktnachweis von

mycoplasmaahnlichen organism in phloem peu-decline-und triebsuchtkranker

bukme? Phytopathol. 2.85, 368-372.



119

224. Seemüller E. Kunze L., Schaper U. (1984a): Colonization behavoir of

MLO and symptom expression of proliferation in dieased apple trees and

decline-diseased pear trees over a period of several years. Journal of Plant

Disease Protection, 91: 525-532.

225. Seemüller E., Schaper U., Zimbelmann F. (1984b): Seasonal variations

in the colonization patterns of mycoplasma-like organisms associated with

apple proliferation and pear decline. Z. Pflanzenkrankeiten Pflanzenschutz,

91: 371-382.

226. Seemüller E., Kartte S., Kunze L. (1992): Resistance in established and

experimental apple rootstocks to apple proliferation disease. Acta

Horticulturae, 203: 245-251.

227. Seemüller, E., Schneider, B., Maurer, R, Ahrens, U., Daire, Xe, Kison,

H., Lorenz, K-H. Firrao, G., Avinent, Le, Sears, B.B., and Stackebrandt, E.

(1994): Phylogenetic classification of phytopathogenic mollicutes by sequence

analysis of 16s ribosomal DNA. Int. J. Syst. Bacteriol. 44,440-446.

228. Seemüller E., Foster A. (1995): European stone fruit yellows. In:

Ogawa J.M., Zehr E.I., Bird G.W., Ritchie D.F., Uriu K., Uyemoto J.K. (eds.).

Compendium of Stone Fruit Diseases, pp. 59-60. APS Press, St. Paul, MN,

USA.

229. Seemüller E., Marcone C., Lauer U., Ragozzino A., Göschl M.

(1998a): Current status of molecular classification of the phytoplasmas.

Journal of Plant Pathology, 80(1): 3-26.

230. Seemüller, E., Stolz, E., Kison, H. (1998b): Persistence of European

stone fruit yellows phytoplasma in aerial parts of Prunus taxa during the

dormant season. Journal of Phytopathology, 146: 407–410.

231. Seemüller E., Lorenz K.H., Lauer U. (1998c): Pear decline resistance

in Pyrus communis rootstocks and progenies of wild and ornamental Pyrus

taxa. Acta Horticulturae, 472:681-691.

232. Seemüller E., Schneider B. (2004): “Candidatus Phytoplasma mali‖,

“Candidatus Phytoplasma pyri‖ and ―Candidatus Phytoplasma prunorum‖,

the causal agents of apple proliferation, pear decline and European stone fruit

yellows, respectively. International Journal of Systematic and Evolutionary

Microbiology, 54: 1217-1226.

233. Seemüller E., Moll E., Schneider B. (2007): Malus sieboldii-based

rootstocks mediate apple proliferation resistance to grafted trees. Bulletin of

Insectology, 60(2): 301-302.

234. Sertkaya G., Martini M., Ermacora P., Musetti R., Osler R. (2005):

Detection and characterization of phytoplasmas in diseased stone fruits and

pear by PCR-RFLP analysis in Turkey. Phytoparasitica 33: 380-390.

235. Sertkaya G, Martini M, Osler R. (2008): First report of Candidatus

Phytoplasma mali in Turkey. Journal of Plant Pathology 90(1), p 143.

236. Shaw, K.J., P.N. Rather, R.S. Hare, and G.H. Miller. (1993):

Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial

relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes. Microbiol. Rev.

57:138-163. Review.

237. Shen, W.C., and Lin, C.P. (1993): Production of monoclonal

antibodies against a mycoplasmalike organism associated with sweetpotato

witchesT-broom. Phytopathology, 83,67 1-675.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?uid=8385262&form=6&db=m&Dopt=b

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?uid=8385262&form=6&db=m&Dopt=b



120

238. Sinclair W.A., Griffiths H.M., Davis R.E. (1996): Ash yellows and

lilac witches'-broom: phytoplasmal diseases of concern in forestry and

horticulture. Plant Disease, 80: 468-475.

239. Sinclair W.A., Griffiths H.M., Whitlow T.H. (1997a): Comparisons of

tolerance of ash yellows phytoplasmas in Fraxinus species and rootstock-scion

combinations. Plant Disease, 81:395-398.

240. Sinclair W.A., Whitlow T.H., Griffiths H.M. (1997b): Heritable

tolerance of ash yellows phytoplasmas in green ash. Canadian Journal of

Forest Research, 27: 1928-1935.

241. Sinha, R.C., and Chiykowski, L.N. (1967): Initial and subsequent sites

of aster yellows vhs infection in a leafhopper vector. Virology 33,702-708.

242. Sinha, R.C. (1974): Purification of mycoplasma-like organisms from

China aster plants infected with clover phyllody. Phytopathology 64, 1156-1

158.

243. Sinha, R.C., and Benhamou, N. (1983): Detection of mycoplasrnalike

organisms antigens from aster yellows-diseased plants by two serological

procedures. Phytopathology 73, 1 199-1202.

244. Sinha, R.C., and Chiykowski, L.N. (1984): Purification and serological

detection of mycoplasmalike organism from plants afT'ected by peach eastem

X-disease. Can. J. Plant Pathol. 6,200-205.

245. Sinha, RC. (1988): Serological detection of mycoplasmalike organisas

from plants affected with yellows diseases. In: Tree Mycoplasrnas and

Mycoplasma Diseases, p. 143-156, C. Hiniki (ed), University of Alberta Press,

Edmonton, Alberta, Canada.

246. Sinha, R.C., and Chiykowski, L.N. (1990): Serological detection of

MLOs in plants and vector leafhoppers using polyclonal antibodies. Zentralbl.

Bakteriol. Suppl. 20, 276-279.

247. Smart C.D., Schneider B., Blomquist C.L., Guerra L.J., Harrison N.A.,

Ahrens U., Lorenz K.H., Seemüller E., Kirkpatrick B.C. (1996): Phytoplasma-

specific PCR primers based on sequences of 16S rRNA spacer region. Applied

Environmental Microbiology, 62: 2988-3033.

248. Soufi, Z. (2012): Molecular detection and identification of

phytoplasmas in sugarcane in Hawaii, Thailand, Cuba and Near East. Ph.D.

Thesis. University of Bayreuth, Germany.

249. Steffeck R, Follak S, Sauvion N, Labonne G, MacLeod A. (2012):

Distribution of ‗Candidatus Phytoplasma prunorum‘ and its vector Cacopsylla

pruni in European fruit-growing areas: a review. Bulletin OEPP/EPPO

Bulletin 42(2), 191-202. 250. Steiner, T., McGarrity, GJ.,and Phillips, D.M. (1982): Cultivation and

partial characterization of spiroplasmas in cell cultures. Intect. Immunity 35,

296-304.

251. Steiner, T., McGamty, G.T., Bové, J.M., Phillips, D.M., and Garnier,

M. (1983): Insect cell cultures in the study of attachrnent and pathogenicity of

spiroplasmas and mycoplasmas. Ann. Microbil. (Inst. Pasteur) 135A: 47-53.

252. Streten C, Conde B, Herrington M, Moulden J, Gibb K. (2005a):

Candidatus Phytoplasma australiense is associated with pumpkinyellow leaf

curl disease in Queensland, Western Australia and the Northern Territory.

Australasian Plant Pathology 34, 103–105.doi: 10.1071/AP04077



121

253. Susuri L.R., and Myrta A.G. (2012): Diseases of fruit trees and

grapevine. p147-156.

254. Suzuki, S., Oshima, K., Kakizawa, S., Arashida, R., Jung, H. Y.,

Yamaji, Y., Nishigawa, H., Ugaki, M., Namba, S. (2006): Interaction between

the membrane protein of a pathogen and insect microfilament complex

determines insect-vector specificity. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America 103, 4252-4257.

255. Syrgianidis, G. D. (1989): Acta Horticulturae No. 235, 21-25.

256. Tedeschi R, Bosco D, Alma A. (2002): Population dynamics of

Cacopsylla melanoneura (Homoptera: Psyllidae), a vector of apple

proliferation phytoplasma in northwestern Italy. Journal of Economic

Entomology, 95: 544-551.

257. Tedeschi R., Alma A. (2006): Fieberiella florii (Homoptera:

Auchenorrhynca) as a vector of ―Candidatus Phytoplasma mali‖. Plant

Disease, 90: 284-290.

258. Teixeira D.C., Wulff N.A., Martins E.C., Kitajima E.W., Bassanezi R.,

Ayres A.J., Eveillard S., Saillard C., Bové J.M. (2009): A phytoplasma related

to ―Candidatus Phytoplasma asteri‖ detected in citrus showing huanglongbing

(yellow shoot disease) symptoms in Guangdong, P. R. China. Phytopathology,

99(3): 236-242.

259. Thomas P.E., Hassan S. (1992): Apparent immunity and tolerance to

tomato big bud disease in Lycopersicon peruvianum and in two of its tomato

hybrids. Plant Disease, 76: 139-141.

260. Thomas P.E., Mink G.I. (1998): Tomato hybrids with nonspecific

immunity to viral and mycoplasma pathogens of potato and tomato.

Hortscience, 33: 764-765.

261. Topchiiska M., Marcone C., Seemüller E. (2000): Detection of pear

decline and European stone fruit yellows in Bulgaria. Zeitschrift für

Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz 107 (6): 658-663.

262. Tran-Nguyen LTT et al., (2008): Comparative genome analysis of ‗

Candidatus Phytoplasma australiense‘ (subgroup tuf Australia I; rp-A) and

―Ca. Phytoplasma asteris‖ strains OY-M and AY-WB. J Bacteriol 190:3979–

3991.

263. Wang, K., Zhong, Q., Khadhair, A.H., and Hiruki, C. (1994): DNA

amplification based on polymerase chah reaction for the sensitive detection of

the mycoplasmalike organism associated with paulownia witches'-broom. Pro.

Japan. Acad. 70B, 87-91.

264. Wang, K. (1997): Molecular Detection and Identification of

Phytoplasmas and Establishment of Phytoplama-free Clonal Plants. Master of

Science Degree. University of Alberta. Edmonton, Canada.

265. Waters, H., and Hunt, P. (1980): The in vivo three-dimensional form of

a plant mycoplasmaiike organism by the analysis of senal uItrathin sections. J.

Gen. Microbiol. 116, 11 1-131.

266. Wei W. et al., (2007): Computer-simulated RFLP analysis of 16S

rRNA genes: identification of ten new phytoplasma groups. Int J Syst Evol

Microbiol 57:1855–1867.

267. Wei W. et al., (2008): Automated RFLP pattern comparison and

similarity coefficient calculation for rapid delineation of new and distinct



122

phytoplasma 16Sr subgroup lineages. Int J Syst Evol Microbiol 58:2368–

2377.

268. Weintraub PG, Beanland LeA. (2006): Insect vectors of phytoplasmas.

Annu Rev Entomol 51:91–111.

269. Welliver, R. (1999): Diseases caused by phytoplasmas. Plant

Pathology Circular No. 82

270. Wolanki, B., and Maramoroseh, IC. (1970): Negatively stained

rnycoplasmas: fact or artifact? Virology 42, 319-327.

271. Yoshikawa, N., Nakamura, H., Sahashi, N., Kubono, T., Katsube, K,

Shoji, T., and Takahashi, T. (1994): Amplification and nucleotide sequences

of ribosomal protein and 16s rRNA genes of mycoplasma-like organism

associated with paulownia witches‘-broom. Ann. Phytopathol. Soc. Japan 60,

569-575.

272. Zhong, Q., and Hiruki, C. (1994): Genetic differentiation of

phytoplasma isolates determined by a DNA heteroduplex mobility assay. Proc.

Japan. Acad. 70B, 127- 131.

273. Zirak L, Bahar M, Ahoonmanesh A. (2009): Characterization of

phytoplasmas associated with almond diseases in Iran. Journal of

Phytopathology 157(11-12), 736-741.

274. Zreik L., Carle P., Bové J.M., Garnier M. (1995): Characterization of

the mycoplasmalike organism associated with witches'-broom disease of lime

and proposition of a Candidatus taxon for the organism, ―Candidatus

Phytoplasma aurantifolia‖. International Journal of Systematic Bacterology.



123

SHTOJCA

I. Metoda e ngjyrimit DAPI

Materialet:

1. Material bimor (p.sh gjethe me bisht).

2. Buferi KH2PO4, 0,1 M, pH 6,8; Shtojmë 6,8 g KH2PO4 në 500 ml H2O të

distiluar. E përziejmë me 7 rpm për 10 min. Shtojmë 1,16 g NaOH në 200 ml

H2O të distiluar dhe e përziejmë me 7 rpm për 10 min. Rregullojmë pH e

solucionit në pH=6,8 duke shtuar solucion NaOH.

3. Buferi KH2PO4, 0,1 M, pH 6,9; Shtojmë 6,8 g KH2PO4 në 500 ml H2O të

distiluar. E përziejmë me 7 rpm për 10 min. Shtojmë 1,16 g NaOH në 200 ml

ujë të distiluar dhe e rrotullojmë me 7 rpm për 10 min. Rregullojmë pH e

solucionit në pH=6,9 duke shtuar solucion NaOH.

4. Glutaraldehid (solucion 5%): 5 ml glutaraldehid, 95 ml 0,1 M bufer KH2PO4

pH 6,8.

5. Ngjyrues DAPI (4‘,6-diamidino-2fenilindole dihidroklorid) (1,000x solucioni

stok); shtojmë 1 mg në 1 ml H2O të distiluar. E rruajmë në 4C nëse nuk

përdoret menjëherë.

6. Ujë i distiluar steril

7. Mikrotom ose bisturi

8. Mikroskop me fluoreshencë

9. Peshore elektronike

10. Balona konike (1,000 ml)

11. Qese plastike

12. Pipeta të shkallëzuara (5 dhe 10 ml)

13. Mikropipeta (100 ml)

14. Lama dhe lamela

15. Piskatore

II. Metoda e ekstraktimit të ADN-së

Materialet:

1. Materiali bimor i freskët

2. Peshore e thjeshtë

3. Peshore elektronike

4. Havan

5. Rërë kuarci

6. Bufer ekstraktimi MLO

7. Bufer CTAB

8. Kloroform/izoamilalkool (24:1)



124

9. ETOH 100% (-20C)

10. ETOH 70% (-20C)

11. Tuba falkon 15 ml

12. Tuba 1,5 dhe 2ml

13. Mikropipeta

14. Ujë i bidistiluar (ddH2O)

15. Izpropanol (-20C)

16. RNA-zë

17. TE

18. Mikrocentrifugë

19. Centrifugë me ftohje

20. Banjomari

21. Termostat

22. Vorteks

23. pH metër

24. Erlenmayer

25. Gota kimike

Tabela 1 Protokolli i përgatitjes së buferit MLO.

(Buferi në formë stoku (pa PVPP) mund të ruhet ne 4 ose -20C. Përpara përdorimit

shtohet PVPP dhe rregullohet pH në 7.6 me NaOH 1M)

Tabela 2 Protokolli i përgatitjes së buferit CTAB

Bufer CTAB 2% 1L

NaCl 1.4M

MkaptoEtOH 0.2 %

EDTA 20mM

Tris-Hcl 100mM

dH2O steril Deri në 1L

pH 8

Bufer MLO 1L

K2HPO4 3H2O 28.5 g

Ac.Ascorbik 5.28 g

Sukrozë 100 g

BSA 1.5 g

PVPP* 20 g

dH2O steril Deri në 1l

pH 7.6



125

Tabela 3 Protokolli i PCR

Mastermix 1x 40 µl Mastermix 31x 1180 µl

Buffer 10x 4 µl Buffer 10x 124 µl

dNTPs 0.4 µl dNTPs 12.4 µl

P1 2 µl P1 62 µl

P2 2 µl P2 62 µl

Taq pol 0.5 µl Taq pol 15.5 µl

MgCl2 4 µl MgCl2 124 µl

ADN 2 µl ADN 2λ *për çdo tub

ddH2O 25.1 µl ddH2O 778.1 µl

Tabela 4 Kategoritë e mostrave të përdorura për shumëfishimin nëpërmjet PCR, cilësia dhe

sasia e secilës prej tyre.

Nr Plantacioni Kategoria Druri Cilësia

OD 260/ OD 268

Sasia

(µg)

1. Korçë Kërcell 1 2 130

2. Korçë Kërcell 4 1.8 90



5. Korçë Rrënjë 6 1.8 160

6. Korçë Trung 6 2 100

7. Korçë Trung 8 1.7 220

8. Korçë Trung 10 2 120

9. Korçë Gjethe 1 2 200

10. Korçë Gjethe 2 1.8 90

11. Korçë Gjethe 7 1.8 110

12. Korçë Gjethe 10 2 400

13. Turan Kërcell 2 1.75 70



16. Turan Gjethe 4 1.7 410

17. Turan Gjethe 4‘ 1.67 150

18. Turan Gjethe 6 1.9 230

19. Turan Gjethe 8‘ 1.76 530

20. Bitinckë Kërcell 1 2 80

21. Bitinckë Kërcell 9 1.7 520

22. Bitinckë Gjethe 3‘ 1.66 250

23. Bitinckë Gjethe 4‘ 2 100

24. Dvoran Trung 1‘ 2 120

25. Dvoran Gjethe 8 1.62 470

26. Cangonj Gjethe 4‘ 1.6 210

27. Cangonj Gjethe 5 2 400

28. Cangonj Gjethe 9 1.6 260



126

Përgatitja e xhelit agarozë 1,5%

2.4g Agarozë + 160ml TAE (1x)

EtBr; 0.5 μL nga stoku 10 mg/mL; sasia e duhur: 8 µl

Përgatitja e mostrave për elektroforezë

Volumi total 55 µl; 40 µl + 15 µl loading buffer

Përgatitja e markerave

Marker; 0.5 µl nga stoku 500 µg/ml

Markeri 100bp; 1µl marker, 10 µl loading buffer, 5 µl H2O

Markeri 1kbp; 1µl marker, 10 µl loading buffer, 5 µl H2O

Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Bitinckë

Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia

1 Trung 0.038 1.31 0.029 380

2 Trung 0.023 1.21 0.019 230

3 Trung 0.025 1.09 0.023 250

4 Trung 0.023 0.96 0.024 230

5 Trung 0.024 0.92 0.026 240

6 Trung 0.029 1.38 0.021 290

7 Trung 0.022 1.05 0.021 220

8 Trung 0.035 1.3 0.027 350

9 Trung 0.034 1.26 0.027 340

10 Trung 0.036 1.06 0.034 360


1‘ Trung 0 0 0 0

2‘ Trung 0 0 0 0

3‘ Trung 0 0 0 0

4‘ Trung 0.034 1.31 0.026 340

5‘ Trung 0.021 1.23 0.017 210

6‘ Trung 0.016 1.14 0.014 160

7‘ Trung 0.051 1.21 0.042 510

8‘ Trung 0.03 1.2 0.025 300

9‘ Trung 0.02 1.25 0.016 200

10‘ Trung 0.026 1.24 0.021 260


1 Kërcell 0.008 2 0.004 80

2 Kërcell 0.006 1.5 0.004 60

3 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40

4 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40

5 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40

6 Kërcell 0.003 1.5 0.002 30

7 Kërcell 0.025 1.4 0.018 250

8 Kërcell 0.017 1.13 0.015 140

9 Kërcell 0.052 1.7 0.031 520

10 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40



127


1 Rrënjë 0.022 1.22 0.018 220

2 Rrënjë 0.043 1.23 0.035 430

3 Rrënjë 0.025 1.14 0.022 250

4 Rrënjë 0.033 1.22 0.027 330

5 Rrënjë 0.03 1.2 0.025 300

6 Rrënjë 0.022 1.22 0.018 220

7 Rrënjë 0.041 1.14 0.036 410

8 Rrënjë 0.034 1.26 0.027 340

9 Rrënjë 0.026 1.3 0.02 260

10 Rrënjë 0.024 1.14 0.021 240


1‘ Rrënjë 0.017 1.3 0.013 170

2‘ Rrënjë 0.02 1.18 0.017 200

3‘ Rrënjë 0.022 1.16 0.019 220

4‘ Rrënjë 0.023 1.15 0.02 230

5‘ Rrënjë 0.025 1.19 0.021 250

6‘ Rrënjë 0.033 1.38 0.024 330

7‘ Rrënjë 0.028 1.12 0.025 280

8‘ Rrënjë 0.022 1.3 0.017 220

9‘ Rrënjë 0.029 1.32 0.022 290

10‘ Rrënjë 0.026 1.3 0.02 260


1 Gjethe 0 0 0 0

2 Gjethe 0.005 5 0.001 50

3 Gjethe 0.022 1.5 0.015 220

4 Gjethe 0.009 0 0 90

5 Gjethe 0.005 0 0 50

6 Gjethe 0.006 0 0 60

7 Gjethe 0.002 0 0 20

8 Gjethe 0.028 0 0 280

9 Gjethe 0.011 3.6 0.003 110

10 Gjethe 0.012 4 0.003 120


1‘ Gjethe 0.026 1.52 0.017 260

2‘ Gjethe 0.04 4 0.01 40

3‘ Gjethe 0.025 1.66 0.015 250

4‘ Gjethe 0.010 2 0.005 100

5‘ Gjethe 0.002 0 0 20

6‘ Gjethe 0 0 0 0

7‘ Gjethe 0 0 0 0

8‘ Gjethe 0.009 0 0 90

9‘ Gjethe 0.007 2.3 0.003 70

10‘ Gjethe 0.032 3.5 0.003 320



128

Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Korçë


1 Kërcell 0.013 2 0.006 130

2 Kërcell 0.012 1.2 0.01 120

3 Kërcell 0.009 1.5 0.006 90

4 Kërcell 0.009 1.8 0.005 90

5 Kërcell 0.018 1.2 0.015 180

6 Kërcell 0.006 1.2 0.005 60

7 Kërcell 0.017 1.7 0.01 170

8 Kërcell 0.016 1.45 0.0011 160

9 Kërcell 0.013 1.62 0.008 130

10 Kërcell 0.015 1.2 0.013 150


1 Trung 0.012 1.09 0.011 120

2 Trung 0.013 0.9 0.014 130

3 Trung 0.01 1.1 0.09 100

4 Trung 0.011 1.1 0.01 110

5 Trung 0.013 0.9 0.014 130

6 Trung 0.016 0.9 0.017 160

7 Trung 0.012 0.9 0.013 120

8 Trung 0.009 0.8 0.011 90

9 Trung 0.014 0.8 0.016 140

10 Trung 0.013 1 0.013 130

Mbas ripastrimit


1 Trung 0.01 1.25 0.008 100

2 Trung 0.005 1.25 0.004 50

3 Trung 0.014 1.27 0.011 140

4 Trung 0.008 1.33 0.006 80

5 Trung 0.005 1.25 0.004 50

6 Trung 0.01 2 0.005 100

7 Trung 0.01 1.42 0.007 100

8 Trung 0.022 1.7 0.013 220

9 Trung 0.003 1.5 0.002 30

10 Trung 0.012 2 0.006 120


1 Rrënjë 0.016 1.06 0.015 160

2 Rrënjë 0.024 1.4 0.017 240

3 Rrënjë 0.015 1.15 0.013 150

4 Rrënjë 0.019 1.26 0.015 190

5 Rrënjë 0.022 1.15 0.019 220

6 Rrënjë 0.016 1.14 0.014 160

7 Rrënjë 0.014 1.4 0.01 140

8 Rrënjë 0.015 1.25 0.012 150

9 Rrënjë 0.019 1.26 0.015 190

10 Rrënjë 0.014 1.27 0.011 140



129

Mbas ripastrimit


1 Rrënjë 0.009 1.3 0.007 90

2 Rrënjë 0.009 1.5 0.006 90

3 Rrënjë 0.009 1.3 0.007 90

4 Rrënjë 0.011 1.4 0.008 110

5 Rrënjë 0.003 1.5 0.002 30

6 Rrënjë 0.016 1.8 0.009 160

7 Rrënjë 0.004 1.33 0.003 40

8 Rrënjë 0.004 1.33 0.003 40

9 Rrënjë 0.014 1.3 0.011 140

10 Rrënjë 0.006 1.5 0.004 60


1 Gjethe 0.002 2 0.001 200

2 Gjethe 0.009 1.8 0.005 90

3 Gjethe 0 0 0 0

4 Gjethe -0.005 0 -0.003 0

5 Gjethe 0 0 0.001 0

6 Gjethe -0.002 0 -0.001 0

7 Gjethe 0.011 1.83 0.006 110

8 Gjethe 0.014 1.4 0.01 140

9 Gjethe 0.005 0.7 0.007 50

10 Gjethe 0.04 2 0.02 400

Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Turan


1 Kërcell 0.01 1.25 0.008 100

2 Kërcell 0.007 1.75 0.004 70

3 Kërcell 0.022 1.69 0.013 220

4 Kërcell 0.03 2.5 0.012 300

5 Kërcell 0.004 1 0.004 40

6 Kërcell 0.01 1.66 0.006 100

7 Kërcell 0.012 1.5 0.008 120

8 Kërcell 0.003 0.75 0.004 30

9 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40

10 Kërcell 0.014 1.55 0.009 140


1 Trung 0.004 4 0.001 40

2 Trung 0.003 0.75 0.004 30

3 Trung 0.002 1 0.002 20

4 Trung 0.002 2 0.001 20

5 Trung 0.002 1 0.002 20

6 Trung 0.003 1 0.003 30

7 Trung 0.003 3 0.001 30

8 Trung 0.004 1.33 0.003 40

9 Trung 0.003 1 0.003 30

10 Trung 0.002 1 0.002 20



130


1 Rrënjë 0.001 1 0.001 10

2 Rrënjë 0.004 1.33 0.003 40

3 Rrënjë 0.003 1 0.003 30

4 Rrënjë 0.018 1.2 0.015 180

5 Rrënjë 0.023 1 0.023 230

6 Rrënjë 0.004 1.33 0.003 40

7 Rrënjë 0.012 1.09 0.011 120

8 Rrënjë 0.002 1.1 0.018 20

9 Rrënjë 0.002 1 0.002 20

10 Rrënjë 0.013 1.08 0.012 130


1 Gjethe 0.018 1.4 0.013 180

2 Gjethe 0.014 1.3 0.011 140

3 Gjethe 0.022 1.6 0.014 220

4 Gjethe 0.041 1.7 0.024 410

5 Gjethe 0.028 1.3 0.022 280

6 Gjethe 0.023 1.9 0.012 230

7 Gjethe 0.017 1.4 0.012 170

8 Gjethe 0.035 1.5 0.023 350

9 Gjethe 0.02 1.3 0.015 20

10 Gjethe 0.014 1.55 0.009 140


1‘ Gjethe 0.02 1.3 0.015 20

2‘ Gjethe 0.023 1.2 0.019 230

3‘ Gjethe 0.033 1.3 0.026 330

4‘ Gjethe 0.015 1.67 0.009 150

5‘ Gjethe 0.015 1.5 0.01 150

6‘ Gjethe 0.025 1.5 0.017 250

7‘ Gjethe 0.016 1.3 0.012 160

8‘ Gjethe 0.053 1.76 0.03 530

9‘ Gjethe 0.023 1.2 0.02 230

10‘ Gjethe 0.014 1.3 0.011 140

Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Cangonj


1 Kërcell 0.012 1 0.012 120

2 Kërcell 0.01 1 0.01 100

3 Kërcell 0.013 0.9 0.014 130

4 Kërcell 0.014 0.8 0.016 160

5 Kërcell 0 0 0 0

6 Kërcell 0.004 1 0.004 40

7 Kërcell 0.003 0.75 0.004 40

8 Kërcell 0.002 1 0.002 20

9 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40

10 Kërcell 0.013 1.08 0.012 130



131


1 Trung 0.02 1 0.02 200

2 Trung 0.029 1.3 0.022 290

3 Trung 0.021 1.2 0.017 210

4 Trung 0.017 1 0.017 170

5 Trung 0 0 0 0

6 Trung 0 0 0 0

7 Trung 0.028 1.1 0.025 280

8 Trung 0.02 1.2 0.017 200

9 Trung 0.007 1 0.007 70

10 Trung 0.016 1 0.016 160


1 Rrënjë 0.009 0.8 0.011 90

2 Rrënjë 0.01 1 0.01 100

3 Rrënjë 0.015 1 0.015 150

4 Rrënjë 0.01 1.1 0.09 100

5 Rrënjë 0.002 1 0.002 20

6 Rrënjë 0.016 1.1 0.014 160

7 Rrënjë 0 0 0 0

8 Rrënjë 0.011 1 0.011 110

9 Rrënjë 0 0 0 0

10 Rrënjë 0.005 0.7 0.007 50


1 Gjethe 0.038 3.1 0.013 380

2 Gjethe 0.005 0 0 50

3 Gjethe 0.039 1.2 0.032 390

4 Gjethe 0.007 0 0 70

5 Gjethe 0.04 2 0.02 400

6 Gjethe 0 0 0 0

7 Gjethe 0 0 0 0

8 Gjethe 0 0 0 0

9 Gjethe 0.026 1.6 0.016 260

10 Gjethe 0.021 5.2 0.004 210


1‘ Gjethe 0.016 1 0.016 160

2‘ Gjethe 0 0 0 0

3‘ Gjethe 0.015 15 0.001 150

4‘ Gjethe 0.021 1.6 0.013 210

5‘ Gjethe 0.007 0 0 70

6‘ Gjethe 0 0 0 0

7‘ Gjethe 0 0 0 0

8‘ Gjethe 0 0 0 0

9‘ Gjethe 0.005 5 0.001 50

10‘ Gjethe 0.005 5 0.001 50



132

Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Dvoran


1 Kërcell 0.016 1.14 0.014 160

2 Kërcell 0.012 1.2 0.01 120

3 Kërcell 0.016 1.23 0.013 160

4 Kërcell 0.016 1.33 0.012 160

5 Kërcell 0.017 1.42 0.012 170

6 Kërcell 0.019 1.12 0.017 190

7 Kërcell 0.028 1.65 0.017 280

8 Kërcell 0.316 2.32 0.136 316

9 Kërcell 0.016 1.14 0.014 160

10 Kërcell 0.014 1.27 0.011 140


1‘ Kërcell 0.028 1.4 0.02 280

2‘ Kërcell 0.015 1.15 0.013 150

3‘ Kërcell 0.015 1.15 0.013 150

4‘ Kërcell 0.028 1.33 0.021 280

5‘ Kërcell 0.216 2.2 0.098 216

6‘ Kërcell 0.471 2.32 0.203 471

7‘ Kërcell 0.017 1.21 0.014 170

8‘ Kërcell 0.024 1.1 0.022 240

9‘ Kërcell 0.017 1.21 0.014 170

10‘ Kërcell 0.022 1.1 0.02 220


1 Trung 0.02 1 0.02 200

2 Trung 0.03 1 0.03 300

3 Trung 0.01 0.5 0.02 100

4 Trung 0.026 0.27 0.096 260

5 Trung 0.03 0.2 0.15 300

6 Trung 0.016 1.14 0.014 160

7 Trung 0.031 1.55 0.02 310

8 Trung 0.03 1.5 0.02 300

9 Trung 0.018 1.3 0.014 180

10 Trung 0.018 1.2 0.015 180


1‘ Trung 0.012 2 0.006 120

2‘ Trung 0.27 2.6 0.102 270

3‘ Trung 0 0 0 0

4‘ Trung 0.015 1.15 0.013 150

5‘ Trung 0.013 0.11 0.013 130

6‘ Trung 0.013 1 0.013 130

7‘ Trung 0.022 1.29 0.017 220

8‘ Trung 0 0 0 0

9‘ Trung 0 0 0 0

10‘ Trung 0.018 1.2 0.015 180



133


1 Rrënjë 0.022 1.38 0.016 220

2 Rrënjë 0.023 1.2 0.019 230

3 Rrënjë 0.032 1.28 0.025 320

4 Rrënjë 0.052 1.68 0.031 520

5 Rrënjë 0.023 1.28 0.018 230

6 Rrënjë 0.019 1.2 0.016 190

7 Rrënjë 0.018 1.2 0.015 180

8 Rrënjë 0.026 1.3 0.02 260

9 Rrënjë 0.022 1.16 0.019 220

10 Rrënjë 0.029 1.53 0.019 290


1‘ Rrënjë 0.019 1.2 0.016 190

2‘ Rrënjë 0.021 1.24 0.017 210

3‘ Rrënjë 0.035 0.21 0.16 350

4‘ Rrënjë 0.029 1.38 0.021 290

5‘ Rrënjë 0.03 1.3 0.023 300

6‘ Rrënjë 0.018 1.4 0.013 180

7‘ Rrënjë 0.022 1.3 0.017 220

8‘ Rrënjë 0.022 1.3 0.017 220

9‘ Rrënjë 0.016 1.07 0.015 160

10‘ Rrënjë 0.019 1.2 0.016 190


1 Gjethe 0.034 1.42 0.024 340

2 Gjethe 0.005 5 0.001 50

3 Gjethe 0.007 0 0 70

4 Gjethe 0.036 1.1 0.033 360

5 Gjethe 0.025 1.5 0.017 250

6 Gjethe 0.022 1.3 0.017 220

7 Gjethe 0.06 1.2 0.05 400

8 Gjethe 0.047 1.62 0.029 470

9 Gjethe 0.018 1.3 0.014 180

10 Gjethe 0.016 1.5 0.011 160


1‘ Gjethe 0.005 5 0.001 50

2‘ Gjethe 0.007 7 0.001 70

3‘ Gjethe 0.004 4 0.001 40

4‘ Gjethe 0.02 1.25 0.016 200

5‘ Gjethe 0.032 1.33 0.024 320

6‘ Gjethe 0.002 1 0.002 20

7‘ Gjethe 0.027 2.4 0.021 270

8‘ Gjethe 0.016 1.23 0.013 160

9‘ Gjethe 0.017 1.3 0.013 170

10‘ Gjethe 0.022 1.57 0.014 220



134

Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Zëmblak


1 Kërcell 0.038 1.1 0.035 380

2 Kërcell 0.014 1 0.014 140

3 Kërcell 0.015 1 0.015 150

4 Kërcell 0.02 1 0.019 200

5 Kërcell 0.028 1.1 0.026 280

6 Kërcell 0.013 0.9 0.014 130

7 Kërcell 0.019 1 0.019 190

8 Kërcell 0.022 1 0.022 220

9 Kërcell 0.035 1.3 0.028 350

10 Kërcell 0.02 0.8 0.022 200


1‘ Kërcell 0.018 0.9 0.019 180

2‘ Kërcell 0.015 1 0.015 150

3‘ Kërcell 0.019 1 0.018 190

4‘ Kërcell 0.012 1 0.012 120

5‘ Kërcell 0.021 1 0.021 210

6‘ Kërcell 0.044 1 0.043 440

7‘ Kërcell 0.019 1 0.019 190

8‘ Kërcell 0.014 0.87 0.016 140

9‘ Kërcell 0.016 0.8 0.018 160

10‘ Kërcell 0.021 1 0.02 210


1 Trung 0.04 1.1 0.037 400

2 Trung 0.028 1 0.028 280

3 Trung 0.025 1.1 0.022 250

4 Trung 0.026 1 0.025 260

5 Trung 0.018 1 0.018 180

6 Trung 0.024 1 0.023 240

7 Trung 0.02 1 0.02 200

8 Trung 0.014 0.8 0.017 140

9 Trung 0.016 1 0.015 160

10 Trung 0.013 0.9 0.014 130


1‘ Trung 0.019 1 0.018 190

2‘ Trung 0.025 1 0.024 250

3‘ Trung 0.023 1 0.022 230

4‘ Trung 0.023 1 0.022 230

5‘ Trung 0.021 1 0.02 210

6‘ Trung 0.028 1 0.027 280

7‘ Trung 0.024 1.14 0.021 240

8‘ Trung 0.033 1.13 0.029 330

9‘ Trung 0.015 1 0.015 150

10‘ Trung 0.016 1 0.015 160



135


1 Rrënjë 0.026 1 0.026 260

2 Rrënjë 0.043 1 0.043 430

3 Rrënjë 0.037 1 0.035 370

4 Rrënjë 0.036 1 0.036 360

5 Rrënjë 0.051 1 0.051 510

6 Rrënjë 0.034 1 0.032 340

7 Rrënjë 0.04 1.2 0.034 400

8 Rrënjë 0.02 0.9 0.022 200

9 Rrënjë 0.027 1.2 0.023 270

10 Rrënjë 0.031 1 0.029 310


1‘ Rrënjë 0.023 1.1 0.021 230

2‘ Rrënjë 0.04 1 0.04 400

3‘ Rrënjë 0.05 1.4 0.044 500

4‘ Rrënjë 0.05 1.1 0.046 500

5‘ Rrënjë 0.041 1 0.039 410

6‘ Rrënjë 0.037 1.1 0.034 370

7‘ Rrënjë 0.021 1.1 0.019 210

8‘ Rrënjë 0.022 1.1 0.02 220

9‘ Rrënjë 0.023 1 0.022 230

10‘ Rrënjë 0.029 1 0.027 290


1 Gjethe 0.013 1.44 0.009 130

2 Gjethe 0.016 1.23 0.013 160

3 Gjethe 0.025 1.5 0.017 250

4 Gjethe 0.02 1.25 0.016 200

5 Gjethe 0.029 1.5 0.02 290

6 Gjethe 0.024 1.3 0.018 240

7 Gjethe 0.023 1.4 0.017 230

8 Gjethe 0.023 1.2 0.019 230

9 Gjethe 0 0 0 0

10 Gjethe 0 0 0 0


1‘ Gjethe 0.01 1.42 0.007 100

2‘ Gjethe 0.019 1.5 0.013 190

3‘ Gjethe 0.032 1.3 0.024 320

4‘ Gjethe 0.025 1.3 0.019 250

5‘ Gjethe 0.02 1.2 0.017 200

6‘ Gjethe 0.04 1 0.04 400

7‘ Gjethe 0.023 1.3 0.018 230

8‘ Gjethe 0.023 1.3 0.018 230

9‘ Gjethe 0 0 0 0

10‘ Gjethe 0 0 0 0



136

LISTA E PUBLIKIMEVE

REFERIME:

1. Desareda Mero, Ariola Bacu (2016): Amount of DNA extracted from

different tissues of apple trees in springtime can be used to describe the level of

infection. The International Conference of the University of Agronomic

Sciences and Veterinary Medicine of Bucharest ―Agriculture for Life, Life for

Agriculture‖. 9-11 June 2016 Bucharest, Romania.

http://biotechnologyjournal.usamv.ro/index.php/scientific-papers/281-amount-

of-dna-extracted-from-different-tissues-of-apple-trees-in-springtime-can-be-

used-to-describe-the-level-of-infection-281.

2. Desareda Mero, Ariola Bacu, Margarita Hysko (2016): Comparison of three

detection methods of phytoplasma at apple trees proves the advantage of

amplification of specific 16srADN. The International Conference of the

University of Agronomic Sciences and Veterinary Medicine of Bucharest

―Agriculture for Life, Life for Agriculture‖. 9-11 June 2016 Bucharest,

Romania.

http://biotechnologyjournal.usamv.ro/index.php/scientific-papers/282-

comparison-of-three-detection-methods-of-phytoplasma-at-apple-trees-proves-

the-advantage-of-amplification-of-specific-16sradn-282.

3. Desareda Mero, Ariola Bacu, Margarita Hysko (2015): Krahasimi i të

dhënave fenotipike me ato të marra nga përdorimi i metodës DAPI për praninë

e fitoplazmave në drurët e mollëve të plantacionit Turan. XIth International

Symposium: Biodiversity Conservation and Sustainable Use for Rural

Development, Tiranë 21 Dhjetor 2015. (me proceeding)

4. Desareda Mero, Ariola Bacu, Margarita Hysko (2015) Zbulimi paraprak i

fitoplazmave nëpërmjet ngjyrimit DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) dhe

mikroskopisë fluoreshente. Konferenca Kombëtare e Shkencave të Aplikuara,

Tiranë 21 Nëntor 2015.

5. Desareda Mero, Margarita Hysko, Ariola Bacu (2014): Early detection

methods for apple phytoplasmas and data related to them in Korca district. 2nd

International Conference on Applied Biotechnology, Tiranë 22 Shtator 2014.

6. Besnik Skënderasi, Edmond Spahiu, Desareda Mero, Hekuran Vrapi (2015):

Vlerësim simptomatologjik i përhapjes së fitoplazmës së mollës (Candidatus

phytoplasma mali), në rajonin e Korçës. Konferenca e II-të Ndërkombëtare e

Bujqësisë, Ushqimit dhe Mjedisit‖, Korçë, 25 Shtator 2015.

http://biotechnologyjournal.usamv.ro/index.php/scientific-papers/281-amount-of-dna-extracted-from-different-tissues-of-apple-trees-in-springtime-can-be-used-to-describe-the-level-of-infection-281



http://biotechnologyjournal.usamv.ro/index.php/scientific-papers/282-comparison-of-three-detection-methods-of-phytoplasma-at-apple-trees-proves-the-advantage-of-amplification-of-specific-16sradn-282





137

BOTIME:

1.

Desareda Mero, Ariola Bacu, Kristi Buzo (2016): Phytoplasmas detection effectiveness based on symptomatology, DAPI staining and specific PCR at plum plant material of different categories. European Journal of Biotechnology and Genetic Engineering (Online), ISSN 2397-2076. Vol. 3 No. 1, 2016, 75-82. http://www.idpublications.org/ejbge-vol-3-no-1-2016.

2.

Desareda Mero, Ariola Bacu (2017): Amplifıcation of Specıfıc Ribosomal and Non-Ribosomal phytoplasma DNA can serve to dıagnose their presence at Apple and Plum trees from Korca plantations. International Journal of Ecosystems and Ecology Science (IJEES) ISSN 2224-4980. Volume 7/1, 2017 Page 99-106. http://www.kitabig.com/journal/journal-40-

International--Journal-of-Ecosystems-and-Ecology-Science--(IJEES) Volume-7-1,-2017.html.

3. Desareda Mero (2015): Diagnostic techniques for detection of apple

phytoplasma diseases. Buletini Shkencor i Universitetit Fan.S.Noli, seria e

shkencave të zbatuara, viti XX i botimit, ISSN 2078-7111. Nr. 30, 2015, fq.

17-24. http://www.unkorce.edu.al/sq/node/682.

4. Desareda Mero, Ariola Bacu, Margarita Hysko (2016): Phytoplasmas

identification based on phenotypic data compared to DAPI staining at apple

plantation of Turan, Korçë. Journal of Agriculture and Animal Production

Science for Rural Development, ISSN 2224-7718. Vol. 6, No 1, 2016, 49-

52.

http://www.idpublications.org/ejbge-vol-3-no-1-2016/

http://www.idpublications.org/ejbge-vol-3-no-1-2016/

http://www.idpublications.org/ejbge-vol-3-no-1-2016

http://www.kitabig.com/journal/journal-40-International--Journal-of-Ecosystems-and-Ecology-Science--(IJEES)%20Volume-7-1,-2017.html



http://www.unkorce.edu.al/sq/node/682



138

PËRMBLEDHJE

Fitoplazmat janë përgjegjëse për një sërë sëmundjesh të bimëve të përhapura në të gjithë botën. Disa

prej sëmundjeve, veçanërisht ato të bimëve drunore janë letale. Si parazitë obligativë, ato janë adaptuar

për të jetuar në dy nishe ekologjike, floemën e bimëve dhe insekte. Fitoplazmat varen nga transmetimi

me anë të vektorëve hemipterë që ushqehen në floemë, pasi janë në përgjithësi të paaftë për të kaluar në

mënyrë direkte në farat e bimëve apo vezët e insekteve. Korça është një nga rajonet kryesore për

kultivimin e dru-frutorëve si molla dhe kumbulla në Shqipëri. Ekonomia e këtij rajoni bazohet

kryesisht në bujqësi dhe prodhimin e dru-frutorëve, ndaj diagnoza e hershme e fitopatologjive të

lidhura me to është shumë e rëndësishme. Deri pak kohë më parë, sëmundjet virale dhe ato të

shkaktuara nga MLO në plantacionet e mollëve dhe kumbullave janë dedektuar bazuar në simptoma, të

cilat shpesh janë të ngjashme dhe çojnë në interpretime të gabuara. Metodat mikroskopike dhe

molekulare janë ndër më të përdorurat për këtë qëllim. Dedektimi me anë të mikroskopisë me

fluoreshencë DAPI bazohet në përdorimin e 4', 6-diamidino-2-phenylindole, një substancë fluoreshente

që ndriçon nën rrezatimin UV. Metodat e bazuara në PCR i referohen shumëfishimit të rajoneve

specifike ribozomale dhe jo-ribozomale për fitoplazmat. Gjashtë plantacione, tre me mollë (Malus

domestica) dhe tre me kumbulla (Prunus domestica), ishin burimi i materialit të kontrolluar, që u morr

nga 10 drurë, 5 paralele nga çdo kategori (rrënjë, kërcej, gjethe, trung). Gjithsej u analizuan katër

kultivarë molle dhe dy kultivarë kumbulle. Metodologjia e ndjekur ishte simptomatologjia, ngjyrimi

DAPI dhe PCR specifike. Bazuar në rezultatet tona, dedektimi me anë të simptomatologjisë dhe

ngjyrimit DAPI varen nga sezoni i marrjes së mostrave, dhe pozicioni i mostrës në pemë. Ndërsa

simptomatologjia mund të japë informacion mbi praninë e sëmundjes në faza të avancuara, DAPI mund

të shërbejë për të identifikuar stade më të hershme të infeksionit. Sidoqoftë, për të qënë e suksesshme

nevojitet një përqëndrim i caktuar i fitoplazmave. Diagnostika e bazuar në PCR varet shumë nga cilësia

e ADN-së të pasuruar me fitoplazma. Në përfundim, ne rekomandojmë përdorimin e njëkohshëm të tre

metodave, të cilat plotësojnë njëra-tjetrën duke dhënë një rezultat të besueshëm.

Fjalët kyçe: fitoplazma, simptoma, DAPI, PCR, Korca.

ABSTRACT

Phytoplasmas are associated with diseases in numerous plant species worldwide. Some of these

diseases, especially those of woody plants, are lethal. As obligate parasites, they are adapted to live in

two ecological niches, plant phloem and insects. Very little is known about the mechanisms by which

phytoplasmas induce disease in plants and the reason for different reactions of the host plants to

phytoplasmal infections. Korca is one of the main areas of apple cultivation in Albania. The economy

of the district is based mainly on agriculture and especially at fruit-trees production, thus the efficient

early diagnosis of phytopathologies related to them is imperative. Until recently the diagnosis of

bacterial, viral or MLO diseases at apple and plum collections was done based on symptoms, which

very often are similar, and as a result the interpretation of them has lead to mistakes on treatment.

Microscopic and molecular methods are among the most used in this respect. DAPI staining detection

is based on the use of 4', 6-diamidino-2-phenylindole, a fluorescent stain, which lights under UV light,

and makes phytoplasmas visible. The PCR based methods of detection address mainly the

amplification of ribosomal and non-ribosomal specific DNA from phytoplasmas. Six collections,

respectively three with apple trees (Malus domestica) and three with plums (Prunus domestica), were

considered as resources of plant material, which were sampled from 10 trees, 5 paralel samples of each

category (root, stem, leaves, trunk). Altogether were analysed four apple cultivars and two plum

cultivars. Methodology followed were symptomatology, DAPI staining and specific-PCR. Based on our

results we conclude that the symptoms and DAPI staining detection depend on seasson of sampling,

and on the sampling position at each tree; While symptomatology can provide information on presence

of disease in advanced phases, DAPI can help identify earlier stages of infection. However, in order to

be successful a certain concentration of phytoplasmas is required. PCR based diagnostic is strongly

dependent on the quality of the DNA, extracted from plant tissues and enriched for the phytoplasmas

DNA content. In conclusion, we recommend the simultaneous use of the three methods, which

complement each-other assuring this way a more reliable result.

Key words: phytoplasma, symptoms, DAPI, PCR, Korca.

Documents

PËRDORIMI I INSTRUMENTEVE MODERNE PËR DIAGNOSTIKIMIN … · Mero D. (201. 7): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave që shkaktojnë infeksione në