ISBN :978-602-73159-0-7

PREDIKSI MODEL PROTEIN PcpB DARI

PENTAKLORPSEUDILIN BIOSINTESIS GEN KLUSTER DENGAN

MENGGUNAKAN SWISS-MODEL

Sri Mulyani1*, dan Karl-Heinz van Pee2

1 Prodi P.Kimia, Fakultas KIP, Universitas Sebelas Maret, Surakarta, Indonesia

2 Institute for Biochemistry, Faculty of Mathematics and Nature Science, Technische Universitāt

Dresden, Dresden, Germany

* Keperluan korespondensi, tel/fax : 0271-646994 ext 376, email: srimulyaniuns@staff.uns.ac.id

ABSTRAK

Expresi dan purifikasi protein dugaan NRPS domain PcpB dari Pentaklorpseudilinebiosyntesis gene cluster sudah dilakukan. Prediksi fungsi protein tersebut bisa dilakukan antara lain bila diketahui struktur proteinnya. SWISS-MODEL adalah salah satu program untuk memprediksi struktur protein berdasarkan homology modeling. Pembuatan model struktur berdasarkan homology modeling dilakukan dengan membandingkan sekuen homolog antara protein target dengan protein lain yang sudah diketahui struktur tiga dimensinya untuk dijadikan sebagai induk atau cetakan. Dalam hal ini diperlukan persamaan sekuen antara protein target dengan protein cetakan yang lebih besar dari 30% agar menghasilkan model yang baik, Model protein PcpB sudah dilakukan dengan program SWISS-MODEL dan menggunakan cetakan model NRPS adenylation proteine CytC1 (3vnq.1.A), Non-ribosomal peptide synthetase (4gr5.1.A), dan Dalaninepoly(phosphoribitol) ligase (3dhv.1.A) yang masing-masing mempunyai kesamaan sekuen sebesar 37,23%; 35,90 % dan 33,62 %.

Kata Kunci: PcpB, Pentachloropseudilin, SWISS-MODEL

PENDAHULUAN

Metabolit yang mengandung halogen

banyak ditemukan di alam. Untuk metabolit

yang mengandung halogen klor banyak

dijumpai pada organisme daratan. Sebagi-

an besar metabolit berhalogen mempunyai

aktivitas antibiotik, diantaranya pentaklor-

pseudilin (Gambar 1).

SEMINAR NASIONAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA VII

“Penguatan Profesi Bidang Kimia dan Pendidikan Kimia Melalui Riset dan Evaluasi”

Program Studi Pendidikan Kimia Jurusan P.MIPA FKIP UNS Surakarta, 18 April 2015

MAKALAH

PENDAMPING BIOKIMIA ISBN :978-602-73159-0-7

ISBN :978-602-73159-0-7

.

NH

OH

Cl

Cl

ClCl

Cl

Gambar 1.Struktur kimia pentaklorpseudilin

Pentaklorpseudilin diproduksi oleh

bakteri Actinoplanes sp. ATCC 33002,

merupakan antibiotika spektrum luas

terutama untuk melawan bakteri gram

positif dan negatif, jamur, dan dermatofita

[1]. Melalui studi pustaka genom terhadap

DNA genom Actinoplanes sp. ATCC 33002

diperoleh Cosmid pIWcos10 yang berukur-

an 45.100 pasang basa [2]. Dari cosmid

tersebut telah diisolasi dan dikarakterisasi

gen halogenase halB yang diketahui

berpartisipasi di dalam proses klorinasi

selama biosintesis Pentaklorpseudilin [3].

Selanjutnya dari subkoning Cosmid

pIWcos10 dengan enzim restriksi SacI,

proses hibridisasi dengan gen halogenase

dan studi homologi dengan data Gene

Bank dapat diidentifikasi 13 gen yang

terlibat dalam Pentaklorpseudilin biosyn-

thesis gene cluster, salah satunya adalah

Gen pcpB [4]. Protein PcpB yang diduga

bagian dari domain Non Ribosomal Peptide

Synthetase (NRPS) yang terlibat dalam

pembentukan pyrroyl-2-carboxy-S-PCP te-

lah diexpresikan dan dimurnikan [5]. Untuk

prediksi fungsi protein tersebut bisa

dilakukan antara lain bila diketahui struktur

proteinnya. Untuk memprediksi struktur

protein dapat dilakukan dengan metode

homology modelling. Metode ini membutuh-

kan program khusus dan urutan serta

database struktur yang up-to-date.

SWISS-MODEL adalah salah satu

program untuk memprediksi struktur protein

berdasarkan homology modeling [6].

Pembuatan model struktur berdasarkan

homology modeling dilakukan dengan

membandingkan sekuen homolog antara

protein target dengan protein lain yang

sudah diketahui struktur tiga dimensinya

untuk dijadikan sebagai induk atau

template. Dalam hal ini diperlukan

kesamaan sekuen antara protein target

dengan protein template yang lebih besar

dari 30% agar menghasilkan model yang

baik. Data base struktur template yang

digunakan oleh SWISS-MODELL diturun-

kan dari Bank Data Protein.

Membangun Model homologi terdiri

dari empat langkah utama, yaitu: (1)

identifikasi struktur template, (2) alignment

urutan target dan struktur template, (3)

pembentukan model, dan (4) evaluasi

kualitas Model. Keempat langkah ini dapat

diulang sampai dicapai hasil pemodelan

memadai. Masing-masing dari empat

langkah memerlukan perangkat lunak

khusus serta akses ke urutan protein dan

database struktur yang up-to-date [6].

METODE PENELITIAN

Isolasi, Sub Kloning, Sekuensing pcpB

Gen pcpB diisolasi dari pIwCos10

dengan metode PCR yang menggunakan

primer PcpB_for2 dan PcpB_rev [5].Hasil

PCR dipotong dari gel dan diekstraksi

dengan GeneJET Gel Extraction Kit dari

Fermentas kemudian dipotong dengan

enzim NcoI/EcoRI. Fragment NcoI/EcoRI

hasil PCR diligasi ke dalam vector ekspresi

pMAL-c5X menghasilkan palsmid pSM-

pcpB. Selanjutnya plasmid pSM-PMpcpB

ISBN :978-602-73159-0-7

ditransformasikan ke dalam E. coli TG1 dan

discreening. Plasmid pSM-PMpcpB yang

telah diisolasi dengan GeneJET plasmid

miniprep kit dikirim ke MWG untuk

disekuensing gen pcpB yang dikandungnya

[5].

Ekspresi dan Purifikasi Protein PcpB

Plasmid pSM-PMpcpB yang

mengandung gen pcpB diekspresikan

dalam E. coli Rossetta 2 (DE3) pLysS

dengan menggunakan medium LB yang

mengandung antibiotik Ampicillin dan

chloramphenicol. Kondisi optimum ekspresi

dicari dengan memvariasi bufer dan pH

ekstraksi, konsentrasi IPTG untuk induksi,

temperatur dan waktu inkubasi. Purifikasi

dilakukan dengan metode amylose affinity

chromatography dengan menggunakan

bufer kromatografi dan bufer elusi seperti

yang disarankan [7].

Prediksi Model Protein PcpB

Prediksi model protein PcpB

dilakukan dengan program SWISS-MODEL

bedasarkan homology modeling [6,8].

HASIL DAN PEMBAHASAN

Gen pcpB yang diisolasi dari plasmid

pIwCos10 dengan metode PCR berukuran

1507 pb dengan start codon GAC. Insersi

gen tersebut kedalam vektor pMAL-c5X

membentuk plasmid pSM-PMpcpB yang

berukuran 7258 pb. Hasil sekuensing pcpB

dapat dilhat dalam Gambar 1.

Gen pcpB dalam plasmid pSM-

PMpcpB berhasil diekspresikan dalam E.

coli Rossetta 2 (DE3) pLysS dalam keadan

larut. Untuk keperluan purifikasi ekspresi

dilakukan dalam medium LB yang

mengandung 0,02% glukosa, antibiotik

Ampicilin dan Chloramphenicol dan

diinduksi dengan 0,6 mM IPTG setelah

kultur diinkubasi pada 37oC selama 3 jam

Gambar 1. Urutan DNA gen pcpB. Urutan

tidak bergarisbawah adalah primer PCR.

ISBN :978-602-73159-0-7

(OD600 sekitar 0,6). Inkubasi kemudian

dilanjutkan pada 30oC selama semalam

(16-20 jam). Ekstraksi protein PcpB

berhasil dilakukan dengan menggunakan

buffer Kalium fosfat 0,1 M pH 7,2. Secara

teoritis PcpB mempunyai pI 5,8 sehingga

tidak digunakan buffer pH sekitar 5,8

karena secara teoritis PcpB akan

mengendap bila dilarutkan dalam buffer

pada pH sama dengan pI nya. Oleh karena

itu untuk mengekstraksi PcpB dipilih buffer

dengan pH 7,2.

Hasil SDS PAGE ekspresi protein

PcpB di dalam E. coli Rossetta 2 (DE3)

pLysS berukuran 96 kDa. Ukuran ini

merupakan ukuran fusi protein PcpB

dengan MalE. MalE tersusun dari 487

asam amino mempunyai ukuran 42,481

KDa. Dengan program Expacy PcpB

diketahui berukuran 53,759 KDa dengan

pH isoelektrik (pI) sebesar 5,80 sedangkan

Mal E mempunyai pI sebesar 5,08. Oleh

karena protein hasil ekspresi berfusi

dengan MalE, maka ukuran ekspresi PcpB

sebesar 96,240 KDa dan ukuran ini sesuai

dengan yang terlihat dalam SDS PAGE.

Vektor pMAL-c5X menyediakan

metode untuk mengekspresikan dan

memurnikan protein yang dihasilkan dari

kloning gen. Gen PcpB yang disisipkan

pada hilir dari gen malE dari E. coli, yang

mengkode maltosa-binding protein (MBP),

sehingga di dalam ekspresinya akan

menghasilkan fusi MalE-PcpB. MBP di

dalam vektor pMAL-c5X ini telah

direkayasa untuk dapat mengikat amilosa

dengan lebih kuat. Vektor ini menggunakan

promotor “tac” dan sinyal inisiasi translasi

malE untuk memberikan ekspresi tingkat

tinggi dari kloning. Purifikasi dapat

dilakukan dengan satu langkah

menggunakan afinitas kromatografy

dengan resin amilosa. MalE-PcpB yang

terikat pada resin amilosa kemudian dielusi

oleh 10 mM maltosa dalam bufer

kromatografi (20mM Tris-Cl, 0,2 M NaCl,

dan 1 mM EDTA).

SWISS-MODEL workspace diguna-

kan untuk memprediksi model protein

PcpB. Dengan menggunakan cetakan

model NRPS adenylation proteine CytC1,

nama cetakan 3vnq.1.A (/templates/3e7x.1)

diperoleh model-template alignment dalam

gambar 2A dan model proteinnya dalam

gambar 2B Sedangkan bila menggunakan

cetakan model Non-ribosomal peptide

synthetase, nama cetakan 4gr5.1.A

(/templates/4gr5.1) diperoleh model-

template alignment dalam gambar 3A dan

model proteinnya dalam gambar 3B. Kedua

model cetakan ini diambil karena dari

alignment cetakan terpilih mempunyai nilai

kesamaan sekuen terhadap protein PcpB

terbesar yaitu 37,23 % untuk model NRPS

adenylation proteine CytC1 dan 35,90 %

untuk model Non-ribosomal peptide

synthetase (NRPS). Nilai ini memenuhi

untuk menghasilkan model yang baik

karena lebih besar dari 30%.

Dari kedua model cetakan yang

dilpilih dan yang mempunyai kesamaan

sekuen yang terbesar menunjukkan bahwa

PcpB merupakan protein potensial yang

mengkatalisis proses adenilasi dari

kompleks enzim NRPS. Ini berdasarkan

ISBN :978-602-73159-0-7

Gambar 2. (A) Model-template alignment dari

PcpB terhadap cetakan model NRPS

adenylation proteine CytC1 (3vnq.1.A) dan (B)

model struktur proteinnya.

Gambar 3. (A) Model-template alignment dari

PcpB terhadap cetakan model NRPS (4gr5.1.A)

dan (B) model struktur protein-nya.

hasil analisis homologi dengan data GenBank

menggunakan program Basic Local Alignment

Search Tool(BLAST)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)

menunjukkan bahwa urutan asam amino PcpB

mempunyai homologi tinggi dengan L-prolyl-

AMP ligase dari S. rishiriensis (CouN4, 56%

identity), S. roseochromogenes (CloN4, 56%

identity), P. fluorescens Pf-5 (PltF, 49%

identity), Streptomyces

coelicolor A3(2)(RedM, 41% identity), Nocardia

sp. CS682 (NgnN4, 58% identity), dan protein

proline adenilasi dari Sorangium cellulosum

(Leu5, 37% identity). Berdasarkan data

homolologi tersebut, maka grup kami

mengusulkan bahwa PcpB merupakan

merupakan superfamily enzim pembentuk

adenilat (AMP ligase) yang mengubah prolin

dengan adanya ATP menjadi intermediet aktif

AMP-prolin melaui reaksi adenilasi [9-15].

KESIMPULAN

Model struktur protein PcpB sudah

dilakukan dengan program SWISS-MODEL

A

B

A

B

ISBN :978-602-73159-0-7

dengan menggunakan cetakan model NRPS

adenylation proteine CytC1 (3vnq.1.A) dan Non-

ribosomal peptide synthetase (4gr5.1.A) yang

masing-masing mempunyai kesamaan sekuen

sebesar 37,23% dan 35,90 %. Berdasarkan

model struktur di atas dan hasil analisis

homologi dapat diusulkan bahwa PcpB

merupkan AMP ligase bagian dari NRPS yang

mengkatalisis melalui reaksi adenilasi untuk

mengubah prolin menjadi intermediet aktif AMP-

prolin.

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terima kasih disampaikan kepada

Direktur DP2M Dikti yang telah memberikan

dana penelitian melalui Hibah Kompetensi TA

2014 – 2015.

DAFTAR RUJUKAN

[1] Cavalleri, B., Volpe, G., Tuan, G. Berti, M.,

Parenti., F., 1978, Curr. Microbiol. 1, 319-

324

[2] Wynands.I., 2007, Detektion und Uber-

expression von Genen FADH2- abhängiger

Halogenasen aus Actinoplanes sp. ATCC

33002Dissertation, Technische Universität

Dresden, Dresden.

[3] Wynands I., van Pee, K-H., 2004. FEMS

Microbiol Lett, 237, 363-367.

[4] Mann, K., 2005,Molekulargenetische

Untersuchungen zur Biosynthese des

Antibiotikums Pentachlorpseudilin.

Dissertation, Technische Universität

Dresden, Dresden.

[5] Mulyani, S., Dirgahayu, P., Weichold, V., and

van Pee, K.-H., 2014. “Expression and

Purification of 3 genes of the

pentachlorpseudilin biosynthetic gene

cluster homologous to NRPS domains

involved in formation of pyrroyl-2-carboxyl-

S-PCP”, Disampaikan dalam 7th

International Seminar Indonesian Society

For Microbiology (ISISM 2014) “Microbil

Use for Human Welfare”, Padang, 13-18

Oktober, 2014.

[6] Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J., and

Schwede, T., 2006, Bioinformatics, 22,

195-201.

[7] New England Biolabs, 2014, pMAL Protein

Fusion & Purification System, Instruction

Manual, ed. Online: www.neb.com., diakses

16 Juni 2014.

[8] Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P.,

Battey, J., and Schwede, T., 2009,

NatProtoc., 4, 1-13.

[9] Kopp, M., Irschik, H., Gemperlein, K., Buntin,

K., Meise, P., Weisssman, K.J., Bode, H.B.,

and Muller, R., 2011, Mol BioSyst, 7:1549-

1563.

[10] Maharjan, S., Aryal, N., Bhattaral, S., Koju,

D., Lamchhane, J., and Sohng, J.K.,

2012, Appl Microbiol Biotechnol, 93:687-

696

[11] Nowak-Thompson, B., Chaney, N., Wing,

J.S., Gould, S.J., and Loper, J.E., 1999, J

Bacteriol181:2166-74.

[12] Pojer, F., Li, S.M., and Heide, L., 2002,

Microbiology,148, 3901-3911.

[13] Thomas, M.G., Burkart, M.D., and Walsh,

C.T., 2002, Chem Biol 9:171-184.

[14] Wang, Z.X., Li, S.M., and Heide, L., 2000,

Antimicrob Agents Chemother,44:3040-

3048.

[15] Xu, H., Wang, Z-X., Schmidt, J., Heide, L.,

and Li, S-M., 2002, Mol Genet Genomics,

268,387-396.