Immunoanal Biol Sp#c (1990) 22, 41-52 41 © Elsevier, Paris

Aspects biochimiques et methodologiques

Problemes particuliers poses par I'immunodosage des sterofdes

J Fiet 1, H Galons 2, JM Villette 1 , P Boudou 1 , J Guechot 3, B Gueux 1, B Gourmel 5, R Julien 1 , JL Brerault 1 , P Vexiau 4, C Dreux 5

1 Laboratoire de biologie hormonale, h6pital Saint-Louis, 1, avenue Claude-Vellefaux, 75010 Paris; 2 Laboratoire de chimie organique, Facult# de pharmacie, 4, avenue de I'Observatoire, 75006 Paris;

3 Laboratoire de biochimie (Dr J Giboudeau), hSpital Saint-Antoine 184, rue du Faubourg Saint-Antoine, 75012 Paris; 4 Service d'endocrinologie (Pr G Cathelineau), hSpital Saint-Louis, 1, avenue Claude-Vellefaux, 75010 Paris; 5 Laboratoire de biochimie et de

neuroendocrinologie, hSpital Saint-Louis, 1, avenue Claude- Vellefaux, 75010 Paris, France

Introduction

L'exploration du m~tabolisme des st~ro'ides a grandement b6n6fici6, depuis les ann6es 70, du d6veloppement des dosages radioimmunolo- giques.

Cependant, le dosage des st~ro'fdes dans les milieux biologiques, malgr6 tes simplifications apparentes dues & I'introduction de traceurs iod6s puis de traceurs non isotopiques, reste un dosage d~licat, aux sources d'erreurs nom- breuses. L'immunodosage des st6roTdes pr~sen- t e e n effet des difficult6s particuti~res qui sont li~es aux caract6ristiques physicochimiques de ces molecules et & leur m~tabolisme.

Les st~ro'fdes sont des molecules de faible poids mol6culaire (PM) (250 & 350 D en moyen- ne). Les m6thodes d'immunoanalyse qu'on peut leur appliquer sont, par consequent, bas~es sur I'immunocomp6tition, les m6thodes dites sandwich immunoradiom~triques et immunoenzy- mom6triques 6tant exclues.

Les st~ro'/des existent dans le plasma sous forme est6rifi~e (sulfates et glucuronides, hydro- solubles, et esters d'acide gras & plus ou moins Iongue chafne) et sous forme non est6rifi6e. Les formes non est~rifi~es, auxquelles on s'int6resse essentiellement, sont v~hicul~es dans le plasma fix~es sur des prot~ines de transport, les formes libres, <<actives,,, 6tant tr~s minoritaires. De caract~re lipophile, ces st~ro'(des devront donc ~tre soit extraits du plasma par des solvants organiques avant immunodosage, soit lib~r~s des prot~ines de transport par divers r~actifs chi-

miques, en particulier dans les m6thodes dites directes.

Les concentrations de ces st6roTdes dans le plasma sont tr~s faibles, bien en dessous de la nmole/I pour certaines, d'oQ la n~cessit~ d'utiliser au cours de leur dosage des immuns6rums de haute affinit&

Les structures chimiques des st6ro'fdes 6tant tr~s voisines, il sera difficile d'obtenir des immun- serums antist6ro'ides parfaitement sp~cifiques du seul st~roTde qu'on souhaite doser.

En effet, alors que les immuns6rums antiste- rofdes permettent de distinguer ais6ment chaque classe principale des st6ro'~'des, tels que les androg~nes, les oestrog~nes, les glucocorticoTdes et les min6ralocortico'fdes, la discrimination des structures & I'int~rieur de chacune de ces classes est moins aisle. Les diff6rences de structure entre les st6roTdes d'une m6me ctasse sont, en effet, g6n6ralement limit6es & la presence ou & I'absence d'une double liaison, d'un hydroxyle, ou & la substitution d'une fonction c6tone par une fonction hydroxyle. En outre, les m6tabolites des st6ro'ides circulant dans le plasma ou 61imines dans les urines sont ti'~s nombreux et de struc- tures voisines, ce qui oblige & beaucoup de vigi- lance dans le contrSle de la specificitY, donc de t'exactitude des dosages effectu~s.

Contrairement & ce qu'on aurait pu attendre, I'av~nement des anticorps monoclonaux dans le domaine particulier du dosage des st~roTdes n'a pas permis de r6soudre jusqu'& maintenant ces probl~mes de sp6cificit& II est, en effet, tr~s diffi- cile d'obtenir des anticorps monoclonaux pr~sen-

42 J Fiet et al

tant simultanement la specificit~ souhaitee et une affinite suffisamment elev~e, n~cessaire pour mesurer les st~ro'ides avec suffisamment de sen- sibilit& Donc b, de rares exceptions pros, les immuns~rums utilises en immunoanalyse des st~rofdes sont des anticorps polyclonaux.

Problemes poses par la preparation d'anti- corps sp(~cifiques

Difficult#s li#es D la nature hapt#nique

Les stero'ides, ~tant de faible poids mol6culaire, ne sont pas directement immunogenes. La pr6pa- ration d'anticorps antist~roTdes n~cessite de rendre ces petites molecules immunog~nes par couplage pr~alable & une molecule de haut poids mol~culaire et immunog~ne (carrier), telie que I'albumine bovine, la thyroglobuline animale ou I'h6mocyanine.

Le couplage s'effectue en 2 temps : - 1 er temps : greffe d'un <<bras>>i d'un appendice sur le noyau des steroYdes. Ce bras aura la parti- cularit~ de se terminer par un groupement car- boxyle-COOH; - 2 e temps : couplage proprement dit du st~ro'fde ainsi modifie sur le carrier, par la methode d'Erlanger [5] ou par la m6thode des carbodi- imides.

Le couplage va consister, au point de vue chi- mique, en la creation de liaisons amides entre le carboxyle libre du st6rofde modifi6 et les fonc- tions amines s des lysines du carrier selon la figu- re 1.

Ainsi par exemple, jusqu'& 40 mol de st#- rofdes pourront ~tre greff~es d'une fagon cova- lente sur 1 mole d'albumine bovine, et c'est ce

conjugu~ immunogene qui sera inject~ ~. I'animal dans le but d'obtenir des anticorps antist6ro'fdes [12].

Le bras qu'on greffe au cours du ler temps de couplage est constitue le plus souvent soit par une chafne aminoxyac~tique introduite & la place d'un groupement CQ du squelette du st~ro'ide for- mant ainsi une (0 carboxym~thyl) oxime, soit par une chafne h~misuccinate form~e par est~rifica- tion d'un groupement -OH du st~rofde par I'anhy- dride succinique. Cependant, d'autres bras de liaison ont ~t~ utilis#s : chlorocarbonate, glucuro- nide, carboxym~thyl ether, etc (liste non exhausti- ve) [2, 8].

Les immuns~rums obtenus seront simultan~- ment anti- carrier, antibras et antist6ro'fde, cepen- dant tout I'ensemble du squelette du st~rofde et de ses groupements fonctionnels ne sera pas <<vu>> avec la m~me acuit6 par I'immuns~rum anti- st~rofde.

Si I'on prend I'exemple de la figure 1 or3 le st~- ro'ide repr~sent~ est la molecule de cortisol avec un bras de liaison greff~ en position 3 sur le noyau A, le noyau D avec sa chafne lat6rale - COCH2OH et son OH en 17 et le noyau C et son -OH en11 seront mieux <<vus,, par I'anticorps anticortisol que le noyau A et le voisinage imm~- diat de I'atome de carbone n ° 3 eL est attach6 ce bras de liaison, ce qui signifie que cet anticorps (dans I'exemple de la figure 1) sera capable de discriminer tout st6roYde diff6rant du cortisol au niveau des noyaux D et C mais sera <<aveugle>, vis-&-vis de st6ro'ides differant du cortisol par des modifications au niveau du noyau A.

La sp~cificit~ des anticorps antist6ro'ides est donc li~e directement & la structure de I'immuno- g~ne inject6 & I'animal et & la position de greffage du bras de liaison sur le noyau du st~roYde.

H20H _St6 ~ O

[ transporteur A CHi \ CH$ CH. ~NH, / ]~ CH/~.20 - ~ N - ~ 4 " - ~ ' ~ oo-;c. s, , / " \ / / l _ _ i I i l I

r j- ~ chaine lat•rale d'une bras de liaison steroide lysine

s, , 's , , I 1 haptene

Fig 1. Structure d'un immunog~ne : cortisol 3 (O-carboxym~thyloxime) albumine bovine.

Immunoanalyse des st~rofdes 43

Difficult~s li~es a des similitudes de structures

La discrimination des st~roi"des au sein de chaque classe des st6ro'fdes est difficile par suite des analogies de structure.

Ainsi, nous soulignerons les analogies de struc- ture suivantes plus ou moins difficiles & discrimi- ner selon la position de couplage choisie : -dans la ciasse des androg~nes : testosterone et dihydrotestost~rone (DHT) qui ne different que par la presence dans la testost6rone et I'absence dans la DHT d'une double liaison 4-5, de m~me pour la AD4 androst~nedione et I'androstanedio- ne; - d a n s la classe des cortico'fdes : cortisol et 11- d~soxycortisol (compos~ S) qui ne different que par la presence dans le cortisol et l'absence dans le 11-d~soxycortisol d'un hydroxyle en position 11; - dans la classe des progestag~nes : la progeste- rone et la pr~gn~nolone qui pr~sentent la m~me chaine lat~rale -COCH 3 en C17, mais la proges- terone a une fonction CO en 3 et une double liai- son 4-5 alors que la pregn~nolone a un -OH en 3j5 et une double liaison 5-6. Nous avons choisi ce dernier exemple pour illustrer I'importance du choix de la position de couplage du bras de liai-

son sur le noyau du st~roi'de pour obtenir des anticorps antist~ro'ides, antiprogest~rone sp6ci- fiques (fig 2).

La preparation des anticorps antiprogest(~rone a ~volu~ au fil des ann~es par I'utilisation succes- sive d'immunog~nes dans lesquels la progestero- ne ~tait unie a. I'albumine bovine (BSA) d'abord au niveau de fonctions existantes, sur la fonction c6tone en 20 (les anticorps obtenus croisent ,~ 100% avec le cortisol), puis sur la fonction c~tone en 3 avec formation d'une fonction oxime par condensation de la fonction CO avec le NH 2 de I'acide aminoxyac~tique (progesterone 3 CMO/BSA), puis au niveau de fonctions cr6~es, rajout~es sur le squelette cyclopentanoperhydro- ph6nanthr6nique de la progest6rone : au niveau du C6 (progesterone 6,6-ol-h~misuccinate BSA), au niveau du C l l (progesterone 11a-ol-h~misuc- cinate/BSA), au niveau du carbone C12 (fig 2).

II en r~sulte une sp~cificit6 (exprim~e en taux de r~action crois~e RC selon Abraham [1] qui, vis-&-vis de la pr6gn~nolone, est comprise entre 15 et 0,3%, illustrant I'importance de ta position de greffage du bras de liaison sur le noyau du st~ro'fde. En effet, Iorsqu'il s'agit de distinguer la pr6gn~nolone de la progesterone, il est plus effi- cace de greffer le bras de liaison en une position

CH~

B S A . C M O ~ O

Progest drone-3-CMO-BSA

CH3

O-H6mlsucclnyI-BSA

Progest6rone-6-H6mlsucclnyI-BSA

OH3

Prdgndnolone

CH 3

15 %

CH~

H e m l s u c c ~ 0

O" v v

Progest6rone-11-H6mlsuccinyl-BSA

0,3 ~.

~- 1% ~ 2% ~ 30 ~ 50%

11-a -OH-Progest6rone

Fig 2. Influence de la position de couplage de I'albumine bovine (BSA) & la progesterone sur la sp~cificit~ d'immuns6rum antiproges- t~rone vis-a-vis de la pr~gn~nolone et de la 11-o~-OH progesterone.

44 J Fiet et al

Tableau I. Positions de couplage les plus favorables pour obtenir les anticorps antist~ro'ides les plus specifiques.

Anticorps Position du bras

AndrogLmes Antitestost~rone Positions 19 et 15 Anti-A4-androst~nedione Position 6 Anti-DHT Position 1 Anti-DHA Position 7

Q~strogenes Anti-aestradiol Positions 6 et 7 Anti-oestrone Position 6 Anti-oestriol Position 6

Progestagenes Antiprogest~rone Positions 11 et 12 Anti-17-OH-progest~rone Position 3

Corticdfdes Anticortisol Positions 3 et 6 Anti- 11 -d6soxycortisol Positions 3 et 6

Min~ralocortico]'des Antid~soxycorticost~rone Anticorticost~rone Anti-aldost~rone

Position 3 Position 3 Position 3

eloignee du carbone 3 et des carbones 5-6 et 4-5 o5 se situent respectivement la double liaison de la progesterone et celle de la pr~gn~nolone (bien entendu, les anticorps antiprogesterone 11-h~mi- succinate/BSA croisent & des taux #levis avec la 11-ot-hydroxyprogest~rone, ce qui n'est pas g6nant car ce dernier st~ro'i'de n'est pas pr#sent en concentrations elevees dans ie plasma (fig 2)).

De tres nombreuses publications ont trait aux sp~cificites des anticorps antist~ro'i'des en .relation avec la structure des immunog~nes et, actuelle- ment, I'exp#rience a montr~ quelles ~taient les positions de couplage les plus favorables pour obtenir les anticorps antistero'~'des les plus sp~ci- fiques (tableau I).

Probl#mes li#s a la structure tridimensionnelle de I'immunog#ne (st#roide + bras de liaison + carrier)

Pour une m#me position de couplage, la nature du bras, ~ventuellement sa ster~ochimie [9], peu- vent influencer la sp~cificit~ des anticorps antist~- ro)'des. Cette influence peut s'exercer & plusieurs niveaux : - la fonctionnalisation d'un carbone du st~ro'(de est susceptible de modifier assez profond#ment la conformation du noyau t~tracyclique [4] et ainsi, la g~om~trie d'un st~ro'i'de dans I'antig~ne peut tout & fait ressembler a celle d'un st~rdide

autre que celui couple, induisant par consequent des reactions crois~es; - la structure du bras de liaison peut d~terminer I'orientation du st6roi'de par rapport au carrier. Une seule des faces du stero'fde est probable- ment g~n6ralement discernable, I'autre face ~tant coll6e 9. la proteine carrier, du fait d'interactions entre les fonctions de la prot~ine et celles du st~- ro)'de [10]. En consequence, les fonctions du st6- rofde situ~es sur la face coll ie & la prot~ine seront mal reconnues.

Bien qu'il existe g~n~ralement un consensus concernant la position de couplage & choisir en fonction des sp6cificit~s souhait#es, pour un m~me immunog~ne inject6 (m~me st~ro'fde, m~me bras de liaison, m~me position de coupla- ge et m~me carrier), les sp~cificit6s obtenues peuvent diff~rer grandement, comme le montrent de nombreuses publications.

En effet, alors que I'on ma?trise la synth~se chi- mique des hapt~nes (st#roi"des + bras de liaison), il n'en est pas de m~me du couplage de I'hapt~ne sur le carrier. II est concevable que la position du st~ro'ide par rapport au carrier pour un re#me immunog~ne varie d'un couplage & I'autre, d'o~ une presentation diff~rente des faces du st#rdfde aux cellules immunocomp~tentes au cours de I'immunisation des animaux.

Ainsi, I'absence de la maftrise de toute la struc- ture spatiale tridimensionnelle de I'immunog~ne ainsi que les r~ponses individuelles et variables

• des animaux immunis~s peuvent expliquer une certaine variabilit~ de la sp~cificit~ des anticorps antist~ro'ides obtenus avec les m~mes immuno- g~nes.

P r o b l e m e s l ids b la d e t e r m i n a t i o n d e la s p e c i -

f i c i t e

La sp~cificit~ de I'immunodosage d'un st~ro'ide dans les milieux biologiques (plasma, urines, sali- ve, LCR) va d~pendre : - de la sp~cificit~ des immuns6rums antist6- ro'ides mis en oeuvre; - des concentrations relatives dans les milieux biologiques d'une part des st~ro)'des & doser (A), d'autre part des st6ro'/des de structure voisine (X) qui -croisent- avec I'immuns~rum antist~ro'ide anti-A (interferences immunologiques), mais ~ga- lement de la pr6sence de substances de structu- re non stero'idienne qui d~placent non sp~cifique- ment le traceur au cours de la r6action d'immunocomp6tition (interference non sp#ci- fique); - des proc~d~s de purification utilis~s permettant de s~parer le st~ro'/de &doser A des autres st~- ro'fdes X croisant avec I'immuns6rum anti-A (cf

Immunoanalyse des st~rofdes 45

Validation et suivi quotidien des techniques de dosage des stero'ides).

Seuls les 2 premiers paragraphes seront envi- sages dans ce chapitre.

Etude de la sp#cificit6 des immuns#rums antist#- roides

La specificite d'un immunserum antisteroide A est determinee classiquement par la mesure des taux de reaction croisee (RC) de I'immunserum anti-A avec differents stero'fdes X, de structure voisine de A.

Le taux de RC est mesure habituellement pour un deplacement du traceur (stero'fde marque, A*) de 50% (RC 50) (fig 3) [1].

Chaque antiserum antisteroi'de A est caracteri- se par un ensemble de RC contre un nombre plus ou moins grand de stero'/des X, les stero'fdes X ayant les taux de RC les plus faibles etant ceux qui sont les moins reconnus par I'anticorps anti-A et inversement.

Le taux de RC d'un steroi'de X represente theo- riquement I'interference du steroTde X au cours de t'immunodosage de A. Ainsi par exemple, si la RC = 10%, I'interference de X dans le dosage de A sera egale & 10% de la masse de X present. En fait, cette interpretation ne sera exacte, que si la courbe de deplacement de X est parall~le & celle de A (fig 3), ce qui n'est pas souvent le cas, les courbes de deplacement des stereTdes qui

interferent etant generalement plus aplaties sur I'axe des concentrations, ce qui entraine des interferences relativement plus importantes pour les concentrations faibles de X (RC 80% > RC 50% > RC 20%) (fig 3). La mesure des taux de RC 50 permet surtout de comparer les anticorps entre eux mais ne donne pas une assurance absolue de la specificite de I'immunserum, car les steroi'des circulant dans le plasma sont en tres grand nombre et generalement, pour des raisons pratiques, on se limite & la determination des reactions croisees de certains d'entre eux seule- ment; d'une part, ceux qui ont la plus grande pro- babilite de croiser compte tenu de la structure de I'immunogene injecte & I'animal et, d'autre part, ceux dont les concentrations previsibles par rap- port & A dans les liquides biologiques sont les plus elevees.

Le nombre de RC etudiees ne pouvant donc ~tre exhaustif, on prend le risque d'une erreur, due & la presence inopinee dans le milieu de dosage de steroi'des rarement presents et dont on n'a pas determine les taux de RC.

La sp6cificit6 de I'immunodosage d'un st~ro'lde A d6pend des concentrations relatives du st6ro'fde

doser A et de celles des st~ro'fdes de structure voisine croisant avec I'anticorps anti-A

II est &noter que les concentrations relatives des steroi'des peuvent varier dans des proportions

~ o

100

80"

50

20 ̧

RF 80 "~ = - - - -

RC 50 % =

RC 20 % = - - A X

X

. . . . . . I ~ I I I I

50 120 160 350

50 x I00 160 = 51,2 %

120 x 100 - - - 10 %

1200

550 x i00 6700 - 5,2 %

I I I

1200 6700 pq/t~e

Fig 3. Mesure des taux de r~action crois~e (RC) d'un immuns~rum antist~ro'fde A vis-&-vis d'un st6ro'fde X pour diff~rents d6place- ments du traceur**.

46 J Fiet et al

tr~s importantes en fonction de la situation phy- siologique (&ge, sexe, cycle ovarien, grossesse), pathologique (deficits enzymatiques) ou Iors de tests dynamiques d'exploration et en fonction du traitement. Nous prendrons quelques exemples pour illustrer ces considerations. ler exemple : sp#cificit6 du dosage de la testo- sterone. La majorite des immunserums antites- tosterone croise & plus de 20% avec la dihydro- testosterone (DHT).

a) Chez I'homme adulte (non traite par la DHT), les concentrations de DHT dans le plasma ne representant que 5 & 10% des concentrations de testost#rone, le dosage immunologique de la tes- tosterone du plasma ne necessite donc pas la separation prealable de la DHT de la testostero- ne. II n'en est pas de m~me chez la femme chez laquelle les concentrations de DHT repr~sentent environ 50% des concentrations de testosterone. Pour obtenir un resultat exact des concentrations de testosterone chez la femme, il sera donc indis- pensable de separer la DHT de la testosterone (chromatographie) avant de realiser la reaction d'immunocompetition.

b) Nous avons obtenu dans notre laboratoire un immunserum antitestosterone qui croise seule- merit & 2% avec la DHT, ce qui nous a laisse esperer pendant quelque temps la realisation possible avec notre anticorps de dosages exacts de la testosterone chez la femme, sans separa- tion chromatographique prealable de la testoste- rone de la DHT. Or, les concentrations de testo- sterone obtenues darts ces conditions etaient frequemment superieures & celles obtenues par une technique specifique mettant en oeuvre une phase prealable de separation de la testosterone par chromatographie.

L'immunserum antitestosterone avait ete obte- nu par immunisation par la 11-(z-OH-testosterone hemisuccinate/BSA. Cet immunserum presentait en fait des taux de reactions croisees elev#es (non mesures initialement) avec les derives 11- hydroxyles de la testosterone, derives presents en concentrations elevees darts le plasma au cours de certains hirsutismes. Un dosage exact de la testosterone chez la femme avec cet antise- rum ne pouvait donc etre realise qu'apr~s separa- tion par chromatographie de la testosterone de ses derives 11-hydroxyles plus polaires. 2 e exemple : specificit6 du dosage du corti- sol La plupart des meilleurs immunserums anti- cortisol ont des taux de reaction croisee vis-&-vis du 11-desoxycortisol (compose S) de I'ordre de 3 & 5% et vis-&-vis de la 17-OH progesterone de I'ordre de 1%, ce qui permet de doser le cortisol plasmatique de base dans la plupart des situa- tions physiologiques.

a) Cependant, ces taux de reaction croisee sont encore trop eleves quand il s'agit de doser le cor- tisol au cours du test & la metopirone, un medica- ment qui, en inhibant la 11-hydroxylase, abaisse la cortisolemie & moins de 10% de sa valeur ini- tiale, ce qui entrafne simultanement chez le sujet normal une augmentation considerable des concentrations plasmatiques du 11-desoxycortisol (concentrations multipliees normalement par 100 & 200) et de celles de la 17-OH progesterone (concentrations multipliees par 10).

Le dosage exact de la cortisolemie par immu- noanalyse au cours du test ,~ la metopirone ne pourra donc etre obtenu qu'apres purification du plasma, c'est-&-dire separation du cortisol de ses precurseurs, 11-desoxycortisol et 17-OH proges- terone.

b) Au cours de certains hirsutismes dus & un deficit en 21-hydroxylase, les concentrations de 17-OH progesterone et de 21 -desoxycortisol, precurseurs du cortisol, que I'on trouve alors habituellement elevees dans le plasma, majorent les concentrations de la cortisolemie si celle-ci a ete dosee sans phase de purification prealable, et cela d'autant plus que les concentrations de la cortisolemie diminuent dans cette situation patho- Iogique.

D'une maniere generale, les dosages de st~- roYdes plasmatiques au cours des deficits enzy- matiques des surrenales exigent, selon nous, une etape de separation chromatographique prea- lable, la plus resolutive possible, des differents stero'fdes, avant I'etape d'immunoanalyse propre- ment dite.

Nous noterons cependant qu'au cours de ces deficits enzymatiques la phase de chromatogra- phie prealable aux immunodosages n'apporte pas une garantie absolue de la specificite des dosages. En effet, plusieurs stero'fdes de polari- tes voisines apres chromatographie peuvent se retrouver isoles dans la m~me fraction chromato- graphique. Nous citerons & titre d'exemple les concentrations faussement elevees de 11- desoxycortisol, trouvees par immunodosage, au cours des deficits en 21-hydroxylase, concentra- tions orientant & tort vers un diagnostic de d~ficit en 11-hydroxylase. Cette erreur s'explique par I'utilisation d'un immunserum anti-11-desoxycorti- sol insuffisamment specifique vis-&-vis du 21- desoxycortisol, stero'fde dont les concentrations augmentent considerablement darts les deficits en 21-hydroxylase et qui, de polarite voisine de celle du 11-desoxycortisol, se retrouve dans la m~me fraction chromatographique (Iors de I'utili- sation des supports chromatographiques habi- tuels, c~lite ou LH 20) [7].

c) Citons egalement I'exemple des concentra- tions faussement elev~es de cortisolemie obte-

Immunoanalyse des st6ro'ides 47

hues apres dosage direct (sans chromatographie) chez des malades traites par ta prednisolone ou la prednisone, cortico'fdes de synthese croisant habituellement & plus de 30% avec la plupart des immunserums anticortisol.

d) Citons enfin I'exemple du dosage du cortisol urinaire dont les resultats peuvent varier chez le sujet normal du simple au triple, voire plus dans les hypercorticismes, selon les methodes ou I'absence de methodes de purification utilisees. L& encore, meme I'utilisation des immunserums anticortisol les plus specifiques ne garantit pas I'exactitude des resultats trouv6s. Seule une puri- fication prealable (Sephadex LH 20, celite, CLHP) & I'immunodosage, rendant possible la separation du cortisol de ces nombreux precurseurs et meta- bolites presents dans I'urine, permettra d'appro- cher la concentration exacte du cortisol urinaire. 3 e exemple : sp#cificit6 du dosage de la proges- t6rone. Les immunserums antiprogesterone les plus specifiques sont obtenus par injection & I'ani- mal de progesterone couplee en position 11 ou 12 & I'albumine bovine. Ces immunserums anti- progesterone presentent des taux de reaction croisee (RC) tres faibles (RC < 0,1%) vis-&-vis de la 17-OH progesterone et de la 17-OH pregneno- lone, faibles (RC < 1%) vis-&-vis de la pregneno- lone (stero'fde dont les concentrations plasma- tiques ne sont pas negligeables par rapport & celles de la progesterone, en particulier pendant la phase luteale). Par consequent, ils permettent generalement le dosage exact, chez la femme non traitee, de la progesterone du plasma sans purification chromatographique prealable & I'immunodosage proprement dit.

En revanche, chez la femme traitee par la pro- gesterone micronisee par voie orale, rimmunoa- nalyse de la progesterone r~alisee sans phase de purification prealable aboutit & des resultats faus- sement eleves. Cela est dr3 & I'interference de metabolites hepatiques de la progesterone [11] (5-o~-pregnanedione-5-15-pregnan~dione en parti- culier, qui croisent ~. des taux Clevis avec la plu- part des immunserums antiprogesterone RC > 20%) apparaissant en concentrations ele- vees dans le plasma en cours de traitement, alors que leurs concentrations sont n~gligeables chez la femme non traitee. Chez la femme normale non traitee, les concentrations de ces metabolites sont en effet 6 & 8 fois plus faibles que celles de la progesterone.

II sera donc indispensable d'effectuer, apres extraction, une chromatographie sur celite afin d'eliminer ces metabolites 5-~ et 5-fi reduits de la progesterone dans les premieres fractions d'elu- tion moins polaires. La progesterone sera eluee dans des fractions chromatographiques plus polaires.

Au cours de la reaction d'immunocompetition, le dosage des stero'fdes peut ~tre perturbe par des interferences non immunologiques, non spe- cifiques entraTnant un deplacement non speci- fique du traceur en I'absence de stero'='de dans le milieu de dosage. Dans ces situations, des concentrations faussement elevees de stero'ides sont alors obtenues.

Ces deplacements non sp6cifiques du traceur que I'on appelle ,,blanc,,, particuliers aux dosages des stero'ides, sont dus & des sub- stances organiques non definies apport~es soit par les solvants utilises au cours de I'extraction des stero'fdes du plasma, soit par les supports chromatographiques (papier, celite, Sephadex LH 20, colonne de CLHP), soit par la verrerie. Un traitement prealable des supports chromatogra- phiques [6] est indispensable, de meme qu'un lavage soigneux de la verrerie par des detergents ou du melange sulfo-chromique.

Problemes associes aux marqueurs

Le dosage radio-immunologique des stero'fdes a ete rendu possible gr&ce & la synthese de ste- ro'fdes trities & partir des annees 69-70, puis quelques annees plus tard de stero'ides iodes [2]. Depuis quelques annees, des marqueurs non iso- topiques commencent & ~tre mis a la disposition des biologistes.

St6ro'(des triti6s

Les molecules de stero'fdes trities presentent une structure tridimensionnelle, tres voisine de celle des steroi'des froids correspondants, puisqu'elles sont synthetisees par remplacement de 1 ou plu- sieurs atomes d'hydrogene presents sur leur noyau cyclopentanoperhydrophenanthrene par un nombre equivalent d'atomes de tritium. L'encombrement sterique de ces molecules radio- actives est donc tr~s proche de celui des ste- ro'fdes froids correspondants et, par consequent, les immunoreactivites de ces molecules froides, d'une part, et tritiees, d'autre part, seront prati- quement identiques, ce qui constitue selon nous plut6t un avantage.

Cependant, I'utilisation de ces traceurs trities en immunocompetition presente un certain nombre d'inconvenients. Le premier est l'obligation d'effectuer une extraction des steroi'des du plas- ma par un solvant organique, suivie d'une reprise en milieu aqueux avant immunocompetition. Cette etape initiale, presentee comme un incon- venient par les partisans des methodes directes de dosage sur le plasma avec les traceurs iodes, constitue en fait selon nous plutSt un prealable

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indispensable b. la realisation de dosages exacts de certains stero'ides. En effet, cette etape elimi- ne, outre les substances provoquant du quen- ching, les stero'ides hydrosolubles et les pro- teines de liaison.

Le deuxieme inconvenient est lie & la methode, obligatoire jusqu'& maintenant, de separation des formes combinees (B) des formes libres (F) apr~s immunocompetition, par une suspension de char- bon-dextran, methode Iongue et peu automati- sable.

Le troisi~me inconvenient concerne le mode de mesure actuel de la radioactivite ,8- des stero'l'des trities, conduisant & I'utilisation de volumes non negligeables de liquide scintillant (3 ,~ 10 ml par fiole de comptage). II s'ensuit des probl~mes d'encombrement, de stockage et d'enl~vement obligatoire de ces fioles de comptage par une societe de service specialisee.

Ces 2 derniers inconvenients inherents & I'utili- sation de stero'fdes trities risquent de disparaftre gr&ce ,~ I'utilisation d'un reactif de separation ori- ginal (Amersham France) disponible depuis peu (2 e anticorps heterologue ou proteine A ,,coate- & la surface de microbilles en plastique contenant une substance scintillante), qui permet I'immuno- dosage des stero'~'des en phase homog~ne sans addition de liquide scintillant.

St6roides iod6s

L'avantage des stero/des marques & I'iode 125 par rapport aux steroYdes trities en radio-immuno- Iogie repose sur leur plus grande praticabilite d'emploi.

En effet, leur detection contrairement aux ste- roldes trities s'effectue sans liquide scintillant, la separation des formes libres (F) des formes com- binees (B) est realisee par des methodes beau- coup plus simples que I'utilisation de charbon- dextran, par exemple, par precipitation & I'aide d'un deuxi#me anticorps heterologue ou egale- ment par la methode des tubes coates dans laquelle le premier anticorps antistero'ide ou bien le deuxi~me anticorps heterologue est adsorbe sur la paroi interne des tubes de dosage.

Le traitement des dechets radioactifs des ste- ro'ides marques & I'iode 125 est egalement plus simple et, pour un nombre de dosages equiva- lents, les volumes de stockage sont moindres.

L'absence de quenching du rayonnement 7 emis par I'iode 125 a permis le developpement de dosages effectues directement sur le plasma sans extraction par des solvants organiques, ni chromatographie, dosages au cours desquels la reaction d'immunoanalyse est effectuee directe- ment sur le plasma (dosages dits directs), ce qui

sur le plan de la praticabilite est tres avantageux mais pose un certain nombre de probl~mes concernant la qualite des resultats (cf infra).

La radioactivite specifique d'un atome d'iode 125 est approximativement 100 fois superieure b. celle d'un atome de tritium. En consequence, 1 mole de stero'l'de lode (sur laquelle on ne peut fixer qu'un atome d'iode 125) aura une radioacti- vite 25 fois superieure & celle de 1 mol de stero'J'- de tetratriti6. Pour une precision identique, la duree de comptage sera de ce fait plus courte (1 min au lieu de 4 & 10 rain pour le tritium).

En outre, les faibles quantites de traceur lode qu'il sera possible de mettre en competition au cours de I'immunodosage augmentent la sensibi- lite des dosages.

Cependant, de nombreuses difficultes apparais- sent Iors de I'utilisation des stero'ides lodes dans les immunodosages. Ces difficultes sont la consequence de la structure des steroTdes lodes. L'atome d'iode 125 n'est pas fixe directement sur le squeiette cyclopentanoperhydrophenanthre- nique mais sur un noyau histamine, phenyl ou tyramine, lui-meme greffe par I'intermediaire d'un bras de liaison sur le squelette du stero'J'de (fig 4).

Ainsi, contrairement aux stero'ides trities, I'immunoreactivite de ces molecules est par consequent tres differente de celles des sterofdes froids correspondants. Lorsque la structure du stero'fde lode, par exemple la testosterone iodee ou testosterone 3CMO histamine iodee (fig 4), est voisine de la structure de I'immunog~ne testoste- rone 3CMO/BSA (fig 4) utilise pour preparer les anticorps antitestosterone, ces anticorps antites- tosterone reconnaissant non seulement le steroT- de mais egalement le bras de liaison commun au traceur et & I'immunog~ne auront une affinite superieure pour le traceur lode & celle qu'ils ont pour le stero'ide froid ou le stero'/de tritie corres- pondant. II en resulte une augmentation de la plus petite concentration detectable de steroTdes. Cette perturbation de la limite de detection peut etre corrigee par la diminution de la quantite de traceurs lodes, d'ot3 une radioactivite mise en jeu plus faible que celle & laquelle on aurait pu s'attendre. Neanmoins, les immunodosages de stero'fdes utilisant les traceurs lodes presentent generalement une limite de detection plus basse que celle utilisant les stero'ides trities.

II faut egalement noter que la courte duree de vie de I'iode 125 (60 jours) est un facteur limitant I'utilisation des stero'l'des b. environ 2 mois, ce qui est un desavantage par rapport aux stero'ides tri- ties.

Les probl~mes essentiels poses par I'utilisation de stero'fdes lodes en radio-immunologie sont des problemes de specificite, donc d'exactitude des dosages. Ces probl~mes sont dus & I'abus

Immunoanalyse des st0ro'fdes 49

TESTOSTERONE IODEE

OH

' l ' l , ~ N \ O II N ~ ~ I ~ CHI - CHI- NH-- C-- CH i - O--

H / [ HISTAMINE IODEE I I OXIME J l TESTOSTERONE l

TESTOSTERONE-3-[(O-CARBOXYMETHYL)OXlME (2-11SlODOHISTAM|NE)]

IMMUNOGENE TESTOSTERONE- CMO-BSA

OIt

o O_N II BSA-- CHI--CHI-CHI- CH i - NH-- C-- CH i -

] BSA - LYSINE I I OXlME I I TESTOSTERONE ]

TESTOSTERONE-3-[(O-CARBOXYMETHYL)OXlME (BSA)

Fig 4. Similitudes de structure de la testost6rone 3-(O-carboxym6thyl) oxime lodge (traceur) et de la testosterone 3-(O-carboxym~- thyl) oxime (BSA) (immunog~ne).

qu'on peut faire de leur emploi sous le pr~texte qu'ils apportent une meilleure praticabilit~.

II faut, en particulier, ~tre vigilant vis-&-vis des m6thodes directes propos~es. Un certain nombre d'entre elles donnent des r~sultats tr~s sup~- rieurs aux valeurs r6elles, comme on pourrait le soup(;onner d'ailleurs par 1'6tendue des valeurs dites usuelles annonc~es dans les notices d'utili- sation des kits de dosages. II faudra, par conse- quent, savoir mettre en oeuvre un certain nombre de moyens pour contr01er la qualit~ des dosages radio-immunologiques effectu6s avec des st6- roTdes iod6s (cf Validation et suivi quotidien des techniques de dosage des st6roTdes).

Enfin, nous avons observ~ que la sp~cificit~ d'un immuns6rum antist~ro'fde, mesur~e avec un traceur iod~, d~pend grandement de la purifica- tion du st6ro'fde iod6 effectu6e par CLHP. II en r~sulte, par consequent, des variations impor- tantes de I'exactitude des dosages en fonction des lots de fabrication des traceurs.

Marqueurs non isotopiques

Les m6thodes non isotopiques de dosage des st~roTdes mettent en oeuvre comme traceurs des

st~ro'fdes couples soit & une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline) qui sera d6tect~e par colorim~trie, chimioluminescence ou fluorim6trie, soit & une mol6cule chimioluminescente (d~riv~s du luminol ou de I'acridine), soit ~. une mole fluo- rescente (telle que la fluoresc6ine d6tect6e par polarisation de fluorescence), soit & un ch6late d'europium d~tect~ par fluorim~trie ,,en temps retardS,>.

Compar~ aux m~thodes isotopiques, I'int~r~t de ces m~thodes repose sur la conservation de Iongue dur~e des traceurs, sur I'automatisation plus facile des dosages et sur de moindres contraintes administratives et techniques (pas d'autorisation pr~alable d'utilisation, pas de pro- blames de d6chets radioactifs ~. ~liminer).

Cependant ces techniques, qui sont en plein d6veloppement, pr~sentent un certain nombre d'inconv6nients dont, pour certaines d'entre elles, une limite de d~tection plus 61ev6e que celle des m~thodes isotopiques, par exemple pour le dosa- ge de I'oestradiol au cours du cycle menstruel.

Mais essentiellement, comme pour les m6thodes utilisant des st6ro'fdes iod6s, I'inconve- nient majeur des m~thodes non isotopiques de dosage des st6ro'fdes est d0 paradoxalement ~.

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leur apparente simplicit~ puisqu'elles sont propo- sees generalement en methode dite directe, sans chromatographie, voire meme sans extraction prealable. II s'ensuit, & I'evidence, dans d'assez nombreuses circonstances physiologiques et pharmacologiques, un manque de sp~cificite donc d'exactitude. Mais le traceur non isotopique n'est pas en cause en tant que tel, si bien qu'il est possible de considerer que les inconvenients des immunodosages utilisant des traceurs non radio- actifs sont les memes que ceux des radio-immu- nodosages utilisant I'iode 125.

Validation et suivi quotidien des techniques de dosage des steroi'des

Quelle conduite adopter en pratique pour valider une technique de dosage des st~ro'ides ? Nous distinguerons 2 circonstances, I'une concerne la validation d'une technique au moment de sa mise au point ou de I'utilisation d'un nouveau kit de dosage et I'autre concerne la surveillance quoti- dienne des resultats d'une technique anterieure- ment validee.

Validation d'une nouvelle technique d'immunoa- nalyse de st#ro'fdes

Les proc~des sont voisins de ceux habituellement mis en oeuvre pour valider toute technique d'immunoanalyse. Nous citerons les determina- tions de la reproductibilit~, de la rep~tabilite, de la plus petite concentration detectable, de I'exactitu- de (par les tests de dilution et de surcharge), I'~tude de la specificite (par la determination des reactions crois~es du plus grand nombre possible de stero'fdes vis-&-vis de I'anticorps antistero'ide).

Le choix des stero'fdes dont les reactions croi- sees seront recherchees prioritairement est guide par la structure de I'immunog~ne ayant servi & preparer I'anticorps, par la connaissance des metabolites du stero'ide dose et d'autres st~- ro'/des de structure apparentee, pouvant etre pre- sents dans le plasma en concentration elevee en meme temps que le stero'fde d'int~ret.

Dans le cas des techniques directes (sans extraction), il est necessaire de verifier I'absence d'interferences dues aux prot~ines de transport (CBG, SHBG), aux acides gras libres et eventuel- lement celles dues & la nature de I'~chantillon (hyperlipemie, ict~re, hemolyse...).

Comme nous I'avons vu d'apr~s les exemples du chapitre Problemes lies 9. la determination de la specificite, la specificite d'un immuns~rum ne garantit pas la sp~cificite de la methode de dosa- ge dans toutes les situations physiologiques, pathologiques et pharmacologiques. La sp~cifici-

t~ de la m~thode de dosage, sur laquelle nous insisterons plus particuli~rement, sera ~tudi~e en comparant les r6sultats qu'elle fournit avec ceux obtenus par une m6thode de r~f6rence telle que la spectrom#trie de masse ou au moins une m~thode qu'on peut assimiler & une m~thode de r~f~rence et qui implique une ~tape d'extraction des st6ro'fdes par des solvants organiques suivie d'une purification par chromatographie avant immunoanalyse.

Deux supports chromatographiques sont & la portee de tous les laboratoires, il s'agit du S6pha- dex LH20 et de la c61ite. Nous d~taillerons quelque peu I'utilisation de la celite dont nous avons I'exp6rience [6].

La celite doit etre traitee par des solvants orga- niques, puis chauff~e 12 h & 800°C et conserv~e anhydre & I'etuve & 100°C. La c~lite sert de sup- port #. I'~thyl~ne glycol ou au propyl~ne glycol (phase stationnaire). Apr~s contact du plasma ou de I'urine avec une dose de traceur de st~roTde triti~ (afin de contrSler le rendement du dosage), on extrait les st6ro'ides par un solvant organique. L'extrait organique s6par~ puis evapor~ est repris par un volume reduit (0,5 & 1,5 ml) de solvant apolaire (isooctane ou hexane) qui est d~pos6 sur la colonne de c~lite. L'addition de solvants de polarit~ croissante isooctane + acetate d'~thytle (phase mobile), par exemple, d~croche les st~- ro'/des de la colonne en fonction de leur polarite. Ainsi, & partir de la prise d'essai, on peut 61uer dans des fractions chromatographiques separ~es des st6ro'/des diff~rents.

Les fractions chromatographiques d'int6r~t sont evapor~es, reprises par du tampon et soumises & I'immunoanalyse proprement dite avec des anti- corps les plus specifiques possibles. Bien enten- du, il faut veiller & ce que dans le meme volume d'~lution chromatographique contenant le st6rof- de d'int~ret X ne soient pas coelu6s d'autres ste- roTdes genants Y, genants par exemple soit parce qu'ils croisent avec I'anticorps anti-X, soit parce que leurs concentrations dans le milieu biolo- gique dose sont relativement importantes par rap- port & X.

On v6rifie cette possibilit~ en determinant la radioactivit6 sp~cifique du st6ro'ide X, sur chaque ml, obtenu par ~lution fractionn6e du volume total d'61ution recueilli. Cette radioactivit6 sp~cifique doit demeurer constante [3].

Un moyen efficace de contrSler I'efficacit~ de la purification consiste & realiser les memes dosages en mettant en oeuvre diff~rents sys- t~mes de chromatographie, par exemple chroma- tographie sur colonne de Sephadex LH20 puis sur colonne de celite, voire CLHP.

,/k notre connaissance, & I'heure actuelle, comp- te tenu de la specificit~ des meilleurs immunse-

Immunoanalyse des st6ro'fdes 51

rums obtenus, cette etape de pu~f;~ication est indispensable & la realisation de dosages exacts des sterofdes plasmatiques suivants (liste non exhaustive) : A4-androstenedione, 11-15-OHA4 androst~nedione, 11-desoxycorticosterone, 21- desoxycortisot, 21-desoxycorticosterone, 5-oc- androstanediol, A5-androst~nediol, oestrone, DHT dans toutes les situations physiologiques; au dosage de la testosterone chez la femme, et chez I'homme traite par la DHT, et chez I'enfant; au dosage de la cortisolemie dans les deficits enzy- matiques des surrenales et au cours du test & la metopirone; de la progesterone chez la femme traitee par voie orale par la progesterone; au dosage du cortisol urinaire.

Au moment du choix d'une nouvelle technique de dosage ou d'un nouveau kit de dosage du commerce, il faut que le biologiste ne sacrifie pas la qualite aux depens de la facilite du dosage. On voit apparaftre en effet de plus en plus de tech- niques de dosages dites directes realisees direc- tement sur le plasma (technique radio-immunolo- gique & I'iode 125 ou technique non isotopique), sans phase prealable d'extraction ni de chroma- tographie. Les normes ou valeurs usuelles propo- sees alors dans la notice d'utilisation du kit (par exemple A4-androst~nedione : 0,4 & 4,5 ng/ml, testosterone chez la femme : 0,07 & 1,16 ng/ml) sont etrangement plus elevees que celles deter- minces au fit des annees (z~4-androst~nedione : 0,4 & 2 ng/ml et testosterone chez le femme : 0,07 & 0,60 ng/ml) par differents chercheurs qui ont mis en oeuvre des techniques certes moins rapides mais plus s0res (avec extraction et chro- matographie). On peut alors legitimement se poser des questions sur I'exactitude de ces tech- niques rapides.

On peut egalement etre aide dans le choix d'une nouvelle technique de dosage de stero'fdes par les resultats du contr61e de qualite interlabo- ratoire (Probioqual, Lyon). Certaines techniques de dosages de sterofdes donnent systematique- ment des resultats plus eleves.

Enfin, il faut que le biologiste, pour juger de la qualite d'une technique, sache mettre en oeuvre des techniques comportant une extraction suivie d'une purification chromatographique.

Inversement, il ne faut pas associer systemati- quement la nature des traceurs & la qualite des techniques de dosages. Toutes les methodes uti- lisant les stero'fdes trities comme marqueurs ne sont pas excellentes et toutes les methodes & I'iode 125 ou les methodes non isotopiques ne sont pas & rejeter. De plus, une methode peut se reveler excellente dans certaines situations et moins bonne dans d'autres : par exemple, les dosages rapides d'oestradiol sont de bonnes methodes pour le monitorage des FIV mais sont

defaillantes pour doser I'oestradiol chez les femmes m6nopausees ou traitees, et chez les hommes.

Nous pensons que la qualite d'une technique de dosage des stero'fdes depend plus des moyens de purification mis en oeuvre avant immunodosage que de la nature du traceur. C'est ainsi que des techniques utilisant I'iode 125 direc- tement sur le plasma pourront donner d'excel- lents r6sultats si au lieu de realiser directement le dosage sur le plasma, comme il est propose generalement dans la notice d'utilisation, on pro- c~de au prealable & une extraction suivie de chromatographie.

I~galement les differentes techniques de dosa- ge du cortisol urinaire, technique non isotopique, et technique isotopique fournissent des resultats semblables si I'on sait mettre en oeuvre avant immunoanalyse proprement dite une phase de purification par chromatographie sur Sephadex LH20.

Surveillance quotidienne d'une technique de dosage des st6ro'ldes

Validation analytique La validation journali~re d'une technique de dosa- ge, utilisant une trousse de reactifs selectionn6e, va consister & contrSler : - les caracteristiques de la courbe d'etalonnage; - les resultats du contr61e de qualite intralabora- toire; - I'absence de ,,blanc>> ou, & tout le moins, un deplacement non specifique bien inferieur au pre- mier point de gamme. Un serum debarrasse de steroYdes par traitement par le charbon doit etre inclus dans chaque serie de dosages;

- la qualite des doublets (qui doivent toujours etre realises); - I'identite des concentrations obtenues sur 2 volumes differents de prise d'essai (il s'agit d'un test de dilution en raccourci : des resultats dis- semblables obtenus sur 2 aliquots de volume dif- ferent indiquent un probleme de specificite); - la valeur du rendement mesure par dilution iso- topique gr&ce & I'introduction dans I'echantillon d'une dose traceuse de stero'fde triti6 avant extra- ction; - le deplacement du traceur en absence de ste- ro'fde froid (Bo), Bo/T doit etre compris sur la courbe standard entre 0,40 et 0,60.

La technique de dosage etant validee, on pro- c~de & la validation clinique, temps essentiel per- mettant, en fonction des renseignements cliniques (helas ! ils sont assez souvent insuf- fisants), de s'assurer d'une erreur due en particu- lier & un metabolite ou & un medicament.

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Validation clinique L'6tape bioclinique de la validation des dosages de st~ro'fdes (non sp~cifique d'ailleurs des st#- ro'fdes) va consister & v#rifier la coh6rence entre le/les r~sultats biologiques et le/les symptSmes cliniques; comme elle oriente ies diagnostics et/ou les traitements, elle doit ~tre men~e avec une grande rigueur.

C'est dire I'immense importance des renseigne- ments cliniques accompagnant la demande de dosage. L'id6al serait d'avoir le ,souhait>> du clini- cien : M. X a tel traitement, je cherche & savoir s'il est bien equilibre. Mme Y pr~sente tels symp- tSmes, je veux confirmer tel diagnostic. Mile Z prend tel m#dicament, je veux confirmer telle cons6quence, etc.

Cette situation (enviable) am#nerait 2 conse- quences : - un gain de temps : ~viter de recommencer une ou plusieurs fois le m~me dosage en pensant s'~tre tromp~ (exemple : refaire x fois une testo- sterone basse car on ne salt pas que le malade est trait~ pour cancer de la prostate); - #viter des erreurs diagnostiques ou th~rapeu- tiques (exemple : suspecter un Cushing chez une femme pour un cortisol & 450 ng/ml alors qu'elle prend la pilule, etc).

,/~ terme, on en arriverait d'ailleurs & un bilan moins long, plus performant et moins on~reux pour ~tayer une d~marche diagnostique ou pour 6quilibrer un traitement.

C'est dire la n6cessit~ d'une formation clinique des biologistes (ou de la presence d'un clinicien au sein de 1'6quipe du laboratoire) comme d'une formation biologique des m~decins (ou de la pr6- sence d'un biologiste au sein de I'~quipe m~dica- ie).

R e m e r c i e m e n t s

Nos remerciements iront aux techniciens(nes) qui, depuis de nombreuses ann~es, pratiquent les dosages de st~ro'ides en clinique.

R e f e r e n c e s

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