Production de l'auxine chez des actinobactéries

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

UNIVESITE LARBI BEN M’HIDI OUM EL BOUAGHI

FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET DES SCIENCES DE LA NATURE

ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

N° d’ordre………. N° de série………...

Mémoire de Fin de Cycle

En vue de l’obtention du diplôme

MASTER

En

BIOLOGIE

OPTION : MICROBIOLOGIE APPLIQUEE Thème

Production de l'auxine chez des actinobactéries

rhizosphériques appartenant aux genres

Streptomyces et Nocardiopsis

Présenté par :

ANNAB Amir & DAFRI Fares

Devant le jury

Présidente : Mr MEDJOUDJ H. M.C.B. Université OEB Rapporteur : Mme AOUAR L. M.C.A. Université OEB Examinateur : Mme CHETTIBI F. M.C.B. Université OEB

Année universitaire : 2017-2018

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

UNIVESITE LARBI BEN M’HIDI OUM EL BOUAGHI

FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET DES SCIENCES DE LA NATURE

ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

N° d’ordre………. N° de série………...

Mémoire de Fin de Cycle

En vue de l’obtention du diplôme

MASTER

En

BIOLOGIE

OPTION : MICROBIOLOGIE APPLIQUEE Thème

Production de l'auxine chez des actinobactéries

rhizosphérique appartenant aux genres

Streptomyces et Nocardiopsis

Présenté par :

ANNAB Amir & DAFRI Fares

Devant le jury

Présidente : Mr MEDJOUDJ H. M.C.B. Université OEB Rapporteur : Mme AOUAR L. M.C.A. Université OEB Examinateur : Mme CHETIBI F. M.C.B. Université OEB

Année universitaire : 2017-2018

Remerciements

Avant toute chose, nous tenons à remercier Allah le tout puissant, qui

nous a donné la force et le courage afin d’élaborer ce modeste travail.

Ce travail a été réalisé, au « Laboratoire de Microbiologique Appliquée,

Département des Sciences de la Nature et de la Vie, Faculté des Sciences

de la Nature et de la Vie, Université Larbi Ben M'hidi Oum El Bouaghi».

Nous remercierons profondément, notre encadreur Mme AOUAR L.

pour le privilège et la confiance qu’elle nous a accordé durant la

réalisation de ce travail, Pour son aide, sa patience, ainsi que pour ses

précieux conseils. « Sincèrement madame, nous ne pouvons que vous

exprimer notre respect et notre gratitude, grâce à vos conseils et à votre

supervision on est entré dans un nouveau monde de sciences et de

savoir».

Nous tenons à remercier Mme CHETTIBI F. Maître de Conférences au

Département des Sciences de la Nature et de la Vie, Faculté des Sciences

de la Nature et de la Vie, Université Larbi Ben M'hidi Oum El Bouaghi,

qui a accepté de présider le jury.

Un grand merci également à Mr Medjoudj H. Maître de Conférences

au Département des Sciences de la Nature et de la Vie, Faculté des

Sciences de la Nature et de la Vie de l’Université Larbi Ben M'hidi Oum

El Bouaghi, d’avoir bien voulu examiner notre travail.

Enfin, un grand merci à toute personne qui a contribué de prés ou de loin

à la réalisation de ce modeste travail.

Dédicaces À mes chers parents, pour tous leurs sacrifices, leur amour, leur

tendresse, leur soutien et leurs prières tout au long de mes études,

surtout mon père défunt que Dieu accepte son âme dans son vaste

paradis et que ce modeste travail soit une charité courante pour

lui.

À mes chères sœurs pour leurs encouragements permanents, et leur

soutien moral,

À mon cher frère Alaa Eddine pour son appui et son

encouragement,

À toute ma famille pour leur soutien tout au long de mon

parcours universitaire,

Que ce travail soit l’accomplissement de vos vœux tant allégués,

et le fruit de votre soutien infaillible,

Merci d’être toujours là pour moi.

Amir

Dédicaces Quand il y a le souci de réaliser un dessein

Tout devient facile pour arriver à nos fins

Malgré les obstacles qui s’opposent

Je dédie ce travail à…

À la mémoire de ma très chère mère, Je ne saurais exprimer mon

grand chagrin en ton absence, J’aurais aimé que tu sois à mes

côtés ce jour.

À mon cher père, qui peut être fier et trouver ici le résultat de

longues années de sacrifices.

À Mes frères et mes sœurs, le simple fait de leur présence me

donne la force d'avancer.

À tous mes amis chacun en son nom.

À tous les collègues de ma promotion, avec qui j’ai passé mes plus

beaux jours.

Je vous dédie ce travail et je vous souhaite une vie pleine de santé

et de bonheur.

Fares

Sommaire

Table des Matières

Liste des abréviations I

Liste des figures II

Liste des photographies III

Liste des tableaux IV

Introduction ............................................................................................................... 01

Revue bibliographique

1. Diversité microbienne du sol ................................................................................. 02

1.1. Rhizosphère ...................................................................................................... 02

1.2. Rhizobactéries ................................................................................................. 02

1.3. Rhizobactéries favorisant la croissance des plantes : (PGPR) .................. 03

1.3.1. Biofertilisants ............................................................................................. 03

1.3.2. Détoxification du milieu ........................................................................... 04

1.4. Rhizodépositions ............................................................................................. 04

1.4.1. Exsudats racinaires .................................................................................... 04

1.4.2. Substances sécrétées .................................................................................. 05

1.4.3. Lysats ........................................................................................................... 05

2. Les actinobactéries .................................................................................................. 05

2.1. Écologie et distribution dans la nature ......................................................... 05

2.2. Morphologie ..................................................................................................... 06

2.3. Génétique ......................................................................................................... 07

2.4. Cycle de développement du genre Streptomyces ........................................ 08

2.5. Importance des actinobactéries ..................................................................... 09

2.5.1. Production des substances antimicrobiennes ......................................... 09

2.5.2. Biodégradation ........................................................................................... 09

3. Les phytohormones ................................................................................................. 10

3.1. Mode d’action .................................................................................................. 10

3.2. Production de l’AIA chez les microorganismes .......................................... 11

3.3. Structure chimique .......................................................................................... 11

3.3.1. Auxines naturelles et synthétiques ........................................................... 11

3.3.1.1. Hormones d'origine synthétique .................................................... 11

3.3.1.2. Hormones d'origine naturelle ......................................................... 12

3.4. Biosynthèse de l’AIA ..................................................................................... 12

Matériel et méthodes

1. Matériel biologique ................................................................................................... 14

2. Milieux de culture ..................................................................................................... 14

3. Repiquage et purification des isolats ...................................................................... 14

4. Production et dosage de l'auxine ............................................................................. 15

4.1. Criblage des souches productrices ................................................................ 15

4.2. Préparation de l’inoculum .............................................................................. 15

4.3. Production d’Acide Indole Acétique (AIA) en milieu liquide .................. 15

4.4. Contrôle de la pureté des cultures ................................................................. 16

5. Mise en évidence de l'auxine ................................................................................... 16

5.1. Récupération du surnageant ............................................................................ 16

5.2. Détermination du poids sec ............................................................................ 16

5.3. Réaction de Salkowski ................................................................................... 16

5.4. Dosage de l'auxine au spectrophotomètre .................................................... 17

5.5. Courbe d’étalonnage ....................................................................................... 17

5.6. Analyse statistique .......................................................................................... 17

6. Développement de la chromatographie sur couche mince .................................... 17

6.1. Révélation du chromatogramme ................................................................... 18

Résultats et discussion

1. Repiquage sur milieu ISP2 ....................................................................................... 19

2. Criblage des souches productrices .......................................................................... 19

3. Contrôle de la pureté : observation microscopique ................................................ 20

4. Courbe étalon .............................................................................................................. 20

5. Dosage de l'auxine ..................................................................................................... 21

6. Étude statistique ........................................................................................................ 25

6.1. ANOVA a deux facteurs ................................................................................ 25

6.1.1. Effet de souche ........................................................................................... 26

6.1.2. Effet de concentration ................................................................................ 26

6.2. Test de Student ................................................................................................ 26

6.3. Test de corrélation ........................................................................................... 27

7. Mise en évidence de l’auxine par analyse chromatographique ........................... 28

Conclusion et perspectives ..................................................................................... 30

Références bibliographiques ................................................................................. 31

Annexe

Résumés

Liste des abréviations

AIA L'acide indole-3-acétique

ANOVA Analyse de variance

BN Bouillon Nutritif.

DO Densité optique

G+C% Coefficient de Chargaff

ISP International Streptomyces Project

M Molaire

MA Mycélium aérien

mM Millimole

MS mycélium du substrat

MSM milieu starch minimum

PGPR Rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes

PS Poids sec

Rf rapport frontal

rpm Rotation par minute

Trp Tryptophane

UFC/g Unité formant colonie par gramme

UV Ultraviolet

V/V Volume par volume

YMEA Yeast Malt Extract Agar

Liste des figures

Figure 01 : Morphologie des différentes chaines de sport chez les streptomycètes

(Madigan et al., 2011) ................................................................................................ 07

Figure 02 : Cycle de développement de Streptomyces sur milieu solide (Delaunay et

al., 2003) ..................................................................................................................... 08

Figure 03 : Structure chimique de deux auxines synthétiques ................................... 11

Figure 04 : Structure chimique de quelques auxines naturelles ................................. 12

Figure 05 : La voie de la biosynthèse de l’AIA à partir de tryptophane par quelques

souches de Streptomyces et les voies de transformation des drivés d’indole en AIA

(Manulis et al., 1994) .................................................................................................. 13

Figure 06 : Courbe d’étalonnage de l’AIA ................................................................ 21

Liste des photographies

Photographies 01 : Souches d'actinomycètes repiquées ........................................... 19

Photographies 02 : Résultats de Criblage des souches ............................................. 20

Photographies 03 : L’observation microscopique avec un grossissement de 100 X 20

Photographies 04 : Différentes concentrations de l'auxine ........................................ 21

Photographies 05 : Réaction colorimétrique de (S. scabis) ...................................... 22

Photographies 06 : Résultat de la chromatographie .................................................. 28

Liste des tableaux

Tableau 01 : Identité des souches d’actinobactéries employées dans l’étude ........... 14

Tableau 02 : Résultats du dosage de l'auxine au spectrophotomètre .......................... 23

Tableau 03 : Représentation des résultats statistiques ANOVA deux facteurs, pour un

seuil de 0,05 ................................................................................................................ 25

Tableau 04 : Comparaison entre les deux concentrations : 2,5 mM et 5 Mm ............ 27

Tableau 05 : Comparaisant entre les deux concentration : 2,5 mM et 7,5 mM ......... 27

Tableau 06 : Comparaisant entre les deux concentration : 5 mM et 7,5 mM ............ 28

Tableau 07 : Représentation des résultats statistiques de Teste de corrélation .......... 29

Introduction

Introduction

1

Sur terre, les microorganismes ont colonisé à peu près tous les écosystèmes. La

microflore tellurique est principalement dominée par les bactéries dont les

actinomycètes, les champignons, les algues et les protozoaires. Les bactéries et les

champignons sont les organismes dominants (Hoorman et Islam, 2010). Certains

microorganismes appelés rhizobactéries entres autres Rhizobium, Bradyrhizobium,

Azorhizobium Arthrobacter, Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Enterobacter,

Pseudomonas, Serratia, Streptomyces ont l’aptitude à coloniser les racines (Saharan

et al., 2011).

Les effets bénéfiques des rhizobactéries sont liés à leur position stratégique à

l’interface sol-racine. En effet, le rhizoplane et la rhizosphère sont le siège d’échanges

intenses entre la plante et le milieu environnant (Rawat et Mushtaq, 2015).

L’ensemble des effets bénéfiques des rhizobactéries s’est élargi dans les dernières

années. En effet, les bactéries colonisant les systèmes racinaires peuvent exercer leurs

actions bénéfiques de plusieurs mécanismes (Glick, 2001).

Ces mécanismes sont divers tels que la fixation de l’azote, la libération des

substances jouant le rôle des agents de biocontrôle comme les antibiotiques ou les

sidérophores, et la production de métabolites végétaux bénéfiques tels que les

phytohormones (Pandey et Maheshwari, 2007).

Les phytohormones participent à la régulation de la croissance et au

développement des plantes, en réponse notamment aux facteurs environnementaux.

Le terme d’hormone se réfère à des substances organiques actives à très faible

concentration produites par les plantes. Parmi ces hormones l’auxine ou l’acide indole

acétique (AIA), c’est la première phytohormone découverte et la plus étudiée. Cette

hormone a été isolée par Went en 1926. Les actinomycètes peuvent favoriser la

croissance racinaire des plantes par la production de promoteurs de croissance tels que

l’auxine, l’acide abscissique et les gibbérellines (Khamna et al., 2010).

Au cours de ce présent travail, nous sommes intéressés à l’étude de la

production et dosage d’auxine (AIA) chez les actinobactéries rhizosphérique

appartenant de deux genres ; Nocardiopsis et Streptomyces, en présence de différentes

concentrations du tryptophane.



2

1. Diversité microbienne du sol

Le sol est pleinement riche en microorganismes dite tellurique parmi l’immense

majorité des espèces microbienne existent, ce qui forme la biodiversité écologique

terrestre, L’étude de cette biodiversité, a montré qu’un gramme de sol contient de 1010

à 1011

, de bactéries, de 6000 à 50000 espèces bactériennes (Curtis et al., 2002), cette

masse microbienne énorme joue un rôle crucial dans les différents cycle éco-

biologique ainsi que l’acquisition d’éléments nutritifs pour les plantes (Smith et

Read, 2010).

La flore microbienne tellurique est naturellement constitués de procaryotes et

d’eucaryotes. Parmi eux il y a des organismes qui n’ont pas d’effet sur le

développement des végétaux (microorganismes commensaux), et d’autres sont

bénéfique (mutualistes) favorisent la croissance des végétaux, comme il existe

d’autres organismes ont un effet nocif sur le développement des végétaux (parasites et

phytopathogènes) (Whipps, 2001). De ce fait, il a été suggéré que la plante favorise

celles qui lui sont bénéfiques (Lynch et Leij, 2012).

1.1. La rhizosphère

Hiltner (1904) a défini la rhizosph?ère comme la partie du sol entourant la racine,

influencée chimiquement, physiquement et biologiquement par la présence de racines

végétales vivantes. C’est un environnement écologique dynamique où les

microorganismes et les plantes sont en interaction continue, pour une meilleure

exploitation des nutriments du sol (micro et macronutriments) présent en quantités

limitées affectant ainsi la croissance des plantes (Gholami et al., 2012).

Précisément, la rhizosphère est divisée principalement en trois grandes

compartiment qui interagissent ensemble : la rhizosphère sol, le rhizoplan et les

racines. La rhizosphère sol est la zone du sol influencée par les racines alors que le

rhizoplan est la surface externe des racines (Barea et al., 2005).

1.2. Rhizobactéries

Selon Soufiane (1998), les bactéries rhizosphériques sont les organismes les plus

nombreux (leur densité est de l'ordre de 109 par gramme de sol) et les plus variés. Les

bactéries filamenteuses ou actinobactéries peuvent atteindre 107 unités par gramme de


3

sol, et elles manifestent souvent un antagonisme vis-à-vis des bactéries et des

champignons voisins ; cet antagonisme résulte de la sécrétion de substances

antibiotiques.

1.3. Rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR)

Les bactéries colonisant les racines des plantes peuvent être libres, parasites ou bien

saprophytes. Leur diversité reste dynamique avec un changement fréquent de la

structure de la communauté et de l’abondance des espèces (Kunc et Macura, 1988),

cela est principalement dû à la quantité et à la composition des exsudats racinaires.

Un groupe important de communautés bactériennes qui exercent des effets

bénéfiques sur la croissance des plantes lors de la colonisation des racines ont été

définies comme des rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR). Ces

bactéries vivant librement et colonisant les racines, lorsqu’elles sont appliquées à des

graines ou à des racines, améliorent la croissance de la plante, réduisent les

dommages causés par les phytopathogènes et confèrent une résistance contre le stress

abiotique (Kloepper et al., 1991).

Les microorganismes stimulés peuvent agir directement sur la plante en

mettant à sa disposition des phytohormones, des vitamines ou des molécules

organiques absorbables par les racines ou bien indirectement en améliorant sa

nutrition minérale par solubilisation ou minéralisation de certains éléments (Soufiane,

1998).

1.3.1. Biofertilisants

Puisque les engrais chimiques sont coûteux, le développement des engrais biologiques

est un domaine important et passionnant. Les relations symbiotiques établies entre les

plantes et les bactéries comme Rhizobium et des actinobactéries. Plusieurs études sur

la relation PGPR-amélioration de l’absorption des nutriments ont conclu que

l’application des inoculations bactériennes améliorent considérablement l’absorption

de N, P, et K (Amir et al., 2005). Fondamentalement, les PGPR sont définies par trois

caractéristiques intrinsèques :

elles doivent pouvoir coloniser la racine.


4

elles doivent survivre et se multiplier dans les microhabitats associés à la

surface des racines, en concurrence avec d’autres microbiotes.

elles doivent favoriser la croissance des plantes. Dans la rhizosphère, les

actinomycètes produisent des promoteurs de croissance tel que l'acide indole-

3-acétique (AIA) pour la croissance racinaire des plantes (Niranjana et

Hariprasad, 2014).

1.3.2. Détoxification du milieu

Dans la rhizosphère, les phytotoxines sont des composés avec des structures

chimiques très variées, ils sont produits par des microorganismes saprophytes et

parasites du sol. Ils inhibent, à de faibles concentrations la croissance et le

développement des plantes. Dans le sol, certaines bactéries comme Pseudomonas

fluorescens éliminent ces phytotoxines (Nagarajkumar et al., 2005).

1.4. Rhizodépositions

Ils existent plusieurs composés organiques libérés par les racines des plantes

au niveau dans la rhizosphère. Ils peuvent être divisés en :

1.4.1. Exsudats racinaires

L’exsudation est définie comme la libération de composés solubles de faible poids

moléculaire. Au niveau de la rhizosphère, les racines libèrent beaucoup de matières

organiques sous forme de mucilage, plus de 40% des produits de photosynthèse

passent dans le système racinaire (Whipps, 1990).

La rhizosphère est également un environnement caractérisé par un volume très

élevé de substances racinaires appelées exsudats racinaires, telles que les acides

organiques, les sucres et les acides aminés. C’est également celle la plus rapidement

métabolisée par les microorganismes. Ces substances stimulent la croissance et les

activités métaboliques des microbes dans le sol, ce qui influe sur le cycle

biogéochimique des nutriments dans le sol. L’extension de la zone rhizosphérique

peut varier selon le type de sol, l’espèce végétale et son âge, et d’autres facteurs

biotiques et abiotiques (Soufiane, 1998 ; Anand et al., 2016).


5

1.4.2. Substances sécrétées

Les substances sécrétées sont des composés de poids moléculaire le plus souvent

élevé. Elles sont représentées par les mucilages, les polymères de carbohydrates et les

enzymes. Elles jouent un rôle très important dans le maintien de la stabilité du sol

(Kennedy et de Luna, 2004).

1.4.3. Lysats

Les lysats sont libérés quand les cellules des tissus corticaux des racines s’autolysent,

ils incluent aussi les cellules desquamées de la coiffe et les membranes cellulaires

(Bell Perkins et Lynch, 2002).

Les rhizodépots impliquent un effet qualitatif et quantitatif sur la microflore de la

rhizosphère (Walker et al., 2003), soit en stimulant ou en inhibant certaines espèces

(Soufiane, 1998).

2. Les actinobactéries

Les actinobactéries, appartiennent à l'ordre des Actinomycetales, sont des eubactéries

à Gram positif et filamenteux avec une teneur élevée en G + C supérieur à 55%. Ce

sont des microorganismes hétérotrophes avec toutefois des espèces capables de

croissance chimio-autotrophe. Le Manuel de Bergey regroupe 6 classes, 23 ordres, 53

familles, 222 genres et environ 3000 espèces (Ludwig et al., 2012).

2.1. Ecologie et distribution des actinobactéries dans la nature

Les actinobactéries sont largement répandus dans la nature. En effet leur nombre

dépend de nombreux facteurs, parmi lesquels la nature et l’abondance de la matière

organique, la profondeur, le pH, l’aération et l’humidité en sont les plus importants.

Elles ont été isolées à partir d’habitats variés tels que les sédiments marins

(Balagurunthan et al., 2010), l'eau de mer (Subramani et Albersberg, 2013), les

rhizosphères des plantes médicinales (Khamna et al., 2010) et de l’écorce des arbres

(Pullen et al., 2002).

Par ailleurs, certaines espèces ont été isolées à partir de milieux extrêmes tel

que des sols pollués contenant des métaux lourds (Desjardin, 2002), des

hydrocarbures ou du pétrole (Baniasadi et al., 2009). D’autres se comportent comme


6

des parasites intracellulaires des spongiaires (Grandhimathi et al., 2007). Les

actinobactéries constituent une proportion importante de la microflore tellurique (107 -

108 UFC/ml) dont la plupart sont saprophytes, mais certaines peuvent être pathogènes

ou symbiotes des plantes et des animaux.

2.2. Morphologie

La morphologie des différents groupes d’actinobactéries est très variable. Elle va de

simples bacilles diphtéroïdes à des formes mycéliennes complexes. Certains peuvent

présenter un mycélium se développant sur et dans les milieux (mycélium végétatif ou

mycélium de substrat) ou dans l'air au-dessus du substrat (mycélium aérien). Les

filaments peuvent produire des spores soit isolées, soit groupées en chaînes ou même

enfermées dans un sporange ou conidies qui libèrent des spores de formes variées.

Ces spores sont d’aspects lisses, ridée, etc ; soit isolées soit groupées en chaînes

(Figure 1). Certaines actinobactéries forment un mycélium non persistant rapidement

transformé en une masse de formes bactéroïdes irrégulières. D'autres ne présentent

que des mycéliums très rudimentaires.

Il existe deux catégories d’hyphes : les hyphes dispersés et les hyphes en

pellets. Dans les hyphes dispersés, la forme "Freely dispersed" et les "mycelial

clumps" sont rencontrées. La première forme c’est des hyphes indépendants dispersés,

la seconde est une masse ou agrégats de mycélium. Les actinobactéries donnant des

hyphes en pellets, posent en fermentation des problèmes de limitation de diffusion de

l’oxygène et des nutriments à travers l’hyphe. Ceci engendre une diminution de la

croissance et peut conduire à une autolyse. Ce point doit être pris en considération,

pour éviter ce genre de problème lors des fermentations industrielles. Heureusement,

pour plusieurs souches productrices de métabolites secondaires, la forme "Clups" ou

masse est la prédominante dans les fermenteurs (90% des cas) (Perry et al., 2004).

Les colonies formées par les actinobactérie sur milieux solides sont

caractéristiques, elles résultent de l’accumulation des hyphes ramifiés et non pas des

cellules comme c’est le cas chez les bactéries non filamenteuses. Le diamètre des

colonies est de 1 à 4 mm. L’aspect des colonies est compact, sec, lisse ou rugueux en

chou-fleur à contours lisse ou échancré. Elles sont très souvent pigmentées en blanc,

crème, jaune, violet, rose, gris, etc. (Perry et al., 2004).


7

Figure 01 : Morphologie des différentes chaines de sport chez les streptomycètes

(Madigan et al., 2011).

2.3. Génétique

La taille de l’ADN des actinobactéries est de 3.7 Méga Daltons c’est à dire deux fois

celui de E. coli, la durée de réplication de l’ADN est de 50 à 65 minutes. Les bactéries

actinomycètales possèdent un remarquable degré de variabilité génétique due à des

réarrangements du génome à cause de plusieurs types de mutations essentiellement

chromosomiques, les plasmides peuvent aussi être sujets à des réarrangements. À la

suite de croisements des actinobactéries, des parties du chromosome de la souche

donneuse peuvent devenir plasmides dans la souche receveuse. Ces derniers jouent un

rôle de régulation dans la synthèse des antibiotiques. Il est rare de trouver des gènes

codant pour la biosynthèse d’antibiotiques localisés sur le plasmide. Ils sont

normalement chromosomiques, regroupés en plusieurs unités de transcription, ils ont

pour voisinage des gènes de régulation spécifiques (Chun et al., 1997).

Les genres d’actinobactéries peuvent être définies par l’étude du GC %, qui

représente le nombre de paires de base guanine-cytosine pour 100 paires de base dans

l’ADN, mais les espèces ne sont pas identifiées par cette technique.


8

Historiquement, la classification des bactéries était basée sur la similarité des

caractères phénotypiques. Bien que cette méthode ait donné toute satisfaction, elle est

coûteuse, lente et pas assez précise pour permettre la distinction entre les organismes

les plus proches. L’étude des acides nucléiques a apporté des renseignements plus

précis. Des auteurs insistent cependant, sur la nécessité de jumeler les études

phénotypiques et moléculaires pour une identification encore plus précise

(Goodfellow, 2004).

2.4. Cycle de développement du genre Streptomyces

Les actinobactéries ont un cycle de développement complexe (Figure 2). Il

commence par la germination d’une spore qui donne un mycélium primaire ou (MS)

formé d’hyphes qui se ramifient. Le développement du mycélium du substrat vers la

partie superficielle donne le mycélium secondaire ou (MA). Les extrémités des

hyphes aériens se différencient pour former des spores, qui sont des agents de

dissémination (Kim et al., 2004).

Figure 02 : Cycle de développement de Streptomyces sur milieu solide

(Delaunay et al., 2003).

2.5. Importance des actinobactéries

Les actinobactéries sont les microorganismes les plus recherchés pour leur

capacité de produire beaucoup de métabolites primaires et secondaires (Barakat et


9

al., 2002). En plus de leur rôle dans la décomposition de la matière organique (Hoster

et al., 2005). Ils sont connues pour leur production de substances biologiquement

actives telles que les phytohormones (El-Mehalawy et al., 2004), les antibiotiques, les

vitamines et les enzymes (de Boer et al., 2005) et des composés antifongiques. Ces

derniers sont également impliqués dans le contrôle phytopathologique. Certaines

espèces ont la capacité de solubiliser le phosphore (Crawford et al., 1993).

2.5.1. Production des substances antimicrobiennes

L’augmentation des multi-résistants aux antibiotiques a créé le besoin d’orienter la

recherche vers de nouvelles molécules antibiotiques. Les actinobactéries constituent

en effet une solution, elles produisent approximativement 2/3 de ces biomolécules

(Bulter et al., 2002). De nombreuses actinobactéries du sol synthétisent des

substances antimicrobiennes. Actuellement, 75% à 60% des antibiotiques produits par

les actinobactéries sont utilisés respectivement en médecine et en agriculture

(Riedlinger et al., 2006). Les streptomycètes sont à l’origine de 75% des

antibiotiques produits. Le genre Streptomyces est considéré en réalité l’un des sources

majeures des produits naturels bioactifs (Subramani et Aabersgreg, 2012).

En outre, Nocardiopsis sp. VITSVK 5(FJ973467) à une activité antifongique

contre Aspergillus fumigatus, A. flavus et A. niger par comparaison à

l’amphotéricine-B. De plus, il est actif vis-à-vis Candida cruzi, C. tropicans et C.

albicans par comparaison à la streptomycine (Vimal et al., 2009)

2.5.2. Biodégradation

Les actinobactéries sont des microorganismes qu’on rencontre sur tous les substrats

naturels courants, et en particulier le sol (Williams et al., 1984). Dans le sol, de

nombreuses actinobactéries sont saprophytes et participent à la dégradation de la

matière organique et à la formation de l’humus, Certaines espèces actinomycètales

peuvent dégrader l’acide salicylique produit par les plantes et les bactéries (Ishiyama

et al., 2004).

La lignine par exemple est un complexe biopolymérique résistant à la

dégradation microbienne, cependant quelques espèces de champignons et bactéries

dont les actinobactéries sont capables de la dégrader (Hasegawa et al., 2006).


10

3. Phytohormones

Les phytohormones sont des substances participent à la régulation de la croissance et

le développement des plantes. Principalement sont des auxines, des gibbérellines ou

de l’éthylène (Ahmad et al., 2005). Parmi les auxines, l’acide indole acétique (AIA)

occupe une place de choix. Il est issu du métabolisme du L-tryptophane chez de

nombreux microorganismes, bactéries (Muller et al., 1989), champignons (Stein et

al., 1990) et algues (Finnie et Van Staden, 1985). L’AIA est aussi produit par les

jeunes feuilles et les graines de végétaux à partir de réactions de transamination et de

décarboxylation du L-tryptophane. En général, le L-tryptophane constitue le

précurseur principal pour l’AIA (Chung et Tzeng, 2004).

3.1. Mode d’action

Les auxines sont les principaux régulateurs de la croissance des plantes produites par

(PGPR). Elles présentent de nombreuses fonctions physiologiques telles que

l’élongation des racines primaires, l’extension et la division cellulaire, la

différenciation des tissus, la formation des pigments, la stimulation de la fixation de

l’azote et la résistance aux différents facteurs de stress (Oves et al., 2013).

Plusieurs paramètres physiologiques chez la plante sont influencés par l’AIA,

à savoir l’élongation et la division cellulaire, la dormance apicale, la différenciation

des tissus vasculaires, la production d’éthylène. En plus de l’initiation et la

prolifération racinaire aboutissant ainsi à une meilleure disponibilité en eau et en

nutriments (Keyeo et al., 2011). Chez de nombreuses espèces de Streptomyces, l’AIA

aussi stimule la formation du mycélium et améliore également la production des

antibiotiques (Matsukawa et al., 2007).

3.2. Production de l’AIA chez les microorganismes

La capacité de produire l'acide indole-3-acétique (AIA) n'est pas limitée aux plantes.

Les microorganismes telluriques utilisent les sources naturelles de tryptophane et

améliorent la croissance des plantes (Narayana et al., 2009). Les bactéries

productrices des phytohormones sont considérées comme de véritables régulateurs de

la croissance végétale dans des conditions de stress salin (Perrig et al., 2007). La

majorité des bactéries du sol (plus 80 %) sont capables de sécréter les auxines surtout


11

l’acide indole acétique, l’acide indole butyrique ou d’autres composés similaires via le

métabolisme du tryptophane (Ramos-Solano et al., 2010).

3.3. Structure chimique

3.3.1. Auxines naturelles et synthétiques

Le terme « auxines » est utilisé au pluriel car d’autres substances, entre autres l’acide

ß-indole acétique, se sont révélées actives avec les tests biologiques initialement

définis pour quantifier l’AIA. Ces tests ne sont pas en fait absolument spécifiques de

l’AIA mais d’une famille de composés à action biologique commune : les auxines

(Péret et al., 2007). Il existe 2 types d'hormones.

3.3.1.1. Auxines d'origine synthétique

Il s’agit de molécules qui miment les effets des auxines naturelles. Ce sont

généralement des structures de type indolique ou bien de type : phénoxycarboxylique,

naphtalène acétique ou benzoïque. La plupart de ces molécules ont un noyau insaturé

et un groupement carboxylique.

l'acide naphtalène acétique l'acide benzoïque

Figure 03 : Structure chimique de deux auxines

synthétiques


12

3.3.1.2. Auxines d'origine naturelle

Sont produites par les plantes et certains microorganismes. On peut citer entres autres:

l'acide indole-3-acétique, l'acide 3-indole-butyrique et l'acide 4-chloro 3-indole

acétique, ou encore l'acide phénylacétique qui ne présente toutefois qu'une faible

activité auxinique.

l'acide indole-3-acétique l'acide 3-indole-butyrique

l'acide 4-chloro 3-indole acétique

Figure 04 : Structure chimique de quelques auxines

naturelles

3.4. Biosynthèse de l’AIA

La synthèse de l’AIA par des microorganismes implique une de ces trois voies

(Figure 05) : la première voie présente dans la formation d’acide indole acétique par

l’intermédiaire de l’acide indole-3-pyruvique et d’acide-3-indole-acétaldéhyde. Elle a

été rencontrée chez la majorité des bactéries comme Erwinia herbicola, les espèces

saprophytes du genre Agrobacterium et Pseudomonas; et certains représentants de

Bradyrhizobium, Rhizobium, Azospirillum, Klebsiella et Enterobacter.

La deuxième voie est la conversion du tryptophane en acide-3- indole-

acétaldéhyde, peut constituer une voie alternative dans laquelle la tryptamine est


13

formée. Cette voie est censée fonctionner chez Pseudomonas et Azospirilla (Khan et

al., 2014).

La troisième voie est la biosynthèse de l’AIA par la formation de l’indole-3-

acétamide, est signalée chez divers espèces de Streptomyces (Manulis et al., 1994), et

certaines bactéries phytopathogènes comme Agrobacterium tumefaciens,

Pseudomonas syringae et Erwinia herbicola et des Pseudomonades saprophytes telles

que Pseudomonas putida et P. fluorescens (Khan et al., 2014).

Figure 05 : La voie de la biosynthèse de l’AIA à partir de tryptophane par quelques

souches de Streptomyces et les voies de transformation des drivés d’indole en AIA

(Manulis et al., 1994)



14

1. Matériel biologique

Les souches d’actinobactéries employées dans cette étude proviennent de la collection

du Laboratoire de Microbiologie Appliquée (LMA), de l’université Larbi Ben M'hidi

Oum El Bouaghi (les souches ont été fournies par Dr Aouar Lamia). Ces isolats sont

désignés par les codes suivants : (AF1, AF2, AF3, FD14, PIN10, S. scabies). Elles ont

été isolées à partir de différentes rhizosphères au niveau de la région d’Oum Bouaghi

(Tableau 01). Les souches sont conservées dans du glycérol à -20°C.

Tableau 01 : Origine des souches d’actinobactéries employées dans l’étude.

Souche Désignation Type de sol Région Année d’isolement

Streptomyces AF1 Agricole Meskana 2014

Streptomyces AF2 Agricole Oum El Bouaghi 2014

Streptomyces AF3 Forestier Meskana 2012

Nocardiopsis FD14 Forestier Oum El Bouaghi 2014

Nocardiopsis PIN10 Agricole Oum El Bouaghi 2012

Streptomyces S. scabies Forestier Oum El Bouaghi 2013

2. Milieux de culture

Les repiquages, les cultures liquides d’actinobactéries et la production de l’AIA, ont

été réalisés sur plusieurs milieux de culture de composition différente ont été utilisés.

1- Milieu ISP2.

2- Milieu Bouillon Nutritif.

3- Milieu minimum amandé ou non en tryptophane.

La composition de ces milieux de culture est indiquée en annexe.

3. Repiquage et purification des souches

Le repiquage et la vérification de la pureté des souches est une étape essentielle, elle

permet d’obtenir des colonies bien isolées et pures. Pour obtenir ces colonies, on doit

ensemencer successivement des boites de Pétri coulées avec le milieu ISP2, pour la

réalisation de la méthode de strie d’épuisement pour chaque souche. Ensuite, ces


15

boites sont incubées à une température de 30°C pendant deux semaines, car les

actinobactéries sont caractérisées par une croissance relativement lente par rapport

aux autres bactéries (Shirling et Gottlieb, 1966).

4. Production et dosage de l'auxine

4.1. Criblage des souches productrices

Sur des boîtes de Pétri contenant le milieu ISP2 additionné de tryptophane 0,2 %,

nous avons déposé un volume de 10 μl d’une jeune suspension bactérienne de 2 jours

préalablement ensemencée dans le bouillon nutritif. Chaque boîte a été recouverte par

un disque stérile de papier filtre Whatman. Après incubation de 5 jours à 30°C, le

papier filtre a été retiré et plongé dans une solution Salkowski (Annexe). Ce réactif en

présence d’AIA donne une coloration rouge violacée. La production de l’AIA a été

révélée par la coloration rouge du disque (Naik et Sakthivel, 2006).

4.2. Préparation de l’inoculum

Le milieu utilisé est celui de bouillon nutritif. Des pré-cultures sont d’abord préparées

dans des erlenmeyers 250 ml à partir des spores raclées d’une boites de Pétri

contenant une culture âgée de trois semaines. L’incubation est effectuée dans une

cuve avec agitation permanente de 180 rpm à 30 ºC pendant 48 heures.

4.3. Production d’Acide Indole Acétique (AIA) en milieu liquide

La capacité de différentes souches étudiées à produire l’auxine AIA a été testée en

milieu minimum (MSM) (Annexe). Dans 30 ml de milieu MSM additionné de

différentes concentrations du tryptophane 2,5 mM, 5 mM, 7,5 mM. D’autre part le

milieu MSM sans tryptophane a été utilisé pour vérifier la production de l’AIA en

l’absence de leur précurseur. Après préparation du milieu et une fois le tryptophane

est ajouté, les erlenmeyers sont recouvrés par le papier aluminium, les milieux ont été

inoculés par 1,5 ml de l’inoculum bactérienne puis incubés pendant 6 jours à 30 ºC et

à l’obscurité sous agitation à 180 rpm (Kumar, 2010).


16

4.4. Contrôle de la pureté des cultures

En aval de récupérer le surnageant, une méthode rapide consiste à observer entre lame

et lamelle une goutte de chaque culture sous un microscope optique à l’objectif (x

100) avec une goutte de huile de cèdre, sans fixation, dans le but de détecter des

éventuels contaminants.

5. Mise en évidence de l'auxine par réaction colorimétrique

5.1. Récupération du surnageant

Après incubation à l'obscurité, les cultures bactériennes ont été ensuite centrifugées à

4000 g pendant 15 min. Les surnageants sont traversés dans des flacons préalablement

recouvert avec le papier aluminium ensuite acidifiés à pH 2,5 avec du HCl 2M. Les

surnageants doivent être analysés le plutôt possible avant la dégradation de l'auxine

(le maximum c’est 30 min).

5.2. Détermination du poids

La concentration cellulaire a été exprimée en poids cellulaire sec, c-à-d après séchage

dans l’étuve. Le volume de culture prélevé est transvasé dans des tubes de 5 ml puis

centrifugé à 4000 g pendant 15 min. Le culot est ré-suspendu dans un volume égal

d'eau distillé stérile (lavage), puis ré-centrifugé à 4000 g pendant 15 min. Le

surnageant est éliminé et le culot est transvasé dans une boite de Pétri en verre

préalablement pesée (m0). La boite de Pétri est ensuite mise au four à 55 °C pour

séchage pendant au moins 48 heures, puis pesée jusqu'au poids constant (m).

Le poids sec est calculé selon l'équation suivante :

PS = m - m0.

m = poids de la boite de Pétri après séchage en g.

m0 = poids de la boite de Pétri vide en g.


17

5.3. Réaction de Salkowski

L’estimation de l’acide indole acétique (AIA) dans le surnageant a été réalisée par la

méthode colorimétrique décrite par Brick et al., (1991). Un 1 ml de surnageant a été

ajouté à 2 ml de réactif de Salkowski, ils ont été mis à l’obscurité pendant 30 min.

L’absorbance de la couleur rose résultante indique la production de l’AIA.

5.4. Dosage de l'auxine au spectrophotomètre

La coloration rose-rouge révèle la présence de l'auxine. La densité optique a été lue à

530 nm avec un spectrophotomètre UV-Visible (Rabhi, 2012). Les taux de l’AIA

libérés ont été calculés à partir de l’équation de régression de la courbe d'étalonnage

et exprimés en µg/ml. Le blanc est le milieu minimum non inoculé ou bien le

traitement contrôle dans le cas où le résultat obtenu est négatif (Khalid et al., 2001).

5.5. Courbe d’étalonnage

Une solution standard d’AIA (100 μg/ml) a été préparée. La courbe d’étalonnage a été

obtenue par l’ajout de 2 ml de réactif de Salkowski à des volumes de 0,1; 0,2; 0,3;

0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 et 1,0 ml de la solution standard dans des tubes à essai.

L’absorbance de ces solutions a été lue, à 530 nm après 30 min d’incubation, avec un

spectrophotomètre UV- Visible (Kumar, 2010) (Figure 4).

5.6. Analyse statistique

Pour l’évaluation de l’effet des souches d’actinobactéries étudiées, de la concentration

du tryptophane sur la production d’AIA, une ANOVA (analyse de la variance) à deux

facteurs ainsi que le test de Student et le teste de corrélation au seuil α < 0,05 ont été

réalisés par le logiciel Excel.

6. Développement de la chromatographie sur couche mince

Dans cette technique, la séparation est réalisée sur une plaque de gel de silice d’un

diamètre de (12 cm x 8 cm). On place la plaque dans la cuve saturée en vapeur de

solvant à l’avance, contenant la phase mobile. L’éluant utilisé dans cette expérience

est acétate d’éthyle selon la méthode décrite par Ahmad et al., 2005. Le solvant

monte par capillarité, et les différents constituants de l’échantillon déposé migrent


18

avec des vitesses différentes. Dans le cas idéal on obtient autant de tâches que les

constituants sur le trajet de migration de solvant. Lorsqu’il arrive presque en haut de

la plaque on sort celle-ci de la cuve et on laisse l’éluant s’évaporer. La durée de

développement dépend de la phase mobile, de la taille de la plaque et de la

température.

6.1. Révélation du chromatogramme

Après Séchage à l’air sous la hotte, la solution de Salkowski a été pulvérisée sur le

chromatogramme. La contacte de ce réactif avec les spots donne une coloration rose

violacée.



19


1. Repiquage sur milieu ISP2

Après la période d’incubation, les six souches (AF1, AF2, AF3, FD14, PIN10, S.

scabies) sont repiquées et ensuite conservées à 4 ° C (Photographie 01).

Photographie 01 : Souches d'actinobactéries repiquées

2. Criblage des souches productrices

Le criblage de l’ensemble des souches testées sur un milieu solide ISP2 additionné de

tryptone 0,2%, nous a permis de mettre en évidence la production de cette hormone

chez seulement quatre isolats (AF3, FD14, PIN10, S. scabies). La révélation de cette

production est traduite par le changement de la couleur du disque de papier

Whatmann en rouge on après avoir révélé avec le réactif Salkowski. Plusieurs études

ont rapporté la production des auxines chez les actinobactéries. En effet, les travaux

de Hamdali et al. (2008) montrent que cinq sur huit isolats d’actinobactéries ont été

susceptibles de produire de l’AIA in vitro.


20

Photographie 02 : Résultats de Criblage des souches, AF) résultat négatif ; Pin10)

résultat positif.

3. Contrôle de la pureté des cultures : observation microscopique

D’après les observations microscopiques qu’on a obtenu après 4 jours d’incubation,

nous distinguons que toutes cultures sont pures et on observe l’absence totale de

contamination, ainsi les cultures peuvent être utilisées pour l’extraction de

l’éventuelle auxine produite (Photographie 02).

Photographie 03 : L’observation microscopique avec un grossissement de 100 X.

4. Courbe étalon

Des solutions aqueuses à des concentrations de 10 à 100 μg/mL sont réalisées. Après

l’ajout de 2 ml de réactif de Salkowski à des volumes de 0,1; 0,2 jusqu’à 1,0 mL de la

solution standard d’AIA (100 μg/mL), une coloration rose se développe, qui sera

dosée à 530 nm (Photographie 04). Après 30 min d’incubation avec un


21

spectrophotomètre UV- Visible (Figure 08). Après avoir tracé le courbe étalon la

pente calculée est égale à 0,011.

Photographie 04 : Différentes concentrations de l'auxine.

Figure 06 : Courbe d’étalonnage de l’AIA.

5. Dosage de l'auxine

La détection de l’auxine est réalisée grâce à la réaction de Salkowski. Cette dernière

est spécifique aux auxines et les composés similaires. Les quatre souches ont montré

une réaction positive avec le réactif de Salkowski, l’apparition d’une coloration rose

reflète la présence de l’auxine (photographie 05).

La production de l’AIA est une caractéristique commune chez les PGPR. Les

quatre souches nécessitent du tryptophane pour la synthèse de l’auxine. Il est

considérée comme le précurseur physiologique des auxines chez les plantes

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 20 40 60 80 100 120

Den

sité

op

tiq

ue

à 5

30 n

m

AIA (μg/ml)


22

supérieures et la production microbienne (Purushothaman et al., 1974), et les

bactéries pourraient exploiter les exsudats racinaires pour former les régulateurs de

croissance. Ainsi, Jaeger et al. (1999) ont observé chez l’avoine une exsudation

importante de tryptophane à l’apex racinaire, où la microflore considérée dans cette

étude est significativement plus abondante. Cela suggère que ce précurseur de

l’auxine pourrait être utilisé par les bactéries pour synthétiser l’AIA et activer ainsi la

croissance des plantes.

L'analyse des données représentées dans le Tableau 02 montré que Le

meilleure production est obtenue avec la souche FD14 avec la concentration (2,5

mM), où elle est de l'ordre de 12,41 μg/mg PS. Donc FD14 c’est la souche la plus

productrice de l'AIA par rapport aux autres souches étudiées. Les concentrations (5

mM et 7,5 mM) du précurseur (Trp), les quantités d'auxine produites sont faibles,

elles sont égales à 9,65 et 6,15 μg/mL, respectivement. Il est probable que cette

souche provenait d’un sol rhizosphérique riche en Trp.

Photographie 05 : Réaction colorimétrique de la souche S. scabis.

Dans notre étude, la variation des concentrations d’acide indole-3-acétique

produits sont entre 5,30 ± 0,24 et 12,41± 0,73 μg/mg PS. Ces valeurs sont nettement

inférieures à celles obtenues par Aouar et al. 2016 (de 1,35 à 31,04 μg/mg PS),

Khamna (2009) et Chaihman et Lumyong (2011) qui sont comprises entre 5,5-144


23

μg/mL et 2,55 à 291,97 μg/mL d’auxine, respectivement. Avec les mêmes

concentrations en tryptophane. Ces quantités produites sont plus proches que celles

reportées par Mahandas et al. (2013) qui sont comprises entre 5,0 et 10,1μg/mL.

Aussi, les travaux d’Asghar et al. (2003) (0,33 et 11,40 μg/mL).


23

Souches Concentration

Trp (mM)

Répétitions DO

530 nm

AIA

μg/ml

AIA

30 ml

P.S. mg

culture

AIA

μg/mg PS

Moyenne Ecart-Type

FD14

2,5

A 0,125 11,36 340,90 29,4 11,59

12,41

0,73 B 0,124 11,27 338,18 26,7 12,66

C 0,122 11,09 332,72 25,6 12,99

5

A 0,081 7,36 220,90 20,5 10,77

9,65

1,09 B 0,074 6,72 201,81 21 9,61

C 0,079 7,18 215,45 25,1 8,58

7,5

A 0,042 3,81 114,54 18 6,36

6,15

0,60 B 0,055 5 150 22,6 6,63

C 0,048 4,36 130,90 23,9 5,47

S. scabies

2,5

A 0,081 7,36 220,80 29,3 7,53

7,68 0,17 B 0,086 7,81 214,30 28 7,65

C 0,079 7,18 225,45 28,6 7,88

5

A 0,096 8,72 261,81 27,2 9,62

9,81

0,25 B 0,103 9,36 280,90 27,8 10,1

C 0,101 9,18 275,40 28,3 9,73

7,5

A 0,046 4,18 125,45 24,1 5,20

5,30

0,24 B 0,048 4,36 130,90 25,5 5,13

C 0,049 4,45 133,63 23,9 5,59


24

AF 3

2,5

A 0,133 11,18 335,45 27,6 12,15

12,38

0,66

B 0,127 11,54 346,36 29,2 11,86

C 0,132 12 360 27,4 13,13

5

A 0,106 9,63 289,09 31 9,32

10,00

0,90 B 0,114 10,36 310,90 32,2 9,65

C 0,121 11 330 29,9 11,03

7,5

A 0,061 5,54 139,09 28,7 4,84

5,97

0,97

B 0,075 6,81 204,54 31,3 6,53

C 0,068 6,18 185,45 28,4 6,52

PIN 10

2,5

A 0,106 9,63 288,9 24,5 11,79

10,31

1,33 B 0,098 8,72 261,6 26,2 9,98

C 0,095 8,63 259,09 28,2 9,18

5

A 0,072 6,54 196,36 24,1 8,14

8,29

0,47 B 0,086 7,81 234,54 28,5 8,28

C 0,083 7,54 226,36 26,7 8,47

7,5

A

pas de production d'AIA

B

C

Tableau 02 : Résultats du dosage de l'auxine au spectrophotomètre


25

Excepté, la souche PIN 10 elle n’a pas produit de l’auxine à la concentration de

7,5 mM. Il est possible que cette concentration soit potentiellement toxique pour la souche

ou encore cette souche provient d’une rhizosphère pauvre en Trp.

6. Étude statistique

À partir de ces résultats, on cherche à savoir si la concentration du tryptophane ou la

souche affecte la production d’auxine, pour cela une analyse de variance à deux facteurs a

été effectuée.

6.1. ANOVA a deux facteurs

Facteur 1 : concentration de tryptophane

Hypothèse

H0 : toutes les moyennes de la concentration sont égales.

H1 : il existe au moins deux moyennes qui sont différentes de manière significatives.

Facteur 2 : la souche

Hypothèse

H’0 : toutes les moyennes de la concentration sont égales.

H’1 : il existe au moins deux moyennes qui sont différentes de manière significatives.

Dans le Tableau 03 sont représentés les résultats statistiques de l’ANOVA deux facteurs,

pour un seuil de 0,05.

RAPPORT

DÉTAILLÉ

Nombre

d'échantillons Somme Moyenne Variance

FD14 4 28,21 7,0525 28,6673583

S. scabies 4 22,79 5,6975 17,820825

AF 3 4 28,35 7,0875 29,3248917

PIN 10 4 18,6 4,65 29,5100667

0 Mm 4 0 0 0

2,5 mM 4 42,78 10,695 5,0063

5 Mm 4 37,75 9,4375 0,60569167

7,5 mM 4 17,42 4,355 8,5631


26

Source des

variations

Somme des

carrés

Degré de

liberté

Moyenne

des carrés F Probabilité

Valeur critique

pour F

souche 16,5800188 3 5,52667292 1,91711563 0,19735625 3,86254836

concentration 290,024169 3 96,6747229 33,5349359 3,2548E-05 3,86254836

Erreur 25,9452563 9 2,88280625

Total 332,549444 15

6.1.1. Effet de souche

Pour un seuil de 0,05 on observer que le F calculé est inférieur à la valeur critique de F

(1,91 < 3,86), on accepter l’hypothèse H0, cette résultat indique qu’il n’y a pas une

différence significative entre les moyennes de l’auxine produite à partir des quatre

souches d’actinobactéries. Donc la souche ne possède aucun effet sur la production

d’auxine.

6.1.2. Effet de concentration

Le F observé est supérieur au F critique (33,53 > 3,86), pour le même seuil 0,05, donc H0

est rejeté, ce qui indique qu’il y’a une différence significative entre les moyennes de la

concentration, donc la concentration du tryptophane affecte la production de l'auxine,

Aussi les études d’Omer et al. (2004) ont montré que la présence du tryptophane stimule

la production de l’AIA.

L’absence de la production de l’auxine en l’absence du Trp confirme que ces

souches produisent de l’auxine via une voie de biosynthèse Trp dépendante. Cependant, la

capacité de certaines actinobactéries à produire de l’AIA en absence du Trp a été rapporté

par (de Oliveira et al., 2010).

6.2. Test de Student

Afin de déterminer les concentrations qui présentent des différences significatives entre

elles, le test de Student devient nécessaire. Les tableaux suivants 4, 5 et 6 représentent les

résultats du test de Student pour une comparaison deux a deux entre les moyennes des

concentrations d’auxine obtenues avec différentes concentrations en tryptophane.


27

Tableau 04 : Comparaison entre les deux concentrations : 2,5 mM et 5 mM.

Test d'égalité des espérances : observations pairées

2,5 mM 5 Mm

Moyenne 10,695 9,4375

Variance 5,0063 0,60569167

Observations 4 4

Coefficient de corrélation de

Pearson 0,12077845

Différence hypothétique des

moyennes 0

Degré de liberté 3

Statistique t 1,10381804

P(T<=t) unilatéral 0,17513043

Valeur critique de t (unilatéral) 2,35336343

P(T<=t) bilatéral 0,35026086

Valeur critique de t (bilatéral) 3,18244631

Tableau 05 : Comparaisant entre les deux concentration : 2,5 mM et 7,5 mM .


2,5 mM 7,5 mM

Moyenne 10,695 4,355

Variance 5,0063 8,5631

Observations 4 4


Pearson 0,23557168


moyennes 0








28

Tableu 06 : Comparaisant entre les deux concentration : 5 mM et 7,5 mM .


5 Mm 7,5 mM

Moyenne 9,4375 4,355

Variance 0,60569167 8,5631

Observations 4 4


Pearson 0,97175428


moyennes 0







À partir des résultats représentés nous remarquons que les P(T<=t) bilatéral de

0,029 (2,5 mM et 7,5 mM), 0,018 (5 mM et 7,5 mM), sont inférieures au seuil 0,05 ce qui

nous permet de conclure y’a une différence significative entre les moyenne comparées

mais la valeur de P(T<=t) bilatéral 0,35 (2,5 mM et 5 mM) est supérieur au même seuil,

indique qu’il n’y a pas une différence significative entre les moyennes de l’auxine

produite avec les deux concentrations (2,5 mM et 5 mM). De ce fait, nous concluons que

la concentration d’AIA la plus élevée est produite dans le milieu avec 2,5 mM de Trp

(12,41 μg/mg PS), est supérieur de manière non significative avec la concentration d’AIA

produit dans le milieu avec 5 mM (9,43 μg/mg PS), et que ce dernier lui aussi supérieur

de manière hautement significative avec la concentration produite dans le milieu avec 7,5

mM (4,35 μg/mg PS).

6.3. Test de corrélation

Notre étude a montré qu’il y a une corrélation négative ente la concentration du Trp et la

quantité de l’auxine produite, par ce que les valeurs de r sont comprises entre -0,52 et -

0,99. Contrairement Leguault et al. (2011), ont trouvé que l’augmentation de la

concentration en Trp engendre une augmentation dans la production de l’auxine.


29

Tableau 07 : Représentation des résultats statistiques de Teste de corrélation.

concentration

du Trp FD14 S. scabies AF 3 PIN 10

concentration

du Trp 1

FD14 - 0,99767914 1

S. scabies - 0,52744614 0,58407106 1

AF 3 - 0,98913629 0,99685006 0,6466067 1

PIN 10 - 0,94353013 0,96389786 0,7791187 0,9819795 1

D’autre part nous constatons que la concentration possède un effet sur la

production d’auxine et n’affecte pas la croissance de la souche. Selon Sarwar et

Frankeberger (1994), la biosynthèse de l’auxine chez les microorganismes nécessite une

quantité adéquate du tryptophane, ainsi, les fortes concentrations ont un effet négatif sur

la production de l’auxine et/ou sur la croissance du microorganisme.

7. Mise en évidence de l’auxine par analyse chromatographique

Photographie 06 : Résultat de la chromatographie.

Après la révélation, on observe la position finale des spots (ou taches) qui

caractérisent la molécule de l’auxine. On lui attribue une valeur, le rapport frontal. Ce Rf


30

est le rapport de la distance parcourue par la molécule par la distance parcourue par

l’éluant, cet éluant entraine le déplacement des différentes taches à des vitesses différentes

(Photographie 06). On remarque que le spot d’AIA commerciale présente un Rf égale à

0,84, ainsi elle se déplace plus vite que les spots d’auxines extraites à partir des souches

ayant la même valeur de Rf qui est égale à 0,71. Cette différence de Rf est certainement

due à la différence en poids moléculaire, il est probable que l’AIA commerciale est plus

pur que l’auxine extraite à partir des souches d’actinobactéries. Ainsi, nous constatons que

les souches produisent la même molécule d’auxine par comparaison de leur Rf.

Conclusion générale et

perspectives

Conclusion et perspectives

31

Notre travail est basé sur l'étude de six souches d'actinobactéries

rhizosphériques AF1, AF2, AF3, FD14, PIN10 et S. scabies, précédemment isolées

pour leur capacité à produire de l’auxine in vitro en présence de différentes

concentrations de tryptophane (2,5 ; 5 et 7,5 mM). Le criblage des souches

productrices sur un milieu solide ISP2 additionné de tryptophane 0,2%, nous a permis

de mettre en évidence la production de l’AIA chez quatre souches à savoir AF3,

FD14, PIN10, S. scabies. Donc ces souches ont été sélectionnées pour la suite de l’étude.

Les résultats montrent que toutes les souches synthétisent l’AIA suivant une

voie Trp-dépendante, car le Trp considéré comme un des précurseurs de la production

d'auxine. Cette dernière est détectée par une réaction colorimétrique de Salkowski. Le

dosage repose sur la mesure de la densité optique à 530 nm. Les quantités d'auxine

produites varient entre 5,30 ± 0,24 et 12,41 ± 0,73 μg/mg PS. Les résultats obtenus

montrent que la souche FD14 est la meilleure productrice et atteint son maximum de

production avec la concentration (2,5 mM) du Trp avec une valeur de 12,41 ± 0,73

μg/mg PS, au-delà de cette concentration la quantité d'AIA diminue.

L’analyse de la variance à deux facteurs montre que les concentrations de

tryptophane employées dans la fermentation affectent négativement la production

d’auxine chez les souches actinobactéries testées. Les fortes concentrations ont un

effet négatif sur la production de l’auxine et/ou sur la croissance du microorganisme.

À partir des résultats de la chromatographie sur couche mince nous constatons que les

souches produisent la même molécule d’auxine.

Cette étude préliminaire a montré clairement la capacité de certaines souches

d’actinobactéries rhizosphériques appartenant aux genres Streptomyces et

Nocardiopsis à produire de l’auxine en présence de différentes concentrations en Trp.

Les résultats de la présente étude ne constituent qu’une initiation à la

recherche des composés auxiniques produits par des actinobactéries. À la suite de ces

résultats, il serait intéressant d’approfondir cette étude afin de réaliser :

- L’identification biochimique et physiologique des souches.

- Quantifier l'auxine avec des techniques plus précises telle que HPLC.

- D’atteindre la structure exacte des molécules en utilisant des techniques

instrumentales les plus sophistiqués telles que la spectrométrie de masse.

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Annexe

Milieux de cultures

Bouillon nutritif

Peptone 10 g

Extrait de levure 5 g

NaCl 5 g

Eau distillé 1 000 ml

pH = 7,3

ISP 2 (YMEA + CaCO3)

Extrait de levure 4 g

Extrait de malt 10 g

Glucose 4 g

CaCO3 1 g

Agar 20 g

Eau distillée 1 000 m l

pH = 7, 3

Milieu minimum (MSM)

Amidon soluble 5 %

Asparagines 0, 5 g

K2HPO4 0, 5 g

MgSO4 0, 2 g

FeSO4 5 ml

Eau distillée 1 000 m l

Les réactifs

Réactif Salkowski

FeCl3 6, 75 g / 50 ml d’eau

H2SO4 150 ml

Eau distillée 250 ml

لملخصا

كانت سواء تفرزها التي المواد تنوع حيث من الدقيقة الكائنات أنواع أهم أحد الخيطية البكتيريا تعتبر

، بالجذور المحيطة التربة الأنظمة؛ هذه بين من البيئية، الأنظمة من العديد تغزو البكتيريا هذه. ثانوية أو أولية

إنتاج على قادرة انها كما النباتات، من الكثير نمو تعزز بالتالي و التربة تخصيب في حيويا دورا تلعب كما أنها

.(AIA) أهمها عديدة انواع على يحتوي الأخير هذا الأوكسين، بينها من التي نباتية هورمونات

الخيطية تنتمي لجنسين مختلفين هما البكتيريا من سلالات أربع كفاءة فحص تم لهذا الغرض

(Nocardiopsis و Streptomycesمعزولة ) من حيث القدرة الإنتاجية بالجذور المحيطة التربة من مسبقا

- mM 0- mM 5,2 (مختلفة من حيث تركيز التربتوفان زراعية أوساط أربعة في (AIA)للهرمون النباتي

mM2 - mM 5,2( لسالكوسكي اللوني التفاعل على يعتمد، كما ان تحديد تركيز الهرمون(Salkowski) ،

بعد ظهور اللون الوردي وقياس التركيز بواسطة جهاز المطياف الضوئي وبالإسقاط على منحنى المعايرة،

لإنتاج الأكسين، بحيث كانت الكميات كمادة أولية التريبتوفان وجود سلالات الاربعة تستلزم أن تبين وقد

كانت الأكثر إفرازا بمقدار FD14سلالة فال .μg/mg PS 15,21و 5,30 بين تتراوح عليها المتحصل

15,21 μg/mg PS في وسط ذو تركيز mM 5,2 .

التربتوفان يأثر على إنتاج الأكسين بعد تطبيق تحليل التباين ذو العاملين على النتائج نستنتج ان تركيز

الكروماتوغرافي يبين أن فصل الهرمونات المنتجة من طرف السلالات الاربع بتقنية بصفة مباشرة، اما

السلالات السابقة تفرز نفس النوع من الهرمون النباتي.

التريبتوفان. ،AIA ، الأوكسين،Streptomyces، Nocardiopsis الخيطية، البكتيريا المفتاحية : الكلمات

Nom : ANNAB

Prénom : Amir

Nom : DAFRI

Prénom : Fares

Date de soutenance :

13 / 06 / 2016

Thème

Production de l'auxine chez des actinobactéries rhizosphériques appartenant aux

genres Streptomyces et Nocardiopsis

Résumé

Les actinobactéries font partie des microorganismes les plus importants par leurs diversités par rapport

aux métabolites qu'elles sécrètent, sois primaires ou secondaires. Ces bactéries se trouvent dans plusieurs

écosystèmes parmi lesquels la rhizosphère, où elle jour un rôle biotique dans la fertilisation du sol, et donc

aident le développement des plantes. En plus, ces bactéries sont capables de synthétiser des hormones

végétales comme les auxines, parmi lesquelles on cite l’acide indole 3- acétique l’AIA.

Quatre souches d’actinobactéries ont été vérifiées pour leur capacité à produire de l’AIA. Ces

souches appartiennent à deux genres; Streptomyces et Nocardiopsis, et sont isolées préalablement du sol

rhizosphérique. La synthétise de l’AIA a été vérifiée dans un milieu contenant différentes concentrations

en tryptophane (0 mM, 2,5 mM, 5mM, 7,5mM). La mise en évidence de l’AIA est basée sur la réaction

colorimétrique de Salkowski. Après l'apparition de la couleur rose et la mesure de la concentration par un

spectrophotomètre. Il s'est avéré que les quatre espèces ont besoin du Trp comme précurseur pour la

production de l'auxine. Les quantités d’auxine produites varient entre 5,30 et 12,41 μg/mg PS. La souche

FD14 est la meilleure productrice et atteint son maximum de production avec la concentration (2,5 mM)

du Trp avec une valeur de 12,41 μg/mg PS.

Après l’application de l’analyse de la variance à deux facteurs, nous concluons que la

concentration de tryptophane affecte négativement la production d’auxine, d’autre part la séparation de

l’AIA extraite par la CCM indique que les quatre souches produisent la même molécule d’auxine.

mots clés : Actinobactéries, rhizosphère, auxine (AIA), tryptophane, Streptomyces, Nocardiopsis

Laboratoire de recherche : Laboratoire de Microbiologie. Faculté des Sciences Exactes et Sciences de la

Nature et de la Vie. Université Larbi Ben M’hidi Oum-el- Bouaghi.

Devant le jury

Présidente : Mr MEDJOUDJ H. M.C.B. Université OEB

Rapporteur : Mme AOUAR Lamia M.C.A. Université OEB

Examinateur : Mme CHETTIBI F M.A.B. Université OEB

Documents

Production de l'auxine chez des actinobactéries