LABORATORIJALABORATORIJAzaza

NEUROFIZIOLOGIJU NEUROFIZIOLOGIJU

ProfProf. dr OLIVERA . dr OLIVERA STANOJLOVISTANOJLOVIĆĆ

Cilj nauke je: Cilj nauke je:

Metoda nauke je metoda smelih I oštroumnih nagadjanja i strogih pokušaja njihovog opovrgavanja

Naučni rezultati ne mogu da budu opravdani, oni mogu samo da budu kritikovani i proveravani i time da budu bliže istini od rezultata suparničkih teorija

.

NauNauččna obelena obeležžjaja

ISTRAISTRAŽŽIVANJE JE AKTIVNOST KOJA KONTRIBUIRA U IVANJE JE AKTIVNOST KOJA KONTRIBUIRA U RAZUMEVANJE FENOMENA RAZUMEVANJE FENOMENA

1.

2.

3.

4.

3.

Problem/Problem/PitanjePitanjeObservObservacijaacija//IstraIstražživanjeivanjeFormulFormulacijaacija HHiipotpotezeeze

EEksksperimentperimentPrikupljanje iPrikupljanje i AnalAnaliizzaa ReRezultatazultata

ZakljuZaključčak ak Diskusija oDiskusija o ReRezultatimazultatima

KoraciKoraci uunaunauččnom metodunom metodu::

KoraciKoraci uuNauNauččnom metodunom metodu

1.1. Problem/Problem/PitanjePitanje::ZapoZapoččinje zapainje zapažžanjem,anjem,

Postavljanjem i definisanjem Postavljanjem i definisanjem problema. problema.

Problem/Problem/PitanjePitanje::

1.1.

Problem - svest o neznanju – pitanje na koje, u sistemu raspoloživog naučnog znanja nema odgovora

??..

??..

??..

KoraciKoraci uuSSnaunauččnom metodunom metodu

2. 2. ObservObservacijaacija//IstraIstražživanje ivanje : :

3. 3. FormulFormulacijaacija HHiipotpotezeeze: : PrPredvidetiedvideti mogumogućći odgovor na i odgovor na

problem ili pitanjeproblem ili pitanje

KoraciKoraci uuNauNauččnom metodunom metodu

KoraciKoraci uuNauNauččnom metodunom metodu

4. 4. EEksksperimentperiment::

Z- STRANE, PROMENLJIVESTRANE, PROMENLJIVE

Njima se u eksperimentu ne manipuliše,one moguPojedinačno/ Međusobnoj interakciji,da proizvedu efekat na zavisnoj promenljivoj

B e o g r a d, april 2008. godineNa osnovu člana 119. Statuta Medicinskog fakulteta u Beogradu,

saglasno članu 138. Zakona o veterinarstvu (Sl. glasnik RS br.91/2005), na predlog Etičkog komiteta Medicinskog fakulteta u

Beogradu, Nastavno naučno veće Medicinskog fakulteta u Beogradu, na sednici održanoj dana 25.03. 2008.godine donosi

P R A V I L N I K

za rad sa eksperimentalnim životinjama na Medicinskom fakultetu u Beogradu

•OPŠTE ODREDBE

Član 1Ovim pravilnikom definišu se zaštićene životinjske vrste, eksperimentalne procedure (etičke i neetičke), principi etičnosti eksperimentalnog rada na životinjama i osposobljenost istraživača za takav rad na Medicinskom fakultetu u Beogradu. Pravilnik zarad sa eksperimentalnim životinjama na Medicinskom fakultetu u Beogradu (u daljem tekstu Pravilnik) posebno utvrđuje način formiranja, sastav, delokrug rada, zadatke i pravila rada Etičkog komiteta za rad sa eksperimentalnim životinjama koji se osniva na Medicinskom fakultetu, njegove zadatke, pravila rada, sastav i način formiranja, postupak dobijanja dozvole za eksperimentalni rad na životinjama od strane Etičkog komiteta kao i postupak u slučaju nepoštovanja pravila rada Etičkog komiteta i odluka donetih na osnovu Pravilnika.

ZAKONSKI PROPISI :ZAKONSKI PROPISI :

••Evropska konvencija o zaEvropska konvencija o zašštiti kititi kiččmenjaka koji se koriste u ogledima, edukaciji testiranjimamenjaka koji se koriste u ogledima, edukaciji testiranjima

••Zakon o dobrobiti Zakon o dobrobiti žživotinja ivotinja

••Pravilnik o radu sa oglednim Pravilnik o radu sa oglednim žživotinjamaivotinjama

••Interna institucijonalna dokumenta, pravilnici i upustva za rad Interna institucijonalna dokumenta, pravilnici i upustva za rad sa oglednim sa oglednim žživotinjamaivotinjama

Ogledna Ogledna žživotinjaivotinja::svaki kisvaki kiččmenjak koji se koristi u menjak koji se koristi u

istraistražživaivaččkim, edukativnim kim, edukativnim programima i tetsiranjuprogramima i tetsiranju

TERMINOLOGIJA PODELE OGLEDNIH TERMINOLOGIJA PODELE OGLEDNIH ŽŽIVOTINJAIVOTINJA

GENETIGENETIČČKAKA

1. Autbredne kolonije (4 generacije)2. Inbredni zapati-sojevi (20 gen.-98%, 40 gen.-99,5%)3. F1 hibridi - parenje 2 inbredna soja4. Koisogene i kongene životinje -inbredni sojevi koji se od roditelja razlikuju za jedan genski lokus (spontana mutacija ili indukovana posebnom šemom parenja)5. "Knock out" - Indukovana mutacija na željenom genskom lokusu genetičkim manipulacijama6. Transgene životinje - poseduju strane segmente DNK molekula u svakoj ćeliji svoga tela

GNOTOBIOTIGNOTOBIOTIČČKAKA

1. Aksenične - slobodne od mikroorganizama2. Gnotobiotičke - definisana mikroflora3. SPF ("Specific Pathogen Free", ogledne životinje slobodne od specifičnih patogena)4.VAF ("Virus Antibody Free", ogledne životinje slobodne od antitela na viruse)5.Konvencionalne životinje (poseduju nedefinisanu mikrofloru, mogu, a i ne mora da budu slobodne od specifičnih patogena)

Klasifikacija modela Klasifikacija modela bolestibolesti

• Većina laboratorijskih animalnih modela razvijena je za ispitivanje uzroka, prirode i terapije bolesti životinja i ljudi.

- Modeli indukovanih (eksperimenatlnih) bolesti– Modeli spontanih (genetskih) oboljenja– Transgeni modeli bolesti– Negativni modeli bolesti– Orfanski modeli bolesti

Šta je model?Model je objekat imitacije, osoba

ili stvar koja liči ili preslikava nešto!

11.

2. 3.Induced mutant models

……..razlirazliččitiitianimalni modelianimalni modeli uu

istraistražživanjuivanjuresearchresearch……

KOJU KOJU ŽŽIVOTINJU ODABRATI IVOTINJU ODABRATI ??

• Jednostavno gajenje, nega i rukovanje

• Jeftino održavanje

• Visok reproduktivni kapacitet (kratka

gestacija, veliko leglo/okot i brz nastup

fertilnog estrusa po partusu)

• Kratak generacijski period i dužina života

• Postoji bogata baza podataka za većinu

glodara

• Postoji veliki broj definisanih zapata i sojeva

• Jednostavno za gajenje u posebnim uslovima

(posebni genetički i mikrobiološki zahtevi)

• Razlike među vrstama, zapatima i sojevima

su vrlo pogodne za brojne eksperimentalne

modele, tj. za različito dizajniranje oglednih

procedura

OBIM I DISTRIBUCIJA TIPOVA ISTRAOBIM I DISTRIBUCIJA TIPOVA ISTRAŽŽIVANJA IVANJA

PREMA VRSTAMA PREMA VRSTAMA ŽŽIVOTINJAIVOTINJA

PACOVPACOV

Prosečan životni vekTelesna masa mužjakaTelesna masa ženkiMasa pri rođenjuPolna zrelost ženkePolna zrelost mužjakaEstrusni ciklusGestacijaZalućenjePočetak unošenja suve hraneVeličina leglaSpremnost za parenje po partusuDužina iskorišćavanja u priplodu ženkeDužina iskorišæavanja u priplodu mužjakaParenjeHromozomski broj (2n)Rektalna temperaturaFrekvenca disanjaFrekvenca rada srcaVolumen krvi - %

Prosečno 3 god300 do 400 g25o do 300 g5 do 6 g100 dana, 200 g100 dana, 300 g5 dana, 20 do 22 dana, 21 dana21 dan, 40do 50 g12 dana8 do 12, Odmah po partusu1 godina1 godina1 mužjak:1 ženka ili 1M:3Ž do 4Ž4237,5 C92 proseèno, 80 do 150350 proseèno, 260do 45050 do 65 ml/kg, 6 do 7%5,5 ml/kg

PACOVPACOVProsečan životni vekTelesna masa mužjakaTelesna masa ženkiMasa pri rođenjuPolna zrelost ženkePolna zrelost mužjakaEstrusni ciklusGestacijaZalućenjePočetak unošenja suve hraneVeličina leglaSpremnost za parenje po partusuDužina iskorišćavanja u priplodu ženkeDužina iskorišæavanja u priplodu mužjakaParenjeHromozomski broj (2n)Rektalna temperaturaFrekvenca disanjaFrekvenca rada srcaVolumen krvi - %

Prosečno 3 god300 do 400 g25o do 300 g5 do 6 g100 dana, 200 g100 dana, 300 g5 dana, 20 do 22 dana, 21 dana21 dan, 40do 50 g12 dana8 do 12, Odmah po partusu1 godina1 godina1 mužjak:1 ženka ili 1M:3Ž do 4Ž4237,5 C92 proseèno, 80 do 150350 proseèno, 260do 45050 do 65 ml/kg, 6 do 7%5,5 ml/kg

Prosečan životni vek:Telesna masa mužjaka:Telesna masa ženki:Masa pri rođenju:Polna zrelost ženke:Polna zrelost mužjaka:Estrusni ciklus:Gestacija:Zalućenje:Početak unošenja suve hrane:Veličina leglaSpremnost za parenje po partusuDužina iskorišćavanja u priplodu ženkeDužina iskorišæavanja u priplodu mužjakaParenjeHromozomski broj (2n)Rektalna temperaturaFrekvenca disanjaFrekvenca rada srcaVolumen krvi - %

Prosečno 3 god300 do 400 g25o do 300 g5 do 6 g100 dana, 200 g100 dana, 300 g5 dana, 20 do 22 dana, 21 dana21 dan, 40do 50 g12 dana8 do 12, Odmah po partusu1 godina1 godina1 mužjak:1 ženka ili 1M:3Ž do 4Ž4237,5 C92 prosečno, 80 do 150350 prosečno, 260do 45050 do 65 ml/kg, 6 do 7%5,5 ml/kg

Prosečan životni vekTelesna masa mužjakaTelesna masa ženkiMasa pri rođenjuPolna zrelost ženkePolna zrelost mužjakaEstrusni ciklusGestacijaZalučenjePočetak unošenja suve hraneVeličina leglaSpremnost za parenje po partusuDužina iskorišćavanja u priplodu ženkeDužina iskorišćavanja u priplodu mužjakaParenjeHromozomski broj (2n)Rektalna temperaturaFrekvenca disanjaFrekvenca rada srca

Prosečno 1,5 god20 do 40 g25 do 40 g1 do 1,5 g50 do 60 dana,60 dana, 20 do 35 g4 do 5 dana, poliestriène životinje17 do 21 dan, 16 do 21 dana, 10 do 12 g10 dana1 do 23, 10 do 12 prosečnoPostpartalno6 do 10 legla18 meseci1 mužjak:1 ženka ili 1M:3Ž4037,5 C138 prosečno, 90 do 180470 prosečno, 300 do 65070 do 80 ml/kg, 6 do 7%7,7 ml/kg

MIMIŠŠ

držanje pacova za bazu repa

NaNaččini drini držžanja pacovaanja pacova

1. HRANA HRANA

2. VODA2. VODA

3. TERMPERATURA3. TERMPERATURA

3. VLA3. VLAŽŽNOSTNOST

4. OSVETLJENJE4. OSVETLJENJE

5. PSIHIPSIHIČČKA UDOBNOSTKA UDOBNOST(ODSUSTVO STRAHA, STRESA)

6. VentilacijaVentilacija: 10 - 15 izmena vazduha/čas

7. Osvetljenjesvetljenje: fotoperiod, fotointenzitet,

325 – 400 lux 1 m iznad poda

7. BukaBuka – 85 dB, auditorni stres, strah

8. Bihevioralne potrebeBihevioralne potrebe – strukturno,

auditorno, olfaktorno i socijalno obogaćivanje

smeštajnog prostora ( familijarnost),

9. ZDRAVLJE ZDRAVLJE (BEZ BOLESTI I POVREDA)

10. KONTAKT SA DRUGIM KONTAKT SA DRUGIM ŽŽIVOTINJAMA IVOTINJAMA pogledom, oglašavanjem, mirisom,

LABORATORIJSKI USLOVI:LABORATORIJSKI USLOVI:

NANAČČIN SMEIN SMEŠŠTAJA TAJA OGLEDNIH OGLEDNIH ŽŽIVOTINJAIVOTINJA

KAVEZNIKAVEZNI SMEŠTAJ

VIVIŠŠEE ETAŽNI (BATERIJE)

SPECIJALNI KAVEZISPECIJALNI KAVEZI

POVRŠINA PODA

POD

DIMENZIJE (VISINA)

OPREMLJENOST

PROSTIRKA

PROMENA PROSTIRKE

JEDNOETAŽNI

PODNI SMESMEŠŠTAJTAJ

Ocena zdravstvenog stanja, IshranaOcena zdravstvenog stanja, IshranaHigijena

Ogled

Završetak ogleda

Peletirana hrana za ogledne životinje na bazi cerealija

Purifikovana peletirana hrana za ogledne životinje

Vrsta Optimalna temperatura

u °C

Relativna vlažnost

(%)

Broj izmena vazduha/h

Osvetljenje

Miš 20-24 50-70 8-12 14

Pacov 20-24 50-55 10-20 12-14

Sirijski hrčak 20-24 45-65 6-10 12

Skočimiš 20-24 40-50 8-10 12-14

Zamorac 20-24 50-60 4-8 12-15

Kunić 15-21 40-50 10-20 12-14

Mačka 15-21 45-55 10-18 12-14

Pas 15-21 45-60 8-12 10-12

PREMA EVROPSKOJ KONVENCIJI ZA ZAPREMA EVROPSKOJ KONVENCIJI ZA ZAŠŠTITU KITITU KIČČMENJAKA MENJAKA KOJI SE KORISTE U EKSPERIMENTALNE I KOJI SE KORISTE U EKSPERIMENTALNE I

\\DRUGE NAUDRUGE NAUČČNE SVRHENE SVRHEOptimalna temperatura smeOptimalna temperatura smešštajnog prostora za ogledne tajnog prostora za ogledne žživotinjeivotinje

vreme Postupak Ime i prezimeistraživaèa

10.12. 10.10.00 h

Životinje stigle u lab: Wistar albino pacov150 g, mužjak

STANOJLOVIćO.

vreme Postupak Ime i prezimeistraživača

12.12. 10.10.- 12. 00h

Habituacija, 155 gpostupak: implantacija elektroda za hronièno registrovanje EEG-a

HRNÈIÆ D.RAŠIÈ A.

LABORATORIJSKI LABORATORIJSKI

DNEVNIK:DNEVNIK:

5. 5. Prikupljanje iPrikupljanje i AnalAnaliizzaaReRezultatazultata

KoraciKoraci uuNauNauččnom metodunom metodu

KoraciKoraci uuNauNauččnom metodunom metodu6. 6. ZakljuZaključčakak: : ukljuuključčuje uje

prihvatanje ili odbacivanje prihvatanje ili odbacivanje hipoteze hipoteze

Ponovno planiranje Ponovno planiranje eksperimentaeksperimenta

7. 7. Diskusija oDiskusija o ReRezultatimazultatimaPripremiti se za prezentovanjePripremiti se za prezentovanje

I oI oččekivati pitanja ekivati pitanja

KoraciKoraci uuNauNauččnom metodunom metodu

!!Nivoi bihejvioralnih istraNivoi bihejvioralnih istražživanjaivanja

Opservacija (telesna masa, temperatura, izgled krzna, aktivnost u kavezu)

• Neurološki refleksi (refleks uspravljanja, treptanje, trzanje uva)• Motorne funkcije (spontana aktivnost, testovi koordinacije, mišićna snaga)• Specifični aspekti ponašanja: hranjenje, učenje i pamćenje, reproduktivno

ponašanje, socijalno ponašanje, testovi/modeli čiji su parametri povezani sa stanjima anksioznosti, depresije, shizofrenije, zavisnosti

Primer in vivo eksperimenta:Primer in vivo eksperimenta:bihejvioralna istrabihejvioralna istražživanjaivanja

Bihejvior (ponašanje) predstavlja celokupnostaktivnosti individue, posebno onaj njen segment koji jepodložan (spoljašnjoj) opservaciji (Bureš i sar., 1983).

Ispitivanje CNSIspitivanje CNS(vizuelizacija)(vizuelizacija)

1. implantacija trajnih 1. implantacija trajnih elektrodaelektroda2. autopsija 2. autopsija (komparacija)(komparacija)3. presecanje delova 3. presecanje delova mozgamozga(odstraniti organ i videti kako on funkcioniše)

4.4.EleElekktroencetroenceffalograalograffiijaja(EEG) (EEG)

4. 4. TTomograomografijafija (CT)(CT)5. 5. MagnetMagnetnana rerezzonanconancaa(MRI)(MRI)5. 5. PozitronPozitronskaska emisiemisijajatomogratomografijafija (PET)(PET)

PET emisija pozitronaPET emisija pozitronatomografija,tomografija,povepoveććani Protok ukazuje na ani Protok ukazuje na Aktivnost neurona tokom Aktivnost neurona tokom Aktivnosti individue...Aktivnosti individue...

EncefalizacijaEncefalizacijacerebracijacerebracija

Ukupna povrUkupna površšina mozga ina mozga je 2200 je 2200 cmcm22

1/3 1/3 ––vidljiva povrvidljiva površšinaina2/3 2/3 ––skrivena u sulkusimaskrivena u sulkusimadebljina debljina : 1.5 mm (V I) : 1.5 mm (V I)

-- 4.5 mm (M I)4.5 mm (M I)

tetežžina ina : 600 g : 600 g (40 % (40 % od ukupne teod ukupne težžine ine mozgamozga))180 g 180 g ------------------ neuronneuronii420 g 420 g ------------------ glialglialne ne ććelijeelije

Cerebrum

•• Siva i bela masa (najveSiva i bela masa (najvećći deo 80%)i deo 80%)•• ViVišša nervna delatnosta nervna delatnost•• HemHemisfereisfere, , cerebralna lateralizacija cerebralna lateralizacija

((LeLeva hemisferava hemisfera –– jezik; jezik; Desna Desna –– muzika, matematika)muzika, matematika)Corpus Corpus callosumcallosum -- iinterkonekcijanterkonekcija

Tri vrste Tri vrste žživotinja imaju mozak ivotinja imaju mozak vevećći od humanog: i od humanog: slon, delfin, i kitslon, delfin, i kit.

TeTežžina telencefalona ina telencefalona ==1,5 kg, 2,5% tm1,5 kg, 2,5% tm

Phineas Gage:

Radnik u 19th veku, živeo u Cavendish, Vermont. Eksplozivom je lomio stene u male delove. Detonacija je resultirala: 42 inch dug , 1.2 inch širok , metalna šipkamu je prošla kroz glavu i izašla na površinu frontalnog dela lobanje.

GageGageprimer Iprimer I

..ali je uništeno: rezonovanje, razumevanje, personaliti,

socijalne norme,

nije pokazivao interesovanje za hobi, postao je vulgaran, neodgovoran...

Gazda koji ga je pre nesreće smatrao najboljim radnikom, odpustio ga je jer je Gage bio potpuno drugačiji...

Dr Penfild: (neurohirurg)Dr Penfild: (neurohirurg)““oni koji prouoni koji prouččavaju neurofiziologiju intelekta nalik su ljudima avaju neurofiziologiju intelekta nalik su ljudima

u podnou podnožžju brda, dok se vrh planine nalazi u oblacimaju brda, dok se vrh planine nalazi u oblacima””......

primer IIprimer II

primer IIIprimer III

LABORATORIJA ZA NEUROFIZIOLOGIJULABORATORIJA ZA NEUROFIZIOLOGIJU

InstitutInstitut zaza medicinskumedicinsku fiziologijufiziologiju

MedicinskiMedicinski fakultetfakultet u u BeograduBeogradu

EKSPERIMENTALNI EKSPERIMENTALNI M O D E L I E P I L E P S I J E M O D E L I E P I L E P S I J E

I TESTIRANJE KONVULZIVNIH I ANTIKONVULZIVNIH SUPSTANCII TESTIRANJE KONVULZIVNIH I ANTIKONVULZIVNIH SUPSTANCI

ProfProf. dr OLIVERA STANOJLOVI. dr OLIVERA STANOJLOVIĆĆ

ANIMALNI MODELI EPILEPSIJEANIMALNI MODELI EPILEPSIJEOKO 50 OKO 50

ANIMALNIANIMALNIH MODELAH MODELA

Skoro Skoro 2% 2% svetske populacije pati od epilepsijesvetske populacije pati od epilepsijeOko Oko 30% 30% pacijenata je refraktarno na terapijupacijenata je refraktarno na terapiju

Modeli pružajuuvid u fundamentalne Neurološkemehanizme epilepsije

Svi komercijalni antiepileptici setestiraju naživotinjama pre nego što budu dostupni u apotekama

Omogućavaju sve aspekte ispitivanja koje nije moguće raditi na ljudima iz etietiččkihkihrazloga

EpiEpileptileptiččki napad je kliniki napad je kliniččki i bihejvioralni događajki i bihejvioralni događaj

vivišše je grupa e je grupa simptoma nego simptoma nego

bolestbolest

sspontanipontani,, ponovljiv dogadjaj sa iktalnom ponovljiv dogadjaj sa iktalnom korelacijom u EEGkorelacijom u EEG

METAFITSKI METAFITSKI MODEL AUDIOGENE MODEL AUDIOGENE

EPILEPSIJEEPILEPSIJE

METAFIT = 1-(1(3-isotiocijanatofenil)cikloheksil) piperidin)

metaphitmetaphit

-- HirurHiruršška implantacija registrujuka implantacija registrujuććih ih elektorda u stereotaksielektorda u stereotaksi

EEEGEG

Foto: Laboratorija za neurofiziologiju, BeogradFoto: Laboratorija za neurofiziologiju, Beograd

LINDANE LINDANE

SCABIESSCABIES

NEUROTOXINNEUROTOXIN

SEIZURESSEIZURES

PESTICIDEPESTICIDE

EEG and behaviorEEG and behavior

gamma - hexachlorcyclohexane

Fig. 5: Representative EEG tracings and corresponding power spectra in rats treated with lindane. No epileptiform activity was recorded in rats without seizures in their behavior (G0). Seizures of grade 1 (G1) correlated with isolated spikes in EEG and multiple spikes were recorded in grade 2 (G2) seizures. Generalized tonic-clonic seizures (G3) were accompanied by repeated bursts of spiking activity in EEG, while uninterrupted series of multiple high-voltage and synchronized spikes were recorded during seizures of maximal severity (G4).

Fig. 2: Distribution of seizure grades (G) in lindane – treated rats. Severity of seizures were scored as follow: G0 – no convulsive response; G1 –head nodding, lower jaw twitching; G2 – myoclonic body jerks (hot plate reaction), bilateral forelimb clonus with full rearing (Kangaroo position); G3 – generalized clonic convulsions followed by tonic extension of fore- and hind limbs and tail; G4 – status epilepticus. Fishers’ exact probability test was used to determine significance of differences (*p<0.05, **p<0.01, ■p<0.01 vs. G0, ∆ p<0.05 vs. G1 and ▲p< 0.01 vs. G1, ●p<0.01 vs. G3

RAZVOJ MODELA RAZVOJ MODELA EPILEPSIJE IZAZVANE EPILEPSIJE IZAZVANE

HOMOCISTEINOMHOMOCISTEINOM

EEGs recordingsEEGs recordingsSWDSWD

ĐĐurouro MacutMacut, , DraganDragan Đuri Đurićć, Helena Lon, Helena Lonččar ar –– StevanoviStevanovićć, Tatjana , Tatjana RadosavljeviRadosavljevićć, Du, Duššan Mladenovian Mladenovićć, Danijela Vu, Danijela Vuččevievićć, Dragan Hrn, Dragan Hrnččiićć, ,

Olivera Olivera StanojloviStanojlovićć , Aleksandra Ra, Aleksandra Raššiićć -- MarkoviMarkovićć