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Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia
IBILCE-UNESP
TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e
MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS
1956
Tijio e Levan
1960
Moorhead et al.
1970 1969
Gall e Pardue
cariótipo
culturas
bandeamento
ISH
1986
Pinkel et al.
1992
Kallioniemi et al.
1996
Schröck et al.
2002
Nakakuki et al.
...
FISH
CGH
SKY
aCGH
CITOGENÉTICA CLÁSSICA
CITOGENÉTICA MOLECULAR
CULTURA DE LINFÓCITOSMoorhead et al, 1960
1. Colheita de 5 ml de sangue e sedimentação2. Montagem da cultura:• meio de cultura (antibióticos) e soro fetal bovino
estímulo da divisão celular: fito-hemaglutinina (feijão Phaseolus vulgaris)cultivo em estufa a 37° C, por 72 horas
3. Bloqueio da divisão celular com colquicina: impede a formação do fuso mitótico acúmulo de metáfases
4. Colheita da cultura:• hipotonização: KCl 0,075M intumescimento das células e separação
das cromátides Fixação: metanol: ácido acético (3:1) preserva a estrutura dos cromossomos
www.geneticamedica.com.br/.../ citogenetica.htm
BANDEAMENTO CROMOSSÔMICO
Coloração usual com GiemsaBandeamento QBandeamento GBandeamento RBandeamento CColoração Ag-NOR
coloração uniforme dos cromossomos:identificação morfológica dos pares cromossômicos: 1, 2, 3, 16,
17, 18 e Y.
Classificação dos cromossomos em grupos: A - G
COLORAÇÃO USUAL
CLASSIFICAÇÃO DOS CROMOSSOMOS HUMANOS (GRUPOS A – G)
Grupo A (1-3): 3 pares de cromossomos gandesA1 e A3 metacêntricosA2 submetacêntricoGrupo B (4-5): 2 pares submetacêntricos grandesGrupo C (6-12+X): 7 pares submetacêntricos médio + XGrupo D (13-15): 3 pares acrocêntricos médio (satélite)Grupo E (16-18): 3 pares de cromossomos pequenos 16 metacêntrico 17 e 18 submetacêntricosGrupo F (19-20): 2 pares metacêntricos pequenosGrupo G (21-22+Y): 2 pares acrocêntricos pequenos (satélite) + Y
biocarampangue.tripod.com/ Segundo-medio.htm
46,XY
BANDA GTG: Seabright (1971)
Tratamento com tripsina e coloração com GiemsaBandas claras e escuras intercaladas (450 bandas)Bandas G+ricas em AT (pobre em genes)Bandas G-ricas em GC (rica em genes)Identificação de alterações estruturais e pareamento dos cromossomos
www.ucm.es/.../AVG/practicas/ cariotipo/carioP.htm http://www.scielosp.org/scielo.php?pid=S1413-81232002000300013&script=sci_arttext
Décadas 70-80: estudo citogenético identificação de cromossomos e regiões cromossômicas diferentes
alterações
•Perda: deleção monossomia
•Ganho: duplicação,
amplificação trissomia, poliploidia•Relocação:
translocação inversãoinserção
CULTURA CELULAR E BANDA G
500 bandas
Resolução:
~6milhões pb
~50genes/banda
>4 Mb
BANDA C (Sumner, 1972)
cora regiões centroméricas e heterocromatina constitutiva: constrições secundárias dos cromossomos 1, 9, 16 e Yq.tratamento em ácido (HCl) e alcali Ba(OH)2 regiões de heterocromatina constitutiva: coradas fortemente DNA da cromatina eucromatina é extraído (solubilizado).
BANDA C - POLIMORFISMOS CROMOSSÔMICOS
46,XY, inv(9q)
46,XY, 1qh+,inv(9q) 46,XX,1qh+
1
9
16
BANDA Ag-NOR – COLORAÇÃO POR
PRATA destaca as regiões do rDNA: RON constrições secundárias dos cromossomos com satélite (braços curtos dos acrocêntricos) (deposição de prata)o número de NORs/ metáfase: varia entre 5 a 10Impregnação pela prata nos cistrons ribossômicos ativos na intérfase anterior
COLORAÇÃO Ag-NORAssociação de satélites
ORDEM DAS ANOMALIAS CROMOSSÔMICASSISTEMA INTERNACIONAL DE NOMENCLATURA DOS
CROMOSSOMOS HUMANOS - 1995
Primeiro aberrações dos cr. Sexuais (X antes do Y)Aberrações dos autossomos em ordem numérica, independente do tipo de aberraçãoAberrações numéricas listadas antes das estruturaisVárias alterações estruturais em ordem alfabéticaExemplos:47,Y,t(X;13)(q27;q12),inv(10)(p13q22), +2148,X,t(Y;12)(q11;p12),del(6)(q11),+8,t(9;22)(q34;q11),+1,7,-21,+2250,XX,+1,+del(1)(p13),+dup(1)(q21q32),+inv(1)(p31q41),+8,+r(10)(p12q25),-21
CARIÓTIPO COMPOSTO42,XX,-7,-8,+13,-20,-21,-22
43,XX,-6,-11,-21
43,XX,-14,-18,-22
43,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-18,-20,-20
45,XX,-7
45,XX,-16
45,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-8
46,XX [4]
46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32) [7]
46,XX, -X, ins(4;2)(q31;q24q32),+5
46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-8
Cariótipo composto:42~46,XX,-X,ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-6,-7,-8,-11,+13,-14,-16,-18,-20,-21,-22[cp20]
ALTERAÇÕES CLONAIS
Clone: população de células derivada de um único progenitor.
Alteração clonal: quando um número de células têm o mesmo ou proximamente relacionado complemento cromossômico anormal.
Ter pelo menos 2 células com a mesma aberração:ganho cromossômico (trissomia) ou rearranjo estrutural
Ter pelo menos 3 células com perda cromossômica (monossomia)
ALTERAÇÕES CLONAIS42,XX,-7,-8,+13,-20,-21,-22
43,XX,-6,-11,-21
43,XX,-14,-18,-22
43,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-18,-20,-20
45,XX,-7
45,XX,-16
45,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-8
46,XX [4]
46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32) [7]
46,XX, -X, ins(4;2)(q31;q24q32),+5
46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-8
Numéricas: +5[2], -8[3]
Estrutural: ins(4;2)(q31;q24q32)[11]
Cariótipo composto:42~46,XX,-X,ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-6,-7,-8,-11,+13,-14,-16,-18,-20,-21,-22[cp20]
TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR
FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação)SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações)M-BAND: Bandeamento colorido (inversão, deleção/duplicação) CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos)Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH
Pinkel et al. (1986)
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência
Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)
FISH - Fluorescent “in situ” hybridization
FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”
Blue Acqua Green Yellow Orange Red
Cláudio C. SilvaUCG/LaGeneDNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica
Sonda: segmento de DNA específico
ETAPASPreparação da lâmina (DNA alvo)
Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa To de ~80oC
Hibridização sonda/DNA (estufa a 37oC – câmara úmida - overnight)
Lavagem pós-hibridização: tampão 2xSSC (citrato de sódio)
Detecção da sonda e contracoloração: iodeto de propídeo (PI) ou DAPI
Fluorocromos: SondasFITC-fluoresceína (verde)Espectrum green ( verde)Rodamina (vermelho)Texas red (vermelho)
• Método para obtenção de núcleosinterfásicos a partir de tecido fresco
Desagregação dosnúcleos
Fixação dos núcleos
ETAPAS
Material:
-núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços
-cromossomos metafásicos: cultura celular
4. Hibridação in situ Fluorescente - FISH
Pré-tratamento Aplicação da sonda(Ácido acético, RNase, pepsinaDesidratação Etanol)
ETAPAS
Co-denaturação Lavagem pós-hibridação
Contra-coloração Análise ao microscópio
Hibridização
(câmera úmida à 37oc)
ETAPAS
Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência
http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm -ANIMAÇÃO
TIPOS DE SONDASSondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas:-sonda alfa-satélite (centromérica)-sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G)-sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y)-sonda telomérica (telômeros)Sondas de cópia única ou locus específicaSondas de cromossomo inteiro (WCP)
SONDAS CENTROMÉRICAS
Enumeração dos cromossomos e aneuploidias
APLICAÇÃO:
aneuploidias em núcleos interfásicos
Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)
gastrite:+7 gastrite: -7
úlcera: +8
SONDAS CENTROMÉRICAS
SONDAS TELOMÉRICAS
Aplicação:
-Deleções terminais
-perdas teloméricas
SONDAS TELOMÉRICAS
(cromossomo 5)
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
del (22q11.2)
Diagnóstico de doenças com microdeleção
Mucosa normal:
TP53 (vermelho)
17 (verde)
Adenocarcinoma gástrico:
Deleção TP53
1 sinal vermelho
Deleção do gene TP53 em câncer gástrico
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
SONDAS WCP – Cromossomo Total
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842005000100018
A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4; material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), B- Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta).
SONDAS WCP – Cromossomo Total
APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH
Mapeamento de genes e sequências gênicas
Estrutura e organização dos cromossomos
Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções
Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos
Identificação de alterações cromossômicas em esperma
Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação
Diagnóstico de neoplasias
Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto)
MICRODISSECÇÃO
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/microDissection.php
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO
APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X: aneuploidias mais comuns relacionadas com idade materna avançada e malformações fetais Citogenética convencional: diagnóstico em 8-15 diasFISH: resultado rápido (2-3 dias) em células do líquido amniótico não cultivadas
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Trissomia do 21 Triplo X
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Normal
DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO
3 sinais verde: blastômero com trissomia do 21
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
AMPLIFICAÇÃO GÊNICA
CCND1, c-MYC, HER2/Neu
TRANSLOCAÇÕES
t(9,22); t(8;14)
DELEÇÕES
TP53 (17p13), RB (13q13)
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIASAmplificação Gênica
(C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico
(E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIASAmplificação Gênica
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKYSchrock et al., Science 273:494-497, 1996
Identificação precisa e simultânea de todos os cromossomos humanos: diferentes cores
Princípio: medição simultânea de todos os pontos do espectro emitidos pela amostra na faixa espectral visível e próxima a infra-vermelha: uso de múltiplas sondas sobrepondo-se espectralmente
Sondas: com 5 diferentes fluorocromos : Cy2, Spectrum green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas combinações
Sondas dos 24 cromossomos humanos marcadas com 5 fluorocromos em combinação resultando em uma cor diferente para cada cromossomo.
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Cor capturadaClassificação das cores pseudo-coloridas
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Cariótipo normal
Cromossomos marcadores
Limitação:
-Cultivo celular – metáfases
-Não detecta deleções/duplicações e inversão
Evolução cariotípica: células de gibão hibridizadas com sondas humanas várias homologias cromossômicas
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
BANDAMENTO COLORIDOCROSS-SPECIES COLOR
BANDING
Permite a coloração sub-regional dos cromossomos para análise do cariótipo humano
Sondas: derivadas de primatas (gibão) do genêro Hylobates concolor e Hylobates syndactilus: cariótipos com extensa reorganização cromossômica quando comparado ao homem
Identificação de rearranjos cromossômicos: inversões, deleções, duplicações, inserções, translocações
BANDAMENTO COLORIDO
mBAND do cromossomo 5:
25 bandas coloridas: corresponde a uma resolução de 550 bandas (complemento haplóide)
BANDAMENTO COLORIDO
Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem re-processada (b). Qualquer alteração pode ser detectada por este sistema.
BANDAMENTO COLORIDO
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
Método para detectar simultaneamente ganhos e perdas de regiões genômicas sem precisar de células em divisãoExtração do DNA: células teste (tumor) e referência (normal)DNA digerido com enzimas de restrição e marcados com fluorocromos diferentes (vermelho e verde)Hibridação simultânea com ambos DNA (teste e referência) sobre lâmina com cromossomos metafásicos normaisComparação intensidade relativa dos dois fluorocromos ao longo do comprimento de cada cromossomo
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
Amplificação/ganho: excesso do DNA teste (verde)
Deleção/perda: excesso do DNA normal (vermelho)
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/
Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em câncer gástrico câncer gástrico (Guan et al., 2000)(Guan et al., 2000)
Resolução: 0,5 Mb
array - CGH
-cromossomos metafásicos substituídos por sondas de DNA ou oligonucleotídeos chips DNA
Análise dos sinais fluorescentes: analisador de imagem, scanner confocal ou câmera CCD
http://www.dkfz.de/en/genetics/pages/projects/array_cgh.html
array - CGH
array - CGH
AVANÇOS TECNOLÓGICOS
1o. Microscópio -Leeuwenhoek
AVANÇOS TECNOLÓGICOS
http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php
Array-CGH continua transformando a Citogenética:
-fornecendo alta-resolução
-tecnologia avançada para mapeamento preciso e detecção de aberrações cromossômicas.
