Upload
nicolas-lobos
View
230
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia
IBILCE-UNESP
AVANÇOS DA CITOGENÉTICA MOLECULAR NO
DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS
Décadas 70-80: estudo citogenético identificação de cromossomos e regiões cromossômicas diferentes
alterações
•Perda: deleção monossomia
•Ganho: duplicação,
amplificação trissomia, poliploidia•Relocação:
translocação inversãoinserção
CITOGENÉTICA MOLECULAR
Pinkel et al. (1986): Aplicações de técnicas de biologia molecular em preparações citogenéticas: sondas marcadas com fluorocromosIdentificação de rearranjos cromossômicos de novo e cromossomos marcadoresDetecção de alterações cromossômicas em núcleos interfásicosEstudo da estrutura e função de regiões cromossômicas específicas
TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR
FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação)SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações)M-BAND: Bandamento colorido (inversão, deleção/duplicação) CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos)Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência
Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)
FISH - Fluorescent “in situ” hybridization
FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”
Blue Acqua Green Yellow Orange Red
Cláudio C. SilvaUCG/LaGene
DNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica
Sonda: segmento de DNA específico
http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm - ANIMAÇÃO
ETAPASPreparação da lâmina (DNA alvo)
Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa temperatura de ~80oC
Pré-tratamento:Ácido acéticoRNase e pepsinaDesidratação Etanol
Hibridização sonda/DNA (estufa a 37oC – câmara úmida - overnight)
Lavagem pós-hibridização: tampão 2xSSC (citrato de sódio)
Detecção da sonda e contracoloração: iodeto de propídeo (PI) ou DAPI
Fluorocromos: SondasFITC-fluoresceína (verde)Espectrum green ( verde)Rodamina (vermelho)Texas red (vermelho)
• Método para obtenção de núcleosinterfásicos a partir de tecido fresco
Desagregação dosnúcleos
Fixação dos núcleos
ETAPAS
Material:
-núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços
-cromossomos metafásicos: cultura celular
4. Hibridação in situ Fluorescente - FISH
Pré-tratamento Aplicação da sonda(Ácido acético, RNase, pepsina)
ETAPAS
Co-denaturação Lavagem pós-hibridação
Contra-coloração Análise ao microscópio
Hibridização
(câmera úmida à 37oc)
ETAPAS
Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência
TIPOS DE SONDASSondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas:-sonda alfa-satélite (centromérica)-sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G)-sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y)-sonda telomérica (telômeros)Sondas de cópia única ou locus específicaSondas de cromossomo inteiro – Whole-chromosome painting
APLICAÇÃO:
aneuploidias em núcleos interfásicos
Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)
gastrite:+7 gastrite: -7
úlcera: +8
SONDAS CENTROMÉRICAS
Mucosa normal:
TP53 (vermelho)
17 (verde)
Adenocarcinoma gástrico:
Deleção TP53
1 sinal vermelho
Deleção do gene TP53 em câncer gástrico
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4 (material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), B- Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta).
SONDAS WCP – Cromossomo Total
APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH
Mapeamento de genes e sequências gênicas
Estrutura e organização dos cromossomos
Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções
Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos
Identificação de alterações cromossômicas em esperma
Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação
Diagnóstico de neoplasias
Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto)
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X: aneuploidias mais comuns relacionadas com idade materna avançada e malformações fetais Citogenética convencional: diagnóstico em 8-15 diasFISH: resultado rápido (2-3 dias) em células do líquido amniótico não cultivadas
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
AMPLIFICAÇÃO GÊNICA
CCND1, c-MYC, HER2/Neu
TRANSLOCAÇÕES
t(9,22); t(8;14)
DELEÇÕES
TP53 (17p13), RB (13q13)
(C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico
(E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIASAmplificação Gênica
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKYSchrock et al., Science 273:494-497, 1996
Identificação precisa e simultânea de todos os cromossomos humanos: diferentes cores
Princípio: medição simultânea de todos os pontos do espectro emitidos pela amostra na faixa espectral visível e próxima a infra-vermelha: uso de múltiplas sondas sobrepondo-se espectralmente
Sondas: com 5 diferentes fluorocromos : Cy2, Spectrum green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas combinações
Sondas dos 24 cromossomos humanos marcadas com 5 fluorocromos em combinação resultando em uma cor diferente para cada cromossomo.
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Inverted-DAPI (A) and SKY classified (B) karyotypes of the previous lung SCC cell.
-6-8
-6-8
A
B
t(1;16)
t(5;9;13)
t(6;8;15)
t(6;7)
t(6;15)
t(11;19)
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Limitação:
-Cultivo celular – metáfases
-Não detecta deleções/duplicações e inversão
Evolução cariotípica: células de gibão hibridizadas com sondas humanas várias homologias cromossômicas
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Permite a coloração sub-regional dos cromossomos para análise do cariótipo humanoSondas: derivadas de primatas (gibões) do genêro Hylobates concolor e Hylobates syndactilus: cariótipos com extensa reorganização cromossômica quando comparado ao homemIdentificação de rearranjos cromossômicos: inversões, deleções, duplicações, inserções, translocações
BANDAMENTO COLORIDO
mBAND do cromossomo 5:
25 bandas coloridas: corresponde a uma resolução de 550 bandas (complemento haplóide)
BANDAMENTO COLORIDO
Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem re-processada (b), ambas esteroscópicas. Qualquer alteração pode ser detectada por este sistema.
BANDAMENTO COLORIDO
Método para detectar simultaneamente ganhos e perdas de regiões genômicas sem precisar de células em divisãoExtração do DNA: células teste (tumor) e referência (normal)DNA digerido com enzimas de restrição e marcados com fluorocromos diferentes (vermelho e verde)Hibridação simultânea com ambos DNA (teste e referência) sobre lâmina com cromossomos metafásicos normaisComparação intensidade relativa dos dois fluorocromos ao longo do comprimento de cada cromossomo
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
Amplificação/ganho: excesso do DNA teste (verde)
Deleção/perda: excesso do DNA normal (vermelho)
Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em câncer gástrico câncer gástrico (Guan et al., 2000)(Guan et al., 2000)
Resolução: 0,5 Mb
array - CGH
-cromossomos metafásicos substituídos por sondas de DNA ou oligonucleotídeos chips DNA
Análise dos sinais fluorescentes: analisador de imagem, scanner confocal ou câmera CCD
http://www.dkfz.de/en/genetics/pages/projects/array_cgh.html
array - CGH