Upload
vohanh
View
234
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
PROTEİN ÇİPLERİ
MUSTAFA UZUNNİSAN 2007
İnsanlık tarihinin en büyük ve sonuçları
açısından en önemli projelerinden olan
İnsan Genom Projesi (human genom project)
ile elde edilen veriler,insan oğluna
yeni ufuklar sunarken birçok farklı projeninde
başlamasına neden olmuştur.
Diğer taraftan insan genom projesi ile elde edilen bilgilerin çoğu ham bilgilerdir.Bu bilgilerin uygulanabilmesi için, yeni bazı
bilgilere ihtiyaç vardır.Halen hücrede birçok molekülün nereden,hangi koşullar
altında sentezlendiği bilinmemekte ve protein moleküllerinin rolleri
açıklanamamaktadır.
Birçok hastalık; gen kontrolü ile ilgili problemler, transkripsiyon,post-transkripsiyonal modifikasyon ve translasyon sırasında oluşan değişiklikler ile oluşmaktadır.Bu nedenle, nükleik asit bazlı labaratuvar tetkikleri yanında protein bazlı labaratuvar tetkiklerinin de önemi artarak sürmektedir.
Sıklıkla kullanılan geleneksel laboratuvaryöntemleri, genellikle tek bir gen
veya proteinin araştırılmasına yöneliktir.Hastalıkların çoğunda birçok gen
etkilenmekte(multigenik) ve birçok faktöre bağlı
olarak hastalıklar oluşmaktadır (multifaktöriyel)
. Bu da, birçok farklı genin veproteinin bir arada, kolay ve efektif olarak
incelenebilmesini gündeme getirmiştir.
Günümüzde gelişen bilgisayar teknolojisinin
biyolojiye uyarlanması ile karşımıza çıkan DNA çipleri,
bize bu olanağısağlamaktadır.
Mikroarrayler ile etkilenen genlerin ekspresyonları, kanserli bir dokuda aynı anda
çalışılmakta, hücre siklusunu etkileyen yüzlerce genin ekspresyonu takip edilebilmektedir.
Mikroarray, ileri derecede genotip ve gen ekspresyon analizleri için geliştirilmiş bir
tekniktir.Küçük örnek hacimleri kullanılarak tek deneyde
mikroarrayler, SNP’lerin,hastalıklı ve normal fizyolojik koşullardaki modifiye gen
ekspresyonunun (mRNA’daki artış ve azalışlar) hızlı bir şekilde çalışılmasını sağlar.
Gen ekspresyon arrayleri, mRNAseviyelerindeki değişiklikleri,kodlanan protein seviyelerindeki değişikliklerle karşılaştırmak için kullanılırlar. Ancak bu çok doğru sonuç vermez. Gen ekspresyon arrayleri, hücre fonksiyonunu etkileyen protein post translasyonal modifikasyonları(fosforilasyon, glikolizasyon v.b.) hakkında bilgi sağlamaz.Protein seviyesinde ekspresyonu değerlendirmek, ilgilenilen proteinlerle ilgili kalitatif ve kantitatif bilgi gerektirir. Bu nedenle, protein mikroarrayleri geliştirilmiştir.
Bir protein mikroarrayi;
antikorlar, proteinler, protein fragmentleri, peptidler, aptamerler veya küçük yüzeylerde immobilize olmuşveya kaplanmış karbonhidrat monomerlerini içerir.
Çip yüzeyinde yüzlerce spotlar vardır.Her spot üzerinde de binlerce aynı tür problarvardır.Prob türü sadece spottan spota değişir.
Protein Array Tipleri
Antikor-Protein ArrayTek Antikor/İşaretlenmiş Örnek Protein ArrayHücresel Lizat Protein Array
Antikor-Protein Array
Antikor mikroarraylerinde, sandviç tip assayler için eşleşen antikor çifti,işaretli tek antikor ve işaretsiz antikor ligant olarak kullanılarak yapılır ve basit işaretleme metodu vardır.
Birçok yayınlanan çalışmada,sandviç immunoassaymikroarray’lerin kullanılabilirliği ve etkinliği gösterilmiştir.Bu yöntemde antikor çifti aynı proteine bağlandığı için yüksek hassasiyetli analiz gerçekleşir.
Saptayıcı antikor, direkt tanımlayıcıişaretle (enzim, floresan molekül, izotop, vb) modifiye edilir veya işaretli streptavidin ile prob uygulamasından sonra saptama için biotinlenir.
Tek Antikor/İşaretlenmiş Örnek Protein Array
Eşleşmiş antikor çiftleri yoksa, işaretli örnekler içeren tek antikor protein mikroarray
protokolleri kullanılır. Sandviç antikor çift arraylerde olduğu gibi, array platformu arrayi
yapılan antikoru (veya antikorları) içerir.. Buyöntemde, protein örneklerinin daha önceden işaretlenmesi (floresan molekülle, isotop veya
biotinle) gerekir. İşaret, örnekteki bir proteinin mikroarray yapılan bir antikorla ve ilişkili elamanlarla etkileşimi tanımlamayı
kolaylaştırır.
Bu teknik, zayıf karakterli hücre sinyal proteinleri gibi protein hedeflerin
değerlendirilmesinde kullanılır. Ana dezavantajı, spesifik antijen tanımasından
emin olunmasını sağlayan antikor fazlalığının olmamasıdır. Ek olarak, tüm örnek bileşenleri
işaretlendiği için, spesifik olmayan arka plan sinyali artacaktır. Yöntem daha çok primer olarak
karşılaştırma ve kalitatif çalışmalarda kulanılır.
Hücresel Lizat Protein Array
Hücresel proteinlerin mikroarrayleri, kompleks protein karışımları veya saflaştırılmış
fazla miktarda eksprese olmuş proteinlerin arraylerinde kullanılır. Kompleks protein karışım
arrayleri, hücresel lizatları dot blotlar. Saflaştırılmışveya fazla miktarda eksprese olmuş
proteinlerin kitaplıklarından oluşan mikroarraylerinoluşturulması, protein:protein
etkileşimlerinin ve kinaz aktivitelerinin görüntülenmesine olanak verir.
Özelliklerine Karar Verme
Protein arrayler, cam, membran, kütle
spektroskopi plateleri, boncuklar ve diğer
partiküllergibi yüzeylere immobilize
proteinler kullanılarak katı-faz ligand bağlama
denemesistemleridir. Denemeler,
paraleldir ve minyatüre edilebilirler (mikroarray ve
protin çipleri).
Hızlı ve otomatik olmaları, yüksek hassasiyette olmaları, çözeltilerin
ekonomik olması ve tekdenemeyle çok veri elde edilebilmesi bu
yöntemin avantajlarıdır. Elde edilen verilerin
değerlendirilmesi biyoinformatik sayesinde yapılabilmektedir.
Uygulama Alanları
Diyagnostikte, hapsedilen arrayler, paralel olarak birçok denemenin gerçekleşmesine olanak verir.
Proteomikte, bu array, farklı örneklerdeki proteinlerin miktarlarını hesaplamada ve
karşılaştırmada kullanılır..
Arrayde, ligandlardan daha spesifik olan proteinler, protein-protein,
protein-DNA, protein-ilaç, reseptör-ligand, enzim-substrat gibi in vitro fonksiyonel
etkileşimlerin görüntülenmesinde kullanlır. Ayrıca, SNP’lerden doğan polimorfik
değişikliklerle protein fonksiyonu koreleedilebilir.
Protein arraylerin kullanıldığı 4 ana alan vardır.
1. Diagnostik: Kan örneklerindeki antijen ve antikorların saptanması.
2. Proteomik: Protein ekspresyon profili oluşturulması, organ ve hastalık spesifikarrayler.
3.İleri ekspresyon ve maniplasyonlar için display kitaplıklarından bireysel üyelerinizolasyonu protein ve antikorların seçilimi
4.Protein fonksiyonel analizi: protein-protein etkileşimleri, reseptörün ligand bağlamaözellikleri, enzim aktiviteleri, antikor çapraz aktivitesi ve spesifitesi, epitop haritalaması.
Formatlar ve Yüzeyler
Protein arrayler, ELISA ve dot blot gibi metodların minyatürize edilmiş şekli
olaraktasarlanmıştır. Genelde kullanılan fiziksel
destek, cam slaydlar, silikon, mikrokuyular,
nitroselüloz membranlar, manyetik veya diğer boncuklardır.Süspansiyondaki
partiküller, array’lerin temeli olarak kullanılır.
Protein İmmobilizasyonu
Proteinlerin imobilizasyonlarındaki çeşitlilikler çözeltiler ve yüzeyin özellikleridir. İyi birprotein array yüzeyi, kimyasal olarak eşleşme prosesinden önce ve sonra stabil olmalıdır, iyispot morfolojisine izin vermelidir, saptamasistemleri arka planla girişim yapmamalıdır.
Kullanılan immobilizasyon metodutekrarlanabilir, farklı özellikteki proteinlere uygulanabilir, otomasyona yatkın olmalı ve tüm fonksiyonel protein aktivitesini geri kazanabilme yeteneğinde olmalıdır.
Protein immobilizasyonu için hem kovalenthem de non-kovalent metodlarkullanılmaktadır.Yüzeye pasif adsorbsiyon metodolojik olarak basittir ancak az kantitatif ve tekrarlanabilirlikleri azdır.Kovalent bağlanma metodları, stabil bağlanma sağlarlar ve çok geniş özellikte proteinlere uygulanabilirler ve tekrarlanabilirlikleri iyidir.
Kovalent bağlanma substratları amino- veya aldehit içeren silançözeltisiyle kaplanmış cam slaytları içerir. Versalinx™ sistemde [Prolinx], fenildiboronik asitve salisilhidroksamik asit ile türevlenmişproteinler arasındaki etkileşimler yüzeye geridönüşümlü olarak immobilize edilmeyi başarılmıştır.Ayrıca, bu yöntemde daha az arka planbağlanması görülmüştür ve immobilizeproteinlerin fonksiyonlarını kazanmalarısağlanmıştır.
En yaygın kullanımı olan biyolojik eşleme metodu, biotin/streptavidin veya heksahistidin/Ni etkileşimleridir. Biotin, titanyum dioksit gibi bir yüzeyde poli liziniskeletine konjuge olabilir.
Saptama
Saptamada en yaygın olarak floresanişaretleme kullanılmaktadır. DNA
mikroarraylerini okumak için kullanılan metodlar, protein arraylere de
uygulanabilmektedir..
Planarwaveguide technology[Zeptosens] ultrahassas
floresans saptamasısağlar ve yıkama
prosedürünün olmamasıda ayrı bir avantajıdır.
Ayrıca, yüksek hassasiyet süspansiyon boncuklarıve partikülleri ile işaret
olarak fitoeritrinkullanılmasıyla sağlanır.
Diğer alternatif metodlar , yüzey plazmonrezonansı , dönen halkasal DNA
amplifikasyonu [Molecular Staging], kütle spektroskopisi ve atomik kuvvet
mikroskopisidir.
Large-Scale Protein Arrayleri
Large-scale fonksiyonel çipler, çok sayıda saflaştırılan proteinin immobilizasyonu ile geniş miktarda biyokimyasal fonksiyonun (protein-protein etkileşimi, ilaç-hedef etkileşimi, enzim-substrat etkileşimi vs.) denemesinde kullanılırlar.
• www.functionalgenomics.org• www.microarray.swmed.edu• www.arrayit.com/.../protein_chips.html• www1.qiagen.com/products/protein• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi• www.gulhanemedicaljournal.org/pdf.php3?id=243