8/13/2019 Proteine Shythese

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APPLICATION OF A THEORY OF ENZYME SPECIFICITY TO PROTEINSYNTHESIS*BY D . E . K O S H L A N D , J R . t

BIOLOGY DEPARTMENT BROOKHAVEN NATIONAL LABORATORY UPTON, NEW YORKT h e n e c e s s i t y f o r a c t i v a t i o n o f a n a m i n o a c i d t o a l l o w i t t o f o r m a p e p t i d e b o n d

h a s t w o a s p e c t s . T h e f i r s t o f t h e s e i s t h e r m o d y n a m i c a n d a r i s e s f r o m t h e f a c t t h a tt h e e q u i l i b r i u m i n t h e r e a c t i o n s h o w n i n e q u a t i o n ( 1 ) l i e s f a r t o t h e l e f t :H3N-CHRCOO- H3NCHR COO- - H3N-CHRCO-NHCOO H20

( 1 )T h e s u g g e s t i o n o f L i p m a n n t ha t t he e n e r g y r e q u i r e d t o d r i v e t h i s r e a c t i o n t o t h er i g h t c a m e f r o m a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e h a s b ee n s u p p o r t e d b y t h e e x t e n s i v e w o r k 2w h i c h h a s b e e n d i s c u s s e d b y t h e p r e v i o u s s p e a k e r s o n t h i s s y m p o s i u m . W h i l e t h ed e t a i l e d m e c h a n i s m o f t h i s e n e r g y t r a n s f e r h a s n o t b e e n f u l l y e l u c i d a t e d , t h e ATPa p p a r e n t l y f o r m s a n a m i n o a c i d a n h y d r i d e . T h e f a c t t h a t a n a n h y d r i d e o f r e l a -t i v e l y h i g h - e n e r g y c o n t e n t i s t h e m e t h o d o f d r i v i n g t he r e a c t i o n t h e r m o d y n a m i c a l l yf i t s i n w i t h o r g a n i c p r a c t i c e i n w h i c h a c y l a n h y d r i d e s a r e t h e u s u a l r e a g en t s f o ra c y l a t i o n s .

I n a d d i t i o n t o t h e r m o d y n a m i c a c t i v a t i o n , t h e r e i s a n e e d e d k i n e t i c a c t i v a t i o n .F o r e x a m p l e , t h e a c y l p h o s p h a t e s a n d a c y l a d e n y l a t e s a c y l a t e a m i n e s n o n - e n z y -m a t i c a l l y a t a p p r e c i a b l e r a t e s i n a q u e o u s s o l u t i o n , 3 b u t t h i s r e a c t i o n i s c e r t a i n l y n o tr a p i d e n o u g h o r s e l e c t i v e e n o u g h t o a c c o u n t f o r p r o t e i n s y n t h e s i s . Th e r e a c t i o n o ft h e s e a c y l a n h y d r i d e s t o f o r m p e p t i d e s m u s t b e c a t a l y z e d , a n d i t i s t h i s c a t a l y s i sw h i c h i s t h e s u b j e c t o f t h i s p a p e r .An a n a l y s i s o f wh y t h i s l i n k i n g o f a m i n o a c i d s p r e s e n t s s u c h f o r m i d a b l e d i f f i c u l -t i e s i s r e v e a l i n g . T h e d i f f i c u l t y a p p e a r s t o b e c a u s e d b y a c o m b i n a t i o n o f r e q u i r e -m e n t s , e a c h o f w h i c h , t a k e n s i n g l y , i s r a t h e r e a s i l y s a t i s f i e d . Th e f i r s t r e q u i r e m e n ti s t h a t a n i n d i v i d u a l p o s i t i o n i n t h e p r o t e i n b e o c c u p i e d b y o n e a n d o n l y o n e a m i n oa c i d . T h i s b y i t s e l f i s n o t a d i f f i c u l t c o n d i t i o n t o s a t i s f y , s i n c e e n z y m a t i c r e a c t i o n so f e q u a l l y h i g h s p e c i f i c i t y a r e w e l l k n o w n . T h e s e c o n d r e q u i r e m e n t i s t h a t a h i g h -m o l e c u l a r - w e i g h t p o l y m e r b e p r o d u c e d . A g a i n , t h i s , b y i t s e l f , i s n o t a u n i q u e c o n -d i t i o n , s i n c e t h e e n z y m a t i c f o r m a t i o n o f h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t m o l e c u l e s f r o m ag i v e n monomer i s a l s o f a m i l i a r , e . g . , c a r b o h y d r a t e p o l y m e r i z a t i o n c a t a l y z e d b yp h o s p h o r y l a s e s . F i n a l l y , t h e m a c r o m o l e c u l e i s f o r m e d f r o m many d i f f e r e n tmonomer u n i t s , b u t t h i s r e q u i r e m e n t i s a l s o e a s i l y a c h i e v e d i f t h e u n i t s a r e r a n -d o m l y a r r a n g e d , e . g . , p o l y n u c l e o t i d e f o r m a t i o n b y p o l y n u c l e o t i d e p h o s p h o r y l a s e . 4H o w e v e r , t h e c o m b i n e d r e q u i r e m e n t s , i . e . , t h e s y n t h e s i s o f a m a c r o m o l e c u l e f r o mmany i n d i v i d u a l m o n o m e r s t o g i v e a s i n g l e s p e c i f i e d s e q u e n c e , i s a p r o b l e m o f d i f -f e r e n t m a g n i t u d e . A m e c h a n i s m i n v o l v i n g a n i n d i v i d u a l e n z y m e f o r e a c h b o n dw o u l d b e a c c e p t a b l e f r o m t h e s p e c i f i c i t y p o i n t o f v i e w , b u t i t w o u l d r e q u i r e a n i n -c o n c e i v a b l y l a r g e n u m b e r o f e n z y m e s t o f o r m a l l t h e p r o t e i n s o f t h e c e l l . M o r e o v e r ,t h e r e a r e o t h e r o b s e r v e d c o n d i t i o n s , e . g . , t h e n e c e s s i t y o f f e e d i n g a l l t h e a m i n o a c i d s

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SYMPOSIUMw i t h i n a s h o r t p e r i o d o f t i m e 5 a n d t h e l a c k o f i n t e r m e d i a t e s , 6 w h i c h a r g u e a g a i n s t as e q u e n c e o f f r e e e n z y m a t i c r e a c t i o n s l i k e t h o s e i n c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m .Th e b e s t f r a m e w o r k f o r e x p l a i n i n g a t l e a s t p a r t o f t h e s e p h e n o m e n a h a s c o m ef r o m a m e c h a n i c a l a n a l o g y , i . e . , t h e t e m p l a t e . T h i s a n a l o g y h a s b e e n r e f i n e d o v e rt h e y e a r s , a n d r e c e n t l y D a l g l e i s h h a s p r o p o s e d a n i n g e n i o u s m o d i f i c t i o n w h i c h i sa bl e t o a c c o u n t f o r b o t h a s y m m e t r i c l a b e l i n g o f a p r o t e i n 8 a n d a r p i d r a t e o f s y n -t h e s i s . He s u g g e s t s t ha t t he p a r t o f t h e p e p t i d e c h a i n w h i c h h a s b e e n c o m p l e t e dp e e l s o f f t h e t e m p l a t e a s i t i s f o r m e d , a l l o w i n g n e w p e p t i d e c h a i n s t o b e s t a r t e db e f o r e t h e i n i t i a l o n e i s c o m p l e t e d . T h u s t h e t i m e f o r f o r m a t i o n o f a n i n d i v i d u a lp r o t e i n m o l e c u l e i s e x t e n d e d , w h i l e t h e h i g h n u m b e r o f m o l e c u l e s f o r m e d p e r u n i tt i m e i s m a i n t a i n e d .Th e d e f i c i e n c y o f a n y t e m p l a t e m o d e l i s s i m p l y t h a t i t i s o n l y a m e c h a n i c a la n a l o g y a n d , s i n c e we a r e m a k i n g c h e m i c a l s a n d n o t a u t o m o b i l e s , t h a t i t h a s t o b et r a n s l a t e d i n t o c h e m i c a l t e r m s . F o r e x a m p l e , i n t h e m o d e l o f D a l g l e i s h i t i s a s -s u m e d t h a t t h e c o m p l e t e d p e p t i d e p e e l s o f f t h e t e m p l a t e ; b u t why i n d i v i d u a l a m i n oa c i d s w h i c h w e r e p r e v i o u s l y t i g h t l y a d s o r b e d s h o u l d s u d d e n l y p r e f e r t o b e d e s o r b e dm u s t a w a i t c h e m i c a l r e a s o n i n g . T h e f i r s t s t e p i n t h i s r e a s o n i n g i s a n a t t e m p t t od e d u c e t h e n a t u r e o f t h e t e m p l a t e i t s e l f .Th e e v i d e n c e s e e m s o v e r w h e l m i n g t h a t t h e t e m p l a t e h a s t h e c h a r a c t e r i s t i c s o fa n e n z y m e , s i n c e t h e t h r e e f e a t u r e s c i t e d a b o v e a r e o b s e r v e d s i n g l y i n e n z y m e -c a t a l y z e d r e a c t i o n s . C e r t a i n l y , i n d u c t i v e e f f e c t s o r v a n d e r W a a l s a t t r a c t i o n sw o u l d n o t a c c o u n t f o r t h e e x c l u s i v e s e l e c t i o n o f i s o l e u c i n e i n c o m p e t i t i o n w i t h v a l i n eo r s e r i n e i n c o m p e t i t i o n w i t h t h r e o n i n e a t a s p e c i f i c p o s i t i o n i n a p e p t i d e c h a i n .W h e t h e r t h e s e i n t e r a c t i o n s a r e p r o v i d e d b y a p r o t e i n o r b y a n u c l e i c a c i d o r b y ac o m b i n a t i o n o f t h e t w o c a n n o t b e d e c i d e d a s y e t , b u t t h e m o n o d i s p e r s e n a t u r e o ft h e p e p t i d e c h a i n s s u g g e s t s t h a t t h e t h e r m o d y n a m i c a l l y a c t i v a t e d a m i n o a c i d a n -h y d r i d e i s k i n e t i c a l l y a c t i v a t e d b y a c a t a l y s t w h i c h b e h a v e s l i k e , e v e n i f i t i s n o ti d e n t i c a l w i t h , a n e n z y m e .

L e t u s , t h e r e f o r e , f i r s t e x a m i n e t h e m a n n e r i n w h i c h a n e n z y m e e x e r t s i t s s p e c i -f i c i t y . I t i s a p p a r e n t t h a t t h i s s p e c i f i c i t y d o e s n o t a r i s e f r o m i n d u c t i v e e f f e c t s i nt he s u b s t r a t e m o l e c u l e s . A c h a n g e f r o m a h y d r o x y t o a m e t h o x y g r o u p a t t h e C - 3p o s i t i o n o f g l u c o s e w i l l h a v e n e g l i g i b l e e l e c t r o s t a t i c e f f e c t s o n t h e b a s i c o r a c i d i cp r o p e r t i e s o f t h e C - 6 h y d r o x y l , a n d y e t t h i s c h a n g e i s e n o u g h t o b l o c k c o m p l e t e l yt he a c t i o n o f h e x o k i n a s e . 9 To e x p l a i n t h i s s p e c i f i c i t y , a k e y- l o c k t h e o r y w a sp r o p o s e d . 1 0 1 I I n e s s e n c e t h i s t h e o r y s a i d t h a t t h e e n z y m e w a s a r a t h e r r i g i d n e g a t i v eo f t h e s u b s t r a t e a n d t h a t t h e s u b s t r a t e h a d t o f i t i n t o t h i s n e g a t i v e t o r e a c t . H e n c ea m o d i f i c a t i o n w h i c h h a d m i n o r e l e c t r o s t a t i c e f f e c t s b u t w h i c h w o u l d s o i n c r e a s et h e b u l k o r c h a n g e t h e s h a p e o f t h e m o l e c u l e t h a t i t c o u l d n o t f i t o n t h e e n z y m es u r f a c e w o u l d p r e v e n t r e a c t i o n . T h i s e x p l a n a t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e d e m o n s t r a -t i o n o f s t e r i c r e p u l s i o n s i n o r g a n i c r e a c t i o n s a n d b y t h e f a c t t h a t t h e k i n e t i c s o fe n z y m e a c t i o n a r e c o mp a t i b l e w i t h a n e n z y m e - s u b s t r a t e c o m p l e x . I t i s c a p a b l eo f e x p l a i n i n g a l m o s t a l l t h e o b s e r v e d s p e c i f i c i t y p a t t e r n s .On c l o s e e x a m i n a t i o n , 1 2 h o w e v e r , i t i s c l e a r t h a t t h i s h y p o t h e s i s d o e s n o t e x p l a i na l l c a s e s , a n d , a s u s u a l , i t i s t h e a n o m a l i e s w h i c h l e a d t o r e v i s i o n s o f o u r t h e o r i e s .T h e a n o m a l i e s f a l l , i n g e n e r a l , i n t h e c l a s s t h a t s m a l l e r a n a l o g o u s c o m p o u n d s r e a c te x t r e m e l y s l o w l y o r n o t a t a l l . F o r e x a m p l e , r i b o s e - 5 - p h o s p h a t e i s h y d r o l y z e d b y 5 -n u c l e o t i d a s e m u c h l e s s r a p i d l y t h a n a d e n y l i c a c i d . 3 S i n c e t h e r i b o s e - 5 - p h o s p h a t e

V O L . 4 4 , 1 9 5 8 9 9

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SYMPOSIUMi s s i m p l y a d e n y l i c a c i d w i t h o u t t h e p u r i n e , i t c o u l d b e a r g u e d t h a t a n a t t r a c t i v eg r o u p i s e l i m i n a t e d a n d h e n c e t h e a f f i n i t y t o t h e e n z y m e i s l e s s ( w h i c h i t p r o b a b l yi s ) . H o w e v e r , w h e n t h i s l o w e r a f f i n i t y i s c o m p e n s a t e d f o r b y c o m p a r i n g t h e v e l o c i -t i e s a t e n z y m e s a t u r a t i o n , t h e r i b o s e - 5 - p h o s p h a t e s t i l l r e a c t s a t l / l o o t h e r a t e o fa d e n y l i c a c i d . Th e k e y - l o c k t h e o r y w o u l d c e r t a i n l y p r e d i c t e q u a l r a t e s a t s a t u r a -t i o n l e v e l s . S i m i l a r l y , t h e f a i l u r e o f a l p h a m e t h y l g l u c o s i d e t o a c t a s a s u b s t r a t e f o ra m y l o m a l t a s e 1 4 i s i n c o n s i s t e n t w i t h t h i s h y p o t h e s i s . A l p h a m e t h y l g l u c o s i d e h a st h e s a m e s t r u c t u r e a s t h e n a t u r a l s u b s t r a t e m a l t o s e , e x c e p t t h a t i t i s s m a l l e r , i . e . ,t w o h y d r o g e n s o n t h e a g l y c o n c a r b o n t a k e t h e p l a c e o f t h e s ec o n d p y r a n o s e r i n g .A s w o u l d b e e x p e c t e d f r o m i t s s m a l l e r , b u t o t h e r w i s e s i m i l a r , s t r u c t u r e , a l p h am e t h y l g l u c o s i d e s h o u l d b e a b -

SUBSTRATE s o r b e d o n t h e e n z y m e s u r f a c e .T h a t i t d o e s i s s h o w n b y i t s a c -t i o n a s a c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r .+ H o w e v e r , i t i s n o t h y d r o l y z e db y t h e e n z y m e . I n t h i s c a s e

a e c e r t a i n l y , l a c k o f a c c e s s t o t h ee n z y m e s u r f a c e c a n n o t e x p l a i ni t s f a i l u r e t o b e a s u b s t r a t e .ENZYME N u m e r o u s s i m i l a r a n o m a l i e sc a n b e f o u n d . 2

NON- SUBSTRATE T h e e x p l a n a t i o n t h a t w es u g g e s t t o e x p l a i n t h e s e p h e -n o m e n a i s a s f o l l o w s : ( a ) ap r e c i s e o r i e n t a t i o n o f c a t a l y t i cg r o u p s i s r e q u i r e d f o r e n z y m ea c t i o n ; ( b ) t h e s u b s t r a t e may

b 9 \ t ^ c a u s e a n a p p r e c i a b l e c h a n g e i nt h e t h r e e - d i m e n s i o n a l r e l a t i o n -s h i p o f t h e a m i n o a c i d s a t t h eENZY MES a c t i v e s i t e ; a n d c ) t h e c h a n g e si n p r o t e i n s t r u c t u r e c a u s e d b y

a s u b s t r a t e w i l l b r i n g t h e c a t -a l y t i c g r o u p s i n t o t h e p r o p e rNON-UBSTRATE o r i e n t a t i o n f o r r e a c t i o n ,w h e r e a s a n o n - s u b s t r a t e w i l ln o t . T h i s s e t o f p o s t u l a t e sh a s b e e n c a l l e d t h e i n d u c e dC LL / \ t 2 f i t t h e o r y f o r b r e v i t y a n d t oLU \ i s e m p h a s i z e t h a t , w h i l e t h e i d e ao f a f i t i s r e t i n e d f r o m t h eENZYME 5 k e y - l o c k t h e o r y , t h e f i t i n t h i sc a s e o c c u r s o n l y a f t e r t h eF I G . 1 . - I n t e r a c t i o n o f e n z y m e w i t h ( a ) s u b s t r a t e , ( b ) c h a n g e s i n d u c e d by t h e s u b s -c o m p o u n d t o o l a r g e t o b e s u b s t r a t e , a n d ( c ) compound t o os m a l l t o b e s u b s t r a t e . C i r c l e d p l u s e s a n d m i n u s e s i n d i c a t e t r a t e i t s e l f .a n y m u t u a l l y a t t r a c t i v e g r o u p s o n e n z y m e a n d s u b s t r a t e . A s i m p l i f i e d s c h e m a t i c r e p -C i r c l e d C s t a n d s f o r c a t a l y t i c g r o u p , a n d j a g g e d l i n e f o rb o n d t o b e b r o k e n . r e s e n t a t i o n i s s h o w n i n F i g

1 0 0 P R O C . N . A . S .

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SYMPOSIUMu r e 1 . I n F i g u r e 1 , a , a c a t a l y t i c g r o u p , C , i s a l i g n e d w i t h t h e b o n d t o b e b r o k e n( s h o w n b y t h e j a g g e d l i n e ) . I n F i g u re 1 , b , i n c r e a s i n g t h e s i z e o f a g r o u p w e l l r e -moved f r o m t h e b o n d t o b e b r o k e n d e s t r o y s t h e a l i g n m e n t ; a n d i n F i g u r e 1 , c ,t h e c o m p l e t e r e m o v a l o f t h e s a m e g r o u p l i k e w i s e d e s t r o y s t h e a l i g n me n t . T h u st h i s t h e o r y e x p l a i n s why a s u b s t r a t e c a n b e c o n v e r t e d t o a n o n - s u bs t r a t e b y a d e -c r e a s e i n , s w e l l s b y a n i n c r e a s e i n , i t s s i z e .

F u r t h e r m o r e , t h e r e i s i n d e p e n d e n t s u p p o r t f o r t h e v a r i o u s p o s t u l a t e s . F i r s t ,t h e f l e x i b l e n a t u r e o f p o r t i o n s , i f n o t a l l , o f t h e p r o t e i n c h i n i s a d d u c e d f r o m manys o u r c e s , a n d t h e s e c h a n g e s c a n b e c a u s e d b y s m a l l m o l e c u l e s , c h a r g e d o r u n -c h a r g e d . A t y p i c a l e x a m p l e i s t h e r e v e r s i b l e d e n a t u r a t i o n o f a n u m b e r o f e n z y m e sb y u r e a . 1 5 T h i s d e n a t u r a t i o n i s a c c o m p a n i e d b y c h a n g e s i n v i s c o s i t y , o p t i c a l r o t a -t i o n , a n d s e d i m e n t a t i o n c o n s t a n t , w h i c h c e r t a i n l y a r e i n d i c a t i v e o f a n a l t e r a t i o n i nt h e g e o m e t r y o f t h e a m i n o a c i d s o f t h e p r o t e i n r e l a t i v e t o e a c h o t h e r . T h e u r e au n d o u b t e d l y c a u s e s t h e s e c h a n g e s b y c o m p e t i n g f o r t h e i n t e r n a l h y d r o g e n b o n d s o ft h e p r o t e i n . 1 6 T h e r e v e r s i b l e n a t u r e o f t h i s d e n a t u r a t i o n s h o w s t h a t , u p o n r e m o v a lo f u r e a , t h e p r o t e i n r e t u r n s t o i t s n a t u r a l c o n f o r m a t i o n . T h e u r e a , b e c a u s e o f i t sp a r t i c u l a r s t r u c t u r e , i s a t t r a c t e d n o n - s p e c i f i c a l l y t o many p e p t i d e l i n k s , w h e r e a s ah y d r o g e n - b o n d e d s u b s t r a t e i s a t t r a c t e d t o o n l y o n e o r a s m a l l n u m b e r o f s i t e s . I ti s c e r t a i n l y r e a s o n a b l e , h o w e v e r , t o e x p e c t t h a t t h e s p e c i f i c a l l y a t t r a c t e d s u b s t r a t ew i l l c a u s e s i m i l a r c o n f o r m a t i o n c h a n g e s i n i t s i m m e d i a t e e n v i r o n m e n t . C h a r g e d o rh y d r o c a r b o n - t y p e c o m p o u n d s a r e o b s e r v e d t o c a u s e a n a l o g o u s a l t e r a t i o n s i n p r o -t e i n s t r u c t u r e .

S e c o n d , t h e r e i s s u p p o r t f o r t h e p o s t u l a t e t h a t a p r e c i s e o r i e n t a t i o n o f c a t a l y t i cg r o u p s i s i m p o r t a n t i n e n z y m e c a t a l y s i s . T h e e v i d e n c e c o m e s f r o m a n a l o g i e s t ob o t h h e t e r o g e n e o u s a n d h o m o g e n e o u s c a t a l y s i s i n s i m p l e c h e m i c a l s y s t e m s a n d a l s of r o m t h e o b s e r v e d b e h a v i o r o f t h e e n z y m e s t h e m s e l v e s . 7 F i n a l l y , t h e i d e a t ha t t hes u b s t r a t e i s n e c e s s a r y t o p r o m o t e t h e p r o p e r o r i e n t a t i o n o f c a t a l y t i c g r o u p s c a ne x p l a i n p h e n o m e n a o t h e r t h a n t h e i r s p e c i f i c i t y , f o r e x a m p l e , s u b s t r a t e - p r o m o t e di s o t o p i c e x c h a n g e s . 1 8P r o v o c a t i v e s u g g e s t i o n s f o r t r a n s l a t i n g t h e t e m p l a t e i n t o c h e m i c a l t e r m s c a n b ed e r i v e d f r o m t h e i n d u c e d - f i t t h e o r y o f s p e c i f i c i t y . F o r e x a m p l e , F i g u r e 2 s h o w s a

p o s s i b l e s e q u e n c e o f r e a c t i o n s i n t h e f o r m a t i o n o f a p e p t i d e b o n d i n t h e c e n t e r o f ap r o t e i n m o l e c u l e . I n t h i s i l l u s t r a t i o n , e a c h a c t i v a t e d a m i n o a c i d c a n f o r m a n a c y lb o n d w i t h i t s a p p r o p r i a t e p o s i t i o n o n t h e s y n t h e s i z i n g t e m p l a t e . H o w e v e r , wea g a i n a s s u m e t h a t t h i s t e m p l a t e i s n o t i n i t i a l l y i n i t s p r o p e r o r i e n t a t i o n b u t t h a tt h i s o r i e n t a t i o n i s i n d u c e d b y t h e p r e s e n c e o f t h e p r e v i o u s a m i n o a c i d . T h u s i nF i g u r e 2 , a , t h e t e n t h a m i n o a c i d h a s f o r m e d a n a c y l b o n d a n d h e n c e h a s b r o u g h tp o s i t i o n 1 1 i n t o t h e p r o p e r a l i g n m e n t ( s c h e m a t i c a l l y i n d i c a t e d b y b e i n g o n a h o r i -z o n t a l s t r a i g h t l i n e ) t o a t t a c k t h e a c y l g r o u p o f t h e a m i n o a c i d a n h y d r i d e ,

0X - C - C H R , 1 - N H 3 + .

A f t e r f o r m a t i o n o f t h e a c y l - t e m p l a t e b o n d ( F i g . 2 , b ) , t h e a m i n o g r o u p i s i n t h ea p p r o p r i a t e p o s i t i o n t o a t t a c k t h e c a r b o n y l c a r b o n o f t h e t e n t h a m i n o a c i d . A st h i s p e p t i d e b o n d i s f o r m e d ( F i g . 2 , c ) , t h e c o m p l e t e d p o r t i o n o f t h e p e p t i d e p e e l so f f , a n d p o s i t i o n 1 2 , w h i c h w a s p r e v i o u s l y u n r e a c t i v e , i s b r o u g h t i n t o p r o p e r o r i e n t a -

V O L . 4 4 , 1 9 5 8 1 0 1

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01 1 +X HR , - N H 3 C H R 9O=C

NH0 11 C H R I O

1 0

0 uC - C H R , , - N H , c - .

l ,7C H R 9

0 = CNH

C H R I O

i f 4

CHR l oC-CHR12-NH3 0 = C

NC-CHR 1 1 113 1 0 \ ~ ~ ~

( C )

F I G . 2 . - P o s s i b l e sequence o f events i n p r o t e i n s y n t h e s i s . ( a ) eleventh a c t i v a t e da m i n o a c i d a p p r o a c h e s t e m p l a t e , i n which e l e v e n t h s i t e h a s been induced i n t o r e a c t i v ep o s i t i o n ; ( b ) a c y l - t e m p l a t e bond i s f o r m e d , and f a v o r a b l e g e o m e t r y f o r r e a c t i o n b e t w e e ne l e v e n t h a n d t e n t h amino a c i d s e s t a b l i s h e d ; ( c ) formation o f p e p t i d e bond b e t w e e ne l e v e n t h a n d t e n t h amino a c i d s i n d u c e s s i t e 1 2 i n t o r e a c t i v e p o s i t i o n and a l l o w s com-p l e t e d p o r t i o n o f p e p t i d e t o p e e l o f f t e m p l a t e .1 0 2

( a )

x

b )

n

X-

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SYMPOSIUMt i o n f o r r e a c t i o n w i t h i t s a c t i v a t e d a m i n o a c i d . P e r s u m a b l y i n t h i s c a s e t h e l a s tp o s i t i o n w o u l d b e s p e c i f i c f o r a s i m p l e a m i n o a c i d , i . e . , h a v i n g a f r e e c a r b o x y l g r o u p ,w h i c h t h e n d e t a c h e s t h e c o m p l e t e d p e p t i d e c h a i n f r o m t h e t e m p l a t e w h e n i t sa m i n o g r o u p i s a c y l a t e d .A l t h o u g h a c o v a l e n t b o n d w a s s h o w n i n t h e i l l u s t r a t i v e e x a m p l e , o t h e r p e r m u t a -t i o n s a r e p o s s i b l e . T h e a t t a c h e d , e . g . , t e n t h , r e s i d u e o f t h e p e p t i d e m i g h t b e p r e s e n ta s a t i g h t l y b o u n d a d e n y l a t e . A s t h e n e x t , i . e . , e l e v e n t h , a c y l a d e n y l a t e a r r i v e s , i t sa m i n o g r o u p r e a c t s t o f o r m a p e p t i d e b o n d , a n d i t s a d e n y l a t e d c a r b o x y l g r o u p i st h e n t i g h t l y b o u n d . O r t h e t i g h t l y b o u n d g r o u p s c o u l d b e a t t h e a m i n o e n d o f t h ep e p t i d e , i n w h i c h c a s e s e l o n g a t i o n o f t h e p e p t i d e w o u l d o c c u r b y d i s p l a c e m e n t b yt h i s a m i n o g r o u p i n t h e c a r b o n y l o f t h e i n c o m i n g a m i n o a c i d a n h y d r i d e . T h e k e yf e a t u r e s o f t h e m e c h a n i s m a r e , t h e r e f o r e , t h a t t h e e n d o f t h e c o m p l e t e d p o r t i o n o ft h e p e p t i d e c h a i n i s t i g h t l y b o u n d t o t h e t e m p l a t e ; t h a t t h i s t i g h t b o n d i s r e l e a s e du p o n f o r m a t i o n o f t h e p e p t i d e b o n d w i t h t h e s u b s e q u e n t a m i n o a c i d ; a n d t h a t e a c hp e p t i d e b o n d f o r m e d i n d u c e s a new t e m p l a t e a r e a , w h i c h a l l o w s t h e f o r m a t i o no f t h e n e x t b o n d .

T h i s c h e m i c a l m o d e l i s c o n s i s t e n t w i t h t h e t e m p l a t e m o d e l . I t e x p l a i n s how az i p p e r - t y p e a c t i o n c o u l d o c c u r , s i n c e e a c h l i n k a d d e d t o t h e c h a i n e s t a b l i s h e s t h ec o n d i t i o n s f o r t h e n e x t l i n k . I t e x p l a i n s how t h e p e p t i d e c h a i n c a n p e e l o f f t h et e m p l a t e a s e a c h l i n k i s c o m p l e t e d . T h e p e e l i n g - o f f o c c u r s b e c a u s e t h e f o r m a t i o n o ft h e p e p t i d e b o n d c a u s e s a d r a m a t i c c h a n g e i n c h e m i c a l t y p e . I n t h e e x a m p l es h o w n , t h e c o v a l e n t b o n d i s b r o k e n . I n t h e c a s e o f a s t r o n g l y a t t r a c t e d a m i n oa c y l - X o r -NH3, e i t h e r t h e X i s r e l e a s e d o r t h e p o s i t i v e c h a r g e i s r e m o v e d . H e n c ea t e m p l a t e a f f i n i t y s t r o n g l y d e p e n d e n t o n X o r t h e p o s i t i v e c h a r g e w o u l d b e e l i m i -n a t e d . A s a r e s u l t , t h e i n t r a m o l e c u l a r a t t r a c t i o n s i n b o t h t h e t e m p l a t e a n d t h ec o m p l e t e d p e p t i d e w o u l d p r o b a b l y b e c o m e m o r e i m p o r t a n t t h a n t h e t e m p l a t e -p e p t i d e a t t r a c t i o n . T h e p e e l i n g - o f f o f t h e p e p t i d e c h i n a n d t h e r e t u r n o f t h e t e m -p l a t e t o i t s o r i g i n a l c o n d i t i o n t h e n a l l o w t h e i n i t i a t i o n o f new c h a i n s b e f o r e t h e c o m -p l e t i o n o f t h e o l d .T h i s m o d e l a l s o e x p l a i n s o t h e r p h e n o m e n a w h i c h a r e n o t a n ec es s a r y c o n -c o m i t a n t o f t h e z i p p e r c o n c e p t . F o r e x a m p l e , a z i p p e r - t y p e m o d e l d o e s n o t p r o v i d ea n y n e c e s s a r y r e a s o n f o r t h e a b s e n c e o f i n t e r m e d i a t e s o n f a i l u r e t o s u p p l y o n ea m i n o a c i d . T h e r e w o u l d b e n o r e a s o n t o k e e p t h e t e m p l a t e f r o m l i n k i n g r e s i d u e su n t i l a p o s i t i o n r e q u i r i n g t h e d e f i c i e n t o n e w a s r e a c h e d , i n w h i c h c a s e t h e p a r t i a l l yc o m p l e t e d p e p t i d e c h a i n w o u l d a c c u m u l a t e . H o w e v e r , t h e c o n c e p t t h a t t h e g r o w -i n g e n d o f t h e c h a i n i s a l w a y s t i g h t l y b o u n d t o t h e t e m p l a t e u n l e s s r e l e a s e d b y t h es u b s e q u e n t a m i n o a c i d means t h a t a d e f i c i e n c y w o u l d l e a v e t h e t e m p l a t e p o i s o n e db y i t s o wn p a r t i a l l y c o m p l e t e d c h a i n . T h u s i n t e r m e d i a t e s c o u l d o n l y a c c u m u l a t ei n a m o u n t s e q u a l t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f t e m p l a t e , w h i c h i s v e r y s m a l l . M o r e o v e r ,t h e c h a i n c o u l d n o t s t a r t i n t h e m i d d l e a n d p r o c e e d t o t h e e n d , s i n c e t h e i n i t i a t i n gs i t e h a s n o t b e e n i n d u c e d i n t o i t s p r o p e r o r i e n t a t i o n .F i n a l l y , i t s h o u l d b e s t a t e d t h a t t h e a u t h o r i s w e l l a w a r e t h a t t h i s t h e o r y i s n o t ac o m p l e t e a n s w e r t o p r o t e i n s y n t h e s i s . I t i s , h o w e v e r , a s f a r a s h e k n o w s , c o m p a t i -b l e w i t h t h e e x i s t i n g f a c t s a n d l e a d s t o c o n c r e t e p r e d i c t i o n s , e . g . , u n d e r c o n d i t i o n sw h e r e a s y m m e t r i c l a b e l i n g i s o b s e r v e d , a p a r t i c u l a r a m i n o a c i d s h o u l d h a v e p r o g r e s -s i v e l y i n c r e a s i n g s p e c i f i c a c t i v i t y o n g o i n g d o w n a c h a i n . A l s o t h e c o m b i n a t i o n o f

V O L . 4 4 , 1 9 5 8 1 0 3

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SYMPOSIUMd a t a f r o m t h e a c t i o n o f p u r e e n z y m e s w i t h d a t a o n t i m i n g i n i n v i v o s y s t e m s p u t ss o m e c h e m i c a l f l e s h o n t h e m e c h a n i c a l s k e l e t o n o f t h e t e m p l a t e .Summary.-The p r o b l e m o f p r o t e i n s y n t h e s i s i s f o r m i d a b l e b ec a u s e o f a c o m b i n a -t i o n o f t h r e e r e q u i r e m e n t s , e a c h o n e o f w h i c h b y i t s e l f i s r a t h e r e a s i l y s a t i s f i e d .S i n c e t he c o n d i t i o n s a r e s a t i s f i e d i n e a c h c a s e b y a n e n z y m e- c a t a l y z e d r e a c t i o n , t h e t e m p l a t e i n p r o t e i n s y n t h e s i s i s p r e s u m e d t o b e e n z y m e - l i k e i n c h a r a c t e r . R e -c e n t l y a n e w t h e o r y t o e x p l a i n e n z y m e s p e c i f i c i t y h a s b e e n p r o p o s e d w h i c h s u g -g e s t s t h a t r e a c t i o n b e t w e e n e n z y m e a n d s u b s t r a t e c a n o c c u r o n l y a f t e r a c h a n g e i np r o t e i n s t r u c t u r e i n d u c e d b y t h e s u b s t r a t e i t s e l f . W h en t h i s t h e o r y i s a p p l i e d t ot h e p r o b l e m o f p r o t e i n s y n t h e s i s , i t i s s e e n t h a t t h e e x i s t i n g d a t a c a n b e e x p l a i n e d b ya f l e x i b l e t e m p l a t e i n w h i c h e a c h c o m p l e t e d p e p t i d e b o n d i n d u c e s a n a l i g n m e n tn e c e s s a r y t o t h e f o r m a t i o n o f t he n ex t b o n d .

* R e s e a r c h c a r r i e d o u t a t B r o o k h a v e n N a t i o n a l L a b o r a t o r y u n d e r t h e a u s p i c e s o f t h e U . S .A t o m i c E n e r g y C o m m i s s i o n .t V i s i t i n g p r o f e s s o r o f c h e m i s t r y , C o r n e l l U n i v e r s i t y , 1 9 5 7 - 5 8 . F . L i p m a n n , A d v a n c e s i n E n z y m o l . , 1 , 9 9 , 1 9 4 1 .2 M. B . H o a g l a n d , E . B . K e l l e r , a n d P . C . Z a m e c n i k , J . B i o l . C h e m , 2 1 8 , 3 4 5 , 1 9 5 6 ; J . A . D e -M o s s a n d G . D . N o v e l l i , B i o c h i m . e t B i o p h y s . A c t a , 1 8 , 5 9 2 , 1 9 5 5 ; E . W. D a v i e , V . V . K o n i n g s -b e r g e r , a n d F . L i p m a n n , A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , 6 5 , 2 1 , 1 9 5 6 ; P . B e r g , J . B i o l . C h e m . , 2 2 2 , 1 0 2 5 ,1 9 5 6 .3 H . C h a n t r e n n e , C o m p t . r e n d . T r a v . L a b . C a r l s b e r g , 2 6 , 1 0 , 2 9 7 , 1 9 4 8 ; D . E . K o s h l a n d , J r . , J .Am . C h e m . S o c . , 7 3 , 4 1 0 3 , 1 9 5 1 .4 M. G r u n b e r g - M a n a g o , P . J . O r t i z , a n d S . O c h o a , S c i e n c e , 1 2 2 , 9 0 7 , 1 9 5 5 ; B i o c h i m . e t B i o p h y s .A c t a , 2 0 , 2 6 9 , 1 9 5 6 .6 H . 0 H a l v o r s o n a n d S . S p i e g e l m a n , J . B a c t e r i o l . , 6 4 , 2 0 7 , 1 9 5 2 .6 G . E h r e n s v a r d , A n n . R e v . B i o c h e m . , 2 4 , 2 7 5 , 1 9 5 5 ; S . S p i e g e l m a n , H . 0 . H a l v o r s o n , a n d R .B e n - I s h a i , Amino A c i d M e t a b o l i s m , e d . W. D . M c E l r o y a n d B . G l a s s ( B a l t i m o r e : J o h n s H o p k i n sP r e s s , 1 9 5 5 ) , p . 1 2 4 .7 C . E . D a l g l e i s h , S c i e n c e , 1 2 5 , 2 7 1 , 1 9 5 7 .8 M. F l a v i n a n d C . B . A n f i n s e n , J . B i o l . C h e m . , 2 1 1 , 3 6 7 , 1 9 5 4 ; M. V a u g h a n a n d C . B . A n f i n s e n ,J . B i o l . C h e m . , 2 1 1 , 3 7 5 , 1 9 5 4 .9 A . S o l s a n d R . K . C r a n e , J . B i o l . C h e m . , 2 1 0 , 5 8 1 , 1 9 5 4 . E . F i s h e r , B e r . , 2 7 , 2 9 8 5 , 1 8 9 4 .

1 1 T h e k e y - l o c k t h e o r y o f s p e c i f i c i t y i s a l s o f r e q u e n t l y r e f e r r e d t o a s a t e m p l a t e t h e o r y . I nt h i s a r t i c l e i t w i l l b e m e n t i o n e d a s a k e y - l o c k t h e o r y t o d i s t i n g u i s h i t f r o m t h e t e m p l a t e t h e o r yo f p r o t e i n s y n t h e s i s , w h i c h , o f c o u r s e , d e a l s w i t h a q u i t e d i f f e r e n t p r o b l e m .

1 2 D . E . K o s h l a n d , J r . , i n T h e E n z y m e s , e d . P . B o y e r , H . L a r d y , a n d K . M y r b a c k ( r e v . e d . , Ne wY o r k : A c a d e m i c P r e s s ) , V o l . 1 ( i n p r e s s ) .1 3 L . A . H e p p e l a n d R . J . H i l l m o e , J . B i o l . C h e m . , 1 8 8 , 6 6 5 , 1 9 5 1 .1 4 H . W i e s m e y e r a n d M. C o h n , F e d e r a t i o n P r o c . , 1 6 , 2 7 0 , 1 9 5 7 .1 5 J . I . H a r r i s , N a t u r e , 1 7 7 , 4 7 1 , 1 9 5 6 ; H . N e u r a t h , J . A . R u p l e y , a n d W. J . D r e y e r , A r c h .

B i o c h e m . a n d B i o p h y s . , 6 5 , 2 4 3 , 1 9 5 6 ; E . P . K e n n e d y a n d D . E . K o s h l a n d , J r . , J . B i o l . C h e m . , 2 2 8 ,4 1 9 , 1 9 5 7 .1 6 W. K a u z m a n n , M e c h a n i s m o f E n z y m e A c t i o n , e d . W. D . M c E l r o y a n d B . G l a s s ( B a l t i m o r e :J o h n s H o p k i n s P r e s s , 1 9 5 4 , p . 7 0 .1 7 D . E K o s h l a n d , J r . , J . C e l l . C o m p . P h y s i o l . , 4 7 , S u p p l . 1 , p . 2 1 7 , 1 9 5 6 .1 8 D . E . K o s h l a n d , J r . , D i s c u s s i o n s F a r . S o c . , 2 0 , 1 4 2 , 1 9 5 6 .

1 0 4 P R o c . N . A . S .