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USO DE POPULAES DIVERGENTES PARA DETECO DE QTLS EM SUNOS

Simone E.F. Guimares e Paulo Svio Lopes

Departamento de Zootecnia - UFV Rua P.H. Rolfs, s/n

36570000 Viosa, MG E-mail: sfacioni@mail.ufv.br

INTRODUO No Brasil, de acordo com TALAMINI et al., 1997, o valor do Produto Interno Bruto da Suinocultura foi de 8,7 bilhes de dlares em 1996, sendo um dos maiores do setor agropecurio. O pas apresenta um rebanho de cerca de 33 milhes de cabeas e tem produzido cerca de 1,5 milho de toneladas de carne por ano. De acordo com DESCHAMPS (1998), no pas, aps anos de produo estagnada, a suinocultura vem crescendo em volume de produo, utilizando novas tecnologias e obtendo melhores ndices produtivos. Tendo em vista a importncia da explorao comercial de sunos, e que a espcie vem se tornando uma opo para estudos comparativos com humanos, a deteco de QTLs (Quantitative Trait Loci) em sunos torna-se uma importante ferramenta, no apenas por ser um modelo gentico muito favorvel, mas tambm pela possibilidade de incorporar dados gerados a programas industriais de melhoramento gentico.

PROJETOS DE MAPEAMENTO DO GENOMA SUNO O genoma suno composto por 19 pares cromossmicos, com comprimento de cerca de trs bilhes de pares de base de DNA, o que gera, tal como em humanos, um mapa em torno de 30 cM (centiMorgans). O propsito dos projetos de mapeamento encontrar marcadores genticos que cubram o genoma produzindo um mapa em dois nveis: um mapa gentico e um mapa fsico. O mapa gentico mostra as distncias entre marcadores estimada a partir da quantidade de recombinaes em cruzamentos experimentais. O mapa fsico permite a localizao de grupos de ligao em cromossomos especficos. De acordo com ROTHSCHILD e PLASTOW (1999), os esforos da comunidade cientfica internacional tm sido significativos para o mapeamento do genoma suno. Cientistas e administradores tm realizado esforos cooperativos para que o mapeamento genmico das espcies domsticas possa ser utilizado em programas comerciais. O PigMap Project (ARCHIBALD et al., 1994) iniciou-se na Europa, financiado pela Comunidade Econmica Europia. O PigMap envolve 18 laboratrios europeus, alm de sete outros laboratrios dos EUA, Japo e Austrlia. O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), deu incio a dois processos: o primeiro um grande projeto desenvolvido no Meat Animal Research Center no Clay Center, Nebraska; O outro o National Animal Genome Research Program, desenvolvido sob direo do USDA a partir de 1993. Este programa foi desenhado para promover uma estrutura

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que estimule a colaborao para o mapeamento gentico em todas as espcies, incluindo sunos. A partir de ento, cientistas de entidades privadas e governamentais criaram o Swine Genome Technical Committee. A coordenao do US Pig Genome Project, associado a outros projetos, fez com que o status do mapa gentico suno evolusse muito rapidamente, sendo hoje um dos mais completos. Em 1989, 50 genes e marcadores estavam mapeados, em 1999, perto de 1800 genes e/ou marcadores j tinham sido localizados, apesar de nem todos terem sido publicados. A tabela 1 cita exemplos de QTLs e genes identificados e usados pela indstria. Tabela 1. Alguns QTLs e genes candidatos identificados e usados pela indstria. QTLs Crescimento Cromossomos 1, 4, 6, 7, 13 Obesidade Cromossomos 4, 6, 7, 13, 18 Comprimento intestinal Cromossomo 4 Resposta imune Cromossomos 1, 4, 6 Genes candidatos e principais RYR1 Sndrome do estresse suno ECF18R Diarria KIT Cor de pelagem (branco dominante) MC1R Cor de pelagem (vermelho/preto) HFABP e AFABP Gordura intramuscular Testes da indstria Teste de paternidade Uso no exclusivo Teste do halotano Qualidade de carne uso no exclusivo ESR Tamanho de leitegada uso exclusivo MC1R Cor vermelha/preta uso exclusivo Testes no disponveis Vrias caractersticas

Fonte: Adaptado de ROTHSCHILD e PLASTOW, 1999

MAPEAMENTO DE QTLS E GENES CANDIDATOS Por definio, QTLs so regies cromossmicas relacionadas com a variao fenotpica das caractersticas quantitativas. Como poucos locos economicamente importantes so conhecidos, e os QTLs no tm suas bases moleculares definidas, estes tm sido referidos mais como uma associao matemtica do que como entidade biolgica, sendo sua herana acompanhada pelos marcadores. Portanto, QTLs podem ser melhor definidos como associaes estatsticas entre dados relativos a uma regio genmica e a variabilidade fenotpica existente entre populaes segregantes (LI, 1998). De acordo com BURROW e BLAKE (1998), os experimentos de mapeamento de QTLs possuem trs objetivos bsicos: 1) localizar genes responsveis pela variao fenotpica; 2) fazer introgresso de cromatina extica, e 3) servir como base para clonagens de QTLs responsveis por fentipos especficos. A falta de uma definio molecular do que seriam os QTLs pode estar contribuindo para que ainda no se tenham QTLs clonados.

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O mapeamento em animais domsticos envolve duas estratgias bsicas: 1) cruzamento entre duas populaes divergentes que tenham fixado, ou estejam prximas da fixao para diferentes alelos; 2) mapeamento de QTLs pode ser feito em populaes comerciais utilizando grandes pedigrees que possuam dados completos de acasalamentos. De acordo com ANDERSSON et al. (1998), o cruzamento entre populaes divergentes tem como vantagens: 1) alelos de grande efeito podem estar segregando; 2) maior poder nas anlises estatsticas, devido a alta heterozigosidade nos QTLs; 3) o poder das anlises estatsticas aumenta, pois a fase de ligao entre marcadores e dentro de QTLs devem ser consistentes entre toda F1; 4) o aumento na heterozigosidade aumenta o nmero de marcadores e cruzamentos informativos. Como principal desvantagem, um QTL detectado por meio deste delineamento pode ou no estar controlando a variao gentica dentro de populaes comerciais, devendo ser testado antes de qualquer introgresso. Com relao aos marcadores utilizados nos programas de mapeamento genmico tem-se tambm basicamente duas opes: os microssatlites e os genes candidatos. Os microssatlites tm sido considerados como os marcadores de eleio em programas de varredura genmica, pois apresentam todas as qualidades requeridas em um bom marcador: so altamente polimrficos, sua herana Mendeliana (ao contrrio da herana polignica dos QTLs), so abundantes e espalhados aleatoriamente pelo genoma, e sua anlise permite a amplificao por PCR. Os genes candidatos por sua vez so genes sequenciados de funo biolgica conhecida e que esto envolvidos com o desenvolvimento da caracterstica. Podem ser genes estruturais ou genes regulatrios em uma via bioqumica que afeta o carter. ROTHSCHILD e SOLLER (1997) citam que a metodologia de estudo de genes candidatos no cara e que apresenta muitas vantagens tais como: alto poder estatstico, ampla aplicabilidade, baixo custo, simplicidade operacional e conveniente aplicao a MAS (Marker Assisted Selection). Como principais passos no estudo de genes candidatos, os autores enumeram: escolha dos genes; obteno dos primers para amplificar o gene; busca dos polimorfismos; desenvolvimento de tcnicas prticas de genotipagem em larga escala; busca de associaes entre o gene candidato e o fentipo da caracterstica.

IDENTIFICAO DE QTLS EM POPULAES DE SUNOS GENETICAMENTE DIVERGENTES

Em sunos, os projetos de mapeamento genmico, tm-se utilizado de cruzamentos entre raas comerciais (Landrace, Large White, Pietran) e raas comuns (selvagens, tipo banha ou nativas). Nos EUA, tm sido utilizadas as raas chinesas, e as equipes europias tm utilizado o porco selvagem europeu como contraste para seus cruzamentos divergentes. No Brasil, em 1998, iniciou-se no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viosa a construo de uma populao segregante de sunos, utilizando como base gentica 20 fmeas de linhagens comerciais e 2 machos da raa nativa Piau. Estes cruzamentos permitiram a seleo de 54 fmeas e 6 machos F1, que foram acasalados com inicio do nascimento da gerao F2 - que deve ter em torno de 450 animais - marcado para final do 1 semestre de 2000.

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Pouco se sabe a respeito da origem das raas sunas brasileiras, temse especulado que as mesmas so provenientes de sunos trazidos pelos portugueses durante o perodo colonial, havendo ainda indcios de influncia de porcos holandeses e mesmo de animais procedentes da frica poca do trfico de escravos (VIANNA, 1985). As raas nativas, vinham sendo criadas em pequenas propriedades rurais onde pela rusticidade e grande adaptao s condies de manejo precrio exigiam poucos cuidados alimentares e sanitrios, fornecendo s populaes alm da carne, a banha de que necessitavam (FRANA, 1991). Entretanto, esta tendncia foi invertida durante a dcada de 90. Poucos animais so remanescentes destas raas em todo o pas. Criatrios considerados como referncia foram extintos e com ele as raas, que esto em vias de extino. Suas principais caractersticas fenotpicas, como a produo de gordura, j no interessam mais ao consumidor, o que vem restringindo o mercado para venda destes animais. Para formao de populaes referncia para estudos de mapas de ligao e efeitos de QTLs e genes candidatos, estes animais possuem um grande potencial ainda no explorado. Alm do seu fentipo relativo a deposio de gordura/carne ser o oposto das raas comerciais, as raas nativas apresentam extrema resistncia a condies precrias de manejo e doenas. IRGANG (1986) cita que a preservao do potencial gentico destas raas poderia ser til, para eventuais cruzamentos destinados a aumentar a rusticidade de animais derivados exclusivamente de raas importadas. Portanto, somando-se a divergncia existente entre as raas escolhidas para originar a populao de referncia, com o imenso conhecimento que j existe sobre o genoma suno, fica claro o potencial multiplicador destas pesquisas genmicas. Todos os animais parentais e da gerao F1 esto sendo genotipados, tanto para marcadores annimos, tipo microssatlite, quanto para genes candidatos (leptina, receptor da leptina, hormnio de crescimento, fatores miognicos, fatores de crescimento, entre outros). Assim que a gerao F2 nascer, esta ser genotipada e avaliada para as caractersticas: converso alimentar, taxa de crescimento, avaliao da carcaa in vivo (rea de olho de lombo e espessura de toucinho), e ps abate (rendimento, cortes e qualidade de carne). Numa segunda etapa do mesmo projeto, pretende-se avaliar as caractersticas de resistncia a doenas e reprodutivas.

IDENTIFICAO DE MARCADORES DE RNA MENSAGEIRO Com a evoluo dos mtodos de anlise gnica, tm surgido tcnicas otimizadas de extrao e amplificao de RNA genmico. A primeira delas, a RT-PCR (Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction), uma tcnica extremamente sensvel, possibilitando a deteco da expresso de genes especficos em pequenas amostras de tecido, ou at em poucas clulas. Pela RT-PCR, faz-se aps a extrao do RNA, a sntese do cDNA (DNA complementar), que ento amplificado especificamente para um determinado gene. Uma tcnica alternativa a DDRT-PCR (Differential Display Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction), que permite aps a sntese do cDNA amplificar e detectar sequncias diferencialmente expressas (LIANG e PARDEE, 1992). Ao contrrio da RT-PCR, a DDRT-PCR se utiliza de primers arbitrrios, que permitem a amplificao de vrias sequncias aleatrias mesmo as expressas em baixos nveis em uma nica reao de PCR. Estas sequncias aps amplificadas so clonadas e sequenciadas, permitindo a identificao dos genes expressos.

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A DDRT-PCR por ser um mtodo poderoso para elucidar diferenas e/ou mudanas na expresso gnica entre animais com fentipos divergentes, tem sido tambm utilizada no projeto desenvolvido pelo Departamento de Zootecnia da UFV como uma das ferramentas na deteco de polimorfismos entre a raa nativa e as raas comerciais utilizadas em seus cruzamentos. Os marcadores de RNA permitem que sejam identificadas sequncias gnicas importantes para a expresso do fentipo no momento em que este est ocorrendo. O DNA ao contrrio, o mesmo para todas as clulas do animal, independente de seu estado fisiolgico e de suas interaes genticas e com o ambiente. Por este motivo e pela alta sensibilidade das tcnicas utilizadas na obteno de seus marcadores, acredita-se que o RNA possa ser fonte importante de informaes, auxiliando rotineiramente a identificao de major e minor genes na gentica e no melhoramento animal.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ANDERSSON, L., ANDERSSON, K., EKLUND, L.A. et al. Mapping of QTLs for growth

and fatness in the pig. In: Molecular dissection of complex traits. 1 ed. CRC, p. 241-254. 1998.

ARCHIBALD, A., BROWN, J., COUPERWHITE, S. et al. The PigMap consortium linkage map of the pig (Sus scrofa). Mammalian Genome, 6:157-175. 1994.

BURROW, M.D., BLAKE T.K. Molecular tools for the study of complex traits In: Molecular dissection of complex traits. 1 ed. CRC, p. 13-30. 1998.

DESCHAMPS, J.C. A cadeia produtiva na suinocultura; In: Agronegcio Brasileiro. CNPq/MCT, p. 239-256. 1998.

FRANA, L.R. Anlise morfofuncional da espermatognese de sunos adultos da raa Piau. Tese MS. UFMG. 185p. 1991.

IRGANG, R. Sunos de raas nativas: o interesse da pesquisa. Suinocultura Industrial, 87:13-20. 1986.

LI, Z. Molecular analysis of epistasis. In: Molecular dissection of complex traits. 1st ed. CRC, p.119 - 130. 1998.

LIANG,P., PARDEE, A.B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of polimerase chain reaction. Science, 257:967-971, 1992.

ROTHSCHILD, M.F., PLASTOW G. Advances in pig genomics and industry applications. AgBiotechnet, Vol. 1, Fevereiro 1999, ABN007

ROTHSCHILD, M.F., SOLLER, M. Candidate gene analysis to detect traits of economic importance in domestic livestock. Probe, 8:13-20. 1997.

TALAMINI D.J.D., SANTOS FILHO, J. CANEVER, M.D. A cadeia produtiva de sunos; In:ABRAVES, 7, 1997, p. 63-69. 1997.

VIANNA, A.T. Os sunos. 14 ed.Nobel, 384p. 1985.