Raziskave staranja cloveskih ocesnih lec z

Ramansko spektroskopijo

Seminar

Avtor: Klemen Kunstelj

Mentor: prof. dr. Dragan Mihailovicprof. dr. Marko Hawlina

25.02.2004

Povzetek

Ze dolgo casa se znanstveniki sprasujejo, zakaj se med 40. in 50. letom

ljudem poslabsa vid. Ze veliko raziskav in razlicnih pristopov k temu

vprasanju je bilo narejenih. Eden izmed moznih je opisan tudi v tem

seminarju, in sicer je to raziskava kemijskih sprememb v cloveski leci

z Ramansko spektroskopijo.

KAZALO 2

Kazalo

1 Uvod 3

2 Ramanska spektroskopija 3

2.1 Ramansko sipanje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.2 Elektricni dipolni moment molekule . . . . . . . . . . . . . . . 42.3 Klasicna teorija Ramanskega sipanja . . . . . . . . . . . . . . 5

3 Fluorescenca 6

4 Zgradba lece 8

4.1 Kapsula, Korteks, Epitelij in Jedro . . . . . . . . . . . . . . . 84.2 Proteini-kristalini . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

5 Ramanov spektrometer 10

6 Zakljucek 12

1 Uvod 3

1 Uvod

Nacinov, kako opazovati mikroskopske spremembe v kemijski strukturi clove-ske lece je veliko [7], [9], [10]. Eden izmed njih je Ramanska spektroskopija.Njeni prednosti pred ostalimi sta predvsem preprosta priprava vzorcev (lahkouporabimo tudi svez in nespremenjen vzorec) in relativno majhen vpliv nasamo strukturo vzorca oz. ocesne lece (moznost veckratnega spektroskopi-ranja).

Ocesno leco obdaja membrana imenovana tudi kapsula. Sprednjo stranlece imenujemo epitelij (epitelne celice), zadnjo stran pa korteks (kortikalnavlakna). V sredini lece je jedro, ki je prav tako sestavljeno iz vlaknastih celic.Sicer pa se v leci nahajajo v glavnem proteini, ki predstavljajo 35% mase lecesesalca [4], [5].

V tem seminarju bom skusal predstaviti nekaj s starostjo povezanih spre-memb v kemijski strukturi lece s pomocjo Ramanske spektroskopije in hkratiz metodo razmerja intenzitet Ramanskih nihanj in fluorescence pokazati, daso nekatere izmed njih nelinearne oz. nenadne.

2 Ramanska spektroskopija

2.1 Ramansko sipanje

Ko monokromatska svetloba s frekvenco ω0 pade na opticno prepustno snov,gre del svetlobe skozi snov z nespremenjeno ω0, del pa se siplje. Ce anal-iziramo sipani del, lahko poleg zacetne ω0 opazimo tudi druge frekvenceω = ω0 ± ωM . Pri tem lahko zasledimo, da se ωM ujemajo s frekvencamirotacijskih, vibracijskih in elektronskih prehodov med molekulami v snovi,od katere se je svetloba sipala. Sipana svetloba ima tudi drugacno polar-izacijo kot zacetna. Taksno sipanje svetlobe se imenuje Ramansko sipanje

po indijskem fiziku C.V.Ramanu, ki je kot prvi opazil ta pojav v tekocinahleta 1928 [1].

Spekter sipane svetlobe imenujemo Ramanski spekter, v katerem spre-menjene frekvence tvorijo Ramanske crte oz. pasove. Ce ima sipana svetlobamanjso ω od ω0, proces imenujemo Stokesov proces. Pri tem gre za prehodiz nizjega energijskega stanja E1 na visje E2, kar pomeni, da sistem anihilirafoton z energijo hω0 in odda foton z energijo h(ω0 −ωM). Ce pa je frekvencavecja od ω0 pa govorimo o anti-Stokesovem procesu, kjer gre za prehod izvisjega (vzbujenega) energijskega stanja E1 v nizje energijsko stanje E2 oz.sistem odda foton z energijo h(ω0 + ωM) [1].

Ramanske pasove v spektru lahko karakteriziramo z velikostjo spremembe

2.2 Elektricni dipolni moment molekule 4

Virt. StanjeVirt. Stanje

Sww hh -0

0wh

)a( )b(

1E1E

2E

2E

ASww hh +00whg

g ¢

Fonon

g

g ¢

Fonon

Slika 1: Slika Stokes in anti-Stokes procesa in pripadajoca Feynmanova dia-grama za oba procesa.

frekvence

|∆ω| = |ω0 − ω| = ωM . (1)

Potem lahko recemo, da je ∆ω pozitivna za Stokesovo in negativna zaanti-Stokesovo sipanje [1].

2.2 Elektricni dipolni moment molekule

Ce molekulo postavimo v elektricno polje E, lahko njen elektricni dipolnimoment zapisemo kot

P = P0 + αE, (2)

kjer je P0 permanentni dipolni moment, α pa tenzor polarizabilnosti. Zanimanas predvsem drugi del enacbe (predpostavimo, da ima molekula v prvempriblizku center simetrije, zato nima permanentnega dipolnega momenta), kiga lahko napisemo v obliki:

Px

Py

Pz

=

αxx αxy αxz

αyx αyy αyz

αzx αzy αzz

Ex

Ey

Ez.

(3)

α je realen in simetricni tenzor 2.ranga [1].

2.3 Klasicna teorija Ramanskega sipanja 5

2.3 Klasicna teorija Ramanskega sipanja

Predpostavimo, da imamo interakcijo molekule s harmonicno oscilirajocimelektricnim poljem E = E0 cos(ω0t) [1]. Na zacetku predpostavimo, daimamo eno samo molekulo, katere jedra lahko prosto nihajo in se ne morejovrteti (jedro lahko niha okoli ravnovesne lege). Zato lahko recemo, da je po-larizabilnost funkcija nuklearnih koordinat. Za majhna nihanja lahko kom-ponente tenzorja polarizabilnosti razvijemo v Taylorjevo vrsto po normalnihkoordinatah:

αij = (αij)0 +∑

k

(

∂αij

∂Qk

)

0

Qk +1

2

∑

k,l

(

∂2αij

∂Qk∂Ql

)

0

QkQl + . . . , (4)

kjer je (αij)0 vrednost polarizacijkega tenzorja v ravnovesju, Qk, Ql pa sonormalne koordinate nihanja. Vrednost posameznih odvodov racunamo vravnovesju. V enacbi (4) upostevamo le prva dva clena (elektricna harmonskaaproksimacija) ter namesto αij pisemo α:

αk = α0 + α′

kQk (5)

pri cemer smo namesto tenzorja ∂αij

∂Qkpisali tenzor α′

k. Ce privzamemo, da gre

za harmonicno nihanje lahko normalne koordinate zapisemo v obliki Qk =Qk0

cos(ωkt+ δM), kjer je Qk0amplituda nihanja, ωk frekvanca nihanja jedra

in δk fazni faktor. To potem vstavimo v enacbo (5) in preoblikujemo (3) vobliko:

P = α0 · E0 cos(ω0t) + α′

k· E0 cos(ω0t)Qk0

cos(ωkt + δk). (6)

Enacbo (6) lahko s pomocjo trigonometricnih identitet zapisemo v obliki:

P = P 0(ω0) cos(ω0t) + P 0(ω0 − ωk) cos(ω0 − ωk − δk)+P0(ω0 + ωk) cos(ω0 + ωk + δk)

P 0(ω0) = α0 · E0

P 0(ω0 − ωk) = 1

2Qk0

α′

k · E0

P 0(ω0 + ωk) = 1

2Qkα

′

k · E0

(7)

V enacbah (7) je P 0(ω0) amplituda Rayleighovega sipanja s frekvenco ω0,P 0(ω0−ωk) amplituda Raman-Stokes sipanja s frekvenco ω0−ωk in P 0(ω0 +ωk) amplituda Raman-antiStokes sipanja s frekvenco ω0 + ωk.

3 Fluorescenca 6

Iz teh matematicnih izracunov lahko na preprost nacin razberemo meha-nizem Ramanskega sipanja po klasicni teoriji sevanja. To sipanje je posled-ica nihanja molekulskega dipola s frekvenco ω0 ± ωk. To pa nastane zaradivpliva nihanja molekule (ωk) na nihanje dipola s frekvenco vpadlega sevanja(ω0). Lahko bi rekli tudi, da se sklapljanje elektricnega polja in nihanjajeder molekul vidi kot harmonicna sprememba polarizacije oz. da so Ra-manske frekvence sklopljene frekvence med frekvenco vpadnega sevanja ω0

in molekulskimi frekvencami ωk. Na sliki 6 imamo primer Ramanskega spek-tra lece letnik 1964 na energijskem obmocju med 300 in 1600 cm−1.

Zakljucimo lahko s tem, da pride do Ramanskega sipanja le, ce se spre-meni polarizabilnost molekule oz. je katerikoli element tenzorja (α′

ij)k ra-

zlicen od 0. Se drugace povedano, pogoj za Ramansko aktivnost prehodaje, da ima v ravnovesni legi ena izmed komponent tenzorja polarizabilnostioz. projekcija te komponente na smer normalne koordinate od 0 razlicengradient [1].

Slika 2: Levo je Ramanski spekter s fluorescenco lece 1964 in desno Ramanskispekter, ko odstejemo fluorescenco.

3 Fluorescenca

Emisija svetlobe je obraten proces od absorbcije svetlobe v snovi. Takolahko elektron iz visjega vzbujenega stanja preide v nizje nezasedeno stanje.Pri tem odda elektromagnetno sevanje z energijo, ki je enaka razliki energijmed stanjema prehoda E = E2 − E1 = hω. Stopnja takega sevanja jedolocena s produktom gostote visjeenergijskih stanj nu, gostote nezasedenihnizjeenergijskih stanj nl in verjetnosti za prehod med stanjema Pul:

R = nunlPul (8)

3 Fluorescenca 7

Najpomembnejsi pogoj za emisijo je, da sistem ni v ravnovesju, karpomeni da mora biti sistem na nek nacin vzbujen. Poseben primer emisije jeemisija svetlobe ali luminiscenca [2]. Vzbuditev z elektricnim tokom imenu-jemo elektroluminiscenca. Opticna ekscitacija sprozi fotoluminiscenco. Flu-

orescenca pa je luminiscenca, ki nastane le med vzbuditvijo snovi [2].

0

2

0

0

1

1

2

21

0S

1S

2S

FluorescencaAbsorpcija

Notranja konverzija

Nesevalnarelaksacija

fknsk

AhnFhn

Slika 3: Jablonski diagram

Fotofizikalne pojave, kot sta absorpcija in emisija lahko prikazemo zJablonskim diagramom na sliki (3). Ker vseh prehodov med energijskimistanji v snovi ni mozno prikazati na eni sliki, si izberemo prehode med tremisingletnimi stanji. Na diagramu imamo prikazana tri elektronska singletnastanja S0, S1 in S2 s po tremi vibracijskimi energijskimi stanji molekule. Tanaj bo na zacetku v najnizjem vibracijskem stanju stanja S0. Pri sobnitemperaturi je po Boltzmannovi statistiki zasedenih manj kot 1% visjih en-ergijskih stanj.

Velikost absorbirane energije, ki jo na sliki 3 predstavlja hνA, odlocakatero visje energijsko stanje S1 (ali S2) bo zasedla molekula. Ta proces sezgodi zelo hitro znotraj 10−15 s. V naslednjih 10−12 s pride do relaksacijemolekule v najnizje vibracijsko stanje S1 - notranja konverzija. Potem pridedo emisije iz najnizjega stanja S1 v eno izmed vibracijskih stanj S0 (zaradi

4 Zgradba lece 8

izbirnega pravila za obhodno kvantno stevilo l, mora za prehod med zacetnimin koncnim stanjem veljati lS0

− lS1= ±1) in pri tem odda foton z manjso

energijo kot jo je imel absorbirani (to se tipicno zgodi v casu 10−9 s). Potempride se do relaksacije znotraj S0 in molekula je ponovno v osnovnem stanjuS0. Procesu sestavljenem iz ekscitacije, notranje konverzije, emisije in relak-sacije pravimo fluorescenca [3].

Intenziteto fluorescence lahko dolocimo glede na razmerje emitiranih inabsorbiranih fotonov. Intenziteta I je potem dolocena kot

I = I0KΦεcl, (9)

kjer je I0 intenziteta vpadne svetlobe, K snovna konstanta, ε koeficient eksc-itacije, c koncentracija snovi in l dolzina poti svetlobe. Ce pogledamo dia-gram vidimo, da lahko molekula poleg fluorescence preide iz S1 v S0 se nanesevalni nacin. Potem lahko definiramo Φ kot razmerje med emitiranimifotoni in celotno populacijo vzbujenih stanj:

Φ =kf

kf + kns

, (10)

pri cemer je kf delez za fluorescenco in kns delez za nesevalni prehod medstanji. Ce je nesevalna relaksacija hitra v primeri s fluorescenco (kf < kns),potem molekula fluorescira zelo malo ali skoraj nic [3].

4 Zgradba lece

4.1 Kapsula, Korteks, Epitelij in Jedro

Leco obdaja membrana imenovana kapsula. Je necelicna struktura sestavl-jena iz glikoproteinov- kolagen tipa IV. Na sprednji strani lece kapsula pokriva

Kapsula

Epitelne celice

Kortikalna vlakna

Prednji del

Zadnji del

Jedro

Korteks

Vlakna v jedru

Slika 4: Zgradba lece.

4.2 Proteini-kristalini 9

epitelne celice (epitelij), na zadnji strani, kjer je tanjsa kot na sprednji strani,pa kortikalne vlaknaste celice (korteks). V sredini je jedro lece, ki je pravtako sestavljeno iz vlaknastih celic [4], [5].

4.2 Proteini-kristalini

Proteini predstavljajo vec kot 35% celotne suhe mase lece sesalca, kar jedvakrat vec kot v kateremkoli drugem tkivu. Velika vecina teh je strukturnihproteinov, ki jih lahko razdelimo v dve skupini: v vodi topni in v vodi

netopni proteini .V prvi skupini so v najvecjem stevilu prisotni kristalini , ki imajo zelo

kompleksno zgradbo. Kristaline razdelimo na osnovi kromatografskih last-nosti v tri glavne skupine: α, β in γ kristalini. Do delitve pride predvsemzaradi razlik v njihovi velikosti in kemicnih lastnostih, kar prikazuje pregled-nica na sliki 5.

Povpr. molekulska masa

(Daltoni)

Odstotek od vseh

proteinov

Podenote

Vodo topni

a kristalini

5105 × 32% 4 podenote z molekulsko maso

okoli 20000 Daltonov:

a - 1A , a - 2A , a - 1B , a - 2B

b kristalini 410554 ×- 55%

bH 4105510 ×- Podenote z maso med

25000 in 27500 Daltonov

bL 41085 ×- Podenote z maso med

23500 in 30500 Daltonov

g kristalini 41020 × 1.5% monomeri

HM-kristalini >61050 × spremenljiv a in b kristalini

Vodo netopni

MIP

31026 ×31022 ×

55% vseh membranskih

proteinov

Slika 5: Preglednica proteinov v leci.

Vodo-netopne proteine lahko glede na topnost v 8M secnini razdelimona netopne in topne proteine. Prvi namrec tvorijo asociate z deli membrane.Eden izmed teh proteinov predstavlja 50% vseh membranskih proteinov inje znan kot glavni intrinzicni polipeptid (MIP). Ta protein ima molekulskomaso 26000 Daltonov in ni prisoten v epitelnih celicah.

S staranjem pride do tvorbe proteinskih agregatov, katerim se zmanjsatopnost v vodi. Zaradi tega lahko pride do tvorbe motnjav in povecanegasipanja svetlobe v leci ali pa se le poveca kolicina v vodi netopnih pro-teinov ter leca kljub temu ostaja prozorna. Pretvorba vodo-topnih v vodo-netopne proteine je naraven proces, ki pa ga lahko doloceni dejavniki iz okoljapospesijo in tako pride do nastanka razlicnih oblik ocesne mrene [4], [5].

5 Ramanov spektrometer 10

5 Ramanov spektrometer

Za snemanje Ramanskih spektrov potrebujemo Ramanov spektrometer, ki jesestavljen iz vec delov. To so laser kot izvor monokromatske svetlobe, mizicaz vzorcem, lecje za zbiranje sipane svetlobe, sistem za razprsitev svetlobe(spektrograf), CCD detektor in programska oprema z racunalnikom.

Vzorec

ZrcaloLaser

ICLE

È

Sistem za disperzijo

ali spektrograf

CCD

Detektor

Zrcalo

Slika 6: Slika eksperimenta

Posnel sem Ramanske spektre razlicno starih cloveskih lec na energijskemobmocju med 200 in 3400 cm−1. Na sliki 7 so prikazani spektri treh razlicnostarih lec, ko sem jih obdelal s programom ORIGIN in jim odstel fluorescenco.

Slika 7: Ramanski spektri lece 1964 (zgoraj), lece 1956 (v sredini) in lece1926 (spodaj) na energijskem obmocju med 200 in 1900 cm−1 (levo) ter 2800in 3900 cm−1 (desno).

Uporabil sem, tako delce lec odstranjene pri rutinski operaciji sive mrene(le delci starejsih lec), kot tudi lece dobljene preko programa darovalca (takomlade kot tudi stare lece). Edina razlika med tema dvema vrstama vzorcev

5 Ramanov spektrometer 11

je v visjih intenzitetah Ramanskega signala in fluorescence v korist celih lec.To pa ne spremeni rezultatov, ker je bila intenziteta obeh kolicin (Raman,fluorescenca) dobljena iz enakega volumna osvetljenega vzorca, kar pa je mocrazbrati tudi iz rezultatov na slikah od 8 do 11. Pri tem je treba poudariti, daje bila moc laserja med spektroskopiranjem vedno 2.5 mW. Posneti spektriimajo poleg Ramanskih vrhov tudi zelo sirok vrh fluorescence (poglavje 3).Primer takega spektra je prikazan na sliki 2.

Iz analiziranih spektrov je razvidno, da pride do spremembe predvsem privrhu 540 cm−1 (nihanje inter in intra molekularne S-S vezi med proteini1),1004 cm−1 (simetricno krcenje in reztezanje benzenovega obroca aminokislinefenilalanin [6], [7] - slika 9), vrhu 1670 cm−1 (raztezanje C-O vezi amida I 2

[7], [8]) in vrhu 2935 cm−1, ki pripada raztezanju C-H vezi vseh kristalinovv leci [7], [8].

SH

SH

SH

SH

SH

HS

S S

S S

S S

S S

Protein

Slika 8: Razmerje med intenzitetoRamana in Fluorescence za vrh540 cm−1.

C

C

CC

CC C

CC

C

H

H

H

H

H

H

H

H

NH2

HO

O

Slika 9: Razmerje med inten-ziteto Ramana in Fluorescence zavrh 1004 cm−1. Nihajni nacinprikazuje slika pod grafom.

Kako se s starostjo spreminja razmerje Ramanski signal/Fluorescenca zavrhove 540 cm−1, 1004 cm−1, 1670 cm−1 in 2935 cm−1 pa prikazujejo grafina slikah od 8 do 11. To razmerje naj bi pokazalo, kako se s staranjem lecespreminja kemijska struktura njenih proteinov.

1Disulfidne vezi nastanejo iz SH podskupin proteinov.2To je posebna oblika amidne vezi med deli proteinov, ki odloca o njihovi sekundarni

strukturi. Tako amid I karakterizira α vijacno strukturo proteinov.

6 Zakljucek 12

C N

O

H

R R1

Slika 10: Razmerje med inten-ziteto Ramana in Fluorescence zavrh 1670 cm−1 (levo). Nihajninacin prikazuje slika pod grafom.

C C

H

H H

H

Slika 11: Graf razmerja med in-tenziteto Ramana in Fluorescenceza vrh 2935 cm−1. Nihajni nacinprikazuje slika pod grafom.

Na podlagi rezultatov na slikah od 8 do 11 lahko recemo, da se vsebnostnekaterih aminokislin v leci s staranjem zmanjsuje (fenilalanin). Prav takose zaradi staranja spreminja sekundarna struktura proteinov - zmanjsuje sedelez α vijacnih proteinov. Iz grafa na sliki 11 pa je ocitno, da se zmanjsujetudi nihanje C-H vezi kristalinov. Zaradi spreminjanja sekundarne strukturein zmanjsevanja nihanja C-H vezi, lahko zakljucimo, da pride s starostjo tudido zmanjsanja vseh kristalinov (v vodi topnih proteinov) v leci. Za razlikood zgoraj nastetih sprememb v leci pa se stevilo disulfidnih vezi s staranjemlinearno povecuje. To privede do nastanka vse vecjih proteinskih agregatovin s tem do tvorbe motnjav v leci ter v nekaterih primerih tudi do bolezni(ocesna mrena).

6 Zakljucek

Ramanska spektroskopija je zelo ucinkovita metoda za dolocitev kemijskihlastnosti oz. zgradbe bioloskih vzorcev. Pomembni lastnosti te spektroskopijesta razmeroma enostavna priprava vzorcev (uporabil sem svez vzorec lece)in zelo majhen vpliv spektroskopiranja na vzorec, kajti le-tega s primernoizbrano mocjo laserskega snopa ne moremo poskodovati oz. spremeniti nje-gove zacetne strukture. To nam omogoca veckratno spektroskopiranje z enim

6 Zakljucek 13

vzorcem, saj se spektri s casom bistveno ne spremenijo.Nova metoda Raman/Fluorescenca je prvic pokazala, da so nekatere s

staranjem povezane spremembe v kemijski strukturi lece tudi nelinearne (ne-nadne). To poznajo predvsem starejsi ljudje, ko zaradi poslabsanja vida po40. letu pricnejo nositi ocala.

Izziv prihodnjih raziskav na tem podrocju pa je, kako odpraviti te spre-membe v kemijski strukturi lece in s tem uvesti nove nacine zdravljenja sstarostjo povezane slabovidnosti.

LITERATURA 14

Literatura

[1] D. A. Long: Raman Spectroscopy, McGraw-Hill International BookCompany 1977;

[2] Jacques I. Pankove: Optical processes in semiconductors, Dover Publi-cations, Inc. New York 1971;

[3] H. Spanggard: Introduction to Fluorescence, The Danish Polymer Cen-tre, Riso National Laboratory;

[4] Robert E. Anderson, MD, PhD: Biochemistry of the Eye, AmericanAcademy of Ophthalmology Manuals Program, San Francisco California1983;

[5] Nicholas P. Brown, Anathony J. Bron: Lens Disorders:A Clinical Man-ual of Cataract Diagnosis, Butterworth-Heinemann Ltd Linacre House,Jordan Hill, Oxford 1996;

[6] Sanford A. Asher, Michael Ludwig, and Craig R. Johnson: UV Reso-nance Raman Excitation Profiles of the Aromatic Amino Acids, J. Am.Chem. Soc. 108, (1986), 3186-3197;

[7] Y. Ozaki, A. Mizuno: Molecular aging of lens crystallines and the lifeexpectancy of the animal. Age-related protein structuural changes stud-ied in situ by Raman spectroscopy, Bioch. et Biophi. Acta 1121, (1992),245-251;

[8] N. Uzunbajakava, A. Lenferink, Y. Kraan, B. Willekens, G. Vrensen, J.Greve, C. Otto: Nonresonant Raman Imaging of Protein Distributionin Single Human Cells, Biopolymers (Biospectroscopy) 72, 1-9 (2003);

[9] M.H. Smeets, Gijs F.J.M. Vrensen, K. Otto, G.J. Puppels, J. Greve:Local variations in protein structure in the human eye lens: a Ramanmicrospectroscopic study; Bioch. et Biophi. Acta 1164, (1993), 236-242;

[10] Y. Ozaki, A. Mizuno, K. Itoh, M. Yoshiura, T. Iwamoto, K. Iriyama:Raman Spectroscopic Study of Age-Related Strutural Changes in theLens Proteins of an Intact Mouse Lens, Biochemistry 1983, (22), 6254-6259;