Recomendaciones para la determinación de biomarcadores en el

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PatologíaR E V I S T A E S P A Ñ O L A D E

www.elsevier.es/patologia

EVISIÓN

ecomendaciones para la determinación de biomarcadores en elarcinoma de pulmón no microcítico avanzado. Consenso nacionale la Sociedad Espanola de Anatomía Patológica y de la Sociedadspanola de Oncología Médica

osé Javier Gómeza,∗, Javier de Castrob, Ángel Conchac, Enriqueta Felipd,olores Islae, Fernando López-Ríos f, Luis Paz-Aresg, José Ramírezh,ulián Sanzi y Pilar Garridoj

Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, Universidad de Cantabria, Santander, EspanaServicio de Oncología Médica, Hospital Universitario La Paz, Madrid, EspanaServicio de Anatomía Patológica, Complejo Hospitalario Virgen de las Nieves, Granada, EspanaServicio de Oncología Médica, Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona, EspanaServicio de Oncología Médica, Hospital Clínico Lozano Blesa, Zaragoza, EspanaServicio de Anatomía Patológica, Hospital de Madrid Norte-Sanchinarro, Madrid, EspanaServicio de Oncología Médica, Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla, EspanaServicio de Anatomía Patológica, Hospital Clínic. IDIBAPS. Universidad de Barcelona, Barcelona, EspanaServicio de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, Instituto de Investigación Sanitariael Hospital Clínico San Carlos (IdISSC), Madrid, EspanaServicio de Oncología Médica, Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid, Espana

ecibido el 10 de octubre de 2011; aceptado el 14 de noviembre de 2011isponible en Internet el 10 de enero de 2012

PALABRAS CLAVECáncer de pulmón decélula no pequena;EGFR;ALK;KRAS;HER-2;

Resumen Actualmente los pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) avanzadoportadores de mutaciones del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), y proba-blemente en un futuro cercano los pacientes con reordenamientos del gen de la quinasa dellinfoma anaplásico (ALK), pueden recibir un tratamiento específico basado en el resultado delanálisis de biomarcadores. Esto les proporcionará mayor calidad de vida y supervivencia librede progresión que la quimioterapia convencional.

Este documento de consenso nace como una iniciativa conjunta de la Sociedad Espanola de

ado de http://www.elsevier.es el 27/01/2013. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.

BRAF;Biomarcadores

Anatomía Patológica (SEAP) y de la Sociedad Espanola de Oncología Médica (SEOM) y proponerecomendaciones diagnósticas y terapéuticas para el paciente con CPNM avanzado basadas en laevidencia científica relacionada con el uso de biomarcadores. Por tanto, supone una oportunidadpara mejorar la eficiencia de la actividad asistencial y la utilización de recursos, lo que sin dudaredundará en un beneficio para estos pacientes.

∗ Autor para correspondencia.Correo electrónico: [email protected] (J.J. Gómez).

699-8855/$ – see front matter © 2011 SEAP y SEC. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.oi:10.1016/j.patol.2011.11.002

dx.doi.org/10.1016/j.patol.2011.11.002

http://www.elsevier.es/patologia

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dx.doi.org/10.1016/j.patol.2011.11.002

Recomendaciones para la determinación de biomarcadores en el carcinoma de pulmón no microcítico avanzado 15

Aunque este campo está en constante evolución, en la actualidad, con los datos disponibles,este grupo de expertos recomienda que en todos los pacientes con CPNM avanzado de célulasno escamosas, así como en pacientes no fumadores con independencia del subtipo histológico,se determine el estado mutacional del gen EGFR en un plazo máximo de 7 días a partir deldiagnóstico anatomopatológico. Los laboratorios involucrados deben participar en programasde gestión de calidad externos. Por el contrario, los reordenamientos del gen ALK solo se debenanalizar en el marco de un ensayo clínico, aunque con los datos tan prometedores que se hanobtenido se justificará previsiblemente en un futuro próximo su estudio rutinario en pacientessin mutaciones de EGFR. Por último, no se considera necesaria la determinación rutinaria deotras anormalidades moleculares en la práctica clínica actual.© 2011 SEAP y SEC. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.

KEYWORDSNon-small cell lungcancer;EGFR;ALK;KRAS;HER-2;BRAF;Biomarkers

Guidelines for biomarker testing in advanced non-small cell lung cancer. A NationalConsensus of the Spanish Society of Pathology and the Spanish Society of MedicalOncology

Abstract Patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) carrying epidermal growthfactor receptor (EGFR) mutations can now have specific treatment based on the result of biomar-ker analysis. Furthermore, this will probably soon be available for patients with rearrangementsof the anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene. More than conventional chemotherapy, suchtreatment provides a better quality of life and progression-free survival.

This consensus document is a joint initiative of the Spanish Society of Pathology (SEAP) andthe Spanish Society of Medical Oncology (SEOM). It makes diagnostic and treatment recommen-dations for advanced NSCLC patients based on scientific evidence of biomarker use. Thus itaims to improve both the efficiency of healthcare and the use of resources, undoubtedly to thepatients’ benefit.

Although this field of research is constantly evolving, with data available at the present time,this panel of experts recommends that all patients with advanced NSCLC of non-squamous cellsubtype, or non-smokers regardless of the histological subtype, should be tested for EGFR genemutations within a maximum of 7 days subsequent to the histopathological confirmation ofthe diagnosis. Participating laboratories must comply with external quality controls. However,at present, ALK gene rearrangements should only be tested in the context of a clinical trial,although the promising results obtained to date would suggest that its routine testing in patientswith no EGFR mutations will be justified in the near future. Lastly, routine testing for othermolecular abnormalities is not considered necessary in current clinical practice.

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Documento descargado de http://www.elsevier.es el 27/01/2013. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.

© 2011 SEAP y SEC. Publish

Introducción

El cáncer de pulmón supone un reto sanitario de gran enver-gadura. De los más de 11 millones de casos nuevos al ano decáncer a nivel mundial, uno de cada ocho es un cáncer depulmón, y en el mundo cada ano fallecen más de 1.100.000personas debido a este tumor. En Espana se estima que en2012 habrá 24.500 casos incidentes de cáncer de pulmón,siendo esta la primera causa de muerte por cáncer en varo-nes (19.681 casos) y la tercera en mujeres (4.011 casos).Datos similares se observan cuando se analizan cifras euro-peas, norteamericanas o incluso mundiales1.

En los últimos anos se han producido múltiples cambios enel abordaje del cáncer de pulmón, y en particular en el cán-cer de pulmón no microcítico (CPNM), entre los que destacael reconocimiento de biomarcadores que permiten seleccio-nar el tratamiento en algunos subgrupos de pacientes conenfermedad avanzada. La decisión de qué biomarcadores y
en qué subgrupo de pacientes deben ser analizados es clave,y además debe hacerse en un tiempo adecuado, ya que elprimer tratamiento que recibe un paciente con cáncer es elque le proporciona más posibilidades. Además, el estudio
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pc

Elsevier España, S.L. All rights reserved.

e biomarcadores debe realizarse en un entorno asisten-ial que garantice los controles de calidad adecuados y laisponibilidad de los resultados en el tiempo recomendado.

No cabe duda de que la complejidad del abordaje deláncer requiere, cada vez más, una estrecha colaboraciónntre distintos profesionales, y que el éxito de la implanta-ión de estrategias terapéuticas individualizadas basadas enl uso de biomarcadores en el entorno asistencial necesitaoordinación entre patólogos y oncólogos.

El primer biomarcador y, por ello, la base sobre la queebe ser construida esta relación es el diagnóstico ana-omopatológico. Conscientes de ello, este documento deonsenso nace como una iniciativa conjunta de la Socie-ad Espanola de Anatomía Patológica (SEAP) y la Sociedadspanola de Oncología Médica (SEOM). Ha sido elaboradoor 10 expertos (5 patólogos con actividad asistencial y 5ncólogos médicos) y tiene como objetivo proponer reco-endaciones diagnósticas y terapéuticas basadas en la

videncia científica para pacientes con CPNM avanzado.La intención de este documento es que sirva de marco

ara que el Comité de Tumores de cada centro, de acuerdoon la Dirección, establezca los circuitos apropiados que

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aranticen que los pacientes con CPNM avanzado subsi-iarios de estudio de biomarcadores cuenten con estaosibilidad y que las determinaciones se lleven a caboiguiendo las recomendaciones de las sociedades científicas,on procedimientos de calidad contrastada y en un tiempolínicamente razonable.

Este documento promueve la estandarización y la calidade la práctica clínica, potenciando una menor variabilidadlínica por causas organizativas. Por ello, es una gran opor-unidad para mejorar la eficiencia de la actividad asistencialoptimizar el uso de los recursos disponibles, lo que sin duda

edundará en un claro beneficio para los pacientes.

spectos clínicos

pesar de los avances realizados, actualmente solo se hanodido identificar alteraciones moleculares en aproximada-ente el 50% de los adenocarcinomas2. Aunque la mutacióne KRAS es la más frecuente, merecen mención especial lasutaciones del receptor del factor de crecimiento epidér-ico (EGFR) y los reordenamientos de la quinasa del linfoma

naplásico (ALK) por su trascendencia clínica.

mportancia clínica de la mutación de EGFR

GFR es una glucoproteína transmembrana compuesta porn dominio extracelular aminoterminal para la unión deigandos, una hélice transmembrana hidrófoba, un dominioitoplasmático que contiene el dominio tirosina quinasa yna región carboxiterminal que contiene residuos de tiro-ina y elementos reguladores del receptor. La unión de losigandos al dominio extracelular da lugar a la oligomeriza-ión del receptor, que activa la porción tirosina quinasa dea molécula y origina la autofosforilación de ambos dominiosel receptor.

Aunque existen distintas alteraciones relacionadas conGFR, como la amplificación génica y la sobreexpresión pro-eica, solo la presencia de mutaciones del gen se consideraoy en día un factor predictivo de eficacia al tratamientoon inhibidores de la tirosina quinasa (ITK) de EGFR (ITK-GFR). Estas mutaciones se identificaron por primera vezn pacientes con CPNM en el ano 2004 y su descubrimientoepresentó el reconocimiento de un subgrupo molecular dearcinomas clínicamente diferentes3,4. La mutación da lugarun incremento de la actividad del factor de crecimientoconlleva cambios conformacionales que convierten a la

élula mutada en «adicta» a las senales de EGFR, por lo que,l administrar un ITK-EGFR, la activación se interrumpe yesencadena la muerte celular. La presencia de mutacionese EGFR en nuestro medio se identifica en el 5 al 15% de losasos de CPNM5.

Las mutaciones más frecuentes (85-90%) son las delecio-es de los nucleótidos 9, 12, 15, 18 o 24 en el exón 19 y lasutaciones puntuales CTG/CGG en el exón 21 (L858R). Exis-

en otras menos comunes (L861Q en el exón 21, G719A/C/Sn el exón 18 y S768I en el exón 20) cuyo comportamientos menos conocido. Además, se han descrito mutaciones
sociadas a la resistencia frente a T790 M en el exón 20.
La importancia del tratamiento con ITK-EGFR en pacien-es con tumores portadores de mutaciones activadoras pro-iene de múltiples estudios, si bien han sido los resultados

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J.J. Gómez et al

e los ensayos fase III con gefitinib o erlotinib los que hanemostrado su beneficio con respecto al tratamiento están-ar con quimioterapia (tabla 1). Además de los dos ITK-EGFRa comentados, existen otros cuyo papel final en la clínicaependerá de los resultados de los estudios que están enarcha.

studio IPASSn el estudio IPASS se incluyeron 1.217 pacientes con CPNMvanzado seleccionados por criterios clínicos a los que seleatorizó a recibir tratamiento con gefitinib o carboplatinopaclitaxel6. El estudio demostró la no inferioridad de gefiti-ib, con unas medianas de supervivencia libre de progresiónSLP) de 5,7 meses para gefitinib y de 5,8 para la ramaon quimioterapia. El análisis de eficacia realizado de formaetrospectiva sobre 437 pacientes (36%) que tenían muestraisponible para la determinación de la mutación de EGFRque resultó positiva en 261 casos, demostró la superiori-

ad de gefitinib en términos de SLP (HR = 0,48; p < 0,0001)de tasa de respuestas (71,2% vs. 47,3%; p = 0,0001). La

nteracción entre la mutación de EGFR y el tratamiento fueignificativa (prueba de interacción, p < 0,001). Por el con-rario, en pacientes con carcinomas carentes de mutacióna quimioterapia fue significativamente más eficaz. En cam-io, la tolerancia y la calidad de vida fueron mejores en laama tratada con gefitinib.

studio First-SIGNALn este estudio se reclutaron 309 pacientes coreanos condenocarcinoma de pulmón avanzado y no fumadores7. Elbjetivo principal, que era demostrar un incremento del 40%n la supervivencia global (SG) al comparar gefitinib con cis-latino y gemcitabina, no se alcanzó (HR = 1,02; p = 0,42). Síe observaron diferencias estadísticamente significativas enérminos de SLP, calidad de vida y tolerancia a favor de gefi-inib. En el análisis por subgrupos, que se realizó en el 31%e los pacientes incluidos, se evidenciaron mutaciones deGFR en el 44% de ellos. En este subgrupo, los pacientes tra-ados con gefitinib alcanzaron una SLP superior (HR = 0,61;= 0,084).

studio WJTOG3405n este estudio japonés se comparó gefitinib con cisplatinodocetaxel en 177 pacientes con CPNM avanzado portado-

es de mutaciones de EGFR8. Los resultados mostraron unaiferencia significativa en la SLP, que era el objetivo pri-ario del estudio, a favor de gefitinib (medianas de 9,2 vs.

,3 meses; HR = 0,48; p < 0,0001), en la tasa de respuesta yn el perfil de toxicidad.

studio NEJ002ste estudio japonés pretendía demostrar, en 230 pacienteson CPNM avanzado con mutaciones de EGFR, la superioridade gefitinib frente a carboplatino y paclitaxel en térmi-os de SLP9. En el análisis intermedio previsto inicialmentee detectó una diferencia significativa a favor de gefitinib
medianas, 10,8 vs. 5,4 meses; HR = 0,30; p < 0,001) y tam-ién en la tasa de respuesta, por lo que se cerró el estudio.a tolerancia al tratamiento fue mejor de nuevo para gefi-inib.

Recomendaciones para la determinación de biomarcadores en el

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carcinoma de pulmón no microcítico avanzado 17

studio OPTIMAL (CTONG 0802)ste estudio, realizado en China, comparó el tratamiento enrimera línea de erlotinib con carboplatino y gemcitabina en65 pacientes con CPNM avanzado portadores de mutacionese EGFR10. En él se observó una diferencia estadísticamenteignificativa en la SLP a favor de erlotinib (medianas, 13,1s. 4,6 meses; HR = 0,16; p < 0,0001), que era el objetivo pri-ario, así como una mejor tasa de respuesta y un perfil de

oxicidad más favorable.

studio EURTACste estudio, coordinado por el Grupo Espanol de Cáncer deulmón (GECP) y el único realizado en población caucásica,omparó erlotinib con quimioterapia basada en platino en74 pacientes con CPNM avanzado con mutación de EGFR11.l estudio fue favorable a erlotinib en su objetivo prima-io, SLP (medianas, 9,4 vs. 5,2 meses; HR = 0,42, p < 0,0001),demás de en la tasa de respuesta y la tolerabilidad.

Por tanto, estos estudios sustentan el uso de ITK-EGFRomo tratamiento de elección en pacientes con CPNM avan-ado portadores de una mutación activadora de EGFR, yomo tal se recoge en las guías terapéuticas nacionales enternacionales12-14. Es importante destacar que en ningunoe los estudios comentados se ha demostrado un beneficiostadísticamente significativo en SG. Este hecho puede serxplicado por el elevado número de pacientes que recibenratamiento con ITK-EGFR tras progresión con quimiotera-ia.

mportancia clínica de la translocacióne EML4-ALK

LK es una proteína transmembrana de 1.620 aminoácidosue está formada por un dominio extracelular con un pép-ido senal aminoterminal, un dominio intracelular con unegmento yuxtamembranoso que acoge el lugar de uniónara el substrato-1 del receptor de insulina y un dominioarboxiterminal. ALK es un receptor tirosina quinasa de lansulina, y su función fisiológica sigue siendo poco clara.ste receptor fue identificado por primera vez como partee la traslocación t(2;5) asociada a la mayoría de los linfo-as anaplásicos y algunos otros linfomas no hodgkinianos15.

e ha puesto de manifiesto recientemente que varios tumo-es humanos, como el CPNM, activan la senalización de ALKediante la creación de fusiones del gen ALK con diferentesarejas16, dando lugar a proteínas que activan el dominiouinasa de ALK17,18.

EML4 es una proteína citoplasmática involucrada en laormación de microtúbulos. EML4-ALK es una fusión de genesue surge de la inversión del brazo corto del cromosoma[Inv (2)(p21p23)] que une los exones 1-13 de EML4 a los

xones 20-29 de ALK18.En CPNM se han identificado múltiples variantes de EML4-

LK, así como otros tipos menos frecuentes de fusionesénicas de ALK con otras parejas, como por ejemplo TFG-11KIF5B19. De forma equivalente a las mutaciones de EGFR,

os reordenamientos de ALK originan una actividad tirosina
uinasa constante, la dependencia de las vías de la cas-ada mitogénica activada, y una elevada sensibilidad a lanhibición de ALK, constituyendo otro ejemplo de «adicciónncogénica»19.

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Las alteraciones moleculares de ALK se pueden iden-ificar por hibridación in situ fluorescente (FISH), pornmunohistoquímica (IHQ) y por transcripción reversa de laeacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Actualmente,ISH es el procedimiento diagnóstico de referencia a nivellínico. La presencia de la fusión EML4-ALK se identifica enl 2 al 7% de los casos de adenocarcinoma2.

En general, los pacientes con CPNM avanzado que tienenna translocación de ALK tienden a ser jóvenes con escasa oula historia de tabaquismo (<10 paquetes de cigarrillos alno)20,21. La mayoría de los casos son adenocarcinomas conroducción de mucina, fundamentalmente intracelular. Laresencia de reordenamientos de ALK no suele coexistir contras mutaciones como las de EGFR y KRAS.

En la actualidad, existen diferentes inhibidores de ALKn estudio. Crizotinib, que es también un inhibidor del fac-or de transición epitelio-mesenquimal (MET), es el que sencuentra en una fase de desarrollo clínico más avanzada20.e administra de forma oral, a dosis de 250 mg, dos veces alía. Su perfil de toxicidad incluye náuseas y diarrea leves,rastornos visuales transitorios sin hallazgos oftalmológicos,sí como alteraciones en la bioquímica hepática y hemato-ógica.

Los datos iniciales de eficacia de crizotinib provienen dena serie de 82 pacientes con reordenamientos de ALK, laayoría previamente tratados, seleccionados a partir de una

ohorte de 1.500 pacientes con CPNM avanzado22. Con unauración media de tratamiento de 6,4 meses, la tasa deespuesta global fue del 57%, mientras que el 33% de losacientes mostró enfermedad estable. En el momento delnálisis, 63 pacientes (77%) continuaban recibiendo crizoti-ib, y la SLP estimada a los 6 meses era del 72%.

Estos hallazgos han dado lugar a la puesta en marchae ensayos clínicos fase III que comparan crizotinib conuimioterapia en distintas líneas de tratamiento del CPNMvanzado y cuya fase de reclutamiento se espera que finalicel ano 2012.

mportancia clínica de otros biomarcadores

demás de los biomarcadores antes descritos, hay otros ennvestigación cuyo papel biológico está aún por definir2. Axcepción de las mutaciones de KRAS, la incidencia del restoe alteraciones moleculares caracterizadas es inferior al 5%casi todas suelen ser mutuamente excluyentes.

ctivación de RASa activación de la vía mediada por RAS, especialmente aravés de KRAS, ocurre en el 30% de los adenocarcinomas yn el 5% de los carcinomas de células escamosas23 (fig. 1).as mutaciones de KRAS en CPNM ocurren en los codones 12 y3 y están asociadas al hábito tabáquico. Aunque numerososstudios atribuyen un valor pronóstico negativo a la presen-ia de estas mutaciones, no existe aún evidencia científicaoncluyente. Hasta el momento, la búsqueda de inhibido-es específicos eficaces ha resultado infructuosa. Por ello,
unque la detección de mutaciones de KRAS puede excluirazonablemente la existencia de mutaciones de EGFR o deLK, su determinación no es prioritaria desde el punto deista clínico.
Cmnm

J.J. Gómez et al

mplificación de METET es el gen que codifica para el receptor del factor derecimiento hepatocitario (HGFR) situado en el cromosomaq21-q31 (fig. 1). Si bien las mutaciones de MET son raras,a amplificación se ha descrito en un porcentaje variablee pacientes con CPNM avanzado (1,4-21%) en función delétodo de detección que se utilice24. A diferencia de las

lteraciones descritas con anterioridad, ésta se ha identi-cado tanto en adenocarcinomas como en carcinomas deélulas escamosas y es independiente de la presencia deutaciones de KRAS o EGFR. De hecho, el 20% de los pacien-

es con tumores EGFR mutados adquieren la resistencia a losTK-EGFR a través de la amplificación de MET.

En la actualidad existen diferentes inhibidores de METn fase avanzada de investigación clínica, tanto anticuerposonoclonales como ITK, por lo que se espera disponer de

llos en un futuro cercano25.

utación de HER-2l receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humanoHER-2), también conocido como c-erbB-2, está sobreex-resado en el 20% de los pacientes con CPNM avanzado,ientras que la amplificación o la mutación del gen solo

curren en el 2% de los casos, respectivamente26. Estautación aparece sobre todo en mujeres, en pacientes no

umadores, en adenocarcinomas y en la población asiática.uelen consistir en inserciones en el exón 20 y no estánresentes en tumores con mutaciones de EGFR o de KRAS.

Con la información actualmente disponible, se cree queas inserciones que ocurren en este tipo de mutaciones pro-ocan una activación constitutiva del receptor que confiereayor sensibilidad a ITK duales frente a EGFR y HER-2, como

apatinib o BIBW 229227,28, pero no a inhibidores exclusivose EGFR29.

utación de BRAFn pacientes con CPNM avanzado, la incidencia de mutacio-es de BRAF se sitúa entre el 1 y el 3%, y no se localizann la misma posición que la mutación clásica del melanomafig. 1).

A diferencia de EGFR y ALK, las mutaciones de BRAF apa-ecen en pacientes fumadores o ex fumadores (p < 0,001)30.n la actualidad se están desarrollando inhibidores espe-íficos, como PLX4032, que han demostrado su eficacia enelanomas portadores de esta mutación.

utación de PI3KCAas mutaciones del gen PI3KCA que codifica las enzimasosfatidilinositol 3-quinasa catalítica alfa son muy pocorecuentes en CPNM31 (fig. 1). Se localizan en el exón, pueden detectarse tanto en los carcinomas de célulasscamosas como en los adenocarcinomas, e incluso pue-en estar presentes en tumores EGFR mutados32. Por otraarte, la amplificación de PI3KCA también se ha visto en
PNM avanzado, sobre todo en carcinomas de células esca-osas, en varones y en pacientes fumadores, aunque no
ecesariamente se encuentra asociada a la presencia deutaciones33.


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factor de crecimiento epidérmico; HER-2: receptor 2 del factorapamicina en mamiferos.

¿Qué pacientes requieren un estudiode biomarcadores?

Mutación de EGFREn la actualidad debe considerarse la determinación de lasmutaciones de EGFR durante el diagnóstico de la enfer-medad en un grupo de pacientes con CPNM avanzado. Losfactores más importantes que nos ayudarán a identificara los pacientes con mayores probabilidades de tener unamutación de EGFR son el hábito tabáquico y el subtipo his-tológico.

En el estudio IPASS6, el 96% de los pacientes tenían ade-nocarcinoma, el 3% carcinoma bronquioloalveolar según laclasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS)de 200434, y solo en el 0,2% de los pacientes no se conocía elsubtipo histológico. Otro criterio de inclusión era el hábitotabáquico, aceptando solo pacientes no fumadores (definidocomo los que han fumado menos de 100 cigarrillos en todasu vida) o pacientes «ex fumadores ligeros» (definido comolos que habían dejado de fumar al menos 15 anos antes y/oque fumaban igual o menos de 10 paquetes/ano). El 93% delos pacientes incluidos en el estudio eran no fumadores yel 6% eran «ex fumadores ligeros». Con estas característicasclínicas, la frecuencia de mutaciones en el estudio fue del59,7%.

Aunque no existen guías publicadas en las que se reco-miende de forma taxativa en qué grupo de pacientes se deberealizar la determinación de la mutación de EGFR, en nues-tro medio la información más importante al respecto es lapublicada por Rosell et al.5 en 2009 con los datos del GECP.En dicho estudio se analizó la mutación de EGFR en 2.105
pacientes y se encontró que estaba presente en 350 (16,6%).Cuando se analizó la frecuencia de mutaciones de EGFR enfunción de las características de los pacientes, se observóque era del 30% en mujeres, del 8,2% en hombres, del 38%
CaEa

crecimiento epidérmico humano; mTOR: molécula diana de la

n pacientes no fumadores, del 9,5% en pacientes ex fuma-ores, del 5,8% en fumadores, del 17% en adenocarcinomas,el 23% en adenocarcinomas de tipo bronquioloalveolar y del1,5% en pacientes con carcinoma de células grandes. No sebservaron mutaciones en ninguno de los 37 pacientes paraos que no existían datos acerca del subtipo histológico.

Así pues, con la información disponible en la actualidad,e recomienda analizar la mutación de EGFR en los siguien-es pacientes con CPNM avanzado: a) todos aquellos coniagnóstico de carcinoma no-escamoso, y b) todos aquelloso fumadores, independientemente del subtipo histológico.

ranslocación de EML4-ALKl oncogén de fusión EML4-ALK está presente entre el 2 y el% de los CPNM35,36, pero su frecuencia aumenta en pacien-es no fumadores, o en los que tienen una historia de hábitoabáquico ligero, y en pacientes con adenocarcinoma. Así,on estas características y en tumores con EGFR no mutado,a frecuencia de esta translocación se incrementa hasta el3%21.

En el estudio de Kwak et al.22 sobre 82 pacientes conranslocación de ALK tratados con crizotinib, el 96% teníandenocarcinoma, el 1% carcinoma de células escamosas y el% tenían otros tipos de histología. El 76% de los pacientesran no fumadores, el 18% fumaba menos de 10 paque-es/ano y el 6% más de 10 paquetes/ano.

Actualmente se recomienda la determinación de reorde-amientos de ALK solo en el contexto de ensayos clínicos. Sinmbargo, los datos que se conocen son muy prometedoresllevarán casi con toda seguridad en un futuro inmediato a

a determinación rutinaria de ALK en algunos pacientes con
PNM avanzado. En principio, este subgrupo debería incluirquellos casos en los que se ha analizado la mutación deGFR, según los criterios que se han comentado en el puntonterior, y el resultado ha sido negativo.

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tras alteraciones molecularesado que en la práctica clínica actual el resultado de otraslteraciones moleculares no condiciona el tratamiento deos pacientes, no se considera necesaria su determinacióne forma rutinaria.

spectos anatomopatológicos

ervicios de Anatomía Patológica y centrose referencia

os Servicios de Anatomía Patológica han de trabajar enoordinación con el resto de servicios involucrados en eliagnóstico y tratamiento de los pacientes con CPNM. Dadaa relativa complejidad de los procedimientos y la participa-ión de distintos profesionales, es necesario establecer unujo de trabajo en cada centro que permita la optimizacióne los recursos para disponer de un diagnóstico integradon un tiempo adecuado. En el caso de estudios en los quexiste una base morfológica, como en IHQ o en FISH, la par-icipación del patólogo es determinante, ya que se debeneconocer las estructuras no patológicas y diferenciarlas deas neoplásicas para realizar el diagnóstico correctamente.uando se llevan a cabo ensayos con ácido desoxirribo-ucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o con proteínasxtraídas a partir de muestras tisulares o celulares, se debeealizar un control microscópico para seleccionar, con o sinicrodisección, las áreas más representativas de la lesión ylanificar los procedimientos a realizar, teniendo en cuentaue las muestras suelen ser de tamano pequeno y que puedexistir heterogeneidad tumoral y/o diferenciación diver-ente.

La determinación de biomarcadores en CPNM avanzadoebe cumplir los siguientes requisitos: a) elevado nivel dealidad científico-técnica; b) garantía de seguridad para elaciente; c) aplicación de criterios de eficiencia, y d) cum-limiento de los principios éticos y el marco legal vigente,eniendo en cuenta que se refieren a actuaciones en elmbito de la asistencia sanitaria y no a la investigacióniomédica. Tienen especial importancia los aspectos rela-ionados con la trazabilidad, la generación de informes, lareservación, la custodia y la gestión de las muestras. Loservicios de Anatomía Patológica y los centros de referen-ia deben tener la acreditación necesaria para realizar estosstudios y cumplir con el marco jurídico (Ley 14/2007, Ley4/2003, Real Decreto 1277/2003, Real Decreto 1691/1989,ey 55/2003).

Es lógico que los ensayos moleculares complejos no seealicen en todas las instituciones sanitarias. Por tanto,eben establecerse centros de referencia que incluyan estaseterminaciones dentro de sus carteras de servicios deorma institucional y que actúen en red. Estos centros deeferencia deben constituirse en base a: a) la cualificacióne los profesionales; b) las características de las instala-iones; c) el volumen de casos al ano; d) el desarrollo dectividades científicas o de formación; e) la participaciónn programas de garantía de calidad, como el programa de
a SEAP y la Academia Internacional de Patología (IAP)37, yor último, f) la acreditación de estos centros por una agen-ia competente como la Entidad Nacional de AcreditaciónENAC) (UNE-EN-ISO 15189:2007; UNE-EN-ISO 9001: 2008).
av

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J.J. Gómez et al

l diagnóstico histológico certero como primeriomarcador

a clasificación histológica del cáncer de pulmón es laue ya definió la OMS en 1999 y que fue actualizada en004. Algunas variedades de carcinoma han sido malin-erpretadas o discutidas, si bien no ha habido ningunalasificación alternativa desde el ano 200434. En 2011 sea publicado una nueva propuesta de clasificación para losdenocarcinomas38. Aunque todavía no se sabe si esta nuevalasificación se incorporará a la práctica diaria, el hecho deer promovida y patrocinada por la Asociación Internacionalara el Estudio del Cáncer de Pulmón (IASLC), la Sociedadorácica Americana (ATS) y la Sociedad Respiratoria EuropeaERS) hace pensar que su aplicación será generalizada.

La intención de este documento es indicar pautas de diag-óstico que permitan seleccionar el tratamiento, limitandol máximo el uso de técnicas que conllevan la pérdida deaterial.La subclasificación de los CPNM se debe hacer separando

os carcinomas escamosos del resto, ya sean adenocarcino-as o carcinomas de otras variantes poco habituales. Elrimer biomarcador que se va a obtener de una muestras el diagnóstico morfológico. No hay que conformarse conn diagnóstico genérico de CPNM. La utilización de técnicasuxiliares, como la IHQ, es fundamental para conseguir uniagnóstico correcto en los casos en que se dispone de unaantidad de material escasa y en los tumores pobrementeiferenciados. Términos como TTF-1, la expresión de la pro-eína p63 y la citoqueratina 5/6, o la napsina, deberían seramiliares para los oncólogos, ya que son los que marcan laiferencia entre carcinomas de células escamosas y adeno-arcinomas. Se ha consensuado que el marcador de mayortilidad para diferenciar ambos carcinomas es el TTF-1, ques positivo en adenocarcinomas. En cambio, los carcinomase células escamosas son positivos para p63 y para citoque-atina 5/6. La pareja de anticuerpos más aceptada en laiteratura es la formada por los dirigidos frente a TTF-1 y63, junto a otros como la napsina39.

Los estudios moleculares se realizan sobre material tisu-ar, si bien pueden realizarse también sobre material deitología en centros especializados. La situación más habi-ual es realizar el diagnóstico en tejido procedente dena biopsia bronquial o de una punción percutánea guiadaadiológicamente. En estos casos se aconseja realizar eliagnóstico con la primera sección histológica, para apli-ar únicamente las técnicas imprescindibles, como son elstudio para los dos marcadores inmunohistoquímicos men-ionados. El resto del material se preserva para los estudiosoleculares correspondientes.

ase pre-analítica

onsideraciones previasa calidad de cualquier determinación molecular comienzantes de la toma de la muestra tumoral, y por tanto el per-onal encargado de la toma de la muestra, los técnicos de
natomía patológica y el propio patólogo deben conocer lasariables que pueden influir en el estudio molecular.
Es importante tratar de obtener siempre la máxima can-idad de tejido posible en los distintos tipos de muestras,

n el carcinoma de pulmón no microcítico avanzado 21

Tabla 2 Condiciones de procesamiento según el tipo demuestra para la determinación de alteraciones molecularesen pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM)avanzado

Biopsias endoscópicas• Secciones de 5 �m de bloque completo, si la proporción

tumoral es superior al 10% para técnicas de PCR a tiemporeal, o mayor del 50% para técnicas de secuenciacióndirecta. Número de cortes del bloque entre 10 y 15.

• Seleccionar fragmentos neoplásicos por microdisección si laproporción de células tumorales es menor a la referida enel punto anterior. Cantidad mínima recomendada: 20-30cortes.

• Si en el bloque de parafina la muestra tumoral está agotadao es insuficiente, se puede retirar el cubre de unapreparación ya tenida, con acetona durante 10 min ehidratar con alcohol de 96◦ durante 24 a 48 h, si hay unacelularidad mínima recomendada de 1.000 célulasa.

Citologías mediante EBUS. EUS o PAAF• Si la proporción tumoral es adecuada, se puede retirar el

cubre de la extensión citológica y raspar todo el porta concuchilla.

• En centros que tengan experiencia en microdisección lásero microdisección con aguja, se debe marcar con rotuladorlos grupos tumorales y después marcar con lápiz dediamante esos grupos en el porta, obteniendo células conaguja 25G bajo control microscópico. Debe existir unacelularidad mínima recomendada de 500 célulasa.

Piezas quirúrgicas:• Marcar la zona tumoral con mayor proporción de

tumor/estroma-inflamación, evitando zonas con necrosisamplia. Realizar de 5 a 10 cortes de 10 �m y separar laszonas de interés.

EBUS: ultrasonografía endobronquial; EUS: ultrasonografía eso-fágica; PAAF: punción-aspiración con aguja fina; PCR: reacciónen cadena de la polimerasa.

a El número de células mínimo depende del método de extrac-ción de ADN (empleo de reactivos comerciales recomendado)y/o del volumen de tampón de lisis que se va a emplear. Exis-ten reactivos comerciales específicos para situaciones de bajacelularidad.

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Recomendaciones para la determinación de biomarcadores e

siempre y cuando esto no suponga un riesgo adicional parael paciente. Por ello, es un requisito imprescindible la impli-cación de todos los especialistas que componen el comité detumores, y en particular del patólogo, tanto si el análisis serealiza en su propio centro, como si la muestra se envía aun centro de referencia.

Tipos de muestrasExisten distintos tipos de muestras en función de la técnicaque se ha utilizado para obtenerlas, como las biopsias endos-cópicas, las biopsias por aguja gruesa, las biopsias guiadaspor ultrasonido endobronquial (EBUS) o endoscópica (EUS),punción-aspiración con aguja fina (PAAF), mediastinoscopiay toracotomías. Con todas ellas se suele obtener una buenacelularidad tumoral, aunque cualquier tipo de muestra quecuente con suficiente representación tumoral puede utili-zarse, siempre y cuando cumpla los requisitos mínimos quese describen en la tabla 2.

Se debe elegir la muestra que sea más accesible y queconlleve el menor riesgo para el paciente, sin que hasta elmomento se hayan encontrado en la literatura discrepanciasimportantes que impidan el análisis de muestras de lesionesmetastásicas.

Todos los procesos de la fase pre-analítica tendrán lugaren zonas de laboratorio «limpias», en las que no exista mani-pulación de productos relacionados con la PCR y que siganlas recomendaciones estándar de patología molecular paraevitar contaminaciones o inhibiciones.

Procesos de la fase pre-analíticaTiempo de hipoxia y fijación. La fijación se realizará loantes posible, y siempre en la primera hora tras la obtenciónde la muestra40-42. Se aconseja fijar la muestra en formolneutro tamponado al 10%. No se utilizarán fijadores basadosen alcohol (B5, Penfix) o mercuriales (Bouin, Zenker). Otrosfijadores están en fase de análisis. El tiempo óptimo de fija-ción es de 8 a 24 h para muestras quirúrgicas grandes y de 6a 12 h para muestras pequenas.

Las muestras citológicas fijadas de forma inmediatamediante los métodos habituales basados en alcohol pue-den usarse y proporcionan ADN de calidad. También sonútiles las citologías en medio líquido o bloques citológicos.Existe la posibilidad de congelar a ---80 ◦C muestras cito-lógicas en soluciones amortiguadoras de pH, como PBS ocitrato.Selección y supervisión histopatológica de muestras. Elpatólogo elegirá el bloque o muestra más apropiado y cuan-tificará la proporción de células tumorales en una seccióninmediatamente anterior a los cortes que se van a utilizarpara el estudio molecular. En el caso de una citología, seexaminará una extensión citológica representativa.

La cuantificación tumoral debe constar en el informedel estudio molecular. El consenso europeo recomiendaun mínimo del 50% de componente invasivo si en la faseanalítica se van a utilizar técnicas con baja sensibilidad(secuenciación directa) o un 10% si son técnicas de altasensibilidad (PCR a tiempo real)42.
Macrodisección o microdisección. Para alcanzar una pro-porción de células tumorales adecuada se pueden realizardiversos procedimientos de macrodisección o microdisec-ción. La macrodisección consiste en separar la zona del
ptme

loque con mejor representación tumoral en el bloque dearafina o en las secciones. La microdisección, manual oediante láser, solo debe realizarse en centros con amplia

xperiencia.xtracción y control de calidad del ADN. Se recomiendal uso de reactivos comerciales para muestras en parafinacitológicas, aunque también pueden ser válidos métodosanuales si se dispone de la experiencia adecuada. No se

ecomienda el uso de reactivos que usen columnas de puri-cación en muestras escasamente celulares. Se recomiendaomprobar la calidad y la concentración del ADN con téc-icas habituales (p. ej., ratio 260/280 >1,8 y concentraciónor microlitro). En varios reactivos comerciales existen con-
roles de ADN, para la determinación de mutaciones de EGFRediante la amplificación de un gen control, que cumplen
sta función.

22 J.J. Gómez et al

Tabla 3 Principales métodos empleados para la determinación de mutaciones de EGFR

Técnica Sensibilidad (%ADN mutado)

Mutacionesidentificadas

Detección precisa dedeleciones e inserciones

Secuenciación directaMétodo de Sanger 25 Conocidas y

nuevasSí

Pirosecuenciación 5-10 Conocidas ynuevas

Sí

PCR cuantitativa en tiempo realTaqMan PCR 10 Solo conocidas NoScorpions ARMS 1 Solo conocidas No

Técnicas de enriquecimiento del alelo mutadoPNA-LNA PCR clamp 1 Solo conocidas NoDigestión con enzimas de restricción 0,2 Solo conocidas NoSmart 0,1 Solo conocidas NoCOLD-PCR 1-10 Conocidas y

nuevasSí

PCR-RFLP 5 Solo conocidas SídHPLC 1 Conocidas y

nuevasSí

Inmunohistoquímica Desconocida Solo conocidas Sí

ARMS: sistema de mutación refractaria a la amplificación; COLD: coamplificación a temperaturas de desnaturalización más bajas; dHPLC:desnaturalización cromatografía líquida de alto rendimiento; EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico; PCR: reacción en

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cadena de la polimerasa; PNA-LNA: ácido nucleico peptídico-ácidde restricción.

ase analítica

utaciones de EGFRe debe realizar el estudio mutacional de los cuatro exo-es (18-21) del gen EGFR. En los casos en que la cantidad oalidad del ADN sea un factor limitante, los exones 19 y 21eben evaluarse de forma preferente5,42-51.

Aunque existe un gran número de métodos para determi-ar mutaciones de EGFR, en nuestro medio los más utilizadoson la secuenciación directa y la PCR en tiempo real (tabla).CR y secuenciación directa. La secuenciación directa conl método de Sanger tiene como principales ventajas frentel resto de métodos: a) uso común y disponibilidad; b) faltae necesidad de agrupar las muestras para su análisis; c)osibilidad de detectar todas las mutaciones posibles, asíomo d) capacidad para identificar exactamente de quéutación se trata.En contrapartida, sus inconvenientes son: a) baja sen-

ibilidad (entre el 20 y el 50%); b) riesgo elevado deontaminación por el manejo de productos post-PCR, y c)enor rapidez, al ser necesarios múltiples pasos, como la

xtracción del ADN, la amplificación basada en PCR, laecuenciación y la interpretación de esta última.

Si se utiliza esta tecnología, se recomienda:

Separar las áreas de trabajo destinadas a PCR y post-PCR
y utilizar materiales exclusivos en cada una de ellas. Seaconseja preparar las mezclas de reacción en una cam-pana de flujo laminar para asegurar un ambiente estéril,mientras que la adición del ADN se debe realizar fuera
•

leico bloqueado; RFLP: polimorfismos de longitud de fragmentos

de dicha campana para minimizar el riesgo de contamina-ción.Para cada reacción de PCR se debe incluir al menos uncontrol positivo con ADN genómico previamente validadoy un control sin ADN.Analizar la eficiencia y la especificidad de la amplificaciónmediante electroforesis en geles de agarosa, de forma quese puedan visualizar los productos de PCR como bandaspor tinción con bromuro de etidio o productos similaresen dichos geles.Los productos de PCR deben secuenciarse en ambas direc-ciones, es decir hacia delante (forward) y hacia atrás(reverse).

CR en tiempo real. Entre estas técnicas, la más utili-ada se basa en la tecnología Scorpion-ARMS, que utiliza uneactivo comercial que permite la identificación de 29 muta-iones de EGFR (TheraScreen® EGFR29 Mutation Test Kit).ntre las ventajas de esta técnica destacan: a) una mayorensibilidad en comparación con la secuenciación directa,n torno al 5% según nuestra propia experiencia; b) unaayor rapidez, y c) un menor requerimiento de celularidad

umoral.Por el contrario, las desventajas de esta técnica son: a) no

ermite identificar todas las mutaciones, sino solo aquellasara las que se ha disenado el reactivo; b) requiere agruparas muestras para optimizar los productos, y c) es más carauando se compara con el coste de la secuenciación directa.

Si se utiliza esta tecnología, se recomienda:

Utilizar las mismas precauciones de separación de áreaspre- y post-PCR que en la secuenciación.

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• Incluir un control positivo con ADN, que habitualmente sesuministra junto con el reactivo comercial, y un controlnegativo o reacción sin ADN en cada análisis.

Translocación de ALKEn nuestro entorno, la única opción analítica realista paradeterminar la translocación de ALK es mediante FISH. Suprotocolo no difiere en lo esencial del empleado para el estu-dio de otros genes. Solo los laboratorios que tengan más de100 pruebas FISH al ano deberían acometer la implementa-ción de esta técnica, según los resultados obtenidos frentea centros de referencia. Actualmente existen dos sondas enel mercado que pueden proporcionar resultados valorables,si bien tienen una aproximación diferente, ya que se tratade sondas de rotura o break-apart (Vysis) y sondas de fusión(Kreatech).

Fase post-analítica

Mutaciones de EGFRPCR y secuenciación directa. Se recomienda utilizar pro-gramas informáticos específicos que permitan comparar lasecuencia o electroferograma obtenido con la secuencia deEGFR no mutado. Una muestra debe considerarse positivacuando la mutación está presente en, al menos, dos secuen-cias diferentes (una forward y otra reverse) obtenidas de dosproductos de PCR independientes. La persona que interpretelas secuencias deberá tener una experiencia contrastada.PCR en tiempo real. El análisis es, en principio, cerrado yno se deberían interpretar casos cuyos controles no ofrezcanel resultado esperado, por coherentes que éstos resulten.

Translocación de ALKPara su interpretación, se deberá tener en cuenta el disenode la sonda, ya que en general se producen imágenes deseparación, así como la información predictiva, ya que lapérdida de senales también puede ser un marcador de res-puesta. La persona que interprete las imágenes deberá teneruna experiencia contrastada.

Control de calidad externo

Independientemente de la participación en un control decalidad externo, todos los laboratorios que utilicen estastecnologías deben validar, como medida de control, tantosu especificidad y su sensibilidad analíticas, como su valorpredictivo. La SEAP está evaluando la incorporación de otrosmarcadores, como BRAF o PI3 K, al control de garantía decalidad.

Mutaciones de EGFREn el ano 2010, la SEAP ha puesto en marcha un Programade Control de Calidad de mutaciones de EGFR37 cuyas carac-terísticas principales se exponen a continuación.

El programa se ha disenado para evaluar las distintasetapas, incluidas las fases pre-analítica y post-analítica ode interpretación de resultados. El laboratorio organiza-
dor selecciona una serie de casos mutados y no mutadospara EGFR, que son remitidos a los laboratorios participan-tes en forma de secciones sin tenir, de tejido fijado enformol e incluido en parafina. Cada porta está claramente
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dentificado con el número correspondiente a la muestra yl número correspondiente a la sección. Cada laboratorioarticipante utilizará los protocolos que emplee de formautinaria en la práctica clínica. Con el fin de valorar el por-entaje de celularidad tumoral de las muestras remitidas,s imprescindible tenir con hematoxilina-eosina (H-E) unae las secciones remitidas para que pueda ser revisada.

El envío de resultados debe realizarse de forma anónima.l número identificador de cada laboratorio participanteparece en la caja de preparaciones. Así, en un plazo de4 días los laboratorios participantes deben remitir al orga-izador por vía electrónica lo siguiente:

Formulario con la información solicitada relativa a las dis-tintas etapas del análisis de mutaciones del gen EGFR.Informe con los resultados del análisis para cada muestra,tomando como modelo el informe que, de forma habi-tual, se remite al médico que solicita la determinaciónde mutaciones.Resultados analíticos sin interpretar, en los que se basa elgenotipo establecido para cada una de las cuatro mues-tras remitidas. Por ejemplo, electroferogramas en el casode realizar el análisis mediante secuenciación directa delproducto de PCR o un archivo con los valores Ct en elcaso de realizar el análisis mediante PCR cuantitativa entiempo real.

Los resultados son evaluados y discutidos por un grupoe trabajo. En todo momento se debe mantener el ano-imato de los participantes. Cada laboratorio participanteecibe un informe personal y otro general con los resultadosbtenidos.

ranslocación de ALKasta el momento no existe en el mundo un control dealidad externo para esta determinación. No obstante, enuestra opinión, a nivel operativo se debería seguir unodelo similar al que se sigue con la hibridación de HER-en los programas de control de calidad que se realizan en

spana, en el Reino Unido y en los países nórdicos.

spectos comunes

lujo de trabajo y unificación de criterios

ugar para realizar las determinacionesas determinaciones pueden realizarse en el propio centrosistencial o en un centro de referencia. Si la técnica se rea-iza en el propio centro asistencial, el laboratorio deberá: a)aber efectuado antes un programa de formación y apren-izaje de las técnicas que sea adecuado; b) estar dotado deos medios técnicos necesarios; c) tener criterios suficientesara la interpretación correcta de los resultados obtenidos,d) disponer de un control periódico de calidad para asegu-

ar la correcta ejecución.Si la técnica se realiza en un centro de ceferencia, el Ser-

icio de Anatomía Patológica del centro asistencial deberá
reparar la muestra de biopsia o citología para su envío,iguiendo los criterios unificados de procesamiento de mues-ras que existen. Con el fin de garantizar que el tiempoe proceso no exceda los 7-10 días, se deberán ajustar los

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istemas de preparación y envío de la muestra, así como deecepción de resultados.

acientes susceptibles de determinaciones molecularesada la dificultad de obtención de la muestra, el costeconómico y el incremento de trabajo, es necesario hacerna correcta selección de los pacientes candidatos para elstudio de biomarcadores. A la espera de los resultados deos estudios en marcha con crizotinib y otros fármacos, deomento a nivel asistencial solo es preciso determinar laresencia de mutaciones de EGFR en todos los pacienteson histología de carcinoma no escamoso y en los pacienteso fumadores, independientemente del tipo histológico queengan.

Aunque hasta el momento la decisión sobre a qué pacien-es debe realizarse el estudio de mutaciones de EGFR la haomado mayoritariamente el oncólogo, es deseable que laeterminación se haga sistemáticamente en el estudio diag-óstico inicial en pacientes con enfermedad avanzada. Estaproximación deberá ser común para todos los biomarcado-es que se incorporen a la práctica diaria.

ptimización de la obtención de la muestraon el fin de obtener la mayor cantidad de material tumoralosible para la determinación, sería recomendable facilitara existencia de vías de comunicación entre los facultati-os que obtienen la muestra (especialmente neumólogos,irujanos torácicos y radiólogos) y los patólogos correspon-ientes. Disponer de información clínica ----como por ejemplol hábito tabáquico---- ayudará a los patólogos a trabajar decuerdo a los algoritmos propuestos. Esto también reque-irá revisar los protocolos existentes en los centros respectola toma de muestras, conservación y transporte hasta los

ervicios de anatomía patológica.

reparación de la muestran el cáncer de pulmón se pueden destacar tres peculiari-ades: a) la mayoría de los pacientes no son susceptiblese tratamiento quirúrgico, por lo que las muestras dispo-ibles para realizar el diagnóstico suelen ser citologías oiopsias pequenas. Por esta razón, es fundamental optimi-ar su procesamiento para obtener la mayor informacióntil posible; b) los avances científicos recientes están modi-cando las estrategias diagnósticas y terapéuticas, y c) laeterogeneidad tumoral en estos carcinomas es relevante.

Cualquiera que sea la entrada del paciente en el proceso,a de ser evaluado en el comité de tumores del centro paraecidir las actuaciones a seguir, entre las que se encuentra laoma de muestras para el diagnóstico cito-histopatológico,enotípico y molecular.

Es aconsejable realizar una valoración y procesamientoe la muestra citológica obtenida en cuanto se recibe enl laboratorio para informar de la representatividad, de laalidad y de la celularidad del material disponible e intentaracer una aproximación diagnóstica que facilite la conti-uidad del proceso asistencial. Para ello, es recomendabletilizar citología en fase líquida, pues evita artefactos y
xtensiones defectuosas y permite obtener preparacionese gran calidad para realizar estudios morfológicos, fenotí-icos y obtener además ADN y/o ARN del material celularxcedente, pudiendo además conservarse a temperatura
steá

J.J. Gómez et al

mbiente durante largos periodos de tiempo. Aunque con unínimo de 150 células se pueden realizar estudios molecula-

es, es a partir de 300-1.000 cuando se obtienen resultadosables52. Si no se dispone de citología en fase líquida, unauena opción es la fabricación de botones celulares.

Ante biopsias de pequeno tamano es importante observara fijación (formol tamponado al 10% a pH de 7,2 durante 6 a4 h) y aprovechar todo el tejido. Para ello, se pueden reser-ar los cortes del desbastado de los bloques de parafina paraa extracción de ADN, colocando los cortes en tubos Eppen-orf, y luego realizar secciones seriadas en portas tratadoson adhesivos para tinciones de rutina e IHQ o FISH.

En caso necesario, se pueden reutilizar preparaciones yaenidas para recuperar tejido y/o células, incluso de casosa archivados. Los resultados obtenidos a partir de prepara-iones citológicas son superponibles a los de las biopsias yiezas quirúrgicas, por lo que ambos tipos de muestras sonálidas para estudios moleculares53.

Si se reciben biopsias intraoperatorias o tejido en fresco,s aconsejable seleccionar un fragmento de material tumo-al representativo y, mejor aún, otro de tejido no tumoralambién, que se congele en no más de 30 min tras su extrac-ión para su crioconservación, siendo de utilidad el uso deonservantes como RNA-later que preservan la calidad delRN.

lgoritmo diagnóstico

n la figura 2 se propone un posible algoritmo diagnósticoara pacientes con CPNM avanzado, aunque hay que tenern cuenta que cada proceso diagnóstico debe adaptarse aas características individuales de cada paciente y el manejoultidisciplinar que debe tener esta patología.

nterpretación de resultados

os resultados de las pruebas referentes a la presencia dea mutación en el gen del EGFR deben ser inequívocos. Sean descrito numerosas mutaciones diferentes en este gen,ero solamente las que se centran en el exón 19 (delecioneslrededor del dominio LREA) y las mutaciones puntuales enl exón 21 (L858R) han demostrado tener valor predictivon cuanto a la respuesta a los ITK-EGFR. Se han descritodemás otras mutaciones, mucho menos frecuentes, par-icularmente en los codones 718 y 719 del exón 18, en elxón 21 (L861Q) y en el exón 20 (deleciones/inserciones)uyo significado es incierto y están en continua revisión ena literatura.

Cabe senalar también que los estudios moleculares per-iten detectar un rango más o menos amplio de mutaciones

n función de la técnica utilizada. Estas limitaciones con-iene reflejarlas en el informe, de manera que se conozcal alcance real del resultado que está valorando.

Por otra parte, se desconoce el impacto clínico queuede tener la detección de mutaciones por técnicas muy
ensibles, como la coamplificación a temperaturas de desna-uralización más bajas (COLD-PCR, COLD-pirosecuenciación,tc.), desaconsejándose en el momento actual su uso en elmbito asistencial.


CPNMEstadio IV

No fumador

EGFR mutado EGFR no mutadoMuestra noevaluable

Carcinomano escamoso

Carcinomaescamoso

Valorar determinarEMLA4-ALKa


Valorar realizarnueva biopsia

EGFR mutado EGFR no mutado


No determinacionesmoleculares

Fumador o Ex-fumadorb

Figura 2 Algoritmo diagnóstico para pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) avanzado. ALK: quinasa del linfomaico.

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anaplásico; EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmbConsiderar carga tabáquica del paciente.

Informe de resultados

El Informe de resultados de determinación de cualquier bio-marcador debe contener al menos la siguiente información:

• Identificación del paciente y del médico solicitante (opersona autorizada en su defecto).

• Diagnóstico anatomopatológico.• Muestra que se remite, a ser posible con la fecha de toma

de muestra.• Identificación del código externo en el caso de centros de

referencia.• Medio en el que se recibe la muestra (fresco, congelación,

parafina, etc.).• Origen anatómico de la muestra.• Fecha de solicitud, recepción de la muestra y emisión de

resultados.• Identificación de la técnica realizada para la determina-

ción del biomarcador, especificando mutaciones y/u otrasalteraciones detectables. En el caso de reactivos comer-ciales, indicar si poseen el sello «Productos de diagnósticoin vitro» (IVD), nombre comercial y número de lote.

• Calidad de la muestra, especificando el porcentaje decélulas tumorales y si se ha hecho enriquecimiento dela muestra mediante micro o macrodisección, así comoconcentración de ADN y pureza.

• Especificar en comentarios si la muestra es adecuada oinadecuada.

• Resultado del análisis, definiendo el tipo de alteración
molecular detectada o la ausencia de alteraciones mole-culares.
• Identificación del profesional responsable de la determi-nación.

cAdr

aEn el contexto de ensayos clínicos con inhibidores de ALK.

Identificación del responsable del laboratorio.Información o comentarios adicionales que sean interéspara el médico peticionario.Acreditación o participación en programas de calidad.

iempos recomendados y aceptables

l tiempo en el que se realiza el estudio molecular es claveara el paciente, y por ello, según el consenso europeo, seecomienda que sea menor de 7 días laborables42.

Se estima que 2-3 días son suficientes para la toma de lauestra, la revisión histológica para comprobar la cantidade tejido y la proporción de células tumorales disponibles ya realización de técnicas de macro o microdisección. Ade-ás, se recomiendan 1-2 días para la extracción de ADN,

-2 días para la fase analítica y 1 día para la interpretaciónenvío del resultado. Por tanto, todo el proceso podría ser

ealizado en 5 días, disponiendo así de 2 días adicionales pori hay que repetir alguna determinación, lo cual ocurre en elal 20% de los casos. Si el estudio molecular se va a demo-

ar más de 7 días, es importante contactar con el oncólogoinformarle.

erspectivas de futuro

s de esperar que en los próximos anos se intensifiquenas oportunidades de tratamiento individualizado para losacientes con cáncer de pulmón. Hasta el momento, úni-amente una minoría de las alteraciones implicadas en la
arcinogénesis pulmonar ha sido objeto de uso terapéutico.simismo, algunos de los estudios que están en curso coniferentes inhibidores dirigidos a dianas de potencial inte-és (p. ej., Her2, PI3 K, mTor, akt, Mek, LKB1, etc.) darán

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us frutos y podrán ser incorporados a nuestro arsenal tera-éutico. Adicionalmente, la búsqueda de nuevas dianas esrevisible que resulte en la incorporación de nuevas molécu-as en el futuro. En este sentido, cabe senalar que el propioroceso de desarrollo de nuevos fármacos anti-tumoraleslevará asociado, en la mayoría de los casos, la incorpora-ión y desarrollo concurrente de un biomarcador que definaa población de pacientes susceptibles de beneficio con eledicamento de interés.Todo ello nos llevará con toda seguridad a extremar las

edidas para obtener tejido tumoral de calidad que per-ita establecer el diagnóstico y la predicción terapéutica.

n este sentido, será crucial la complicidad de todos losrofesionales implicados en el cuidado de los pacientes conáncer de pulmón, particularmente de los responsables debtener las muestras (endoscopistas y cirujanos) y de losesponsables de optimizar y garantizar la calidad de la infor-ación (patólogos y biólogos moleculares).La incorporación de nuevos fármacos y biomarcadores

recisará también de la revisión frecuente de los algorit-os de priorización en el uso de las muestras, que atenderácriterios de utilidad de cada biomarcador, beneficio con

ada medicamento, parámetros clínico-epidemiológicos, yisponibilidad y accesibilidad tecnológicas. Es asimismo pre-isible el desarrollo en un futuro próximo de tecnologías queabiliten la utilidad de marcadores basados en muestras deácil acceso en la práctica clínica, como el suero o las célulasumorales circulantes.

Otro desarrollo previsible será la confección de bio-arcadores complejos, basados en múltiples predictores

imples, que nos faciliten información, no solo de la utili-ad potencial de diferentes tratamientos en monoterapia,ino también de sus combinaciones. La sofisticación tecnoló-ica deberá también resolver la posibilidad de incorporar ana misma prueba diagnóstica diferentes tecnologías, comoISH y análisis mutacional.

Finalmente, si se vislumbra una intensificación del uso deredictores en la práctica clínica relacionada con el cuidadoe los pacientes con cáncer de pulmón, se deberá prestararticular atención a dos aspectos adicionales. En primerugar, la puesta a punto no solo de cada biomarcador enada centro (local o de referencia) sino de los sistemas regu-ares y regulados de control de calidad. En segundo lugar,a expansión del uso de biomarcadores tendrá implicacio-es económicas para los sistemas sanitarios. Por ello, su usoebe ser optimizado y basado en consensos que evalúen laecnología empleada y su utilidad potencial.

onclusiones

a trascendencia de la adecuada selección de tratamienton pacientes con CPNM avanzado y la necesidad de que losiomarcadores que permiten esta selección sean analizadoson los controles de calidad más rigurosos, y en el menoriempo posible, han guiado la elaboración de este consensoiderado por las sociedades científicas SEAP y SEOM.

Este documento tiene un marcado carácter asistencial,
or lo que las recomendaciones se cinen a los biomarcado-es que actualmente delimitan subgrupos de pacientes conbordajes terapéuticos diferentes, validados y basados enármacos ya comercializados. Es de esperar, no obstante,
J.J. Gómez et al

ue en un futuro cercano esta batería se amplíe, si bien lasropuestas de trabajo multidisciplinar en el entorno de losomités de Tumores, las decisiones colegiadas y la calidade resultados contrastada que han guiado la elaboración deste documento seguirán siendo válidas.

esponsabilidades éticas

rotección de personas y animales. Los autores declaranue para esta investigación no se han realizado experimen-os en seres humanos ni en animales.

onfidencialidad de los datos. Los autores declaran que enste artículo no aparecen datos de pacientes.

erecho a la privacidad y consentimiento informado. Losutores declaran que en este artículo no aparecen datos deacientes.

inanciación

a SEAP y la SEOM agradecen el apoyo económico sin res-ricciones para este proyecto de AstraZeneca, Boehringerngelheim, Lilly Oncología, Pfizer Oncología y Roche FarmaEspana).

onflicto de intereses

os autores declaran que, en el momento de la redacción yevisión del texto, desconocían el nombre de los laboratoriosue han apoyado económicamente este proyecto, por lo queste apoyo no ha influido en el contenido de este artículo.

gradecimientos

eatriz Gil-Alberdi de HealthCo (Madrid, Espana) ha pro-orcionado asistencia editorial para el desarrollo de esteanuscrito. Los miembros del Grupo de Trabajo en Bio-arcadores SEOM-SEAP son R. Colomer, P. García-Alfonso,

. Garrido, A. Ariza, E. de Álava y J. Palacios.

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Documents

Recomendaciones para la determinación de biomarcadores en el