TARTU LIKOOL LOODUS-JA TEHNOLOOGIA TEADUSKOND

Valk-DNA interaktsioonidReferaat

Janika Kaurson Karin Knd Riinu Kiiker Siiri Sarv

Tartu 2011

Sisukord Sissejuhatus ....................................................................................................................................... 3 Valk-DNA interaktsioonid ................................................................................................................. 4 Valk-DNA interaktsioonide uurimise metoodika ................................................................................ 7 ChIP............................................................................................................................................... 7 ChIP-i tphimte .................................................................................................................... 8 ChIP-chip ................................................................................................................................... 9 ChIP-Seq .................................................................................................................................. 11 ChIP metoodika edasiarendused ............................................................................................... 12 SELEX ........................................................................................................................................ 13 Bakteri/prmi ksikhbriid ........................................................................................................... 15 DNA-valk interaktsioonide andmebaasid ja arvutuslik ennustamine ................................................. 17 PDIdb .......................................................................................................................................... 18 JASPAR....................................................................................................................................... 21 DBD ............................................................................................................................................ 23 hPDI ja UniPROBE...................................................................................................................... 24 ENCODE ..................................................................................................................................... 25 DP-BIND ..................................................................................................................................... 26 Valk-DNA interaktsioonide rakenduslikud vljundid ........................................................................ 26 Kokkuvte ....................................................................................................................................... 27 Kasutatud kirjandus: ........................................................................................................................ 27 Lisa 1. .............................................................................................................................................. 32 Lisa 2. .............................................................................................................................................. 35

2

SissejuhatusTulemas veel.

3

Valk-DNA interaktsioonidValgu ja nukleiinhappe interaktsioonid vivad toimuda vgagi erinevatel spetsiifilisuse astmetel. See krge spetsiifilisusega ratundmine on mratud konkreetsete nukleotiidsete jrjestustega; interaktsioon toimub enamasti valgu dimeeri ja vastava kaksikahelalise DNA vastava piirkonna vahel. Otseses kontaktis aluspaaridega on seejuures niteks he alfa-heeliksi seostumisel DNA-ga -4-5 aminohappe jki. Interaktsioonide kigus toimuvad muudatused nii valgukompleksi kui ka kaheahelalise DNA konformatsioonis (Molloy, 2001). Spetsiifilise struktuuri moodustustumisel nivad olevat htemoodi olulised nii konkreetsed vesiniksidemed aluste ja aminohapete vahel (enamasti klgahelate), van-der-Waalsi interaktsioonid kui ka elektrostaatika. DNA komplekse valkudega vib jagada spetsiifilisuse astme alusel kahte kategooriasse : 1) kompleksid, mis garanteerivad antud valgumolekuli tbile vaid he (vi mne vhese), suure spetsiifilisusega seondumiskoha kogu genoomi ulatuses; 2) kompleksid, mille tekkeks on oluline eelkige vaid DNA kaksikheeliksi enese olemasolu, tema kige philisemad (B-vormi) karakteristikud: molekuli pinna iserasused, fosfaatrhmade paigutus, jne (Slutsky, 2001). Valgud, mis seonduvad DNA-ga omavad hiseid voltumise mustreid, mida tuntakse DNA seondumisdomnidena. Iga seondumisala koosneb ratundmise piirkonnast ja stabiliseerivast

piirkonnast. Enamus valgud, mis seonduvad DNA-ga on geeniekspressiooni reguleerivad transkriptsioonifaktorid. Teadaolevalt on DNA-ga seonduvaid transkriptsioonifaktoreid umbes 20003000. (Vaquerizas, 2009). DNA-ga seondumine vib olla spetsiifiline (valgu ahelate vahe) ja

mittespetsiifiline (DNA fosfaat ,selgroo ja valgu ahelate vahel). DNA ja valgu vahelistes interaktsioonides on peamine roll suurel vaol, mille kaudu toimub valguahelatega interakteerumine. DNAga seonduvate valkude (enim tuntud) spetsiifilised motiivid (Lisa 2.): Heeliks-pre-heeliks (helix-turn-helix) Tsinksrmed (zinc finger) 4

-lehe motiiv (beta sheet motif) Peptiidiling (peptide loop) Leutsiini (tmb)lukk (leucine zipper) Heeliks-ling-heeliks (helix-loop-helix)

Heeliks-pre-heeliks (helix-turn-helix) Heeliks-pre-heeliks (HTH) motiiv on umbes 20 aminohappe pikkune domeen, koosneb kahest heeliksist ja neid hendavast prdest. Heeliks-pre-heeliks-motiivi sisaldavad valgud seonduvad DNA-ga dimeerina. Esineb prokarootide valkudel, mis reguleerivad geeniekspressiooni niteks nagu E. coli trp repressor, 434 Cro repressor ja E. coli lac repressor. Leutsiini (tmb)lukk (leucine zipper) Heeliksi regioon, kus leutsini jk on igas 7-ndas positsioonis, mis paiknevad heeliksi hel kljel. Osaleb hdrofoobsetes interaktsioonides. Tsinksrmed (zinc finger) Tsinksrmed on levinud eukarootsed transkriptsiooni regulaatorid, mis esinevad tandeemsete kordustena (ksteise krval).

Geneetiline informatsioon on salvestatud DNA-sse, selle avaldumine aga on kontrollitud tpsete mehhanismide poolt. (Transkriptsiooni regulaatoriteks on valgud, mille seondumine DNA-ga muudab DNA konformatsiooniliselt aktiivseks ja seelbi geenide avaldumist.) Need muutused ei toimu mitte ainult geenide regulatoorses piirkonnas (promooterid ja enhanserid) vaid ka kodeerivas alas. Sellisel juhul on tegemit epigeneetiliste modifikatsioonidega, mis thendab et nad modifitseerivad kromatiini, ilma genoomset jrjestust muutmata. Kui transkriptsioonifaktoritel on DNA-ga seondumise domnid, siis histoonide seondumine DNA-ga on mittespetsiifiline (Meaburn, 2011).

5

Kromatiini vib jaotada transkriptsioonilise aktiivsuse jrgi hetero- ja eukromatiiniks. Histoonid on spetsiaalselt DNA pakkimiseks meldud valgud, mis pakitakse koos DNA-ga nukleosoomiks (DNA pakkimise vikseim hik on nukleosoom, mis koosneb 8-st histooni molekulist ja 147-st aluspaarist DNA-s). Histoonide N-terminaalsed sabad jvad nukleosoomist vljapoole ning on vastutavad

paljude valk-valk interaktsioonide eest, samuti toimub nendes piirkondades histoonide posttranslatsiooniline modifitseerimine (Mario-Ramrez, 2001). Histoonide N-terminaalsed sabad: on suhteliselt pikad (H3: 30ah / 135) (Mario-Ramrez, 2001); sisaldavad palju lsiini- ja arginiinijke; muutliku struktuuriga. Histoonidel on kirjeldatud jrgmisi modifikatsioone: lsiinijkide atsetleerimine, metleerimine ja mono-ubikvitineerimine, SUMO-leerimine, biotinleerimine; y y y arginiinijkide metleerimine, ADP-ribosleerimine; seriini- ja treoniinijkide fosforleerimine; proliinijgi isomerisatsioon. ulatuvad nuleosoomi kerest kaugele vljapoole; on

y

Modifikatsioonide kaudu mjutatakse kromatiinini struktuuri ja seelbi geenide ekspressiooni. Niteks atsetleeritud histoonid thistavad transkriptsiooniliselt aktiivset kromatiini, metleeritud histoonid aga vaigistatud geene. Fosforleerimine on ldiselt seotud kas teiste modifikatsioonide reguleerimisega vi siis kromatiini kondenseerumisega mitoosis. Histoonide modifikatsioonid on olulised ka teistes protsessides nagu DNA reparatsioon, replikatsioon ja selle kigus uute nukleosoomide moodustamisel (Kouzarides, 2007). Tabelis 1 on toodud vlja histoonide erinevad modifikatsioonid ja nende funktsioonid.

6

Tabel 1. Histoonide modifikatsioonid ja nende funktsioonid (Kouzarides, 2007).

Valk-DNA interaktsioonide uurimise metoodikaValk-DNA interaktsioonide uurimiseks on pikka aega kasutatud biokeemilisi meetodeid (niteks elektroforeetilise liikuvuse anals ja nukleaasi footprinting), mis vimaldavad uurida he vi vheste valkude interaktsioone mne kandidaat DNA jrjestusega (Lane et al., 1992; Hampshire et al., 2007). Nende meetodite miinusteks on madal lbilaskevime, tmahukus; nende tulemiks on DNA seondumiskohtade konsensusjrjestused. Viimase kmne aastaga on krge lbilaskevimega tehnoloogiad kiiresti arenenud ja vimaldanud vga paljude valk-DNA interaktsioonide kirjeldamist (Walhout, 2006). Need meetodid jagatakse valgukeskseteks biokeemilisteks (valkude DNA-ga seondumise spetsiifika kindlaks tegemiseks) ja DNA-keskseteks geneetilisteks (DNA jrjestusega seonduvate valkude tuvastamiseks) tehnoloogiateks. Esimesse rhma kuuluvad SELEX ja kromatiini immunosadestamise (ChIP) meetodid ning valke seondavad mikrokiibid, teise kuuluvad bakteri/prmi ksikhbriid ja valgu mikrokiibid (Walhout, 2006).

ChIPKromatiini immunosadestamine e ChIP on laialdaselt kasutatav meetod valk-DNA interaktsioonide uurimiseks in vivo. Seda kasutatakse posttranslatsiooniliselt modifitseeritud histoonide, erinevate histooni variantide, transkriptsioonifaktorite vi kromatiini modifitseerivate ensmide asukoha kindlaks mramisel genoomil vi uuritavas lookuses (O Neill ja Turner, 1996). ChIP-i kasutamist 7

raskendab selle tehniline keerukus ja valkudega seonduvate vga spetsiifiliste antikehade vike hulk. ChIP on ebaefektiivne ka selliste transkriptsioonifaktorite tuvastamisel, mida ekspresseeritakse madalal tasemel vi ainult koeproovi vhestes rakkudes. Analsil ei ole vimalik eristada otseselt seondunud valke kaudselt seonduvatest valkudest, mis teeb tulemuste interpreteerimise keeruliseks (Xie et al., 2011).

ChIP-i tphimteOtseses kontaktis olevate valkude ja DNA kovalentne ristsidumine kemikaalide

y

(formaldehd) toimel. Rakkude lsimine ja kromatiini fragmenteerimine mikrokoki nukleaasiga (MNaas) vi sonikeerimisega 200-1000 aluspaarilisteks fragmentideks. Lsaat puhastatakse sedimentatsiooniga ja valk-DNA kompleksid immunosadestatakse spetsiifiliste antikehadega, mis on eelnevalt seotud magnet- (magnetic beads) vi muust materjalist (agaroos-, sefarooskerakesed) kerakestele. Immunosadestatud kompleksid pestakse lbi kindlatel tingimustel, et eemaldada

y

y

y

mittespetsiifiliselt seondunud kompleksid; seejrel valk-DNA kompleksid lhutakse (krge temperatuur) ja DNA fragmendid puhastatakse vlja. Valguga seondunud DNA edasine anals PCR-i, qPCR-i, mikrokiibi vi sekveneerimisega. (Collas, 2010) (Joonis 1)

y

8

Joonis 1. Kromatiini immunosadestamise (ChIP) metoodika (Collas, 2010).

ChIP-chipChIP-chip on kromatiini immunosadestamise (ChIP) kombinatsioon mikrokiibi tehnoloogiaga (chip), niteks Affymetrix, Agilent ja Illumina. See tehnoloogia vimaldab teha genoomilest analsi ja on vga oluline nii histooni modifikatsioonide kui ka transkriptsioonifaktorite seondumiskohtade

uurimisel kogu genoomis (Clark ja Shen, 2006; Ren et al., 2000). ChIP metoodikaga (Joonis 2) saadud DNA fragmentidele genereeritakse DNA polmeraasiga tmpotsad. Seejrel ligeeritakse adapteroligo, mis vimaldab fragmentide amplifitseerimist PCR-iga, mille kigus mrgistakse fragment fluorestseeruva mrgisega. Samamoodi mrgistatakse kontrollproov mne teise fluorofooriga. Need kaks proovi segatakse kokku ja hbridiseeritakse mikrokiibile, millel olevad jrjestused katavad kogu genoomi vi osa sellest. Immunosadestatud valgu seondumisjrjestus genoomil tuvastatakse, kui

9

ChIP-ga saadud DNA fluorestsentsi intensiivsus on suurem kui kontroll DNA-l (Collas, 2010) (Joonis 2).

Joonis 2. ChIP-chip metoodika (Collas, 2010).

ChIP-chip analsil kasutatakse philiselt PCR-i produkti vi oligonukleotiidi mikrokiipe. PCR-i kiipidel on 20 000 kuni 30 000 DNA fragmenti, mis on PCR-ga amplifitseeritud ja seejrel mehhaaniliselt klaas-slaididele mrgistatud. Oligonukleotiidi kiibid on valmistatud oligonukleotiidide in situ snteesiga, mis oluliselt suurendab kiipide tihedust, hele kiibile mahub le he miljoni jrjestuse. Transkriptsioonifaktori seondumiskoha tuvastamisel le kogu genoomi kasutataksegi oligonukleotiidi kiipe (Hudson ja Snyder, ). Suureskaalalist ChIP-chip analsi kasutati esimesena 106 prmi Saccharomyces cerevisiae transkriptsioonifaktori seondumiskoha uurimiseks (Lee et al., 2002). ChIP-chip metoodikaga on uuritud Drosophila arenguga seotud transkriptsioonifaktorite seondumiskohti. Niteks leiti, et Twist valgul on koguni le 2000 seondumiskoha Drosophila genoomis ning kolme embronaalses arengus olulise transpriktsioonifaktori Twist, Dorsal ja Snail seondumiskohtade jrjestused kattuvad oluliselt (Zeitlinger et al., 2007). Imetaja (hiire) embronaalsetes tvirakkudes mrati legenoomselt ChIPchip metoodikaga suur hulk geene, mis on olulised geeniekspressioonis ja arengus, ning seni teadmata

10

promootorjrjestusi, millega seonduvad embronaalsete tvirakkude pluripotentsuse silitamises oluslised valgud Stat3 ja c-Myc (Kidder et al., 2008).

ChIP-SeqChIP-i tehnoloogia arendamisel on jutud ChIP-Seq-ni (Joonis 3), mis hendab kromatiini immuunosadestamist ja DNA mass-sekveneerimist (Robertson et al., 2007), et kaardistada DNA-ga assotsieeruvate valkude seondumissaite, sealhulgas RNA polmeraase, TF-eid, transkriptsiooni kofaktoreid ning ka histooni valke le terve genoomis (Johnson, 2007; Park, 2009). Kromatiini immunosadestamisel saadud DNA fragmente saab kasutada raamatukogu valmistamiseks. Kigepealt snteesitakse DNA polmeraasiga fragmentidele tmpotsad nagu ChIP-chip puhul. Uuritavate DNA fragmentide otsa ligeeritakse praimeritele spetsiifilised adapterid ja DNA fragmendid

amplifitseeritakse. Seejrel sekveneeritakse fragmendid mass-sekveneerimise meetodiga ja lugemid kaardistatakse genoomile. Saadavad lugemid on lhikesed, umbes 25-50 nukleotiidi, kuid samas suudetakse heaegselt lugeda miljoneid DNA fragmente (Collas et al., 2010).

Joonis 3. ChIP-Seq metoodika (http://www.illumina.com/technology/chip_seq_assay.ilmn).

11

ChIP-Seq tehnoloogia on hetkel alternatiiv ChIP-chip meetodile, kuna le on saadud kiibi limiteerivatest faktoritest (Park, 2009). ChIP-Seq on kige mitmeklgsem ja ainus terve genoomi analsi tehnika, mis sobib suurematele genoomidele, kui on prmil ja dikakrbsel, tnu selle sobivale hinnale, meetodi tundlikkusele ja kiirusele (Northrup et Zhao, 2011). Eksperimendi kavandamisel ja tulemi analsil on vga oluline teada, millised tehnoloogilised erinevused esinevad ChIP-chip-i ja ChIP-Seq-i vahel. Niteks valgu seondumissaidi identifitseerimisel produtseerib ChIPSeq ldiselt parema lahutusvime ja genoomi katvusega profiile, millel on suurem tundlikkus ja spetsiifilisus kui ChIP-chip-il. ChIP-Seq-iga saab analsida phimtteliselt kiki liike, kellel on genoom sekveneeritud, kuid ChIP-chip-i korral saab kasutada vaid organismi-spetsiifilist kiipi (Park, 2009; Ho et al., 2011). Protseduuri edu sltub tavaliselt ChIP-il kasutatavate rakkude hulgast. Tavaliselt vetakse algmaterjaliks 1 kuni 10 miljonit rakku, kuid praeguseks on vlja ttatud mitmed ChIP-Seq protokollid, mis ttavad hsti ka viksemate algmaterjali kogustega (Adli et al., 2010; Goren et al., 2010). Lisaks on ChIP-Seq juba praegu imetaja genoomi uurimiseks majanduslikult tasuvam meetod ning kasulikkus suureneb veelgi kui mass-sekveneerimise tehnoloogia hind langeb (Ho et al., 2011).

ChIP metoodika edasiarendusedChIP metoodika suurim puudus on pikka aega olnud see, et protseduuri lbiviimiseks on vaja suurt hulka rakke. See on olnud vajalik selleks, et kompenseerida rakkude kadu prast ristsidumist, ChIP-i ldist ebaefektiivsust ja ChIP-ga rikastatud DNA tuvastamist. Suure hulga rakkude vajadus on seni takistanud ChIP-i kasutamist niteks vikese koe biopsiate, haruldaste tviraku populatsioonide vi embro rakkude uurimisel (Collas, 2010). Selle probleemi lahendamiseks on vlja ttatud mitmed erinevad protokollid. Kandja-ChIP (Carrier-ChIP) sobib vga hsti 100-1000 raku suuruste proovide uurimiseks, DNA tuvastamine toimub radioaktiivse PCR-ga. CChIP metoodikaga analsiti aktiveerivaid ja represseerivaid histooni modifikatsioone vhestes hiire embro sisemise rakumassi ja trofoektodermi rakkude sihtmrk-lookustes (O`Neill et al., 2006). 12

CChIP- i alternatiiviks on kiire ja kvantitatiivne Q2ChIP, mis vimaldab uurida 100 000 raku suurust proovi, tnu lhemale protokollile, osade protseduuride ra jtmisele ja suurenenud antikehamrklaudjrjestuste suhtele. Selle meetodiga on uuritud histoonide H3K4, K9 ja K27 atsetleerimist ja metleerimist, mis on seotud embronaalsete kartsinoomi rakkude diferentseerumisega (Dahl ja Collas, 2007). Tavalised ChIP protokollid on aeganudvad ja nendega on paralleelselt analsitavate proovide hulk limiteeritud. Kiir-ChIP-i metoodika korral toimub antikehade ja kromatiini inkubatsioon ultrahelivannis, mis suurendab oluliselt antikeha-valgu seondumist ja toimub kigest 15 minutiga. Teine protokolli lhendav etapp on DNA eraldamine, mis viiakse lbi katioone seondava maatriksi abil 1 tunniga (Nelson et al., 2006a, 2006b). ChIP-i lbilaskevime suurendamiseks ja meetodi lihtsustamiseks on arendatud mikroplaadil phinev Maatriks-ChIP, mille lbiviimiseks kulub kigeks ks pev. Antikehad on immobiliseeritud koos proteiin A-ga 96 kaevukesega mikroplaadi igasse kaevukesse, mis lihtsustab proovi ksitlemist ja hoiab antikehad iges orientatsioonis. Kik etapid toimuvad mikroplaadi kaevukestes, mis vimaldab protseduuri automatiseerida (Flanagin et al., 2008).

SELEXSELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) metoodika vimaldab in vitro selekteerida oligonukleotiidide raamatukogust jrjestusi, millega seondub rekombinantne

transkriptsioonifaktor vi mni muu uuritav valk (Djordjevic, 2007). Krge afiinsusega jrjestused valitakse algsest raamatukogust (enamasti 1015-1016 jrjestust) korduvate tsklitega (mrklaua seondumine, selektsioon, amplifikatsioon) (Joonis 4). Oligonukleotiidide keskmine osa on suvaline DNA jrjestus (20-30 aluspaari), otstes on kindlaks mratud jrjestused (15-25 aluspaari), mis vimaldavad nende jrjestuste amplifikatsiooni (Djordjevic, 2007). Metoodika eelisteks on see, et analsiks on vaja vikeses koguses puhastatud valku, iseloomustada saab terveid valgujrjestusi ja

13

saab kindlaks mrata pikemaid kui 10-nukleotiidseid DNA seondumisjrjestusi. Selle metoodikaga on keeruline uurida korraga palju DNA-ga seonduvaid valke, kuna lbi tuleb analsida suur hulk kloone ja positiivsed kloonid peab sekveneerima (Xie et al., 2011).

Joonis 4. SELEX metoodika (Xie et al., 2011).

Valke seondavad mikrokiibidValke seondava mikrokiibi tehnoloogia vimaldab in vitro he pevaga iseloomustada DNA-valk interaktsioone. Selle metoodikaga hbridiseeritakse rekombinantne transkriptsioonifaktor vi mni muu uuritav valk, mille kljes on glutatioon S-transferaas, kaheahelalise DNA mikrokiibile. Pesemisetappide kigus eemaldatakse mittespetsiifiliselt seondunud valgud, spetsiifiliselt seondunud valgud mrgistatakse glutatioon S-transferaasi suhtes spetsiifilise ja fluorofooriga seondunud antikehaga (Joonis 5). Valgu DNAga seondumise spetsiifikat saab otseselt mrata, mtes seondunud kaheahelalise DNA signaali intensiivsust (Mukherjee et al., 2004).

14

Joonis 5. Valke seondava mikrokiibi metoodika (Xie et al., 2011).

Vrreldes SELEX- phise meetodiga, saab korraga uurida palju rohkem jrjestusi ja seega leitakse palju tpsemad DNA-ga seonduvad valgumotiivid. Valke seondava mikrokiibi analsiks on vaja suurt kogust rekombinantset valku, mis teeb vheekspresseeruvate valkude (nt paljud tispikkusega transkriptsioonifaktorid vi posttranslatsiooniliste modifikatsioonidega valgud) uurimise keeruliseks. Enamasti on vimalik tuvastada ainult krge afiinsusega interaktsioone ja kuna mikrokiibil on 10aluspaarilised DNA jrjestused, on sellest pikemaid seondumisjrjestustusi raske kindlaks mrata. DNA-valk interaktsioonide uurimiseks kasutatakse ka valke seondavale mikrokiibile vastupidist valgu mikrokiibi metoodikat, kus fluorofooriga mrgistatud DNA fragmente hbridiseeritakse valgu mikrokiibile (Xie et al., 2011).

Bakteri/prmi ksikhbriidSELEX ja valku siduva mikrokiibi meetodid sobivad valgu DNAga seondumise jrjestuse kindlaks tegemiseks, aga mingi kindla DNA jrjestusega seonduva valgu mramiseks oleks parem kasutada prmi vi bakteri ksikhbriidi meetodit. Bakteri ksikhbriidi meetod on lihtne, valik toimub kiiresti

15

ning see meetod on hsti rakendatav ja kttesaadav (Meng et al., 2005). Bakteri ksikhbriidi ssteem koosneb kolmest osast: 1. ekspressioonivektor, mis kodeerib RNA polmeraasi alfa subhiku ja uuritava valgu (nt transkriptsioonifaktor) liitvalku; 2. reportervektor, kuhu on kloneeritud erinevate seondumisjrjestuste raamatukogu kahe reportergeeni (prmi HIS3 ja URA3 geenid) promootorist lesvoolu; 3. selekteerimiseks vajalik bakteritvi (Joonis 6) (Meng et al., 2005). Kui uuritava valgu DNA-ga seonduv domn tunneb ra mrklaudjrjestuse reportervektoris, hakkab RNA polmeraas reportergeene transkribeerima, mrklaudjrjestuste mramiseks need

sekveneeritakse (Meng et al., 2005).

Joonis 6. Bakteri ksikhbriidi metoodika (Xie et al., 2011).

Prmi ksikhbriidi ssteemis kasutatakse hbriidvalku, kus tugev transkriptsiooni aktivatsiooni domn on liidetud uuritava valgu klge. Reportergeeni ekspressioon aktiveeritakse, kui valk seondub DNA jrjestusega (Joonis 7). Hetkel on kasutusel rekombinatsioonil phineva Gateway kloneerimisega (Invitrogen) seotud prmi ksikhbriidi ssteem, mis vimaldab edukalt paljude

16

lhikeste DNA fragmentide (nt cis-regulatoorsed DNA elemendid) ja ksikute suurte DNA jrjestuste (nt promootorid) kloneerimist reportervektorisse (Deplancke et al., 2004).

Joonis 7. Prmi ksikhbriidi meetod (Xie et al., 2011).

DNA-valk interaktsioonide andmebaasid ja arvutuslik ennustamineAastakmnete jooksul kogutud andmed DNA-valk interaktsioonide kohta on kttesaadavad erinevatest allikatest. Praeguseks on teada tuhandete nukleiinhapete ja valkude omavaheliste komplekside struktuurid. Need andmed on kigile vabalt kttesaadavad bioloogiliste makromolekulide 3D struktuuride andmebaasist PDB (The Protein Data Bank). 2011. aasta 1. novembri seisuga on teada 3335 nukleiinhappe ja valgu kompleksi struktuur, kusjuures le 90 % nendest struktuuridest on saadud rntgenstruktuuranalsiga (www.pdb.org). Lihtsustamaks DNA ja valkude interaktsioonide mehhanismide uurimist ja mistmist, on loodud mitmeid vastavaid andmebaase ja arvutiprogramme. Lisas 1 on toodud nited DNA-valk interaktsioonide analsimise/ennustamise tarkvarast ning andmebaasidest.

17

PDIdbPDIdb (The Protein-DNA Interface database) on 2009. aastal loodud andmebaas, kuhu on koondatud info rntgenstruktuuranalsil kindlaks tehtud ja PDB-s leiduvate DNA-valk komplekside struktuuride kohta. Selle andmebaasi eesmrgiks on aidata mista, millised on need phireeglid, mis mravad DNA ja valkude omavahelise molekulaarse ratundmise protsessi. Selleks keskendutakse just DNA ja valkude interaktsioonipinna (interface) kirjeldamisele, mitte aga seondumise seisukohalt oluliste kas ainult valkude vi nukleiinhapete struktuursete omaduste (nt valgu motiivid jms) kirjeldamisele (Norambuena et Melo, 2010). Iga andmebaasi kirje iseloomustab seega hte ja sltumatut valgu ja DNA interaktsioonipinda (Joonis 8).

Joonis 8. PDB kompleksid ja interaktsioonipinna definitsioon. (A) Nide struktuurist, mille assmeetriline hik moodustab poole bioloogiliselt aktiivsest kompleksist. (B) Iga andmebaasi kirje koosneb hest ja sltumatust valk-DNA interaktsioonipinnast, mis on isoleeritud tervest PDB kompleksist. Kaks illustreerivat nidet: 1am9, mille PDB failis on kaks eraldatavat kompleksi he valk-DNA interaktsioonipinnaga; 1h89, millel on ks kompleks, kuid kahe erineva valk-DNA interaktsioonipinnaga. Igal interaktsioonipinnal on andmebaasis oma unikaalne ID (Melo et al., 2010).

Hetkel on andmebaasis 922 kirjet. Lisaks sisaldab iga kirje ka jrgmist infot: 1. Valgu omadused: funktsiooniphine klassifikatsioon (nt transkriptsiooni faktor, ensm jne);

y

18

y

funktsiooni-

ja struktuuriphine klassifikatsioon,

kus

niteks

ensmid jagunevad

nukleaasideks, kinaasideks jne; transkriptsioonifaktorid aga motiivide jrgi, nt beetaleht, heeliks-pre-heeliks jne; multimeersete valkude DNA-ga interaktsiooni suund (ahelaga risti, paralleelselt) (joonis 9. I); multimerisatsioon (homo-, heteromultimeer).

y

y

2. DNA omadused: he- vi kaheahelaline (joonis 9. II A); "kleepuvate" otste olemasolu (joonis 9. II B); vlja pratud aluste olemasolu (joonis 9. II C); ahela katkete olemasolu (joonis 9. II D); ahelas thimike olemasolu ehk aluste puudumine (joonis 9. II E); kas DNA on avatud otsetes - alused ei moodusta vesiniksidemeid (joonis 9. II G); modifitseeritud aluste olemasolu (joonis 9. II F); kas Holliday struktuuri moodustades on DNA ahelas katkeid; kas DNA on Z-konformatsioonis (vasakule prduv heeliks).

y y y y

y y y

y y

3. Interaktsioonipinna omadused: millised DNA ahela osad osalevad interaktsioonides (otsad, suur vagu, vike vagu); valgu jrjestuse joondamise phjal klastrisse kuuluvust - kaks interkatsioonipinda kuuluvad samasse klastrisse, kui kaks interaktsioonipinna moodustavat valgu jrjestust omavad vhemalt 70% identseid aminohappejrjestusi vhemalt 90% jrjestuse ulatuses; aatomite otseste kontaktide arv; 19

y y

y

y

aatomite kontaktide phjal klastrisse kuuluvust - kaks interaktsioonipinda moodustavad he klastri, kui need omavad 75% ulatuses identseid aatomite kontakte; aatomite kontaktide klassifikatsioon (vesinik-, ioonsed sidemed, hdrofoobsed interaktsioonid jne); aatomite kontaktide kuuluvust kas vikesesse vi suurde vakku.

y

y

Joonis 9. (I) Multimeersete valkude DNA-ga interakteerumise suund. Valgu ja DNA kaksikheeliksi interaktsioonipinnad on risti (A), paralleelsed (B) vi kombinatsioon kahest eelmisest (C). (II) DNA omadused. (A) he- vi kaheahelaline, (B) "kleepuvad" otsad, (C) vlja pratud alused, (D) ahela katked, (E) thimikud ahelas, (F) modifitseeritud alused ahelas, (G) ahela otsad on avatud (mugavdatud, Norambuena et Melo, 2010).

Veebibrauseriphise Java rakenduse Jmol abil on erinevat informatsiooni vimalik ka visualiseerida, nt PDB-st saadud 3D struktuuri, 10 vesiniksidemeid on vljavte jpm (Norambuena mis et Melo, infot 2010; he

http://www.pdb.org).

Joonisel

andmebaasist,

sisaldab

transkriptsioonifaktori - sterooli regulatoorse elemendiga seonduv valk (SREBP) - he DNA-ga interakteeruva pinna kohta. Samuti on andmebaasi veebilehelt vimalik alla laadida ka tarkvara aatomite kontaktide analsimiseks.

20

Joonis 10. Vljavte PDI andmebaasist sterooli regulatoorse elemendiga (http://www.pdb.org).

seonduva

valgu

(SREBP)

kohta

JASPARTranskriptsioonifaktorid moodustavad suurima ja ka enim uuritud osa DNA-ga seonduvatest valkudest. Kaasaegse hinnangu jrgi moodustavad transkriptsioonifaktorid umbes 4.65 % loomade (Metazoa) kikidest geenidest (Charoensawan et al., 2010). Selgitamaks, milliseid geene transkriptsioonifaktorid reguleerivad, oleks vaja teada, millisele jrjestusele see valk seondub. Seondumiskoha motiivi ennustamisel alustatakse nende DNA jrjestuste kogust, mille kohta on teada, et uuritav transkriptsioonifaktor sinna seondub. Nendest jrjestustest motiivi leidmiseks eelistatuim meetod on positsioonisptetsiifiline skoorimismaatriks, mis moodustatakse eespool mainitud joondatud jrjestuste phjal. Transkriptsioonifaktori seondumiskohtade ennustamisel saab koostatud maatriksit kasutada hindmaks kskik millise jrjestuse sarnasust nendele jrjestuste kogumile, mille phjal maatriks koostati. 2004. aastal loodud avalik andmebaas JASPAR (Sandelin et al., 2004) kasutabki seda meetodit DNA-ga interakteeruvate valkude seondumiskohtade ennustamiseks. Andmebasi kige uuem versioon sisaldab 457 ksitsi annoteeritud eukarootide transkriptsioonifaktorite ja ka teiste DNA-ga interakteeruvate valkude seondumiskohtade profiili (Portales-Casamar et al., 2010). Esimese

21

versiooni mrklaudjrjestused olid koostatud kas SELEX katsetest saadud andmete vi teadaolevate in vivo regulatoorsete regioonide jrjestuste phjal (Sandelin et al., 2004), uusimas vljalaskes ka ChIPseq ja ChIP-chip eksperimentide andmete phjal (Portales-Casamar et al., 2010). Andmebaasi kodulehekljel http://jaspar.cgb.ki.se/ on vimalik lehitseda seondumiskohtade profiile, otsida profiile erinevate kriteeriumite jrgi (organism, valgumotiivide struktuurne klass, eksperimentaalne meetod jne), sisestada oma huvipakkuv FASTA formaadis nukleotiidide jrjestus leidmaks vimalikke transkriptsioonifaktorite seondumiskohti. Joonisel 11 on nha kolme seondumiskoha profiili vastusena jrgmisele otsingule: eksperimentaalne meetod e. Type - chip-seq, liik e Species - Mus Musculus transkriptsioonifaktori struktuurne klass e Class - Zipper Type ("leutsiin-tmblukk" motiiv).

y y y

Lisaks DNA jrjestusele on seondumisel vga oluline ka DNA heeliksi 3D struktuur (Rohs et al., 2010).

22

Joonis 11. Kolm valgu seondumiskoha profiili, mis saadud vastuseks JASPAR andmebaasis tehtud otsingule: eksperimentaalne meetod e. Type - chip-seq; liik e Species - Mus Musculus; transkriptsioonifaktori struktuurne klass e Class Zipper Type ("leutsiin-tmblukk" motiiv). (http://jaspar.cgb.ki.se/).

DBD2005. aastal loodud andmebaas DBD sisaldab transkriptsioonifaktorite ennustusi 929 organismi tielikult sekveneeritud genoomi jaoks. Praegune andmebaasi versioon ennustab 2886 inimese transkriptsioonifaktorit ehk ca 6% kikidest valgujrjestustest on transkriptsioonifaktorid

(http://www.transcriptionfactor.org). Ennustusmeetod identifitseerib jrjestusspetsiifilised DNA-ga seonduvad transkriptsioonifaktorid homoloogia kaudu peidetud Markovi mudeli jrgi modelleeritud DNA-ga seonduvate domnide profiilidega. Need mudelid on kogutud valguperekondade andmebaasidest SUPERFAMILY ja Pfam ning ksitsi annoteeritud (Kummerfeld et Teichmann, 2006). Andmebaasi kodulehel on ennustusi vimalik lehitseda, otsida ja alla laadida genoomi vi domni perekonna jrgi, vaadata transkriptsioonifaktorite perekondi domni arhitektuuri phjal ja uurida kasutaja poolt sisestatud valgujrjestust. Andmebaasi loojate arvates viksid

transkriptsioonifaktorite ennustused muuta paremaks genoomide annoteerimist, mitmeid meetodeid, 23

(ChIP-chip, valke seondav mikrokiip, prmi ksihbriid) ja geeni regulatsiooni evolutsiooni uurimist. Koosklas varasemate uuringutega selgub ennustustest, et suuremate proteoomide reguleerimiseks on vajalik suurem transkriptsioonifaktorite osakaal. Lisaks leiti, et niteks loomade ja seente transkriptsioonifaktorite DNA-ga seonduvad domnid on omavahel sarnasemad kui loomade ja taimede domnid, mis peegeldab loomade ja seente lhemat flogeneetilist seotust (Wilson et al., 2008).

hPDI ja UniPROBEhPDI (human Protein DNA Interactome) (Xie et al., 2010) ja UniPROBE (Universal PBM Resource for Oligonucleotide Binding Evaluation) (Newburger et Bulyk, 2009) avalikesse andmebaasidesse on kogutud info valkude in vitro seondumisspetsiifika kohta, mis on saadud valke seondavate kiipide katsetest ja katsetulemuste statistilisest analsist. Neist esimene on loodud 2010. aastal ja sisaldab hetkel andmeid 1013 inimese DNA-ga seonduva valgu kohta. Geenide funktsiooni andmebaasi GO ja valguperekondade andmebaasi Pfam annotatsioonide phjal on 493 nendest valkudest defineeritud kui transkriptsioonifaktorid; lejnud on defineeritud kui ebaharilikud DNA-ga seonduvad valgud e valgud, mille puhul pole varem DNA-ga seondumist nidatud (http://bioinfo.wilmer.jhu.edu/PDI/). UniPROBE andmebaasis on hetkel info erinevatest organismidest (hiir, pagariprm, C. elegans, malaaria tekitaja Plasmodium falciparum jt) prit 415 valgu kohta, millest enamus on transkriptsioonifaktorid (Robasky et Bulyk, 2011; http://thebrain.bwh.harvard.edu/uniprobe/).

Mlemad andmebaasid vimaldavad teostada otsinguid, lehitseda valkude seondumisjrjestuste profiile, otsida potentsiaalseid seondumiskohti ja sellega seonduda vivaid valke kasutaja poolt sisetatud DNA jrjestuse phjal. UniPROBE-s saab lisaks vrrelda oma seondumisjrjestuste motiive andmebaasis leiduvatega. Kui UniPROBE-s teostada pring liigi Homo sapiens jrgi, on tulemuseks kaks valku, millest ks on transkriptsioonifaktor Sox4. Joonisel 12 on nha, millist infot kirje antud valgu kohta sisaldab.

24

Joonis 12. Tehes otsingut Homo sapiens UniProbe andmebaasist, saame tulemuseks info kahe valgu kohta, millest ks on transkriptsioonifaktor Sox4 (http://the_brain.bwh.harvard.edu/uniprobe/).

ENCODELihtsustamaks inimese genoomi jrjestuse tlgendamist ja nende teadmiste rakendamist inimese bioloogia mistmisel ja meditsiini vallas, kivitati 2003. aastal ENCODE-i (ENCyclopedia Of DNA Elements) projekt (The Encode Project Consortium, 2004), mille eesmrgiks on identifitseerida kik funktsionaalsed elemendid inimese genoomis. Projekti pilootfaasis, mis kestis 2007. aastani, keskenduti 30 Mb (~1%) suurusele inimese genoomi osa uurimisele, mille eesmrgiks oli erinevate eksperimentaalsete meetodite sobilikkuse hindamine. Projekti kigus loodetakse annoteerida kik valke kodeerivad ja mittekodeerivad geenid, pseudogeenid, erinevad cis-regulatoorsed elemendid (promooterid, vimendajad, vaigistajad jne), neile iseloomulik kromatiini struktuur ja

modifikatsioonid, regulatoorsete elementidega seonduvad valgud, sh RNA polmeraasi seondumine, identifitseerida kromatiini erienvate regioonide interaktsioonid jne. Peamised meetodid, mida selleks kasutatakse on ChIP-seq, DNAse I hpersensitiivsuse anals, RNA-seq (The Encode Project 25

Consortium, 2011). ENCODE andmebaasis sisalduv info on kigile kttesaadav aadressil http://genome.ucsc.edu/ENCODE/index.html. Andmeid on vimalik alla laadida, aga ka visualiseerida UCSC genoomi brauseris. Joonisel 13 on nide infost, mida on vimalik nha GAPDH geeni kohta.

Joonis 13. UCSC genoomi brauseris visualiseeritud ENCODE-i andmebaasis GAPDH geeni kohta sisalduv info (http://genome.ucsc.edu/).

DP-BINDValk-DNA interaktsioone saab ennustada ka lhtudes valgu struktuurist. Kuna struktuuri mramine pole aga alati lihtne, siis on vlja arendatud ka valgu jrjestusel phinevaid ennustusmeetodeid. heks selliseks on niteks DP-Bind (Hwang et al., 2007; http://lcg.rit.albany.edu/dp-bind/), veebiserver, mis ennustab kasutaja poolt sisestatud FASTA formaadis valgu jrjestuse phjal DNA-ga interakteeruvaid aminohappejke.

Valk-DNA interaktsioonide rakenduslikud vljundidRavimi vljattamise philised sihtmrgid ja meetodid, mille abil neid sihtmrke analsitakse: 26

Molekulaarse meditsiini areng on viimastel aastatel kiirenenud, just tnu HGP-i (inimese genoomi projekt) lpetamisele, mis pakub vimalust avastada uusi sihtmrkvalke ravimitele. Ravimi ,sihtmrgiks peetakse molekulaarset struktuuri (mis omab vhemasti molekulmassi), ja mis omab interaktsiooni kemikaaliga (ravimiga) ning seelbi omab positiivset efekti haigusseisundi ravimisel. Kuna ravimiarenduse etapid on kulukad ja aeganudvad, on igati ratsionaalne leida vimalikult efektiivne ravim. Selle jaoks aga on tarvis teada nii haiguse molekulaarseid mehhnisme kui tehnoloogiat, mille abil oleks vimalik kindlaks teha ravimi mju sihtmrgile. Meetodid mille abil ravimite sihtmrke ,ennustatakse uuenevad pidevalt. Nii vib tuuagi ChIP-i heks niteks millega leiab jrjest enam sihtmrke (peale selle identifitseerimist), phinevad kik struktuuri uurimisel: rntgen struktuuranals ja tuuma magnetresonants spektroskoopia.

Joonis 13. Peamised ravimite sihtmrgid; Bioinformation. 2006; 1(8): 314320.

Meetodid ravimite sihtmrkide analsimisel: Rntgenkiire struktuuranals ja magnetresonants spektroskoopia (milliste sihtmrkide juures neid uuritakse) ChIP (kasutatakse nukleiinhappe ja sellega interakteeruvate valkude sihtmrgi uurimisel)

KokkuvteOn tulemas veel.

Kasutatud kirjandus:27

Adli, M., Zhu, J., Bernstein, B.E. (2010). Genome-wide chromatin maps derived from limited numbers of hematopoietic progenitors. Nat Meth, 7:615-618. Goren, A., Ozsolak, F., Shoresh, N., Ku, M., Adli, M., Hart, C., Gymrek, M., Zuk, O., Regev, A., Milos, P.M., et al (2010). Chromatin profiling by directly sequencing small quantities of immunoprecipitated DNA. Nat Meth, 7:47-49. Ho, J.W.K., Bishop, E, Karchenko, P.V., Ngre, N., White, K.P., Park, P.J. ChIP-chip versus ChIP-seq (2011). Lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics, 12:134 Johnson D.S., Mortazavi A., Myers R.M., Wold B. (2007). Genome-wide mapping of in vivo protein DNA interactions. Science 316:14971502. Mario-Ramrez, L., Levine, K.M., Morales, M., Zhang, S., Moreland, R.T., Baxevanis, A.D., Landsman, D. (2011). The Histone Database: an integrated resource for histones and histone foldcontaining proteins. Meaburn, E., Schulz, R (2011). Next generation sequencing in epigenetics: Insights and challenges. Molloy, P. L., Watt, F.(2001). DNA Methylation and Specific Protein-DNA Interactions. Narayanan, S.S., Pal, S.K. (2007). Nonspecific Protein-DNA Interactions: Complexation of rChymotrypsin with a Genomic DNA. Northrup D. L., Zhaol, K. (2011). Application of ChIP-Seq and Related Techniques to the Study of Immune Function. Immunity 34:830-842 Park, P.J. (2009). ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet, 10:669-680. Rabinovich, A., Jin V.X., Rabinovich R., Xu X., Farnham P.J., (2008). E2F in vivo binding specificity: comparison of consensus versus nonconsensus binding sites. Genome Res. 18:17631777.

28

Robertson, G., Hirst, M., Bainbridge, M., Bilenky, M., Zhao, Y., Zeng, T., et al. (2007). Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods, 4:651657. Schmidt, D., Wilson, M. D., Spyrou, C, Brown G. D., Hadfield, J., Odoma D. T., (2009). ChIP-seq: Using high-throughput sequencing to discover proteinDNA interactions. Methods 48:240248 Slutsky, M., Mirny, L.A. (2004). Kinetics of Protein-DNA Interaction: Facilitated Target Location in Sequence-Dependent Potential. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S.K., Teichmann, S. A, and Luscombe, N.M A census of human transcription factors: function, expression and evolution Vaquerizas, J. M., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. (2007). How Do You Find Transcription Factors? Computational Approaches to Compile and Annotate Repertoires of Regulators for Any Genome. Weibrecht, I., Gavrilovic, M., Lindbom, L., Landegren, U., Whlby, C., Sderberg, O. (2011). Visualising individual sequence-specific protein-DNA interactions in situ. Norambuena, T., Melo, F. (2010). The Protein-DNA Interface database. Bioinformatics, Vol 11: 262

Berman, H.M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T.N., Weissig, H., Shindiyalov, I.N., Bourne, P.E. (2000). The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res., Vol. 28, No. 1

Charoensawan, V., Wilson, D., Teichmann, S.A. (2010). Genomic repertoirs of DNA-binding transcription factors across the tree of life. Nucleic Acids Res., Vol. 38, No. 21

29

Sandelin, A., Alkema, W., Engstrm, P., Wasserman, W.W., Lenhard, B. (2004). JASPAR: an openaccess database for eukaryotic transcription factor binding profiles. Nucleic Acids Res., Vol. 32, Database issue

Portales-Casamar, E., Thongjuea, S., Kwon, A.T., Arenillas, D., Zhao, X., Valen, E., Yusuf, D., Lenhard, B., Wasserman, W.W., Sandelin, A. (2010). JASPAR 2010: the greatly expanded openaccess database of transcription factor binding profiles. Nucleic Acids Res., Vol. 38, Database issue

Kummerfeld, S.K., Teichmann, S.A. (2006). DBD: a transcription factor prediction database. Nucleic Acids Res., Vol. 34, Database issue

Wilson, D., Charoensawan, V., Kummerfeld, S.K., Teichmann, S.A. (2008). Nucleic Acids Res., Vol. 36, Database issue

Xie, Z., Hu, S.H., Blackshaw, S., Zhu, H. and Qian, J. (2010). hPDI: a database of experimental human protein-DNA interactions. Bioinformatics Vol 26 (2)

Newburger, D.E., Bulyk, M.L. (2009). UniPROBE: an online database of protein binding microarray data on protein-DNA interactions. Nucleic Acids Res., Vol. 37, Issue suppl 1

Robasky, K., Bulyk, M.L. (2011). UniPROBE update 2011: expanded content and search tools in the online database of protein binding microarray data on protein-DNA interactions. Nucleic Acids Res., Vol. 39, Issue suppl 1 30

The Encode Project Consortium (2004). The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science 306, 636

The Encode Project Consortium (2011). A User's Guide to the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE). PLOS Biol 9(4)

Hwang, S., Gou, Z., Kuznetsov, I.B. (2007). DP-Bind: a web server for sequence-based prediction of DNA-binding residues in DNA-binding proteins. Bioinformatics 23(5)

Rohs, R., Jin, X., West, S.M., Joshi, R., Honig, B., Mann, R.S. (2010). Origins of Specicity in Protein-DNA Recognition. Annu. Rev. Biochem. 79

Kasutatud veebiaadressid: http://melolab.org/pdidb/web/content/home www.pdb.org http://jaspar.cgb.ki.se/ www.transcriptionfactor.org http://bioinfo.wilmer.jhu.edu/PDI/ http://thebrain.bwh.harvard.edu/uniprobe/ http://genome.ucsc.edu/ENCODE/index.html

31

http://lcg.rit.albany.edu/dp-bind/

http://higheredbcs.wiley.com/legacy/college/boyer/0471661791/structure/protein_dna/protein_dna.ht m Tienemas veel.

Lisa 1.Tabel 2. Niteid valk-DNA interaktsioonide ennustamise programmidest ja andmebaasidest (mugavdatud; Norambuena ja Melo, 2010).Name Type Main Feature Published Address

3d-footprint

DB

Collection structure.

of

PWM

extracted

from

2010

http://floresta.eead.csic.es/3dfootprint

3DNA

S

Tool

for

extracting

DNA

structure

2003

http://rutchem.rutgers.edu/~xiangjun/3D NA

parameters.

AANT

DB

Collection

of

amino

acid-nucleotide

2004

http://aant.icmb.utexas.edu/

interactions derived from experimentally determined structures. proteinnucleic acid

BindN

S

SVM-based tool for prediction of DNA and RNA binding residues in protein.

2006

http://bioinfo.ggc.org/bindn/

BIPA

DB

Database

for

proteinnucleic

acid

2009

http://mordred.bioc.cam.ac.uk/bipa

interactions in 3D structures. It provides various features of protein-nucleic acid interfaces.

32

Curves+

S

Tool

for

extracting

DNA

structure

2009

http://gbio-pbil.ibcp.fr/Curves_plus

parameters.

DNABindR

S

Web server for identification of DNA binding residues in protein sequences.

2006

http://turing.cs.iastate.edu/PredDNA/

DP-Bind

S

Web-server that takes a sequence of a DNA-binding protein and predicts residue positions involved in interactions with DNA.

2007

http://lcg.rit.albany.edu/dp-bind/

hPDI

DB

Database that holds experimental protein DNA interaction data for humans

2010

http://bioinfo.wilmer.jhu.edu/PDI/

identified by protein microarray assays.

IAlign

S

Software to align protein-DNA interfaces based on a matrix score.

2005

http://luna.bioc.columbia.edu/honiglab/s oftware/IAlign/

JASPAR

DB

Open-access

database

for

eukaryotic

2004

http://jaspar.genereg.net

transcription factor binding profiles.

NDB

DB

The nucleic acid database.

1992

http://ndbserver.rutgers.edu/

NPIDB

DB

Database containing information derived from structures of DNA-protein and RNAprotein complexes extracted from PDB.

2007

http://mouse.belozersky.msu.ru/NPIDB/

NUCPLOT

S

Programme diagrams

to

generate

schematic

1997

http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/nucp lot.html

of proteinnucleic acid interactions.

PDA

S

Automatic programme for the analysis of protein-DNA complex structures.

2009

http://bioinfozen.uncc.edu/webpda/

PDBSum

DB

Web-based database of summaries and analyses of all PDB structures.

1996

http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/

ProNIT

DB

Database

that

collects experimentally

2001

http://gibk26.bse.kyutech.ac.jp/jouhou/p ronit/pronit.html

observed binding data from the literature. It contains several important

thermodynamic data for protein-nucleic

33

acid binding.

ProNuC

DB

Database containing structural data of protein-nucleic acid complex. The data are classified according to recognition motif of proteins and DNA forms involved in the complex.

1998

http://gibk26.bse.kyutech.ac.jp/jouhou/p ronuc/pronuc.html

ProtNA-ASA

DB

Database that combines the data on conformational parameters of nucleic

2009

http://www.protna.bio-page.org/

acids and accessible surface area of nucleic acid atoms in protein-DNA/RNA complexes.

Tfmodeller

S

Programme for comparative modelling of protein-DNA complexes.

2007

http://maya.ccg.unam.mx/~tfmodell/

TRANSFAC

DB

Private

database

for

eukaryotic

1996

http://www.biobaseinternational.com/pages/index.php?id=tr ansfac

transcription factor binding profiles.

ZifBase

DB

Collection

of

various

natural

and

2009

http://web.iitd.ac.in/~sundar/zifbase/

engineered zinc finger proteins, containing sequence features and linked to their structures.

34

Lisa 2.

Joonis Heeliks-pre-heeliks-motiivi sisaldavad valgud

Joonis

?

Tsinksrme

sisaldavad valgud

Joonis ? -lehe tpi DNAga seonduv motiiv

35

Joonis ? Leutsiiniluku motiiv

Joonis ? Peptiidiling - DNA ja p53

Joonis ? Heeliks-ling-heeliks motiiv

36