UNIVERSITATEA DIN BACĂUFACULTATEA DE INGINERIESECŢIA: INGINERIE BIOCHIMICĂ

REFERAT LA ENZIMOLOGIE

STUDENŢI:BUTNARU IULIANA;

COORDONATOR: CIOBANU MIHAELA;CONF.DR.ING.RUSU LĂCRĂMIOARA RUGINĂ MANUELA;

GRUPA: 1141.A.

-2008-

1

TEMA REFERATULUIPROCEDEE DE PURIFICARE,

SEPARARE ŞI CONCENTRARE A ENZIMELOR

2

CUPRINS

I. Enzimele…………………………………………………………………pag.4. I.1. Cataliza enzimatică (biocataliza)…………………………………….…..pag.6. I.2. Clasificarea enzimelor……………………………………………………pag.6.

II. Criterii de purificare pentru enzime………………………………………pag.7. II.1 Purificarea enzimelor……………………………………………….…….pag.8. II.2.Procedee de purificare a enzimelor……………………………………...pag.10. II.3.Purificarea lactat dehidrogenazei………………………………………..pag.11. II.4.Procedeul de purificare al lactat dehidrogenazei………………………...pag.12. III. Procedee de separare a enzimelor………………………………………pag.13.

III.1.Separarea electroforetică a enzimelor…………………………………..pag.15.III.2.Metode de separare a enzimelor…………………………………….….pag.16.

III.3.Dializa…………………………………………………………………..pag.17.III.4.Termoprecipitarea enzimelor…………………………………………...pag.17.

III.5.Precipitarea fracţionată la pH izoelectric a enzimelor………………….pag.17. IV. Procedee de determinare a concentraţiei enzimelor…………………….pag.18.

IV.1.Modul de exprimare a concentraţiei enzimelor………………………...pag.18.IV.2.Preparate enzimatice de înaltă puritate…………………………………pag.19.

V. Bibliografie……………………………………………………………..pag.22.

3

I. ENZIMELE

Enzimele sunt macromolecule de natură proteică , ce au rol de catalizatori în reacţiile din organismele vii .

Termenul de enzimă a fost introdus de Kühne în 1878 şi înseamnă în drojdie , ceea ce arată că activitatea enzimelor catalizatori ai reacţiilor biochimice nu este legată de viaţa celulei de drojdie .

Enzima a existat din cele mai vechi timpuri , dezvoltându-se pe baze empirice, pe experienţa câştigată de generaţii . În ultimii ani enzimologia s-a dezvoltat exploziv, pe baza unor cercetări ample privind structura enzimelor , mecanisme de reacţii studiate la nivel electronic si cuantic , integrarea şi reglarea proceselor enzimatice în cadrul metabolismului intermediar . Sinteza chimică a unor enzime reprezintă una din marile performanţe ale enzimologiei moderne – ce deschide calea unor importante posibilităţi de aplicabilitate teoretică şi practică . S-au obţinut preparate enzimatice înalt purificate (proteaza, pectinaze, amilaze, ribonucleaze, celulaze etc.) în stare liberă sau imobilizate pe suporturi solide , care deschid perspectiva obţinerii unor complexe multienzimatice , utilizate ca medicamente, ca senzori enzimatici pentru poluare , în microbiologie , în industria alimentară , în industria medico-farmaceutică , în menaj .

Printre factorii care determină calitatea alimentelor , gustul şi mirosul joacă un rol important . Complexul de senzaţii compus din gust şi miros formează arma. Substanţele aromate pot exista ca atare în legume şi fructe sau se formează după recoltare sub influenţa activităţii diferitelor enzime al căror substrat poate fi aminoacizi , zaharide , derivaţi , lipide , acizi graşi sau alte substanţe numite precursori aromatici . În general substanţele aromatizante sunt uşor volatile şi în timpul conservării se pierd . Produsul conservat îşi pierde de cele mai multe ori aroma de produs natural proaspăt şi capătă în schimb alte caractere organoleptice . Cercetătorii au constatat că prin sterilizare termică se distrug pe lângă alte enzime şi enzimele ce caracterizează formarea substanţelor aromatizante dar nu se distrug precursorii substanţelor aromatizante . Dacă la procesul alimentar conservat se adaugă preparate enzimatice extrase din produsul natural (sau din altă plantă din aceeaşi familie), alimentul conservat redobândeşte gustul şi mirosul specific al produsului crud.

Gustul amar al grepfruturilor şi al produselor fabricate din acesta (sucuri, gemuri, marmelade ) se datorează unui glicozid naringina care se găseşte în cantitate mare în albedo ( partea albă a cojii). Prezenţa naringinei în concentraţie mare în sucurile de grepfrut le face dezagreabile. Aceste neajunsuri pot fi înlăturate prin hidroliza naringinei rezultând substanţe ce nu sunt amare. Enzima naringinaza, ce catalizează această reacţie, a fost identificată în seminţele de ţelină în cantităţi mici în regiunea dintre flavedă şi albedo din grepfruturi.

Îmbrumarea enzimatică a fructelor şi legumelor se datorează faptului că sunt oxidaţi compuşii fenolici cu formare de chinone apomelanine – substanţe de culoare

4

închisă – procese ce implică enzime din categoria fenoloxidazelor, tirozinazelor. Acest fenomen este dependent de lumină şi căldură, de aceea fructele şi legumele care primesc mai multă lumină au o valoare mai intensă decât cele umbrite.

Procesele enzimatice care au loc în produsele animale. Şi în produsele animale, în special carne, au loc procese enzimatice după sacrificarea animalului. Glicogenul nu mai este degradat aerob la bioxid de carbon şi apă, ci anaerob la acid lactic. De aceea pH – ul cărnii scade de la 7,3 – 7,4 la 5,4 – 5,6 , proces numit maturare. Frăgezirea cărnii se poate realiza cu preparate enzimatice proteolitice. Durata de gătire la carnea tratată cu preparate enzimatice se reduce cu 1/3. Datorită acestui fapt creşte valoarea nutritivă a cărnii. Se poate recurge şi la injectarea enzimelor proteolitice înainte de sacrificarea animalului, obţinând astfel carne fragedă şi din animale mai bătrâne.

Enzimele sunt considerate a fi indicatorii de calitate în industria alimentară. Aprecierea calităţii alimentelor se face prin :

Dozarea activităţii enzimelor proprii produsului; Dozarea activităţii enzimelor străine de produs aduse de impurităţi sau

apărute prin alterarea microbiologică.Spre exemplu, aprecierea calităţii laptelui se face prin determinarea mai întâi a enzimelor proprii sau celor apărute prin fenomenul de contaminare bacteriană. Cu ajutorul enzimelor existente în lapte, se poate deosebi laptele crud de cel pasteurizat. Pentru laptele crud proba analizei este pozitivă ( se foloseşte coloraţia pe care o dă iodul cu amidonul ). Dintre enzimele conţinute în lapte, prezintă o importanţă deosebită în aprecierea calităţii amilazele, fosfatazele, prexidazele, xantin oxidaza.

În medicină şi farmacie enzimele îşi găsesc cele mai multe aplicaţii. Enzimologia clinică constă în determinarea enzimelor localizate în organe, ţesuturi, lichide biologice şi este un preţios instrument în diagnostic şi tratament.

Cu toate dificultăţile generate de structura lor proteică, enzimele sunt folosite din ce în ce mai mult în terapeutică. Enzimoterapia foloseşte enzime individuale, asociaţii enzimatice, asociaţii de enzime şi alte substanţe active, activatori şi inhibitori enzimatici. În cazul afecţiunilor digestive se folosesc pepticazele ( pepsina, tripina, chimotripsina ), lipaza şi amilaza. În afecţiuni dermatologice însoţite de procese inflamatorii se utilizează enzime proteolitice (tripsina, papaina, alfa-chimotripsina). În afecţiunile oftalmologice se folosesc lizozimul, tripsina, alfa-chimotripsina.

Enzimele au largi aplicaţii în industria de biosinteză enzimatică. Astfel se pot obţine substanţe optic active (aminoacizi, hidroxiacizi), antibiotice şi alte medicamente, biopolimeri folosiţi în industria extractivă. De asemenea se pot realiza diferite reacţii de oxidare a unor substanţe organice sau reacţii de transformare biochimică a unor compuşi naturali (hormoni steroizi).

Botanica şi chimia agricolă aplică analiza enzimatică în cercetarea fiziologiei plantelor, în controlul calităţii unor produse vegetale. Studiile privind comportamentul la ger şi la secetă a unor plante de cultură folosesc analiza enzimatică. Calitatea seminţelor este testată prin activitatea enzimatică a proteinelor, a alfa – amilazei.

Folosirea preparatelor enzimatice pentru hidroliza materialelor celulozice, deschide perspective transformării superioare a unor reziduuri vegetale sau animale.

Enzimele îşi găsesc o largă aplicabilitate şi în microbiologie. Microorganismele sunt crescute în medii de cultură încât pot produce cantităţi mari dintr-o gamă variată de substanţe organice.

5

În industria chimică enzimele sunt utilizate atât ca reactivi chimici de analiză, cât şi ca reactivi chimici de sinteză. În domeniul chimiei, proteinelor nu li se poate concepe studiul secvenţei de aminoacizi a unei proteine fără utilizarea metodelor de hidroanaliză enzimatică cu proteinoze. În chimia analitică sunt folosiţi electrozi enzimatici sensibili la concentraţia diferitelor substanţe. În chimia preparativă se folosesc diferite transferaze pentru grefarea unor grupări de compuşi organici rezultând substanţe noi, ce se obţin greu prin metode chimice clasifice. Preparatele enzimatice sunt folosite în industria textilă, industria tăbăcăriei, blănurilor, în curăţătorii chimice.

Importanţa deosebită a enzimelor explică varietatea domeniilor de aplicabilitatea acestora.

I. 1. Cataliza enzimatică (biocataliza)

Enzimele sunt constituite din macromolecule de natură proteică, specific structurate, astfel încât să poată fixa, prin legături slabe, moleculele substratului care reacţionează. Asemenea tuturor catalizatorilor, enzimele nu modifică echilibrul chimic sau proprietăţile termodinamice ale sistemului.

Fiecare reacţie metabolică este catalizată de o singură enzimă. Specificitatea enzimelor arată că aceasta prezintă o porţiune superficială, numită centru activ, pe care se pot absorbi slab, într-o poziţie favorabilă reacţiei, moleculele substratului. Între conformaţia centrului activ al enzimei şi conformaţia aptă pentru a reacţiona a moleculelor substratului există o corespondenţă geometrică specifică, capabilă cu ce care există intre o cheie şi broasca la care aceasta se potriveşte. În general, intersecţia enzimei E cu substratul S presupune parcurgerea următoarelor etape : difuzia moleculelor substratului din soluţie către suprafaţa enzimei; orientarea moleculei sub acţiunea forţelor de atracţie şi fixarea acesteia la nivelul

centrului activ; desorbţia produşilor de reacţie de pe suprafaţa enzimei şi eliberarea centrului activ

care poate relua seria transformărilor. Forţele de intersecţie substrat – centru activ trebuie să fie suficient de puternice pentru a asigura menţinerea moleculei în poziţie potrivită, un timp suficient de îndelungat pentru producerea reacţiei.

Viteza reacţiilor catalizate cu enzime depăşesc cu 8 până la 11 ordine de mărime viteza celor necatalizate. Activitatea enzimelor depinde de temperatură, de pH, precum şi de alte proprietăţi ale mediului pe care celula le reglează în vederea controlării procesului metabolic.

Denumirea enzimelor se face indicând printr-un sufix denumirea substratului sau a reacţiei catalizate la care se adaugă terminaţia ~ ază. Astfel enzimele care acţionează în reacţiile redox de dehidrogenare au asupra lipidelor, proteinelor, amidonului şi esterilor se numesc reactivi oxidoreductaze, dehidraze, lipaze, protaze, amilaze şi esteraze.

Din cele prezentate rezultă că descifrarea mecanismului biocatalizei este esenţial pentru înţelegerea proceselor metabolice şi al chimismului vieţii în general.

I.2. Clasificarea enzimelor

Se cunosc în prezent câteva sute de enzime dar , având în vedere complexitatea proceselor chimice care au loc în organismele vii, numărul enzimelor aparut în natură trebuie sa fie mult mai mare.

6

Structura enzimelor este prea puţin cunoscută pentru a putea servi ca baza a unei clasificări, de aceea enzimele se clasifică după tipul reacţiilor pe care le provoacă sau după substraturile asupra cărora acţionează.

În clasificarea adoptată aici enzimele sunt împărţite în (după Hoffmann Ostenhof 1953) cinci clase principale, fiecare divizată în mai multe subclase:

1.Hidrolaze

2.Transferaze

3.Oxido-reductaze

4.Liaze şi simpetaze

5.Izomeraze şi Racemaze

La drept vorbind aproape toate reacţiile enzimatice sunt reacţii de transfer al unor grupe de atomi de la un donor la un acceptor. Astfel hidrolizele sunt reacţii de transfer al unor grupe acil, glicozil etc. cedate de substrat, către apă ca acceptor iar reacţiile de oxido-reducere sunt reacţii de transfer de hidrogen sau electroni termenul de transferare se foloseste însă, în nomenclatura curentă mai ales pentru transaminări, transmetilări, transacetilări.

După o clasificare mai nouă (Union of Biochemistry Commission of Enzymes 1961) enzimele sunt împărţite în şase clase:

1.Oxido-reductaze

2.Tranferaze

3.Hidroraze

4.Liaze

5.Izomeraze

6.Ligaze(sintetaze)

Fiecare divizată la rândul ei în mai multe subclase, fiecare enzimă este desemnată din patru cifre ex. 1111(hidrogenaza alcolului) este o oxido-reductoză (clasa 1) acţionează asupra grupei CH-OH a donorului(subclasa 1) cu DPN sau TPN ca acceptor(subclasa 1) şi este primul termen din această ultimă subdiviziune.

II. CRITERII DE PURIFICARE PENTRU ENZIME

În lucrările de enzimologie pentru caracterizarea unei enzime şi pentru stabilirea modului ei de acţiune este necesar să se obţină enzima în stare pură. Pentru aprecierea purităţii unei enzime şi în general a unei substanţe proteice nu exista deocamdată criterii sigure.

7

Dacă enzima este supusă la toate probele de puritate cunoscute şi dacă toate acestea arată că enzima este pură, atunci probabilitatea că ea este într-adevăr pură creşte foarte mult.

Probele pentru controlul purităţii care se aplică în prezent sunt următoarele:Maximul de activitate. Prin operaţiile de purificare se poate ajunge la preparate foarte

active. De cele mai multe ori operaţiile de purificare se termină prin obţinerea enzimei în stare cristalizată. Cristalizarea însă nu este o garanţie de puritate deoarece de cele mai multe ori cristalele substanţelor proteice sunt heterogene. Dacă enzima a fost obţinută în stare cristalizată şi prin recristalizări repetate se obţine mereu aceiaşi activitate, atunci se poate întâmpla ca enzima să fie pură. Activitatea enzimei se raportează la diferite unităţi: greutate uscată, substanţă organică, azotul total etc.

Procentul maxim al unui constituent caracteristic. Dacă în molecula enzimei se găseşte un component simplu uşor de determinat, atunci concentraţia procentuală a acestuia se poate folosi ca un criteriu de puritate.

De exemplu: Citocromii conţin fier. În preparatele purificare de citocrom c s-a gasit la început un procent de 0,34% Fe. S-a crezut că preparatele cu 0,34% Fe reprezintă citocromul c pur. Când Theorell şi Akeson au reuşit să izoleze citocromul c cu un procent de 0,34% Fe, primul a fost socotit ca impur. Deci procentul maxim al unui constituent ce se găseşte într-un preparat obţinut după anumite metode nu constitue o garanţie că substanţa este pură.

II.1. Purificarea enzimelor

Testele de purificare a enzimelor se bazează pe proprietăţile fizico-chimice : Comportarea la ultracentrifugare, în câmp electric, solubilitatea lor etc.

Dacă un preparat enzimatic este supus ultracentrifugării şi sedimentează un singur component există posibilitatea de a fi pur omogen. Nu trebuie pierdut din vedere însă că constantele de sedimentare ale enzimelor nu sunt distincte ci tind către anumite valori probabile.Proteinele cu proprietăţi fizico-chimice asemănătoare vor fi purificate concomitent, iar la analiza lor ultracentrifugală pot sedimenta ca un singur component. Cu toate acestea forma, lăţimea şi viteza de difuzie a unui maxim proteic, separat prin ultracentrifugare pot da informaţii preţioase asupra purităţii enzimei. Impurităţile pot fi puse în evidenţă atât sub forma unei maxime separate, cât şi ca urmare la maximul principal, prin profiluri asimetrice sau printr-o lăţime a maximului mai mare decât ceea calculată conform constantei de difuziune a enzimei. Se recomandă pentru siguranţa interpretării rezultatelor experimentale obţinute prin analize ultracentrifugale, ca acestea să fie conduse la diferite pH şi tării ionice ale preparatului enzimatic.

Un alt text de puritate este electroforeza prin care diferite componente dintr-un preparat enzimatic pot fi puse în evidenţă datorită mobilităţilor lor electroforetice diferite. Astfel un preparat enzimatic obţinut din muşchiul de iepure se dovedeşte a fi format din două componente proteice prin analiza ultracentrifugală şi din opt prin analiza electroforetică. Cu toate acestea sunt cazuri în care două sau mai multe enzime posedă mobilităţi electroforetice similare. Pentru siguranţa rezultatelor, în cazul în care un preparat enzimatic migrează ca o singură proteină este recomandabil să se repete experimentul la diferite valori de pH. În cazul

8

în care mai multe electroforegrame conţin o singură bandă există o mare posibilitate ca preparatul să fie pur.

Unul dintre cele mai sigure texte de purificare îl reprezintă natura curbei de solubilitate a unui preparat enzimatic, criteriu propus de Northrop şi colaboratorii săi în cercetările lor asupra enzimelor. Curbele de solubilitate se obţin prin determinarea experimentală a concentraţiei proteice din soluţie în funcţie de concentraţia proteinei solide adăugate în soluţie. Practic cantităţi crescânde de preparat enzimatic solid sunt adăugate într-un volum mic şi constant de solvent, probele sunt centrifugate, iar în supernatant este dozată concentraţia proteică sau activitatea enzimatică.

Într-un sistem de axe retangulare se trasează pe abcisă cantitatea de proteină adăugată iar pe ordonată-cantitatea de proteină solubilizată dozată în supernatante. În figura 1. se prezintă curbele de solubilitate ale pepsinei cristalizate pure (a) şi ale unui preparat brut de pepsină (b), după Northrop şi colaboratorii săi.

1,5

1,0((aaaaa

(a)0,5

0

1,5

1,0 (b)

0,5

1 2 3 4 5 mgFig.1. Curbele de solubilitate ale pepsinei pure (a) şi din preparatele brute, nepurificate (b) –după Northrop.

În cazul preparatului pur, curba de solubilitate este compusă din două segmente de dreaptă. Primul cu o pantă finită corespunde creşterii cantităţii de enzimă în soluţie proporţional cu cantitatea de proteină adăugată, al doilea cu o pantă egală cu zero corespunzător saturaţiei în enzimă a soluţiei. Punctul de intersecţie ale celor două segmente de dreaptă este punctul de saturaţie. Prezenţa impurităţilor în preparatul brut de pepsină (b) modifică forma curbei de solubilitate dând indicaţii asupra eterogenităţii unui preparat enzimatic. În cazul în care în soluţie există două proteine cu solubilităţi diferite, soluţia se va satura în ele la momente diferite şi curba de solubilitate a preparatului impur va avea mai multe puncte de intersecţie. Pentru acurateţea rezultatelor şi mai ales pentru siguranţa interpretării se recomandă ca aceste puncte de solubilitate să fie realizate în diferiţi solvenţi.

9

Sunt extrem de rare cazurile în care două proteine au aceiaşi solubilitate într-un solvent oarecare şi este mai puţin probabil ca doua proteine să aibă solubilităţi egale în diferiţi componenţi.

Textele imunologice sunt deosebit de specifice şi sensibile. Astfel dacă în sângele animalelor imunizate cu proteina de cercetat apare un singur tip de anticorp, proteina este unitară.

Dacă se compară rezultatele experimentale obţinute prin diferite metode ( compoziţia în aminoacizi, măsurarea presiunii osmotice, microscopie electronică, analiză de sedimentare viteză-difuziune, echilibru de sedimentare, gel cromatografie) pentru determinarea masei moleculare a preparatului enzimatic purificat se obţin valori mult deosebite este un indiciu asupra heterogenităţii acestuia.

Evidenţierea unor impurităţi prin texte funcţionale este un procedeu de punere în evidenţă a unor cantităţi mici de substanţe contaminante în cazul în care acestea au proprietăţi biologice specifice (enzime, hormoni). În situaţii rare în care o dingură proteină are două sau mai multe activităţi biologice, raportul lor trebuie să rămână constant pe tot parcursul procedeului de purificare.

II.2. PROCEDEE DE PURIFICARE A ENZIMELOR

Punerea în comun a unui procedeu de purificare pentru o anumită enzimă este rezultatul unor serii de experienţe preliminări în care sunt tatonate diferite metode de fracţionare. Evaluarea oportunităţii folosirii unei anumite metode de fracţionare se face utilizând două criterii : factorul de purificare şi randamentul procedeului. Factorul de purificare indică de câte ori activitatea specifică a enzimei luate în studiu, dintr-o anumită etapă este mai mare decât cea din extractul proteic total care a fost supus fracţionării. În tabelul de mai jos se prezintă un procedeu ipotetic de purificare de purificare a unei enzime şi modalitatea de calcul a randamentului şi factorului de purificare după fiecare etapă.

Un procedeu ipotetic de purificare a unei enzime

Etape de purificare

Volum(ml)

Proteină(mg/ml)

Activitatea(U/ml)

Activitatea specifică(U/mg

proteină)

Factorul de

purificare

Randamentul(%)

Extractul proteic total

200 12,4 124 10 1 100

Precipitare izoelectrică

200 8,4 200 23,8 23,8 -

Precipitare cu sulfat de amoniu

80 6,0 240 40 4 77,4

Gel cromatografie

20 1,0 480 480 48 38,7

Cromatografie pe DEAE-

5 0,5 790 1580 158 16

10

celuloză

II.3. Purificarea lactat dehidrogenazei

Principiul metodeiPrepararea lactat dehidrogenazei din drojdia de bere se realizează prin absorbţii

fracţionale pe geluri de alumină şi fosfat de calciu.Reactivi şi soluţii necesare:

1. Autolizat de drojdie ( se încălzesc 650 g drojdie prospătă la 37C, în prezenţa a 40 ml toluen; se incubează o oră la 37C, sub agitare ocazională; se adaugă 30ml apă, se incubează din nou 45 minute la 37C după care se adaugă 650ml apă, ajustându-se pH la 7,5-8,0 cu KOH 2 N; după ce suspensia este lasată să stea 48 ore la temperatura camerei, se centrifugheză la 8000-10.000g, păstrându-se supernantantul);

2. Gel de alumină C;3. Gel de fosfat de calciu,4. Soluţie tampon K2HPO4

-KH2PO4 66mM, pH 7;5. Soluţie tampon 4 conţinând (NH4)2 SO4 10%;6. Reactivi pentru dozarea activităţii lactat dehidrogenazei;7. Reactivi pentru dozarea proteinelor prin metoda spectrofotometrică.

Modul de lucru. 75ml autolizat de drojdie sunt trataţi cu 24ml gel de alumină C . Se amestecă timp de 15 minute preparatul proteic cu gelul după care urmează o centrifugare la 8000g/15minute. Se dozează concentraţia proteică în autolizat şi în supernatant. De asemenea se determină activitatea lactat dehidrogenazei în cele două preparate. Se constată că pe gel au fost absorbite proteinele inactive din punct de vedere catalitic, iar în supernatant se regăseşte 95% din activitatea iniţială.

La 81ml supernatant se adaugă 25ml gel fosfat de calciu, se omogenizează cu ajutorul unei baghete de sticlă 15 minute, după care se centrifugheză la 8000g/15 minute. În supernatant se dozează concentraţia proteică şi activitatea lactat dehidrogenazică. Se constantă că numai 5% din activitate a ramas în supernatant, deci 95% din enzimă se află absorbită pe gelul de fosfat de calciu.

Se spală sedimentul de gel de patru ori cu câte 10ml soluţie tampon 4. eluţia enzimei se realizează prin spălarea gelului de două ori cu 10ml şi odată cu 5ml soluţie 5. În cei 25ml se dozează concentraţia proteică (prin metoda spectrofotometrică şi activitatea lactat dehidrogenazică.

11

II.4. Procedeul de purificare al lactat dehidrogenazei (LDH) poate fi reprezentat schematic astfel:

Preparat proteic+

Gel de alumină C

centrigugare

sediment-1 supernatant-1se aruncă

+ gel fosfat de calciucentrifugare

sediment-2 supernatant-2(conţine adsorbit LDH) se aruncă

desorbţie

Preparat LDH

Datele experimentale obţinute în urma dozărilor de concentraţii proteice şi activităţii LDH sunt prezentate într-un tabel de tipul:

Etapa Volum ml Proteinămg/ml Activitatea LDH Factorul de purificareU/ml U/ml

Autolizat . . . . . . . . . .Supernatant-1 . . . . . . . . . .Preparat LDH . . . . . . . . . .

12

III. PROCEDEE DE SEPARARE A ENZIMELOR

Procedeele de separare utilizate în tehnologiile de biosinteză se pot clasifica în două grupe principale:

procedee de separare a fazei solide (masă microbiană), care se folosesc apoi ca atare sau se prelucrează pentru separarea produselor utile intracelulare;procedee de separare a antibioticelor, enzimelor, polizaharidelor microbiene etc. din soluţia apoasă.

Alegerea procedeului de separare a fazei solide se face în funcţie de proprietăţile fizice, chimice şi biologice ale mediului, precum şi de cantitatea de mediu care trebuie prelucrată. Pentru separarea masei microbiene se utilizează filtrarea, realizabilă prin centrifugare sau cu ajutorul filtrelor rotative, cu sau fără modificarea proprietăţilor reologice ale suspensiei de biomasă, cu sau fără adaos de substanţe filtrante.

În ultimul timp, au fost dezvoltate procedee care realizează separarea biomasei simultan cu extracţia produselor extracelulare.

În cazul în care produsele de metabolism (primar sau secundar) şi enzimele sunt localizate intracelular, biomasa separată se usucă, se macină, prin diferite procedee, în scopul distrugerii membranei celulare, după care se supun extracţiei cu solvenţi.

Separarea după îndepărtarea fazei solide, constituie o problemă dificilă, datorită labilităţii structurale a produselor biosintetizate. Pentru a se putea alege cel mai adecvat procedeu, este necesară cunoaşterea proprietăţilor fizico-chimice ale produsului care urmează a fi separat din soluţia apoasă, ca şi comportarea lui în anumite condiţii de mediu ambiant.

Principalele proprietăţi care se impun a fi cunoscute sunt:1. solubilitatea:

- în apă şi soluţii diluate de săruri;- în solvenţi polari (metanol, acetonă, butanol);- în solvenţi slab polari (cloroform, hidrocarburi);

2. stabilitatea în soluţie:- domeniul optim de pH;- efectul temperaturii;- efectul soluţiilor-tampon;- efectul solvenţilor organici;- efectul liofilizării;

3. stabilitatea în stare solidă:- efectul temperaturii;- efectul oxigenului şi al umidităţii;

4. principalele proprietăţi fizice si chimice în soluţie:- dializabilitatea prin membrane;- adsorbţia pe suporturi solide;- migrarea în câmp electric funcţie de valoarea pH-ului;- sedimentarea în ultracentrifugare;- stabilitatea la acţiunea diverselor enzime;

13

- stabilitatea la acţiunea unor agenţi chimici.;Pentru separarea produselor utile din faza lichidă se pot aplica următoarele

tehnici:• extracţia fizică cu solvenţi organici;• extracţia reactivă în solvenţi organici cu diferiţi extractanţi;• extracţia cu fluide supercritice;• extracţia în sisteme apoase bifazice;• sorbţia pe schimbători de ioni;• distilarea;• cromatografia;• separarea şi concentrarea prin tehnici membranare (ultrafiltrare, osmoză inversă,

electrodializa);• complexarea produsului biosintetizat cu reactivi specifici, distrugerea

complexului şi extracţia cu solvenţi;• precipitarea etc.În extracţia fizică direct din soluţie sau după eliberarea din complex, este necesar

ca produsul să treacă prefenţial în solvent, respectiv valoarea coeficientului de repartiţie K (definit ca raportul concentraţiei produsului din solvent şi concentraţia sa în faza apoasă după stabilirea echilibrului dintre faze trebuie să fie cât mai mare, pentru a favoriza grade de extracţie ridicate şi un consum cât mai redus de solvent. Uneori, pentru mărirea coeficientului repartiţie se apelează la o serie de metode de reducere a solubilităţii produsului în faza apoasă, cum ar fi adăugarea unor săruri.

În ultimii ani se studiază din ce în ce mai intens utilizarea extracţiei reactive, procedeu în care solubilizarea produselor de biosinteză într-un solvent organic se realizează pe baza unei reacţii chimice cu un agent de extracţie (denumit şi extractant, agent purtător). Extractanţii sunt compuşi organici cu structuri voluminoase, solubili, de preferinţă, în faza organică, capabili să reacţioneze cu produsul util şi să formeze compuşi solubili numai în faza organică. Performanţele extracţiei reactive, comparativ cu cea fizică, sunt superioare ca rezultat al participării simultane a celor două tipuri de extracţie, fizică şi reactivă la realizarea separării.

Utilizarea extracţiei cu fluide supercritice permite, pe de o parte, evitarea degradării produselor extrase, datorită condiţiilor termice blânde de operare, iar pe de altă parte, oferă eficienţă sporită, comparativ cu alte procedee de separare. Fluidele supercritice prezintă avantajul îmbinării puterii de solubilizare specifice lichidelor cu capacitatea de transport a gazelor.

Pentru separarea, în special, a moleculelor proteice, au fost propuse sisteme de extracţie bifazice apoase, constituite din amestecuri de două soluţii apoase ale unor polimeri diferiţi sau dintre o soluţie apoasă a unui polimer şi a unei sări, care, pentru anumite valori ale concentraţiei componenţilor, devin două faze distincte. Prin modificarea concentraţiei componenţilor sau a valorii acestor parametri (pH, concentraţie electrolit, temperatură), sunt posibile separări selective din amestecuri a produselor biosintetizate, cu conservarea caracteristicilor acestora.

14

III.1. SEPARAREA ELECTROFORETICĂ A ENZIMELOR

Metodologia enzimologică şi-a îmbunătăţit arsenalul cu o serie de tehnici de punere în evidenţă sau dozare cantitativă a activităţilor enzimatice în preparatele proteice supuse separărilor electroforetice.Capacitatea de migrare în câmp electric a proteinelor este funcţie de sarcina globală şi dimensiunile moleculelor.

Astfel mobilitatea electroforetică este dată de relaţia:

unde este sarcina particulei;d este distanţa între stratul dublu electric;r este raza particulei; este vâscozitatea soluţiei;

Prin urmare mobilitatea va creşte cu cât diametrul moleculei este mai mic astfel încât substanţele cu mase moleculare mici pot parăsi suportul solid în care se face separarea electroforetică înainte de terminarea experimentului. Moleculele asimetrice vor migra mai greu decât cele cu formă sferică, dacă acestea au aceiaşi masă moleculară şi aproximativ aceeaşi încărcare electrică.

Soluţia tampon în care se efectuează migrarea electroforetică influenţează valoarea mobilităţii electroforetice prin tăria ionică a componentelor, prin vâscozitatea şi proprietăţile lor fizico-chimice. Astfel prin creşterea tăriei ionice a soluţiei creşte cantitatea de curent transportată de speciile ionice prezente în tampon, scade valoarea mobilităţilor electroforetice iar benzile sunt mai clar delimitate. Soluţiile tampon utilizate în separările electroforetice trebuie să fie constituite din substanţe chimice care reacţionează chimic cu componentele de separat.

Dacă suportul solid unde se realizează separarea efectivă conţine grupări ionizate, acestea dau naştere unui curent electroosmotic.

Puterea de rezoluţie a separării electroforetice este proporţională cu tăria intensităţii curentului electric aplicat la electrozi şi cu timpul cât durează experimentul. Cu toate acestea creşterea tensiunii aplicate este limitată de faptul că se degajă căldura care poate provoca denaturarea enzimelor. Efectul termodenaturării enzimelor se manifestă prin alungirea spoturilor rezultate după separarea electroforetică.

Separarea enzimelor dintr-un amestec, în câmp electric, poate fi realizată pe benzi de hârtie Whatman pe benzi de acetat de celuloză, pe gel de amidon, pe gel de agar sau agaroză în gel de poliacrilamidă (plăci sau procedeul disc electroforezei) etc. Suporturile sunt preparate în soluţii tampon de obicei cu tării ionice mai mic decât cele care umple tancul electroforetic.

Probele proteice de separat se aplică direct pe suport sau se înglobează în masa gelului. Separarea efectivă se realizează aplicând un curent de aproximativ 300V şi 100mA, timpul cât durează experimentul este funcţie de mărimea plăcilor de electroforeză şi de structura substanţelor de separat ( de la 15 minute la 5 ore). După terminarea migrării

15

electroforetice plăcile sunt spălate cu apă distilată pentru a îndepărta suluţia tampon şi se scufundă în mediul de reacţie pentru ca benzile electroforetice care catalizează enzima luată în studiu să acţioneze corespunzător. Urmează o reacţie de developare, în urma căruia se vizualizează direct pe suport activitatea catalitică când se obţin aşa numitele zimograme. În cazul particular al enzimelor care acţionează asupra unor substrate cu structură macromoleculară, acestea din urmă pot fi înglobate în suportul solid în care se realizează separarea electroforetică. De exemplu, dacă mediul de electroforeză este transparent razelor ultraviolete, activitatea enzimatică a NAD (P) –dehidrogenazelor poate fi măsurată spectrofotometric la 340 nm sau fluorimetric la 340 nm (emisie 430-460nm) cu ajutorul unui densimetru.

Majoritatea tehnicilor de evidenţiere a enzimelor au apelat la metode histochimice care folosesc încorporarea în sistem a unor produşi insolubili.

Astfel citocrom oxidaza, care catalizează o reacţie de transfer a electronilor de la citocromul c la O2 poate fi recunoscută prin reducerea citocromului c cu dimetil-p-fenilendiamina, ca donor de electroni; p-fenilendiamină oxidată reacţionează cu -naftolul, când în urma unor reacţii de oxidare şi cuplare se formează un compus indofenolic, colorat în albastru (reacţia Nadi).

Izoenzimele pot fi separate prin electroforeză orizontală în gel de agar (0,9%) utilizând tampon veronal pH 8,4, =0,1. În gelul în care urmează să se execute separarea electroforetică se adaugă albumină pentru a proteja LDH5 contra denaturării şi EDTA pentru a favoriza dezvoltarea culorii la izoenzime LDH4 şi LDH5. Electroforeza este realizată timp de 15 minute la o intensitate a curentului de 20V/cm. Imediat după terminarea electroforezei se acoperă gelul cu al doilea strat de agar care conţine L-lactat, NAD şi sarea de tetrazoliu pentru a vizualiza reducerea enzimatică a NAD. Acest gel poartă denumirea de substrat se prepară prin amestecarea unei soluţii 1,5 % agar în tampon veronal diluat 1:1 cu apă distilată cu soluţie substrat (200mM DL-lactat, 0,18 mM fenazin metosulfat, 2,9 mM NAD+ şi 1 mM INT). pH optim de transformare a lactatului în piruvat este de 8,3-8,9. Plăcile acoperite cu stratul dublu de agar sunt incubate 120 minute la 37C, într+un termostat la întuneric. Benzile proteice cu activitate LDH sunt colorate în purpuriu. Evaluarea optică se face fie în gel umed, fie pe film uscat, obţinut prin imersarea plăcilor 3 ore de acid acetic, soluţie 0,34N, şi prin uscare peste noapte pe o hârtie de filtru. Densitometrarea se face la 546 nm.

Principala sursă de erori o reprezintă colorarea nespecifică a lipoproteinelor - fenomen ce poate fi evitat prin prelungirea timpului afectat electroforezei la 60 minute, când lipoproteinele se separă de izoenzime LDH. Efectul falselor dehidrogenaze apare în special când cercetările sunt efectuate pe extracte tisulare concentrate.

Alte suporturi pentru separarea electroforetică a LDH pot fi benzile de acetat de celuloză gelurile de amidon şi policrilamidă.

III.2. Metode de separare a enzimelor

În extractele proteice apoase coexistă împreună cu enzima pe care dorim s-o separăm şi s-o purificăm alte enzime, proteine cu mase moleculare şi încărcări electrice diferite, acizi nucleici şi nucleotide, polizaharide şi electroliţi etc.

Aceste substanţe contaminante pot fi îndepărtate treptat din extractul proteic folosind diverse procedee, ca de exemplu: dializa, termoprecipitarea, precipitarea la pH

16

izoelectric, fracţionarea cu solvenţi organici şi săruri neutre, separarea cromatografică cu adsorbanţi, site moleculare, schimbători de ioni etc.

III.3. DIALIZA

Acest procedeu de separare se aplică numai enzimelor formate dintr-un singur component proteic sau celor formate din două componente strâns legate una de cealaltă. Aplicarea dializei unui preparat enzimatic format dintr-o parte proteică şi dintr-o parte prostetică (coenzima sau cofactorul metalic) poate conduce la inactivarea lui datorită faptului că acest cofactor legat labil de proteină dializează în mediul exterior. Dializa reprezintă o metodă de îndepărtare din extractul proteic a moleculelor cu mase moleculare mici.

III.4. Termoprecipitarea enzimelor

Acest procedeu de fracţionare se aplică numai în cazul purificării unor enzime termostabile. Într-un domeniu relativ restrâns al temperaturilor, 0C-40C majoritatea enzimelor prezintă o creştere a solubilităţii cu temperatura. Se realizează încălzirea soluţiei la 50-60C o perioadă definită de timp (10-15 minute) când proteinele contaminante enzimei termostabile precipită şi pot fi îndepărtate prin centrifugare. Este posibil a realiza termoprecipitarea fracţionată a proteinelor pentru purificarea unei anumite enzime în prezenţa substratului ei care de regulă manifestă un efect termoprotector de stabilizare a structurii tridimensionale a acesteia.Astfel serin transhidroximetilaza din ficatul puiului de găină a fost purificată de trei ori prin încălzirea preparatului la 70C timp de 2 minute în prezenţa serinei, 0,017 M, care ulterior este îndepărtată prin dializă. În absenţa serinei, enzima este denaturată termic.

III.5. Precipitarea fracţionată la pH izoelectric a enzimelor

Procedeul se bazează pe comportarea acido-bazică în soluţie a proteinelor şi enzimelor. Proteinele globulare, în soluţie îşi orientează spre exterior grupările ionizabile formând o suprafaţă polară, hidrofilă şi spre interior grupările nepolare formând un miez hidrofob. Proteinele native diferă prin structura lor primară şi prin conformaţia lor în soluţie astfel că prezintă un număr variabil de grupări ionizabile şi o distribuţie diversă a sarcililor electrice la suprafaţa globului proteic. Proteinele si peptidele ca şi aminoacizii au valori caracteristice ale pH izoelectrice, când molecula nu posedă o sarcină globală suma sarcinilor pozitive este egală cu suma sarcinilor negative.

17

IV. PROCEDEE DE DETERMINARE A CONCENTRAŢIEI ENZIMELOR

Determinarea concentraţiei enzimelor prezintă interes :- la determinarea concentraţiilor lor în medii naturale : ţesuturi, organe, celule,

microorganisme;- în operaţiile de izolare a enzimelor în stare pură, când prin determinarea

concentraţiei se urmăreşte gradul de purificare şi randamentul pentru fiecare fază;- în standardizarea preparatelor enzimatice destinate scopurilor practice şi pentru

controlul calităţii acestor preparate.Determinarea concentraţiei unei enzime nu se poate face direct prin determinarea

substanţei în sine cu ajutorul unei reacţii stoechiometrice.Acest lucru este valabil atât pentru enzimele care nu au fost obţinute încă în stare pură, deci care nu sunt bine caracterizate fizico-chimic şi nu li se cunoşte greutatea moleculară, cât şi pentru enzimele care au fost obţinute în stare pură şi sunt bine caracterizate.Explicaţia acestui fapt este următoarea: enzimele sunt substanţe proteice şi reacţiile pe care le pot da sunt reacţiile grupelor reactive din resturile de aminoacizi care intră în alcătuirea lor. Aceste reacţii nu sunt specifice, deoarece sunt date şi de substanţeţe proteice străine de enzimă care apar alături de ea în mediile naturale şi în preparatele impure.

În cazul enzimelor care conţin grupe prostetice cu proprietăţi fizico-chimice caracteristice, o estimare a concentraţiei enzimei se poate face prin dozarea grupei prostetice. De exemplu concentraţia enzimelor hemoproteice (citocromi, catalaze şi peroxidaze) se poate determina prin spectrele de absorbţie ale grupei porfirinice.

Determinarea concentraţiilor enzimei se face indirect prin măsurarea activităţii lor. Concentraţia unei enzime se poate determina prin măsurarea activităţii numai dacă reacţia enzimatică se desfăşoară în anumite condiţii care permit stabilirea unei relaţii matematice între activitate şi concentraţie. Cinetica reacţiilor enzimatice determină concentraţia enzimelor.

IV.1. Modul de exprimare a concentraţiei enzimelor

Concentraţia enzimelor se exprimă în unităţi de activitate stabilită arbitrar şi care diferă de la enzimă la enzimă. În general definiţia unităţii se poate da în felul următor: o unitate corespunde acelei cantităţi de enzimă care într-un timp dat, în condiţii bine determinate de pH, temperatură tampon etc. poate să transforme o cantitate determinată de substrat. De exemplu o Cantitate urează corespunde acelei cantităţi de enzimă care în 5 minute la pH=7 şi temperatura de 20C eliberează din uree 1mg azot amoniacal sau un alt exemplu: o unitate lipază corespunde cantităţii de enzimă care în timp de o oră la 30 C şi un pH iniţial de 8,9, în prezenţă de 15mg albumină de ou şi 10mg CaCl 2, hidrolizează 2,5 g ulei de măsline în proporţie de 24 %.

18

În cazul enzimelor obţinute în stare pură şi cu greutate moleculară cunoscută, activitatea se poate exprima după propunerea lui Warburg prin activitatea molară dată de raportul:

Acest raport se numeşte şi numărul de transformare sau de transfer.Numărul de transfer sau activitatea molară arată câţi moli de substrat sunt transformaţi de la 1 mol enzimă în timp de 1 min. În tabelul de mai jos se prezintă câteva exemple de numere de transfer.

IV.2. Numerele de transfer a câtorva preparate enzimatice de înaltă puritate

Enzima Substratul pH Temperatură C Numărul de transfer

Colinesteraza din ser

Acetilcolinabutirilcolina

8,5 30 90.000

Acetilcolinesteraza din Electrophorus

electricus

acetilcolina 7,5 30 210.000

Ureeaza din Canavalia ensiformis

ureea 7,0 25 18000.000

Pepsina din stomacul bovinelor

Caseina 2,5 20 460.000

-Amilaza din malţ

Amidon 4,6 20 1000

Catalaza din ficatul de cal

H2O2 6,8 30 19.000

Enzima cu aceeaşi specificitate din

Micrococus lysodeikticus

H2O2 6,8 0 5000.000

Piruvat decarboxilaza din

drojdie

Acid piruvic 6,15 20 850

Activitatea preparatelor enzimatice se exprimă în unităţi raportate la substanţa uscată (unităţi/substanţă uscată).deoarece determinarea substanţei uscate uneori este greoaie s-a propus raportarea activităţii la mărimi care se pot determina mai precis şi care stau în

19

strânsă legătură cu gradul de puritate al preparatelor enzimatice. Astfel se obişnuieşte să se raporteze activitatea la substanţa organică a preparatului la azotul total determinat la proteina precipitabilă cu acid triclororacetic şi la concentraţia de tirozină din preparat.

Determinarea substanţei organice se poate face calorimetric prin oxidare în mediu acid cu soluţie de bicromat de potasiu.

Calcularea unităţilor. La reacţiile de ordin zero viteza de transformare a substratului este constantă V=k3[A]=k3[En] = constant şi nu este influenţată de concentraţia substratului, în schimb este proporţională cu concentraţia enzimei.

Activitatea preparatului în unităţi se află făcând raportul:

în care V(determinat) este viteza de transformare corespunzătoare concentraţiei enzimei din preparat şi V (unitate) este viteza de transformare corespunzătoare concentraţiei de enzimă care dă unitatea.

În cazul reacţiilor monomoleculare există proporţionalitatea între constanta vitezei de reacţie şi cantitatea de enzimă. Acest lucru se poate vedea din relaţia:

este constanta vitezei de reacţie

notată cu K iar

deci: ,

Din ultima relaţie se vede că între k şi [En]t există proporţionalitatea.Activitatea preparatului în unităţi este dată de raportul:

în care k (determinat) –constanta vitezei de reacţie monomoleculară corespunzătoare concentraţiei enzimei din preparat, iar k (unitate) –constanta vitezei de reacţie monomoleculare corespunzătoare concentraţiei enzimei care dă unitatea.

20

După cum s-a arătat, k este dat de relaţia:

La determinarea activităţii unei enzime trebuie păstrate riguros condiţiile de lucru prevăzute de metoda de determinare: temperatură, pH-ul, natura tamponului care asigură pH-ul şi alţi factori pe care îi prevede metoda. La stabilirea unei metode de determinare a activităţii unei enzime se are grija ca tamponul ales pentru asigurarea pH-ului optim, să nu influenţieze prin componentele sale activitatea enzimei în cazul reacţiilor enzimatice lente, care trebuie urmărite timp mai îndelungat, se produce contaminarea mediului de reacţie cu microorganisme care pot să descompună atât enzima cât şi substratul. Pentru prevenirea contaminării se folosesc diferiţi atiseptici, astfel aleşi încât să nu influenţeze activitatea enzimei. Influenţa negativă a unui antiseptic asupra unei enzime se stabileşte separat pentru fiecare enzimă în parte. Antisepticii cei mai mult folosiţi în cazul reacţiilor enzimatice sunt: toluenul, timolul, cloroformul, fenolul, iodoformul şi fluorura de sodiu.

21

V. BIBLIOGRAFIE

1. D. INTERNET ; www.IMAC.ro 2. Dumitriu. Biochimie.1980.

3. Dumitriu Florea. Introducere în enzimologie.1981. 4. Dumitriu I, D. Iordăchescu, S. Niculescu – Introducere in biochimie.1974. 5. D. Iordăchescu.Biochimie. 1980. 6. D.Iordăchescu, S.Niculescu, I.F. Dumitriu – Cercetări în biochimie. 1975.

7. I.F. Dumitriu, D. Iordăchescu, S. Niculescu, G. Şerban –Studii şi cercetări în biochimie. 1970.

8. I.F. Dumitriu, D. Iordăchescu, I. Ceauşescu-Rev. Roum. Biochimie. 1975. 9. Google.ro. Procedee de purificare a enzimelor. 10. I.F. Dumitriu, I.Ceauşescu, D. Popescu-Rev.Roum. Biochimie. 1978. 11. H. Barnett – Biochimie.1962

22