Relatore

Prof. Luciana Avigliano

Candidata

Laura Masciullo

EFFETTI APOPTOTICI DI ORIGANUM VULGARE IN CELLULE

TUMORALI DEL COLON

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA “TOR VERGATA”

CANCRO DEL COLON

FATTORI GENETICI

DIETA MEDITERRANEA: BASSO RISCHIOElevato consumo ortaggi, frutta, spezie, legumi, cereali

DIETA OCCIDENTALE: ALTO RISCHIObasso consumo di prodotti di origine vegetale

FATTORI AMBIENTALI

L’origano è ampiamente utilizzato in tutti i paesi del bacino

mediterraneo

Effetti chemiopreventivi dell’Origanum vulgare:

SCOPO DELLO STUDIO

proliferazione cellulare

stato redox

apoptosi

MODELLO SPERIMENTALE:CELLULE UMANE Cancerose: cellule di adenocarcinoma del colon (Caco2) Normali: colture primarie di fibroblasti e colonociti (FHC)

FOGLIE E FIORI ESSICCATI FRANTUMATI FINEMENTE

ESTRAZIONE CON ETANOLO 70% PER 24 ORE A 4°C, AL BUIO

FILTRAZIONE SU CARTA WHATMAN NO. 1

CENTRIFUGAZIONE A 2500 RPM PER 20 MIN

CONCENTRAZIONE DEL SUPERNATANTE SOTTO FLUSSO D’AZOTO

ESTRATTO DI ORIGANO LIOFILIZZATO

PREPARAZIONE DELL’ESTRATTO DI ORIGANO

Resa: 20 % (2.5 gr di origano essiccato = 0.5 gr estratto secco)

Capacità Antiossidante Totale: 2.4 ± 0.2 mmol di Trolox equivalenti/g di estratto secco

Caratterizzazione dell’estratto origano

Contenuto Totale Fenolico (Metodo Colorimetrico Folin-Ciocalteu):

150 mg di acido gallico equivalenti/gr di estratto secco

Composti fenoliciflavonoidi acidi fenolici

lignani monoterpeni

flavoni

flavonoli

flavanoni

antocianine

flavanoli

isoflavoni

stilbeni

ANALISI COMPOSTI FENOLICI (HPLC con rivelatore a fotodiodi = 310 nm)

0.00

100.00

200.00

300.00

400.00

500.00

600.00

700.00

800.00

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

minuti

Acido caffeico

Acido rosmarinico

Acido ferulico Daidzeina

Esperetina

Composti fenolici identificati mediante analisi cromatografica (HPLC-DAD)

FENOLI CLASSE TEMPO DI RITENZIONE

(min)

CONCENTRAZIONE(mg/g di estratto secco)

% FENOLI

Ac. rosmarinico Acidi fenolici 26.7 55.20±6.00 31.80

Naringenina Flavononi 30.0 34.32±1.00 19.82

Esperetina Flavononi 34.1 2.35±0.11 1.36

Ac. cumarico Acidi fenolici 21.0 1.40±0.12 0.81

Carvacrolo Terpeni 42.0 1.30±0.09 0.75

Ac. gallico Acidi fenolici 2.1 0.61±0.06 0.34

Acido caffeico Acidi fenolici 15.0 0.81±0.08 0.46

Ac.clorogenico Acidi fenolici 13.1 0.72±0.08 0.41

(+) Catechina Flavanoli 11.2 0.21±0.02 0.11

Diosmetina Flavoni 40.5 0.33±0.03 0.20

Ac.protocatecuico Acidi fenolici 6.8 0.32±0.02 0.17

Ac. ferulico Acidi fenolici 24.3 0.15±0.01 0.08

Daidzeina Isoflavoni 31.2 0.07±0.007 0.04

Altri fenoli --- --- 71.24±10.0 41.18

FENOLI TOTALI 173±12.00 100

02040

60

80100

12 24 48 72

0

2040

60

80

100

12 24 48 72

% del controllo

% del controllo

#

##

#**

# #*

300 g/ml

500 g/ml

ore

ore

120

120

L’origano esercita differenti effetti sulle cellule normali e cancerose

FIBROBLASTIFHC

CaCo2

* p<0,05 # p<0,001

0

70

140

210

280

350

Eve

nti

100 101 102 103 104

FL2-H

0

70

140

210

280

350

Eve

nti

100 101 102 103 104

FL2-H

origano

Ipodiploide 24% G0/G1 31%G2/M 30%S 39%

Ctrl

Ipodiploide 10% G0/G1 49%G2/M 14%S 37%

L’origano promuove l’arresto della crescita nella fase G2 prevenendo

l’entrata in mitosi e inducendo morte cellulare

Analisi al citofluorimetro

L’origano induce sia la necrosi sia l’apoptosi

Colorazione con ioduro di propidio ed analisi al FACS

Normale

Apoptosi

Necrosi

Normale

Apoptosi

Necrosi

origanoCtrl

13 %

12 % 18 %

30 %

L’origano attiva le caspasi esecutrici

Ctrl origano

PARP (89 kDa)

caspasi 3 (17 kDa)

PARP0

2

1

3

Vol

te s

u co

ntro

llo

Casp-3

Ctrl origano

* *

* p<0,001

Via recettoriale

Via mitocondriale

pro-apoptotico

anti-apoptotico

tubulina

caspasi 8 (18 kDa)

APAF-1 (130 kDa)

Bak (25 kDa)

pro-caspasi 9 (47 kDa)

Bcl-xL (30 kDa)

L’origano attiva la via intrinseca e la via estrinseca dell’apoptosi

Bcl-xLBak

#

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0

2

4

1

3

5#

#

*

Vol

te s

u co

ntro

llo

Casp-8 APAF-1 Pro casp-9

Ctrlorigano

*

* p<0,05 # p<0,001

L’origano promuove una perturbazione nel potenziale di

membrana mitocondrialeColorazione con JC-1 ed analisi al FACS

origanoCtrl

Ctrl origano

Flu

ore

scen

za (

un

ità

arb

itra

rie)

L’origano riduce il glutatione totale ed incrementa il GSSG

Glutatione totale Glutatione ossidato

Livelli di ROSCapacità antiossidante totale

Ctrl origano

Ctrl origano

Ctrl origano

Glu

tati

on

e to

tale

(nm

oli/

mg

pro

tein

a)

nm

oli

Tro

lox

eq./m

g p

rote

ina

GS

SG

/GS

H x

100

Origano 36%Ctrl 32%

L’estratto di origano promuove:

Arresto della crescita e morte cellulare

Alterazione dello stato

redox

Attivazione delle vie apoptotiche

Tali effetti non sono ascrivibili ad un singolo componente, ma all’alimento “in toto”

I colonociti sono le cellule che “in vivo” entrano a direttocontatto con la spezia

La diffusione dell’origano potrebbe essere correlata a questi effetti benefici

Gli effetti anti-tumorali si ottengono con quantità di origano raggiungibili con la dieta Mediterranea

CONCLUSIONI

100 mg

Gli effetti protettivi dipendono dall’estratto “in toto” e non dai singoli

componenti

volte su controllo

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

CTRL

A. ROSMARINICO

A. CAFFEICO

A. CLOROGENICO

A. COUMARICO

A.GALLICO

CARVACROLO

(+) CATECHINA

A. PROTOCATECUICO

DAIDZEINA

A. FERULICO

ESPERETINA

NARINGENINA

DIOSMETINA

volte su controllo

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

CTRL ORI 500 MIX 13

**

* p<0,001