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REPARACIÓN DE LAS LESIONES GENÓMICAS INDUCIDAS POR LOS VENENOS DE LA

TOPOISOMERASA II

M. de Campos Nebel, M.E. Elguero, I. Larripa, M. González-Cid.

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Depto. de Genética, I.I.HEMA. Academia Nacional de Medicina.

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Topoisomerasa II

dos isoformas, α y β, codificadas por diferentes genes

enzima dependiente de ATP,

cataliza cambios en la topología del ADN,

y β p g

expresión fuertemente regulada durante el ciclo celular,

rol en la condensación y separación cromosómica,

participa en la organización de la cromatina y en transcripciónparticipa en la organización de la cromatina y en transcripción,

blanco de acción de muchos agentes quimioterapéuticos.

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Venenos de Topoisomerasa II

Idarubicina EtopósidoIdarubicina Etopósido

Blanco principal para inducir daño

Droga Blanco daño al ADN

Idarubicina Topoisomerasa II α DSB

Síntesis de ADN DSBSíntesis de ADN DSB

Topoisomerasa I (in vitro) SSB

Etopósido Topoisomerasa II α DSB

Topoisomerasa II β DSB

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Envenenamiento de la Topoisomerasa IIDroga

Complejo ternario

(ADN-enzima-droga)

DSB persistente

Etop

ósid

o2h

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H2AX

Reparación de las DSB generadas

γH2AX

Procesado de extremos

Reparación por HR Reparación por c-NHEJ

pS2056DNA-PKcsFocos Rad51

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Idarubicina:• primera y segunda línea de tratamiento en leucemia mieloide aguda,

Venenos de Topoisomerasa II

• segunda línea en leucemia linfoblástica aguda,

• cáncer de mama,

• leucemia mieloide crónica y linfoma No-Hodgkin.

Et ó idEtopósido:• primera línea de tratamiento de tumores testiculares y carcinoma de pulmón de células pequeñas,

• tratamiento de linfomas de Hodgkin y No-Hodgkin y leucemia mieloide aguda,

• tratamiento de varios carcinomas, hepatoblastoma, leucemia linfoblástica aguda, linfomas de células T cutáneos, mieloma múltiple, neuroblastoma, sarcomas de tejidos blandos, tumores cerebrales primarios, tumores trofoblásticos gestacionales, y carcinomas de pulmón de células no pequeñas.

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Tumores relacionados a la terapia

• Frecuentes (1-15% de los pacientes, dependiendo de la terapia).

A t l T i IIAgentes que envenenan a la Topoisomerasa II:• 5-15% de los pacientes con neoplasias desarrollan LMA-t luego de un corto período de latencia.

LMA:- 70% presentan translocacionesque involucran al gen MLL.

Nat. Rev. Cancer (2005), 5: 943-55

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OBJETIVO

- Evaluar el rol de las vías c-NHEJ y HR en impedir lapropagación de inestabilidad genómica inducida por ETO eIDA en fibroblastos humanos normales y en líneas celularesIDA en fibroblastos humanos normales y en líneas celularesde Hámster chino proficientes y deficientes en estosmecanismos.

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Esquema experimental (I)

Fibroblastos humanos diploides (PTP)

t=0 2h 26h

52h38h 50h 74h28h

Evaluación de muerte celular por Anexina V (Cit Flujo)-Evaluación de muerte celular por Anexina V (Cit. Flujo)

Cultivos sincronizados -Focos de reparación por HR (Rad51) y NHEJ (pS2056DNA-PKcs)

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Fibroblastos de Hámster chino:

Esquema experimental (II)

-CHO9 (wt) y XR-C1 (DNA-PKcsmut)-V79 (wt) y V-C8 (BRCA2mut)

Cultivos sincronizados:

Cultivos asincrónicos: Daño residual (γH2AX), aberraciones cromosómicas y MN

Tratamiento c/ IDA o ETO

InterfaseG1 S G2 M

t=0

Análisis de aberraciones cromosómicas

Formación de MN

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Efecto de ETO e IDA sobre la inducción de muerte celular

ETO

2h

EID

A 2h

PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.

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Cinética de reparación de DSB

PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.20 µm

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Reparación por c-NHEJ

PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.

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Reparación por HR

PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.

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C-NHEJ y HR actúan con especificidad de fase en el ciclo celular

PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.

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Eventos de reparación residual por c-NHEJ frente al daño inducido por los venenos de Topoisomerase II

ETO: MN= 5-17% pS2056+ ; Ap=14-56% pS2056+

IDA: MN=12 28% pS2056+ ; Ap=40 63% pS2056+

Ampliación:

IDA: MN=12-28% pS2056+ ; Ap=40-63% pS2056+ ET

O 3

8 h

PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.

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Daño remanente en células deficientes en c-NHEJ o HR

Cultivos asincrónicos:

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Cultivos sincronizados:

Aberraciones cromosómicas en primera mitosis

Cultivos sincronizados:

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Aberraciones cromosómicas inestables

XR-C1:

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Conclusiones

. c-NHEJ y HR actúan con especificidad de fase en el ciclo celular en respuesta al daño inducido por los venenos de Topoisomerasa II,

. Las actividades residuales de reparación por c-NHEJ mediadas por DNA-PKcs pueden contribuir a la generación de inestabilidad cromosómica,

.Tanto c-NHEJ como HR son importantes para impedir la propagación de inestabilidad genómica inducida por los venenos de Topoisomerasa II,

. Si bien alteraciones en c-NHEJ o HR resultan en frequenciast d d b i ó i i d id ETO IDA l

,

aumentadas de aberraciones cromosómicas inducidas por ETO e IDA, la vía c-NHEJ mediada por DNA-PKcs en S/G2 preserva la integridadcromosómica y promueve la progresión de células aberrantes.

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