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Bibliotecas Genómicas
Domínguez Hernández Mariana
Garza Jesús Erick Alejandro
Romero Cruz Víctor Adolfo
Rojas Estrada Anahí
IntroducciónHay diferentes tipos de bibliotecas de Fragmentos en los cuales hay :
Biblioteca de clonos
Biblioteca Restringida
Biblioteca de DNA complementario
Biblioteca Genómica
Bibliotecas Genómicas
• Colección de fragmentos de DNA que representan tanto todas las secuencias de un genoma los cuales son clonados en un vector que puede ser usado o mantenido establemente.
Aplicaciones Para una Biblioteca Genómica
Secuenciar un gen entero o una región de un cromosoma
Secuenciación de genomas Identificar promotores
http://www.qb.fcen.uba.ar/bm/2009%20%28ir%20a%20materias.qb.fcen.uba.ar%29/TE%D3RICO-PR%C1CTICO/Clase%204/Clase%20biblio%20genomica%202009.pdf
Construcción de Una biblioteca Genómica
DNA GenómicoCorte mecánico o Endonucleasas
Separación por Tamaño
Elección del vector
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ingenieria/2001832/lecciones/bibliotecas.html
Genotecas de DNA
Genoma del Fago
cDNA preparado por transcripción inversa de los mRNA
• Aislar todo el mRNA• Utilización de la transcriptasa inversa• Síntesis de DNA apartir de RNA• Metilación del cDNA• Clonación• Corte con enzimas de restricción
Sondas de Oligonucleótidos
Preparación de sondas especificas con marca radioactiva.
• Debe de tener longitud suficiente y tener especificidad.– Sondas degeneradas– Sondas basadas en EST exclusivo.
Sondas degeneradas
• Fig 7-19 Diseño de sondas de oligonucleótidos sobre la base de la secuencia proteica.
Sondas basadas en EST exclusivo
• Sonda basada en una secuencia parcial de aa determinada de una proteína aislada.
• Identifica un único oligonucleótido.• Secuencias parciales de cDNA de 200–400 pb.• En base a programas de computación que
aplican el código genético.• PCR.
Identificación, análisis y determinación de la secuencia de
DNA clonado
Aislación de una proteína
Aislar el gen que la codifica
Biblioteca Genómica λ completa hasta un millón de clones
Biblioteca cDNA debe contener clones suficientes de mRNA
Hibridación con sondas de DNA o RNA marcadas radioactivamente
Separacion Escision del vector recombinante con misma E..R
Identificar la secuencia
Prue
ba d
e H
ibrid
ació
n co
n m
b pa
ra la
de
tecc
ión
de Á
cido
s nu
clei
cos
Calentamiento en sol salina o por elevación de pH a 11
Si vuelve a neutralidad se forman de nuevo los enlaces Si se lleva a cabo la
reacción en un soporte la reacción es irreversible
Union de sonda a cada complementaria
Identificación de un clon especifico de una biblioteca de fago λ por hibridación con membrana con
una sonda radiactiva
Los viriones recombinantes λ presentes en un cultivo de E. coli se transfieren a una membrana
de nitrocelulosa.
Placas individuales
de fago
Placa maestra de placas de fago λ sobre un
cultivo de E. coli
Filtro de nitrocelulosa
Se reproduce sobre la
superficie de la membrana una
replica de la placa Petri que contiene gran cantidad de
clones λLa placa madre se refrigera para almacenar el conjunto
de clones λ
Replica de la caja de Petri sobre la superficie de la membrana de
nitrocelulosa
La membrana se incuba en una
solución alcalina que deteriora los viriones y
libera y desnaturaliza el
DNA encapsulado.
Se lisan los fagos y
desnaturaliza el DNA
DNA
La membrana se seca y a su superficie se fija el DNA recombinante. Por ultimo la membrana se incuba con una sonda con marca radiactiva en
condiciones de hibridación.
DNA monocatenario de fago fijado al filtro
La sonda no hibridada se
elimina por lavado
Sonda con marca
radiactiva
El filtro se somete a autorradografia. La
aparición de una mancha indica la
presencia de un clon recombinante λ que
contiene DNA complementario de
la sonda.
Las partículas de fago de una región
identificada de la placa maestra se
aíslan y se resiembra, entonces se pueden obtener aislamientos
puros del clon que contiene el DNA de
interes.
GRACIAS
