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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
Resistência a antibióticos carbapenêmicos em enterobactérias
mediada pela impermeabilidade de membrana externa
Camila Vieira Martins
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da Universidade de
São Paulo.
Orientador: Nilton Lincopan
São Paulo
2017
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, José Carlos e Magda, que durante toda minha vida me incentivaram
e apoiaram nos estudos. Agradeço por terem tornado possível esses últimos anos,
por terem vibrado com cada conquista minha na faculdade, e em especial, pelo amor
e carinho incondicional.
Às minhas irmãs e amigos, pelo carinho, amizade, ajuda e companheirismo durante
esses anos de graduação.
Aos colegas de laboratório, pela ajuda, apoio e ensino, de modo a tornar o ambiente
de trabalho um local agradável.
Aos funcionários da graduação da FCF, pela orientação e ajuda.
À Professora Dra. Elsa Mamizuka e à Dra. Mónica Pavez, pela oportunidade de
desenvolver esse projeto, pela paciência, atenção e pelos ensinamentos sempre
passados de forma dedicada.
Ao meu orientador, Professor Dr. Nilton Lincopan, que de maneira extremamente
atenciosa me ajudou na elaboração do presente projeto. Agradeço à dedicação e
disposição com que me passa seu conhecimento.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... 4
RESUMO .................................................................................................................... 5
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 6
1.1 Carbapenêmicos ..................................................................................................... 6
1.2 Mecanismos de resistência aos carbapenêmicos ......................................... 8
1.2.1 Impermeabilidade de membrana .................................................................... 8
1.2.2 Beta-lactamases .................................................................................................. 9
2 OBJETIVOS ...................................................................................................... 12
2.1 Objetivo geral......................................................................................................... 12
2.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 12
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 12
3.1 Isolados bacterianos ........................................................................................... 12
3.2 Condições de cultura........................................................................................... 13
3.3 Análises do perfil de porinas no grupo CR ................................................... 13
3.3.1 Extração de porinas da membrana externa ............................................... 13
3.3.2 Análise das porinas de membrana externa ............................................... 14
3.4 Análise fenotípica do grupo CS ........................................................................ 14
3.5 Indução da resistência por exposição ao imipenem .................................. 14
3.6 Concentração inibitória mínima (CIM) ............................................................ 15
3.6.1 CIM por diluição em ágar ................................................................................ 15
3.6.2 CIM por microdiluição em caldo ................................................................... 16
3.7 Análise dos resultados ....................................................................................... 16
4 RESULTADOS .................................................................................................. 16
4.1 Grupo CR ................................................................................................................ 16
4.2 Grupo CS................................................................................................................. 18
4.3 Caracterização fenotípica dos isolados após indução com antibiótico imipenem ........................................................................................................................... 18
5 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 20
5.1 A resistência aos carbapenêmicos em enterobactérias de importância clínica pode ser mediada por diferentes mecanismos que atuam em conjunto. ............................................................................................................................ 20
5.2 A deleção da porina de 36-kDa em enterobactérias pode estar associada a CIM do imipenem ≥ 0,5 ug/mL. ............................................................. 21
5.3 A exposição ao imipenem em enterobactérias sensíveis carregando ESBL ou AmpC pode induzir a deleção da porina de 36-kDa. ............................ 22
5.4 A redução da permeabilidade induzida por imipenem também afeta a susceptibilidade das enterobactérias ao meropenem e ertapenem. ................ 23
6 CONCLUSÃO .................................................................................................... 24
7 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................. 26
8 ANEXO .............................................................................................................. 30
LISTA DE ABREVIATURAS
AmpC Beta-lactamase do tipo AmpC
BKC-1 Brazilian Klebsiella carbapenemase-1
CIM Concentração inibitória mínima
CLSI Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais
EDTA Ácido etilenodiamino tetracético
ESBL Beta-lactamase de espectro ampliado
kDa Quilodalton
KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase
LB Caldo Luria Bertani
MH Caldo Mueller Hinton
OMP Proteína da membrana externa
OmpC Porina de membrana externa tipo C
OmpF Porina de membrana externa tipo F
PBPs Proteínas ligadoras de penicilina
PBS Tampão de fosfato de sódio
PCR Reação de cadeia da polimerase
PMSF Fenil metil sulfonil fluoreto
rpm Rotações por minuto
SDS-PAGE Dodecil-sulfato de sódio (SDS) de poliacrilamida
RESUMO
MARTINS, C.V. Resistência a antibióticos carbapenêmicos em enterobactérias mediada pela impermeabilidade de membrana externa. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.
Palavras-chave: carbapenêmicos, resistência, porinas, membrana externa
INTRODUÇÃO: Devido à disseminação de enterobactérias multirresistentes
envolvidas nas infecções relacionadas à assistência à saúde, a medicina tem
recorrido cada vez mais ao uso dos antibióticos carbapenêmicos, o que tem gerado
significativo aumento na resistência bacteriana ao mesmo. Um dos mecanismos
para tal resistência é mediado pela redução de permeabilidade da membrana
externa decorrente da deleção de porinas, que segundo estudos, estaria relacionada
com a presença de beta-lactamases. OBJETIVOS: O presente trabalho teve como
objetivo avaliar a influência da presença das beta-lactamases ESBL e AmpC no
desenvolvimento da resistência por deleção das porinas de 35-kDa e 36-kDa em
enterobactérias expostas ao imipenem. MATERIAL E MÉTODO: 45 isolados foram
separados em resistentes e sensíveis aos carbapenêmicos. Em uma fase inicial
todos os isolados tiveram seu perfil de porinas analisado por eletroforese SDS-
PAGE. Posteriormente, as cepas sensíveis (produtoras e não produtoras de beta-
lactamases) foram submetidas a sucessivas passagens em meio de cultura
contendo imipenem em concentrações subinibitórias (CIM/2) e tiveram seu perfil de
porinas e sensibilidade reanalisados. RESULTADOS: no grupo resistente, 62,5%
das cepas apresentaram alteração de porina associada com presença de beta-
lactamase. Já no grupo sensível, apenas cepas produtoras de beta-lactamases
tiveram alteração no seu perfil de porinas, passando para um perfil de resistência ao
imipenem. Duas cepas sensíveis, produtoras de AmpC, passaram a ser resistentes
ao imipenem após a exposição, porém não apresentaram modificação no perfil de
porinas da membrana externa. CONCLUSÃO: A exposição de enterobactérias
produtoras de beta-lactamases ao imipenem pode influenciar o desenvolvimento de
resistência aos carbapenêmicos por deleção da porina de 36-kDa. No entanto,
outros mecanismos podem atuar em conjunto no estabelecimento da resistência.
6
1 INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas as bactérias Gram-negativas têm adquirido um papel
importante na etiologia das infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS),
constituindo um problema para a saúde pública devido a sua prevalência e índices
de morbimortalidade associados, muitas vezes associados à virulência e/ou
resistência aos agentes antibacterianos comercialmente disponíveis. De fato, a
antibioticoterapia tem sofrido um colapso decorrente de novos e abrangentes
mecanismos de resistência que podem ser adquiridos e disseminados nas diferentes
espécies de enterobactérias de importância médico-hospitalar (THOMSON &
BONOMO, 2005).
No tratamento de infecções hospitalares, os antibióticos carbapenêmicos
(ertapenem, imipenem, meropenem) têm se consagrado como uma das últimas
alternativas terapêuticas. Recentemente, os índices de resistência aos
carbapenêmicos em bactérias Gram-negativas de interesse médico têm aumentado
de forma proporcional ao seu uso (NETO et al., 2007). Com o aparecimento de
bactérias Gram-negativas produtoras de beta-lactamases de amplo espectro
(ESBL), o tratamento com imipenem passou a ser a terapia de escolha,
consequentemente o uso exacerbado deste antibiótico contribuiu com a emergência
de resistência aos carbapenêmicos. Esta resistência tem sido associada com
mecanismos enzimáticos e impermeabilidade da membrana, sendo que a
impermeabilidade associada à bomba de efluxo contribui para um perfil de múltipla
resistência para antibióticos estruturalmente não relacionados como quinolonas,
cloranfenicol e tetraciclina (BORNET et al., 2003).
1.1 Carbapenêmicos
Na categoria dos antibióticos beta-lactâmicos estão inclusas as penicilinas
(amoxicilina, ampicilina), as cefalosporinas (cefalotina, cefotaxima, ceftriaxona,
ceftazidima), os monobactâmicos (aztreonam), e os carbapenêmicos. Esta classe de
antibióticos possui em comum o anel beta-lactâmico, o qual determina o mecanismo
de ação, o mesmo é formado por três átomos de carbono e um de nitrogênio.
7
Estruturalmente, os carbapenêmicos se diferenciam pela presença de um anel
pirrólico fundido ao anel beta-lactâmico (Figura 1).
Figura 1: estrutura química dos carbapenêmicos (PAPP-WALLACE et al., 2011)
Beta-lactâmicos inibem a síntese da parede celular, bloqueando a atividade
das transpeptidases (PBPs, proteins binding penicillin), enzimas responsáveis pela
ligação das subunidades de peptideoglicano. Estes antibióticos se ligam
covalentemente às PBPs (SUAREZ & GUDIOL, 2009), como resultado final há
formação de células deficientes com parede osmoticamente frágeis, o que leva a lise
das mesmas (atividade bactericida). Assim, a inibição da síntese da parede mediada
por beta-lactâmicos, requer de uma fase de crescimento exponencial.
Os carbapenêmicos atingem seu alvo, em bactérias Gram-negativas,
atravessando a membrana externa através de canais iônicos denominados porinas.
Seu uso massivo foi consolidado devido sua estabilidade a hidrolise pela maioria das
beta-lactamases clinicamente importantes, incluindo as ESBLs, porém, nos últimos
anos seu uso tem sido comprometido pelo aparecimento e rápida disseminação das
carbapenemases, enzimas que hidrolisam quase todos os tipos de beta-lactâmicos
(QUEENAN & BUSH, 2007). Clinicamente, carbapenêmicos são utilizados em
infecções intra-abdominais complicadas, pneumonias nosocomiais e comunitárias,
infecções de pele, meningites, sepse, e em casos de febre neutropênica (RODLOFF
et al., 2006). O imipenem (primeiro dos carbapenêmicos a ser introduzido na prática
médica) e o meropenem são fármacos de escolha empregados na terapia de casos
de infecções hospitalares (ZHANEL et al., 2007).
8
1.2 Mecanismos de resistência aos carbapenêmicos
A resistência aos carbapenêmicos é decorrente de eventos genéticos
adquiridos ou intrínsecos que resultam em (TSAI et al., 2015):
Hidrolise do antibiótico por meio de enzimas carbapenemases do tipo
serina ou metalo-beta-lactamases;
Perda da afinidade do alvo pelo antibiótico por alterações das PBPs;
Limitação do acesso intracelular da droga através da alteração da
permeabilidade da sua membrana externa, mediada pela deleção de
porinas e/ou pela superexpressão de bombas de efluxo.
Figura 2: Mecanismos de resistência aos carbapenêmicos. 1. carbapenemases. 2. bomba de efluxo.
3. deleção de porinas. 4. alteração das PBPs. (TAFUR, 2008)
1.2.1 Impermeabilidade de membrana
A parede celular bacteriana é uma barreia efetiva e semipermeável a
substâncias presentes no ambiente. Nos microrganismos Gram-negativos, essa
parede é composta por duas diferentes membranas separadas pelo espaço
periplasmático, onde se localiza o peptideoglicano. A membrana interna é similar à
membrana citoplasmática de Gram-positivas, formada por bicamada de fosfolipídeos
e proteínas. No entanto, a membrana externa é atípica, uma vez que contém
bicamada assimétrica composta internamente por camada de fosfolipídeos, porinas
e lipoproteína ancorada ao peptideoglicano e externamente por lipopolissacarídeo
9
(LPS) (MARTÍNEZ, 2008). As porinas de membrana externa (OMPs) são proteínas
triméricas que formam canais aquosos que permitem a difusão passiva de pequenas
moléculas hidrofílicas, como ferro e nutrientes, para o interior da célula. Os
antibióticos, por sua vez, para atingir seu alvo também necessitam ultrapassar a
barreira da membrana celular externa, e no caso dos antimicrobianos β-lactâmicos,
em isolados de K. pneumoniae e de E. cloacae, as vias utilizadas são as porinas
denominadas OmpK35 (de 35-kDa) e OmpK36 (de 36-kDa) (FERNÁNDEZ &
HANCOCK, 2012).
Essas porinas possuem uma alta similaridade entre si (60-70%), porém
diferem na seletividade e condições de expressão. OmpK35 (homóloga OmpF em E.
coli e OmpK41 em S. marcescens) e OmpK36 (homóloga OmpC em E. coli e
OmpK42 em S. marcescens) são as porinas mais abundantes em enterobactérias,
com maior seletividade para moléculas catiônicas e regulação menos específica,
influenciando na osmolaridade, pH, temperatura e nutrientes (COWAN et al., 1992).
Estudos clínicos têm demonstrado que a resistência a antimicrobianos está
relacionada com modificações no perfil das OMPs. Tratamentos com antibióticos
têm levado à diminuição da expressão de OMPs ou a substituições de aminoácidos
que afetam o tamanho do poro ou o potencial elétrico do poro, o que restringe a
entrada do antibiótico, diminuindo assim sua concentração intracelular (PAGES et
al., 2008; GARCÍA et al., 2010). Relatos descrevem que este mecanismo de
resistência estaria acoplado à presença de certas beta-lactamases de tipo ESBL e
AmpC. De fato, a seleção in vivo de mutantes deficientes de porinas em isolados
produtores de AmpC e ESBLs pode ocorrer após o tratamento do paciente com
antibióticos carbapenêmicos. (ELLIOTT et al., 2006).
1.2.2 Beta-lactamases
A produção de enzimas beta-lactamases, também tem sido relatada como um
importante mecanismo de resistência aos antibióticos beta-lactâmicos. Essas
enzimas hidrolisam o anel beta-lactâmico, e retiram assim, a capacidade desses
10
antibióticos de inibir a síntese da parede celular bacteriana (WILLIAMS, 1999).
Essas enzimas seguem duas classificações:
Classificação de Ambler, com base na estrutura molecular e na
homologia da sequência de aminoácidos resultando em quatro
grandes grupos, A- ESBL, penicilases e carbapenemases de tipo
serina, B- Metalo-beta-lactamase, C- AmpC ou cefalosporinases, D-
Oxacilinases (AMBLER, 1980).
Classificação de Bush, onde se relaciona o perfil dos substratos e dos
inibidores com a sua estrutura molecular resultando em quatro grupos
com vários subgrupos (BUSH et al., 1995)
Tanto as beta-lactamases ESBL, quanto as AmpC são classificadas como
serino-beta-lactamases, enzimas que possuem no seu centro ativo um resíduo
serina. Estas acilam os beta-lactâmicos e quebram a ligação amida do anel devido
ao ataque nucleofílico do grupo -OH da serina com o grupo C do anel. Desta reação,
forma-se um intermediário acil-enzima, ocorrendo desacilação (Figura 3).
Figura 3: Mecanismo de ação da inativação de beta-lactâmicos por beta-lactamases com
serina no seu centro ativo (SILVA & LINCOPAN, 2012)
As beta-lactamases de amplo espectro (ESBL) são enzimas capazes de
hidrolisar a maioria dos antibióticos beta-lactâmicos com exceção das cefamicinas,
carbapenêmicos e os inibidores de beta-lactamases; como o ácido clavulânico,
sulbactam ou tazobactam (BUSH, 2001). A maioria das ESBL pertence à classe
molecular A de Ambler e são agrupadas e denominadas de acordo com a sua
similaridade com enzimas precursoras. São derivadas na maior parte das enzimas
SHV (sulfidril variável) e TEM (Temoniera). Entretanto, mais de 500 enzimas com
11
fenótipo de ESBL já foram caracterizadas (http://www.lahey.org/), sendo as do tipo
CTX-M, BES, GES, VEB descritas no Brasil (OLIVEIRA et al., 2009; KHAN et al.,
2010, SILVA & LINCOPAN, 2012). Tais enzimas são de grande incidência em
ambientes hospitalares, porém, atualmente é de conhecimento que o uso de
antimicrobianos na agropecuária contribui com a seleção de cepas produtoras de
ESBL, as quais podem disseminar-se para a comunidade por meio de produtos
contaminados, assim como pelo contato direto (SILVA & LINCOPAN, 2012).
Quando as ESBL são comparadas com as enzimas tipo AmpC, a principal
diferença é que essas hidrolisam cefamicinas. As enzimas do tipo AmpC pertencem
ao grupo 1 de Bush e à classe molecular C de Ambler, são resistentes aos
inibidores de beta-lactamases, porém, são inativadas por oxacilinas e inibidas de
forma reversível pelo ácido fenil borônico (BAVUVOIS, 2007). AmpCs podem ser de
origem plasmidial (pAmpC) ou cromossômica, sendo a enzima CMY a mais
detectada mundialmente, apesar de existirem outros tipos, como CMY, MIR, MOX,
FOX, DHA, ACT e ACC (ROCHA et al., 2016).
As carbapenemases são as beta-lactamases mais versáteis, devido à sua
ampla atividade hidrolítica a maioria dos antibióticos beta-lactâmicos, inclusive aos
carbapenêmicos, além de que apresentam uma fraca inibição por inibidores de beta-
lactamases comercialmente disponíveis. A grande maioria pertence a duas classes,
a das serino-carbapenemases (sendo a KPC de maior importância) e a das metalo-
β-lactamases (enzimas que requerem Zn+2 no sítio ativo e assim podem ser inibidas
por agentes quelantes como o EDTA) (GULMEZ et al., 2008). No Brasil, o primeiro
relato de KPC ocorreu no ano de 2009, em que foi descrita a detecção da enzima
em K. pneumoniae de quatro pacientes do Recife. Posteriormente, a produção de
KPC em enterobactérias passou a ser disseminada por todo o país (SAMPAIO &
GALES, 2016). Frente ao aumento do número de casos, em 2010 a ANVISA
publicou a Nota Técnica N°1/2010 com medidas para identificação, prevenção e
controle de infecções relacionadas à assistência à saúde por microrganismos
multirresistentes.
12
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Analisar a presença das porinas de membrana externa (OmpK35 e OmpK36)
em enterobactérias produtoras e não produtoras de beta-lactamases (ESBL, AmpC),
e avaliar a relação entre a expressão das porinas e o perfil de resistência aos
carbapenêmicos.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar a deleção de porinas em cepas resistentes aos carbapenêmicos e
produtoras de beta-lactamases do tipo ESBL e AmpC.
Avaliar a influência da deleção de porinas na alteração da concentração
inibitória mínima aos carbapenêmicos, após a exposição de cepas sensíveis a
concentrações (CIM/2) de imipenem.
Avaliar a contribuição das beta-lactamases de tipo ESBL e AmpC no
desenvolvimento da resistência aos carbapenêmicos mediada pela deleção de
porinas em cepas sensíveis.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Isolados bacterianos
Foram utilizados no presente estudo, 45 isolados de enterobactérias, obtidos
de diversos materiais clínicos (hemocultura, urina, cateter, entre outros), coletados
entre os anos 2003 e 2009, provenientes de três centros hospitalares da cidade de
São Paulo. As cepas ficaram separadas em dois principais grupos, um formado por
aquelas resistentes (Tabela 1) e outro pelas sensíveis (Tabela 2) aos
carbapenêmicos. No grupo carbapenem-resistente (CR) a ausência de
carbapenemases foi confirmada em estudos prévios do grupo de pesquisa, por
métodos fenotípicos e PCR.
A disposição dos isolados nos grupos resistente e sensível foi realizada com
base em resultado de antibiograma e valor da CIM para os carbapenêmicos,
determinado por diluição em ágar. Testes fenotípicos e PCR permitiram a
identificação das beta-lactamases. O grupo de isolados sensíveis (CS) foi
13
subdividido em 3 subgrupos: subgrupo CS-S (não produtor de beta-lactamase);
subgrupo CS-A (produtor da beta-lactamase AmpC); subgrupo CS-E (produtor da
beta-lactamase ESBL).
3.2 Condições de cultura
As cepas foram semeadas em ágar MacConkey e incubadas por 24 h em
estufa controlada a 37°C. As colônias foram semeadas em 3 mL de caldo MH
(Muller-Hinton) e incubadas a 37°C por 24 h sob agitação constante em shaker
rotativo a 150 rpm. Ao resultado dessa semeadura foram acrescentados 20% de
glicerol para o congelamento.
3.3 Análises do perfil de porinas no grupo CR
Os 24 isolados que compõem o grupo resistente tiveram seu perfil de porinas
analisado por verificação da presença das duas principais porinas de membrana
externa (35-kDA e 36-kDa) por eletroforese SDS-PAGE.
3.3.1 Extração de porinas da membrana externa
Células bacterianas crescidas em fase estacionária foram coletadas por
centrifugação a 5.000 rpm por 15 minutos e lavadas com 10mM de tampão de
fosfato de sódio (PBS), pH 7,0. O pellet foi ressuspenso com o mesmo tampão
acrescido de 1mM de fenil metil sulfonil fluoreto (PMSF) e as células foram rompidas
com o auxílio de sonicador, utilizando 3 pulsos de 1 minuto cada um, com intervalos
de 1 minuto de resfriamento entre cada pulso para preservação das proteínas.
Restos celulares foram removidos por meio de centrifugação a 4.300 rpm durante 15
minutos e o resultado do sobrenadante foi submetido a ultra centrifugação a 30.000
rpm durante 120 minutos a 4°C para que fossem coletadas as frações de
membrana. O sobrenadante dessa centrifugação foi descartado e o pellet resultante
ressuspenso em 150 L de solução tampão PBS 10mM, pH 7,0, acrescido de PMSF
na concentração final de 1mM. 100 L do volume final do lisado foi tratado com 800
L de solução de sarcosil a 2% por 20 minutos à temperatura ambiente. A
membrana externa foi obtida por meio de centrifugação a 15.000 rpm durante 60
minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em 50 L de
solução tampão PBS 10mM, pH 7,0 acrescido de 1mM de PMSF e mantido sob
14
refrigeração (4ºC) durante 24 horas para solubilização. Posteriormente, foi estocado
a -20ºC(ACHTMAN et al., 1983; FUNG-TOMC et al., 1995).
3.3.2 Análise das porinas de membrana externa
A análise das proteínas de membrana externa foi realizada por meio de
eletroforese SDS-PAGE. O material obtido foi preparado de acordo com a
metodologia descrita por Laemmli para análise de proteínas em SDS-PAGE
(LAEMMLI, 1970).
Como controle foi utilizada a cepa ATCC de Escherichia coli K12, conhecida
previamente como sensível ao imipenem. As amostras e o padrão de peso
molecular foram aplicados no gel concentrado a 12% em volumes de 10 L por poço
e submetidos à eletroforese a fim de se obter a separação das proteínas para
verificar a presença ou ausência de proteína que possui peso molecular de 35 e 36
KDa. Após a eletroforese, o gel foi corado por Coomassie blue.
3.4 Análise fenotípica do grupo CS
Os 21 isolados do grupo CS também tiveram seu perfil de porinas analisado
por eletroforese SDS-PAGE, em uma etapa inicial chamada “zero”. Em seguida,
todas as cepas desse grupo foram induzidas à resistência através da exposição a
concentrações subinibitórias de imipenem.
Cada cepa foi exposta a 5 - 6 passagens de crescimento (Tabela 3 – 4) em
meio de cultura contendo o antibiótico imipenem e tiveram seu perfil de porinas e
CIM aos carbapenêmicos analisados após cada passagem.
3.5 Indução da resistência por exposição ao imipenem
Os isolados, em uma concentração de 1x107 UFC/mL, foram semeados em
60 mL de caldo LB acrescido do antibiótico imipenem em uma concentração
correspondente à CIM/2 da passagem anterior. Após uma incubação overnigth, 50
mL do inóculo foi utilizado para extração das OMPs. A partir deste mesmo inóculo foi
determinada a CIM para os carbapenêmicos. Assim, para as passagens posteriores,
a obtenção de culturas puras foi obtida pelo re-isolamento em placas contendo ágar
15
MacConkey acrescido com a imipenem na concentração CIM/2 obtido na passagem
prévia (NOTO et al., 2008).
3.6 Concentração inibitória mínima (CIM)
A CIM foi realizada por microdiluição em caldo Muller-Hinton (Tabela 4) e ágar
diluição (Tabela 1 - 2) segundo as normas do CLSI para os antibióticos
carbapenêmicos (CLSI, 2012).
3.6.1 CIM por diluição em ágar
Os carbapenêmicos foram testados em uma faixa de concentração entre 0,03
– 512 µg/mL. As diluições seriadas foram realizadas a partir de uma solução estoque
em tubos contendo 19 mL de ágar Mueller-Hinton (Merck, Darmstad- Alemanha)
previamente esterilizados e estabilizados a uma temperatura entre 45º a 50ºC. Uma
vez estabilizados, 1 mL da solução do antimicrobiano com concentração 20 vezes
superior para cada diluição testada foi adicionado aos 19 mL de ágar Mueller-Hinton.
Após homogeneização, o conteúdo foi depositado em placas de Petri estéreis de 90
x 15 mm.
Para cada isolado, 10 µL de cultura crescida overnight foram cultivados em 2
mL de caldo Mueller-Hinton (DIFCO, Lawrence, KS. USA) e incubadas a 37º C
durante duas a três horas para atingir uma turbidez equivalente a 0,5 na escala de
MacFarland na fase de crescimento exponencial da bactéria, a qual foi confirmada
no espectrofotômetro Spectronic 20 (ThermoSpectronic, Rochester, NY, USA) a uma
absorbância entre 0,08 e 0,1 em um comprimento de onda de λ 625 nm. Este
método de crescimento foi utilizado para todos os testes fenotípicos.
Para o teste de diluição em ágar, a suspensão bacteriana já atingida com
turbidez equivalente ao 0,5 da escala de Mcfarland foi diluída em caldo Mueller-
Hinton estéril na proporção 1:10, resultando em um inóculo de aproximadamente
107UFC/mL. A seguir, 300 µL dessa suspensão foram transferidos para o inoculador
de Steers. Desse modo, 1 a 3 µL de cada isolado foram inoculados simultaneamente
em ágar Mueller-Hinton com uma concentração bacteriana final de 104 UFC/mL
(CLSI 2012) e as placas incubadas por 18 a 20 horas. A CIM foi definida como a
menor concentração de cada antimicrobiano capaz de inibir o crescimento
16
bacteriano e foram interpretadas de acordo com os critérios de sensibilidade
estabelecidos pela CLSI para a família Enterobacteriaceae (CLSI 2012).
3.6.2 CIM por microdiluição em caldo
O método de microdiluição foi utilizado para os antibióticos carbapenêmicos
após cada etapa de indução com imipenem.
Os agentes antimicrobianos foram testados numa faixa de concentração de
0,015 – 128 µg/mL. As diluições seriadas foram realizadas em cada placa a partir de
uma solução inicial de 2 mL (128 µg/mL) utilizando um volume de 100 µL para cada
diluição.
Os isolados foram crescidos a 37ºC overnigth em caldo Muller-Hinton. A partir
desse cultivo foi atingida uma turbidez equivalente a 0,5 na escala de MacFarland e
confirmada no espectrofotômetro Spectronic 20 (ThermoSpectronic, Rochester, NY,
USA) a uma absorbância entre 0,08 e 0,1 em um comprimento de onda de λ 625
nm. A suspensão bacteriana já atingida foi diluída 1:10 em caldo Muller-Hinton
estéril, resultando em um inóculo de aproximadamente 107UFC/mL. 5 uL de essa
suspensão foram depositados em cada um dos poços para obter assim um inóculo
final de 104 UFC/mL (CLSI 2012).
3.7 Análise dos resultados
A análise dos resultados foi feita de forma descritiva. Os valores referência de
resistência aos carbapenêmicos seguiram as normas da CLSI (http://clsi.org/wp-
content/uploads/sites/14/2013/11/ORWG-CRE-Laboratory-Role-5.30.16.pdf).
4 RESULTADOS
4.1 Grupo CR
A tabela 1 é composta dos isolados resistentes aos carbapenêmicos com
seus respectivos perfis de susceptibilidade obtidos através de antibiograma e análise
da CIM, a mesma também apresenta a presença de beta-lactamases de cada
isolado, a qual foi determinada, previamente, por testes fenotípicos (disco
17
combinado cefotaxima e cefotaxima associadas ao ácido clavulânico) e confirmados
por PCR utilizando primers para gene específico de ESBL e/ou AmpC.
O perfil de porinas foi obtido a partir da extração das porinas e posterior
análise por eletroforese SDS-PAGE (Figura 4).
Figura 4- Gel de SDS-PAGE de amostras de extratos de proteínas de membrana externa de três isolados de E. aerogenes (cepas C-6, C-52, C7-1) e um isolado de E. coli (cepa K-12). Cepas de E. aerogenes CR, apresentaram deleção de porina de 36-kDa, quando comparado com cepa de E. coli CS. Tabela 1: Antibiograma, concentração inibitória mínima (CIM) para os carbapenêmicos (μg/mL),
identificação de beta-lactamases, e perfil de porinas do grupo CR.
18
4.2 Grupo CS
A tabela 2 é composta de isolados sensíveis aos carbapenêmicos alocados
em cada subgrupo. São apresentados os perfis de susceptibilidade obtidos através
de antibiograma e análise da CIM, assim como o perfil de porinas dessas cepas
antes da passagem em meio contendo imipenem (passagem zero).
Tabela 2: Antibiograma, concentração inibitória mínima (CIM, µg/mL), e perfil de porinas do grupo
CS.
4.3 Caracterização fenotípica dos isolados após indução com antibiótico
imipenem
Na tabela 3 são apresentados os resultados obtidos na análise SDS-PAGE para
verificação da presença ou ausência das porinas de 35-kDa e 36-kDa ao final de
cada passagem da exposição ao imipenem.
19
Tabela 3: Análise da presença ou ausência de porinas de 35- e 36-kDa no grupo CS antes e após a
exposição ao imipenen (passagem 0 – 6).
A Tabela 4 apresenta os valores da CIM (µg/mL) para cada carbapenêmico antes e
após a exposição ao imipenen (passagem 0 – 6). Em destaque, isolados que
atingiram uma mudança da CIM para o valor interpretativo de resistência (≥ 2 µg/mL
para imipenem e meropenem e ≥1 µg/mL para ertapenem).
Tabela 4: CIM (µg/mL) para cada carbapenêmico antes e após a exposição ao imipenen (passagem
0 – 6).
20
5 DISCUSSÃO
5.1 A resistência aos carbapenêmicos em enterobactérias de importância
clínica pode ser mediada por diferentes mecanismos que atuam em
conjunto.
Como critério de seleção para os isolados do grupo CR foi estabelecido que os
mesmos fossem produtores de pelo menos uma beta-lactamase do tipo ESBL ou
AmpC, a fim de se observar o fenômeno de perda de porina em cepas CR
produtoras de tais enzimas. A beta-lactamase do tipo ESBL estava presente em
83,3% dos isolados CR, enquanto a do tipo AmpC em 45,8%, sendo que 29,2% dos
isolados apresentou ambas beta-lactamases simultaneamente. A ausência de uma
das porinas foi observada em 15 dos 24 isolados, ou seja, 62,5%, sendo que em
todos a porina perdida foi a porina de 36-kDa. A presença de ambas as porinas nos
outros 37,5% sugere a atuação de outros mecanismos de resistência aos beta-
lactâmicos, como por exemplo, superexpressão de bombas de efluxo e/ou alteração
das PBPs (TSAI et al., 2015).
Para suportar a participação da impermeabilidade por deleção de porinas
como mecanismo de resistência único, este grupo de isolados CR foi
exclusivamente formado por cepas não produtoras de carbapenemases prevalentes,
as quais foram selecionadas com base em resultados do Teste de Hodge Modificado
e pelo uso do inibidor EDTA ou ácido fenil borônico. No entanto, esses métodos não
são 100% confiáveis, podendo o Teste de Hodge gerar resultado falso positivo em
enterobactérias produtoras de ESBL ou AmpC (BARTH et al., 2012). Assim, a
confirmação de carbapenemase nos isolados que geraram dúvidas foi feita através
de PCR para genes codificadores de carbapenemases prevalentes. Neste ponto,
uma limitação poderia ser a não inclusão de genes descritos recentemente. De fato,
Nicolette e colaboradores, no ano de 2015, caracterizaram uma nova
carbapenemase da classe A de Ambler (BKC-1) em três cepas de K. pneumoniae
provenientes de dois hospitais de São Paulo, tendo as mesmas sido isoladas no ano
de 2008. Uma vez que, o gene para tal carbapenemase não foi testado durante a
seleção do grupo resistente, é possível que os altos valores da CIM de imipenem
para as cepas de K. pneumoniae C15-1, C-40, C15-2, C-5, e para a cepa C-6 de E.
21
aerogenes (cepas com nível de resistência característico da hidrólise do antibiótico),
sejam conseqüência da presença da BKC-1.
5.2 A deleção da porina de 36-kDa em enterobactérias pode estar associada a
CIM do imipenem ≥ 0,5 ug/mL.
O grupo CS foi composto por 21 cepas sensíveis aos carbapenêmicos
imipenem, meropenem e ertapenem. Observando os resultados da triagem realizada
na “passagem 0” (Tabela 2), temos que o subgrupo CS-S, formado por 6 isolados,
possui CIM variando entre 0,06 e 0,125 µg/mL para o imipenem, entre 0,03 e 0,06
µg/mL para meropenem e entre 0,015 e 0,03 µg/mL para ertapenem. O perfil
fenotípico de OMPs mostrou a presença das duas porinas OmpK35 e OmpK36 em
todos os isolados (Tabela 2), assim como o relatado em 2012 por Shakib, que em
seu estudo com K. pneumoniae, não detectou perda de porina em nenhum dos 30
isolados não produtores de beta-lactamases analisados. No entanto, já na
“passagem 0”, observamos nos isolados sensíveis produtores de beta-lactamases,
deleção de uma das porinas. No subgrupo CS-E, 1 das 7 cepas não possuía a
porina de 36-kDa, enquanto que no subgrupo A isso ocorreu em 3 das 8 cepas.
Dentre esses 4 isolados, as cepas E-24, A-7 e A-4 apresentaram CIM de 0,5 µg/mL
para imipenem e a cepa A-38 de 1 µg/mL.
Uma vez que, segundo os critérios estabelecidos pela CLSI (2016), cepas
com valor de CIM ≤ 1 µg/mL são sensíveis ao imipenem, seria importante considerar
que a deleção da porina de 36-kDa pode ser evidenciada quando um isolado
apresenta CIM ≥ 0,5 µg/mL, o que hipotetiza que na pratica clínica, isolados com
CIM ≥ 0,5 µg/mL chegaram a ser resistentes a este antibiótico depois de uma terapia
prolongada. No futuro, maiores estudos deverão ser realizados para validar esta
hipótese, o que poderia inferir em mudanças no break-point, atualmente
estabelecidos para definir sensibilidade e resistência.
Por tratar-se de isolados clínicos, supomos que o possível tratamento ao qual
os pacientes já vinham sendo submetidos no ambiente hospitalar tenha iniciado uma
indução na perda de porina. Sendo assim, tais bactérias já estariam sofrendo
redução da susceptibilidade, de forma que a deleção da porina estaria associada a
CIM de 0,5 µg/mL para o imipenem.
22
5.3 A exposição ao imipenem em enterobactérias sensíveis carregando ESBL
ou AmpC pode induzir a deleção da porina de 36-kDa.
Com finalidade conclusiva, as tabela 3 e 4 foram analisadas simultaneamente.
O subgrupo CS-S, não produtor de beta-lactamases, passou por 5 passagens de
tratamento. Até a passagem final não houve nenhuma alteração no perfil de
permeabilidade das cepas, tendo todas permanecido com ambas as porinas. Esses
resultados concordam com os já descritos na literatura, em que a perda de uma das
porinas normalmente está associada com a presença de uma beta-lactamase.
Quanto às alterações no perfil de susceptibilidade, duas cepas tiveram variações
mais significativas para o imipenem. A cepa S16-2 teve um aumento de 4 CIMs, com
sua CIM alterada de 0,06 para 1 µg/mL, valor limite de sensibilidade, enquanto a
CIM para o isolado S-7 aumentou em 5 vezes, passando de 0,06 para 2 µg/mL e
assim terminando o tratamento com um perfil de resistência intermediária. Esses
resultados sugerem que o mecanismo pelo qual essas cepas diminuem a
susceptibilidade pode estar relacionado a outro mecanismo como superexpressão
de bomba de efluxo (TSAI et al., 2015).
No grupo produtor de ESBL a cepa E-24, que já iniciou a passagem sem uma
das porinas, teve sua CIM elevada de 0,5 para 2 µg/mL, alcançando um perfil
intermediário de resistência ao imipenem. Duas cepas perderam uma de suas
porinas durante a exposição ao imipenem e tiveram alteração da CIM. Com relação
a isto, o isolado E-3 atingiu nível intermediário de resistência, com CIM de 2 µg/mL e
perda da porina na passagem 6. O isolado E-1 apresentou CIM final de 4 µg/mL,
passando a ser classificado como resistente segundo as normas da CLSI (2016), o
mesmo perdeu sua porina na passagem 2, quando sua CIM atingiu 0,5 µg/mL, o que
reforça a hipótese apresentada acima, de que a redução da permeabilidade em
cepas produtoras de beta-lactamases sob pressão seletiva já ocorre em valores de
CIM ≥ 0,5 µg/mL para o imipenem.
No subgrupo produtor de AmpC, das 3 cepas que já iniciaram o tratamento
com ausência de uma das porinas 2 tiveram sua CIM elevada para valor
intermediário de resistência. A cepa A-7 iniciou a passagem com CIM de 0,5 µg/mL
e a A-38 com 1 µg/mL, ambas atingiram valor de 2 µg/mL na passagem 6. A terceira
23
cepa que iniciou o tratamento com ausência de uma das porinas foi a A-4, a mesma
teve sua CIM elevada em 4 vezes, com valor de 16 µg/mL na etapa final, o que a
caracteriza como resistente ao imipenem. Nesse grupo não houve perda de porina
nos demais isolados durante o tratamento.
Dentre os isolados produtores de beta-lactamases, 3 tiveram alteração do seu
perfil de susceptibilidade, porém sem redução da permeabilidade por perda de
porina, permanecendo com ambas até o fim do tratamento. A cepa E-23 apresentou
perfil intermediário de resistência na etapa 6, com CIM de 2 µg/mL; as cepas A-17 e
A-26 tiveram CIM de 4 µg/mL na etapa final, tendo ambas assim passado para um
perfil de resistência. Esses isolados ficam dessa forma caracterizados
semelhantemente aos do grupo CR que apresentavam ambas as porinas. Para
novos estudos essas 3 cepas poderiam ser adicionadas às outras 9 do grupo
resistente a fim de se analisar quais outros mecanismos poderiam estar envolvidos,
como superexpressão de bombas de efluxo ou alteração das PBPs.
Comparando-se o subgrupo produtor de beta-lactamases (CS-A e CS-E) com
o subgrupo não produtor (CS-S) observa-se que a alteração da permeabilidade da
membrana externa só ocorreu no subgrupo CS-A/CS-E, indo em acordo com o já
descrito por outros pesquisadores. Porém nosso estudo não foi conclusivo quanto
qual das beta-lactamases, ESBL ou AmpC, poderia estar mais envolvida na deleção
ou modificação das porinas. Em todos os casos, no entanto, que houve modificação
da permeabilidade, tanto do grupo resistente como do selecionado, isso ocorreu por
alteração da porina de 36-kDa, cuja deleção se mostra mais relacionada à
resistência ao imipenem. Em fevereiro de 2017, Dalmolin e colaboradores relatam
que em seu estudo realizado com isolados coletados entre 2013 e 2014 no Brasil,
não observou influência significante no desenvolvimento da resistência em cepas de
K. pneumoniae com perda da porina de 35-kDa. Outros estudos têm mostrado que
poucos são os casos de isolados clínicos produtores de beta-lactamases em que se
observa a deleção de ambas as porinas (SHAKIB et al., 2012).
5.4 A redução da permeabilidade induzida por imipenem também afeta a
susceptibilidade das enterobactérias ao meropenem e ertapenem.
24
Ao fim do tratamento, observa-se que no grupo CS, os 6 isolados com
ausência da porina Ompk36 apresentaram CIM acima dos valores de resistência
tanto para o ertapenem como para o meropenem, com exceção dos isolados E-3 e
A-38 que se mantiveram sensíveis ao meropenem. Em 2008, Martínez descreve que
a perda de ambas as porinas, OmpK35 e OmpK36, em K. pneumoniae produtora de
ESBL diminui a susceptibilidade aos carbapenêmicos, porém particularmente ao
ertapenem. Um ano depois, em 2009, dois isolados de K. pneumoniae resistentes a
carbapenêmicos foram coletados de pacientes de um hospital na China. Uma das
cepas era produtora de ESBL, enquanto a outra continha genes tanto de ESBL
como de AmpC. Ambas produziam OmpK36 estruturalmente deficientes, resistência
estabelecida ao ertapenem, e susceptibilidade reduzida ao imipenem e meropenem
(WANG et al., 2009). Em nosso estudo, observou-se maior aumento na CIM para o
ertapenem nos isolados do grupo CS com ausência da OmpK36, tendo a cepa E-24
atingido CIM de 128 µg/mL e as cepas A-7 e A-4 de 64 µg/mL. Isso sugere que a
passagem do ertapenem para o interior da bactéria ocorre principalmente pela
porina OmpK36 e que dentre os carbapenêmicos é o mais afetado pela deleção da
mesma.
Dentre a limitações do presente estudo podemos citar o número reduzido de
isolados analisados, assim como, a falta de uma completa caracterização de todas
as beta-lactamases (ESBL, AmpC, carbapenemases) até agora descritas. Assim,
nossas conclusões são baseadas em observações dignas de serem confirmadas por
investigações adicionais.
Esse estudo também contribuiu com o trabalho de nosso grupo de pesquisa,
o qual foi publicado em 2016 (ANEXO).
6 CONCLUSÃO
1. A redução da permeabilidade da membrana externa por deleção da porina (36-
kDa) em cepas produtoras de beta-lactamases (não carbapenemases) pode
influênciar o desenvolvimento de resistência aos antibióticos carbapenêmicos.
2. A exposição ao imipenem em enterobactérias sensíveis carregando ESBL ou
AmpC pode induzir a deleção da porina OmpK36.
25
3. Esta deleção da porina de 36-kDa em enterobactérias pode estar associada a
CIM do imipenem ≥ 0,5 µg/mL.
4. A deleção da porina de 36-kDa pode ser responsável pela resistência ao
imipenem e ertapenem, sendo este último o mais afetado dentre os
carbapenêmicos.
26
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30
8 ANEXO
1. Introduction
Carbapenems have long been considered as an effective therapeutic alternative against cephalosporin-
resistant enterobacteria. Nevertheless, resistance to carbapenem antibiotics by the Enterobacteriaceae family has
steadily increased in recent years in different regions of the world [1,2]. Moreover, therapy with imipenem, one
of the main carbapenem drugs in clinical use, has contributed to an adaptive response through a mechanism
associated with membrane impermeability, such as increased expression of efflux pumps and decreased
synthesis of porins [3].
The impermeability-related multidrug-resistant (MDR) profile avoids establishment of active concentrations of
antibiotics within the bacterial cell, albeit because of efflux pumps and/or porin loss [4]. Membrane permeability
in enterobacteria is mainly modulated by the major 35 kDa and 36 kDa porins, encoded by omp35-like and
omp36-like genes, respectively. There are several reports of porin-mediated resistance in clinical isolates of
enterobacteria, mainly affecting susceptibility to β-lactams [5–7]. Carbapenem resistance by in vivo selection of
mutants lacking porins in AmpC-and extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing isolates has been
31
reported in patients after treatment with carbapenems or cephalosporins [8–10]. In 2009, Doumith et al identified
a high prevalence of mutations in coding regions of porins, such as substitutions and deletions leading to
premature stop codons and interruptions by the presence of insertion sequences, leading to carbapenem
resistance [11]. Nevertheless, decreased expression of porins in isolates without functional mutations remains
unexplained. In this way, regulatory mechanisms of multidrug resistance and repressors of porins, such as MarA
and OmpR, respectively, could also affect susceptibility to these antibiotics [12].
Efflux pumps represent an active protection mechanism against toxic compounds and have been largely
related to resistance to several antibiotics. The role of efflux pumps in multidrug resistance in enterobacteria is
well known owing to the low selectivity of the pumps [4].
Although this mechanism has not been well associated in enterobacteria with β-lactam antibiotic resistance,
the use of imipenem has been demonstrated to induce the expression of the efflux pump AcrAB–TolC in
Enterobacter sp. [13,14]. Moreover, the regulator MarA plays a role in the expression of efflux pumps,
demonstrating that it is a key modulator of membrane permeability [15].
Although membrane impermeability is related to several mechanisms, the molecular processes involved in the
establishment of impermeability in clinical isolates are poorly understood [11,16]. We evaluated the
establishment of membrane impermeability in Enterobacteriaceae clinical isolates exposed to imipenem in order
to report the molecular behavior of bacteria, with a special focus on the role of genes that modulate the
expression of porins and efflux pumps. This study attempted to understand the possible molecular mechanism of
therapeutic failures related to an adaptive response to imipenem exposure.
2. Materials and methods
2.1. Bacterial isolates
From 125 Enterobacteriaceae clinical isolates collected between 2005 and 2009 in three hospitals of São Paulo,
Brazil, 22 strains were selected for imipenem induction according to susceptibility profile and molecular typing
in order to exclude isolates that were clonally related. The susceptibility profile of the isolates was determined by
performing antibiogram, minimum inhibitory concentration (MIC) determination, and screening of the ESBL,
AmpC and carbapenemase β-lactamases by double disk diffusion tests with disks containing clavulanic acid,
boronic acid and ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA), respectively [17–19]. Molecular typing was
performed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR
(ERIC-PCR) [20,21]. Subsequently, unrelated strains were grouped into: (i) multisensitive group, defined by
isolates with reported resistance to up to two antibiotic classes; (ii) ESBL-producing group; and (iii) AmpC-
producing group.
2.2. Susceptibility testing
MICs were determined by broth microdilution for the following antibiotics: imipenem; meropenem;
ertapenem; ceftazidime; cefotaxime; cefepime; tetracycline; chloramphenicol; cefoxitin; gentamicin;
ciprofloxacin; tigecycline; and polymyxin B. Briefly, bacteria were suspended in Muller–Hinton broth to 1/10
the turbidity of a 0.5 McFarland standard and then 5 μL was inoculated directly onto 100 μL of antibiotic-
containing Muller–Hinton broth. After 16– 20 h of incubation, MICs were interpreted according to Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) recommendations [22]. MICs were also determined using β-lactamases
and effux pump inhibitors [clavulanic acid 4 μg/mL, boronic acid 400 μg/mL, EDTA 320 μg/mL and carbonyl
cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) 100 μM]. Escherichia coli strain ATCC 25,922 was used as the
quality control strain [23].
2.3. β-lactamase screening
β-Lactamase genes were detected by PCR amplification using primers designed in Primer3 software
(http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi). The primer sequences are described in Table 1.
32
2.4. Real-time reverse transcription PCR (RT-PCR) studies
Total RNA was isolated from cultures in exponential growth during imipenem induction using the QIAGEN
RNeasy® protocol (QIAGEN Biotechnology Brazil Ltda, São Paulo, Brazil). Quantification and purity of RNA
were evaluated by spectrophotometry at 260 nm and 280 nm using a NanoDrop™ Spectrophotometer (Thermo
Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). RNA samples were treated with DNase (Ambion, Austin, TX) according
to the manufacturer’s protocol and were further reverse transcribed using the SuperScript™ II Reverse
Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) as specified by the manufacturer. Quantitative PCR was performed on
a StepOnePlus™ System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) and each sample was assayed in technical
duplicate using Fast SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). The primer sequences of genes
acrA, omp35-like, omp36-like, ompR, sdeR and marA and the house-keeping gene gapA are described in Table 2.
PCR cycling conditions consisted of 95 °C for 10 min, and 40 cycles of 95 °C for 15 s and 60 °C for 1 min.
Dissociation curves were run to confirm the specificity of all PCR amplicons. Relative mRNA expression was
calculated using the comparative Ct method using the formula 2–ΔΔCt and non-induced isolates as a calibrator.
33
2.5. Imipenem induction
Selected isolates were grown in the presence of imipenem at subinhibitory concentrations of 0.5 × MIC.
Briefly, 1 × 107 CFU were cultured in 60 mL of Luria–Bertani medium containing specific concentrations of
imipenem at 37 °C. After 6 h, 10 mL was taken to evaluate the growth rate by measuring the optical density at
625 nm and to perform total RNA extraction. The remaining 50 mL was cultured overnight to determine the
MIC of carbapenems and for the extraction of outer membrane proteins. Isolates were exposed six consecutive
times to imipenem at 0.5 × MIC according to the value obtained after the last exposure previously described.
2.6. Statistical analysis
Statistical analysis was performed using GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). The influence
of imipenem exposure on the profile of mRNA expression was evaluated by one-way analysis of variance
(ANOVA) test for paired samples followed by Tukey’s test. The association observed between the expression of
transcriptional factors studied and the mRNA profile of multidrug resistance determinants was evaluated by one-
way ANOVA for in-dependent samples followed by Tukey’s test. The level of significance was set at P < 0.05.
3. Results
3.1. Phenotypic characterisation of the isolates
Six non-clonally related isolates were selected in the multisensitive group, which showed some resistance
only to tetracycline and aminoglycosides (33% each; data not shown). The carbapenems had low MIC values (up
to 0.125 μg/mL for imipenem, 0.03 μg/mL for meropenem and 0.03 μg/mL for ertapenem).
Another seven non-clonally related isolates carrying β-lactamase genes comprised the ESBL-producer group.
All isolates were resis-tant to penicillins, cephalosporins and chloramphenicol, and also had a high prevalence of
resistance to sulfa and quinolone drugs (86% each; data not shown). Carbapenems MIC values were higher than
the multisensitive group, although they were considered susceptible (up to 1 μg/mL for imipenem, 0.5 μg/mL for
meropenem and 0.25 μg/mL for ertapenem). Interestingly, identification of ESBL genes indicated that all seven
isolates carried genes encoding enzymes of the CTX-M-2 group and TEM-like. Moreover, the pres-ence of
SHV-like and CTX-M-25 was also observed (Table 3).
AmpC-producing isolates were composed of nine isolates, all of which were resistant to cefoxitin,
cephalosporin and ESBL inhibitors. Resistance to other antibiotics was characterized by resistance to
chloramphenicol, fluoroquinolones, tetracycline, trimethoprim/ sulfamethoxazole and aminoglycosides (57%,
65%, 33%, 33% and 22%, respectively; data not shown). All nine isolates were susceptible to carbapenems with
MIC values up to 1 μg/mL for imipenem, 0.25 μg/ mL for meropenem and 0.5 μg/mL for ertapenem (Table 3).
Identification of β-lactamases revealed the presence of ESBL-producing CTX-M-2 group, CTX-M-1 group and
TEM-like. Moreover, one isolate carried the plasmid AmpC MIR/ACT (Table 3).
3.2. Phenotypic characterisation after imipenem induction
Following imipenem exposure, the phenotypic susceptibility profile to carbapenems changed for 73% of the
induced isolates, increasing their MIC by ≥2 doubling dilutions (Table 3). None of the isolates in the
multisensitive group showed significant changes in the susceptibility profile to meropenem and ertapenem.
However, for imipenem the MICs after induction had a significant increase in two isolates (up to 5 doubling
dilutions). Increased resistance to chloramphenicol and polymyxin B was also observed (MIC dilution ≥2
doubling dilutions).
ESBL- and AmpC-producers had noticeably higher MICs of carbapenems after exposure, mainly for
meropenem (MIC up to 8 μg/ mL for both groups) and ertapenem (MIC up to 128 μg/mL and 64 μg/ mL for
ESBL and AmpC groups, respectively), which represent an increase of up to 11 doubling dilutions in MICs.
However, some isolates did not have the same response and after exposure did not change their MICs (MIC
34
dilution ≥2 doubling dilutions). The in-crease of imipenem MICs was lower than other carbapenems with an
MIC up to 4 μg/mL and 16 μg/mL for ESBL and AmpC groups, respectively (see Table 3). The efflux pump
inhibitor CCCP suggested active drug efflux in some isolates, decreasing the MIC against tigecycline for three
strains at the end of treatment (data not shown). However, CCCP also exerts other deleterious effect on bacterial
cells such as inhibition of biofilm formation and depolarisation of the membrane, which could also prevent the
antibiotic resistance [26].
3.3. Imipenem induction and expression of multidrug resistance determinants
To examine the effect of imipenem therapy on the emergence of efflux mechanisms, the transcriptional
level of acrA was analysed. A two-fold increase in mRNA expression was observed from the second
antibiotic exposure (P < 0.05), suggesting an active AcrAB– TolC efflux pump (Fig. 1).
omp35-like showed a low basal level of gene expression, which was maintained during all imipenem
inductions. Its homologue in Serratia marcescens (the 41 kDa OmpF [27]) had a tendency to reduce mRNA
expression during induction with imipenem, but this was not statistically significant (Fig. 2A,B).
The porin most related to carbapenem resistance was Omp36-like. Following imipenem induction, this porin had
a decrease in gene expression from the first passage, reaching a reduction of 78% at the fourth passage (Fig. 2B).
On the other hand, the 40 kDa OmpC (the Omp36 homologue in S. marcescens [27]) was not affected by
imipenem induction (Fig. 2D).
The effect of imipenem on gene expression was also evaluated by genus, separately. Although the same trend
to lower omp36 and higher acrA following induction was observed for each species, there was no statistical
significance (P > 0.05; data not shown). It is likely that the small number of isolates of Klebsiella pneumoniae (n
= 6), E. coli (n = 5) and E. cloacae (n = 3) does not support a minimal power to statistical tests.
35
36
3.4. Effects of imipenem induction on multidrug resistance regulators
mRNA expression of marA, the main MDR phenotype regulator, was induced by imipenem (P < 0.05).
mRNA levels were increased from the second passage with the antibiotic, reaching >10-fold induction at the
fourth passage (Fig. 3A). The SdeR regulator, which is only described in S. marcescens and has 40% genetic
similarity with MarA, had a gradual increase of mRNA levels following each imipenem exposure (Fig. 3B).
To evaluate the involvement of MarA in the establishment of a multiresistant profile with imipenem as an
inducer, the expression of marA was classified as low, intermediate or high according to the terciles of mRNA
expression (Fig. 3C–E). It was observed that high marA expression levels were associated with higher values of
acrA expression (Fig. 3C), suggesting an association between this regulator and a modulation of efflux pumps.
No significant associations were observed in omp35-like and omp36-like expression according to marA mRNA
levels (Fig. 3D,E).
OmpR, a specific regulator of porins, had a gradually increased expression from the beginning of treatment,
leading to a final significantly higher mRNA expression (Fig. 4A; P < 0.05), demonstrating that this
transcriptional regulator is affected by exposure to imipenem and could participate in the establishment of
membrane impermeability [28].
The correlation of gene expression of porins was analysed ac-cording to ompR mRNA levels grouped in low,
intermediate and high levels. Interestingly, a higher expression of omp35-like in the high ompR expression group
was observed (Fig. 4B; P < 0.05), but there was no correlation with omp36-like (Fig. 4C).
37
4. Discussion
Enterobacteriaceae are commensal Gram-negative bacteria that adapt easily to antibiotic therapy during treatment of
nosocomial infections. Imipenem remains a powerful antibiotic currently used in clinical practice and it is important to
elucidate its selecting activity and its role in the emergence of multidrug resistance. In this way, some clinical trials have
suggested an association between exposure to imipenem and the development of a MDR profile [1,2].
In this study, we evaluated molecular mechanisms involved in the activation of a MDR profile in clinical isolates of
Enterobacteri-aceae exposed to imipenem in vitro, focusing on modulation of the gene expression of porins, efflux pumps
and multidrug resistance regulators.
The multisensitive group had minor changes in the susceptibility to carbapenems following induction. On the other hand,
ESBL-and AmpC-producers had significant changes in susceptibility for the three studied carbapenems, reaching resistant
MIC values. Following induction, the ESBL group had increased MICs for carbapenems, mainly for ertapenem, which
reached an increase of up to 10 doubling dilutions. Establishment of this resistance may be related to the high prevalence of
CTX-M, since Girlich et al found that CTX-M contributes to decreased sensitivity to ertapenem [29]. Concordantly, Tsai et al
reported that the presence of ESBL and porin loss are related to ertapenem resistance. These authors recommend the use of a
carbapenem antibiotic other than ertapenem in these isolates [30]. Nevertheless, in the current study we showed that
carbapenem resistance increased for all carbapenems when ESBL-producers were induced by our experimental model in
vitro, suggesting a possible treatment failure in patients carrying ESBL-producing isolates if they are treated with imipenem.
Decreased expression of omp36-like was observed in isolates exposed to imipenem. Omp36-like is the main porin related
to membrane impermeability and carbapenem resistance, and porin loss is widely reported in isolates resistant to these
antibiotics [5–7,11]. There is limited information about the adaptive response of bacteria to treatment with imipenem
regarding porin loss, and a few studies focus on the evaluation of patients treated with long therapies of imipenem [31]. An
important extent of our experimental model is that the continuous exposures represent an early stage of induction with
imipenem. The results presented here demon-strate that the immediate defence of bacteria was a significant decrease in the
expression of this antibiotic entrance channel (Omp36-like), showing that as early as the first dose of the treatment,
regulatory mechanisms of the bacteria are activated to adapt to this new hostile environment.
Although low omp36-like expression affects the susceptibility to carbapenems, these results demonstrate that this
mechanism is not enough to explain carbapenem resistance. This is because porin absence was also found in susceptible
strains before imipenem induction.
By studying the expression of omp35-like, low mRNA levels were observed during all inductions without significant
changes in gene expression, showing that imipenem has no effect on this porin, and it has no contribution to the induction of
a carbapenem-resistant profile. Interestingly, a different behavior was observed for the S. marcescens OmpF, which was
slightly induced by the imipenem exposure, suggesting that imipenem may play a role in the establishment of a MDR profile
in this species through ompF modulation.
A low rate of porin loss was observed in this study, suggesting that this mechanism is not an immediate adaptive response,
being likely one of the last stages of adaptation of bacteria against a hostile environment (data not shown). In 2013, Lavigne
et al reported the establishment of resistance in Enterobacter aerogenes from patients treated with imipenem during the 3
months following the initiation of treatment. A change in porin balance (Omp35/Omp36) was observed in isolates with
intermediate susceptibility to imipenem, whereas porin deficiency was reported in isolates that became resistant to imipenem
38
[32]. In this way, the results of the current study are in agreement with that observed in E. aerogenes, responding to an initial
step of adaptive response to imipenem treatment.
Moreover, it is also likely that post-transcriptional factors play an important role in the establishment of impermeability
affecting protein expression of porins, as suggested by earlier studies where non-coding small RNAs, such as micC and micF,
are pro-posed to regulate porin expression [33]. However, further investigations are necessary to understand the role of post-
transcriptional regulation mediated by small RNAs as a mechanism of porin regulation and in the development of a MDR
profile.
Another determinant related to membrane impermeability and resistance in the Enterobacteriaceae family is increased
expression of efflux pumps such as AcrAB–TolC. The AcrAB–TolC pump is, so far, the main pump related to antibiotic
resistance. However, there is limited information about the role of imipenem on the expression of this efflux pump. An early
study evaluated the activity of the efflux pump in E. aerogenes when exposed to imipenem, re-porting increased efflux
activity [13]. We observed similar behavior in other Enterobacteriaceae species regarding acrA expression, with a significant
increase in gene expression, demonstrating that imipenem also induces changes in efflux pumps. Moreover, the differences in
acrA expression among the clinical isolates suggest the presence of other factors participating in the adaptive response to
imipenem (data not shown).
Previous studies suggest that increased transcriptional activity of the regulator MarA is associated with the activation of
various mechanisms related to a MDR phenotype, such as efflux pumps, outer membrane porins and other minor factors [34].
In S. marcescens strains, we evaluated the expression of a regulatory gene called sdeR, which is not well characterised but is
considered a homologue of marA in this species and also acts as a regulator of multidrug resistance and on the efflux pump
SdeAB [35]. In the current study, the S. marcescens sdeR regulatory gene had similar behavior to that observed for marA in
other Enterobacteriaceae species. Therefore, both transcriptional regulators were highly induced by imipenem.
Regulation of efflux pumps such as AcrAB–TolC by the transcriptional factor MarA has been extensively studied, but
there are a number of others regulators of acrA that exert their function inde-pendent of MarA modulation [36]. The high
correlation found between marA and acrA in the current study suggests that at an early stage in the development of a MDR
profile in response to imipenem, MarA is responsible for the increased expression of the efflux pump AcrAB.
At the initial stage of induction with imipenem, it was possible to observe that the transcriptional factor OmpR had a
quick and aggressive response against the hostile environment generated by the presence of the antibiotic. There are few
reports about porin control systems; however, the current results suggest that modulation of ompR is an immediate adaptive
response against imipenem exposure. In contrast, marA had no correlation with porin expression, showing a minor
contribution in its regulation.
Another adaptive response to antibiotic exposure is the induction of mutations in the genes for porins, efflux pumps and
regulators of impermeability, which could affect the development of high-level carbapenem resistance [11]. In this study, we
did not evaluate mutations as a possible mechanism of the adaptive response of clinical isolates, which could be considered a
limitation of our work. Nevertheless, theses mutations are frequently related with longer time antibiotic exposure compared
with those used in our work (four passages) [37], which was focused on the adaptive mechanisms ob-served at the beginning
of imipenem therapy mainly related to the modulation of gene expression.
5. Conclusions
Imipenem induction is an important factor in the development of resistance to carbapenems and other unrelated
antibiotics, leading to a MDR profile in clinical isolates. Imipenem modulates at an early stage of treatment, the gene
expression of determinants of membrane impermeability. However, the lack of porins is not enough to explain the resistance
to carbapenems in isolates without carbapenemases; therefore, further studies are needed to better understand these
mechanisms.
This work contributes to the understanding of the molecular behavior of clinical isolates in an adaptive response to
imipenem therapy, which is essential to elucidate possible contributions to treatment failure.
Acknowledgments
The authors thank Mario and Rosario Hirata for technical support during execution of the molecular biology experiments.
Funding: This study was supported by grants from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
[protocol #481372/2011-3] and Dirección de Investigación, Universidad de La Frontera (DIUFRO) [protocol #DI15-0070].
MP and AC were recipients of fellowships from Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT),
Chile. CV was the recipient of a fellowship from CNPq, Brazil. LMdA was the recipient of a fellowship from Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Brazil.
39
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