GENETICA

sub1.APARATUL GENETIC AL CELULEI

Structurile celulare care contin ADN (nucleul si mitocondriile) precum si cele care intervin in realizarea fct sale (ribozomii si central cellular) alc aparatul genetic al celulei.

NUCLEUL INTERFAZIC: nucleul=component principal a ap genetic(99,5 % din ADN-ul cel) si rep central de comanda si control al active celulei eucariote.

Nucleul interfazic este alc din: mb nuclear, nucleoplasma, cromatina si nucleoli.

Membrana nucleara: mb dubla, prevazuta cu pori; foita externa continua RER si prez ribozomi pe fata citoplasmatica; foita interna, lipsita de ribozomi, contine o retea fibroasa, densa=”lamina fibrosa” sau “lamina nuclear” care asigura disparitia si refacerea mb in fct de etapele ciclului cellular. La niv porilor foita ext se cont cu cea int; intre cele 2 mb exista spatial perinuclear/intermediary ce comunica direct cu lumenul RE.

Nucleoplasma: interactioneaza cu nucleolul si cromatina

Nucleolul: e alc din pct de vdr chimic din protein(90%), ARN(7%) si ADN(3%).

La ME se disting 3 componente ale nucleolului:

1. Comp granular- dominant, rep de precursorii nucleolului2. Comp fibroasa- alc din fb de ADN pe care se sintetizeaza ARN-ul ribosomal3. Comp amorfa- umple spatiile dintre comp granular si fibroasa

Cromatina = nucleoproteina alc in principal din ADN si protein histonice si ARN, protein acide, lipide, ioni de Ca si Mg. Cromatina rep forma relaxata a cromozomilor. Cromozomii sunt elem constant ale nucleului, dar se vad doar la MO in diviziune, pt ca in interfaza cromozomii sunt despiralati.

La MO, cromatina se prezinta sub 2 forme:

1. sub2.EUCROMATINA – active genetic, formata din gene structural pe care se face transcriptia, contine AND nerepetitiv, se replica precoce; este necondensata, se coloreaza slab cu coloranti bazici

2. sub3.HETEROCROMATINA – inactive genetic, nu este transcriptibila, contine ADN repetitive, ce se replica tardiv; este condensate si se coloreaza intens cu coloranti baziciSe disting 2 tipuri de heterocromatina: a. Heterocromatina constitutiva: cromatina constant condensate in interfaza(cromocentrii),

inactive genetic, nu contine gene structural, nu se face transcriptia pe eab. Heterocromatina facultativa: cromatina condensate ce contine gene represate in anumite

per ale dezvoltarii si numai in anumite tipuri de cel. In fct de tipul de cromozomi ce le apartine, este de 2 tipuri:I. Heterocromatina autozomala- coresp portiunii condensate ale autozomilorII. Heterocromatina gonozomala – coresp cromatinei seuale X si Y

1

GENETICA

La ME, cromatina se prez ca o retea de filam spiralizate si condensate neregulat.

sub4.INTERFAZA:

Interfaza=per cuprinsa intre 2 diviziuni successive, in care se desfasoara toate active specific unei cellule

Are 3 etape: faza G1(presintetica), faza S(de sinteza) si faza G2postsintetica)

1. Faza G1: (gap=interval)- sunt sintetizate subst necesare cresterii si functionarii cel. Cromozomii sunt despiralizati, monocromatidieni, alc dintr-o sg mol de ADN. Cand de mat genetic este 2C mol de ADN sub forma 2n(46) cromozomi. Faza G1 e subdivizata in subfaza G1A( se acumuleaza subst necesare pana la o concentratie prag=punct de restrictive(R) ) si subfaza G1B(cel se preg sa intre in faza S).Daca nu se depaseste pct de restrictive, cel din G1A trec in G0 sau G1Q(quiescent=inert) de active metabolic redusa, raman viabile timp indelungat.Daca dispar conditiile respective, cel din G0 pot reveni in G1 pt ca isi pastreaza capac de diviziune.Unele cel din G1A parasesc definitive ciclul cellular si trec in G1D, a cel differentiate care nu se mai divid.

2. Faza S (synthesis=sinteza) in care are loc sinteza de ADN si de histone; aici se dubleaza cant de material genetic, 4C, conditie obligatory pt desfasurarea diviz celulare; nr de cromoz va ramane set diploid 2n=46, dar vor fi bicromatidieni, ce contin 2 mol identice de ADN.

3. Faza G2: se carac prin sinteza de protein specific si cant mica de ADN , necesar in proc de corectare a erorilor de replicare; cand de ADN ramane nemodificata(4C) iar cromozomii in set diploid sunt bicromatidieni si despiralatiSpre finalul fazei G2 se activeaza fact de declansare al mitozei (MPF) care det condensarea filam de cromatina in cromozomi si form fusului de diviz.

sub5.Celulele rezultate dupa diviziune pot evolua in 3 directii: proliferare, diferentiere si trecerea in stadiu de repaus.

PROLIFERAREA-cel care se divid repetat alc comp proliferative si se gas in tesuturile embrionare, maduva hematogena, stratul bazal al epidermului, etc

DIFERENTIEREA- cel pararesc ciclul cellular si se transforma in cel specializate, care nu se mai divid. Ex: neuronii, hematiile mature.

STADIUL DE REPAUS- cel care intra in faza G0 au active metab redusa dar isi pastreaza capac de diviz si form comp neproliferativ(cel stem); acestea isi pot relua ciclul cellular sub act unor subst mitogene(fitohemaglutinina).

Pt buna desfasurare a ciclului cellular exista 3 pct de control:

1. G1/S in care se decide progresia ulterioara prin faza S2. G2/M in care se decide intrarea cel in mitoza3. M in care diviziunea se opreste si este verificata alinierea perfecta a cromozolilor

2

GENETICA

sub6.MITOZA-ANAFAZA:

Au loc 3 fenomene:

1. Clivarea longitudinal a centromerului-ruperea puntilor de heterocromatina dintre kinetocori2. Disjunctia(segregare) cromatidiana-separarea celor 2 cromatide surori prin scurtarea

microtubulilor kinetocorali3. Migrarea simultana, cu aceasi viteza a cromoz monocromatidieni spre polii cel; rez va fi imp

totala si egala a materialului genetic intre cel fiice

sub7.ACCIDENTE IN ANAFAZA MITOZEI

Uneori fen genetice din anafaza sunt perturbate rezultand eorri de distributie a materialului genetic in cel fiice.

1. Clivarea transversal a centromerului: urmata de formarea unor cromozomi alc numai din barte scurte ip sau numai din brate lungi iq; daca celelalte fen anafazice decurg normal vor rezulta 2 cel fiice cu acelasi nr de cromoz, dar inegale intre ele

2. Nedisjunctia cromatidiana- urmata de nesepararea cromatidelor surori care migreaza la acelasi pol; vor rezulta 2 clule fiice diferite intre ele si de cel mama. O cel va fi trisomica(47 cromoz) si cealalta monosomica(45 cromoz)

3. Intarzierea anafazica- migrarea lenta a unui cromoz monocromatidian, care va ramane in afara nucleului cel fiice in mom formarii mb nucleare; ei form micronuclei care dispar in urmatoarea diviz. O cel fiica va fi identical cu cel mama(46 cromoz) si cealalta va avea 1 cromoz in minus(45 cromoz)

4. Absenta citokinezei- daca nu se produce citokineza va rezulta o cel tetraploida(4n) cu cromoz monocromatidieni(4C). acest process este numit endomitoza si e intalnit in regenerarea hepatica.

Erorile de distrib a mat genetic in mitoza det aparitia unor anomalii de nr si structura ale cromoz in cel somatic. Prezenta in acelasi organism a unor linii celulare se num mosaic cellular.

Sub8.MEIOZA I-PROFAZA

Cuprinde 5 stadii:

1. LEPTOTEN-prin condensarea fb de cromatina, cromozomii devin vizibili ca filam lungi si subtiri, asezati in talomeri la mb nuclear; cromoz sunt bicromatidieni, la MO nu se disting cele 2 cromatide

2. ZIGOTEN- cromozomii omologi(matern si patern) se aproprie cu cromatidele paralele, fen numit conjugarea cromozomilor sau sinapsa. Astfel se realizeaza o aliniere “gena la gena” a cromoz, care form bivalenti sau tetrad. Bivalentii se form pt autozomi si cromozomii X la sexul F. La sexul M, cei 2 gonozomi nu sunt omologi si de aceea fac sinapsa prin telomerii bratelor scurte, unde form vezicula sexual.

3

GENETICA

3. PAHITEN- cromozomii se scurteaza si se ingroasa; devin vizibile niste puncte intens colorate=cromomere, a caror nr si pozitie sunt caract fiecarui cromozom. Dispozitia lor coincide cu cea a benzilor G.Catre sf pahitenului, o cromatida a unui omolog trece peste cromatida celuilalt, fenomen=incrucisarea omologilor sau crossing over. La acest niv, cromatidele care nu sunt surori se rup si are loc schimb reciproc si egal de fragmente cromozomice, fenomen=recombinare intracromozomiala sau genica=> un fragment de cromatida dp un cromozom matern face schimb cu omologul sau patern rez o noua combinative de gene de la ambii parinti.Recombinarea genica este o importanta sursa de variabilitate, dat noilor combinatii ce apar si se transmit la descendenti. La om se produc 1-3 recombinari pe cromozom. Rareori schimbul de fragm e inegal rezultand deletia sau duplicatia unor gene.

4. DIPLOTEN- cromozomii se vor separa, dar raman uniti la niv unor puncte=”chiasmate”. Chiasma rep fenomenul optic prin care se localizeaza incrucisarea cromozomica

5. DIAKINEZA- are loc terminarea chiasmatelor, adica alunecarea chiasmatelor in lungul cromatidelor. In aceasta etapa se evidentiaza clar bivalentii la MO, cu cromatidele surori unite prin centromer si cromatidele nesurori unite prin chiasma.

Sub9.MEIOZA I-ANAFAZA

- Disjunctia cromozomilor-separarea cromozomilor omologi- Migrarea simultana, cu aceasi viteza a cromoz omologi bicromatidieni catre polii opusi ai cel

Fen genetice din anafaza I au drept consecinte:- Reducerea nr de cromozomi, din set diploid(2n) in set haploid(n)- Fiecare cel va avea doar un cromozom din perechea de omologi, matern sau patern; sta la baza

primei legi a lui Mendel, legea segregarii- Separarea fiecarei perechi de cromozomi e aleatorie- Asortarea independent a cromoz poarta numele de recombinare intracromozomiala- Fen de recombinare intra- si inter-cromozomiala explica marea variabilitate a gametilor=legea 2

Mendel, referitoare la combinarea libera a “factorilor ereditari”- Prin fecundarea pe baza de probabilitate a gametilor feminine cu cei masculine rezulta zigoti

diferiti din pct de vedere genetic, iar indivizii sun tunicate genetice.

Sub10.MEIOZA II-ANAFAZA

Au loc:

1. Clivarea longitudinala a centromerului2. Disjunctia cromatidiana3. Migrarea simultana, cu aceasi viteza a cromozomilor bicromatidieni catre polii celulei

4

GENETICA

Sub11.ACCIDENTE IN ANAFAZA MEIOZEI I

- Nedisjunctiacromozomiala urmata de meioza II =>formarea de gamete disomici si nulisomici. Gametii disomici au in cazul perechii afectate un cromozom matern si unul patern

- Intarzierea anafazica urmata de o meioza II normal=> formarea de gamete normali si nulisomici- Nesepararea ovocitelor de gradul II=> formarea de gamet diploid, care prin fecundarea cu un

gamet normal det aparitia unui zigot triploid(3n), neviabili.

Sub12.ACCIDENTE IN ANAFAZA MEIOZEI II

- Nedisjunctia cromatidiana=> formarea de gamete disomici si nulisomici. Gametul disomic contine 2 cromozomi cu aceasi oriine: maternal sau paterna, fen=disomie uniparentala

- Intarziere anafazica=> form de gamete normali si nulisomici

Gametii disomici dupa fecundare cu gamete normali form zigoti trisomici. Gametii nulisomici dupa fecundarea cu gamete normali formeaza zigoti monosomici

Accidentele anafazice vor det aparitia de gamete cu anomalii de nr de cromozomi, care dupa fecundarea cu gamete normali, duc la aparitia unor zigoti anormali. Prezenta anomaliiilor cromozomiale in toate cel organismului se num=anomalie omogena.

Sub13.MORFOLOGIA CROMOZOMILOR

Sub14.PROTOCOLUL EVIDENTIERII CROMOZOMILOR

In cel somatic exista in mod normal 46 cromozomi care form 23 perechi: 22 perechi autozomi si o pereche gonozomi: XX-la femeie, XY-la barbat.

Pentru evidentierea cromozomilor umani se parcurg 3 etape:

a. Obtinerea de cellule in diviziuneb. Oprirea diviziunilor in metafazac. Obtinerea preparatelor microscopic1. Obtinerea de cellule in diviziune:- Se realizeaza direct prin recoltarea de tesuturi care se divid activ: maduva hematogena, tumori,

sau indirect: culture de cellule. - Metoda directa este rapida, dar prez riscul de obtinere unui nr mic de metafaze- Metoda indirect este mai des folosita si cultura de limfocite este cel mai frecvent utilizata, pt ca

dureaza numai 3 zile si poate fi stimulate pt a obtine un indice mitotic crescut- Celelalte metode directe sau indirect: maduva osoasa hematogena, fibroblasti, cel din lichidul

amniotic, vilozitati coriale si tumori, au indicatii particulare si prez dificultati de prelevare sau cultura

- Cultura de limfocite din sangele periferic se realizeaza in 3 timpi: recoltarea de sange, prin punctie venoasa; insamantarea mediului de cultura; mentinerea la thermostat la 37oC, timp de 72h

5

GENETICA

2. Oprirea diviziunilor in metafaza- Este identical pt toate tipurile de cel recoltate- Pt oprirea diviziunilor in metafaza, cel mai des este folosita colchicina si derivatii sai.- Dupa adaugarea colchicinei, cultura se va mentine la thermostat timp de 2 h- Ea va distruge fusul de diviziune, iar cromozomii din placa metafazica sunt bine individualizati3. Obtinerea preparatelor microscopic: presupune mai multi timpi:- Hipotonizarea: se adauga peste sediment o solutie hipotona(KCl 0,075 M) si se introduce la

thermostat pt 20-30 min; solutia hipotona patrunde in cel si disperseaza cromozomii- Fixarea: se adauga peste sediment un amestec fixat din alcool etilic absolute si acid acetic

glacial, in proportie de 3:1, pt 2-3 min; fixarea presupune intreruperea vietii cel, dar cu pastrarea structurii morfologice; se fac 2-3 fixari pt fiecare preparat

- Etalarea: sedimentul se resuspenda intr-un mililitru de fixator proaspat si cu aj unei pipette se dispune pe o lama portobiect; astfel se obtin preparate definitive, care pot fi folosite atat printr-o colorare uniforma cat si pt bandare

- Colorarea: pt o colorare uniforma se fol coloranti bazici: solutie Giemsa- Examinarea: initial se vor selecta cele mai bune metafaze, care ulterior vor fi studiate cu

obiectivul cu imersie

Pt studierea anomaliilor de nr si structura sunt necesare 20 de metafaze (daca nu exista abateri de la normal) si 30 de metafaze( cand sunt depistate anomalii omogene sau mozaicuri).

Exista 2 metode de a studia o metafaza, in fct de dotarile lab. Fie se fotografiaza metafaza si apoi se decupeaza cromozomii, fie se capteaza imaginea de la microscop in calculator si apoi se analizeaza cu aj unui soft automat sau semiautomat.

Dispunerea sistematizata a cromozomilor unei cellule somatic in perechi si grupe de cromozomi, pe baza criteriilor morfologice, in ordinea descrescatoare a marimii lor se numeste cariotip.

Pt cazurile normal sunt necesare 2-3 cariotipuri, iar in prezenta anomaliilor de nr sau structura sunt necesare mai multe; cel putin 2 cariotipuri pt fiecare linie celulara.

Sub.15.TEHNICI DE GENERATIA A II-A ANALIZA CROMOZOMIALA

=tehnici de marcaj cromozomial in benzi

- Folosind o serie de tratamente si/sau coloratii special a ADN-ului se vizualizeaza pe cromozomi metafazici o structura specifica de benzi alternative intens colorate si putin colorate. Se evidentiaza 300-400 benzi pt un set haploid de cromoz metafazici.

- Permit identificarea precisa a fiecarui cromozom si caracterizarea maj anoamlilor cromozomiale(exceptand microdeletiile)

Sub16. TEHNICI DE GENERATIA A III-A ANALIZA CROMOZOMIALA

6

GENETICA

=Tehnici de marcaj de inalta rezolutie

- Studiaza cromozomii in primele faze ale diviziunii, cand sunt mai putin condensati- Fiecare banda din cromozomii metafazici poate fi astfel subdivizata in mai multe subbenzi- Se pot identifica 550 sau 850 benzi, coresp prometafazei sau profazei. Fiecare banda coresp

probabil la 20-30 gene, aceasta fiind limita maxima de rezolutie in analiza citogenetica conventional

- Aceste tehnici permit evidentierea unor modificari mici la str cromoz(ex: microdeletiile)

Sub17. TEHNICI DE GENERATIA A IV-A ANALIZA CROMOZOMIALA

=tehnici de citogenetica molecular

- Se folosesc “ sonde” de ADN monocatenar, specific unui anumit cromozom, regiuni cromozomiale sau unor gene cu localizare cunoscuta in anumite zone

- Sondele se fixeaza(hibridizeaza) prin complementaritate in aceste situsuri “tinta”- Pt a putea fi evidentiate, sondele sunt marcate cu un fluorocrom(vizibil la microscopul cu lumina

UV)- Se mai numeste: hibridizare fluorescent in situ sau, prescurtat FISH( de la Fluorescence In Situ

Hybridization)- FISH e o metoda performanta dar dificila si scumpa. Are indicatii precise si nu se substituie

celorlalte tehnici citogenetice.- Se foloseste pt: suspiciunea clinica/citogenetica a unei microdeletii sau microduplicatii, a unor

translocatii criptice sau deletii telomerice; detectia sexului genetic sau a unor aneuploidii in nuclei interfazici; caract unor remanieri complexes au a unor cromozomi marker, mai ales in cel tumorale; detectarea unor secvente de la Y la barbatii XX; evaluarea unui mozaicism

Sub18. CRITERII DE IDENTIFICARE A CROMOZOMILOR

1. Lungimea cromozomului, rep de: lungimea absoluta(exprimata in micron), lungimea relative(exprimata in procente din lungimea unui set haploid normal, in care gonozomul este X)

Lr= p+q22autozomi+X

x 1000

In fct de lungime cromozomii se imp in: mari, mijlocii si mici

2. Pozitia centromerului, se apreciaza prin indicele centromeric(IC):

IC= pp+q

x100

3. Raportul dintre brate(R):

R=qp

4. Satelitii, rep la om pe bratele scurte ale cromozomilor acrocentrici din grupa D(13,14,15) si grupa G(21,22), cu exceptia gonozomului Y

- Nr si marimea satelitilor variaza de la o pers la alta.

7

GENETICA

- Se noteaza cu s, dupa nr si bratul cromozomului- Ex: 13ps5. Constrictiile secundare=reg cromozomice despiralizate de diferite marimi, prezente inconstant in

zona juxtacentromerica a bratelor lungi ale cromozomilor 1,9,16; f rare pe alti cromozomi- Se noteaza cu h, dupa nr si bratul cromozomului- Ex: 1ph6. Situsurile fragile=regiuni cromozomice la niv carora se produc mai frecvent rupture- Situsul fragil poate fi evidentiat prin adaugarea in culturile de cel de agenti antifolati, capabili sa

produca rupture cromozomice la acest nivel- Maj situsurilor fragile sunt considerate marker normali- Exceptie: FRAXA situate pe bratul lung al cromozomului X(Xp27), asociat cu retard mintal

(sindromul X fragil)- Studii sugereaza ca unele situsuri ar putea avea un rol in progresia tumorala: rupturile in aceste

situsuri produc inactivarea unor gene supresoare de tumori7. Marcajul in benzi

Sub19. MARCAJUL PE BENZI= metoda de identificare a perechilor omologi, deoarece dupa tratarea chimica sau termica a preparatelor se pot evidential de-a lungul cromatielor benzi, care au aceeasi dispozitie pe cromozomii omologi. Exista 2 categorii de benzi:

1. Benzi care marcheaza intreg cromozomul:a. Benzi Q-se obt in urma colorarii metafazelor cu fluorocrom; are dezavantajul ca preparatele

nu sunt permanente si necesita un echipament special de microscopie; este utila pt analiza cromozomului Y

b. Benzi G-se obt prin digestive controlata cu tripsina, urmata de col cu Giemsa; tehnica este relative simpla si frecvent fol; benzile G au aceasi distributie ca si benzile Q fluorescente

c. Benzi R- au o dispozitie inversa benzilor G si Q; se obt prin denaturarea tehnica controlata(85o) a preparatelor intr-o solutie salina, inaintea col cu Giemsa

2. Benzi care marcheaza anumite regiuni:a. Benzi C- rep de heterocromatina constitutive din reg centrometrice caract pt fiecare

cromozom; permite evidentierea variantelor individuale sau familial ale constrictiilor secundare si reg centrometrice

b. Benzi T- evidentiaza telomerii. Bandarea T permite depistarea modificarilor de la niv extreme cromozomilor

c. Benzile NOR- marcheaza reg organizatorilor nucleolari, coresp satelitilor cromozomilor acrocentrici

In citogenetica se realizeaza mai intai marcaj genetic, apoi in fct de tipul anomaliei remarcate se poate aplica un marcaj coresp reg afectate

8

GENETICA

Fiecare cromozom e alc dintr-o alternanta de benzi positive, colorate si benzi negative, necolorate; secventa benzilor este o caracteristica a specie, fiind aceeasi pt toti indivizii specie si in toate celulele organismului.

Unele benzi sunt bine delimitate si colorate=benzi reper, care delim reg de-a lungul cromozomului

Regiunile si benzile sunt numerotate cu cifre arabe, de la centromer la telomeri pt fiecare brat

Nomenclatura: nr cromozomului, simbolul bratului, nr reg, nr benzii, subbenzile

Exemplu: 21q22.1=cromozomul 21, brat lung, regiunea 2, banda 2, subbanda 1

Pe baza marcajelor Q,G,R,C s-au stability prezenta a 320 de benzi per set haploid. In metafaza se evidentiaza 300-450 benzi, prometafaza 550-850 si in profaza pana la 1000 de benzi, utilizand tehnici de inalta rezolutie.

Sub20. GRUPA A DE CROMOZOMI

- Perechile 1,2,3: cromozomi mari, 1 si 2- M, 3-SM- Cromozomul 1 este cel mai mare si poate avea o constrictive secundara pe bratul lung langa

centromer(1qh)

Sub21. GRUPA B DE CROMOZOMI

- Perechile 4 si 5: cromozomi mari si SM- Bratele scurte ale cromozomului 4 sunt mai mari decat bratele scurte ale cromozomului 5

Sub22. GRUPA C DE CROMOZOMI

- Perechile 6-12, X: cromozomi mijlocii si SM: grupa cu nr variabil de cromozomi, in fct de sex: 15 la M si 16 la F

- Daca nu se utilizeaza marcajul in benzi se vor ordona in fct de marime, descrescator si de pozitia centromerului

- Cromozomii 8,10,12 au centromerul evident submedian

Sub 23. GRUPA D DE CROMOZOMI

- Perechile 13,14,15: cromozomi mijlocii, acrocentrici- Toti cromozomii pot prezenta sateliti pe bratele scurte: 13ps,14ps,15ps

Sub 24. GRUPA E DE CROMOZOMI

- Perechile 16,17,18: cromozomi mijlocii- Perechea 16-M, poate avea o constrictive secundara pe q, langa centromer(16qh)- Cromozomii 17 si 18 sunt SM- Bratele scurte ale cromozomului 17 sunt mai mari decat bartele scurte ale cromozomului 18

9

GENETICA

Sub 25. GRUPA F DE CROMOZOMI

- Perechile 19,20: cromozomi mici, metacentrici

Sub 26. GRUPA G DE CROMOZOMI

- Perechile 21,22,Y: cromozomi mici, acrocentrici- Grupa cu nr variabil de cromozomi, in fct de sex: 4-F si 5-M; perechile 21 si 22 pot prezenta

sateliti pe bratele scurte: 21ps, 22ps

Sub27. HETEROMORFISMUL CROMOZOMILOR

- Prin dif tehnici s-au studiat variatii in morfologia cromozomilor omologi de la un individ sau la pers diferite=heteromorfism cromozomic, iar cromozomul care se deosebeste de omologul sau este considerat a fi un cromozom marker.

- Deoarece reg cromozomice heteromorfice sunt arii de heterocromatina, bogate in ADN repetitive si inactive genetic, marimea lor variabila este fara consecinte fenotipice

- Unele studii arata totusi o frecventa mai mare a acestor variante heterocromatinice la cuplurile cu avorturi spontane repetate sau in grupul pers cu retard mintal; semnificatia acestui fen este necunoscuta.S-au descries 4 tipuri majore de heteromorfism cromozomic:1. Marime cromozomului Yp(10% din barbatii normali au un Y mai lung sau mai scurt)2. Marimea heterocromatinei centromerice (benzi C) sau juxtacentromerice ( mai ales la

cromozomii 1,9,16)3. Polimorfismul satelitilor4. Situsurile fragile induse de antifolati(peste 5% din populatie are 60 de tipuri diferite de

situsuri)

Fiecare pers poseda un heteromorfism particular(are cel putin un cromozom marker) cu aceasi valoare ca si amprentele sale. De obicei, markerul se transmite nemodificat de la parinte la copil, putand fi folosit uneori in det paternitatii.

Sub 28. INDICATIILE CARIOTIPULUI

Analiza cromozomilor umani este esentiala pt diagnosticul urm circumstante:

1. Diagnosticul prenatal indicat in dif situatii:- Varsta maternal peste 35 ani in momentul conceperii- Un parinte purtator al unei anomalii cromozomiale de structura echilibrate- Cuplu care are déjà un copil cu o anomalie cromozomiala de structura neechilibrata- Stabilirea sexului copilului, in cazul in care mama este heterozigota pt o gena anomala recesiva,

cu transmitere legata de X2. Rudele de gradul I ale pers cu anomalii cromozomiale de structura

10

GENETICA

3. Cupluri cu sterilitate primara, in special la femei cu amenoree priamara si la barbate cu spermograma anomala, la care se pot depista o anomalie a gonozomilor sau o anomalie structural echilibrata

4. Avorturi spontane repetate in primul trimestru de sarcina sau NN morti dat unor anomalii cromozomiale de structura echilibrate. Efectuarea cariotipului la produsii de avort poate identifica fie o anomalie de nr , poliploidie sau aneuploidie, fie o anomalie de structura neechilibrata : deletie, izocromozomi, duplicatie, cromozom inelar

5. Intarzierea pubertatii, din cauza necunoscuta, in specil la fete cu talia mica sau baieti cu talia mare, pt identificarea unei anomalii gonozomice

6. Stari intersexuale pt stabilirea concordantei intre sexul genetic si sexul civil si eventualele anomalii gonozomice

7. Sindroame plurimalformative cu/fara retard mintal, de preferat marcajul in benzi, FISH, pt identificare si a anomaliilor structural mici. Cariotipul este obligatoriu si in situatiile in care diagnosticul clinic este clar pt precizarea tipului de dezechilibru si acordarea sfatului genetic

8. Retardul mental, cu sau fara tulburari de comportament, cand sidentifica microdeletii telomerice sau situsul X fragil

9. Cancere care sunt insotite de anomalii cromozomiale de structura dobandite. Ex: leukemia mieloida cronica poate fi identificat cromozomul Phi sau un alt tip de translocatie; in retiniblastom exista o deletie 13q-, iar in tumora Wilms deletia 11p-

10. Expunerea la actiunea unor agenti mutageni, pt identify unor anomalii de structura neechilibrate, dobandite de tipul cromozomilor in inel sau dicentrici.

Sub 29. TESTUL BARR

1. Recoltarea: se recomanda clatirea gurii cu apa inaintea examinarii. Apoi se recleaza cu aj unei lame rodate pe fata int a obrazului si se indeparteaza stratul de mucus sic el epiteliale din structurile superioare ale epidermului, dp lama cu un tampon de tifon. Se recleaza din nou, in aceasi zona, pt a preleva cel din stratul spinocelular, care au nuclei bine conturati si se realizeaza un frotiu. :a copii reclarea se face pe fata int a buzei inf

2. Fixarea: imediat se introduce frotiul in fixator, format din alcool etilic absolute si acid acetic glacial, in proportie de 3:1. Durata fixarii este de 30 min si maxim 24 h

3. Hidratarea: se realizeaza prin trecerea succesiva a lamelor prin 2 bai de alcool etilic 70%, 50% si 2 bai de apa distilata, cate 5 min pt fiecare baie.

4. Colorarea: se pun cateva picaturi de colorant Barr pe lama, timp de 1-2 min. Excesul de colorant poate fi indepartat cu alcool etilic absolute.

5. Examinarea: cu obiectivul cu imersie se pot aprecia caracterele morfologice ale cromatinei sexual X si frecventa ei

Sub30. CORPUSCULUL BARR-DESCRIERE, VARIATII DE NUMAR SI MARIME

- In cel epiteliale ale mucoasei bucale, cromatina X se prez sub forma unui cromocentru intens colorat bazofil, sit pe fata int a mb nucleare , ovalar sau plan convex, cu marime medie de 1 micron=corpuscul Barr

11

GENETICA

- Variatii de marime: se datoresc variatiilor de marima a cromozomului X inactivat. Ex: in cazul izocromozomilor X pe brate scurte si lungi, corpusculul Barr va fi mai mic de 1 micron si respective mai mare de 1,5 microni

- Toti nuclei celulelor provenite de la pers normale de sex feminine ar trb sa aiba un corpuscul Barr. Practic, procentul cellular “chromatin X positive” este cuprins intre 15-35% dat: calitatii improprii pt analiza a unor nuclei si actiunii unor factopri celulari care produc decondensarea cromozomului X fara a afecta insa inactivarea lui. Pt stabilirea corecta a frecventei se numara cel putin 300 de nuclei.

- Nr de corpusculi Barr=cu suma cromozomilor X-1. Astfel, se pot preciza nr cromozomilor X si diagnostic, simplu si repede, sexul genetic si diferite anomalii numerice: X0, XXX, XXY, etc

Sub 31-CROMATINA SEXUALA Y

- In cel provenite de la o pers de sex masculine se poate evidential prin coloratia cu dif fluorocromi(quinacrina) si examinare microscopic in lumina UV, un corpuscul intens fluorescent=corpusculul F

- El rep aspectul interfazic al celor 2/3 distale a bratului lung al cromozomului Y, alc din heterocromatina intens fluorescent

- Marimea medie a corpusculului F este de 0,25 microni. Frecventa variaza in fct de tesutul examinat, intre 50-80% daca este examinat imediat dupa colorare.

- Nr de corpusculi F=nr cromozomilor Y- Variatii de nr: depind de variatiile de nr ale cromozomului Y- In lab cu dotari pt FISH se fol sonde marcate fluorescent pt X si Y care permit evidentierea mai

precisa a prezentei si nr de cromozomi sexuali in nuclei interfazici

Sub 32-TIPURI DE ANOMALII CROMOZOMIALE DE NUMAR

Anomaliile cromozomiale numerice sunt modificari ale numarului de cromozomi in raport cu nr rapid diploid(2n) de 46 cromozomi. Anomaliile numerice se clasifica in : poliploidii si aneuploidii

POLIPLOIDII=prezenta in plus a unuia sau mai multor seturi haploid de cromozomi. Singurele poliploidii identificate la om sunt:

1. Triploidia(3n=69 cromozomi)- cauza cea mai frecventa este dispermia=fecundarea unui ovul de catre 2 spermatozoizi; mai rar triploidia rezulta prin fertilizarea unui gamet normal(n) de catre un gamet diploid(2n): spermatozoid(diandrie) sau ovuldiginie)

2. Tetraploidia(4n=92 cromozomi)- se prod printr-o eroare in prima diviziune a zigotului: ADN a fost replicat si cant totala devine 4C, dar nu are loc diviziunea

ANEUPLOIDIILE=prezenta in plus sau absenta unuia mai multor cromozomi

1. Monosomiile=anomalii caracteriate prin prezenta intr-o celula somatic a unui sg cromozom, in locul unei perechi de cromozomi(2n-1). Monosomiile autozomale sunt complet letale; sg monosomie compatibila cu viata este monosomia X

12

GENETICA

2. Trisomiile: prezenta intr-o celula somatic a 3 exemplare ale aceluiasi cromozom in locul perechii normale de cromozomi omologi(2n+1). La om, maj trisomiilor sunt complet letale, ducand la avorturi spontane precoce. Singurele exceptii sunt trisomiile autozomale: 21,18,13,8 si cele gonozomale(XXX, XXY, XYY)

In cazul anomaliilor gonozomale sunt posibile tetrasomiile(48,XXXX; 48,XXYY; 48,XXXY ) sau chiar pentasomiile ( 48, XXXXX; 49, XXXXY ).

Dezechilibrul genetic det o serie de “semen commune”: tulburari de crestere prenatala si postnatala, dismorfie facial, retard mintal, dermatoglife anormale, tulburari ale fct gonadale, anomalii congenital majore multiple, displazii; cunoasterea lor poate orienta un diagnostic spre categoria “ boli cromozomiale”.

Sub 33-SINDROMUL DOWN-ASPECT CLINIC

Sindromul Down este cea mai frecventa boala cromozomiala si a fost descrisa clinic de john Langdon Down in 1866, dar abia in 1959 Jerome Jejeune si colaboratorii au stability ca afectiunea este produsa de trisomia 21.

Incidenta trisomiei 21 a fost estimate la 1:650-1:800 NN vii. Boala este frecventa la copii de sex masculine. Deobicei este diagnosticat clinic in perioada neonatal sau la sugari care au fenotip characteristic.

Copil cu trisomie 21 are talia si greutatea sub media varstei, prezinta hipotonie muscular, hiperlaxitate articulara, reflexe comportamentale reduse.(ex: Moro)

Dismorfii cranio-faciale: microcefalia, brahicefalia cu occiput turtit si fontanele largi. Facies characteristic: fantele palpebrale oblice in sus si in afara, hipertelorism, epicantus, irisul pestrit, nas mic cu radacina turtita si narine mici si anteversate, gura deschisa si protruzie lingual, urechile mai jos situate, mici si displazice. Gatul este scurt, cu exces de piele pe ceafa, maini scurte, cu bradidactilie, clinodactilia degetului 5 si frecvent, un sg pliu de flexie palmara, iar spatial interdigital 1 la picior este mult mai larg.

Dermatoglifitele anormale: pliu palmar transvers unic, exces de bucle cubitale, triradius axial situate distal, etc

Niciunul dintre aceste semen, luate separate, nu este relevant, numai in asociere cu celelalte semen permite diagnosticul de sindrom Down.

Unii copii pot prezenta diferite malformatii visceral: cardio-vasculare, digestive, renale. Malformatiile cardiac afecteaza 40% din NN , majoritatea fiind defecte septale. Malformatiile digestive(3-5%) mai frecvente sunt atreziile sau stenozele duodenale si megacolonul.

13

GENETICA

In anul 2 de viata devine evident intarzierea psiho-motorie: toate active se fac cu 2-3 ani mai tarziu decat normal; mers e mult timp nesigur, iar vorbirea relative simpla. Copii sunt insa linistiti, ascultatori, au o personalitate atragatoare, iubesc anturajul si muzica

Sindromul se asociaza intotdeauna cu un retard mintal si tubulrari de limbaj. Un bolnav de sindromul Down poate acumula un nivel max de cunostinte comparabil cu al unui copil normal de 6-8 ani si nu este capabil de o viata independent.

Ritmul de crestere este redus sit alia va fi cu >- DS sub media normal a varstei(talia maxima la adult va fi 140-160 cm). Frecvent se asociaza obezitatea iar dezvoltarea pubertara este mult intarziata si incomplete. Barbatii sunt sterile iar femeile au o fertilitate reduaa.

Sub 34-SINDROMUL DOWN – ANALIZA CROMOZOMILOR

Poate evidential:

1. Trisomie 21 libera si omorgena: in 92-95% din cazurile de sindrom Down; rez prin nedisjunctie meiotic, cel mai frecevent maternal si in special meioza I

2. Trisomie 21 libera, in mosaic: in circa 2-3 % din cazuri; rez prin nedisjunctie mitotic postzigotica sau foarte rar prin pierderea cromozomului 21 in cel ce deriva dintr-un zigot trisomic

3. Trisomie 21 prin translocatie Robertsoniana neechilibrata: intre cromozomul 21 si alt cromozom acrocentric- poate fi obs in 4-5% din cazuri; cel mai frecvent se intaln translocatia 14q;21q care in jumatate din cazuri e mostenita de la unul dintre parinti(mama); translocatiile 21q;22q sau 21q;21q sunt mai rare si maj sunt de novo

4. Trisomie 21 partiala, mai putin de 1%; rez prin segregarea meiotic a cromozomilor derivative, formati in urma unor translocatii echilibrate, prezente la unul dintre parinti.

In primii ani de viata multi copii sunt confruntati cu diferite problem medicale. Cele mai importante: sunt det de malformatii visceral in special cardiace si digestive. Infectiile respiratorii sunt frecvente iar riscul de a dezvolta leucemie este de 15-20 ori mai mare decat in populatia generala. Dupa 40 ani se instaleaza frecvent o dementa senile precoce si mortalitatea creste semnificativ prin accidente vasculare. In tarile dezvoltate speranta de viata este de 60 ani.

Sindromul Down este produs de trisomia cromozomului 21 si mai exact d trisomia regiunii 21q22, numita si DSCR. S-a dovedit ca in regiunea 21q22.1-22.3 se gasesc genele care prin effect de dezaj produc majoritatea semnelor clinice caracteristice sindromului Down.

Sub 35-SINDROMUL EDWARS – ASPECT CLINIC

Sindromul Edwars are o incidenta de aprox 1/5000-8000 de nasteri, maj cazurilor80% fiind de sex feminine; incidenta la conceptie este mult mai mare, de aprox 95% dintre embrionii cu trisomie 18 sunt eliminate prin avort.

Nou-nascutul prez o greutate mica, hipertonie, dismorfie cranio-faciala evocatoare:doliocefalie cu occiput proeminent, frunte tesita, microretrognatie, urechi jos implantate, hipoplkazice(urechi de faun).

14

GENETICA

Frecvent prezinta camptodactilie caracteristica: degetele 2 si 5 acopera degetele 3 si 4. Unghiile sunt hipoplazice si dermatoglifele anormale. Sternul este scurt, piciorul are aspect de “piolet” si halucele scurt si flectat.

Deseori sunt prezente hernia sau omfalocel si malformatii congenital grave: cardiac(90%), renale, cerebrale, vertebrale. Suspiciunea clinica este sustinuta si de evidentierea anamnestica a polihidramniosului in cursul sarcinii.

Sub. 36- SINDROMUL EDWARS – ANALIZA CITOGENETICA

Diagnosticul este precizat prin analiza citogenetica unde se poate identifica o trisomie 18 libera si omogena, 94%, prin nedisjunctie maternal sau in mosaic , 5% sau o trisomie 18 partiala (1%).

Frecventa trisomiei 18 creste o data cu cresterea varstei materne, indeosebi de trisomia 21, peste 50% dintre erorile de distributie se produc in meioza II. Nu s-a localizat o regiune critica care sa fie corelata cu fenotipul sindromului edwars dar foarte probabil este localizata pe 18q. Trisomiile partiale rezulta datorita unei translocatii sau inversii, de obicei mostenita de la unul dintre parinti.

Speranta de viata este foarte mica, aprox 90% dintre copii murind in primele 6 luni de viata datorita malformatiilor visceral grave. Doar 5% supravietuiesc dupa varsta de 1 an, dar prezinta o intarziere severa in dezvoltarea psihomotorie.

Riscul de recurenta este de 1-2 %. Depistarea este posibila in 60% din cazuri pe baza ecografiei fetale si a triplului test( val scazute ale AFP,hCG, uE3); confirmarea se face insa numai prin efectuarea analizei cromozomilor din celulele fetale.

Sub37 – SINDROMUL PATAU – ASPECT CLINIC

Trisomia 13 are o incidenta de aprox 1/10.000-20.000 nasteri

Nou nascutul prez: intarziere in crestere, microcefalie cu suture larg deschise, aplazie cutanata in reg vertexului sau occiputului, frunte tesita, microftalmie/anoftalmie, colobom irian, despicaturi orofaciale, urechi malformate, camptodactilie, polidactilie postaxiala la maini si/sau picioare. Aproape constant se intln malformatii ale SNC(arhinencefalie sau holoprosencefalie), ale cordului 80% si sist urogenital.

Diagnosticul clinic este sugerat de triada caracteristica(holoprosencefalie): descpicatura labio-palatina, microftalmie/anoftalmie si polidactilie postaxiala-observata la aprox 70% dintre pacienti. Absenta lor partial face diagnosticul mai dificil, desi sunt si alte semen care pot evoa trisomia 13(ex: proeminenta radacinii si varfului nasului ).

Diagnosticul este stability prin cariotip; in 80% din cazuri trisomia 13 este complete, libera, omogena; mozaicurile sunt foarte rare, dar 20% din cazuri au fost identificate: trisomii complete sau partiale produse prin translocatii neechilibrate, de obicei t(13q; 14q) din care jumatate sunt mostenite de la unul dintre parinti.

15

GENETICA

Malformatiiile visceral multiple si severe determina decesul a peste 50% din cazuri in prima luna de viata. Doar 3% din bolnavi supravietuiesc peste un an, avand un retard mental sever. Supravietuirea

16