Radioimunoloke analizeprincipiProf.dr sc.med. Boris Ajdinovi

UvodRazvoj radioimunolokih metoda (RIA) vezano je za ime Jalou i Bersena (Yalow i Berson) 1960. godine, ije se metode baziraju na principu takmienja neobeleenog i radioizotopom obeleenog insulina na vezivna mesta antitela. Iste godine Ikins (Ekins) je postavio osnove radiosaturacionih metoda baziranog na principu kompeticije neobeleenog i obeleenog tiroksina na fizioloki transportni protein ovog hormona.

Dr. Rosalyn Yalow - prva ena dobitnica Nobelove nagrade- 1959

RIA- pretea modernih imunoeseja

Uvod

Radioimunoloke analize su mikroanalitike tehnike bazirane na principu reakcije (antigen-antitelo) izmeu bioloki aktivnih supstancija u telesnim tenostima i specifinih vezujuih proteina uz primenu radioaktivnih izotopa.

Prednosti radioimunolokih analiza:OSETLJIVOST- veoma male koliine ( koncentracije) mogu biti kvantifikovane

SPECIFINOST meri se koncentracija samo jedne supstance od mnogih koje se nalaze u uzorku

UPOTREBLJIVOST- veliki broj uzoraka moe biti obraen za kratko vreme

OSETLJIVOST Kocka eera u olimpijskom bazenuKoncentracija eera u vodi 5g/ 1 milion l vode ( 5 g / l )

Koncentracija T3 u serumu 1g / l

SPECIFINOST ANTIGEN-ANTITELO IMUNOLOKA REAKCIJAPrincip kljua

Vezivanje antigena i antitelaantiteloantigen

Zahtevi RIAProdukcija i karakterizacija antigena (analita koji treba da se odreuje) Obeleavanje antigena radioaktivnom substancomProdukcija specifinog antitelaRazvijanje RIA kompleta (eseja)

Principi kompetitivnih vezujuih radioimunoanaliza- radioimunoeseja

Kompetitivno vezivanjeDodavanje poznatog obeleenog AgDodavanje nepoznatog AgKompeticija jednog i drugog za vezujua mesta na molekulu AbSubpstanca koja nije reagovala se mora odvojitiNain obeleavanja poznatog Ag odrejuje i metod detekcije.

Kompetitivno vezivanje

Radioimmunoassay Competitive

Measurement of Circulating Hormone: RIA MethodExcess Labeled + No Unlabeled HormoneAntibodies saturated by excess labeled hormone; Equilibrium: unbound labeled + antibody bound labeled AFigure 2. Example of a radioimmunoassay

Measurement of Circulating Hormone: RIA MethodLabeled Hormone + Some Unlabeled Hormone BSmall amount of unlabeled displaces some labeled = labeled antibodyEquilibrium: unbound unlabeled + saturated labeled antibody some unlabeled boundFigure 2. Example of a radioimmunoassay

Measurement of Circulating Hormone: RIA MethodLabeled Hormone + Large Quantity of Unlabeled Hormone CLarge amount of unlabeled displaces most labeled = labeled antibodyEquilibrium: unbound unlabeled + saturated labeled antibody mostly unlabeled boundFigure 2. Example of a radioimmunoassay

Measurement of Circulating Hormone: RIA Displacement CurveNo unlabeled hormoneSmall amount unlabeled hormoneLarge amount unlabeled hormoneFigure 2. Example of a radioimmunoassay

Measurement of Circulating Hormone: RIA Standard CurvePercent labeled hormone (*H) bound to antibodyConcentration of total unlabeled hormoneStandard curve: *H-antibodyknown unlabeled [hormone] vs measured labeled boundXX = measured for patient sampleFigure 3. Standard curve for evaluation of blood [hormone] by RIA

Produkcija i obeleavanje Antigena- analita-substance koja se odreuje Produkcija AntigenaSinteza molekula Izolovanje iz prirodnih izvora

Obeleavanje antigena 3 H 14 C 125 I kao obeleivai

NE SME se naruiti specifinost antigena kao ni aktivnost antigena!

Pripremanje specifinog antitelaintradermalno injektovanje antigena zeevima ili zamorcima produkcija antitelaAntitela izdvojena iz seruma Neki analiti su slabo antigeni- te se konjugiraju sa haptenima Hormoni , Steroidi, lekovi HAPTENI : Gastrin, Morphine, Hapteni conjugovani za albumin antigeni

Radioimunoloka- RIA -metodaSadraj kompleta:boica sa radioaktivno obeleenim Ag (I-125-Tg);boica sa Ab (oviji anti - Tg antiserum);standardi (tano odreene koncentracije Tg);3% rastvor PEG;kontrolni serum.

Pregled postupaka radioimunolokih analizapriprema analitikih uzoraka (ukoliko je potrebna) - deproteinizacija, izdvajanje proteinskih analoga, preiavanjepravljenje standardnih rastvora za kalibracionu mernu krivuformiranje saturacionog sistema (inkubacija i uspostavljanje ekvilibrijuma)izdvajanje slobodne /F/ od za proteine vezane /B/ frakcijemerenje aktivnosi reakcije /B ili F/

Principi i postupci u toku RIA analize;inkubacija (duina trajanja i uslovi predloeni od strane proizvoaa)

dodavanje sredstva za taloenje (PEG)

centrifugiranje

Aspiriranje

merenje radioaktivnosti u vezanom kompleksu u gamascintilacionom brojau;

koliina izmerene radioaktivnosti obrnuto je proporcionalna koncentraciji hormona u serumu.

Radioimmunassay

Princip testa

Princip testa/ RIA

RIA- standardna kriva

Tanost rezultata radioimunolokih analiza

Tanost rezultata radioimunolokih analiza

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent AssayPrincip: Bazira na imunoj reakciji kao RIAOd RIA se razlikuje po metodi detekcijeDetekcija se bazira naEnzim katalizatorskoj reakcijiFluorescentnoj probiNEMA RADIOAKTIVNOSTI (PREDNOST)

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

PRINCIP: Detekcija antigena ili antitela antitelima koja su obeleena razliitim enzimima.

ENZIMI: Alkalna fosfataza Peroksidaza -galaktozidazaHromogeni supstrat - bezbojni supstrat kojiregauje sa enzimom

STOP reagens zaustavlja enzimsku reakciju(najee neka kiselina)ELISA reader

ELISA

Klasifikacija Heterogena potrebno odvajanje reaktanataHomogena nema odvajanja

Dva tipa: Kompetitivna kompeticija poznatog I nepoznatogNekompetitivna reaguje samo nepoznato

ELISA nekompetitivni Sandwich Assay Antigen merni sistemEpruvete obloene odgovarajuim antitelom Dodavanje uzorka krvi sa AgInkubacija do zavretka reakcije Ag-AbIspiranje odvajanje nevezanog antigenaDodavanje Antitela obeleenog EnzimomIncubacija dok se l antigen ne vee za obeleeno antiteloIspiranje odvajanje nevezanog antitelaDodavanje substrata ; inkubacijaEnzyme + Substrate Produkt merenje boje Boja proporcionalna antigenu u uzorku seruma pacijenta

Sandwich Technique ELISA

ELISA- kompetitivni esej Kompeticija nepoznatog Ag sa obeleenim poznatim AgEnzimi izazivaju kolor reakciju

PRIMENA IMUNOESEJA [RIA & ELISA] Analiza hormona, vitamina, metabolita, tumorskih markera ACTH, FSH, T3, T4, Glucagon, Insulin, Testosteron, vitamin B12, prostaglandini, glukokortikoidi, Praenje koncentracije uneenih lekova: Barbiturati, morfin , digoxin, Diagnostika procedura za otkrivanje infekcije HIV, Hepatitis A, B, itd.

IRMA Imunoradiometrijski esej) _ Princip testakvantitativno odreivanje hormona ili neke druge supstance;sendvi metoda reakcija vezivanja supstance iz seruma sa Mo-At vezanim za dno epruvete i sa Mo-At koja su obeleena radioaktivnim izotopom I-125;inkubacija (vreme trajanja i uslovi predloeni od strane proizvoaa);aspiriranje i ispiranje (broj aspiririranja predloen od strane proizvoaa);merenje radioaktivnosti u gamascintilacionom brojau;koliina izmerene radioaktivnosti direktno je proporcionalna koncentraciji hormona u serumu.

IRMA Imunoradiometric assay ) Nekompetitivna ili Sendvi analiza

ImunoradiometrijskaIRMA - metodaSadraj kompleta:boica sa radioaktivno obeleenim Mo-Ab I-125;epruvete sa vezanim Mo-Ab;standardi (tano odreene koncentracije);rastvor za ispiranje;kontrolni serum.

Princip testa

IRMA- standardna kriva

Imunoloki radioimunieseji

Fluorescence Immunoassay

Markeri Fluoroforni ili fluorohromniSposobnost apsorpcije energije i emitovanja svetlostiNajee u upotrebi :Fluorescein zelenaTetramethylrhodamine crvena

Fluorescencija

Fluorescent Immunoassay

Direktna imunofluorescencijaMarkirano antitelo dodaje se nepoznatom antigenu fiksiranom na stripIndirektna imunofluorescencijaPacientov plus poznati fiksirani antigenDodavanje markiranog anti-antitelaFluorescencija

DELFIA METODA (Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmuno Assay)Sadraj kompletaboica sa hormon- Eu-tracer;antiserum za hormon koji se odreuje;stripovi sa Po-At;standardi (tano odreene koncentracije);rastvor za ispiranje;boica sa rastvorom za izdvajanje Europijuma.

Princip testakvantitativno odreivanje;kompetitivno vezivanje serumskog hormona i Europijumom obeleenog hormona za poliklonalana anti-hormonska At koja su vezana za dno epruvete;inkubacija;ispiranje;dodavanje rastvora za izdvajanje Europijuma;merenje jaine fluorescentnog signala;jaina fluorescentnog signala je obrnuto proporcionalna koncentraciji hormona u serumu.

Princip testa/ DELFIA

Radioligandni eseji

metodaVezujui proteinAfinitet (l/ mol)Klinika primenaRIA

CPBA(competitivni protein vezujuci esej)

RRARadioreceptorski esejAntitelo

Plazma ili tkivno vezujuci proteini

elijski receptori hormona 109- 1011

108- 109

108-109Hormoni

Vit B12, folna kiselina stariT4

autoantitela

*****