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Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale Amiotrofica. Internato di tesi svolto presso il Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università degli Studi di Milano Fondazione IRCCS CA’ GRANDA Ospedale Maggiore Policlinico. Relatore: Chiar.ma Prof.ssa Silvia DE BIASI - PowerPoint PPT Presentation
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Ruolo di TDP43 nella Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale AmiotroficaSclerosi Laterale Amiotrofica
Tesi di Laurea di:Serena Diana Ghezzi
Relatore: Chiar.ma Prof.ssa Silvia DE BIASI Correlatore: Chiar.mo Prof. Giacomo P. COMI
Internato di tesi svolto presso il Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università degli Studi di Milano
Fondazione IRCCS CA’ GRANDA Ospedale Maggiore Policlinico
tipo di SLA
gene classe
geni mendeliani
SLA1 SOD1 enzima detossificante
SLA2 ALS2 signali GEF
SLA4 SETX metabolismo del DNA e dell’ RNA
SLA5 SPG11 recettore o trasportatore di membrana
SLA6 FUS legame al RNA, silenziamento e riparo del DNA
SLA8 VAPB traffico vesciculare
SLA9 ANG neovascolarizzazione
SLA10 TARDBP legame all’RNA ed exon skipping
SLA DCTN1 trasporto assonale
SLA-FTDP
MAPT assemblamento dei microtubuli e loro stabilità
loci mendelianiSLA3 Ignoto Ignota
SLA7 Ignoto Ignota
SLA-X Ignoto Ignota
SLA-FTD1 Ignoto Ignota
SLA-FTD2 Ignoto Ignota
Sclerosi Laterale AmiotroficaSclerosi Laterale Amiotrofica
INTRODUZIONE
La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa fatale, risultato del preminente interessamento dei motoneuroni superiori e inferiori. La durata di malattia dal momento dell’esordio dei sintomi è in media di 3-5 anni con un decorso più rapido nelle forme ad esordio bulbare.
La diagnosi è essenzialmente clinica, non esiste infatti un test diagnostico specifico.
5-10% familiari (SLAf)90-95% sporadici (SLAs)
Dati familiari ed epidemiologici indicano che i fattori genetici contribuiscono alla sua patogenesi.
L’exitus avviene generalmente in seguito a paralisi della muscolatura respiratoria
INTRODUZIONE
TARDBPTARDBP
La proteina TAR DNA binding protein (TDP43) è il principale componente delle inclusioni citoplasmatiche neuronali ubiquitino-positive presenti nella maggior parte dei casi SLAs e di SLAf negativi per mutazioni di SOD1
Nel tessuto nervoso dei pazienti SLA, TDP43 è iperfosforilata, ubiquitinata e clivata in modo anomalo. Si ipotizza che in condizioni patologiche la proteina sia eliminata dal nucleo e si accumuli a livello del citoplasma innescando la degenerazione motoneuronale
1p36
1. regolazione della trascrizione2. regolazione dello splicing3. stabilità dell’mRNA
INTRODUZIONE
TARDBP (TDP43)TARDBP (TDP43)
ex1 ex2 ex3 ex4 ex5 ex6
RRM1 RRM2 GRRNLS 414 aa, 43 KDa
sito di interazione hnRNP
siti di interazione con l’mRNA
segnale di localizzazione nucleare
Sito di clivaggio (aa86-89) Sito di clivaggio (aa216-219)
Lo scopo del nostro studio è stato quello di caratterizzare geneticamentecaratterizzare geneticamente l’ampia coorte di pazienti SLA afferenti all’Ambulatorio Malattie del Motoneurone – Dipartimento di Scienze Neurologiche – Policlinico di Milano.
SCOPO
OBIETTIVIOBIETTIVI
Tale studio ci ha permesso di individuare la mutazione A382T risultata essere la variante più comune sul territorio nazionale. Abbiamo quindi costruito un modello cellularemodello cellulare che permettesse di studiare in vitro gli effetti di tale mutazione.
SCREENING GENETICOSCREENING GENETICO
La frequenza mutazionale è risultata pertanto essere del 2.3% calcolata sull’intera coorte di pazienti (1.6% nelle forme
sporadiche e 7.7% in quelle familiari).
Pazienti SLA
Soggetti SANI
numero di soggetti 213 181
casi familiari 26
genere (M/F) 122/91 102/79
età di insorgenza (anni) 58.3 ± 12.8
età al prelievo (anni) 60.8 ± 12.5 67.4 ± 8.8
insorgenza bulbare 21.4%
durata della malattia (mesi)
31.6 ± 29.4
SOD1, VAPB e ANG positivi nessuno4 mutazioni missenso in 5 casi (2 familiari e 3
sporadici)
RISULTATI
I:1 I:2
II:1 II:2 II:3 II:4 II:5 II:6 II:7 II:8
III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8 III:9
IV:1 IV:2 IV:3
p.Ala382Thr
RISULTATI
SLAf
SLAs
G294V G295S G348C A382T
c.881G>T p.Gly294Val c.883G>A p.Gly295Ser c.1144G>A p.Ala382Thr
I:1 I:2
II:1 II:2 II:3 II:4
III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8
IV:1 IV:2 IV:3 IV:4 IV:5 IV:6 IV:7 IV:8 IV:9 IV:10
V:1 V:2 V:3 V:4 V:5 V:6 V:7 V:8 V:9
VI:1 VI:2 VI:3 VI:4 VI:5 VI:6 VI:7 VI:8
p.Gly348Cys
SCREENING GENETICOSCREENING GENETICO
c.881G>T p.Gly294Val c.883G>A p.Gly295Ser
SCREENING GENETICOSCREENING GENETICO
p.Ala382Thrp.Gly348Cys
ex1 ex2 ex3 ex4 ex5 ex6
RRM1 RRM2 GRRNLS
c.1144G>A p.Ala382Thr
RISULTATI
c.1144G>A p.Ala382Thr
Costruzione del modello cellulareCostruzione del modello cellulare
ficol mRNA cDNA
A B
AB
820bp965bp 820bp521bp
NdeINdeI
RISULTATI
Validazione del modello cellulareValidazione del modello cellulare
hHEK
hSK-N-SH
mES
actina
hHEK hSK-N-SH
mES
45 KDa 45 KDa
45 KDa
NT WT A382T NT WT A382T
NT WT A382T
Western-Western-BlotBlot
TDP43 DAPI MERGE
NT
WT
A382T
ImmunocitochimicaImmunocitochimica
RISULTATI
Validazione del modello cellulareValidazione del modello cellulare
GAPDH
TDP43
RISULTATI
Costruzione del modello con GFPCostruzione del modello con GFPhHEK
DAPI TDP43
MERGE
wt
A382T
TDP43WTGFP
TDP43A382TGFP
RISULTATI
CONCLUSIONICONCLUSIONI
E’ interessante notare come, per quanto riguarda le forme di SLA a trasmissione autosomica dominante, la rilevanza mutazionale di TARDBP sia paragonabile, se non superiore, a quella di SOD1SOD1, nel nostro come in altri studi.
La frequenza mutazionale frequenza mutazionale del gene TARDPB nella nostra coorte di paziente è risultata pari al:1.6% nei casi sporadici (sovrapponibile a quanto riportato in letteratura) 7.7% nei casi familiari (maggiore di quanto descritto, circa il 5%).
Il quadro clinicoquadro clinico della SLA10 è analogo a quello della malattia classica, con qualche variabilità interfamiliare per quanto riguarda età e sito di esordio
GENETICAGENETICA
DISCUSSIONE
Paziente
genere paese d’origine
ereditarietà
TDP43
insorgenza durata (mesi)età sede
A, V:3 M Belgio AD G348C 50 spinale 36 a
A, V:1 M Belgio AD G348C 53 spinale -A, III:3 F Belgio AD b 67 spinale 36-48A, III:4 M Belgio AD b 39 spinale 36A, III:5 M Belgio AD b 36 spinale - a
A, III:6 F Belgio AD b 54 spinale 36A, IV:1 M Belgio AD b 66 spinale 48A, IV:3 M Belgio AD b 58 spinale 48A, IV:6 F Belgio AD b 53 spinale 60B, III:2 M Italia AD A382T 50 spinale con crampi agli arti inferiori 60 a
B, II:5 M Italia AD b 50 spinale con debolezza all’arto superiore sinistro
36
C M Italia sporadica A382T 54 spinale con paresi alla mano sinistra -D F Italia sporadica G294V 73 spinale con debolezza progressiva agli
arti inferiori36
E M Italia sporadica G295S 64 spinale con debolezza e atrofia agli arti superiori
36a
CONCLUSIONICONCLUSIONI
Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due modelli cellularidue modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata.
ANALISI FUNZIONALEANALISI FUNZIONALE
DISCUSSIONE
actina
hHEK
45 KDaNT WT A382T
hSK-N-SH
45 KDa NT WT A382T
mES
45 KDa NT WT A382T
CONCLUSIONICONCLUSIONI
Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due modelli cellularidue modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata.
ANALISI FUNZIONALEANALISI FUNZIONALE
DISCUSSIONE
mRNA non tradotto proteina degradata
2 31 2 31
2 31
45 KDa 45 KDa
45 KDa
HEK non trasfettate
HEK TDP43WT HEK TDP43A382T
PROSPETTIVEPROSPETTIVE
1. Proseguire la caratterizzazione genetica
2. Approfondire lo studio dei meccanismi di degradazione
proteica
3. Verificare l’eventuale regolazione dei livelli di trascritto
4. Confermare i dati fin qui ottenuti anche con i modelli
esprimenti la proteina legata alla GFP
5. Replicare gli esperimenti validati nelle HEK anche in un
modello neuronale (es. SK-N-SH)
6. Valutare i meccanismi di neurogenesi nei modelli cellulari
fin qui descritti
DISCUSSIONE
RINGRAZIAMENTIRINGRAZIAMENTI