Saccharomyces cerevisiae - GWDGwebdoc.sub.gwdg.de/ebook/dissts/Dresden/Kuschel2006.pdf · Saccharomyces cerevisiae DISSERTATION Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum

Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH-Proteinfamilie in den Hefen Yarrowia lipolytica und

Saccharomyces cerevisiae

DISSERTATION

Zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor rerum naturalium

(Dr. rer. nat.)

vorgelegt der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der Technischen Universität Dresden

von

Diplom-Biologin Margret Kuschel

geboren am 14.03.1976 in Dresden Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. habil. G. Barth

Prof. Dr. rer. nat. habil. G. Rödel

Prof. Dr. rer. nat. habil. K. Breunig

Eingereicht am: 30.09.2005

Tag der Verteidigung: 09.02.2006

Aus aktuellen Gründen wurden Teile dieser Arbeit bereits veröffentlicht:

Publikation Gentsch M, Kuschel M and Barth G (2003) Expression of mutant Gpr1p in Yarrowia lipolytica and its effect on growth on different media. In: Wolf K, Breunig K, Barth G (Eds), Non-conventional yeasts in genetics, biochemistry and biotechnology. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg New York, pp.379-384

Tagungsbeiträge Barth G, Augstein A, Gentsch M and Kuschel M (2001) Stress caused by acetic acid or etha-nol – involvement of the Gpr1 protein of the yeast Yarrowia lipolytica. 21st International Spe-cialized Symposium on Yeasts: Biochemistry, genetics Biotechnology and Ecology of NON-conventional yeasts., Lviv, Ukraine

Gentsch M, Augstein A, Kuschel M and Barth G (2001) Functional analysis of the Gpr1 pro-tein in Yarrowia lipolytica. 21st International Specialized Symposium on Yeasts: Biochemistry, genetics Biotechnology and Ecology of NON-conventional yeasts, Lviv, Ukraine

Gentsch M, Augstein A, Kuschel M and Barth G (2002) The stress response of Yarrowia lipolytica to acetic acid at low pH values. Third Yarrowia lipolytica international meeting, Dresden, Germany

Gentsch M, Kuschel M and Barth G (2002) Mutational analysis of the Gpr1 protein of Yar-rowia lipolytica. Third Yarrowia lipolytica international meeting, Dresden, Germany

Kuschel M and Barth G (2002) Functional effects of dominant GPR1 alleles of Yarrowia lipolytica and mutations in the GPR1 homologues ScYCR010c and ScYNR002c in Saccha-romyces cerevisiae. Third Yarrowia lipolytica international meeting, Dresden, Germany

Kuschel M, Creuzburg K, Hohmann S and Barth G (2003) Trans-dominant mutations in two members of the Gpr1/Fun34/yaaH protein family (Ynr002cp, Ycr010cp) effect acetic acid sensitivity in Saccharomyces cerevisiae. XXIst International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Gothenburg, Sweden

Gentsch M, Kuschel M, Shapoval L, Salzer R and Barth G (2003) Members of the Fun34-YaaH protein family – components of a new signal transduction cascade. Third European Life Scientists Organisation (ELSO) meeting, Dresden, Germany

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ....................................................................................................1

1.1 Stressantwort von Mikroorganismen......................................................................... 1 1.1.1 Nährstoffmangel.................................................................................................. 1 1.1.2 Hitzestress .......................................................................................................... 4 1.1.3 Stress durch schwache Säuren und Ethanol ...................................................... 5

1.2 Aufnahme und Verwertung von Acetat ................................................................... 10 1.3 Die Gpr1/Fun34/yaaH-Proteinfamilie ...................................................................... 13

1.3.1 Das GPR1-Gen der Hefe Yarrowia lipolytica .................................................... 13 1.3.1.1 Charakterisierung der GPR1d-Mutanten .................................................. 14 1.3.1.2 Regulation des Promotors des GPR1-Gens ............................................ 15 1.3.1.3 N-terminale Deletionen des Gpr1-Proteins .............................................. 16 1.3.1.4 Lokalisierung des Gpr1-Proteins .............................................................. 16 1.3.1.5 Expression des Gpr1-Proteins ................................................................. 17 1.3.1.6 Phosphorylierung des Gpr1-Proteins ....................................................... 17 1.3.1.7 Funktion des Gpr1-Proteins ..................................................................... 18

1.3.2 Die Gpr1p-orthologen Genprodukte Ycr10cp, Ydr384cp und Ynr002cp der

Hefe Saccharomyces cerevisiae....................................................................... 19 1.3.2.1 Regulation der Genexpression von YCR010c, YDR384c und YNR002c . 20

1.3.3 Ammoniumsekretion der Hefe Saccharomyces cerevisiae............................... 21 1.4 Zielstellung der Arbeit ............................................................................................. 23

2 Material und Methoden.............................................................................25

2.1 Geräte ..................................................................................................................... 25 2.2 Chemikalien und Biochemikalien ............................................................................ 26 2.3 Kitsysteme .............................................................................................................. 26 2.4 Enzyme ................................................................................................................... 27 2.5 Antikörper................................................................................................................ 27 2.6 Nukleinsäuren ......................................................................................................... 27

2.6.1 DNA-Molekulargewichtstandards und Nucloeotide........................................... 27 2.6.2 Verwendete Plasmide ....................................................................................... 28 2.6.3 Konstruierte Plasmide ....................................................................................... 29 2.6.4 Oligonucleotide ................................................................................................. 30

2.7 Mikroorganismen .................................................................................................... 31 2.7.1 Escherichia coli ................................................................................................. 31

Inhaltsverzeichnis

II

2.7.2 Saccharomyces cerevisiae ............................................................................... 31 2.7.3 Yarrowia lipolytica ............................................................................................. 33

2.8 Kultivierungsmedien................................................................................................ 33 2.8.1 Kultivierungsmedium für Escherichia coli.......................................................... 33 2.8.2 Kultivierungsmedien für Saccharomyces cerevisiae und Yarrowia lipolytica .... 33

2.9 Gentechnische Arbeitsmethoden............................................................................ 35 2.9.1 Agarosegel-Elektrophorese............................................................................... 35 2.9.2 Restriktionsspaltungen...................................................................................... 36 2.9.3 Ligation von DNA-Fragmenten.......................................................................... 36 2.9.4 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ................................................................. 36 2.9.5 Isolierung von DNA aus Agarosegelen ............................................................. 37 2.9.6 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli ............................................ 37 2.9.7 Isolierung von DNA aus Hefen.......................................................................... 37 2.9.8 Isolierung von RNA aus Saccharomyces cerevisiae......................................... 38 2.9.9 Northern-Hybridisierung.................................................................................... 39 2.9.10 Transformation von Mikroorganismen............................................................... 41

2.9.10.1 Herstellung und Transformation elektrokompetenter Escherichia coli-

Zellen (modifiziert nach Dower et al., 1988)............................................. 41 2.9.10.2 Herstellung und Transformation kompetenter Saccharomyces

cerevisiae-Zellen ...................................................................................... 41 2.9.10.3 Herstellung und Transformation elektrokompetenter Yarrowia

lipolytica-Zellen (modifiziert nach Dower et al., 1988).............................. 41 2.9.10.4 Integrative Transformation von Yarrowia lipolytica................................... 42

2.9.11 DNA-Sequenzierung ......................................................................................... 42 2.9.12 Southern-Hybridisierung ................................................................................... 42 2.9.13 Plasmidkonstruktionen...................................................................................... 43 2.9.14 Konstruktion des Yarrowia-lipolytica-Stammes PO1d-GPR1-2 ........................ 47

2.10 Biochemische Methoden......................................................................................... 47 2.10.1 Zellaufschluss mittels Glasperlen...................................................................... 47 2.10.2 Proteinbestimmung nach Lowry et al. (1951).................................................... 48 2.10.3 Deglycosylierung............................................................................................... 48 2.10.4 Dephosphorylierung.......................................................................................... 48 2.10.5 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) ....................................... 48 2.10.6 Western-Blot-Analyse ....................................................................................... 50 2.10.7 Immunochemischer Nachweis geblotteter Proteine.......................................... 50 2.10.8 Photometrische Bestimmung von Ammonium (modifiziert nach Palková

et al., 2002) ....................................................................................................... 50

Inhaltsverzeichnis

III

3 Ergebnisse ................................................................................................52

3.1 Die Gpr1/Fun34/yaaH-Familie ................................................................................ 52 3.1.1 Datenbankanalyse von Gpr1p dessen Homologen und Orthologen................. 52

3.2 Das Gpr1-Protein in Yarrowia lipolytica .................................................................. 57 3.2.1 Identifizierung möglicher Interaktionspartner von Gpr1p .................................. 57

3.2.2 Unterschiede im Wachstum zwischen PO1d und PO1dΔgpr1 auf

verschiedenen C-Quellen.................................................................................. 63 3.2.3 Wachstum verschiedener Yarrowia lipolytica-Stämme ..................................... 65

3.3 Die Gpr1p-Orthologen in Saccharomyces cerevisiae ............................................. 65 3.3.1 Wachstum verschiedener Saccharomyces cerevisiae-Stämme ....................... 66 3.3.2 Wachstum der YN-Stämme auf verschiedenen C-Quellen............................... 66 3.3.3 Expression der GPR1-Mutantenallele in Saccharomyces cerevisiae ............... 69 3.3.4 Ort-spezifische Mutagenese von Ycr010cp und Ynr002cp ............................... 70 3.3.5 YCR010c- und YNR002c-Allele unter Kontrolle ihres authentischen

Promotors.......................................................................................................... 71 3.3.6 Zufällige Mutagenese der GPR1-Orthologen in Saccharomyces cerevisiae .... 72 3.3.7 C-terminale Verkürzung von Gpr1p, Ycr010cp und Ynr002cp.......................... 74 3.3.8 Sequenzanalyse der Promotoren...................................................................... 76 3.3.9 Untersuchung der Nit2p-Erkennungssequenz .................................................. 82

3.3.10 Expression von β-Galactosidase unter der Kontrolle der Promotoren von

YCR010c, YDR384c und YNR002c im Vergleich zu GPR1.............................. 83 3.3.11 Expression der mit HA getagten Homologen Ycr010cp und Ynr002cp ............ 84 3.3.12 Auftreten der drei Gpr1p-Orthologen in unterschiedlichen Formen .................. 85

3.3.12.1 Deglycosylierung...................................................................................... 85 3.3.12.2 Dephosphorylierung ................................................................................. 86

3.3.13 Expression der Gpr1p-Orthologen in Saccharomyces cerevisiae..................... 87 3.3.13.1 Expressionsverlauf in Minimalmedium mit Glucose ................................. 88 3.3.13.2 Expression in Minimalmedium mit verschiedenen C-Quellen .................. 93 3.3.13.3 Expression in Minimalmedium mit verschiedenen pH-Werten ................. 95 3.3.13.4 Expression in Minimalmedium mit verschiedenen Essigsäure-

konzentrationen........................................................................................ 97 3.3.13.5 Expression der Homologen unter Stress.................................................. 99

3.3.14 Herstellung von anti-Ycr010cp-Antikörpern .................................................... 101 3.3.15 Lokalisierung der Gpr1-Orthologen................................................................. 105 3.3.16 Bestimmung von sekretiertem Ammonium ..................................................... 106

3.3.16.1 Einfluss der Deletion von je zwei bzw. aller drei Gpr1p-Orthologen

auf die Ammoniumproduktion................................................................. 106

Inhaltsverzeichnis

IV

3.3.16.2 Einfluss der dominanten Mutationen in Ycr010cp und Ynr002cp

auf die Produktion von Ammonium ........................................................ 107

4 Diskussion...............................................................................................112

4.1 Datenbankanalyse von Gpr1p und dessen Orthologen in Saccharomyces

cerevisiae .............................................................................................................. 112 4.2 Identifizierung möglicher Interaktionspartner von Gpr1p ...................................... 115 4.3 Expression der Mutantenallele von GPR1 und dessen Orthologen in

Saccharomyces cerevisiae ................................................................................... 117 4.4 Ort-spezifische und zufällige Mutagenese von Gpr1p in Yarrowia lipolytica und

dessen Orthologen in Saccharomyces cerevisiae ................................................ 119 4.5 Sequenzanalyse und Regulation der Promotoren der GPR1-Orthologen ............ 122 4.6 Auftreten der drei Gpr1p-Orthologen in unterschiedlichen Formen ...................... 125 4.7 Expression in Minimalmedium mit verschiedenen Essigsäurekonzentrationen.... 126 4.8 Bestimmung von sekretiertem Ammonium ........................................................... 127 4.9 Mögliche Funktionen der Gpr1p-Orthologen......................................................... 131

5 Zusammenfassung.................................................................................135

6 Literatur ...................................................................................................138

7 Anlagen....................................................................................................150

7.1 Plasmidkarten ....................................................................................................... 150 7.2 Topologiemodelle der Gpr1p-Orthologen in Saccharomyces cerevisiae .............. 152 7.3 Potentielle Modifizierungsorte der Gpr1p-Orthologen in Saccharomyces

cerevisiae .............................................................................................................. 153

Abkürzungsverzeichnis

V


A Acetat

Abb. Abbildung

AK Antikörper

ATP Adenosintriphosphat

BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)

bp Basenpaare

cpm counts per minute (detektierte Zerfallserscheinungen pro Minute)

C-Quelle Kohlenstoffquelle

CYC1 Cytochrom c, Isoform 1

ddH2O doppelt destilliertes Wasser

DEPC Diethylpyrocarbonat

dH2O destilliertes Wasser

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EtOH Ethanol

5-FOA 5-Fluor-Orothsäure

G Glucose

GPR1-1 GPR1-Allel aus dem Y. lipolytica-Stamm B204-12C-112

GPR1-2 GPR1-Allel aus dem Y. lipolytica-Stamm B204-12C-156

kDa Kilodalton

HA Hämagglutinin-Epitop (abgeleitet aus dem Influenza HA-Protein)

lacZ Gen der β-Galactosidase aus E. coli

LB Luria Bertani

λ-PPase λ-Phosphatase

M Minimalmedium für S. cerevisiae

MES 2-Morpholinoethansulfonsäure

MM Minimalmedium für Y. lipolytica

OD600 optische Dichte bei 600 nm

OEP overlap extension PCR

ORF open reading frame (offener Leserahmen)

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)

PVDF Polyvinylidenfluorid

RT Raumtemperatur

SDS Natriumdodecylsulfat


VI

SL Stammlösung

Tab. Tabelle

TCA Trichloressigsäure

TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin

U units (enzymatische Einheit)

üN über Nacht

v/v Volumenanteil/Volumenanteil

v/w Masseanteil/Volumenanteil

YPD yeast/pepton/dextrose (Hefeextrakt/Pepton/Glucose)

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Stressantwort von Mikroorganismen

Zellen haben die Fähigkeit auf Veränderungen von Umweltbedingungen, die physikalischen

oder chemischen Ursprungs sein können, zu reagieren. Es handelt sich hierbei um Faktoren

wie Temperatur, Druck, Strahlung, Salzkonzentration, Wassergehalt, Ionen, toxische chemi-

sche Wirkstoffe, pH-Wert und Verfügbarkeit von Nährstoffen. Die spezifischen Reaktionen

erfordern ein komplexes Netzwerk an Signaltransduktionen. Die Adaptation an diese Bedin-

gungen durch Anpassung der Genexpression und des Zellmetabolismus gewährleistet

Wachstum und Vermehrung der Zellen.

1.1.1 Nährstoffmangel

Nährstoffmangel führt in Hefezellen, in Abhängigkeit von der jeweils fehlenden Nährstoff-

komponente, zur Veränderung und Anpassung des zellulären Metabolismus an die neuen

Bedingungen.

Saccharomyces cerevisiae gehört zu den fakultativ anaeroben Hefen. Eine Besonderheit von

S. cerevisiae ist, dass sie unter aeroben und anaeroben Bedingungen Hexose-Zucker (z. B.

Glucose, Fructose) vergären kann. Nicht vergärbare Substrate, wie z. B. Ethanol, Lactat oder

Acetat, werden im oxidativen Metabolismus verwertet. Wächst S. cerevisiae als Batchkultur

in Medium mit Glucose als C-Quelle, so kann das Wachstum in verschiedene Phasen unter-

teilt werden. Die erste Phase ist durch schnelles Wachstum charakterisiert, Glucose wird

vergärt und gleichzeitig werden die für oxidativen Metabolismus notwendigen Gene repri-

miert. Nach dem Glucoseverbrauch kommt es zum diauxischen Shift, d. h. die Hefezelle

stellt ihren Stoffwechsel auf die aerobe Verwertung von Ethanol um. Dieser Prozess hat eine

kurze lag-Phase zur Folge. Während des diauxischen Shifts werden die durch Glucose re-

primierten Gene dereprimiert und die Kultur adaptiert ihren Metabolismus an die Verwertung

von Ethanol und anderen Nebenprodukten der Gärung (z. B. Glycerin, Acetat) (Francois et

al., 1987; Blanco et al., 2004). Die Derepression von Genen, die für die Verwertung von

Ethanol benötigt werden, beginnt bereits bevor die Glucose vollständig verbraucht ist

(Moehle and Jones, 1990). Das Wachstum in der dritten, der post-diauxischen Phase, ist

wesentlich langsamer und endet mit dem Verbrauch des zur Verfügung stehenden Ethanols,

Glycerins und Acetats. Danach geht die Kultur in die stationäre Phase über. S. cerevisiae

bevorzugt die Verwertung vergärbarer Zucker, insbesondere Glucose. Auch bei einem

Wachstum auf Mischmedien mit Glucose und Fructose oder Mannose als C-Quellen wird

Einleitung

2

zuerst die Glucose vergärt (Suomalainen and Oura, 1971; Wills, 1990). Durch Glucose re-

primierte Gene können in drei Klassen eingeteilt werden (Ronne, 1995): I) Spezifische glu-

coneogenetische Enzyme (Fructose-1,6-Biphosphatase, Phosphoenolpyruvatcarboxykinase)

und Gene des Glyoxylatzyklus (Isocitratlyase, Malatsynthase) (Yin et al., 1996), II) mito-

chondriale Enzyme (Enzyme des Krebszyklus und der Atmung) (de Winde and Grivell, 1993)

und III) Proteine die an der Aufnahme alternativer C-Quellen (Galactose, Maltose) beteiligt

sind. Der Ras/cAMP Signaltransduktionsweg ist unter Berücksichtigung vorhandener Nähr-

stoffe zur Koordinierung von Wachstum, Zellzyklus und Metabolismus notwendig (Ronne,

1995). Durch diesen Signaltransduktionsweg werden Prozesse während des diauxischen

Shifts und der folgenden post-diauxischen Phase negativ reguliert. Dies führt u. a. zur Akti-

vierung von Gis1p. Dieser Transkriptionsfaktor induziert während des diauxischen Shifts Ge-

ne, deren Genprodukte für das Überleben der Zelle unter Nährstofflimitation notwendig sind

(Pedruzzi et al., 2000). Der Snf1p Kinase Komplex ist ein genereller Aktivator für die De-

repression Glucose reprimierter Gene. Seine Aktivität inhibiert die Funktion eines Komple-

xes, der aus dem Transkriptionsfaktor Mig1p und den Corepressoren Ssn6p/Cyc8p und

Tup1p/Cyc9p besteht. Dieser Komplex reprimiert die Expression von Genen in Anwesenheit

von Glucose (Nehlin and Ronne, 1990; Nehlin et al., 1991; Keleher et al., 1992; Lundin et al.,

1994; Treitel and Carlson, 1995; Ostling et al., 1996). Bei Glucosemangel wird z. B. die Re-

pression von CAT8 durch Mig1p aufgehoben (Hedges et al., 1995). Der Transkriptionsaktiva-

tor Cat8p ist für die Expression gluconeogenetischer Gene, die ein CSRE-Motiv (carbon

source responsive element) in ihrem 5´-upstream Bereich enthalten, verantwortlich (Hedges

et al., 1995). Er bindet an die CSRE-Motive und aktiviert somit die Transkription dieser Gene

(Rahner et al., 1996; Randez-Gil et al., 1997).

Viele glycolytische Gene enthalten in ihren Promotoren Bindungsstellen für multifunktionale

Transkriptionsfaktoren, wie z. B. Rap1p, Gcr1p, Rep1p und Abf1p (Chambers et al., 1995).

S. cerevisiae ist in der Lage, eine große Vielfalt an Nährstoffkomponenten als N-Quelle zu

nutzen. Bevorzugte N-Quellen sind Ammonium, Glutamin, Glutamat sowie Asparagin, das in

Ammonium und Glutamat gespalten wird (Cooper, 1982; Magasanik, 1992). Die Verwertung

von Ammonium, Glutamin und Glutamat in Hefezellen ist in Abb. 1 dargestellt. Während des

Wachstums in Anwesenheit dieser N-Quellen werden Enzyme, die für die energieaufwendi-

gere Aufnahme und Verwertung von anderen N-Quellen wie Prolin, Allantoin oder γ-Amino-

butyrat notwendig sind, reprimiert (NCR: nitrogen catabolite repression) (Cooper, 1982;

Magasanik, 1992; Coffman et al., 1995). In S. cerevisiae wird die Stickstoff-Katabolit-

Repression durch vier Transkriptionsfaktoren der GATA-Familie (Aktivatoren: Gln3p, Gat1p/

Nil1p; Repressoren: Dal80p/Uga43p, Deh1p/Gzf3p) reguliert (ter Schure et al., 2000). Bei

Mangel an Stickstoff werden Gln3p und Gat1p im Kern angereichert. Diese Transkriptions-

Einleitung

3

faktoren binden an die GATA-Sequenzen von NCR-Genen und aktivieren so deren Trans-

kription (Stanbrough et al., 1995). Steht z. B. kein Glutamin als N-Quelle zur Verfügung, so

wird die Glutamin Synthetase Gln1p benötigt, welche die Reaktion von Glutamat zu Glutamin

katalysiert. Sinkt die intrazelluläre Konzentration an Glutamin, dann wird die Expression von

GLN1 durch den Transkriptionsfaktor Gln3p gesteigert (Minehart and Magasanik, 1991). In

Anwesenheit von Glutamin werden Gln1p und Gln3p durch Ure2p gehemmt (Wickner, 1994).

Tritt in der Zelle ein Mangel an Aminosäuren auf, so ist deren Biosynthese notwendig. Für

die meisten Aminosäuren ist Glutamat (Glutamin) die Quelle für Aminogruppen. Unter diesen

Bedingungen erfolgt die Derepression des transkriptionellen Aktivators Gcn4p durch den

regulatorischen GCN-Mechanismus (general amino acid control) (Hinnebusch, 1990). Dieser

Mechanismus wird durch das Auftreten ungeladener tRNAs aktiviert, die durch die Sensor-

Kinase Gcn2p detektiert werden (Wek et al., 1995; Kubota et al., 2000; Kubota et al., 2001).

Gcn4p aktiviert eine Reihe von Genen, die in die Aminosäurebiosynthese involviert sind

(Hinnebusch, 1990). Durch die gesteigerte Synthese von Aminosäuren wird der intrazelluläre

Glutamin-Pool reduziert. Dies führt zur Induktion von GLN1 durch Gln3p. Die Expression von

GLN1 wird außerdem direkt durch Gcn4p aktiviert (Minehart and Magasanik, 1992).

Werden heterozygote (a/α-diploide) Hefezellen Stickstoffmangel ausgesetzt, so wird ihr

Knospungsmuster polarisiert und dadurch kommt es zur Bildung von Pseudohyphen

(Gimeno et al., 1992).

Abb. 1: Verwertung von Ammonium und anderen N-Quellen in Hefe (nach Cooper, 1982; Magasanik, 1992; ter Schure et al., 2000). Ammonium kann direkt mit α-Ketogluta-rat zu Glutamat oder mit Glutamat zu Glutamin und anschließend zu Glutamat um-gewandelt werden. Das entstandene Glutamat wird in α-Ketoglutarat und Ammoni-um überführt. Gdh1: NADPH abhängige Glutamat-Dehydrogenase, Gln1: Glutamin-Synthetase, GluS: Glutamat-Synthase, Gdh2: NAD+ abhängige Glutamat-Dehydro-genase.

Als Phosphatquelle nutzt S. cerevisiae, wie viele andere Hefen, bevorzugt anorganisches

Phosphat (Pi: inorganic phosphate). Kommt es zum Mangel an Pi so können eine Reihe or-

ganischer Verbindungen mit Hilfe von sauren Phosphatasen als Phosphatquelle genutzt

werden (Oshima, 1982; Vogel and Hinnen, 1990; Johnston and Carlson, 1992). Gene die für

die Verwertung dieser Phosphatquellen notwendig sind, werden spezifisch durch die Anwe-

1. NH3 + α-Ketoglutarat + NADPH/H+ Glutamat + NADP+

2. NH3 + Glutamat + ATP Glutamin + ADP/Pi

3. Glutamin + α-Ketoglutarat + NADH/H+ 2 Glutamat + NAD+

4. Glutamat + NAD+ α-Ketoglutarat + NH3 +NADH/H+

Gdh1

Gln1

GluS

Gdh2

1. NH3 + α-Ketoglutarat + NADPH/H+ Glutamat + NADP+

2. NH3 + Glutamat + ATP Glutamin + ADP/Pi

3. Glutamin + α-Ketoglutarat + NADH/H+ 2 Glutamat + NAD+

4. Glutamat + NAD+ α-Ketoglutarat + NH3 +NADH/H+

Gdh1

Gln1

GluS

Gdh2

Einleitung

4

senheit von Pi reprimiert (Martinez et al., 1998; Oshima, 1997). Nach Verbrauch von Pi wer-

den Gene der „phosphate-starvation response“ aktiviert. So wird u. a. das Gen PHO5 (co-

diert für eine sekretierte saure Phosphatase mit breitem Substratspektrum) durch den

Transkriptionsaktivator Pho4p induziert (Vogel et al., 1989; Berben et al., 1990; Svaren et al.,

1994; Lenburg and O'Shea, 1996). Die negative Regulation von Pho4p während hoher Pi-

Konzentrationen erfolgt durch die Bindung der Regulatoren Pho80p und Pho85p (Uesono et

al., 1992; Hirst et al., 1994; Kaffman et al., 1994).

Schwefel wird in der Zelle weitgehend nur für die Biosynthese von Methionin und Cystein

benötigt. Arten der Gattung Saccharomyces können Sulfat leicht als Schwefelquelle nutzen.

Dieses wird von zwei Sulfat-spezifischen Permeasen (Sul1p, Sul2p) in die Zelle aufgenom-

men, zu Sulfid reduziert und sofort für die Biosynthese von Methionin und Cystein genutzt

(Jones and Fink, 1982; Mountain et al., 1991). Alle Gene, die für die Reduktion und Assimi-

lierung von Sulfat notwendig sind (MET-Gene), werden auf Transkriptionsebene durch

S-Adenosyl-Methionin (AdoMet) oder Methionin reprimiert (Thomas et al., 1989; Thomas and

Surdin-Kerjan, 1997).

Hefezellen, denen ein oder mehrere lebenswichtige Nährstoffe fehlen, beenden ihren Zell-

zyklus und verweilen in der nächsten G1-Phase (Pringle and Hartwell, 1981). Später gehen

sie in die G0- bzw. stationäre Phase über, hier können sie Nährstoffmangel wesentlich län-

ger überleben als in den anderen Phasen des Zellzyklus. Stehen wieder alle Nährstoffe zur

Verfügung, so geht die Zelle in die G1-Phase zurück und durchläuft den üblichen Zellzyklus

(Winderickx et al., 2003).

1.1.2 Hitzestress

Hitzestress verursacht eine schnelle Akkumulation von Trehalose im Cytoplasma. Trehalose

ist ein Disaccharid, das aus zwei Glucoseeinheiten besteht. Dieser Zucker ist eine wichtige

Substanz zur Erhaltung membraner Strukturen während Wassermangels, Kälte- oder Hitze-

stresses (Colaco et al., 1992; Hottiger et al., 1994). Außerdem dient Trehalose zur Stabilisie-

rung von Proteinen, indem es ihre durch Wärme ausgelöste Aggregation verhindert (Trott

and Morano, 2003). Hitzeschock hat unmittelbare und verzögerte Effekte auf die Zellmem-

bran. Unmittelbar wird die Permeabilität der Membran für Protonen und Ionen erhöht, da-

durch kommt es zur Störung des Protonengradienten der Plasmamembran. Dies hat zur Fol-

ge, dass die für die Nährstoffaufnahme, Ionenbalance und Regulation des intrazellulären pH-

Wertes wichtige H+-ATPase aktiviert wird (Coote et al., 1994; Piper et al., 1997). Somit kann

der erhöhten passiven Aufnahme von Protonen in die Zelle ein aktiver Transport nach außen

Einleitung

5

entgegengesetzt werden. Verzögerte Effekte auf die Zellmembran sind: I) Änderungen in der

Proteinzusammensetzung (Reduzierung der Konzentration der H+-ATPase, Auftreten von

Hsp30p: heat shock protein) (Panaretou and Piper, 1992), II) Veränderung der Sättigung von

Lipiden in der Membran (dient wahrscheinlich zur Reduktion der Membranpermeabilität, u. a.

könnte dadurch die Aufnahme von Protonen reduziert werden) (Watson, 1984), III) die Deh-

nung der Membran während des Wachstums bei hohen Temperaturen öffnet Ca2+-Kanäle

(somit werden Ca2+-abhängige Enzyme aktiviert) (Piper, 1997). Weiterhin kommt es durch

verschiedene Stressfaktoren, wie Hitzeschock, Ethanol, schwache organische Säuren oder

Glucoselimitierung zur Induktion des Plasmamembranproteins Hsp30p (Piper et al., 1994;

Panaretou and Piper, 1992; Piper et al., 1997). Während längerem Hitzestress verringert

sich die Menge des H+-ATPase-Proteins (Panaretou and Piper, 1992) und dessen Aktivität

wird durch Hsp30p herabgesetzt (Piper et al., 1997). In gestressten Zellen verbraucht die H+-

ATPase sehr viel ATP, Hsp30p wirkt somit einem unnötigen Energieverbrauch entgegen

(Piper et al., 1997). Stress durch Hitze hat ebenfalls Auswirkungen auf den Zellzyklus, die

Zellen akkumulieren ohne Knospen in der G1-Phase (Johnston and Singer, 1980). Zellen,

die Hitzestress ausgesetzt sind, verändern ebenso ihr Expressionsmuster. Promotoren von

S. cerevisiae, deren Genexpression durch Hitzestress induziert wird, können zwei verschie-

dene Promotorelemente enthalten (Piper, 1997). Es handelt sich hierbei um HSEs (heat

shock element) und STREs (stress responsive element). An HSEs bindet der Hitzeschutz-

faktor Hsf1p. Dieser transkriptionelle trans-Aktivator steuert die Induktion von Genen auf-

grund von Hitzeschock (Sorger and Pelham, 1988; Wiederrecht et al., 1988). Im Gegensatz

zu HSEs werden Promotoren, die STREs enthalten, nicht nur durch Hitzeschock, sondern

auch durch andere Stressbedingungen, wie z. B. Osmostress, oxidativen Stress, N-Mangel,

schwache organische Säuren, hohen pH-Wert außerhalb der Zelle oder Ethanol aktiviert

(Belazzi et al., 1991; Marchler et al., 1993; Schüller et al., 1994; Mager and De Kruijff, 1995;

Ruis and Schüller, 1995). An die Konsensussequenz CCCCT (in beiden Orientierungen)

(Kobayashi and McEntee, 1993) von STREs binden die Transkriptionsaktivatoren Msn2p und

Msn4p (Martinez-Pastor et al., 1996). Hitzeschockgene können unter der Kontrolle von HSE,

STRE oder beider Elemente stehen (Piper, 1997).

1.1.3 Stress durch schwache Säuren und Ethanol

Wachsen Mikroorganismen in Gegenwart schwacher organischer Säuren, passieren diese

Säuren in undissoziierter Form durch passive Diffusion die Zellmembran (Sikkema et al.,

1995; van der Rest et al., 1995; Casal et al., 1996; Geros et al., 2000). Da im Cytoplasma ein

höherer pH-Wert vorherrscht, dissoziieren die Säuren in der Zelle. Bei diesem Vorgang wer-

den Protonen freigesetzt, so dass der intrazelluläre pH-Wert sinkt und so verschiedene

Einleitung

6

Stoffwechselwege gestört werden (Krebs et al., 1983). Ethanol gelangt ebenfalls durch pas-

sive Diffusion in die Zelle, was aber im Gegensatz zu schwachen Säuren unabhängig vom

pH-Wert erfolgt. Schwache organische Säuren und Ethanol verändern in der Zelle verschie-

dene Prozesse, wie den Ionen- und Nährstofftransport, die Proteinsynthese, die Morphoge-

nese, die Membranstruktur sowie die Fettsäure- und Phospholipidzusammensetzung der

Membran (Mishra, 1993; Sikkema et al., 1995). Dies führt in vielen Fällen zum Zelltod.

Schwache Säuren sind bei niedrigem pH-Wert antimikrobiell wirksam, dagegen wirkt Ethanol

unabhängig vom pH-Wert zelltoxisch. Aufgrund dieser Eigenschaften werden Ethanol und

verschiedene organische Säuren, wie Milch- und Essigsäure, seit langer Zeit zur Konservie-

rung von Lebensmitteln eingesetzt. Im Gegensatz zu den gut untersuchten intrazellulären

Prozessen, die durch Ethanol und organische Säuren ausgelöst werden, ist über die moleku-

laren Mechanismen zur Anpassung an diese Stressbedingungen nur wenig bekannt. Einige

Mikroorganismen können sich an höhere Konzentrationen von organischen Säuren und

Ethanol anpassen und diese als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen. Für das Wachstum

auf nicht fermentierbaren C-Quellen sind ein intakter Glyoxylatzyklus und die Gluconeogene-

se notwendig. Weiterhin müssen sich die Mikroorganismen wirksam gegen die toxischen

Effekte der Substrate schützen. Dies kann u. a. durch kontrollierte Aufnahme oder aktive

Ausfuhr der toxischen Bestandteile erfolgen. Obwohl von der Existenz aktiver Transportsys-

teme für die anionische Form von Acetat ausgegangen wird (Casal et al., 1996; Geros et al.,

2000), konnte bisher in keinem Organismus ein spezifisches Molekül für die intrazelluläre

Aufnahme dieses Anions isoliert und charakterisiert werden. In S. cerevisiae konnten aller-

dings verschiedene Membranproteine, die für das Wachstum von Zellen unter schwachem

Säurestress wichtig sind, wie z. B. Hsp30p, Pdr12p (pleiotropic drug resistance) und Azr1p

(acetic acid and azole resistance), charakterisiert werden.

In Bakterien sind verschiedene Prozesse bekannt, die der Wirkung von schwachen Säuren

entgegenwirken. Ziel dieser Mechanismen ist die Aufrechterhaltung der Nährstoff- und Ener-

gieversorgung sowie des cytoplasmatischen pH-Wertes. Weiterhin ist der Schutz von Protei-

nen und der DNA notwendig. Vor allem gastrointestinale Mikroorganismen haben Mecha-

nismen entwickelt, um den extrem niedrigen pH-Wert von 1,5 im Magen zu überleben (Boot

et al., 2002). Allerdings wird dieser niedrige pH-Wert hauptsächlich durch Salzsäure verur-

sacht.

Es muss zwischen der Stressantwort von Zellen allein auf starke Säuren und der Stressant-

wort auf niedrigen pH-Wert im Zusammenspiel mit schwachen Säuren unterschieden wer-

den. Im Gegensatz zu starken Säuren (z. B. Salzsäure) liegen schwache Säuren bei niedri-

gem pH-Wert in ihrer undissoziierten Form vor und gelangen durch passive Diffusion in die

Zelle.

Einleitung

7

Foster (2000) stellt in einem Übersichtsartikel verschiedene Strategien von neutrophilen Bak-

terien zum Schutz vor Stress durch Säuren dar. Escherichia coli verfügt über vier verschie-

dene Systeme, um das Cytoplasma alkalisieren zu können (Foster, 2000; Richard and Fos-

ter, 2004). Das AR1 (acid resistant system) ist in der stationären Phase induziert und benö-

tigt den alternativen Sigmafaktor RpoS und CRP (cyclisches AMP receptor protein)

(Castanie-Cornet et al., 1999). Über die strukturellen Komponenten und den Mechanismus

dieses Systems ist bisher nichts bekannt. Die Wirkungsweise der folgenden Systeme beruht

auf der Decarboxylierung der jeweils involvierten Aminosäure (Glutamat, Arginin oder Lysin),

wobei je ein Proton aus dem Cytoplasma verbraucht wird. In der stationären Phase oder

während des logarithmischen Wachstums in saurem Minimalmedium wird das AR2 induziert.

Dieses System benötigt extrazelluläres Glutamat (Castanie-Cornet and Foster, 2001). Das

dritte System AR3 ist ähnlich dem zweiten, bis auf die Tatsache, dass es extrazelluläres Ar-

ginin benötigt und bei niedrigem pH-Wert unter aeroben Bedingungen induziert wird

(Castanie-Cornet et al., 1999). Das letzte System AR4 beruht auf der Decarboxylierung von

Lysin durch die Lysin-Decarboxylase (Iyer et al., 2003).

Weiterhin sind Bakterien in der Lage durch K+/H+-Antiporter oder mit Hilfe von F0F1-ATPasen

Protonen aus dem Cytoplasma auszuschleusen (Foster, 2000). Helicobacter pylori setzt

Harnstoff mittels Ureasen in CO2 und alkalischen Ammoniak um, wodurch das Cytoplasma

alkalisiert wird (Marshall et al., 1990; Scott et al., 1998).

Der Gehalt von Cyclopropan-Fettsäuren in der Membran ist in E. coli wichtig für das Überle-

ben unter Säurestress, da diese die Permeabilität der Membran beeinflussen (Chang and

Cronan, 1999). An Säure adaptierte Zellen von E. coli und Salmonella enterica (Serovar

Typhimurium) können ihren intrazellulären pH-Wert besser aufrechterhalten als nicht adap-

tierte Zellen. Die Bildung von Cyclopropan-Fettsäuren könnte einen erschwerten Protonen-

einfluss in die Zelle zur Folge haben (Jordan et al., 1999; Foster, 2000).

S. enterica (Serovar Typhimurium) besitzt zwei verschiedene Systeme (ATR: acid tolerance

response), um auf Stress durch Säuren während des logarithmischen Wachstums und der

stationären Phase reagieren zu können (Foster and Hall, 1991; Foster, 2000). Kommt es in

der logarithmischen Wachstumsphase zum Stress durch Säuren, so werden 50 Säure-

schockproteine (ASPs: acid shock proteins) gebildet (Foster, 1991; Foster, 1993). Diese

werden durch den intra- bzw. extrazellulären pH-Wert induziert (Foster, 2000). Zu den wäh-

rend der logarithmischen Phase induzierten regulatorischen Proteinen gehören der alter-

native Sigmafaktor σS (codiert durch rpoS), Fur (ferric uptake regulator) und PhoP/Q

(phosphatase). Jeder dieser Regulatoren kontrolliert die Expression mehrerer ASPs (Foster,

2000). Mit dem Erreichen der stationären Phase wird σS und somit die Säuretoleranz indu-

ziert. Der Regulator OmpR (outer membrane porine) wird σS-unabhängig, durch Säure indu-

ziert (Bang et al., 2000). Die Induktion der Reaktionen auf Säurestress findet interessanter-

Einleitung

8

weise auch bei neutralem pH-Wert und gleichzeitig hohen Konzentrationen an organischen

Säuren statt (Kwon and Ricke, 1998).

Mittels 2D-Elektrophorese konnten in Acetobacter acetii 19 Proteine (Aaps: acetate adaptati-

on proteins) identifiziert werden, die spezifisch durch Acetat induziert werden (Steiner and

Sauer, 2001).

Weiterhin spielen Proteine zur Reparatur der DNA (Ada) eine Rolle, da diese durch einen

sauren pH-Wert geschädigt wird (Foster, 2000).

Die Ansäuerung ruft ebenfalls eine Aggregation von Proteinen hervor. Diese Aggregation

wird durch die Bindung von Chaperonen an diese Proteine verhindert. Es ist unklar, ob diese

gebundenen Proteine nach Neutralisierung des pH-Wertes rückgefaltet oder abgebaut wer-

den (Boot et al., 2002).

In Hefen konnten verschiedene Proteine charakterisiert werden, die für eine Anpassung der

Zellen an Säurestress notwendig sind. Durch die Dissoziation der aufgenommenen Säuren

kommt es im Cytoplasma zur Anreicherung von Protonen. Die Plasmamembran H+-ATPase

pumpt Protonen aus der Zelle, wodurch der pH-Wert im neutralen Bereich gehalten wird und

der elektrochemische Protonengradient erhalten bleibt (Goffeau and Slayman, 1981). Dieser

Prozess ist ATP-abhängig. Schwache Säuren, wie z. B. Octansäure oder Sorbinsäure, erhö-

hen die Aktivität der Plasmamembran H+-ATPase (Viegas and Sa-Correia, 1991; Viegas et

al., 1994; Holyoak et al., 1996; Viegas et al., 1998). McCusker et al. (1987) zeigten, dass

pma1-Mutanten (plasma membrane H+-ATPase) mit einer geringen Pma1p-Aktivität nicht

mehr in der Lage sind, bei niedrigem pH-Wert und in Anwesenheit schwacher Säuren zu

wachsen. Die Aktivierung der Pma1p wird nicht durch den extrazellulären pH-Wert (z. B.

durch HCl bedingt), sondern durch die Wirkung schwacher organischer Säuren (z. B. Succi-

nat und Acetat) verursacht (Carmelo et al., 1997). Weiterhin kann die Aktivierung der Pma1p

durch Glucose erfolgen (Serrano, 1983). Die Aktivierung durch Glucose über Phosphorylie-

rung/Dephosphorylierung ist ein reversibler Prozess (Morsomme et al, 2000), wohingegen

die Aktivierung durch den niedrigen intrazellulären pH-Wert irreversibel zu sein scheint

(Eraso and Gancedo, 1987). Eine weitere Plasmamembran H+-ATPase (Pma2p) wird durch

verschiedene Stressoren (z. B. Octansäure) induziert. Die Expression dieses Proteins ist

aber hundertfach geringer als die von Pma1p, somit ist die Aktivität von Pma2p für die Zelle

kaum von Bedeutung (Viegas et al., 1994; Carmelo et al., 1996).

Hsp30p ist ein Protein der Plasmamembran, das bei verschiedenen Stressbedingungen, wie

Ethanol, Hitzestress oder Glucosemangel, aber auch durch schwache organische Säuren

induziert wird. In Gegenwart schwacher organischer Säuren wird in S. cerevisiae die Aktivität

der H+-ATPase durch Hsp30p gesenkt. Somit wird ein ausgewogener Energiehaushalt bei

länger anhaltenden Stressbedingungen gewährleistet und ein übermäßiger Verbrauch von

Einleitung

9

ATP vermieden (Braley and Piper, 1997; Piper et al., 1997). Die Zelle muss aber auch die

passive Diffusion der protonierten Säure reduzieren. Welcher Mechanismen sie sich dazu

bedient, ist bisher weitgehend unbekannt. Zum einen könnte ähnlich wie in Bakterien die

Veränderung der Zellmembranzusammensetzung die Diffusion verringern. Andererseits ist

bekannt, dass Zellwand-Mannoporine die Porosität der Zellwand vermindern (De Nobel and

Barnett, 1991), dies könnte ebenfalls zu einer Abnahme der Diffusion führen.

Ein weiteres für die Anpassung an Säuren wichtiges Gen ist PDR12 (pleiotropic drug re-

sistance), dessen Genprodukt in der Plasmamembran lokalisiert ist. Das Pdr12-Protein ist

ein Mitglied der ABC-Transporter-Proteinfamilie (ATP-binding cassette) und wird u. a. durch

Sorbinsäure induziert. Die pdr12-Deletionsmutante weist eine erhöhte Sensitivität gegenüber

Sorbin-, Benzoe-, Propion- und Essigsäure auf (Piper et al., 1998; Holyoak et al., 1999). Un-

ter Verbrauch von ATP ist Pdr12p in der Lage intrazellulär akkumulierte Säureanionen mit

einer Kettenlänge von C1 bis C7 aus der Zelle zu transportieren (Holyoak et al., 1999). Es

stellte sich jedoch später heraus, dass Acetat, Alkohole (Ethanol, Propanol, Butanol), hohe

Osmolarität (1 M NaCl) und Oxidationsmittel (Menadion, H2O2) keine detektierbare Aktivität

von PDR12 induzieren. Der Regulator von PDR12 ist War1p (weak acid response). Dieser

Transkriptionsaktivator bindet in seiner phosphorylierten Form an zwei WARE-Elemente

(weak acid response element) im 5´-upstream Bereich von PDR12 und induziert so dessen

Expression. War1p wird durch Sorbin-, Benzoe- und Propionsäure, jedoch nicht durch Essig-

säure aktiviert. Die Induktion von PDR12 beruht allerdings nicht auf dem niedrigen pH-Wert,

da Acetat nicht aktivierend wirkt, obwohl es den pH-Wert in der Zelle erniedrigt. Im Gegen-

satz dazu stellt Sorbinsäure einen Aktivator dar, obwohl es den intrazellulären pH-Wert nicht

beeinflusst (Kren et al., 2003). Die negative Regulation von Pdr12p erfolgt posttranslational

durch Cmk1p (Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase1). Zellen, in denen CMK1 deletiert

ist, sind konstitutiv resistent gegenüber Sorbin- und Benzoesäure (Holyoak et al., 2000).

Schüller et al. (2004) führten phänotypische Analysen (Wachstum auf YPD mit Sorbinsäure)

und Microarrays nach Behandlung der Zellen mit Sorbinsäure durch. In S. cerevisiae können

durch schwache Säuren induzierbare Gene durch drei verschiedene Signaltransduktionswe-

ge aktiviert werden. Diese Gene werden unterteilt in: I) Msn2p/4p abhängige Gene, II) War1p

abhängige Gene, III) Msn2p/4p und War1p unabhängige Gene (z. B. HSP30). Dabei können

einzelne Gene auch von Msn2p/4p und War1p koreguliert werden. PDR12 ist das einzige

Gen, das durch Sorbat induzierbar ist und für die Anpassung an Stressbedingungen benötigt

wird (Schüller et al., 2004).

Das Azr1-Protein (acetic acid and azole resistance) wird in S. cerevisiae durch den ORF

YGR224 codiert. Es ist ein Plasmamembrantransporter der „Major Facilitator Superfamily“

(MFS) und an der multiplen Wirkstoffresistenz (MDR = multiple drug resistance) gegenüber

Azolen beteiligt. Azr1p wird für die Anpassung der Hefe an kurzkettige organische Säuren,

Einleitung

10

insbesondere an Acetat, benötigt. Es ist aber nicht essentiell für die Verwertung dieser

C-Quellen. Die genaue Funktion von Azr1p bei der Essigsäureresistenz ist noch unklar. Es

exportiert keine Acetationen aus der Zelle, aber es könnte indirekt die Acetataufnahme be-

einflussen (Tenreiro et al., 2000). Der positive Regulator Ylr266p von AZR1 bindet in dessen

5´-upstream Bereich und induziert somit dessen Expression (Hikkel et al., 2003).

Aqr1p (weak acid and quinidine resistance) verleiht Hefezellen eine erhöhte Resistenz ge-

genüber toxischen Konzentrationen von Azolen, Kristallviolett und kurzkettigen Monocarbo-

xylsäuren (Tenreiro et al., 2002). Allerdings scheint dies nur ein Nebeneffekt zu sein, da die-

ses Protein hauptsächlich an der Sekretion von Aminosäuren aus der Zelle beteiligt ist

(Velasco et al., 2004).

Der ABC-Transporter Yor1p (Yrs1p) vermittelt Zellen Resistenz gegenüber Reveromycin A

und anderen Stoffen. Außerdem scheint er für die Toleranz von S. cerevisiae gegenüber

Benzoe-, Propion-, Essigsäure und anderen organischen Anionen mit Carboxylgruppen von

Bedeutung zu sein (Cui et al., 1996).

1.2 Aufnahme und Verwertung von Acetat

Bei niedrigem pH-Wert erfolgt die Aufnahme schwacher Säuren vor allem durch passive Dif-

fusion (Sikkema et al., 1995; van der Rest et al., 1995; Casal et al., 1996; Geros et al.,

2000). Viele Hefen sind in der Lage auch bei höheren pH-Werten schwache Säuren zu ver-

werten, deshalb müssen spezifische Transportsysteme vorhanden sein. Die Aktivität bekann-

ter Monocarboxylat-Transporter ist jeweils von den zur Verfügung stehenden C-Quellen ab-

hängig.

Für den Transport von Acetat, Formiat und Propionat ist in Dekkera anomala und Torulaspo-

ra delbrueckii ein durch Glucose reprimierter Proton-Symporter zuständig (Casal and Leão,

1995; Geros et al., 2000).

Die Hefe Zygosaccharomyces balii ist eine stressresistente Hefe, vor allem gegenüber Säu-

re-haltigem Medium und Ethanol. Sie befördert Acetat mittels eines Proton-Symport-

Transportsystems, das ebenfalls Propionat und Formiat, aber nicht Lactat, Sorbat und Ben-

zoat transportiert. Dieses System ist im Gegensatz zu denen von anderen Hefen auch in

Anwesenheit von Glucose oder Fructose aktiv, es wird dann aber nur noch Acetat als Sub-

strat erkannt (Sousa et al., 1996). In Z. balii unterliegt die Acetyl-CoA-Synthetase nur be-

schränkt der Glucoserepression, deshalb ist die Hefe in der Lage Acetat gleichzeitig neben

Glucose zu verwerten (Sousa et al., 1998).

Yarrowia lipolytica ist ebenfalls in der Lage in Gegenwart von Glucose die organischen Säu-

ren Acetat, Succinat, Propionat oder Malat zu verwerten. Stehen neben Glucose Citrat oder

Lactat als C-Quellen zur Verfügung, so wird ein diauxisches Wachstum beobachtet. Dies

Einleitung

11

lässt den Schluss zu, dass die Verwertung der beiden letzt genannten Säuren der Glucose-

repression unterliegt (Rodrigues and Pais, 2000). In Y. lipolytica liegen derzeit keine Unter-

suchungen zur Aufnahme von schwachen Säuren vor. Es ist nahe liegend, dass auch bei

dieser Hefe die undissoziierte Säure durch passive Diffusion in die Zelle gelangen kann.

In der Hefe S. cerevisiae konnten zwei Monocarboxylat-Proton-Symporter mit unterschiedli-

chen Substratspezifitäten identifiziert werden. Wachsen die Zellen auf Essigsäure oder Etha-

nol, so werden Acetat, Formiat und Propionat durch den gleichen Monocarboxylat-Proton-

Symporter transportiert. Lactat und Pyruvat können dagegen unter diesen Bedingungen nicht

aufgenommen werden (Casal et al., 1996). Während des Wachstums auf Lactat ist zusätz-

lich ein Transporter für Lactat, Pyruvat, Propionat und Acetat aktiv (Cassio et al., 1987; Casal

et al., 1996). Beide Transporter werden durch Glucose, Fructose und andere Zucker voll-

ständig deaktiviert. Somit kann die Aufnahme schwacher Säuren nur durch passive Diffusion

stattfinden (Casal et al., 1996). Das Jen1-Protein ist in S. cerevisiae für den Lactat-Proton-

Symport verantwortlich (Casal et al., 1999; Makuc et al., 2001). Paulsen et al. (1998)

vermuteten, dass der ORF YHL008c für einen Acetat-Proton-Symporter kodiert. Dies konnte

jedoch nicht bestätigt werden (Makuc et al., 2001). Es konnte dagegen nachgewiesen wer-

den, dass Ycr010cp in S. cerevisiae am aktiven Transport von Acetat in die Zelle beteiligt ist.

Die Deletion von YCR010c führt im Vergleich zum Wildtyp nicht zu einer Veränderung in der

Genexpression in Gegenwart von Acetat. Somit ist dessen Genprodukt nicht an der durch

Acetat ausgelösten Stressreaktion der Zelle beteiligt (Paiva et al., 2004). Das Ycr010cp ge-

hört zur GPR1/FUN34/yaaH-Proteinfamilie, die im nächsten Kapitel näher beschrieben wird.

Die zelluläre Verwertung von Acetat erfolgt nach Aktivierung in Acetyl-CoA mit Hilfe Acetyl-

CoA-Synthetase über den Glyoxylatzyklus (Abb. 2).

In S. cerevisiae existieren zwei Gene für die Acetyl-CoA-Synthetase (ACS1, ACS2). Das

ACS1-Gen kodiert für ein Protein mit hoher Affinität zu Acetat (van den Berg et al., 1996).

Dieses Protein wird durch Glucose inaktiviert (de Jong-Gubbels et al., 1997) und dessen

Transkription reprimiert. Das zu Acs1p homologe Acs2p besitzt eine niedrigere Affinität zu

Acetat als Acs1p (van den Berg et al., 1996) und wird im Gegensatz zu diesem in Gegenwart

von Glucose exprimiert (de Jong-Gubbels et al., 1997; van den Berg et al., 1996). Die acs2-

Nullmutante ist nicht mehr in der Lage in Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle zu wach-

sen. Die Deletion von ACS1 führt dagegen in Minimalmedium mit Glucose, Ethanol oder

Acetat als C-Quellen zu einer Verlängerung der lag-Phase, aber beeinflusst nicht die spezifi-

sche Wachstumsrate (van den Berg and Steensma, 1995). Kluyveromyces lactis besitzt

ebenfalls zwei Acetyl-CoA-Synthetasen (Acs1p/2p), deren transkriptionelle Regulation der in

S. cerevisiae gleicht. Im Vergleich zum Wildtyp zeigte die Nullmutante Δacs1 eine 50%ige

Reduktion der spezifischen Wachstumsrate in Medium mit Acetat als C-Quelle (Zeeman and

Einleitung

12

Steensma, 2003). Die Doppelmutante (Δacs1Δacs2) von S. cerevisae bzw. K. lactis ist nicht

mehr lebensfähig (van den Berg and Steensma, 1995; Zeeman and Steensma, 2003). Ein

ACS2 orthologes Gen konnte aus Z. bailii kloniert werden. Die Expression dieses Gens in

S. cerevisiae beeinflusste die spezifische Wachstumsrate in Minimalmedium mit Gluco-

se/Acetat als C-Quellen im Vergleich zum Wildtypstamm nicht. Allerdings konnte eine gering-

fügige Verkürzung der lag-Phase in Medium mit Glucose/Acetat (Acetatkonzentration: 0,1 bis

0,35 %) beobachtet werden. War die Acetatkonzentration höher als 0,35 %, so zeigten die

Zellen beider Stämme eine signifikant längere lag-Phase (Rodrigues et al., 2004).

Abb. 2: Schematische Darstellung des Citrat- und Glyoxylatzyklus und deren Einbindung in den Zellstoffwechsel nach Kujau et al. (1992), Lorenz and Fink (2001), Lorenz and Fink (2002) und Schüller (2003). Reaktionen und Enzyme, die für den Glyoxylat-zyklus spezifisch sind, wurden rot dargestellt. Die jeweiligen Enzyme werden in S. cerevisiae von folgenden Genen codiert: ADH = Alkoholdehydrogenase (ADH2), ALD = Aldehyd-Dehydrogenase (ALD6), Acetyl-CoA-Synthetase (ACS1, 2), Citrat-synthase (CIT1-3), Aconitase (ACO1), Isocitratlyase (ICL1), Malatsynthase (MLS1), Isocitrat-Dehydrogenase (IDH1, 2; IDP1), α-Ketoglutarat-Dehydrogenase (KGD1, 2; LPD1), Succinyl-CoA-Synthetase (LCS1, 2), Succinat-Dehydrogenase (SDH1-4), Fumarase (FUM1), Malat-Dehydrogenase (MDH1-3).

Glyoxylat

Succinyl-CoA

α-Ketoglutarat

Isocitrat

CitratOxalacetat

Malat

Fumarat

Succinat

Acetyl-CoA

Acetat EthanolADHALD

Acetyl-CoA-Synthetase

Citratsynthase

Isocitrat-Dehydrogenase

Aconitase

α-Ketoglutarat-Dehydrogenase

Succinyl-CoA-Synthetase

Succinat-Dehydrogenase

Fumarase

Malat-Dehydrogenase

CO2

CO2

Acetaldehyd

Gluconeogenese

Glycin HämSerin

PurinePhospholipidMethioninCysteinTryptophanThymidilatMethyltetrahydrofolat

Fettsäureβ-Oxidation

Malatsynthase

IsocitratlyaseGlyoxylat

Succinyl-CoA

α-Ketoglutarat

Isocitrat

CitratOxalacetat

Malat

Fumarat

Succinat

Acetyl-CoA

Acetat EthanolADHALD

Acetyl-CoA-Synthetase

Citratsynthase

Isocitrat-Dehydrogenase

Aconitase

α-Ketoglutarat-Dehydrogenase

Succinyl-CoA-Synthetase

Succinat-Dehydrogenase

Fumarase

Malat-Dehydrogenase

CO2

CO2

Acetaldehyd

Gluconeogenese

Glycin HämSerin

PurinePhospholipidMethioninCysteinTryptophanThymidilatMethyltetrahydrofolat

Fettsäureβ-Oxidation

Malatsynthase

Isocitratlyase

Einleitung

13

Im Glyoxylatzyklus werden Zwei-Kohlenstoff-Acetyleinheiten in Vier-Kohlenstoff-Acetylein-

heiten (Succinat) umgewandelt. Dabei umgeht der Glyoxylatzyklus die beiden Decarboxylie-

rungsschritte des Citratzyklus. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass zwei Moleküle

Acetyl-CoA pro Durchgang eingeschleust werden, während es beim Citratzyklus nur ein Mo-

lekül ist. Der Glyoxylatzyklus beginnt wie der Citratzyklus mit der Kondensation von Acetyl-

CoA und Oxalacetat zu Citrat, das im folgenden Schritt zu Isocitrat isomerisiert wird. An-

schließend erfolgt anstatt der Decarboxylierung die Spaltung des Isocitrats in Succinat und

Glyoxylat durch die Isocitratlyase. In den folgenden Schritten wird Oxalacetat aus Glyoxylat

regeneriert. Acetyl-CoA kondensiert mit Glyoxylat zu Malat, dies wird durch die Malat-

Synthase katalysiert. Danach wird Malat zu Oxalacetat oxidiert.

1.3 Die Gpr1/Fun34/yaaH-Proteinfamilie

Mitglieder der Gpr1/Fun34/yaaH-Familie besitzen die konservierten Sequenzmotive

(A/G)NPAPLGL und SYG(X)FW, sowie 5 bis 6 membranspannende Domänen. Die Gene

dieser Proteinfamilie codieren für hochkonservierte Proteine, die sowohl in Archae- und Eu-

bakterien als auch in niederen eukaryotischen Zellen vorkommen. Die Proteine der Proka-

ryoten besitzen im Gegensatz zu den eukaryotischen Vertretern keinen hydrophilen

N-Terminus.

1.3.1 Das GPR1-Gen der Hefe Yarrowia lipolytica

Mutanten der Hefe Y. lipolytica, die in der Acetatverwertung blockiert sind, wurden von meh-

reren Arbeitsgruppen isoliert und charakterisiert (Matsuoka et al., 1980; Matsuoka et al.,

1984; Bassel and Mortimer, 1982; Barth, 1985; Barth and Weber, 1987). Kujau et al. (1992)

mutagenisierten die Y. lipolytica Stämme B204-12C und KB50-4 mit N-Methyl-N´-Nitro-N-

Nitroso-Guanidin. Es konnten 550 Acetat-nichtverwertende (Acu-) Mutanten durch Repli-

kaplattierung von Minimalmedium mit Glucose auf Minimalmedium mit Acetat selektiert wer-

den. Diese Mutanten konnten in 4 phänotypische Klassen (Klasse I bis IV) eingeteilt werden.

Die Charakterisierung basierte auf der Verwertung von Acetat, Ethanol und n-Alkanen. Wei-

terhin wurden in den Mutanten die Enzymaktivitäten der Acetyl-CoA Synthetase (ACS), der

Isocitratlyase (ICL) und der Malatsynthase (MAS) gemessen.

Mutanten der Klasse II zeigten kein Wachstum auf Ethanol und Acetat, konnten aber n-Alka-

ne als C-Quelle verwerten. Der Komplementationsgruppe ICL2 wurden wurden 92 Mutanten

zugeordnet, bei denen keine oder kaum eine ACS-Aktivität nachgewiesen werden konnte.

Sieben Mutanten des Stammes B204-12C und eine des Stammes KB50-4, die einen domi-

Einleitung

14

nanten Acu--Phänotyp zeigten, ordnete man einer zweiten Komplementationsgruppe zu.

Weitere Untersuchungen dieser Mutanten zeigten, dass alle dominanten Mutationen das

gleiche Gen betrafen. Es konnte keine Kopplung zwischen dem Gen dieser dominanten

Komplementationsgruppe und den Genen der Komplementationsgruppen ICL1, ICL2 und

ICL3 nachgewiesen werden. Das neu entdeckte Gen wurde als GPR1 (glyoxylate pathway

regulation) bezeichnet, da keine Aktivitäten der Enzyme des Glyoxylatzyklus und der ACS

während der Inkubation auf Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle nachweisbar waren.

1.3.1.1 Charakterisierung der GPR1d-Mutanten

Trans-dominante Mutationen im GPR1-Gen (GPR1d) von Y. lipolytica führen zu unterschied-

lichen pleiotropen Effekten. Es kommt zu Veränderungen intrazellulärer Strukturen, der Zell-

und Koloniemorphologie sowie der Lebensspanne der Zellen. Weiterhin sind die Zellen sen-

sitiv gegenüber Essigsäure im Medium (Tzschoppe et al., 1999).

Die vier GPR1d-Mutanten B204-12C-38, B204-12C-112, B204-12C-124 und B204-12C-156

wiesen die deutlichsten Veränderungen im Wachstum und der Zellmorphologie auf und wur-

den deshalb näher untersucht (Tzschoppe, 1998; Tzschoppe et al., 1999). Diese Mutanten

sind selbst in Anwesenheit von Glucose sehr sensitiv gegenüber Essigsäure und Ethanol im

Medium. Nur der Stamm B204-12C-124 kann im Gegensatz zu den anderen GPR1d-

Mutantenstämmen auf Ethanol wachsen. Im Wachstum auf Minimalmedium mit anderen

C-Quellen wie Ölsäure, Lactat oder Glycerin zeigen diese Stämme keine Wachstumsunter-

schiede im Vergleich zum Wildtyp. Die GPR1d-Mutantenstämme wachsen in Vollmedium mit

Glucose (YPD) langsamer als der Wildtyp. Weiterhin sind die Zelldichten der Mutanten in der

stationären Phase geringer als die des Wildtypstammes. Während der exponentiellen

Wachstumsphase treten bei den beiden Stämmen B204-12C-112 und B204-12C-156 ver-

stärkt Lyse und Zelltod auf. Weiterhin zeigen diese beiden Mutantenstämme Veränderungen

der Zellmorphologie. Im Gegensatz zum Wildtyp bildet B204-12C-112 mehr Pseudohyphen

und echte Hyphen aus, Zellen des Stammes B204-12C-156 besitzen vergrößerte Mitochon-

drien und ein reduziertes endoplasmatisches Retikulum. Die Anfärbung dieser Zellen mit

dem Farbstoff FM4-64, der die Membranen von Cytoplasma, Vakuolen und endocytotischen

Vesikel färbt, zeigte, dass die intrazellulären Membranen empfindlich gegen diesen Farbstoff

sind und somit schnell zerstört werden. Dies deutet auf eine Veränderung des Elektronenpo-

tentials und der Zusammensetzung der Membranen hin, was durch Befunde einer veränder-

ten Fettsäure- und Phospholipidzusammensetzung bestätigt werden konnte. Bei den von

Tzschoppe et al. (1999) durchgeführten elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte

in den Mutanten keine Peroxisomenproliferation nach Umsetzung auf Minimalmedium mit

Acetat oder Ethanol als C-Quellen festgestellt werden.

Einleitung

15

Acetat und Ethanol induzieren den Abbau von Zellorganellen der untersuchten Mutanten. Die

Mitochondrien werden am schnellsten zerstört, dagegen bleibt der Zellkern lange morpholo-

gisch unverändert. Während des Wachstums auf Ölsäure zeigen die GPR1d-Mutanten keine

Abnormalitäten im Vergleich zum Wildtyp, diese Zellen besitzen intakte Mitochondrien, proli-

ferierte Peroxisomen und die Enzyme des Glyoxylatzyklus werden normal exprimiert.

Die genetische Analyse des pleiotropen GPR1d-Phänotyps zeigte, dass heterozygote diploi-

de GPR1-1/GPR1-Stämme in der Acetat- und Ethanolverwertung blockiert sind. Auf Minimal-

medium mit Glucose als C-Quelle wachsen sie dagegen normal und zeigen im Vergleich

zum Wildtypstamm keine morphologischen Veränderungen. Heterozygote GPR1-1/GPR1-2-

und homozygote GPR1-1/GPR1-1-Stämme entwickeln den gleichen Phänotyp wie die haplo-

iden Mutantenstämme. Diese Untersuchungen zeigten, dass nur die Acetat- und Ethanol-

sensitivität trans-dominant ist. Die Effekte auf Wachstumsrate, Dimorphismus und Induktion

des frühen Zelltodes sind dagegen rezessiv (Tzschoppe et al., 1999).

Sequenzanalysen von Augstein et al. (2003) ergaben, dass es sich bei der Mutation im

Stamm B204-12C-112 um einen Austausch von Glycin248 durch Asparaginsäure im C-Termi-

nus des Gpr1-Proteins handelte. In den Stämmen B204-12C-38, B204-12C-124 und B204-

12C-156 waren die polaren Aminosäuren Leucin65, Glycin62 bzw. Glycin63 im N-Terminus von

Gpr1p durch die polaren Aminosäuren Glutamin, Serin bzw. die saure Aminosäure Aspara-

gin ausgetauscht. Der GPR1-Promotor des Stammes B204-12C enthält im Gegensatz zum

GPR1-Promotor des Stammes PO1d eine Insertion des Retrotransposons Ylt1 (Augstein,

2001). Mittels Reportergenanalysen konnte festgestellt werden, dass diese Insertion eine

Erniedrigung der Expression auf 2 – 4 MU zur Folge hat. Diese minimale Genexpression hat

jedoch keine Auswirkung auf die Ausprägung des Mutantenphänotyps. Geringe Mengen an

gebildetem Gpr1p-Mutantenprotein reichen für eine Sensitivität der Zellen gegenüber Essig-

säure aus (Augstein et al., 2003).

Die Deletion von GPR1 im Stamm PO1dΔgpr1 hatte keinen phänotypischen Effekt. Ebenso

konnten durch die Überexpression des GPR1-Gens keine Auswirkungen auf den Phänotyp

beobachtet werden (Augstein, 2001).

1.3.1.2 Regulation des Promotors des GPR1-Gens

Die Untersuchung der Expression des lacZ-Reportergens unter der Kontrolle des GPR1-

Promotors ergab, dass die Transkription des GPR1-Gens durch Ethanol und Acetat im Ver-

gleich zu Glucose zwei- bis dreifach stärker induziert wird. Gpr1p ist aber nicht essentiell für

die Verwertung dieser C-Quellen. Die GPR1-Deletionsmutante kann in Gegenwart von Ace-

tat oder Ethanol selbst bei geringeren pH-Werten (pH4) normal wachsen.

Einleitung

16

Im Vergleich zu Minimalmedium ohne C-Quelle wird der GPR1-Promotor durch Medium mit

Ölsäure, Glucose und am stärksten durch Glycerol reprimiert. Die Kultivierung auf Minimal-

medium mit Acetat, Ethanol, Lactat, oder Pyruvat als C-Quellen führt zu einer Derepression

des Gens. Auf Mischmedien mit Glucose ist erst nach Glucoseverbrauch eine erhöhte Pro-

motoraktivität messbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der GPR1-Promotor eher

durch Derepression als durch Induktion reguliert wird (Augstein, 2001).

Von Augstein (2001) durchgeführte Promotorstudien (Deletion von Promotorbereichen und

anschließende lacZ-Fusion mit Bestimmung der β-Galaktosidseaktivität, Gel-Shift-Experi-

mente) zeigten, dass ein Bereich, der zwei überlappende potentielle Motive für Transkripti-

onsfaktoren enthält, einen starken Einfluss auf die Promotoraktivität hat. Bei diesen Motiven

handelt es sich um das CSRE-Motiv (carbon source responsive element) aus S. cerevisiae

sowie das FACB-Bindemotiv aus Aspergillus nidulans. An diese Motive binden in S. cerevi-

siae Cat8p/Sip4p bzw. FacBp in A. nidulans. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein

ähnliches Regulatorprotein an der Regulation von GPR1 beteiligt sein könnte. Allerdings gibt

es in Y. lipolytica kein Cat8p homologes Protein (Barth, persönliche Mitteilung). Es ist jedoch

nicht auszuschließen, dass z. B. das FacBp-Orthologe in Y. lipolytica dessen Funktion über-

nimmt.

1.3.1.3 N-terminale Deletionen des Gpr1-Proteins

Im Gegensatz zu Gpr1p-Orthologen in Prokaryoten besitzen die Vertreter in Eukaryoten ei-

nen hydrophilen N-Terminus. Drei der vier untersuchten GPR1-Mutantenallele haben in die-

sem Bereich Aminosäureaustausche, die den Mutantenphänotyp verursachen. Es konnten

im N-Terminus keine Signalsequenzen für eine Membranlokalisierung des Proteins identifi-

ziert werden. Für eine weitere Aufklärung der Funktion des N-terminalen Bereichs wurde

dieser teilweise deletiert und mutiert.

Der N-Terminus bis einschließlich F60 ist nicht essentiell für die Funktion des Gpr1-Proteins.

Wird der N-Terminus vollständig oder teilweise bis einschließlich F61 deletiert, so sind Trans-

formanden mit diesem Konstrukt Essigsäure-sensitiv. Die alleinige Deletion der Aminosäure

F61 oder deren Mutation in Glutaminsäure bewirkt ebenfalls eine Sensitivität der Transfor-

manden gegenüber Essigsäure. Das Ersetzen dieser Aminosäure durch Tyrosin, das struktu-

rell ähnlich ist, hat dagegen keinen Einfluss auf das Wachstum der Transformanden auf Me-

dium mit Essigsäure (Augstein, 2001; Augstein et al., 2003).

Gentsch (2003) führte weitere Deletionsanalysen des Gpr1-Proteins durch. Hierbei wurde

das Familienmotiv NPAPLG als funktionell wichtiger Bereich identifiziert.

1.3.1.4 Lokalisierung des Gpr1-Proteins

Einleitung

17

Hydrophobizitätsblots der Proteinsequenz von Gpr1p zeigen, dass es sich um ein membran-

ständiges Protein mit 5 bis 6 membranspannenden Domänen handeln könnte. Mit Hilfe von

Gpr1p-GFP-Fusionen konnte gezeigt werden, dass das Fusionsprotein in der Plasma-

membran lokalisiert ist (Tzschoppe, 1998). Durch subzelluläre Lokalisierung konnte dieser

Befund bestätigt werden. Bei der Kultivierung in Minimalmedium mit Acetat trat das Signal

des Gpr1-GFP-Proteins anfangs nur in der Cytoplasmamembran auf. Nach 4 bis 8 Stunden

kam es zu einer deutlichen Zunahme des Signals in Vesikeln. Diese Vesikelbildung könnte

auf einen Aktivierungs- und Deaktivierungsmechanismus für Gpr1p hindeuten, wie er für Re-

zeptoren bekannt ist (Augstein et al., 2003).

1.3.1.5 Expression des Gpr1-Proteins

Im Stamm PO1d wurde die Expression von Gpr1p mittels Western-Blot-Analyse untersucht.

Es konnte nur eine geringe Expression nachgewiesen werden, wenn die Zellen länger auf

Minimalmedium mit Ethanol oder Glucose als C-Quelle kultiviert wurden (pH-Wert wurde

nicht korrigiert). Während des Wachstums säuert Y. lipolytica das Medium an. Wurde der

pH-Wert auf den Ausgangswert (pH5,5) korrigiert, so nahm die Expression von Gpr1p nicht

ab. Allerdings konnte keine direkte Abhängigkeit der Gpr1p-Expression vom pH-Wert nach-

gewiesen werden (Gentsch, 2003).

Nach dem Transfer der Zellen in frisches Minimalmedium mit oder ohne C-Quelle nahm die

Expression des Gpr1-Proteins schnell zu. Während der Kultivierung in Minimalmedium mit

Acetat/Glucose als C-Quellen nahm die Konzentration an Gpr1p nicht ab (pH-Wert wurde

ebenfalls nicht korrigiert). Wurden die Zellen in Vollmedium kultiviert, so war die Gpr1p-

Expression sehr niedrig (Gentsch, 2003).

1.3.1.6 Phosphorylierung des Gpr1-Proteins

Gentsch (2003) konnte das Gpr1-Protein in Abhängigkeit von der C-Quelle in einer phospho-

rylierten und dephosphorylierten Form nachweisen. Nach Verbrauch oder Entzug der

C-Quelle wurde Gpr1p schnell dephosphoryliert. Wurden die Zellen in Minimalmedium mit

Glucose als C-Quelle kultiviert, so lag Gpr1p in beiden Formen vor. Nach Zugabe von Acetat

oder Essigsäure zu diesen Kulturen erfolgte innerhalb von 10 min die Phosphorylierung fast

aller Gpr1p-Moleküle. Die C-Quellen Glucose, Glycerol, Ethanol oder Ölsäure bewirkten

ebenfalls die Phosphorylierung von Gpr1p. Allerdings wurde nur ein Teil der Moleküle von

Gpr1p phosphoryliert. Es konnte keine Abhängigkeit der Phosphorylierung vom pH-Wert, der

Osmolarität oder der N-Quelle nachgewiesen werden (Gentsch, 2003; Gentsch and Barth,

2005).

Einleitung

18

Durch den Austausch von Aminosäuren potentieller Phospholylierungsorte konnte später die

Aminosäure Ser37 als Phosphorylierungsort des Gpr1-Proteins identifiziert werden (Gentsch

and Barth, 2005).

1.3.1.7 Funktion des Gpr1-Proteins

Die von Augstein (2001) duchgeführte Deletion des GPR1-Gens im Stamm PO1d hatte kei-

nen Effekt auf die Essigsäuresensitivität. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass bei

Überimpfung des Stammes PO1dΔgpr1 von Minimalmedium mit Glucose auf Acetat als

C-Quelle die Zellen langsamer anwachsen als die des Wildtypstammes PO1d. In Minimal-

medium mit Glucose wurden keine Unterschiede im Wachstum festgestellt. Dies deutet auf

eine Funktion des GPR1-Gens bei der Adaptation an Acetat hin (Gentsch, 2003).

Augstein (2001) und Gentsch (2003) schlugen ein Modell zur möglichen Funktion von Gpr1p

vor. Es wird angenommen, dass Gpr1p in Abwesenheit von Essigsäure aktiv ist und Essig-

säureadaptationsprozesse inhibiert.

Abb. 3: Hypothetisches Modell der Funktion von Gpr1p in Y. lipolytica (nach Gentsch, 2003). Mit roten Pfeilen sind aktivierende Prozesse, grün inhibierende Prozesse dargestellt. Ebenso sind Proteine im aktiven Zustand rot und im inaktiven Zustand grün gekennzeichnet. AcT: hypothetischer Acetattransporter, AmT: hypothetischer Ammoniumtransporter, „Pma1p“: Pma1p-orthologes Protein.

Die Zugabe von Essigsäure bei niedrigem pH-Wert führt zum Einstrom von undissoziierter

Essigsäure ins Cytoplasma (Abb. 3). Dort dissoziiert diese und es kommt zur Anhäufung von

Protonen und Acetationen. Es wird angenommen, dass Gpr1p durch eine höhere intrazellu-

läre Acetatkonzentration deaktiviert wird. Die Deaktivierung hat die Aufhebung der Hemmung

eines hypothetischen Acetattransporters (AcT) und der Protonenpumpe („Pma1p“) zur Folge.

H+

„Pma1p“ AcT Gpr1p

H3C-COOH

H3C-COO-

H3C-COOH

H3C-COO-H+

ATP ATD+PiP P

Kinase

C-Quelle

Medium

Cytosol

H+

„Pma1p“ AcT Gpr1p

H3C-COOH

H3C-COO-

H3C-COOH

H3C-COO-H+

ATP ATD+PiPP PP

Kinase

C-Quelle

Medium

Cytosol

Einleitung

19

Die Protonenpumpe wird auch durch einen sauren intrazellulären pH-Wert aktiviert (Carmelo

et al., 1997), so dass dies zusätzlich zur Aktivierung des Pma1p-Orthologen in Y. lipolytica

beitragen könnte. Durch die Aktivierung von Prozessen, die zu einem Umbau der Cytoplas-

mamembran führen, könnte die weitere Diffusion undissoziierter Essigsäure ins Cytoplasma

vermindert werden.

Gentsch and Barth (2005) beobachteten zudem eine schnelle Phosphorylierung von Gpr1p.

Dies könnte mittels einer durch Acetat aktivierten (direkt oder indirekt über eine Signaltrans-

duktionskette) Kinase erfolgen.

1.3.2 Die Gpr1p-orthologen Genprodukte Ycr10cp, Ydr384cp und Ynr002cp der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Die Genprodukte von YCR010c, YDR384c und YNR002c der Hefe S. cerevisiae gehören

ebenfalls der Proteinfamilie Gpr1/Fun34/yaaH an und sind Orthologe zu Gpr1p (Tab. 1).

Tab. 1: Gpr1p-orthologe Proteine in S. cerevisiae (modifiziert nach Augstein, 2001)

Genname Organismus Amino-säuren

% identische AS zu Gpr1p

% identische AS im hydrophoben Bereich zu Gpr1p

GPR1 Y. lipolytica 270 - -

YCR010c (ADY2, ATO1) S. cerevisiae 283 47 54

YNR002c (FUN34, ATO2) S. cerevisiae 282 47 55

YDR384c (ATO3) S. cerevisiae 275 27 35

Der ORF von YDR384c befindet sich auf dem rechten Arm von Chromosom IV. YCR010c ist

auf dem rechten Arm von Chromosom III nahe dem Centromer lokalisiert. Es kodiert wahr-

scheinlich für ein Membranprotein mit 6 membranspannenden Domänen (Skala et al., 1992).

Ycr010cp zeigt eine große Ähnlichkeit zu Ydr384cp und ist mit Ynr002cp zu 78 % identisch

(Verhasselt et al., 1994). Der ORF von YNR002c bzw. FUN34 (function unknown now) liegt

auf dem rechten Arm in der Centromer nahen Region des Chromosoms XIV. Das Gen co-

diert für ein transmembranes Protein mit unbekannter Funktion (Stettler et al., 1992; Lalo et

al., 1994). Ynr002cp ist nicht essentiell für das Wachstum von S. cerevisiae, auch nicht auf

Substraten, die einen oxidativen Metabolismus voraussetzen. Es ist wahrscheinlich kein mi-

tochondriales Protein, da es nicht durch Glucose reprimiert wird (Lalo et al., 1994). Bei dem

Gen YNR002c könnte es sich um eine interchromosomale Duplikation von YCR010c han-

deln (Lalo et al., 1993). Die Unterschiede der Aminosäuresequenz von Ynr002cp und

Ycr010cp beschränken sich auf deren N-terminale Enden. Die könnte möglicherweise eine

unterschiedliche Lokalisierung der Proteine in der Zelle zur Folge haben (Lalo et al., 1994).

Einleitung

20

Das ist z. B. bei Cit1p und Cit2p der Fall, diese Proteine sind in den Mitochondrien bzw. Pe-

roxisomen lokalisiert. Ihre codierenden Gene befinden sich in direkter Nachbarschaft zu

YNR002c und YCR010c. CIT1 ist durch eine interchromosomale Verdopplung von CIT2 ent-

standen (Lalo et al., 1993; Lalo et al., 1994).

Wird YCR010c in E. coli exprimiert, so ist in der Lage in E. coli die SOS-Antwort, die durch

DNA-schädigende Agenzien oder Hemmung des DNA-Metabolismus aktiviert wird, zu indu-

zieren. Somit könnte dieses Gen im DNA-Metabolismus oder in die Stabilisierung des Ge-

noms involviert sein (Perkins et al., 1999). Weiterhin bildet die Nullmutante von YCR010c nur

noch zwei Sporen aus (SGD1).

In Two-Hybrid-Analysen konnte eine Interaktion des Ydr384c-Proteins mit Ymr009wp nach-

gewiesen werden (Ito et al., 2001). Der ORF YMR009c kodiert für eine Acireducton-

Dioxygenase (ARD). Dieses Enzym nimmt zwei Sauerstoffatome auf und ist an der Bildung

von L-Methionin aus Metylthioadenosin (Regeneration von L-Methionin) beteiligt (Hirano et

al., 2005).

1.3.2.1 Regulation der Genexpression von YCR010c, YDR384c und YNR002c

Glucose reprimiert in der Zelle eine große Anzahl von Genen, die u. a. an der Verwertung

alternativer C-Quellen, der Gluconeogenese, der Atmung oder der Peroxisomenproliferation

beteiligt sind. Die Regulation dieser Gene erfolgt in S. cerevisiae über das in ihrem 5´-up-

stream Bereich enthaltene CSRE-Motiv (Schöler and Schüller, 1994). In dieser Regulation

spielt die Ser/Thr-spezifische Proteinkinase Snf1p (Cat1p) eine zentrale Rolle. Snf1p besteht

aus einer N-terminalen catalytischen Kinase-Domäne (KD) und einer C-terminalen regulato-

rischen Domäne (RD). Dieses Protein weist eine C-Quellen-abhängige Autoinhibierung auf.

Beide Domänen interagieren unter reprimierenden Bedingungen (hoher Glucosegehalt), aber

nicht unter dereprimierenden Bedingungen (Jiang and Carlson, 1996). Das Genprodukt von

SNF4 ist im Kern lokalisiert (Schüller and Entian, 1988) und wird für die Aktivität der Snf1-

Proteinkinase benötigt. Unter dereprimierenden Bedingungen (niedriger Glucosegehalt) in-

teragiert Snf4p mit der regulatorischen Domäne von Snf1p und aktiviert somit die Kinase.

(Celenza and Carlson, 1989; Celenza et al., 1989; Fields and Song, 1989). Die aktivierte

Snf1p-Kinase übt während des Übergangs vom fermentativen zum oxidativen Metabolismus

zwei Funktionen aus. Zum einen wird der negative Regulator Mig1p (Cat4p) phosphoryliert

und so die Repression von CAT8 aufgehoben (Hedges et al., 1995). Andererseits reguliert

Snf1p die Funktion und Expression von Cat8p (Hedges et al., 1995; Rahner et al., 1996;

Randez-Gil et al., 1997) und Sip4p (Lesage et al., 1996; Vincent and Carlson, 1998). Cat8p

ist essentiell für die Verwertung nicht fermentierbarer C-Quellen wie z. B. Ethanol, Acetat, 1 http://www.yeastgenome.org/

Einleitung

21

Lactat und Glycerol. Mit Hilfe von DNA-Microarrays wurden von Haurie et al. (2001) die Ex-

pression Cat8p-abhängiger Gene während des zweiphasigen Wachstums (Diauxie) auf Glu-

cose untersucht. In einem Δcat8-Stamm konnte kaum noch eine Expression von YCR010c

nachgewiesen werden. Dagegen war YNR002 das einzige Gen, das in dieser Mutante stär-

ker exprimiert wurde. Die Expression von YDR384c war dagegen durch die Deletion von

CAT8 nicht betroffen. Nur der Promotor von YCR010c enthält ein CSRE-Motiv. Somit könnte

YCR010c einer positiven Regulation durch Cat8p nach Glucosevebrauch unterliegen,

YNR002c dagegen negativ reguliert werden. Diese Befunde deuten darauf hin, dass die er-

höhte Expression von YNR002c in Abwesenheit von Cat8p den Expressionsausfall von

YCR010c ausgleichen könnte.

In ρ0-Zellen ist die Expression von YDR384c dramatisch erhöht (Guaragnella and Butow,

2003). Weiterhin konnten Guaragnella and Butow (2003) feststellen, dass der Transkriptions-

aktivator Gcn4p eine Rolle bei der Expression von YDR384c spielt.

In Candida albicans und S. cervisiae werden nach der Phagocytose der Zellen durch Macro-

phagen spezifische Gene des Glyoxylatzyklus induziert. In S. cerevisiae wird YDR384c unter

diesen Bedingungen ebenfalls exprimiert (Lorenz and Fink, 2001).

Das YNR002c-Gen wird durch War1p positiv reguliert (Schüller et al., 2004). Dieser

Transkriptionsfaktor bindet an die Konsensussequenz 5´-CGGc/tTg/ct/gTAa/t-3´ und wird zur

Adaptation der Zellen an schwache organische Säuren, wie z. B. Sorbin-, Benzoe- und Pro-

pionsäure, jedoch nicht Essigsäure, benötigt (Schüller et al., 2004; Kren et al., 2003).

Alle drei Homologen unterliegen der Regulation durch Sok2p. Die Deletion von SOK2 hat

eine niedrigere Expression von YCR010c, YDR384c und YNR002c zur Folge (Vachova et

al., 2004). Weiterhin produziert der Δsok2-Stamm weniger Ammonium in der alkalischen

Phase des Wachstums (Vachova et al., 2004) (vgl. Kapitel 1.3.3). Der Transkriptionsfaktor

Sok2p ist in verschiedenste zelluläre Prozesse involviert. Dies betrifft u. a. das Wachstum,

die Entwicklung und die Anpassung an Veränderungen der Umwelt (insbesondere Verfüg-

barkeit von Nährstoffen) (Vachova et al., 2004).

Diese unterschiedlichen Regulationsmechanismen der GPR1-orthologen Gene in S. cerevi-

siae deuten darauf hin, dass sie verschiedene Funktionen besitzen könnten.

1.3.3 Ammoniumsekretion der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Palková et al. (2002) stellten fest, dass auf festem Nährmedium wachsende Kolonien der

Hefe S. cerevisiae den pH-Wert des sie umgebenden Mediums von sauer nach alkalisch und

umgekehrt ändern. Mittels cytogenetischer und genetischer Untersuchungen sowie Microar-

rays wurde dieser Übergang von sauer nach alkalisch in sechs Phasen unterteilt. Der Über-

gang ist mit der Produktion von flüchtigem nicht-protonierten Ammoniak verbunden, der als

Einleitung

22

Signal für Mangelerscheinungen zwischen Zellen einer Kolonie dient. Die Grundlage der

Ammoniakproduktion liefern Aminosäuren (Zikánová et al., 2002). Der erste Ammoniakpuls

findet nach der Kulturanimpfung statt und verläuft ungerichtet, gefolgt von einer schnellen

Ansäuerung des Mediums. Der zweite Puls scheint gerichtet zu sein und beeinflusst die be-

nachbarten Zellen. Die induzierte Ammoniakproduktion synchronisiert den sauer/alkalischen

Puls in benachbarten Zellen unabhängig von ihrem Entwicklungsstand (Palková et al., 1997;

Palková and Forstová, 2000). Ammoniak signalisiert benachbarten Zellen Nährstoffmangel

und führt zur vorübergehenden Einstellung des Wachstums. Somit wird ebenfalls verhindert,

dass benachbarte Kolonien aufeinander zuwachsen. Das Wachstum findet nur dort statt, wo

sich keine anderen Kolonien befinden (Palková et al., 1997). Nach der alkalischen Phase

erfolgt der Rückgang der Ammoniakproduktion und die Kolonien können ihr Wachstum wie-

der aufnehmen (Palková et al., 2002).

Während der Anfangsphase der Ammoniakproduktion des zweiten Ammoniakpulses findet

eine starke Induktion der GPR1-Orthologen YCR010c, YDR384c und YNR002c in S. cerevi-

siae statt. In dieser Phase bilden die Stämme mit einzelnen Gendisruptionen der GPR1-

orthologen Gene weniger Ammoniak als der Wildtypstamm BY4742. Palková et al. (2002)

vermuten, dass die Proteine Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp als Ammonium-Proton-

Antiporter fungieren. Aus diesem Grund werden sie auch als ATO1-3 (ammonia transport

outward) (Tab. 1) bezeichnet.

Einleitung

23

1.4 Zielstellung der Arbeit

Gegenstand vorangegangener Untersuchungen war das Gpr1-Protein in Y. lipolytica. Ver-

schiedene Mutationen im GPR1-Gen verursachen eine erhöhte Sensitivität gegen Essigsäu-

re und sind trans-dominant über das Wildtypallel. Die Sequenzierung der Mutantenallele von

vier Hefestämmen (B204-12C-38, -112, -124 und -156) ergab, dass der Mutantenphänotyp

durch Aminosäureaustausche sowohl im N- als auch im C-terminalen Teil des Gpr1-Proteins

verursacht wird. Die Expression des GPR1-Gens wurde mittels Reportergenanalysen näher

charakterisiert. Weiterhin wurden die Auswirkungen der teilweisen und fast vollständigen

Deletion des N-Terminus von Gpr1p auf das Wachstum von Transformanden untersucht.

Das Gpr1-Protein konnte in Abhängigkeit von der zur Verfügung stehenden C-Quelle in einer

phosphorylierten und dephosphorylierten Form nachgewiesen werden. Mittels fluoreszenz-

mikroskopischen und subzellulären Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass Gpr1p ein

integrales Protein der Cytoplasmamembran ist.

In der vorliegenden Arbeit sollte das Gpr1-Protein in Y. lipolytica und die Gpr1p-Orthologen

in S. cerevisiae näher charakterisiert werden. Damit stellten sich folgende Aufgaben:

1. Suche nach potentiellen Interaktionspartnern des Gpr1-Proteins in Y. lipolytica. Hierfür

sollte geprüft werden, ob in Revertaten von GPR1d-Mutanten extragene Mutationen, die

zu einer Suppression des Mutantenphänotyps führen könnten, nachweisbar sind. 2. Durch die Einbeziehung der drei Gpr1p-Orthologen Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp in

S. cerevisiae sollte versucht werden, weitere Informationen über die Regulation der Ex-

pression und der Funktion dieser Proteinfamilie zu erhalten. 3. Untersuchung der Expression der Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae. Zur weiteren Funk-

tionsaufklärung sollte überprüft werden, unter welchen Bedingungen die Expression die-

ser Gene erfolgt und wie diese reguliert werden. Dies sollte mit Hilfe von Messung lacZ-

Reportergenanalysen, Northern- und Western-Blots erfolgen.

4. Aufklärung funktionell wichtiger Bereiche in Gpr1p und dessen Orthologen durch Ort-

spezifische und zufällige Mutagenese. Von besonderem Interesse waren die Auswirkun-

gen von Deletionen der C-Termini des Gpr1-Proteins und dessen Orthologen. Ferner

sollten durch zufällige Mutagenese der Orthologen von S. cerevisiae weitere funktionell

wichtige Bereiche identifiziert werden 5. Aufklärung posttranslationaler Modifikationen der Homologen in S. cervisiae. Insbeson-

dere sollte hierbei untersucht werden, ob diese Proteine möglicherweise einer Glycosylie-

rung oder Phosphorylierung unterliegen.

Einleitung

24

6. Lokalisierung der Gpr1-Orthologen in S. cerevisiae mittels GFP-Fusion. 7. Bestimmung von sekretiertem Ammonium. Hierbei stand die Auswirkung der Deletion

von zwei bzw. aller Homologen auf die Produktion von Ammonium im Vordergrund. Wei-

terhin war von Interesse, inwieweit Mutationen in Ycr010cp bzw. Ynr002cp einen Einfluss

auf die produzierte Ammoniummenge haben.

Material und Methoden

25

2 Material und Methoden

2.1 Geräte Autoklaven und Sterilisatoren: Hochdruckdampfsterilisator (KSG) Modell 500 Heißluftsterilisator (Memmert) Varioklav Dampfsterilisator (H+P)

Brutschränke und Schüttler: BE 500 (Memmert) Kühlbrutschrank BK 600 (Heraeus) Multitron® (Infors HT)

Novotron® AK82 (Infors HT)

Elektrophoresesysteme: HE 99X (Hoefer) Maxigel Gelelektrophoresesystem (Biometra) PROT-Resolv MINI-LC Gelelektrophorese-System (Phase) Sub-Cell® GT Electrophoresis Systems (BioRad)

Elektroporationsgeräte: GenePulser® II und MicropulserTM (BioRad)

pH-Messgeräte: pH526 und pH537 (WTW)

Thermocycler: Primus (MWG-Biotech) Primus 96PLUS (MWG-Biotech) T1-Thermocycler (Biometra)

Semidry-Elektroblotter: The PantherTM Semi-Dry-Elektroblotter Modell HEP-1 (Peq- Lab)

Sequenzierer: CEQTM 2000XL mit der Analysesoftware „CEQ Sequence Analysis 4.3.9“ (Beckman Coulter)

Spektrophotometer: Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech) Uvikon 943 (Kontron Instruments)

Stromversorgungsgeräte: Electrophoresis Power Supply EPS 3500 (Pharmacia Bio- tech) PowerNPac 300 (BioRad) Power Pack P25 (Biometra)

Zentrifugen: Biofuge fresco (Heraeus) Biofuge 15 R mit dem Rotor HFA 5.50 (Heraeus Sepatech) Sorvall RC 5C mit den Rotoren SS 34 und SLA 3000 (Du Pont)

Weitere Geräte: Blockthermostat BT100 (Kleinfeld Labortechnik) DNA Speed Vac® (Savant)

Fastprep BIO 101 (Q BIOgene) HS12/2 Sicherheitswerkbank (Heraeus) Kühlthermostat (Techne Tempcold) UV Transilluminator TEX-35M mit Biophotonics GelPrint 2000 Software (MWG-Biotech) Zellmühle (Retsch)


26

2.2 Chemikalien und Biochemikalien Acrylamid/Bisacrylamid Roth

Agar Agar Roth

Agarose Biozym

Ampicillin Roth

APS (Ammoniumperoxodisulfat) Merck

BenchmarkTM Protein Ladder (prestained) Invitrogen

BSA Roth

DTT (Dithiothreitol) Roth

Ethidiumbromid Serva

Gentamycin SIGMA

Glucose-Teststreifen Kallies Feinchemie AG

MES-Puffer Merck

Neßlers-Reagenz A und B Merck

Protease-Inhibitoren-Cocktail (completeTM) Roche

TEMED Serva

Tween 20 Serva

2.3 Kitsysteme

CEQTM DTSC-Quickstart kit Beckman Coulter

ECLPLUS Western Blotting Detection reagents Amersham Biosciences

Gene Images random prime labelling module Amersham Biosciences

Gene Images CDP-Star detection module Amersham Biosciences

JETQUICK Gel Extraction Spin Kit Genomed

JETQUICK PCR Purification Spin Kit Genomed

JETQUICK Plasmid Miniprep Spin Kit Genomed

JETSORB Gel Extraction Kit Genomed

JETSTAR Plamid Midiprep Kit Genomed

„MegaprimeTM DNA labelling systems“ Amersham Biosciences


27

2.4 Enzyme

CombiZyme DNA Polymerase InViTek

Endoglycosidase H Roche

λ-Protein-Phosphatase New England Biolabs

Pwo DNA Polymerase Roche

Restriktionsenzyme MBI-Fermentas

RNaseA USB

T4-DNA Ligase Promega

Taq-Polymerase MBI-Fermentas

2.5 Antikörper Die nachfolgend aufgeführten Antikörper wurden entsprechend den Herstellerangaben gelöst

und gelagert. Für Western-Blot-Analysen wurden die Antikörper in Blocklösung (vgl. Kapitel

2.10.7) in den angegebenen Verdünnungen eingesetzt.

Monoklonale Antikörper Mouse Anti-HA (Roche) 1:1000

Polyklonale Antikörper Rabbit Anti-Ycr010cp (Pineda, diese Arbeit: 3.3.14) 1:2500

Sekundäre Antikörper Sheep Anti-mouse Ig-HRP1 (Amersham Biosciences) 1:5000

Donkey Anti-Rabbit Ig-HRP1 (Amersham Biosciences) 1:5000 oder 1:10000

2.6 Nukleinsäuren

2.6.1 DNA-Molekulargewichtstandards und Nucloeotide

1kb-Leiter MBI Fermentas

λ-DNA MBI Fermentas

dNTPs MBI Fermentas

1 horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase)


28

2.6.2 Verwendete Plasmide

Tab. 2: Vektoren für S. cerevisiae

Plasmid Genotyp Referenz

p416ADH ADH1prom, Ampr, CYC1ter, CEN6/ARSH4, URA3

Mumberg et al. (1995)

p426MET25 Ampr, CYC1term, MET25prom, URA3 Mumberg et al. (1994)

pUG30 Ampr,MET25prom, CYC1term, Kanr, yEGFP3 Güldener and Hege- mann

YEp351-3HA Ampr, LEU2, lacZ´, 2 µ, MCS/3 x HA-ORF R.J. Schweyen, Wien

YIp352 Ampr, URA3 Hill et al. (1986)

Tab. 3: Vektoren für Y. lipolytica

Plasmid Genotyp Referenz

pG1-P265 Ampr, ARS18, LEU2, GPR1B, C-terminal ab P265 verkürzt

Gentsch (2003)

pG1-Y256 Ampr, ARS18, LEU2, GPR1B, C-terminal ab Y265 verkürzt

Gentsch (2003)

pG1-A247 Ampr, ARS18, LEU2, GPR1B, C-terminal ab A247 verkürzt

Gentsch (2003)

pG1-F242 Ampr, ARS18, LEU2, GPR1B, C-terminal ab F242 verkürzt

Gentsch (2003)

pG1-dYNAYA Ampr, ARS18, LEU2, GPR1B, YNAYA deletiert Gentsch (2003)

pG2-P265 Ampr, ARS18, LEU2, pGPR1B-GPR1-2, C-terminal ab P265 verkürzt

Gentsch (2003)

pG2-Y256 Ampr, ARS18, LEU2, pGPR1B-GPR1-2, C-terminal ab Y256 verkürzt

Gentsch (2003)

pG2-A247 Ampr, ARS18, LEU2, pGPR1B-GPR1-2, C-terminal ab A247 verkürzt

Gentsch (2003)

pG2-F242 Ampr, ARS18, LEU2, pGPR1B-GPR1-2, C-terminal ab F242 verkürzt

Gentsch (2003)

pG2-dYNAYA Ampr, ARS18, LEU2, pGPR1B-GPR1-2, YNAYA deletiert

Gentsch (2003)

pINA237 Ampr, ARS18, LEU2, Tetr Fournier et al. (1993)

pINA443 Ampr, ARS18, URA3 Augstein (2001)

pTSC1-HA Ampr, LEU2, GPR1-3xHA Gentsch (2003)

pUCGlacZF Ampr, GPR1 Augstein (2001)

pYLD103 Ampr, ARS18, LEU2, GPR1-1 Schmid-Berger et al. (1994)

pYLD203 Ampr, ARS18, LEU2, GPR1-2 Augstein (2001)

pYLG2 Ampr, ARS18, LEU2, pGPR1B-GPR1-2 Augstein (2001)

pYLG3 Ampr, ARS18, LEU2, GPR1B Augstein (2001)


29

2.6.3 Konstruierte Plasmide

Tab. 4: Übersicht über die in dieser Arbeit konstruierten Plasmide.

Plasmid Insert

p416YCR YCR010c-Allel p416YCR-dA258 YCR010c-Allel, Deletion des Ycr010cp ab AS 259 p416YCR-dY267 YCR010c-Allel, Deletion des Ycr010cp ab AS 268 p416YCR-dYNAYA YCR010c-Allel, Deletion des YNAYA-Motivs in Ycr010cp p416YCR-Q75 YCR010c-Allel, Ycr010cp mit ausgetauschter AS (L75Q) p416YCR-D259 YCR010c-Allel, Ycr010cp mit ausgetauschter AS (G259D) p416YCR-HA YCR010c-Allel, Ycr010cp mit 3 x HA fusioniert p416YCR-Q75-HA YCR010c-Allel, Ycr010cp mit ausgetauschter AS (L75Q),Ycr010cp

mit 3 x HA fusioniert p416YCR-D259-HA YCR010c-Allel, Ycr010cp mit ausgetauschter AS (G259D),Ycr010cp

mit 3 x HA fusioniert p416YDR YDR384c-Allel p416YDR-HA YDR384c-Allel, Ydr384cp mit 3 x HA fusioniert p416YNR YNR002c-Allel p416YNR-dA257 YNR002c-Allel, Deletion des Ynr002cp ab AS 258 p416YNR-dY266 YNR002c-Allel, Deletion des Ynr002cp ab AS 267 p416YNR-dYNAYA YNR002c-Allel, Ynr002cp mit deletiertem YNAYA-Motiv p416YNR-Q74 YNR002c-Allel, Ynr002cp mit mutierter AS (L74Q)) p416YNR-D259 YNR002c-Allel, Ynr002cp mit mutierter AS (G259D) p416YNR-HA YNR002c-Allel, Ynr002cp mit 3 x HA fusioniert p416YNR-Q74-HA YNR002c-Allel, Ynr002cp mit ausgetauschter AS (L74Q),Ycr010cp

mit 3 x HA fusioniert p416YNR-D259-HA YNR002c-Allel, Ynr002cp mit ausgetauschter AS (G259D),Ycr010cp

mit 3 x HA fusioniert p426METGPR1 GPR1-ORF unter Kontrolle des MET25-Promotors p426METGPR1-112 GPR1-1-ORF unter Kontrolle des MET25-Promotors p426METGPR1-156 GPR1-2-ORF unter Kontrolle des MET25-Promotors p426METYCR YCR010c-ORF unter Kontrolle des MET25-Promotors p426METYCR-Q75 YCR010c-ORF unter Kontrolle des MET25-Promotors, Ycr010cp

mit mutierter AS (L75Q) p426METYCR-D259 YCR010c-ORF unter Kontrolle des MET25-Promotors, Ycr010cp

mit mutierter AS (G259Q) p426METYDR YDR384c-Allel unter Kontrolle des MET25-Promotors p426METYNR YNR002c-Allel unter Kontrolle des MET25-Promotors p426METYNR-Q74 YNR002c-Allel unter Kontrolle des MET25-Promotors, Ynr002cp mit

mutierter AS (L74Q) p426METYNR-D259 YNR002c-Allel unter Kontrolle des MET25-Promotors, Ynr002cp mit

mutierter AS (G259D) YIp352YCR YCR010c-Allel YIp352YCR-Q75 YCR010c-Allel, Ycr010cp mit ausgetauschter AS (L75Q) YIp352YCR-D259 YCR010c-Allel, Ycr010cp mit ausgetauschter AS (G259D) YIp352YNR YNR002c-Allel YIp352YNR-Q74 YNR002c-Allel, Ynr002cp mit mutierter AS (L74Q)) YIp352YNR-D259 YNR002c-Allel, Ynr002cp mit mutierter AS (G259D)


30

2.6.4 Oligonucleotide

Tab. 5: Übersicht über die verwendeten Oligonucleotide. Erkennungssequenzen für Re-striktionsenzyme sind kursiv geschrieben. Eingefügte oder mutierte Nucleotide sind fett hervorgehoben. Nucleotide des HA-Tags sind unterstrichen.

Name Sequenz (5´- 3´) Restriktions-schnittstelle

18S-F CTATCAACTTTCGATGGTAGG 18S-R TATGGTTAAGACTACGACGGT HAStopp-Cla-rev ATATCGATTTAAGCGTAATCTGGAACGTC ClaI GPR1-Cla-rev TACGCAATCGATTTAGTCCTTCTTGACGA-AGG ClaI GPR-LacZ GAGGATCCGCGTCCTTCTTGACGAAGG BamHI GPR1-Spe-uni GTACTTACTAGTATGAACACCGAAATCCC-

CGATC SpeI

sYCR-uni CTTAATGTTGTCGTCGGT sYDRPr-f2 CATAATCTCACCGCAGCT sYNR-uni GCCTCGTTCAACTCATTGC TSB1-d32 CTGGATCCAAGAAATTATCCCTC BamHI YCR-226-uni AATCCAGGGTTAGCT YCR-238-rev AGCTAACCCTGGATTTTGGGTACCACCAAA YCR-759-rev CCAAGCAATGAAAGC YCR-849-rev AAAGATTACCCTTTCAG YCR-Cla-rev ATATCGATTTAAAAGATTACCCTTTC ClaI YCR-D259-rev TGAATTCTGCTTTGTAGCAACATCTGCATATGC EcoRI YCR-dA258-rev ATATCGATTTATGCATATGCGTTGTACC ClaI YCR-dY267-rev ATATCGATTTAATATGAATTCTGCTTTG ClaI YCR-dYNAYA-uni GCTTTCATTGCTTGGGGTGTTGCTACAAAG YCR-GFP-uni TCGTCCATTCCCATTACCATCTACTGAAAGGGTA

ATCTTTTCTAAAGGTGAAGAATTATTCACTG

YCR-HA-uni CTGAAAGGGTAATCTTTTACCCATACGATGTTCC YCR(Hind)-518-uni GGAAGCTTACGAAGAC HindIII YCR-Xho-rev TCTCGAGTTAAAAGATTACCCTTTC XhoI YCRPr-Hind-f ATAAAGCTTGATAGGCGTCGTATATAG HindIII YCRPr-Sph-uni ATGCATGCCCGTGGAATAGGCGA SphI YCR-Spe-uni ATACTAGTATGTCTGACAAGGAACAA SpeI YCRt-kan-rev CAGCCATTCTATTTAAACATATAAAAGTACGATTA

GTTGGTGTGGCATAGGCCACTACTGGATCTG

YDR-825-rev AGGAGCATTTGGCATTG YDR-Cla-rev ATATCGATTTAAGGAGCATTTGGCATTGT ClaI YDR-GFP-uni TTATTTAGCCTTCAGGGCGCACACAATGCCAAAT

GCTCCTTCTAAAGGTGAAGAATTATTGACTG

YDR-HA-uni CAATGCCAAATGCTCCTTACCCATACGATGTTCC YDRPr-Sac-uni AGAGCTCTCTTGCAATTATGTTATAG SacI YDR-Spe-uni ATACTAGTATGACATCGTCTGCTTCT SpeI YDRt-kan-rev GACTATGTCTAAACGTAACGTTATCATTATTATTA

AATCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG

YNR-237-rev GGCTAAACCGGGATTTTGAGTACCACC YNR-223-uni AATCCCGGTTTAGCCCCC YNR-772-rev GTCTTGTGGCAATACC YNR-775-uni ATTGCCACAAGACAAAAC YNR-792-rev GTTTTGTCTTGTGGCAATATCTGCGTAAGC YNR-846-rev GAAGAACACCTTATCATTG


31

YNR-Cla-rev ATATCGATTTAGAAGAACACCTTATC ClaI YNR-dA257-rev ATATCGATTTATGCGTAAGCGTTGTACC ClaI YNR-dY266-rev ATATCGATTTAGTACGAGTTTTGTCT ClaI YNR-dYNAYA-uni GCCTTCATTGCCTGGGGTATTGCCACAAG YNR-GFP-uni CCATCCATTCGCATTACCTAGCAATGA-

TAAGGTGTTCTTCTCTAAAGGTGAAGAATTATT-CACTG

YNR-HA-uni CAATGATAAGGTGTTCTTCTACCCATAC-GATGTTCC

YNR(Hind)-473-uni GGTTAAGCTTCGGTGC HindIII YNR-kan-rev GAAATGCATGAGAACAGTGTTGTTTTATAAAG-

GATTCTATGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG

YNRPr-Sac-uni AGAGCTCAAGTTCTTGACTACCCCT SacI YNR-Spe-uni ATACTAGTATGTCTGACAGAGAACAA SpeI

2.7 Mikroorganismen

2.7.1 Escherichia coli

Tab. 6: Verwendeter E. coli-Stamm.

Stamm Genotyp Referenz

DH5αC Δlac, endA1, gyrA96, hsdR17, recA1, relA1, supE44, thi-1, U169 (φ80, lacZΔM15)

Strauss, MDC-Berlin-Buch

2.7.2 Saccharomyces cerevisiae

Tab. 7: Verwendete und konstruierte S. cerevisiae-Stämme.


BY4741 MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0 EUROSCARF

DBY747 MATa, his3-1, leu2-3, leu2-112, trp1-289, ura3-52 ATCC 44774

W303 MATa, ade21, his311-15, leu23-112, trp11, ura31, can1100, GAL, SUC2

ATCC 200060

W303Δmsn2Δmsn4 MATa, ade21, his311-15, leu23-112, trp11, ura31, can1100, GAL, SUC2, msn2Δ3::HIS3, msn4Δ::TRP1

P. Estruch

W303Δgis1 MATa, ade21, his311-15, leu23-112, trp11, ura31, can1100, GAL, SUC2, gis1Δ::LEU2

H. Ronne

YN99-50 MATa, leu2Δ1, trp1Δ63, ura3-52, ΔYDR384c::KanMX4, ΔYNR002c::KanMX4

EUROFAN II

YN99-67 MATa, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52, ΔYCR010c::KanMX4loxP, ΔYNR002c::KanMX4

EUROFAN II

YN99-7 MATα, trp1Δ63, ura3-52, ΔYDR384c::KanMX4 EUROFAN II


32

YN99-76 MATα, leu2Δ1, ura3-52, ΔYNR002c::KanMX4 EUROFAN II

YN99-72 MATα, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52, ΔYCR010c::KanMX4loxP, ΔYDR384c::KanMX4, ΔYNR002c::KanMX4

EUROFAN II

YN99-77 MATa, trp1Δ63, ura3-52, ΔYCR010c::KanMX4loxP, ΔYDR384c::KanMX4

EUROFAN II

YN99-80 MATa, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52, ΔYCR010c::KanMX4loxP

EUROFAN II

YN99-89 MATa, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52 EUROFAN II

YNΔycr[YIp] MATa, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52::URA3, ΔYCR010c::KanMX4loxP

diese Arbeit

YNΔycr[YIpYCR] MATa, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52::URA3/YCR010c, ΔYCR010c::KanMX4loxP

diese Arbeit

YNΔycr[YIpYCR-Q] MATa, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52::URA3/ YCR010c-Q, ΔYCR010c::KanMX4loxP

diese Arbeit

YNΔycr[YIpYCR-D] MATa, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52::URA3/ YCR010c-D, ΔYCR010c::KanMX4loxP

diese Arbeit

YNΔynr[YIp] MATα, leu2Δ1, ura3-52::URA3, ΔYNR002c::KanMX4

diese Arbeit

YNΔynr[YIpYNR] MATα, leu2Δ1, ura3-52::URA3/YNR002c, ΔYNR002c::KanMX4

diese Arbeit

YNΔynr[YIpYNR-Q] MATα, leu2Δ1, ura3-52::URA3/YNR002c-Q, ΔYNR002c::KanMX4

diese Arbeit

YNΔynr[YIpYNR-D] MATα, leu2Δ1, ura3-52::URA3/YNR002c-D, ΔYNR002c::KanMX4

diese Arbeit

YN[YCR-GFP] MATa, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52,YCR010c-GFP diese Arbeit

YN[YDR-GFP] MATa, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52, YDR384c-GFP diese Arbeit

YN[YNR-GFP] MATa, his3Δ200, trp1Δ63, ura3-52, YNR002c-GFP diese Arbeit

Zum besseren Verständnis wurden die nummerierten YN-Hefestämme in dieser Arbeit wie

folgt bezeichnet:

YN (YN99-89) YNΔycrΔydr (YN99-77)

YNΔycr (YN99-80) YNΔycrΔynr (YN99-67)

YNΔydr (YN99-7) YNΔydrΔynr (YN99-50)

YNΔynr (YN99-76) YNΔycrΔyrΔynr (YN99-72)


33

2.7.3 Yarrowia lipolytica

Tab. 8: Verwendete und konstruierte Y. lipolytica Stämme


B204-12C MATA, met6-1, spo1-1 Kujau et al. (1992)

CXAU1 MATA, ade1, ura3 Iida et al. (1998)

E129 MATA, leu2-270, lys11-23, ura3-302, xpr2-322 Le Dall et al. (1994)

H222 MATA (Wildtyp) Barth and Weber (1982)

W29 MATA (Wildtyp) Gaillardin et al. (1975)

PO1d MATA, leu2-270, ura3-302, xpr2-322 Barth and Weber (1982)

PO1dΔgpr1 MATA, leu2-270, ura3-302, xpr2-322, Δgpr1::URA3

Augstein (2001)

PO1d-GPR1-2 MATA, leu2-270, ura3-302, xpr2-322, Δgpr1::GPR156

diese Arbeit

2.8 Kultivierungsmedien

Festen Medien (Agarplatten) wurden jeweils 2 % (w/v) Agar zugesetzt.

2.8.1 Kultivierungsmedium für Escherichia coli

LB-Medium (Sambrook et al., 1989): Hefeextrakt 0,5 % (w/v) NaCl 1 % (w/v) Pepton 1 % (w/v)

Ampicillin (1000fache SL): 100 mg/ml

2.8.2 Kultivierungsmedien für Saccharomyces cerevisiae und Yarrowia lipolytica

Vollmedium für S. cerevisiae und Y. lipoytica (YPD)

Glucose 2 % (w/v) Hefeextrakt 1 % (w/v) Pepton 2 % (w/v)


34

Minimalmedium für S. cerevisiae (M) Das Minimalmedium für S. cerevisiae setzte sich aus Readersalzen, Spurenelementen, Ei-

senchlorid-Lösung, Vitaminen, C-Quelle und eventuellen Supplementen zusammen.

10 x Readersalze: Ca(NO3)2 x 4 H2O 4 g/l KH2PO4 10 g/l K2HPO4 x 3 H2O 1,6 g/l MgSO4 x 7 H2O 7 g/l NaCl 5 g/l (NH4)2SO4 30 g/l

1000fache Spurenelemente-SL: CuSO4 x 5 H2O 40 mg/l H3BO3 500 mg/l KI 100 mg/l MnSO4 x 4H2O 400 mg/l

Na2MoO4 200 mg/l ZnSO4 x 7 H2O 400 mg/l

5000fache Eisen(III)chlorid-SL: FeCl3 x 6H2O 30 g/l in Ethanol lösen

100fache Vitamin-SL: Biotin 2 mg/l Calciumpantothenat 400 mg/l Folsäure 2 mg/l Inositol 2 g/l p-Aminobenzoesäure 200 mg/l Pyridoxin x HCl 400 mg/l Riboflavin 200 mg/l

Thiaminhydrochlorid 400 mg/l Niacin 400 mg/l

Supplemente (100fach): L-Histidin 2 g/l L-Leucin 10 g/l L-Lysin 2 g/l L-Methionin 5 g/l L-Tryptophan 2 g/l Uracil 2 g/l

Kohlenstoffquellen: Endkonzentrationen im Medium

Ethanol 2 % (v/v) Glucose 2 % (w/v) Natriumacetat 30 mM

Glucose wurde autoklaviert, Natriumacetat dagegen steril filtriert. Der pH-Wert von Natrium-

acetat wurde mit Salzsäure je nach Bedarf auf pH4, pH5,5 oder pH6 eingestellt.


35

Minimalmedium für Y. lipolytica (MM) Das Minimalmedium für Y. lipolytica setzte sich aus Salzlösung, Thiaminhydrochlorid-

Lösung, C-Quelle und bei Bedarf Supplementen zusammen.

5 x Salzlösung (5 x MMT): KH2PO4 7 g/l K2HPO4 x 3 H2O 9,3 g/l MgSO4 x 7 H2O 5 g/l

NH4H2PO4 25 g/l Spurenelemente-Lösung 5 ml/l

Spurenelemente-Lösung: Ca(NO3)2 x 4 H2O 20 g/l CoCl2 100 mg/l

CuSO4 x 5 H2O 100 mg/l FeCl3 x 6 H2O 2 g/l H3BO3 500 mg/l KI 100 mg/l MnSO4 x 4H2O 400 mg/l NaMoO4 200 mg/l ZnSO4 x 7 H2O 400 mg/l

1000fache Thiaminhydrochlorid-SL: Thiaminhydrochlorid 300 mg/l steril filtrieren

Die Konzentration der C-Quellen und Supplemente sind unter der Zusammensetzung von

Minimalmedium für S. cerevisiae mit aufgeführt.

2.9 Gentechnische Arbeitsmethoden

Grundlegende gentechnische Arbeiten wurden nach Sambrook et al. (1989) und Ausubel et

al. (1997) durchgeführt.

2.9.1 Agarosegel-Elektrophorese

Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte bei 8 bis 10 V/cm in

1 x TAE-Puffer. Die Gele wurden in Abhängigkeit der zu trennenden Fragmente aus 0,5 -

2%iger Agarose und 2 µl/100 ml Ethidiumbromid-SL in 1 x TAE-Puffer hergestellt. Die DNA-

Proben wurden vor dem Auftragen mit Ladepuffer versetzt. Nach der elektrophoretischen

Auftrennung konnten entstandene DNA-Ethidiumbromidkomplexe mit einem UV-Trans-

illuminator bei 312 nm sichtbar gemacht werden.

50 x TAE-Puffer: EDTA (0,5 M, pH8) 100 ml/l Eisessig 57,1 ml/l Tris 242 g/l

Ethidiumbromid-SL: Ethidiumbromid 10 mg/ml


36

6 x Ladepuffer: Bromphenolblau 0,05 % (w/v) Glycerol 30 % (v/v) Tris, 1 % (w/v) 1 Tropfen

2.9.2 Restriktionsspaltungen

Für präparative Restriktionsspaltungen wurde die benötigte Menge an Plasmid-DNA bzw.

PCR-Produkt mit 3 U Enzym pro µg DNA sowie dem für das Enzym optimalen Puffer ver-

setzt und 3 h oder üN bei 37 °C inkubiert. Analytische Restriktionsanalysen erfolgten in ei-

nem Gesamtvolumen von 10 µl mit ca. 500 ng DNA, dem entsprechenden Puffer und 0,2 U

Enzym bei 37 °C für 1 h.

2.9.3 Ligation von DNA-Fragmenten

Die Vektor-DNA wurde mit Insert-DNA im molaren Verhältnis von 1:3 gemischt und nach

Zugabe von Ligasepuffer und T4-Ligase (3 U) in einem Endvolumen von 20 µl 3 h bei Raum-

temperatur oder üN bei 16 °C ligiert.

Vor der Transformation in E. coli wurden 4 µl des Ligationsansatzes mit Hilfe einer „Milipore

White VSWP Membrane“ (Ø 0,025 µm) 15 min gegen dH2O dialysiert.

2.9.4 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die Amplifikation von DNA-Fragmenten erfolgte in einer zweistufigen PCR, wobei die Annea-

lingtemperatur der ersten 5 Zyklen 6 °C und die der folgenden 20 Zyklen je 3 °C unter der

Schmelztemperatur (TS) des Primers mit der niedrigsten Schmelztemperatur lag.

Die PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Initialschmelzen 94 °C 5 min

5 Zyklen Schmelzen 94 °C 1 min Annealing TS-6 °C 1 min 30 s Synthese 72 °C 1 min pro 1000 bp

20 Zyklen Schmelzen 94 °C 1 min Annealing TS-3 °C 1 min 30 s Synthese 72 °C 1 min pro 1000 bp

Synthese 72 °C 5-7 min


37

Die PCRs wurden in 50-100 µl Ansätzen wie folgt angesetzt:

Template 15 ng Plasmid-DNA oder 30-60 ng genomische DNA

Primer jeweils 1,5 µl (SL: 10 pmol/µl)

dNTPs 2 µl (SL: 10 mM pro dNTP)

Reaktionspuffer 5-10 µl (SL: 10 x)

MgSO4 oder MgCl2 5-10 µl (SL: 25 oder 50 mM)

Polymerase 0,5 µl (SL: 5 U/µl)

Die von Pogulis et al. (1996) beschriebene rekombinante PCR (OEP: „Overlap Extension

PCR”) wurde für Punktmutationen, Insertionen und Fusionen an beliebigen Stellen eines

Genes verwendet.

Die zur zufälligen Mutagenese angewandte PCR-Methode ist in Kapitel 2.9.13 beschrieben.

2.9.5 Isolierung von DNA aus Agarosegelen

Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde der „JETQUICK Gel Extracti-

on Spin Kit“ oder der „JETSORB Gel Extraction Kit“ benutzt und nach Herstellerangaben

verfahren.

2.9.6 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli

Plasmid-DNA wurde aus 2 ml einer üN-Kultur (LB-Flüssigmedium mit Ampicillin) nach der

Methode von Birnboim and Doly (1979) gewonnen. Für Sequenzierungen wurde die Plas-

mid-DNA mit Hilfe des „JETQUICK Plasmid Miniprep Spin Kit“ isoliert.

2.9.7 Isolierung von DNA aus Hefen

Für die Präparation chromosomaler DNA und zur Rückisolierung von Plasmiden aus den

Hefen S. cerevisiae und Y. lipolytica wurde die Methode nach Hoffman and Winston (1987)

angewandt.

Es wurden 10 - 20 ml einer üN-Kultur bei 3000 x g für 5 min abzentrifugiert und das Pellet in

200 µl TEST-Puffer resuspendiert. Weiterhin wurden 200 µl Phenol:Chloroform:Isoamylalko-

hol (25:24:1) und ca. 0,3 g Glasperlen (Ø 0,45 mm) zugesetzt und die Zellen 3 min durch

kräftiges Schütteln aufgeschlossen. Danach wurden 200 µl TE-Puffer zugegeben und der

6400 x g Überstand ein weiteres Mal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol und anschlie-

ßend zweimal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert.


38

Für die Transformation von Plasmid-DNA in E. coli-Zellen wurde der Überstand nach Zugabe

von 1 Volumen Isopropanol gefällt, mit 70%igem EtOH gewaschen und anschließend in 10 µl

dH2O aufgenommen. Die Hälfte des DNA-Gemisches wurde zur Transformation eingesetzt.

Für die Gewinnung der gesamten DNA aus Hefezellen wurde der Überstand mit 40 µl Natri-

umacetat (3 M, pH5,2) sowie 1 ml EtOH versetzt und 10 min bei -20 °C inkubiert. Nach der

Fällung durch Zentrifugation wurde die DNA ebenfalls mit 70%igem EtOH gewaschen. Das

Pellet wurde in 50 µl TE-Puffer mit RNase A (100 µg/ml) aufgenommen und für 1 h bei 37 °C

inkubiert.

TEST-Puffer: EDTA (pH8) 1 mM NaCl 100 mM SDS 10 % (w/v)

Tris-HCl (pH8) 10 mM Triton X-100 2 % (v/v)

TE-Puffer: EDTA (pH8) 1 mM Tris-HCl (pH8) 10 mM

2.9.8 Isolierung von RNA aus Saccharomyces cerevisiae

Bei der Isolierung von RNA wurden immer Handschuhe getragen und alle Arbeitsschritte auf

Eis bzw. bei 4 °C durchgeführt. Zur Inaktivierung vorhandener RNasen wurde das verwen-

dete dH2O zuvor mit DEPC behandelt.

Für die Isolierung von RNA wurden 5 bis 80 OD600 in einem Maximalvolumen von 50 ml einer

S. cerevisiae-Flüssigkultur geerntet. Das Volumen wurde bei Bedarf auf 50 ml mit eiskaltem

dH2O aufgefüllt und die Zellen bei 3000 x g für 5 min bei 4 °C abzentrifugiert. Danach wurde

das Pellet in 1 ml dH2O aufgenommen und 15 s bei 6400 x g zentrifugiert. Nachdem der

Überstand abgenommen wurde, konnten die Zellen bei -20 °C gelagert werden.

Für den Zellaufschluss wurden die Zellen in 300 µl Extraktionspuffer aufgenommen und 0,3 g

Glasperlen (Ø 0,45 mm) sowie 300 µl Phenol:Choroform:Isoamylalkohol (mit 1 % SDS ver-

setzt) zugegeben. Der Zellaufschluss wurde in der Fastprep BIO101 für 20 s durchgeführt. Anschließend erfolgte eine 15minütige Zentrifugation bei 13000 x g und 4 °C. Der Überstand

wurde abgenommen und mit 25 µl 40%igem (w/v) Kaliumacetat (pH5,5) sowie 300 µl Phe-

nol:Chloroform:Isoamylalkohol (ohne SDS) versetzt. Der Ansatz wurde 30 s kräftig geschüt-

telt und danach 10 min bei 6400 x g und 4 °C zentrifugiert. Zur Fällung der RNA wurde der

Überstand mit 1 ml 100%igem Ethanol versetzt und mindestens 1 h bei -20 °C inkubiert.

Nach der 15minütigen Zentrifugation bei 6400 x g und 4 °C wurde der Überstand abgenom-

men und das RNA-Pellet mit 200 µl 80%igem (v/v) Ethanol gewaschen. Die RNA wurde an-

schließend getrocknet und in 25 bis 75 µl dH2O aufgenommen.


39

Die RNA-Konzentration und –Reinheit wurde mittels Absorptionsmessung bei OD260 und

OD280 ermittelt (OD260:OD280 sollte ca. 2 betragen, 1 OD260 = 40 ng/µl). In allen Proben wurde

die RNA-Konzentration auf 3 µg/µl eingestellt und die Proben bei -20 °C aufbewahrt.

Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1): Phenol pH4,2 (SIGMA P-4682)

Extraktionspuffer: EDTA 1 mM LiCl 100 mM SDS 1 % (w/v) Tris-HCl (pH7,5) 100 mM

2.9.9 Northern-Hybridisierung

Elektrophorese und Kapillarblot Für das Agarosegel wurde 1 % (w/v) Agarose in 1 x NBC gelöst. Nachdem die Gellösung auf

60 °C abgekühlt war, wurde 37%iges Formaldehyd (2 ml pro 80 ml) zugegeben und die Lö-

sung in die Gel-Apparatur gegossen. Zur Equilibrierung des Gels und Zerstörung vorhande-

ner RNasen fand ein 15minütiger Vorlauf statt.

Zu 2,5 µl RNA-Lösung (3 µg/µl) wurden 8,5 µl Ladepuffer II zugegeben und die Proben 5 min

bei 70 °C denaturiert, danach wurden diese sofort für 5 min auf Eis abgekühlt. Die RNA-

Proben wurden auf das Gel aufgetragen und bei 10 V/cm aufgetrennt. Zur Entfernung des

Formaldehyds im Gel wurde dies anschließend 2 x 10 min mit dH2O gewaschen. Danach

erfolgte eine 10minütige Inkubation des Gels in 10 x SSC. Der Transfer der RNA auf die Hy-

bond-N+ (Amersham Biosciences) erfolgte üN mittels Kappilarblotting unter Verwendung von

10 x SSC. Nachdem die Membran in 2 x SSC gewaschen wurde, erfolgte die Fixierung der

RNA mittels UV-Crosslinking (2 x 125 mJoule).

Prähybridisierung und Hybridisierung Die Prähybridisierung erfolgte in Hybridisierungspuffer für 2 h bei 65 °C. In dieser Zeit wur-

den die Sonden mit Hilfe des „MegaprimeTM DNA labelling systems“ (Amersham Bioscien-

ces) nach Angaben des Herstellers markiert. Für die Markierung der Sonden wurde die DNA

mittels PCR gewonnen (Tab. 9). Die markierte Sonden-DNA wurde über eine Säule (NICK

columns der Firma Amersham Biosciences) gereinigt und die Radioaktivität bestimmt. Es

wurden von der markierten Sonden-DNA 1 Million cpm für die Hybridisierung eingesetzt. Die

markierte Sonde wurde 5 min bei 100 °C denaturiert und anschließend auf Eis abgekühlt.

Nach der Zugabe der Sonde erfolgte die Hybridisierung bei 65 °C üN im Hybridisierungsofen.


40

Waschen und Nachweis der Sonde Die Membran wurde 2 x 10 min bei RT und anschließend für 2 x 45 min bei 65 °C in

0,5 x SSC/0,1 % SDS (w/v) gewaschen. Danach konnte die Detektion erfolgen.

Vor einer erneuten Beprobung der Membran wurde diese 2 x 30 min bei 85 °C in 0,1 % SDS

(w/v) gewaschen, um die Sonde zu entfernen.

Ladepuffer I: NBC (20 x) 1 V EtBr (SL: 10 mg/ml) 4 µl/ml Formaldehyd (37 %, v/v) 3 V Formamid 10 V Ladepuffer II 2 V

Ladepuffer II: Bromphenolblau 0,25 % (w/v) EDTA (pH8) 0,1 mM Ficoll 400 15 % (w/v) Xylencyanol FF 0,25 % (w/v)

20 x NBC (pH7): Borsäure 1 M DEPC 0,1 % NaOH 100 mM Natriumcitrat 20 mM

50 x Denhardts-Lösung: BSA 1 % Ficoll 400 1 %

Polyvinylpyrrolidon 1 % Steril filtriert und bei -20 °C gelagert

20 x SSC: NaCl 3 M Natriumcitrat (pH7) 0,3 M

Prähybridisierungspuffer: Denhardts-Lösung 5 x NaH2PO4 50 mM

SDS 0,5 % (w/v) SSC 5 x ssDNA 0,1 mg/ml

10 min bei 100 °C inkubieren und auf Eis abkühlen

Hybridisierungspuffer: Prähybridisierungspuffer + 10 % Dextransulfat

Tab. 9: Im Northern-Blot verwendete Sonden. Die DNA wurde durch PCRs mit Hilfe der angegebenen Templates und Primer gewonnen.

Sonde Template Primer

YCR010c p426MET-YCR YCR-Spe-uni/YCR-Cla-rev

YDR384c p426MET-YDR YDR-Spe-uni/YDR-Cla-rev

YNR002c p426MET-YNR YNR-Spe-uni/YNR-Cla-rev

18S RNA genomische DNA (YN) 18S-F/18S-R


41

2.9.10 Transformation von Mikroorganismen

2.9.10.1 Herstellung und Transformation elektrokompetenter Escherichia coli-Zellen (modifiziert nach Dower et al., 1988)

400 ml LB-Flüssigmedium wurden mit 4 ml einer E. coli-üN-Kultur beimpft und auf dem

Schüttler bei 37 °C inkubiert. Nach Erreichen einer OD600 von 0,5 - 0,8 wurden die Zellen

15 min auf Eis gestellt und anschließend abzentrifugiert (4000 x g, 15 min, 4 °C). Nach

zweimaligem Waschen mit eiskaltem dH2O (400 ml bzw. 200 ml) wurden die Zellen einmal

mit 20 ml 10%igem (v/v) Glycerol gewaschen. Das Pellet wurde in 2 ml 10%igem (v/v) Glyce-

rol resuspendiert und in 40 µl Portionen mit Trockeneis/Ethanol schockgefroren. Die Zellen

wurden bei -80 °C gelagert.

Zur Transformation wurden 40 µl Zellen mit der DNA-Lösung (4 µl Ligationsansatz oder ca.

25 ng Plasmid-DNA) gemischt und in Elektroporationsküvetten (0,2 cm von PeqLab, vorge-

kühlt) gegeben. Nach der Elektroporation bei 25 µF, 200 Ω und 2,5 kV wurde sofort 1 ml

SOC-Medium zugegeben und die Zellen 1 h bei 37 °C inkubiert. Nach Ausplattieren des An-

satzes auf LB-Platten mit Ampicillin erfolgte üN die Inkubation bei 37 °C.

SOC-Medium: Glucose 20 mM Hefeextrakt 0,5 % (w/v) KCl 2,5 mM

MgCl2 10 mM NaCl 10 mM Pankreatisches Pepton aus Casein 2 % (w/v)

2.9.10.2 Herstellung und Transformation kompetenter Saccharomyces cerevisiae-Zellen

Die Herstellung und Transformation kompetenter S. cerevisiae-Zellen wurde wie bei Dower

et al. (1988) beschrieben durchgeführt. Die kompetenten Hefezellen wurden mit ca. 10 bis

15 ng Plasmid-DNA transformiert.

Zur integrativen Transformation von S. cerevisiae wurden 50 bis 500 ng Fragment-DNA (YIp-

Konstrukte, mit StuI geschnitten) verwendet.

2.9.10.3 Herstellung und Transformation elektrokompetenter Yarrowia lipolytica-Zellen (modifiziert nach Dower et al., 1988)

Diese Methode wurde für die Transformation von Y. lipolytica mit autonom replizierenden

Hefevektoren verwendet.


42

500 ml YPD-Medium wurden mit einer üN-Kultur des gewünschten Hefestammes mit einer

OD600 von ca. 0,3 angeimpft. Es erfolgte die Kultivierung bei 28 °C auf dem Schüttler bis zum

Erreichen einer OD600 von 1,3 bis 1,5. Die Zellen wurden bei 4000 x g für 5 min und 4 °C

geerntet. Das Pellet wurde zweimal mit eiskaltem dH2O (500 ml bzw. 250 ml) gewaschen

und danach in 20 ml eiskaltem 1 M Sorbitol aufgenommen. Nach erneuter Zentrifugation

wurden die Zellen in 0,5 ml 1 M Sorbitol resuspendiert (Endvolumen ca. 1,5 ml) und in Porti-

onen von 40 µl mit Trockeneis/Ethanol schockgefroren. Die Lagerung der Zellen erfolgte bei

-80 °C.

Zur Transformation wurden 40 µl elektrokompetente Hefezellen mit 100 bis 400 ng Plasmid-

DNA gemischt, in eine Elektroporationsküvette (0,2 cm von PeqLab, vorgekühlt) überführt

und einem elektrischen Puls von 1,8 kV bei 200 Ω und 25 µF ausgesetzt. Die Zellen wurden

anschließend sofort in 1 ml Sorbitol aufgenommen und auf Selektivagarplatten ausplattiert.

Nach 2 bis 3 Tagen Kultivierung bei 28 °C wurden die Transformanden sichtbar.

2.9.10.4 Integrative Transformation von Yarrowia lipolytica

Die integrative Transformation von Y. lipolytica erfolgte nach der bei Barth and Gaillardin

(1996) beschriebenen Methode. Die Selektion der Transformanden erfolgte auf MMG-Platten

unter Zusatz von 5-FOA (1,25 g/l) und Uracil (10 mg/l).

Es wurden 500 ng Fragment-DNA für die Transformation verwendet.

2.9.11 DNA-Sequenzierung

Die korrekte Sequenz aller Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzierung nach der Kettenab-

bruchmethode von Sanger et al. (1977) mit Hilfe des Sequenzierers CEQTM2000XL der Fir-

ma Beckman Coulter unter Verwendung des Kitsystems „CEQTM DTSC-Quickstart“ überprüft.

2.9.12 Southern-Hybridisierung

Für Southern-Hybridisierungen wurden das „Gene Images random prime labelling module“

und das „Gene Images CDP-Star detection module“ der Firma Amersham Biosciences ver-

wendet und nach den Herstellerangaben verfahren.

Es wurden 500 ng geschnittene genomische DNA sowie 5 ng λDNA (EcoRI/HindIII geschnit-

ten) als Größenstandard aufgetragen.

Die verwendeten Sonden und deren Herstellung sind in Tab. 10 angegeben.


43

Tab. 10: Herstellung der Sonden, die für die Southern-Hybridisierung verwendet wurden.

Sonde Plasmid Herstellung der Sonde

YCR010c p426METYCR SpeI/ClaI-Fragment (859bp)

YNR002c p426METYNR SpeI/ClaI-Fragment (856bp)

URA3 (S.c.) YIp352 NdeI/Mph1103I-Fragment (903bp)

GPR1 pUCGlacZF EcoRV/BamHI-Fragment (845bp)

URA3 (Y.l.) pINA443 SalI-Fragment (1704 bp)

2.9.13 Plasmidkonstruktionen

In den Anlagen befinden sich Plasmidkarten wichtiger Plasmide.

Plasmide, die für verschiedene Gpr1-Proteine kodieren Die Amplifizierung der GPR1-Allele (GPR1, GPR1-1 und GPR1-2) erfolgte mit Hilfe der Pri-

mer GPR1-Spe-uni/GPR1-Cla-rev unter Verwendung der Plasmide pYLG1, pYLG2 bzw.

pYLG3 als entsprechende Templates. Die PCR-Produkte wurden über die Schnittstellen

SpeI und ClaI in den Vektor p426MET25 kloniert (p426MET-GPR1, p426METGPR1-1 und

p426METGPR1-2).

Plasmide mit den GPR1-Orthologen aus S. cerevisiae

Die Amplifizierung der GPR1-Orthologen YCR010c, YDR384c bzw. YNR002c fand unter

Verwendung der Primerpaare YCR-Spe-uni/YCR-Cla-rev, YDR-Spe-uni/YDR-Cla-rev bzw.

YNR-Spe-uni/YNR-Cla-rev statt. Als Template diente die genomische DNA des Stammes

DBY747 (für YCR010c) bzw. BY4741 (für YDR384c und YNR002c). Die Klonierung der

PCR-Produkte erfolgte über die Schnittstellen SpeI und ClaI in den Vektor p426MET25

(p426METYCR, p426METYDR, p426METYNR).

Ort-spezifische Mutagenese der Homologen YCR010c und YNR002c

Es sollten in Ycr010cp und Ynr002cp analog den Mutationen in den Allelen GPR1-1 und

GPR1-2 die Aminosäuren L75 (YCR010c) bzw. L74 (YNR002c) durch Q sowie G259 durch D

ausgetauscht werden.

Die Mutation in Ycr010cp von L75 in Q erfolgte mit Hilfe einer OEP (vgl. Kapitel 2.9.4). Zuerst

wurden zwei Subfragmente mit Hilfe der Primer YCR-Spe-uni/YCR238-rev und YCR-226-

uni/YCR-Cla-rev unter Verwendung von p426METYCR als Template erzeugt. Danach fand

eine PCR mit diesen beiden Subfragmenten und den Primern YCR-Spe-uni und YCR-Cla-

rev statt. Das PCR-Produkt wurde über die Schnittstellen SpeI und ClaI in den Vektor

p426METYCR inseriert (p246METYCR-Q75). Zum Austausch von G259 in D wurden die Pri-


44

mer YCR-Spe-uni und YCR-D259-rev verwendet. Die Amplifizierung des PCR-Fragmentes

erfolgte mit dem Plasmid p426METYCR als Template. Das entstandene PCR-Produkt wurde

über SpeI und EcoRI in den Vektor p426METYCR kloniert (p246METYCR-D259).

Die Ort-spezifischen Mutagenesen von L74 zu Q und G259 zu D in Ynr002cp wurden ebenfalls

mit Hilfe der OEP (vgl. Kapitel 2.9.4) durchgeführt. Zur Klonierung von p426METYNR-Q74

wurden zuerst die Subfragmente mit den Primern YNR-Spe-uni/YNR-237-rev bzw. YNR-237-

uni/YNR-Cla-rev und p426METYNR als Template erzeugt. Diese PCR-Fragmente wurden in

der folgenden PCR als Template und YNR-Spe-uni/YNR-Cla-rev als Primer verwendet. Das

entstandene PCR-Produkt wurde über SpeI und ClaI in den Vektor p426METYNR kloniert.

Für den Austausch von G259 zu D fand ebenfalls eine Amplifikation von zwei Subfragmenten

statt. Dabei dienten YNR-Spe-uni/YNR-792-rev sowie YNR-775-uni/YNR-Cla-rev als Primer

und p426METYNR als Template. Anschließend wurden diese Subfragmente in einer weite-

ren PCR als Template verwendet. Die eingesetzten Primer waren YNR-Spe-uni und YNR-

Cla-rev. Das PCR-Produkt wurde über SpeI und ClaI in p426METYNR (p426METYNR-D259) kloniert.

Zufällige Mutagenese der Allele YCR010c, YDR384c und YNR002c

Nach Shafikhani et al. (1997) wurde eine mutagene PCR mit Taq-Polymerase in Gegenwart

von 0,05, 0,1 und 0,15 mM MnCl2 unter der Verwendung der Primer YCR-Spe-uni/YCR-Cla-

rev, YDR-Spe-uni/YDR-Cla-rev sowie YNR-Spe-uni/YNR-Cla-rev durchgeführt. Als Template

dienten die Plasmide p426METYCR, p426METYDR bzw. p426METYNR. Die entstandenen

PCR-Produkte wurden über SpeI/ClaI in den Vektor p426MET25 kloniert. Der resultierende

Plasmidpool wurde in E. coli transformiert, jeweils von ca. 12 Kolonien Plasmid-DNA präpa-

riert und die Inserts sequenziert. Zur Transformation in die Stämme DBY747 und

YNΔycrΔydrΔynr wurde der Ansatz gewählt, dessen Inserts die meisten Einzelmutationen

aufwies. Die Hefetransformanden wurden auf frische MG-Platten ausgestrichen und an-

schließend auf MA- (nur der Stamm YNΔycrΔydrΔynr), MAG- und MG-Platten überstempelt.

Von Transformanden, die ein schlechteres Wachstum auf MA bzw. MAG zeigten wurden

1 x 105 Zellen auf MA-, MAG- und MG-Platten ausgetropft und somit nochmals deren

Wachstum überprüft. Konnte der Phänotyp bestätigt werden, erfolgte eine Plasmid-

Reisolierung und Transformation der Plasmid-DNA in E. coli. Aus jeweils drei E. coli-

Transformanden wurde die Plasmid-DNA präpariert und anschließend zur Identifizierung der

Mutationen zwei der Inserts sequenziert.

Klonierung der Allele YCR010c, YDR384c und YNR002c

Die Amplifizierung des YCR010c-, YDR384c- und YNR002c-Allels fand mit Hilfe der Primer

YCRPr-Hindf/YCR-Cla-rev, YDRPr-Sac-uni/YDR-Cla-rev bzw. YNRPr-Sac-uni/YNR-Cla-rev


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unter Verwendung genomischer DNA des Stammes BY4741 (YCR010c, YNR002c) bzw. YN

(für YDR384c) statt. Die entstandenen PCR-Fragmente wurde über die Schnittstellen SacI

und ClaI in den Vektor p416ADH (p416YCR, p416YDR, p416YNR) kloniert.

Klonierung der Ort-spezifischen Mutationen in die Allele YCR010c und YNR002c Für die Klonierung von p416YCR-Q75 wurde das BstXI/HindIII-Fragment aus dem Plasmid

p426METYCR-Q75 in den Vektor p416YCR inseriert. Der Vektor p416YCR-D256 wurde aus

dem HindIII/EcoRI-Fragment des Vektors p426METYCR-D259 und p416YCR konstruiert.

Zur Konstruktion von p416YNR-Q74 wurden die Vektoren p416YNR und p426METYNR-Q74

mit den Restriktionsenzymen Bsu36I und HindIII geschnitten und die entsprechenden Frag-

mente ligiert. Die Klonierung von p416YNR-D259 fand mit Hilfe der HindIII/EcoRI-Fragmente

von p426METYNR-D259 und p416YNR statt.

C-terminale Verkürzungen und Deletionen von YCR010c bzw. YNR002c

Zur Verkürzung des C-terminalen Teils von YCR010c wurden die Primer YCR(HindIII)-518-

uni/YCR-dA258 bzw. YCR-dY267 eingesetzt. Als Template wurde der Vektor p416YCR ver-

wendet. Die beiden entstandenen PCR-Produkte wurden über die Schnittstellen HindIII und

ClaI in die Vektoren p416YCR (p416YCR-dA258, p416YCRdY266) und p416YCR-Q75

(p416YCR-Q75-dA258, p416YCR-Q75-dY266) kloniert. Für die Deletion des YNAYA-Motivs

war eine OEP (vgl. Kapitel 2.9.4) erforderlich. Zunächst wurden die beiden Subfragmente mit

den Primern YCR(HindIII)-518-uni/YCR-759-rev, YCR-dYNAYA-uni/YCR-Cla-rev und

p416YCR als Template amplifiziert. Anschließend erfolgte eine zweite PCR unter Verwen-

dung der beiden Subfragmente als Template und mit YCR(HindIII)-518-uni/YCR-Cla-rev.

Das PCR-Fragment wurde über HindIII und ClaI in die Vektoren p416YCR (p416YCR-dYNAYA) und p416YCR-Q75 (p416YCR-Q75-dYNAYA) kloniert.

YNR002c wurde unter der Verwendung der Primer YNR(HindIII)-473-uni/YNR-dY266-rev

bzw. YNR-dA257-rev und p416YNR als Template C-terminal verkürzt. Durch die Klonierung

der entstandenen PCR-Fragmente über die Schnittstellen HindIII und ClaI in die Vektoren

p416YNR und p416YNR-Q74 entstanden die Konstrukte p416YNR-dA257, p416YNR-dY266, p416YNR-Q74-dA257 und p416YNR-Q74-dY266. Zur Deletion des YNAYA-Motivs

in Ynr002cp wurde eine OEP (vgl. Kapitel 2.9.4) durchgeführt. Es wurden zwei Subfrag-

mente mit Hilfe der Primer YNR(HindIII)-473-uni/YNR-772-rev und YNR-dYNAYA-uni/YNR-

Cla-rev und dem Plasmid p416YNR als Template erzeugt. Diese beiden Fragmente wurden

in der anschließenden PCR als Template verwendet, als Primer dienten YNR(HindIII)-473-

uni/YNR-Cla-rev. Die Klonierung des PCR-Fragmentes in die Vektoren p416YNR

(p416YNR-dYNAYA) und p416YNR-Q74 (p416YNR-Q74-dYNAYA) fand über die Schnitt-

stellen HindIII und ClaI statt.


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GFP-Fusionskonstrukte Um eine zelluläre Lokalisierung der Gpr1p-Orthologen zu ermöglichen sollten diese C-termi-

nal mit GFP fusioniert werden. Für die PCR wurde das Plasmid pUG30 als Template und die

Primer YCR-GFP-uni/YCRt-kan-rev, YDR-GFP-uni/YDRt-kan–rev sowie YNR-GFP-

uni/YNRt-kan-rev verwendet. Es wurden mit Hilfe dieser PCR das GFP- und das Kanamycin-

Gen (kodiert für Resistenz gegen Gentamycin) amplifiziert. Die Primer enthielten an ihren

Enden Sequenzen des jeweiligen Homologen, so dass eine integrative Transformation der

PCR-Produkte über diese Sequenzen in die Hefe S. cervisiae erfolgen konnte. Die Selektion

der Transformanden erfolgte auf YPD-Platten mit zugesetztem Gentamycin (Endkonzentarti-

on: 200 mg/l).

HA-Fusionskonstrukte Für die C-terminale Fusion von Ycr010cp und Ynr002cp mit 3 x HA waren OEPs (vgl. Kapitel

2.9.4) notwendig.

Zunächst fand die Amplifizierung der Subfragmente mit den Primern sYCR-uni/YCR-849-rev

bzw. YCR-HA-uni/HAStopp-Cla-rev unter Verwendung von p416YCR bzw. YEp351-3HA als

jeweiliges Template statt. Die sich anschließende PCR wurde mit den beiden Subfragmenten

und den Primern sYCR-uni/HAStopp-Cla-rev durchgeführt. Die Klonierung des entstandenen

PCR-Fragmentes konnte über die Schnittstellen HindIII und ClaI in die Vektoren p416YCR

(p416YCR-HA), p416YCR-Q75 (p416YCR-Q75-HA) und p416YCR-D259 (p416YCR-D259-HA) erfolgen.

Zur Klonierung der C-terminalen Fusion von Ydr384cp mit 3 x HA wurden zuerst PCRs mit

den Primern sYDRPr-f2/YDR-825-rev bzw. YDR-HA-uni/HA-Stopp-Hind-rev und p416YDR

bzw. YEp351-3HA als Templates durchgeführt. Die beiden Fragmente wurden in der folgen-

den PCR als Template sowie sYDRPr-f2/HAStopp-Cla-rev als Primer genutzt. Das erhaltene

PCR-Fragment konnte über XbaI und HindIII in den Vektor p416YDR (p416YDR-HA) kloniert

werden.

Zur C-terminalen Fusion von Ynr002cp mit 3 x HA mussten ebenfalls Subfragmente amplifi-

ziert werden. Die PCR fand mit Hilfe der Primer sYNR-uni/YNR-846-rev bzw. YNR-HA-

uni/HAStopp-Cla-rev sowie p416YNR bzw. YEp351-3HA als Templates statt. Beide Sub-

fragmente dienten in der folgenden PCR als Template, es wurden die Primer sYNR-

uni/HAStopp-Cla-rev verwendet. Das entstandene PCR-Fragment wurde über die Schnitt-

stellen HindIII und ClaI in die Vektoren p416YNR (p416YNR-HA), p416YNR-Q74 (p416YNR-Q74-HA) und p416YNR-D259 (p416YNR-D259-HA) kloniert.


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Klonierung der Vektoren zur integrativen Transformation der YCR010c- und YNR002c-Allele Die Klonierung der YCR010c-Allele in YIp352 erfolgte in zwei Schritten. Zuerst wurde der

CYC1-Terminator aus p426MET25 in YIp352 kloniert, dies erfolgte über die Restriktions-

schnittstellen SalI und KpnI (YIp352CYC1). Die YCR010c-Allele wurden mit Hilfe der Primer

YCRPr-Sph-uni/YCR-Xho-rev sowie p416YCR, p416YCR-Q75 bzw. p416YCR-D259 als

Template amplifiziert. Die entstandenen PCR-Produkte wurden mit SphI und XhoI geschnit-

ten und in den Vektor YIp352CYC1 kloniert (YIpYCR, YIpYCR-Q75, YIpYCR-D259).

Für die Klonierung der YNR002c-Allele in den integrativen Vektor YIp352 wurden dieser und

die Plasmide p416YNR, p416YNR-Q74 sowie p416YNR-D259 mit den Restriktionsenzymen

SacI und KpnI geschnitten. Anschließend erfolgte die Ligation der YNR002c-Fragmente mit

dem Vektor YIp352 (YIpYNR, YIpYNR-Q74, YIpYNR-D259).

2.9.14 Konstruktion des Yarrowia-lipolytica-Stammes PO1d-GPR1-2

Bei dieser Konstruktion wurde als Ausgangsstamm PO1dΔgpr1 gewählt. Der Stamm wurde

integrativ mit dem GPR1-2-Fragment, das durch das Schneiden des Vektors pYLG2 mit den

Restriktionsenzymen BamHI/HindIII gewonnen wurde, transformiert. Die entstandenen

Transformanden wurden auf MG-Platten mit 5-FOA (Endkonzentration: 1,25 mg/ml) selek-

tiert. Nach der weiteren Überprüfung des Phänotyps auf MA-Platten erfolgte im Southern-

Blot die Kontrolle des Genotyps.

2.10 Biochemische Methoden

2.10.1 Zellaufschluss mittels Glasperlen

Von einer Zellkultur wurden 50 ml (entsprach 35 bis 100 OD600) durch eine 5minütige Zentri-

fugation bei 3000 x g und 4 °C geerntet. Das Zellpellet wurde mit 1 ml eiskaltem Aufschluss-

puffer gewaschen und bei -80 °C eingefroren. Zu den gefrorenen Zellpellets wurden 500 µl

Aufschlusspuffer mit CompleteTM und ca. 0,3 g Glasperlen (Ø 0,45 mm) zugegeben. Der Auf-

schluss erfolgte bei 4 °C in der Zellmühle bei 30 Hz für 4 min. Die Zelltrümmer wurden

10 min bei 4 °C und 3000 x g abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorf-

Reaktionsgefäß überführt.

Aufschlusspuffer: Sorbitol 0,4 M Tris-HCl, pH7,5 50 mM


48

2.10.2 Proteinbestimmung nach Lowry et al. (1951)

Die Proben wurden je nach Bedarf mit 0,1 M NaOH verdünnt. Zu 0,2 ml Probe wurden 1 ml

Lösung D gegeben und nach gutem Durchmischen für mindestens 10 min bei RT stehen

gelassen. Danach wurden 100 µl Lösung E zugegeben und sofort kräftig geschüttelt. Nach

30 min konnte die Extinktion der Proben bei λ = 720 nm (d = 1 cm) gegen einen Leerwert

(0,1 M NaOH) gemessen werden. Die Bestimmung des Proteingehalts erfolgte durch den

Abgleich mit einer Standardeichkurve, die nach den gleichen Vorgaben unter Verwendung

von jeweils 0,02 µg, 0,04 µg, 0,06 µg, 0,08 µg und 0,1 µg BSA angefertigt wurde.

Lösung A: 2 % (w/v) Na2CO3 in 0,1 NaOH Lösung B: 1 % (w/v) CuSO4 x 5H2O Lösung C: 2 % (w/v) Na-K-Tartrat Lösung D: 49 ml Lösung A mit 0,5 ml Lösung B und 0,5 ml Lösung C mischen Lösung E: 1 N Folin-Ciocalteau-Reagenz

2.10.3 Deglycosylierung

Es wurden 80 bis 100 µg Gesamtprotein mit EndoH-Puffer und 5 mU Endoglycosidase H

versetzt. Der Reaktionsansatz wurde eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach 10minütiger In-

kubation bei 40 °C mit Probenpuffer (vgl. Kapitel 2.10.5) wurden die Proben mittels SDS-

PAGE aufgetrennt und im Western-Blot analysiert.

2 x EndoH-Puffer: Natriumcitrat (pH5,5) 150 mM β-Mercaptoethanol 100 mM

2.10.4 Dephosphorylierung

Zur Dephosphorylierung wurden 80 bis 100 µg Gesamtprotein eingesetzt. Die Dephosphory-

lierungsreaktion fand im mitgelieferten Puffer und mit 400 U λ-Protein-Phosphatase in einem

Gesamtvolumen von 20 µl bei 37 °C für 1 h statt. Die Proben wurden anschließend 10 Minu-

ten in Probenpuffer (vgl. Kapitel 2.10.5) bei 40 °C inkubiert. Danach erfolgte die Auftrennung

und Analyse der Proteinproben mittels SDS-PAGE sowie Western-Blot.

2.10.5 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

Zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen

wurde nach der Methode der diskontinuierlichen Elektrophorese nach Laemmli (1970) ver-

fahren. Die aufgetragene Proteinmenge betrug 45 µg, im Falle einer vorangegangen Degly-

cosylierung bzw. Dephosphorylierung 80 bis 100 µg.


49

Es wurden 4%ige Sammelgele und 12%ige Trenngele verwendet. In Tab. 11 ist das Pipet-

tierschema für 15 ml einer 12%igen Trenngellösung bzw. 10 ml einer 4%igen Sammelgellö-

sung angegeben.

Zuerst wurde das Trenngel gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Nach dessen Po-

lymerisation wurde das Isopropanol abgeschüttet und mit dH2O nachgespült. Anschließend

wurde das Sammelgel gegossen und der Probenkamm eingesetzt. Nach der Polymerisation

des Sammelgels wurde die Elektrophoreseapparatur zusammengesetzt, mit 1 x Elektroden-

puffer gefüllt und die Probenkämme entfernt. Vor dem Auftragen der Proteinlösung wurden

die Probentaschen mit 1 x Elektrodenpuffer gespült. Die Elektrophorese erfolgte bei 20 mA

(Sammelgel) und 30 mA (Trenngel). Die Auftrennung der Deglycosylierungs- bzw.

Dephosphorylierungsansätze erfolgte im Maxigel Gelelektrophorese-System von Biometra

bei einer Stromstärke von 30 mA pro Gel für das Sammelgel und 55 mA pro Gel für das

Trenngel. Dieses Gel wurde während der Elektrophorese gekühlt (4 °C).

10 x Elektrodenpuffer: Glycin 1,92 M SDS 1 % (w/v) Tris 250 mM

6 x Probenpuffer: Bromphenolblau 0,012 % DTT 200 mM, frisch zugeben

Glycerol 36 % (v/v) SDS 10,28 % (w/v) Tris-HCl (pH6,8) 0,35 M

Tab. 11: Zusammensetzung der Gellösungen (Menge ausreichend für 2 Minigele) für die SDS-PAGE. Für andere Gelvolumina wurde ein entsprechendes Vielfaches aller Volumina verwendet.

Lösung Trenngel (12 %)

Sammelgel (4 %)

Stammlösungen

Acrylamid-Lösung 6 ml 1,3 ml 30 % (w/v) Acrylamid, 0,8 % (w/v) Bisacryl- amid

4 x Trenngelpuffer 3,75 ml - 1,5 M Tris-HCl, pH8,8

4 Sammelgelpuffer - 2,5 ml 0,5 M Tris-HCl, pH6,8

SDS-Lösung 150 µl 100 µl 10 % (w/v) SDS

TEMED 7,5 µl 10 µl unverdünnt

APS-Lösung 75 µl 50 µl 10 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat

dH2O 5 ml 6,04 ml

Gesamtvolumen 15 ml 10 ml


50

2.10.6 Western-Blot-Analyse

Für die anschließende immunochemische Analyse wurden die Proteine aus dem SDS-Gel

auf eine PVDF-Membran (Immobilon-P, Ø=0,45 µm, Firma Millipore) im Semi-Dry-Blotver-

fahren transferiert. Vor dem Transfer wurden das Gel und die vorher für 30 s in Methanol

äquilibrierte PVDF-Membran 5 min in Transferpuffer inkubiert. Der Transfer erfolgte für 2 h

bei 1 mA/cm2. Nach dem Transfer wurde die Membran mit 1 x Ponceau-S-Lösung für ca.

5 min gefärbt und anschließend bis zum Sichtbarwerden der Proteinbanden mit dH2O ent-

färbt. Die Membran wurde danach üN in Blocklösung inkubiert (vgl. Kapitel 2.10.7) oder ge-

trocknet und bei 4 °C gelagert.

Transferpuffer: Glycin 192 mM Methanol 15 % (v/v)

Tris 25 mM SDS 0,01 % (w/v)

10 x Ponceau-S-Lösung: Ponceau-S 2 % (w/v) 5-Sulfonsalicylsäure-2-hydrat 30 % (w/v) TCA 30 % (w/v)

2.10.7 Immunochemischer Nachweis geblotteter Proteine

Die PVDF-Membran wurde üN bei 4 °C oder 1 h bei RT in Blocklösung inkubiert. Nach kur-

zem Waschen mit Waschpuffer wurde die Membran für 1 h mit dem in Blocklösung verdünn-

ten primären Antikörper geschüttelt. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer für je

5 min erfolgte eine 30minütige Inkubation mit dem ebenfalls in Blockierungslösung verdünn-

ten sekundären Antikörper. Danach wurde 3 x für 15 min gewaschen. Die Detektion erfolgte

unter Verwendung des „ECLPlus Western Blotting Detection Kits“ nach Herstellerangaben. Die

verwendeten Antikörperverdünnungen sind im Kapitel 2.5 aufgeführt.

Blocklösung: 5 % (w/v) Magermilchpulver in Waschpuffer

Waschpuffer: NaCl 137 mM Tris-HCl (pH7,6) 20 mM Tween 20 0,1 % (w/w)

2.10.8 Photometrische Bestimmung von Ammonium (modifiziert nach Palková et al., 2002)

Die Vorkulturen der Hefestämme wurden üN in flüssigem YPD-Medium bei 28 °C geschüt-

telt. Nach dem einmaligen Waschen der Zellen mit 1 x Readersalzen, wurden diese in


51

1 x Readersalzen aufgenommen und die Zellzahl auf 1 x 107 Zellen/ml eingestellt. Es wurden

von dieser Zellsuspension jeweils 10 µl auf GM-Platten (insgesamt 20 Tropfen pro Platte)

getropft und bei 28 °C inkubiert.

Alle Lösungen für die Ammoniumbestimmung wurden mit ddH2O hergestellt.

Nach 12tägiger Inkubation wurden die Zellen einer Platte in einem mit 1 ml 10 mM MES-

Puffer gefüllten Eppendorf-Reaktionsgefäß suspendiert und 5 min bei 3000 x g abzentrifu-

giert. Nachdem das Pellet in 1 ml 10 mM MES-Puffer aufgenommen war, wurde die Zelldich-

te auf 109 Zellen/ml in einem Gesamtvolumen von 1 ml eingestellt. Dieser Ansatz wurde bei

28 °C geschüttelt und es wurde nach 0, 5, 10, 15, 20 und 25 min jeweils 150 µl Probe ent-

nommen. Diese Proben wurden 3 min bei 6400 x g zentrifugiert und 100 µl vom Überstand

mit 900 µl 10 mM MES-Puffer verdünnt. Danach wurden die Proben mit 40 µl Nessler-

Reagenz versetzt. Nach 10minütiger Inkubation wurde die Extinktion bei 425 nm gemessen.

Die Bestimmung des Ammoniumgehaltes erfolgte durch den Abgleich mit einer Standard-

eichkurve die unter Verwendung von 0, 0,5, 1, 2, 3 und 4 mg Ammonium angefertigt wurde.

Ammonium-SL (1 mg NH4+/ml): Ammoniumchlorid im Exsiccator getrocknet und davon

2,9654 g mit ddH2O auf 1 l aufgefüllt.

GM-Agarplatten: Agar 2 % CaCl2 30 mM Glycerol 3 % Hefeextrakt 1 % Von CaCl2 und Glycerol wurden einzelne SL (500 mM CaCl2 bzw. 50 % Glycerol) hergestellt und diese nach dem Autoklavieren zum Medium gegeben.

MES-Puffer-SL: 100 mM MES-Puffer pH-Wert auf 6,0 eingestellt

Nesslers-Reagenz: Nesslers-Reagenz A und B zu gleichen Teilen frisch gemischt

Ergebnisse

52

3 Ergebnisse

3.1 Die Gpr1/Fun34/yaaH-Familie

3.1.1 Datenbankanalyse von Gpr1p dessen Homologen und Orthologen

In Datenbanken (InterPro-Datenbank1, NCBI-BLAST-Software2 und Fasta-Programm3) wur-

de nach Orthologen des Gpr1-Proteins gesucht. In der InterPro-Datenbank wurde eine Reihe

von Proteinen gefunden, die zur Gpr1/Fun34/yaaH-Familie gehören. Die Mitglieder dieser

Proteinfamilie besitzen sechs potentiell membranspannende Domänen und enthalten das

charakteristische Familienmotiv N-P-[AV]-P-[LF]-G-L-X-[GSA]-F. GPR1-orthologe Gene kom-

men in vielen Organismen vor, es handelt sich hierbei um Archaebakterien, Eubakterien,

einzellige und filamentöse Pilze sowie Algen. Keine Gpr1p-Orthologen konnten in höheren

Pflanzen, wirbellosen Tieren und Vertebraten gefunden werden. Die Organismen besitzen

ein (z. B. Schizosaccharomyces pombe, Pichia angusta, Chlamydomonas reinhardtii) bis

acht (z. B. Candida albicans) Gpr1p-Orthologe.

Mit Hilfe der Génolevures4 Datenbank konnten in Y. lipolytica fünf Homologe zu Gpr1p identi-

fiziert werden. S. cerevisiae enthält dagegen nur drei Gpr1p-Orthologe (Ycr010cp, Ydr384cp

und Ynr002cp). Die in Y. lipolytica zu Gpr1p-homologen Proteine wurden nach ihrem Homo-

logiegrad zu Gpr1p als Gpr2p bis Gpr6p (Gpr2p: homologes Gpr1p-Protein weist höchste

Homologität zu Gpr1p auf) bezeichnet (Tab. 12).

Die Orthologen Ycr010cp und Ynr002cp aus S. cerevisiae sind zu 47 % identsch zu Gpr1p,

Ydr384cp weist dagegen nur eine Identität von 29 % auf.

Ein Alignment der Gpr1p-Homologen bzw. –Orthologen in Y. lipolytica und S. cerevisiae, das

mit Hilfe des Programms ClustalW5 (Thompson et al., 1994) erstellt wurde, ist in Abb. 5 dar-

gestellt.

Abb. 4 zeigt den phylogenetischen Baum der im Alignment verglichenen Proteine. Aus dieser

Abbildung ist ersichtlich, dass das Gpr1-Protein aus Y. lipolytica nah verwandt zu Ycr010cp

und Ynr002cp aus S. cerevisiae ist. Alle anderen Gpr1p-Homologen bzw. das Gpr1p-

Orthologe Ydr384cp nehmen eine gesonderte Stellung ein.

1 http://www.ebi.ac.uk/interpro/DisplayIproEntry?ac=IPR000791 2 http://expasy.ch/tools/blast/ 3 http://www.ebi.ac.uk/fasta33/index.html 4 http://cbi.labri.fr/Genolevures/ 5 http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_clustalw.html

Ergebnisse

53

Tab. 12: Homologe Proteine zu Gpr1p in Y. lipolytica. Angegeben ist der in dieser Arbeit festgelegte Name der Proteine, deren Datenbanknummern, sowie der Homolo-giegrad (identische Aminosäuren) zu Gpr1p.

Gpr-Protein EMBL-Gen-Nummer1 Homologiegrad zu Gpr1p

Gpr1p YALI0C23617g -

Gpr2p YALI0E27291g 43 %

Gpr3p YALI0F13145g 43 %

Gpr4p YALI0C23298g 41 %

Gpr5p YALI0F16225g 40 %

Gpr6p YALI0E12837g 40 %

Abb. 4: Der phylogenetische Baum der Gpr1p-Homologen aus Y. lipolytica (Yl) und Gpr1p-Orthologen aus S. cerevisiae (Sc) wurde mit Hilfe der Programme ClustalX-1.81 (Thompson et al., 1997) und TreeView 1.6.62 erstellt.

1 http://www.ebi.a.uk 2 http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html

0.1 (Die Aminosäuresequenzenweisen 10 % Unterschiede auf)

Yl Gpr3p

Yl Gpr5p

Yl Gpr6p

Sc Ydr384cp

Yl Gpr1p

Sc Ycr010cp

Sc Ynr002cp

Yl Gpr2p

Yl Gpr4p

0.1 (Die Aminosäuresequenzenweisen 10 % Unterschiede auf)

Yl Gpr3p

Yl Gpr5p

Yl Gpr6p

Sc Ydr384cp

Yl Gpr1p

Sc Ycr010cp

Sc Ynr002cp

Yl Gpr2p

Yl Gpr4p

Ergebnisse

54

Yl Gpr1p -----MNTEIPDLEKQ---------------------QIDHNSG-----SDDPQPIHDDMAPVSRIRSSG 39 Sc Ycr10cp MSDKEQTSGNTDLENA---------------------PAGYYSSHDNDVNGVAEDERPSHDSLGKIYTGG 49 Sc Ynr002cp MSDREQSSGNTAFEN----------------------PKALDSSEGEFISENNDQSRHSQESICKIYTAG 48 Yl Gpr2p ------MSQPIDLERGE------SH--------------SSLNDME---------------KVAQVHTSG 29 Yl Gpr3p ------MSDDLKPHT------------------------SHPQDIETPSSHQDEPV-----VLGRVRTSG 35 Yl Gpr4p ------MTHH-----------------------------DLETGVDSLSSAGMD-------KLMRVVTSG 28 Yl Gpr5p ------MTTLNNSSH------------------------AMASDLDLERGGSTDRI-----SHVENGKDG 35 Yl Gpr6p ------MSHTVDLEHGYSLNHQVSHRSKTQAIDEEAVASSNASNIQGLTGDECSDI-----KLAKVETSG 59 Sc Ydr384cp --MTSSASSPQDLEKG---------------------VNTLENIETLPQQGSIAGVSQGFPNIQEIYSDR 47 Consensus 1 Yl Gpr1p ---PNHEYIHIADQKFHRDDFYRAFG-GTLNPG-GAPQPSRKFGNPAPLGLSAFALTTLVFSLCTVQARG 104 Sc Ycr10cp ---DNNEYIYIGRQKFLKSDLYQAFG-GTLNPG-LAPAPVHKFANPAPLGLSAFALTTFVLSMFNARAQG 114 Sc Ynr002cp ---KNNEYIYIGRQKFLRDDLFEAFG-GTLNPG-LAPAPVHKFANPAPLGLSGFALTTFVLSMFNARAQG 113 Yl Gpr2p ---DNNEYIHIAGNRYHKEDFMRAFG-GTLNPG-SAPMPSRKFGNAAPIGLFSFSITIFILGMCLVNARG 94 Yl Gpr3p ---ERDEYIHIGGVKYHRDDFARAFG-GTLNPG-SAPVPTRQFGNAAPSGLFAFSMTMFILGMCLVNARN 100 Yl Gpr4p ---DNDEYIHLGGHKYHRNELAKAFG-GQFNPG-SAPIPSRKFANTAPIGVFAFSIAIILLGLYLTETRG 93 Yl Gpr5p RVLENGEYLIIAGTRYHRNEFMQAFG-GTLNPG-SAPAPSRKFGNAAPIGLFAFSVTMIILGFCTCGVRG 103 Yl Gpr6p ---TNGEYIHIAGVKYHKDDFMSAFG-GTLNPG-SAPIPSRRFANAAPIGLFSFSITCFILGMCLVNARG 124 Sc Ydr384cp ------DFITLGSSTYRRRDLLNALDRGDGEEGNCAKYTPHQFANPVPLGLASFSLSCLVLSLINANVRG 111 Consensus A G G A F N P G F 9 Yl Gpr1p VPNPSIAVGLALFYGGVCQFAAGMWEFVQENTFGAAALTSYGGFWMSWAAIEMNAFGIKDSYNDP-IEVQ 173 Sc Ycr10cp ITVPNVVVGCAMFYGGLVQLIAGIWEIALENTFGGTALCSYGGFWLSFAAIYIPWFGILEAYEDNESDLN 184 Sc Ynr002cp ITIPNVVVGCAMFYGGLVQLIAGIWEIALENTFGGTALCSFGGFWLSFGAIYIPWFGILDAYKDKESDLG 183 Yl Gpr2p VHAPNVMVGCAIFGGGLVEFTAGIWEIVAENTFAATVFMCFACFWWSWAVLNLP-IGIEKYYATE-EEFM 162 Yl Gpr3p VHAPNVMVGCAFFGGGLIEVIAGIWEIVAENTFAATVFFCFGAFWFSWSMLNFP-IGIEKYYSTP-DEFA 168 Yl Gpr4p IMTPNLVVGNALFGAGLVLFVAGLWEIVAENTFAAIVFMCFSCFWMSYAAINIPWFGIIEAYTDP-GEFA 162 Yl Gpr5p IGAPNVMVGCAIFGGGLCELIAGIWEIVAENTFAACVFLCFSCFWFSWAMLNLP-IGIEKYYATE-DEFA 171 Yl Gpr6p VHAPNVMVGCAIFGGGLVEFVAGIWEIVAENTFAATVFLCFSCFWWSWSLLHLP-IGIEKYYETA-DEFS 192 Sc Ydr384cp VTDGKWALSLFMFFGGAIELFAGLLCFVIGDTYAMTVFSSFGGFWICYGYGLTDTDNLVSGYTDP-TMLN 180 Consensus F G AG T FW Y 17 Yl Gpr1p NAVGIYLFGWFIFTLMLTLCTLKSTVAFFGLFFMLMMTFLVLACANVTQHHGTAIGGGWLGIITAFFGFY 243 Sc Ycr10cp NALGFYLLGWAIFTFGLTVCTMKSTVMFFLLFFLLALTFLLLSIGHFANRLGVTRAGGVLGVVVAFIAWY 254 Sc Ynr002cp NALGFYLLGWALFTFGLSVCTMKSTIMFFALFFLLAVTFLLLSIANFTGEVGVTRAGGVLGVIVAFIAWY 253 Yl Gpr2p QAVGIFLMGWFIFAILMTLCTLKSTVAFFILFVSLDLAVIFLAAGYFNNNPKLLQAGGGFCISTGLLGCW 232 Yl Gpr3p QSVGIFLMGWFIFAFLMTLCTLKATVAFFLLFISLDLALIFLAAGYFQSNSKLTNAGGGFCISTGLLGCW 238 Yl Gpr4p NAMGVYLMVWFAFAVVLTLCTVRATIPFFLLFFFLDLALMFLAIGYFTDNYAFINAGGGFCIACGVMGFW 232 Yl Gpr5p QAVGVFLMGWFVFCVLMTLCTLKATVAFFVMFVSLDLAVIFLAAGNFTGNPRLLVAGGSFCISTGLLGCW 241 Yl Gpr6p QAVGLFLMGWFIFAILMTLCTVKATVAFFLLFCSLDLAIIFLASGHFLNNPKLVQAGGGFCISTGLLGCY 262 Sc Ydr384cp NVIGFFLAGWTVFTFLMLMCTLKSTWGLFLLLTFLDLTFLLLCIGTFIDNNNLKMAGGYFGILSSCCGWY 250 Consensus G L W F CT T F L L GG 29 Yl Gpr1p NAYAGLANPGNSY--IVPVPLDMPFVKKD--- 270 Sc Ycr10cp NAYAGVATKQNSY--VLARPFPLPSTERVIF- 283 Sc Ynr002cp NAYAGIATRQNSY--IMVHPFALPSNDKVFF- 282 Yl Gpr2p NGFSGVATPQSTYKWLIPKAIMMPGAHA---- 260 Yl Gpr3p NGYAGVASPQSTYKWLIPKAVMMPGAHQ---- 266 Yl Gpr4p NAWAGMATADNTFTWLLPGTFMMPWAKKTD-- 262 Yl Gpr5p NAMAGVATPQSTYKWFIPVPIMMPGAHKPKMT 273 Yl Gpr6p NGFGGVATPQSTFTWIIPRAIMMPGAHKKDY- 293 Sc Ydr384cp SLYCSVVSPSNSY--LAFRAHTMPNAP----- 275 Consensus P 30

Abb. 5: Multiples Alignment der Gpr1p-Homologen und –Orthologen in Y. lipolytica (Yl) und S. cerevisiae (Sc). Je nach Konservierungsgrad sind die Aminosäuren rot (iden-tisch) bzw. blau (hoch konserviert) hervorgehoben. Das Alignment wurde mit Hilfe des Programms ClustalW1 (Thompson et al., 1994) erstellt.

1 http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_clustalw.html

Ergebnisse

55

Mit Hilfe verschiedener, im Internet zur Verfügung stehender Programme wurden die voraus-

sichtlichen Topologien von Ycr01cp, Ydr384cp und Ynr002cp ermittelt (Tab. 13).

Tab. 13: Verschiedene Topologiemodelle der Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae. Es sind jeweils die Anzahl der vorhergesagten Transmembranhelices angegeben.

Programm Ycr010cp Ydr384cp Ynr002cp

TMHMM1 5 Helices 6 Helices 5 Helices

HMMTOP2 6 Helices 6 Helices 6 Helices

TMpred 3 (N-Term innen)* 5 Helices 6 Helices 6 Helices

TMpred (N-Term außen)* 6 Helices 6 Helices 6 Helices

TopPred24 5 Helices 6 Helices 5 Helices

DAS (cutoff 1,7)5 6 Helices 7 Helices 6 Helices

DAS (cutoff 2,2) 6 Helices 4 Helices 6 Helices

PSORT II6 6 Helices 4 Helices 6 Helices

* Unterstrichen wurde die bei diesem Programm favorisierte Orientierung der Proteine.

Verschiedene Programme sagen unterschiedlich viele Membrandomänen voraus, in den

meisten Fällen werden allerdings sechs membranspannende Domänen favorisiert. Eine

Sonderstellung nimmt Ydr284cp ein. Für dieses Protein werden vier bis sieben Membrando-

mänen vorhergesagt. Die Aminosäurebereiche, welche die Membrandomänen bilden, sind in

den Anlagen aufgelistet.

Eine Analyse von Gpr1p und dessen Orthologen in S. cerevisiae mit dem Programm SignalP

V1.1 (CBS-Datenbank)7 ergab keine Signalpeptidsequenzen in diesen Proteinen.

Die Aminosäuresequenzen der Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae wurde mit Hilfe des

ScanProsite8-Programms bzw. dem ELM-Server9 (Eucaryotic Linear Motif resource for func-

tional sites) auf potentielle Modifizierungsorte untersucht. Die Ergebnisse des ScanProsite-

Programms sind in Abb. 6, Abb. 7 und Abb. 8 dargestellt. In den Anlagen befinden sich die

Darstellungen der Modifizierungsorte, die durch den ELM-Server ermittelt wurden. Es wur-

den mögliche Orte für Phosphorylierungen, Glycosylierungen, Myristylierungen, Sulfonierun-

gen und Interaktionen identifiziert.

1 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ 2 http://www.enzim.hu/hmmtop/ 3 http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html (unterstrichen: bevorzugte Orientierung) 4 http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html 5 http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS/ 6 http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form2.html 7 http://www.cbs.dtu.dk/SignalP/ 8 http://us.expasy.org/cgi-bin/prosite 9 http://elm.eu.org

Ergebnisse

56

Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv von Ycr010cp MSDKEQTSGN TDLENAPAGY YSSHDNDVNG VAEDERPSHD SLGKIYTGGD NNEYIYIGRQ KFLKSDLYQA FGGTLNPGLA PAPVHKFANP APLGLSAFAL TTFVLSMFNA RAQGITVPNV VVGCAMFYGG LVQLIAGIWE IALENTFGGT ALCSYGGFWL SFAAIYIPWF GILEAYEDNE SDLNNALGFY LLGWAIFTFG LTVCTMKSTV MFFLLFFLLA LTFLLLSIGH FANRLGVTRA GGVLGVVVAF IAWYNAYAGV ATKQNSYVLA RPFPLPSTER VIF GPR1/FUN34/yaaH-Familienmotiv: NPAPLGLSAF

Proteinkinase C-Phosphorylierungsorte:SDK (2-4) TER (278-280) TMK (205-207)

Caseinkinase II-Phosphorylierungsorte: SDKE (2-5) SSHD (22-25) TDLE (11-14) TGGD (47-50)

N-Glycosylierungsort: NESD (179-182)

N-Myristylierungsorte: GGDNNE (48-53) GVTRAG (236-241) GTALCS (149-154) GGVLGV (241-246) GILEAY (171-176) GVVVAF (245-250) GLTVCT (200-205)

Sulfatierungsort: WFGILEAYEDNESDL (169-183)

Abb. 6: Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv der Gpr1/Fun34/yaaH-Protein-familie von Ycr010cp. Grau unterlegt sind potentiell membranspannende Domänen, die mit dem Programm HMMTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/) ermittelt wurden.

Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv von Ydr384cp MTSSASSPQD LEKGVNTLEN IETLPQQGSI AGVSQGFPNI QEIYSDRDFI TLGSSTYRRR DLLNALDRGD GEEGNCAKYT PHQFANPVPL GLASFSLSCL VLSLINANVR GVTDGKWALS LFMFFGGAIE LFAGLLCFVI GDTYAMTVFS SFGGFWICYG YGLTDTDNLV SGYTDPTMLN NVIGFFLAGW TVFTFLMLMC TLKSTWGLFL LLTFLDLTFL LLCIGTFIDN NNLKMAGGYF GILSSCCGWY SLYCSVVSPS NSYLAFRAHT MPNAP GPR1/FUN34/yaaH-Familienmotiv: NPVPLGLASF (86-95)

Proteinkinase C-Phosphorylierungsorte:SDR (45-47) TLK (201-203) TYR (56-58)

Caseinkinase II-Phosphorylierungsort: SPQD (7-10) TDTD (164-167) SDRD (45-48) TFLD (213-216)

N-Myristylierungsort: GSIAGV (28-33) GLTDTD (162-167) GVSQGF (32-37) GGYFGI (237-242) GVTDGK (111-116) GILSSC (241-246)

Sulfatierungsort: FPNIQEIYSDRDFIT (37-51)

Zellanheftungssequenz: RGD (68-70) Abb. 7: Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv der Gpr1/Fun34/yaaH-Protein-

familie von Ydr384cp. Grau unterlegt sind potentiell membranspannende Domänen, die mit dem Programm HMMTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/) ermittelt wurden.

Ergebnisse

57

Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv von Ynr002cp MSDREQSSGN TAFENPKALD SSEGEFISEN NDQSRHSQES ICKIYTAGKN NEYIYIGRQK FLRDDLFEAF GGTLNPGLAP APVHKFANPA PLGLSGFALT TFVLSMFNAR AQGITIPNVV VGCAMFYGGL VQLIAGIWEI ALENTFGGTA LCSFGGFWLS FGAIYIPWFG ILDAYKDKES DLGNALGFYL LGWALFTFGL SVCTMKSTIM FFALFFLLAV TFLLLSIANF TGEVGVTRAG GVLGVIVAFI AWYNAYAGIA TRQNSYIMVH PFALPSNDKV FF GPR1/FUN34/yaaH-Familienmotiv: NPAPLGLSGF (88-97)

Proteinkinase C-Phosphorylierungsorte:SDR (2-4) TMK (204-206)

Caseinkinase II-Phosphorylierungsorte: SDRE (2-5) SEGE (22-25) TAFE (11-14)

Tyrosinkinase-Phosphorylierungsort: KNNEYIY (49-55)

N-Myristylierungsorte: GTALCS (148-153) GVTRAG (235-240) GILDAY (170-175) GGVLGV (240-245) GNALGF (183-188) GVIVAF (244-249) GLSVCT (199-204)

N-Glycosylierungsort: NFTG (229-232)

Abb. 8: Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv der Gpr1/Fun34/yaaH-Protein-familie von Ynr002cp. Grau unterlegt sind potentiell membranspannende Domänen, die mit dem Programm HMMTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/) ermittelt wurden.

3.2 Das Gpr1-Protein in Yarrowia lipolytica

3.2.1 Identifizierung möglicher Interaktionspartner von Gpr1p

Es gibt verschiedene Methoden, mögliche Interaktionspartner von Proteinen zu identifizieren.

Die Suche nach mit Gpr1p interagierenden Proteinen wird insbesondere dadurch erschwert,

dass Gpr1p einen hohen Anteil hydrophober und potentiell membranspannender Bereiche

enthält. Aus diesem Grund hat Gentsch (2003) in seiner Arbeit nur den hydrophilen N- bzw.

C-Terminus von Gpr1p in Bindungsstudien (Coimmunopräzipitation) untersucht. Allerdings

konnten mit dieser Methode keine Gpr1p-Wechselwirkungspartner identifiziert werden. Eine

weitere Möglichkeit wäre in einem Two-Hybrid-System (Fields and Song, 1989) nach poten-

tiellen Interaktionspartnern von Gpr1p zu suchen. Der Nachweis von Proteininteraktionen

setzt jedoch voraus, dass die zu untersuchenden Proteine in den Kern transportiert werden.

Dies ist jedoch ohne Kernlokalisierungssequenz nicht unproblematisch. Außerdem könnten

nur die hydrophilen Bereiche des Gpr1p eingesetzt werden, da hydrophobe Bereiche zu

falsch positiven Ergebnissen führen könnten. Dies hat aber den Nachteil, dass Interaktionen,

die über den hydrophoben Bereich des Proteins vermittelt werden, nicht nachgewiesen wer-

den können. Zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen wäre das

„Split-Ubiquitin“-System (Stagljar et al., 1998) geeignet. Allerdings scheinen alle von Gentsch

(2003) durchgeführten Markierungen von Gpr1p mit verschiedenen Tags ungeeignet, da

Ergebnisse

58

diese die Funktion des Proteins beeinträchtigen. Weiterhin ist dieses System für Y. lipolytica

bisher nicht etabliert.

In der vorliegenden Arbeit sollten daher Revertanten-Stämme von Y. lipolytica gewonnen

werden, die trotz der dominanten Mutation im GPR1-Gen (GPR1-1 oder GPR1-2) wieder auf

Medium mit Acetat als C-Quelle wachsen können. Gene, die zur Aufhebung des Mutanten-

phänotyps führen, könnten für potentielle Interaktionspartner von Gpr1p kodieren. Zur Identi-

fikation dieser Gene sollte aus den Revertanten die genomische DNA isoliert und mit einem

bzw. mehreren Restriktionsenzymen geschnitten werden. Die erhaltenen Fragmente sollten

in ein Plasmid kloniert werden. Anschließend sollten diese Klone in einen Y. lipolytica-

Stamm, der die Mutantenallele GPR1-1 bzw. GPR1-2 im Genom enthält transformiert wer-

den. Von Transformanden, die in der Lage waren auf Minimalmedium mit Acetat zu wach-

sen, sollten die Plasmide reisoliert werden. Die Sequenzierung der Inserts dieser Plasmide

würde zur Identifizierung des Proteins führen, das möglicherweise mit Gpr1p interagiert.

Diese Untersuchungen sollten mit dem Stamm PO1dΔgpr1, der die Plasmide pYLD103,

pYLD203 oder pYLG2 enthielt, durchgeführt werden. In einem Vorversuch wurden die zur

Auswahl stehenden Plasmide getestet. Der Stamm PO1dΔgpr1 wurde mit den Plasmiden

pYLD103, pYLD203 bzw. pYLG2 transformiert. Die Transformanden wurden üN in Minimal-

medium mit Glucose geschüttelt, von den Kulturen wurden jeweils 1 x 108 Zellen auf Mini-

malmediumplatten mit Acetat ausplattiert. Nach mehrtägiger Inkubation bei 28 °C wurden die

gewachsenen Kolonien gezählt. Die Transformanden des Stammes PO1dΔgpr1/pYLG2 er-

gaben zwei bis neun Revertanten pro 1 x 108 Zellen, im Falle von PO1dΔgpr1/pYLD103 bzw.

pYLD203 waren ca. 240 Kolonien pro 1 x 108 ausplattierter Zellen gewachsen. Die GPR1-

Allele der Plasmide pYLD103 und pYLD203 enthalten im Bereich des GPR1-Promotors die

LTR-Sequenz (long terminal repeat) des Retrotransposons Ylt1 aus Y. lipolytica. Die Inserti-

on der LTR-Sequenz in den Promotor verursacht im Vergleich zum authentischen GPR1-

Promotor eine etwa 100fach geringere Expression des GPR1-Gens (Augstein, 2001). Dies

könnte zur Instabilität der Plasmide und damit zu der hohen Anzahl auf Acetat gewachsener

Kolonien (240/1 x 108 Zellen) führen. Für das Revertantenscreening wurden somit Transfor-

manden, die das Plasmid pYLG2 enthielten, gewählt. Die Vorgehensweise zur Isolierung und

Überprüfung der Revertanten ist in Abb. 9 dargestellt.

Die auf Minimalmediumplatten mit Acetat gewachsenen Kolonien wurden nochmals im

Wachstum auf Acetat getestet und anschließend die Plasmide reisoliert und in E. coli trans-

formiert. Nach einer Plasmidpräparation wurden diese Plasmide in einem Restriktionsverdau

(EcoRV) überprüft. Zu Beginn der Arbeiten stellte sich heraus, dass eine große Anzahl der

Plasmide Veränderungen in ihrem Restriktionsmuster aufwiesen. Das GPR1-2-tragende

Fragment konnte nicht mehr nachgewiesen werden, dieser Bereich war verändert oder dele-

Ergebnisse

59

tiert. Deshalb wurde zuerst eine PCR mit den Primern TSB1-d32/GPR-LacZ mit ganzen

E. coli-Zellen durchgeführt, deren Produkt eine Aussage darüber zuließ, ob das GPR1-2-

tragende Fragment noch enthalten war. Von E. coli-Kolonien, deren Plasmid ein PCR-

Produkt ergab, wurde das Plasmid präpariert, mittels Restriktionsverdau mit EcoRV überprüft

und nochmals in PO1dΔgpr1 transformiert. Das Wachstum der Transformanden wurde auf

Minimalmediumplatten mit Acetat getestet. Parallel dazu wurden die Revertanten, damit sie

ihr Plasmid verlieren, in YPD kultiviert und danach erneut mit pYLG2 transformiert und ihr

Wachstum ebenfalls auf Minimalmediumplatten mit Acetat überprüft. Konnte durch beide Tests bestätigt werden, dass es sich um eine Mutation im Genom han-

delt, so sollte von den entsprechenden Stämmen eine Genbank hergestellt werden. An-

schließend sollten die erhaltenen Genbanken in Y. lipolytica-Stämme, die GPR1-1 bzw.

GPR1-2 integrativ in ihrem Genom besitzen, transformiert werden.

Insgesamt wurden 155 Revertanten isoliert. Davon wiesen die Plasmide von 115 dieser Re-

vertanten große Veränderungen auf, d. h. sie ergaben kein PCR-Produkt bzw. die Banden

waren im Restriktionsverdau verändert (die Bande des GPR1-2 tragenden Fragmentes konn-

te nicht mehr nachgewiesen werden). Nach erneuter Transformation mit dem Plasmid

pYLG2 konnten alle Transformanden nicht mehr auf Minimalmedium mit Acetat wachsen.

Somit konnten mit dieser Vorgehensweise keine Revertanten isoliert werden, die den Phäno-

typ von GPR1-2 aufheben konnten. Eine mögliche Ursache hierfür ist die Instabilität des

verwendeten Plasmids pYLG2, deshalb sollte das GPR1-2-Allel integrativ in PO1dΔgpr1

transformiert werden.

Ergebnisse

60

Abb. 9: Vorgehensweise zur Isolierung und Überprüfung von Revertanten der Transfor-mande PO1dΔgpr1/pYLG2. Das Wildtypallel GPR1 ist als schwarzer Pfeil darge-stellt. Grau wurde das mutierte GPR1 (Pfeil) oder Mutationen im Genom (Punkt) gezeichnet. Die Hefezellen wurden oval, die Plasmide als Kreise und die genomi-sche DNA als Linie abgebildet.

Konstruktion des Stammes PO1d-GPR1-2

Die Isolierung von Revertanten mit Hilfe von Transfomanden, die das GPR1-1- bzw.

GPR1-2-Allel auf einem Plasmid trugen, führte nicht zur Identifikation möglicher Interaktions-

partner von Gpr1p. Die Instabilität des Plasmides sollte durch die integrative Transformation

des Mutantenalleles ausgeschlossen werden.

Transformation des Stammes PO1dΔgpr1mit dem Plasmid pYLG2

Kultivierung der Transformandenin Minimalmedium mit Glucose

Ausplattieren von 1 x 108 Zellen auf Minimal-mediumplatten mit 30 mM Acetat (pH 4)Isolierung von Reveratanten (Acu+)

Plasmidreisolation Curing des Plasmids

Transformation in E. coliPCR mir ganzen E. coli-Zellen, Plasmidreisolation und Restriktionsverdau

Transformation der Plasmide in PO1dΔgpr1,Test des Wachstums der Transformanden aufMinimalmedium mit Acetat

Transformation der Revertantenstämmeohne Plasmid mit pYLG2, Wachstum auf Minimalmediummit Acetat überprüfen

Acu-,verwerfen

Acu-,verwerfen

Acu+,verwerfen

Acu+,Mutation in einem Gen der genomischen DNA,Anlegen einer genomischenDNA-Bank

Transformation des Stammes PO1dΔgpr1mit dem Plasmid pYLG2

Kultivierung der Transformandenin Minimalmedium mit Glucose

Ausplattieren von 1 x 108 Zellen auf Minimal-mediumplatten mit 30 mM Acetat (pH 4)Isolierung von Reveratanten (Acu+)

Plasmidreisolation Curing des Plasmids

Transformation in E. coliPCR mir ganzen E. coli-Zellen, Plasmidreisolation und Restriktionsverdau

Transformation der Plasmide in PO1dΔgpr1,Test des Wachstums der Transformanden aufMinimalmedium mit Acetat

Transformation der Revertantenstämmeohne Plasmid mit pYLG2, Wachstum auf Minimalmediummit Acetat überprüfen

Acu-,verwerfen

Acu-,verwerfen

Acu+,verwerfen

Acu+,Mutation in einem Gen der genomischen DNA,Anlegen einer genomischenDNA-Bank

Ergebnisse

61

Zur Konstruktion des Stammes PO1d-GPR1-2 wurde der von Augstein (2001) hergestellte

Stamm PO1dΔgpr1 als Ausgangsstamm verwendet. Für die integrative Transformation wur-

de das Plasmid pYLG2 mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII geschnitten und das

3784 bp große GPR1-2-Allel isoliert (Abb. 10). Dieses Fragment wurde integrativ in den

Y. lipolytica Stamm PO1dΔgpr1, der ein intaktes URA3-Gen enthält, transformiert. Die Selek-

tion der Transformanden erfolgte mit Hilfe von 5-FOA (Endkonzentration: 1,25 mg/ ml), das

den Minimalmediumplatten mit Glucose zugegeben wurde. Hefezellen, die ein intaktes U-

RA3Gen besitzen, wandeln 5-FOA in ein toxisches Produkt um, und sterben somit ab. Trans-

formanden, bei denen das GPR1-2-Allel an der homologen Stelle integriert war, konnten auf

Minimalmedium mit Glucose mit 5-FOA wachsen, da sie Uracil-auxotroph waren. Außerdem

waren diese Stämme aufgrund des GPR1-Mutantenallels nicht mehr in der Lage auf Medium

mit Acetat als C-Quelle zu wachsen.

Abb. 10: Konstruktion des Stammes PO1d-GPR1-2: Das GPR1-2-Fragment wurde aus dem

Plasmid pYLG2 isoliert (BamHI/HindIII) und in den Stamm PO1dΔgpr1 integrativ transformiert. Dabei kam es zum Austausch des unten dargestellten, chromosoma-len Fragmentes mit dem GPR1-2-Fragment aus dem Plasmid pYLG2.

Der Nachweis der korrekten Integration des GPR1-2-Allels erfolgte mittels Southern-

Hybridisierung (Abb. 11). Es wurde die genomische DNA einer Transformande (PO1d-

GPR1-2), von PO1d und PO1dΔgpr1 isoliert und mit den Restriktionsenzymen BglII und

HindIII geschnitten. Der Southern-Blot wurde mit der GPR1- bzw. URA3-Sonde beprobt. Bei

der Beprobung mit der GPR1-Sonde zeigten die Stämme PO1d-GPR1-2 und PO1d ein Sig-

nal bei 2,9 kb, der Ausgangsstamm PO1dΔgpr1 wies dagegen eine größere Bande von

4,3 kb auf. Erfolgte eine Beprobung mit der URA3-Sonde, wurde in allen Stämmen eine

Bande von ca. 4 kb und im Stamm PO1dΔgpr1 eine zusätzliche Bande von 4,3 kb nachge-

wiesen. Der Stamm PO1d-GPR1-2 wies im Southern-Blot das gleiche Bandenmuster wie der

GPR1terpGPR1Δ

GPR1-2 (BamHI/HindIII-Fragmentaus pYLG2), 3651 bp

pGPR1 GPR1-2

BglII, 717 ClaI, 1240NcoI, 2608

GPR1ter

BamHI XhoI, 2960 HindIII, 3651

BglII, 717 ClaI, 1240 SalI, 2618

URA3 Δgpr1

BamHI HindIII, 5017NcoI, 4194

PO1dΔgpr1

GPR1terpGPR1Δ

GPR1-2 (BamHI/HindIII-Fragmentaus pYLG2), 3651 bp

pGPR1 GPR1-2

BglII, 717 ClaI, 1240NcoI, 2608

GPR1ter

BamHI XhoI, 2960 HindIII, 3651

BglII, 717 ClaI, 1240 SalI, 2618

URA3 Δgpr1

BamHI HindIII, 5017NcoI, 4194

PO1dΔgpr1

Ergebnisse

62

Stamm PO1dΔgpr1 auf. Somit konnte nachgewiesen werden, dass das GPR1-2-Allel an der

homologen Stelle integriert war.

Abb. 11: Southern-Blot zum Nachweis der Integration des GPR1-2-Allels in den Bereich GPR1::URA3 des Stammes PO1dΔgpr1. Die genomische DNA wurde mit BglII und HindIII geschnitten. Als Sonden wurden das GPR1-Fragment aus pUGCGlacZF und das URA3-Fragment aus pINA443 genutzt. In den einzelnen Spuren ist die genomi-sche DNA folgender Stämme aufgetragen: a) PO1d-GPR1-2, b) PO1d, c) PO1dΔgpr1. Als DNA-Größenstandard diente EcoRI/HindIII geschnittene λ-DNA.

Der neu konstruierte Stamm wurde zur Isolierung von Revertanten, die auf Minimalmedium

mit Acetat wuchsen, verwendet. Diese Stämme wurden mit dem Plasmid pYLG2 transfor-

miert und nochmals das Wachstum der Transformanden auf Minimalmedium mit Acetat als

C-Quelle getestet. Führte in den Revertantenstämmen eine Mutation in einem anderen Gen

als GPR1-2 zur Aufhebung des Mutantenphänotyps, so hätten diese Transformanden wach-

sen müssen. Anschließend sollte von den entsprechenden Revertantenstämmen die geno-

mische DNA isoliert werden. Nach Restriktionsverdau sollte durch die Klonierung der ent-

standenen Fragmente in ein Plasmid die Anlage von genomischen Banken erfolgen. Diese

Konstrukte sollten in PO1d-GPR1-2 transformiert werden. Von Transformanden, die in der

Lage waren auf Minimalmedium mit Acetat zu wachsen, sollten die Plasmide reisoliert wer-

den. Die Sequenzierung der Plasmidinserts würde zu potentiellen Interaktionspartnern von

Gpr1p führen.

Insgesamt konnten 167 Revertanten isoliert werden, diese wurden nach der Transformation

mit dem Plasmid pYLG2 in ihrem Wachstum auf Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle

überprüft. Keine dieser Transformanden war in der Lage auf MMA-Platten zu wachsen. Wäre

21226 bp

5148 bp4973 bp4268 bp

3530 bp

2027 bp1904 bp

1584 bp1375 bp

λ-DNA a ab bc c

GPR1-Sonde URA3-Sonde

21226 bp

5148 bp4973 bp4268 bp

3530 bp

2027 bp1904 bp

1584 bp1375 bp

λ-DNA a ab bc c

GPR1-Sonde URA3-Sonde

Ergebnisse

63

der Mutantenphänotyp durch eine Mutation in einem anderen Gen als GPR1-2 aufgehoben

worden, so hätten die Transformanden auf Minimalmedium mit Acetat wachsen müssen.

Dies war nicht der Fall, möglicherweise wurde der Mutantenphänotyp durch eine Verände-

rung im GPR1-2-Gen selbst hervorgerufen.

Es konnten keine Supressormutationen in anderen Genen nachgewiesen werden, somit war

es nicht möglich potentielle Interaktionspartner von Gpr1p zu identifizieren.

3.2.2 Unterschiede im Wachstum zwischen PO1d und PO1dΔgpr1 auf ver-schiedenen C-Quellen

Augstein (2001) stellte fest, dass die Deletion von GPR1 zu keiner erhöhten Essigsäuresen-

sitivität führt. In der Arbeit von Gentsch (2003) wurde untersucht, ob es nicht doch leichte

Wachstumsunterschiede zwischen den Stämmen PO1d und PO1dΔgpr1 gibt. Das Wachs-

tum der beiden Stämme wurde im Plattentest und Submerskultur in Minimalmedium mit Glu-

cose, Acetat bzw. Ethanol als C-Quelle getestet. Es konnte festgestellt werden, dass

PO1dΔgpr1 nach dem Umsetzen der Zellen in Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle eine

längere lag-Phase zeigte als der Wildtypstamm PO1d.

In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit die beiden Y. lipolytica-Stämme PO1d

und PO1dΔgpr1 sich im Wachstum auf Minimalmedium mit Acetat, Glycerin und Acetat/ Gly-

cerin als C-Quellen unterscheiden. Die Ergebnisse des Wachstumstests sind in Abb. 12 dar-

gestellt.

Abb. 12: Vergleich des Wachstums der Y. lipolytica-Stämme PO1d und PO1dΔgpr1 auf Mi-nimalmedium mit verschiedenen C-Quellen. Die Kulturen wurden üN in YPD-Flüssigmedium kultiviert, einmal mit 1 x MMT gewaschen und 1 x 105 Zellen auf die Platten getropft.

Der Wildtypstamm PO1d und der Deletionsstamm PO1dΔgpr1 zeigten auf Minimalmedium-

platten mit Glucose, Acetat oder Glycerin als C-Quelle keinen Unterschied im Wachstum. Auf

Minimalmedium mit Acetat/Glycerin als C-Quellen wuchs PO1d nicht, im Gegensatz dazu

konnte der Stamm PO1dΔgpr1 auf diesem Medium wachsen.

PO1dΔgpr1

PO1d

Glucose Acetat Glycerin Acetat/Glycerin

PO1dΔgpr1

PO1d

Glucose Acetat Glycerin Acetat/Glycerin

Ergebnisse

64

Der Stamm PO1d ist Leucin-auxotroph, was zu einem schlechteren Wachstum in Minimal-

medium führt. Das Plasmid pINA237 enthält das LEU2-Markergen, das die Leucin-

Auxotrophie aufhebt und ein besseres Wachstum zur Folge hat. Dies sollte im folgenden

Versuch überprüft werden. Es wurde das Wachstum der Stämme PO1d/pINA237,

PO1dΔgpr1/pINA237 und PO1dΔgpr1/pYLG3 auf Medium mit verschiedenen C-Quellen ge-

testet (Abb. 13).

Abb. 13: Vergleich des Wachstums von PO1d- und PO1dΔgpr1-Transformanden auf Mini-malmedien mit verschiedenen C-Quellen. Die Zellzahl der üN in Minimalmedium mit Glucose kultivierten Transformanden wurde bestimmt und die angegebenen Zell-mengen auf die Platten getropft.

Alle getesteten Stämme wuchsen auf Minimalmedium mit Glucose bzw. Glycerin gleich gut.

Enthielt das Minimalmedium Acetat als C-Quelle, so wuchsen die Stämme etwas schlechter,

aber es waren keine Wachstumsunterschiede zwischen ihnen zu erkennen. Wurde den Mi-

nimalmediumplatten Acetat/Glycerin als C-Quellen zugesetzt, so wuchsen die Stämme

PO1dΔgpr1/pINA237 und PO1dΔgpr1/pYLG3 besser als der Stamm PO1d/pINA237.

Die Deletion von GPR1 im Stamm PO1dΔgpr1 führte dazu, dass dieser Stamm im Gegen-

satz zum Wildtyp in der Lage war, auf Minimalmedium mit Acetat/Glycerin als C-Quellen zu

wachsen. Dieser Effekt konnte durch die Transformation des Plasmides pYLG3, das das

GPR1-Allel trägt, nicht kompensiert werden. Der Phänotyp von PO1dΔgpr1 ist somit nicht

direkt auf die Deletion von GPR1 zurückzuführen. Möglicherweise erzeugte die GPR1-

Deletion sekundäre Effekte, die irreversibel sein müssen.

Glucose, 3d Glycerin, 3d

Acetat, 6d Acetat/Glycerin, 4d

PO1d/pINA237

PO1dΔgpr1/pINA237

PO1dΔgpr1/pYLG3

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

PO1d/pINA237

PO1dΔgpr1/pINA237

PO1dΔgpr1/pYLG3

1) 1 x 101 Zellen2) 1 x 102 Zellen3) 1 x 103 Zellen4) 1 x 104 Zellen5) 1 x 105 Zellen

Glucose, 3d Glycerin, 3d

Acetat, 6d Acetat/Glycerin, 4d

PO1d/pINA237

PO1dΔgpr1/pINA237

PO1dΔgpr1/pYLG3

1 2 3 4 51 2 3 4 5

1 2 3 4 51 2 3 4 5 1 2 3 4 51 2 3 4 5

1 2 3 4 51 2 3 4 5

PO1d/pINA237

PO1dΔgpr1/pINA237

PO1dΔgpr1/pYLG3

1) 1 x 101 Zellen2) 1 x 102 Zellen3) 1 x 103 Zellen4) 1 x 104 Zellen5) 1 x 105 Zellen

Ergebnisse

65

3.2.3 Wachstum verschiedener Yarrowia lipolytica-Stämme

Es konnte ein Unterschied im Wachstum von PO1d und PO1dΔgpr1 auf Minimalmedium mit

Acetat/Glycerin als C-Quelle festgestellt werden. Daraufhin sollte untersucht werden, ob die-

ser Phänotyp im Wachstum stammspezifisch oder ein allgemeiner Effekt ist (Abb. 14).

B204-12C

MMG, 3d MMGly, 3d MMA, 6d MMAGly, 6d

CXAU1

E129

H222

W29

Abb. 14: Vergleich des Wachstums verschiedener Y. lipolytica-Stämme auf Minimalmedium mit unterschiedlichen C-Quellen. Die Stämme wurden üN in YPD-Flüssigmedium kultiviert und einmal mit 1 x MMT gewaschen. Es wurden 1 x 105 Zellen auf die Platten getropft.

Abb. 14 zeigt das Wachstum unterschiedlicher Y. lipolytica-Stämme auf Minimalmediumplat-

ten mit verschiedenen C-Quellen. Auf Minimalmedium mit Glucose, Glycerin oder Acetat

konnten alle Stämme wachsen. Das Wachstum der Wildtypstämme H222 und W29 war auf

Glucose und Glycerin besser als das der anderen Stämme. Auf Medium mit Acetat/Glycerin

ist der Stamm B204-12C wie PO1d nicht mehr in der Lage zu wachsen, ebenso ist das

Wachstum von E129 stark eingeschränkt. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass

der Unterschied im Wachstum von Y. lipolytica-Stämmen auf Minimalmediumplatten mit Ace-

tat/Glycerin als C-Quellen stammspezifisch ist.

3.3 Die Gpr1p-Orthologen in Saccharomyces cerevisiae

In die Untersuchungen dieser Arbeit wurde S. cerevisiae einbezogen, da diese Hefe im Ge-

gensatz zu Y. lipolytica nur drei Gpr1p-Orthologe enthält. Weiterhin standen Mutantenstäm-

me mit Deletionen von einem, zwei oder allen dieser drei Gene zur Verfügung.

Zunächst standen in S. cerevisiae grundlegende Untersuchungen des Wachstums der

Stämme mit Deletionen der GPR1-Orthologen im Vordergrund (vgl. Kapitel 3.3.2).

Ergebnisse

66

3.3.1 Wachstum verschiedener Saccharomyces cerevisiae-Stämme

Der Test des Wachstums verschiedener Y. lipolytica-Stämme auf Minimalmedium mit unter-

schiedlichen C-Quellen ergab, dass einige von den untersuchten Stämmen nicht auf Mini-

malmedium mit Acetat/Glycerin als C-Quellen wachsen konnten (vgl. Kapitel 3.2.3).

Es sollte getestet werden, ob dieser stammspezifische Wachstumseffekt auch in der Hefe

S. cerevisiae auftritt (Abb. 15).

Abb. 15: Vergleich des Wachstums verschiedener S. cerevisiae-Stämme auf Minimalmedi-um mit unterschiedlichen C-Quellen. Die Stämme wurden üN in YPD-Flüssig-medium kultiviert und einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen. Es wurden 1 x 105 Zellen aufgetropft und die Platten 2 bis 4 d bei 28 °C inkubiert.

In Abb. 15 ist das Wachstum verschiedener S. cerevisiae-Stämme auf Minimalmediumplat-

ten mit unterschiedlichen C-Quellen dargestellt. Auf Minimalmedium mit Glucose, Ace-

tat/Glucose (pH4 bzw. pH6,5) wuchsen alle Stämme. Der Stamm W303 war nicht in der La-

ge in Anwesenheit von Glycerin und Acetat/Glycerin (pH4 bzw. pH6,5) als C-Quellen zu

wachsen. Allerdings besitzt dieser Stamm keinen atmungsdefizienten Phänotyp. Möglicher-

weise akkumumulierte eine erhaltene Mutation, die zum Verlust der Atmungsaktivität führte,

während der Kultivierung auf fermentierbaren C-Quellen. Die Stämme DBY747 und

YNΔycrΔydrΔynr konnten nicht auf Minimalmedium bei einem pH-Wert 4 mit Acetat/Glycerin

als C-Quellen wachsen. Betrug der pH-Wert des Mediums jedoch 6,5, so war ein Wachstum

dieser beiden Stämme nachweisbar.

Auch im Fall der Hefe S. cerevisiae gab es wie bei Y. lipolytica stammspezifische Unter-

schiede im Wachstum auf Minimalmediumplatten mit Acetat/Glycerin als C-Quellen.

3.3.2 Wachstum der YN-Stämme auf verschiedenen C-Quellen

Zu Beginn der Arbeiten waren keine Unterschiede zwischen Stämmen mit Einzeldeletionen

der GPR1-Orthologen und dem Wildtyp im Wachstum auf verschiedenen C-Quellen bekannt.

DL1

DBY747

W303

H30

Glucose Acetat/GlucosepH4

Acetat/GlucosepH6,5

Glycerin Acetat/GlycerinpH4,0

Acetat/GlycerinpH6,5

DL1

DBY747

W303

H30

Glucose Acetat/GlucosepH4

Acetat/GlucosepH6,5

Glycerin Acetat/GlycerinpH4,0

Acetat/GlycerinpH6,5

Ergebnisse

67

Deshalb sollte das Wachstum dieser Stämme auf Minimalmedium mit unterschiedlichen

C-Quellen getestet werden. Weiterhin sollte untersucht werden, inwieweit Doppelmutationen

und die Deletion aller drei Orthologen eventuell Auswirkungen auf das Wachstum der Deleti-

onsstämme haben. Somit wurde das Wachstum der verschiedenen YN-Stämme auf Mini-

malmedium mit unterschiedlichen C-Quellen getestet. Die Ergebnisse sind in Tab. 14 darge-

stellt.

Tab. 14: Wachstumstest der YN-Stämme auf Minimalmedium mit unterschiedlichen C-Quellen. Die Stämme wurden üN in YPD-Flüssigmedium geschüttelt. Nach dem Waschen der Kulturen mit 1 x Readersalzen, wurden 1 x 105, 1 x 104, 1 x 103, 1 x 102 und 1 x 101 Zellen auf die Platten ausgetropft und 2 bis 9 d bei 28 °C inku-biert. Die Anzahl der „+“ zeigt die Stärke des Wachstums an.

YN YNΔycr YNΔydr YNΔynr YNΔycr Δydr

YNΔycr Δynr

YNΔydrΔynr

YNΔycr ΔydrΔynr

MG +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

MAG, pH4,0

+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

MAG, pH5,5

+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

MAG, pH6,5

+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

MGly ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++

MAGly, pH4,0

++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++

MAGly, pH5,5

++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++

MAGly, pH6,5

++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++

MA, pH4,0

++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++

MA, pH5,5

++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++

MA, pH6,5

++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++

ME ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

MEG +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Die YN-Stämme zeigten auf Minimlamedium mit Acetat/Glucose und Ethanol/Glucose ein

gleich gutes Wachstum wie auf Minimalmedium mit Glucose als C-Quelle. Standen nur Gly-

cerin, Acetat/Glycerin, Acetat oder Ethanol als C-Quellen zur Verfügung, so war das Wachs-

tum etwas schwächer.

Ergebnisse

68

Es konnten keine Unterschiede im Wachstum der Stämme auf Medium mit Acetat/Glucose,

Ethanol, Ethanol/Glucose oder Glucose als C-Quellen festgestellt werden. Auf Minimalmedi-

umplatten mit Glycerin oder Acetat/Glycerin wuchs der Stamm YNΔynr etwas schlechter als

der Wildtypstamm YN. Zur Bestätigung dieses Effektes wurde ein weiterer Versuch durchge-

führt (Abb. 16).

Abb. 16: Vergleich des Wachstums von Transformanden des Stammes YN und YNΔynr

auf Minimalmediumplatten mit verschiedenen C-Quellen. Die Transformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium kultiviert und die angegebenen Zellmengen auf die Platten getropft. Die Platten wurden mehrere Tage bei 28 °C inkubiert.

Es wurden der Deletionsstamm YNΔynr mit dem Plasmid p416YNR für diesen Test verwen-

det. Weiterhin wurde das Wachstum der Stämme YN und YNΔynr mit dem Plasmid

p416YNR verglichen. Der Stamm YN/p416YNR besaß den gleichen Genotyp wie

YN/p416ADH und sollte somit den gleichen Wachstumsphänotyp wie dieser aufweisen.

Auf Minimalmediumplatten mit Glucose bzw. Glycerin als C-Quellen gab es zwischen den

getesteten Transformanden keine Unterschiede im Wachstum. Enthielt das Medium Acetat

oder Acetat/Glycerin als C-Quellen, so konnte nur ein Unterschied bei pH4,0 beobachtet

YN/p416ADH

YNΔynr/p416ADH

YNΔynr/p416YNR

Glucose Glycerin

Acetat/Glycerin, pH5,5 Acetat/Glycerin, pH6,5

Acetat, pH5,5 Acetat, pH6,5Acetat, pH4,0

YN/p416ADH

YNΔynr/p416ADH

YNΔynr/p416YNR

YN/p416ADH

YNΔynr/p416ADH

YNΔynr/p416YNR

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Acetat/Glycerin, pH4,0

1: 1 x 101 Zellen2: 1 x 102 Zellen3: 1 x 103 Zellen4: 1 x 104 Zellen5: 1 x 105 Zellen

YN/p416ADH

YNΔynr/p416ADH

YNΔynr/p416YNR

Glucose Glycerin

Acetat/Glycerin, pH5,5 Acetat/Glycerin, pH6,5

Acetat, pH5,5 Acetat, pH6,5Acetat, pH4,0

YN/p416ADH

YNΔynr/p416ADH

YNΔynr/p416YNR

YN/p416ADH

YNΔynr/p416ADH

YNΔynr/p416YNR

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Acetat/Glycerin, pH4,0


Ergebnisse

69

werden. Lag der pH-Wert dagegen bei 5,5 bzw. 6,5, so wuchsen alle Transformanden gleich

gut. Der Wildtypstamm mit dem Plasmid p416ADH wuchs auf Minimalmedium mit einem pH-

Wert von 4,0 und Acetat oder Acetat/Glycerin im Vergleich zu YNΔynr/p416ADH und

YNΔynr/ p416YNR besser. Die Komplementation des Stammes YNΔynr mit einem für

Ynr002cp kodierenden Plasmid (p416YNR) führte jedoch nicht zu verbessertem Wachstum

dieser Transformande. Somit konnte der Wachstumseffekt der Deletion von YNR002c (Tab.

14) nicht aufgehoben werden.

3.3.3 Expression der GPR1-Mutantenallele in Saccharomyces cerevisiae

Es stellte sich die Frage, inwieweit die Mutantenallele GPR1-1 und GPR1-2 aus Y. lipolytica

auch in S. cerevisiae funktionell sind. Zur Klärung dieses Aspektes wurden die ORFs von

GPR1, GPR1-1 und GPR1-2 in den S. cerevisiae-Vektor p426MET25, unter der Kontrolle

des MET25-Promotors, kloniert und in die S. cerevisiae-Stämme DBY747 (Wildtyp) sowie

YNΔycrΔydrΔynr (Deletion aller drei Homologen) transformiert. Das Wachstum der Trans-

formanden wurde auf Minimalmedium mit Glucose und Acetat/Glucose als C-Quellen getes-

tet (Abb. 17).

Abb. 17: Wachstum von S. cervisiae-Transformanden, die Gpr1p sowie im C-Terminus bzw. N-Terminus mutiertes Gpr1p exprimieren. Die Transformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium kultiviert, von den Kulturen wurden 1 x 105 Zellen auf die entsprechenden Platten getropft.

Alle Transformanden wuchsen auf Minimalmedium-Platten mit Glucose als C-Quelle. Stan-

den allerdings Acetat/Glucose (pH-Wert von 4,0) als C-Quellen zur Verfügung, konnten Zel-

len, die das GPR1-1- oder das GPR1-2-Allel trugen, nicht wachsen. Dies zeigte, dass die

GPR1-Mutantenallele (GPR1-1 und GPR1-2) ebenfalls in S. cerevisiae wirksam sind.

DBY747/ p426MET25

DBY747/ p426METGPR1

DBY747/ p426METGPR1-1


YNΔycrΔydrΔynr/ p426MET25

YNΔycrΔydrΔynr/ p426METGPR1

YNΔycrΔydrΔynr/ p426METGPR1-1


Glucose GlucoseAcetat/Glucose

Acetat/Glucose

DBY747/ p426MET25

DBY747/ p426METGPR1



YNΔycrΔydrΔynr/ p426MET25

YNΔycrΔydrΔynr/ p426METGPR1



Glucose GlucoseAcetat/Glucose

Acetat/Glucose

Ergebnisse

70

3.3.4 Ort-spezifische Mutagenese von Ycr010cp und Ynr002cp

Die Gpr1p-Orthologen Ycr010cp und Ynr002cp besitzen 47 % identische Aminosäuren zu

Gpr1p, Ydr384cp enthält dagegen 27 % identische Aminosäuren. Diese hohen Homologien

der Proteine lassen ähnliche oder gleiche Funktionen vermuten. Um diesen Sachverhalt zu

testen, sollten Ort-spezifische Mutationen analog zu denen im Gpr1-Protein (Gpr1-1p und

Gpr1-2p) in die Orthologen eingeführt werden. Ycr010cp und Ynr002cp enthalten an den

Stellen L74 (Ynr002cp) bzw. L75 (Ycr010cp) und G259 die gleichen Aminosäuren wie Gpr1p,

Ydr384cp enthält dagegen an diesen Stellen andere Aminosäuren (E72 und S255) (vgl. Abb.

5). Im N-Terminus befindet sich somit anstatt einer hydrophoben Aminosäure (Leucin) eine

saure Aminosäure (Glutaminsäure). Der C-Terminus von Ydr384cp enthält an der Stelle 255

die Aminosäure Serin, die wie Glycin eine polare Aminosäure ist. Allerdings sind in Ydr384cp

die an Serin angrenzenden Aminosäuren völlig verschieden von denen in Gpr1p, Ycr010cp

oder Ynr002cp (Ydr384cp enthält z. B. kein YNAYA-Motiv wie die anderen Proteine). Somit

kamen für diese Mutagenese nur Ycr010cp und Ynr002cp in Frage. Es wurden im N-

Terminus Leucin in Glutamin (AS 75 in Ycr010cp, AS 74 in Ynr002cp) und im C-Terminus

Glycin gegen Asparaginsäure (AS 259) ausgetauscht. Die Expression der mutierten Proteine

erfolgte im Vektor p426MET25. Das Wachstum der Transformanden wurde in einem Tropf-

test überprüft (Tab. 15).

Tab. 15: Wachstum von YN- und YNΔycrΔydrΔynr-Transformanden, deren Plasmide für Ycr010cp und Ynr002cp sowie deren Mutantenproteine mit AS-Austauschen kodie-ren. Die Transformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, von diesen Kulturen wurden 1 x 105 Zellen auf die entsprechenden Agarplatten getropft. Die Platten wurden bei 28 °C inkubiert. Es bedeuten „+++“, dass diese Transformanden genauso gut wie Transformanden mit p426METYCR bzw. p426METYNR wuchsen. Konnte kein Wachstum festgestellt werden, ist dies durch „-“ gekennzeichnet.

Plasmid Glucose Acetat/Glucose

YN YNΔycrΔydrΔynr YN YNΔycrΔydrΔynr

p426METYCR +++ +++ +++ +++

p426METYCR-Q75 +++ +++ - -

p426METYCR-D259 +++ +++ - -

p426METYNR +++ +++ +++ +++

p426METYNR-Q74 +++ +++ - -

p426METYNR-D259 +++ +++ - -

Ergebnisse

71

Zellen, deren enthaltene Plasmide für die mutierten Ycr010c- und Ynr002c-Proteine kodier-

ten, waren nicht mehr in der Lage, auf Minimalmedium mit Acetat oder Acetat/Glucose als

C-Quellen zu wachsen. Dieser Mutantenphänotyp war ebenso wie der von Gpr1-1p und

Gpr1-2p dominant. Somit könnten Ycr10cp und Ynr002cp in S. cervisiae ähnliche Funktionen

haben wie Gpr1p in Y. lipolytica.

3.3.5 YCR010c- und YNR002c-Allele unter Kontrolle ihres authentischen Pro-motors

Im vorhergehenden Versuch wurde festgestellt, dass Ort-spezifische Mutationen in Ycr010cp

bzw. Ynr002cp Essigsäuresensitivität der Transformanden verursachen. Allerdings standen

die Gene YCR010c und YNR002c unter Kontrolle des konstitutiv exprimierten Methionin-

Promotors und befanden sich außerdem auf einem high-copy-Plasmid (Mumberg et al.,

1994). Es sollte überprüft werden, inwieweit dieser Mutantenphänotyp noch zu beobachten

ist, wenn die Gene in einem low-copy-Plasmid unter der Kontrolle ihres authentischen Pro-

motors stehen. Tab. 16 fasst die erhaltenen Ergebnisse zusammen.

Tab. 16: Wachstum von YN- und YNΔycrΔydrΔynr-Transformanden, deren Plasmide für Ycr010cp, Ynr002cp sowie deren Proteine mit AS-Austauschen kodieren. Die auf den Plasmiden enthaltenen Gene YCR010c und YNR002c stehen jeweils unter der Kontrolle ihres Originalpromotors. Die Transformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, von den Kulturen wurden 1 x 105 Zellen auf die ent-sprechenden Agarplatten getropft und mehrere Tage bei 28 °C inkubiert. Es bedeu-ten „+++“, dass diese Transformanden genauso gut wie Transformanden mit p416ADH wuchsen. Konnte kein Wachstum festgestellt werden, ist dies durch „-“ gekennzeichnet.

Plasmid Glucose Acetat/Glucose Acetat

YN YNΔycrΔydr

Δynr

YN YNΔycrΔydr

Δynr

YN YNΔycrΔydr

Δynr

p416 +++ +++ +++ +++ +++ +++

p416YCR +++ +++ +++ +++ +++ +++

p416YCR-Q75 +++ +++ +++ +++ - -1

p416YCR-D259 +++ +++ +++ +++ - -

p416YNR +++ +++ +++ +++ +++ +++

p416YNR-Q74 +++ +++ +++ +++ - -

p416YNR-D259 +++ +++ +++ +++ - -

1 Kein Wachstum war nur bei frisch transformierten Zellen zu beobachten. Waren die Transforman-

den etwas älter bzw. der Konserve entnommen, wuchsen sie auf Minimalmedium mit Acetat (al-lerdings etwas schlechter als YN/p416YCR).

Ergebnisse

72

Stehen die Gene YCR010c und YNR002c unter der Kontrolle ihrer authentischen Promoto-

ren, so war der Mutantenphänotyp, im Unterschied zum Mutantenphänotyp von Gpr1p in

Y. lipolytica, nicht mehr in gleichzeitiger Gegenwart von Glucose und Acetat detektierbar.

Allerdings waren die Transformanden, deren Plasmid die mutierten Proteine exprimierte,

noch sensitiv gegenüber Essigsäure.

3.3.6 Zufällige Mutagenese der GPR1-Orthologen in Saccharomyces cerevisi-ae

Die zufällige Mutagenese der orthologen Gpr1-Proteine in S. cervisiae diente der Identifikati-

on funktionell wichtiger Bereiche, die in Gpr1p noch nicht bekannt waren. Für das Ydr384c-

Protein war bisher noch kein Mutantenphänotyp bekannt, deshalb sollte dieses ebenfalls mit

in die Mutagenese einbezogen werden.

Diese drei homologen Gene wurden mittels mutagener PCR amplifiziert (vgl. Kapitel 2.9.13).

Dazu wurden PCR-Reaktionen mit unterschiedlichen MnCl2-Konzentrationen durchgeführt

und von diesen der Ansatz in das Plasmid p426MET25 kloniert, der die meisten Einzelmuta-

tionen im entsprechenden Gen aufwies. Im Falle von YCR010c waren dies vier von 12 se-

quenzierten Klonen. Die Mutagenese von YNR002c ergab von sieben sequenzierten Klonen

drei mit einem Austausch. Im Ansatz von YDR384c hatten von 11 Klonen drei einen Aus-

tausch in diesem Gen. Die jeweiligen Plasmidpools wurden in entsprechende Hefestämme

transformiert.

Für das Screening der Hefetransformanden standen die Stämme DBY747, YN und

YNΔycrΔydrΔynr zur Auswahl. Diese wurden in einem Vortest mit den Plasmiden

p426METYCR, p426METYCR-D259, p426METYNR und p426METYNR-D259 transformiert

und auf die Ausbildung des Mutantenphänotypes (kein Wachstum auf Acetat) nach dem

Überstempeln auf Minimalmedium mit Acetat untersucht. Aufgrund des insgesamt schwa-

chen Wachstums des Stammes YN auf Acetat war der Mutantenphänotyp bei Transforman-

den dieses Stammes nicht deutlich zu erkennen. Für die Transformation der Plasmide, wel-

che die zufällig mutierten Inserts enthielten, wurden die S. cerevisiae-Stämme DBY747 und

YNΔycrΔydrΔynr verwendet. Die Tripelmutante wurde für dieses Screening ausgewählt um

eventuelle rezessive Mutationen identifizieren zu können.

Im Fall von YCR010c konnten 35 x 10-4 Transformanden isoliert werden, die nicht mehr in

der Lage waren auf Acetat zu wachsen. Das Screening von Transformanden, deren Plasmid

zufällig mutiertes YNR002c enthielt, ergab 5 - 8 x 10-4 Mutanten. Somit konnten insgesamt

11 Transformanden, die auf ihrem Plasmid für zufällig mutiertes Ycr010cp kodierten, isoliert

werden. Im Falle von Ynr002cp konnten im Screening vier Transformanden isoliert werden,

die einen Essigsäure-sensitiven Phänotyp aufwiesen. Es wurden ca. 4100 Transformanden

Ergebnisse

73

des Stammes DBY747, deren Plasmid für zufällig mutiertes Ydr384cp kodierte, getestet.

Vom Stamm YNΔycΔydrΔynr wurden dagegen nur 1200 Hefetransformanden überprüft, da

hier jede zehnte Transformande nicht mehr auf Acetat wachsen konnte, diese erwiesen sich

aber im Tropftest alle als falsch positiv. Möglicherweise haben Mutationen im Ydr384-Protein

keine Auswirkungen auf das Wachstum auf Minimalmedium mit Acetat oder es wurden zu

wenig Transformanden überprüft.

In Abb. 18 sind die Stellen der mutierten Aminosäuren in Ycr010cp und Ynr002cp, die eine

Sensitivität gegenüber Essigsäure hervorrufen, dargestellt.

Punktmutationen in YCR010c und YNR002c (random Mutagenese) Y.l.GPR1 1 -----MNTEI PDLEKQQIDH NSG-----SD DPQPIHDDMA PVSRIRSSGP NHEYIHIADQ KFHRDDFYRA FG-GTLNPG- GAPQPSRKFG S.c.YNR002c 1 MSDREQSSGN TAFEN-PKAL DSSEGEFISE NNDQSRHSQE SICKIYTAGK NNEYIYIGRQ KFLRDDLFEA FG-GTLNPG- LAPAPVHKFA S.c.YCR010c 1 MSDKEQTSGN TDLENAPAGY YSSHDNDVNG VAEDERPSHD SLGKIYTGGD NNEYIYIGRQ KFLKSDLYQA FG-GTLNPG- LAPAPVHKFA S.c.YDR384c 1 -----MTSSA SSPQDLEKGV NTLENIETLP QQGSIAGVSQ GFPNIQEIYS DRDFITLGSS TYRRRDLLNA LDRGDGEEGN CAKYTPHQFA Consensus 1 S E S I G N EYI IG Q KF R DL A FG GTLNPG AP P HKFA ausgetauschte AS G V V IPD T bzw.V Y.l.GPR1 79 NPAPLGLSAF ALTTLVFSLC TVQARGVPNP SIAVGLALFY GGVCQFAAGM WEFVQENTFG AAALTSYGGF WMSWAAIEMN AFGIKDSYND S.c.YNR002c 88 NPAPLGLSGF ALTTFVLSMF NARAQGITIP NVVVGCAMFY GGLVQLIAGI WEIALENTFG GTALCSFGGF WLSFGAIYIP WFGILDAYKD S.c.YCR010c 89 NPAPLGLSAF ALTTFVLSMF NARAQGITVP NVVVGCAMFY GGLVQLIAGI WEIALENTFG GTALCSYGGF WLSFAAIYIP WFGILEAYED S.c.YDR384c 86 NPVPLGLASF SLSCLVLSLI NANVRGVTDG KWALSLFMFF GGAIELFAGL LCFVIGDTYA MTVFSSFGGF WICYGYGLTD TDNLVSGYTD Consensus 34 NPAPLGLS F ALTT VLS NA A G T P VG AMFY GG QL AG WE ENTFG TAL S GGF W S AI FGI Y D ausgetauschte AS GD D Y.l.GPR1 169 P-IEVQNAVG IYLFGWFIFT LMLTLCTLKS TVAFFGLFFM LMMTFLVLAC ANVTQHHGTA IGGGWLGIIT AFFGFYNAYA GLANPGNSYI S.c.YNR002c 178 KESDLGNALG FYLLGWALFT FGLSVCTMKS TIMFFALFFL LAVTFLLLSI ANFTGEVGVT RAGGVLGVIV AFIAWYNAYA GIATRQNSYI S.c.YCR010c 179 NESDLNNALG FYLLGWAIFT FGLTVCTMKS TVMFFLLFFL LALTFLLLSI GHFANRLGVT RAGGVLGVVV AFIAWYNAYA GVATKQNSYV S.c.YDR384c 176 P-TMLNNVIG FFLAGWTVFT FLMLMCTLKS TWGLFLLLTF LDLTFLLLCI GTFIDNNNLK MAGGYFGILS SCCGWYSLYC SVVSPSNSYL Consensus 90 L NA G FYL GW FT F L CT KS T FF LFF L TFLLL I F G AGG LG AF WYNAYA G A NSY ausgetauschte AS A KS R L Y.l.GPR1 258 VPVPLDMPFV KKD-- 270 S.c.YNR002c 268 MVHPFALPSN DKVFF 282 S.c.YCR010c 269 LARPFPLPST ERVIF 283 S.c.YDR384c 265 AFRAHTMPNA P---- 275 Consensus 141 P P 142 ausgetauschte AS I

Abb. 18: Alignment der Aminosäuresequenzen von Gpr1p, Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp. Es wurde mit Hilfe des Programms ClustalX-1.81 (Thompson et al., 1997) erstellt. Je nach Konservierungsgrad sind die Aminosäuren rot (identisch) bzw. blau (hoch konserviert) dargestellt. Grau unterlegt sind die potentiell memb-ranspannenden Domänen, die mit dem Programm HMMTOP1 ermittelt wurden. Grün sind die Aminosäuren unterlegt, deren Austausch Essigsäuresensitivität verursacht. Aminosäuren, die in Gpr1-1p bzw. Gpr1-2p ausgetauscht sind, wur-den gelb markiert.

Die zufällige Mutagenese von Ycr010cp ergab 11 Transformanden, die senstitiv gegen Es-

sigsäure waren. Von diesen Transformanden trugen neun eine Mutation (Tf2 2: F212S, Tf 4:

N145D, Tf 5: E144G, Tf 6: A88V, Tf 7: T74I, Tf 11: M211K, Tf 13: F71V, Tf 16: A70V, Tf 83: E144G).

Zwei Transformanden enthielten jeweils zwei ausgetauschte Aminosäuren (Tf 35: E35G und

T209A, Tf 91: M211L und H230R). Die Plasmide, deren kodiertes Ycr010c-Protein ausgetausch-

te Aminosäuren enthielt, konnten alle aus dem Stamm DBY747 isoliert werden. Unter den

Transformanden des Stammes YNΔycrΔydrΔynr konnten keine Transformanden nachgewie-

sen werden, die Essigsäure-sensitiv waren. 1 http://www.enzim.hu/hmmtop/ 2 Transformande

Ergebnisse

74

Das Screening der Hefetransformanden, die auf ihrem Plasmid mutiertes Ynr002cp trugen,

ergab vier Transformanden, die nicht mehr in der Lage waren auf Medium mit Acetat zu

wachsen. Die durch Sequenzierung identifizierten veränderten Aminosäuren in Ynr002cp

sind ebenfalls in Abb. 18 dargestellt. Von diesen Transformanden enthielten drei jeweils eine

ausgetauschte Aminosäure (Tf 15: N75D, Tf 16: G147D, Tf 21: S265L). Die vierte Transforman-

de enthielt an drei Stellen ausgetauschte Aminosäuren (Tf 17: L74P, A87T und M268I). Die

Plasmide 16, 17 und 21 wurden aus dem Stamm DBY747 und Plasmid 15 aus

YNΔycrΔydrΔynr isoliert.

Weiterhin wurde überprüft, ob die mutierten Ycr010c- bzw. Ynr002c-Proteine einen dominan-

ten oder rezesiven Phänotyp aufweisen. Die Plasmide, die für diese Proteine kodierten, wur-

den in die Stämme DBY747 und YNΔycrΔydrΔynr transformiert und das Wachstum der

Transformanden auf Minimalmedium mit Essigsäure überprüft. Keine der Transformanden

war in der Lage auf Essigsäure zu wachsen, d.h. der Phänotyp aller mutierten Proteine ist

dominant.

3.3.7 C-terminale Verkürzung von Gpr1p, Ycr010cp und Ynr002cp

Augstein (2001) testete unter anderem, inwieweit die teilweise oder vollständige Deletion des

hydrophilen N-Terminus von Gpr1p Auswirkungen hat. Es zeigte sich, dass der Mutanten-

phänotyp (Essigsäuresensitivität) auch auftrat, wenn der N-Terminus nahezu vollständig de-

letiert wurde. Dies lässt vermuten, dass im N-Terminus keine Signalsequenzen vorkommen,

die für die korrekte Lokalisierung des Proteins wichtig sind. Daraufhin wurden die Auswir-

kungen von Deletionen des ebenfalls hydrophilen C-Terminus auf das Wachstum der Trans-

formanden auf essigsäurehaltigem Medium getestet (siehe auch Gentsch, 2003). Der

C-Terminus von Gpr1-2p wurde unterschiedlich verkürzt (bis Aminosäure P265, Y256, A247 oder

F242). Außerdem wurde nur das YNAYA-Motiv deletiert. Diese Konstrukte wurden in die

Stämme PO1d und PO1dΔgpr1 transformiert und das Wachstum auf MMA getestet (Tab.

17). Es stellte sich u. a. heraus, dass das YNAYA-Motiv von Gpr1p wesentlich für dessen

Funktion zu sein scheint, da der Mutantenphänotyp durch Deletion von YNAYA aufgehoben

wird. Möglicherweise ist es für eine Di- bzw. Oligomerisierung des Gpr1 Proteins notwendig.

Ergebnisse

75

Tab. 17: Wachstum von PO1d- und PO1dΔgpr1-Transformanden, die für C-terminal verkürz-te bzw. YNAYA-deletierte Gpr1p-Konstrukte kodieren. Die Transformanden wurden nach 24 h Inkubation auf MMG-Platten auf Minimalmediumplatten mit Glucose bzw. Acetat/Glucose als C-Quellen überstempelt und bei 28 °C inkubiert. Die Anzahl der „+“ gibt die Stärke des Wachstums an. Dabei bedeuten „+++“, dass diese Trans-formanden genauso gut wie Transformanden mit pYLG3 wuchsen. Konnte kein Wachstum festgestellt werden, ist dies durch „-“ gekennzeichnet.

Plasmid Glucose Acetat/Glucose

PO1d PO1dΔgpr1 PO1d PO1dΔgpr1

pYLG3 +++ +++ +++ +++

pG1-P265 +++ +++ ++ +++

pG1-Y256 +++ +++ ++ +++

pG1-A247 +++ +++ + +++

pG1-F242 +++ +++ +++ +++

pG1-dYNYAYA +++ +++ +++ +++

pYLG2 +++ +++ - -

pG2-P265 +++ +++ - - (2 von 5 Trans-formanden)

pG2-Y256 +++ +++ - +++

pG2-A247 +++ +++ - +++

pG2-F242 +++ +++ +++ +++

pG2-dYNAYA +++ +++ +++ +++

In dieser Arbeit sollte weiterhin untersucht werden inwieweit C-terminale Deletionen von

Ycr010cp und Ynr002cp Auswirkungen auf die Sensitivität der Zellen gegenüber Essigsäure

haben. Ydr384cp wurde in diese Untersuchungen nicht mit einbezogen, da dieses Protein

kein YNAYA-Motiv enthält und kein Mutantenphänotyp zur Verfügung stand. Es wurden

Plasmide konstruiert, die für C-terminal verkürztes bzw. YNAYA-deletiertes Ycr010cp oder

Ynr002cp kodieren. Diese Plasmide wurden in die Stämme YN und YNΔycrΔydrΔynr trans-

formiert und das Wachstum auf Minimalmediumplatten mit Glucose bzw. Acetat getestet.

Das Ergebnis ist in Tab. 18 dargestellt.

Eine Verkürzung bzw. Deletion des YNAYA-Motivs von Ycr010cp und Ynr002cp hatte keine

Auswirkung auf das Wachstum der Transformanden mit Plasmiden, die für die jeweiligen

Wildtyp-Proteine kodierten. Wurden jedoch die Proteine der Mutantenallele verkürzt oder in

diesen das YNAYA-Motiv deletiert, so waren die Transformanden in der Lage auf Minimal-

medium mit Acetat als C-Quelle zu wachsen. Dies deutet darauf hin, dass das YNAYA-Motiv

auch in S. cerevisiae eine wichtige funktionelle Rolle spielt.

Zwischen den Stämmen YN und YNΔycrΔydrΔynr gab es im Gegensatz zu Y. lipolytica keine

Unterschiede im Wachstum auf Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle.

Ergebnisse

76

Tab. 18: Wachstum von YN- und YNΔycrΔydrΔynr-Transformanden, die für C-terminal ver-kürzte bzw. YNAYA-deletierte Ycr010cp- und Ynr002cp- Konstrukte kodieren. Die Transformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium kultiviert, von diesen Kulturen wurden 1 x 105 Zellen auf die entsprechenden Agarplatten getropft. Die Platten wurden bei 28 °C inkubiert. Die Anzahl der „+“ gibt die Stärke des Wachstums an. Dabei bedeuten „+++“, dass diese Transformanden genauso gut wie Transforman-den mit p416YCR bzw. p416YNR wuchsen. Konnte kein Wachstum festgestellt werden, ist dies durch „-“ gekennzeichnet.

Plasmid Glucose Acetat

YN YNΔycrΔydrΔynr YN YNΔycrΔydrΔynr

p416YCR +++ +++ +++ +++

p416YCR-dY267 +++ +++ +++ +++

p416YCR-dA258 +++ +++ +++ +++

p416YCR-dYNAYA +++ +++ +++ +++

p416YCR-Q75 +++ +++ - -

p416YCR-Q75-dY267 +++ +++ +++ +++

p416YCR-Q75-dA258 +++ +++ +++ +++

p416YCR-dYNAYA +++ +++ +++ +++

p416YNR +++ +++ +++ +++

p416YNR-dY266 +++ +++ +++ +++

p416YNR-dA257 +++ +++ +++ +++

p416YNR-dYNAYA +++ +++ +++ +++

p416YNR-Q74 +++ +++ - -

p416YNR-Q74-dY266 +++ +++ +++ +++

p416YNR-Q74-dA257 +++ +++ +++ +++

p416YNR-Q74-dYNAYA +++ +++ +++ +++

3.3.8 Sequenzanalyse der Promotoren

Mit Hilfe im Internet zugänglicher Datenbanken ist es möglich, DNA-Sequenzen, die Promo-

torelemente enthalten, näher zu charakterisieren. Die Promotorbereiche der Gene YCR010c,

YDR384c und YNR002c wurden mit Hilfe des Programms MatInspector V2.21 (Quandt et al.,

1995) auf mögliche Transkriptionsfaktor-Bindestellen näher untersucht. Es konnten verschie-

dene Sequenzmotive ermittelt werden, die mögliche Bindungsstellen für Transkriptionsfakto-

ren darstellen. Eine Auswahl ist in Abb. 19, Abb. 20 und Abb. 21 dargestellt.

1 http://www.genomatix.de

Ergebnisse

77

-600 GATAGGCGTC GTATATAGTC TCTTCTTTTA CATAAGAAAT AATAATTTTT CTATCCGCAG CATATATCAG AGAAGAAAAT GTATTCTTTA TTATTAAAAA -550 GGCCCCGCAA CTTTCCTTAT TTTCGAGAGG GTCCACTGCC CGTTGATCCG CSRE CCGGGGCGTT GAAAGGAATA AAAGCTCTCC CAGGTGACGG GCAACTAGGC -500 GAGCTCCGTG GAATAGGCGA GCGGCTGAGT GGTTCTCCAA GCTACGGTTT 3 x FACB CTCGAGGCAC CTTATCCGCT CGCCGACTCA CCAAGAGGTT CGATGCCAAA PHO4 (-) -450 TTACGTGTAG CCCCATGTGA GCAAGCCAAA CAAGGGCCCT TAAAGGCGTG AATGCACATC GGGGTACACT CGTTCGGTTT GTTCCCGGGA ATTTCCGCAC -400 ACTACAAAAA GGGGCGGGTT GGAAGGTCAT CTGCAGCGAG ATACGAAAAG STRE TGATGTTTTT CCCCGCCCAA CCTTCCAGTA GACGTCGCTC TATGCTTTTC GCR1 (-) NIT2 (-) -350 ATTTTTTGCC AGATTTGCGG TTGGGCGGCT ATTTCGGTAT TGTTGGGGTA TAAAAAACGG TCTAAACGCC AACCCGCCGA TAAAGCCATA ACAACCCCAT REPCAR1 (-) -300 ACAAACGTTG GGGAAGACTG CATTTTCTTA CAGCTTTTTT TCGTTATCGC MIG1 NIT2 TGTTTGCAAC CCCTTCTGAC GTAAAAGAAT GTCGAAAAAA AGCAATAGCG GCR1 (-) -250 GGGTTGGGCG GCTATGGCGC CTTCTCCTCT GTACTCCAAC CTGTCAGAGA STUAP1 (+/-) CCCAACCCGC CGATACCGCG GAAGAGGAGA CATGAGGTTG GACAGTCTCT REPCAR1 (-) -200 CACCAAGCTG TATATAAAGC ACCTTGGTTG GATCGTATTT CCCTGAGATC GTGGTTCGAC ATATATTTCG TGGAACCAAC CTAGCATAAA GGGACTCTAG HAP234 (-) -150 TTGCTATAGG TTCATTTTAT ATATCGTCCA ATAGCAATAA CAATACAACA NIT2 HAP234 AACGATATCC AAGTAAAATA TATAGCAGGT TATCGTTATT GTTATGTTGT -100 GAAACTACTA GCATCTGTTT ATAAGAAAAA GGCAAATAGT CGACAGCTAA CTTTGATGAT CGTAGACAAA TATTCTTTTT CCGTTTATCA GCTGTCGATT -50 CACAGATATA ACTAAACAAC CACAAAACAA CTCATATACA AACAAATAAT ATG Start YCR010c GTGTCTATAT TGATTTGTTG GTGTTTTGTT GAGTATATGT TTGTTTATTA NIT2 (-)

Abb. 19: Sequenz des YCR010c-Promotorsbereiches bis Position -600. Mögliche regulato-rische Sequenzmotive sind farbig hervorgehoben. CSRE: carbon source respon-sive element, FACB: Motiv für FacBp Aktivator aus A. nidulans bzw. N. crassa, PHO4: Pho4p Bindemotiv, STRE: stress response element, GCR1: Motiv für Gcr1p Aktivator, NIT2: Bindemotiv für Nit2p Regulator aus N. crassa, REPCAR1: Bindungsstelle für Repressor von CAR1, MIG1: Motiv für Mig1p Repressor, STU-AP1: Bindemotiv für StuAp, HAP234: HAP2/3/4 Motiv, (-): das Motiv liegt in um-gekehrter Orientierung vor.

-1201 TCTTGCAATT ATGTTATAGT TTGTGTTTGT GGTCTTTGAG TCTGAATGCT AGAACGTTAA TACAATATCA AACACAAACA CCAGAAACTC AGACTTACGA ABAA (-) -1151 AAACACCAAA AGGGCAATCG TGAAATGTAA GAGAATAATA TGTATAATCT TTTGTGGTTT TCCCGTTAGC ACTTTACATT CTCTTATTAT ACATATTAGA -1101 AAGATATCAA GAATATATAG AAAAGAAGAA TAAGCTCACA AAATGAAAAA NIT2 TTCTATAGTT CTTATATATC TTTTCTTCTT ATTCGAGTGT TTTACTTTTT NIT2 (-) -1051 AAACTTTTAA GAAAAAATTT TTTTCTCTCT TCGTTTTGCT CACTCCAAAA TTTGAAAATT CTTTTTTAAA AAAAGAGAGA AGCAAAACGA GTGAGGTTTT -1001 GCCTACTGCA TTGTAATACC TGAAGAGAAC AAACCATAAC CTGGAGGACA HSF5 CGGATGACGT AACATTATGG ACTTCTCTTG TTTGGTATTG GACCTCCTGT -951 ACAGCCCAGT GTGCAGGGAG ATCTGAGAAA GAAAGGAACC ACACGAGAGA TGTCGGGTCA CACGTCCCTC TAGACTCTTT CTTTCCTTGG TGTGCTCTCT

Ergebnisse

78

-901 CCCGAGAGGA AAGACCAAAT CCCTTTCCCA AACTAGTTGT GTTTTTGTCA GGGCTCTCCT TTCTGGTTTA GGGAAAGGGT TTGATCAACA CAAAAACAGT -851 GGTTAATGCG TCTGTGTATT TCTCAGAACG CTTACGTTCC AGGTATTTCG CCAATTACGC AGACACATAA AGAGTCTTGC GAATGCAAGG TCCATAAAGC -801 CACCCATTTT GAATTCTCCA TATCGTTTTG CACGGAAAAC CCATTTATCA ABF1 NIT2 GTGGGTAAAA CTTAAGAGGT ATAGCAAAAC GTGCCTTTTG GGTAAATAGT FacB (+/-) -751 TCTATTCTGT ATATAACCAC AATAGGCATC TCATTTCTTG CTTTGAAATA AGATAAGACA TATATTGGTG TTATCCGTAG AGTAAAGAAC GAAACTTTAT MCM1 (-) -701 GTAGGTACTT TTGTACGTAA TTCTTCTGGT AAAAAAAAAA GAAAAAAAAG HSF2 CATCCATGAA AACATGCATT AAGAAGACCA TTTTTTTTTT CTTTTTTTTC STE11 (-) -651 GAAGGAATTT GGGTCTCAAT TTTCACCCTT TTGTATAACA GTAGCATTCT ABAA CTTCCTTAAA CCCAGAGTTA AAAGTGGGAA AACATATTGT CATCGTAAGA -601 TGCATGTAAT CTCCAATATT TGGCTTGTGA TTGCCATCTC TATACTTCGT ACGTACATTA GAGGTTATAA ACCGAACACT AACGGTAGAG ATATGAAGCA -551 CAGCCATTAC CTTTTCCCCT CCCCTTCCCC TCCCCTCTCC TATTGCCGCA GTCGGTAATG GAAAAGGGGA GGGGAAGGGG AGGGGAGAGG ATAACGGCGT 4 x STRE (-) -501 CCGCCGGCTA CAAACATAAC TCCAACCATA ATCTCACCGC AGCTGGCATA NIT2 GGCGGCCGAT GTTTGTATTG AGGTTGGTAT TAGAGTGGCG TCGACCGTAT -451 TCCTCCGGTT TTCCCTCTCC ATCGCCCATT GTGTGCCAGA CAAAAGACGC AGGAGGCCAA AAGGGAGAGG TAGCGGGTAA CACACGGTCT GTTTTCTGCG -401 CGAAAAAAAC CGGAACTGCC GCCGCTGGTC CTGAGAAGAG CAAGAACCAT GCTTTTTTTG GCCTTGACGG CGGCGACCAG GACTCTTCTC GTTCTTGGTA -351 ACGGAAGAGT CTCAGCAGGC GCTGCTCCAA CTTGGCACAC GGCAGAACCT TGCCTTCTCA GAGTCGTCCG CGACGAGGTT GAACCGTGTG CCGTCTTGGA -301 GCACTACAAT AGCGTTAGGA AGAAGCATCA TTTTTTTCTA CTGTTTTTTT CGTGATGTTA TCGCAATCCT TCTTCGTAGT AAAAAAAGAT GACAAAAAAA GCR1 (-) -251 TTTTCTTGGG GAACCGCTCA GGGCCTAATG GAAACACCAA TGGATTTGAG AAAAGAACCC CTTGGCGAGT CCCGGATTAC CTTTGTGGTT ACCTAAACTC -201 AATTTTAACG CTATTCACGA TGACCGTGAC TCAGAAGGAA TATTTAAATA 2 x GCN4 TTAAAATTGC GATAAGTGCT ACTGGCACTG AGTCTTCCTT ATAAATTTAT -151 AAACAACTTT TTAGCAAATT GAATACTCAT CGATGAGCTT CGCTTGATTG TTTGTTGAAA AATCGTTTAA CTTATGAGTA GCTACTCGAA GCGAACTAAC -101 CCTAATATTC CCCCAGTTTT ATAAACAGTT GGGTCACATA TAACTGAATA ABAA GGATTATAAG GGGGTCAAAA TATTTGTCAA CCCAGTGTAT ATTGACTTAT MIG1 (-) -51 CATTCCCAGA AAGATTTAGT AAGAATAAAA AATAAAAATA CTGGTTAAAA GTAAGGGTCT TTCTAAATCA TTCTTATTTT TTATTTTTAT GACCAATTTT -1 TATG Start YDR384c A

Abb. 20: Sequenz des YDR384c-Promotorbereiches bis Position -1201. Mögliche regulato-rische Sequenzen sind farbig hervorgehoben. ABAA: Motiv für AbaAp aus A. nidulans, NIT2: Bindemotiv für Nit2p Regulator aus N. crassa, HSF2/5: Motiv für Hitzeschutzfaktor, ABF1: Bindemotiv für Abf1p, FACB: Motiv für den FacBp Aktivator aus A. nidulans bzw. N. crassa, MCM1: Bindungsstelle für Mcm1p, STE11: Motiv für Transkriptionsaktivator Ste11p aus S. pombe, STRE: stress response element, GCR1: Motiv für Gcr1p Aktivator, Gcn4: Bindemotiv für Gcn4p Regulator, MIG1: Motiv für Mig1p Repressor, (-): das Motiv liegt in umgekehrter Orientierung vor.

Ergebnisse

79

-488 AAGTTCTTGA CTACCCCTAT CTCACACTAG TACGTAATTC AATGTATCAT NIT2 ABAA TTCAAGAACT GATGGGGATA GAGTGTGATC ATGCATTAAG TTACATAGTA STRE (-) -438 TCGTATTGTA AGTAGATAGA GACGCAATAC AGGAAAGCTG ACCTTCCTTC GCR1 HAP234 AGCATAACAT TCATCTATCT CTGCGTTATG TCCTTTCGAC TGGAAGGAAG NIT2 (-) -388 CAATCACCAC GGCTGAAATG CTTTGTTGAC CAATTACGGA CGCTTAAGAG STE11 HAP234 GTTAGTGGTG CCGACTTTAC GAAACAACTG GTTAATGCCT GCGAATTCTC -338 CGGACGCGGC TGGAACGGCT CCATCCTAAA TCGGCGGAGG GAGAACTCCG STUAP1 (+/-) GCCTGCGCCG ACCTTGCCGA GGTAGGATTT AGCCGCCTCC CTCTTGAGGC NIT2 (-) -288 ATACCAGCCG ACATGGCAAT AATAGTGACA GTAGATGCTA CCAGCCCCGC TATGGTCGGC TGTACCGTTA TTATCACTGT CATCTACGAT GGTCGGGGCG MIG1 (-) -238 AATAATTTCA CAGTAGATCA TCAACAGTCT CCTCATTTCT GGAAATGATC HSF5 FacB TTATTAAAGT GTCATCTAGT AGTTGTCAGA GGAGTAAAGA CCTTTACTAG HSF5 (-) -188 AGCAACTTCG ACGGATTTAA CTCTCAAGCA GTTACGCACT CCGAGAACAG TCGTTGAAGC TGCCTAAATT GAGAGTTCGT CAATGCGTGA GGCTCTTGTC -138 CCGTGATCAT CTTTGAACAA GCAAAATATA TAAAGCAGGA GAACTGTCCT GGCACTAGTA GAAACTTGTT CGTTTTATAT ATTTCGTCCT CTTGACAGGA -88 ACCTAGAGCT AGAATAGCCA TAACTAACTA TGTAACATTC TACAGATCAA ABAA TGGATCTCGA TCTTATCGGT ATTGATTGAT ACATTGTAAG ATGTCTAGTT -38 TCAAAAACAA TCTTCAATCA CAGAAAAAAA TAAAAGGCAT G Start YNR002c AGTTTTTGTT AGAAGTTAGT GTCTTTTTTT ATTTTCCG

Abb. 21: Sequenz des YNR002c-Promotorbereiches bis Position -488. Mögliche regulato-rische Sequenzen sind farbig hervorgehoben. NIT2: Bindungsstelle für Nit2p Re-gulator, ABAA: Motiv für AbaAp aus A. nidulans, STRE: stress response element, GCR1: Motiv für Gcr1p Aktivator, HAP234: HAP2/3/4 Motiv, STE11: Motiv für Transkriptionsaktivator Ste11p aus S. pombe, STUAP1: Bindemotiv für StuAp, MIG1: Motiv für Mig1p Repressor, HSF5: Bindungsstelle für Hitzeschutzfaktor, (-): das Motiv liegt in umgekehrter Orientierung vor.

In den Promotoren von YCR010c und YNR002c konnten potentielle Bindungsstellen für

Mig1p identifiziert werden. Mig1p ist für die Repression Glucose-reprimierbarer Gene not-

wendig (Nehlin and Ronne, 1990; Lundin et al., 1994; Lutfiyya et al., 1998). Weiterhin enthal-

ten die Promotoren aller drei Homologen ein Sequenzmotiv für die Bindung von Gcr1p, das

für die positive Regulierung glycolytischer Gene wichtig ist (Holland et al., 1987, Willis et al.,

2003). Ein CSRE-Motiv (carbon source responsive element, Consensussequenz

CCRTYSRNCCG), das nicht in der verwendeten Datenbank aufgeführt ist, konnte im Promo-

tor von YCR010c identifiziert werden (Schöler and Schüller, 1994). Diese genannten Bin-

dungsstellen für Transkriptionsfaktoren Mig1p, Gcr1p und das CSRE-Motiv deuten auf eine

Glucose-abhängige Regulation der Promotoren hin.

In allen drei Promotoren wurden ein bzw. mehrere Bindemotive für den FacBp Aktivator aus

Aspergillus nidulans und Neurospora crassa mit der Consensussequenz TCC/G N8-10 C/GGA

gefunden (Todd et al., 1997; Todd et al., 1998; Bibbins et al., 2002). Das FacBp ist in die

Verwertung von Acetat involviert.

Ergebnisse

80

Die Promotorregion von YCR010c enthält eine mögliche Bindungsstelle für Pho4p. Dieser

Transkriptionsfaktor ist unter Phosphat-Mangelbedingungen dephosphoryliert und damit aktiv

(Springer et al., 2003).

In allen drei Promotoren konnten mehrere NIT2-Motive identifiziert werden, die auf eine

Stickstoff-abhängige Regulierung hinweisen. Das Nit2p aus N. crassa ist ein positiver Regu-

lator und aktiviert Gene, die bei der Verwertung sekundärer N-Quellen benötigt werden

(Chiang et al., 1994; Chiang and Marzluf, 1995). Der Promotor von YCR010c weist zwei Bin-

dungsstellen für den Repressor von CAR1 (REPCAR1-Motiv) auf. Das CAR1-Gen codiert für

Arginase, die für den Abbau von Arginin verantwortlich ist (Cooper et al., 1992). Die Expres-

sion von CAR1 wird durch Arginin und unter N-Mangel induziert (Smart et al., 1996).

Das Gcn4-Protein ist in die Regulation von Genen der Aminosäurebiosynthese involviert

(Sosa et al., 2003). Eine potentielle Bindungsstelle für dieses Protein konnte im YDR384c-

Promotor identifiziert werden, dessen Regulation Gcn4p abhängig ist (Guaragnella and Bu-

tow, 2003).

In allen drei Promotoren befinden sich STRE-Elemente (stress response element; Schüller

et al., 2004). Weiterhin konnten im YDR384c- und YNR002c-Promotor Bindungsstellen für

Hitzeschutzfaktoren (YDR384c: HSF2/5, YNR002c: HSF5) nachgewiesen werden

(Fernandes et al., 1994). Somit könnte die Regulation der drei Homologen Stress-abhängig

sein.

Der Transkriptionsaktivator Ste11p ist in Schizosaccharomyces pombe für die sexuelle Ent-

wicklung notwendig (Sugimoto et al., 1991) und wird unter Nährstoffmangel induziert

(Kunitomo et al., 2000). Die Promotoren von Ydr384c und YNR002c enthalten mögliche Bin-

dungsstellen für dieses Protein.

In den Promotoren von YDR384c und YNR002c konnte ein Bindemotiv für Abf1p nachge-

wiesen werden. Dieser Transkriptionsfaktor ist in einer Vielzahl von Prozessen im Kern in-

volviert, wie z. B. der DNA-Replikation, Transkriptionsaktivierung und Stilllegung von Genen

(Marahrens and Stillman, 1992; Miyake et al., 2004).

Der Transkriptionsfaktor AbaAp aus A. nidulans spielt während der Entwicklung der Konidi-

ophore in der Chitin-Biosynthese eine Rolle, indem er den Level von Chitin-Synthase-Genen

reguliert (Andrianopoulos and Timberlake, 1994; Park et al., 2003). In den Promotoren von

YDR384c und YNR002c konnten für AbaAp Bindungsstellen identifiziert werden. Das Genom

von A. nidulans codiert weiterhin für das StuA-Protein, das ebenfalls in der asexuellen Ver-

mehrung (Konidienbildung) involviert ist (Dutton et al., 1997; Wu and Miller, 1997). Mögliche

DNA-Bindemotive für dieses Protein konnten im Ycr010c- und YNR002c-Promotor identifi-

ziert werden.

Ergebnisse

81

In den meisten eukaryotischen Promotoren ist ein Hap2/3/4/5-Motiv (CCAAT) präsent

(Mantovani, 1998; Serra et al., 1998). Dieses Motiv enthalten jedoch nur die Promotoren von

YCR010c und YNR002c.

Im YDR384c-Promotor konnte ein potentielles Bindemotiv für Mcm1p (Minichromosome

Maintenance) nachgewiesen werden, dieses Protein ist für die effiziente Replikation von Mi-

nichromosomen notwendig. Mcm1p ist an den Replikationsstartpunkten lokalisiert und spielt

in der Initiation der DNA-Replikation eine wichtige Rolle (Chang et al., 2003).

In der SGD1 sind Microarray-Daten einsehbar, welche die RNA-Expression aller Gene aus

S. cerevisiae unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen enthalten. In Tab. 19 sind die

Expression der GPR1-Orthologen unter ausgewählten Bedingungen zusammengefasst. Es

wurden die RNA-Expressionen unter Stressbedingungen, auf verschiedenen C-Quellen so-

wie N-Quellen dargestellt.

Tab. 19: Regulation der Promotoren YCR010c, YDR384c und YNR002c, die in der Tabelle aufgeführten Daten stammen aus Microarrays, die in der „Saccharomyces Genome Database“1 eingesehen werden können. Rot bedeutet eine Induktion der Expressi-on, grün steht dagegen für eine Repression.

YCR010c YDR384c YNR002c Stressbe- Hitzeschock Hitzeschock (30 min) Hitzeschock dingungen diauxischer Shift diauxischer Shift diauxischer Shift YPD stat. Phase ab 5 h spätere stat. Phase stat. Phase Ethanol Ethanol Ethanol H2O2 (gering) H2O2 H2O2 (ganz gering) msn2msn4 + H2O2 (ganz

gering) msn2msn4 + H2O2 -

Kälteschock Kälteschock Kälteschock (ganz gering)

Sobitol (gering) - - DTT DTT DTT hypoosm. Shock hypoosm. Schock hypoosm. Schock Beginn stat. Phase Beginn stat. Phase - YAP1 Überexpression YAP1 Überexpression - C-Quelle Galactose Galactose - Glucose Glucose (gering) Glucose Mannose Mannose Mannose Raffinose Raffinose (sehr gering) - Sucrose - Sucrose (gering) Fructose Fructose - N-Quelle - Diamid Diamid - AS-Mangel bis 0,5 h - N-Mangel N-Mangel

1 http://www.yeastgenome.org/

Ergebnisse

82

3.3.9 Untersuchung der Nit2p-Erkennungssequenz

Mit Hilfe des Programms MatInspector V2.21 konnten in den Promotoren der drei GPR1-

Orthologen YCR010c, YDR384c und YNR002c verschiedene Erkennungssequenzen für

Regulatorproteine identifiziert werden (vgl. Kapitel 3.3.8). Darunter befanden sich in allen

drei Promotoren Sequenzmotive die mögliche Bindungsstellen für das Nit2p aus N. crassa

(Gln3p in S. cerevisiae) darstellen. In N. crassa werden nach dem Verbrauch von primären

Stickstoffquellen Strukturgene durch Nit2p aktiviert, die für die Verwertung sekundärer Stick-

stoffverbindungen benötigt werden (Chiang et al., 1994; Chiang and Marzluf, 1995).

Microarray-Daten, die in der SGD2 zugänglich sind, zeigen eine Repression von YDR384c

unter Stickstofflimitation (Tab. 19). YNR002c wird unter diesen Bedingungen induziert. Die

Regulation von YCR010c ist dagegen unabhängig von der Stickstoffquelle. Dillschneider

(2003) untersuchte in ihrer Diplomarbeit die Funktionalität der möglichen Nit2p-Bindungs-

stellen im Promotor von YNR002c. Die für Nit2p möglichen Bindungsstellen mit dem Se-

quenzmotiv GATA wurden zu TATA mutiert. Anschließend wurde die Aktivität der

β-Galactosidase unter Kontrolle des unveränderten und des mutierten YNR002c-Promotors

(YNR002c-NIT2-4) auf verschiedenen Stickstoffquellen in Minimalmedium mit Ethanol als

C-Quelle bestimmt. Als primäre Stickstoffquellen wurden Ammoniumsulfat und Glutamat

verwendet, Prolin kam als sekundäre Stickstoffquelle zum Einsatz. Die Zunahmen der

β-Galactosidaseaktivitäten sind in Abb. 22 dargestellt.

02468

101214161820

YN[YIp357RYNRPr] YN[YIp357RYNRPr-NIT2-4]

Zunh

ame

der

β-

Gal

akto

sida

seak

tivitä

t in

MU/

h

AmmoniumsulfatGlutamatProlin

Abb. 22: Zunahme der β-Galacosidaseaktivität unter Kontrolle des YNR002c- und YNR002c-NIT2-4-Promotors in Abhängigkeit von verschiedenen N-Quellen über einen Kultivierungszeitraum von 10 h (nach Dillschneider, 2003).

1 http://www.genomatix.de 2 http://www.yeastgenome.org/

Ergebnisse

83

Der YNR002c-Promotor zeigte auf den verschiedenen N-Quellen Ammoniumsulfat, Glutamat

und Prolin die gleiche Zunahme der β-Galactosidaseaktivität, somit war die Induktion auf

allen drei N-Quellen gleich. Der an den Nit2p-Bindungsstellen mutierte YNR002c-NIT2-4-

Promotor zeigte mit Ammoniumsulfat oder Glutamat als N-Quelle eine ähnliche Zunahme der

β-Galactosidaseaktivität wie der Ausgangspromotor. Stand den Zellen allerdings nur eine

sekundäre Stickstoffquelle in Form von Prolin zur Verfügung, so wurde die Zunahme der

Aktivität der β-Galactosidase geringer. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die mögli-

chen Nit2p-Bindungsstellen im Promotor von YNR002c funktionell sind und dieses Gen wäh-

rend der Verwertung sekundärer Stickstoffquellen eine Rolle spielen könnte.

3.3.10 Expression von β-Galactosidase unter der Kontrolle der Promotoren von YCR010c, YDR384c und YNR002c im Vergleich zu GPR1

Creuzburg (2002) und Dillschneider (2003) untersuchten in ihren Arbeiten die Regulation der

Promotoren von YCR010c, YDR384c und YNR002c durch verschiedene C-Quellen mittels

lacZ-Reportergenanalysen. In Y. lipolytica wurde von Augstein (2001) auf diese Weise eben-

falls die Regulation des GPR1B-Promotors aus dem Stamm PO1d getestet. In Abb. 23 sind

die erhaltenen Ergebnisse miteinander verglichen.

050

100150200250300350

ohne

C-Q

uelle

Glu

cose

Gly

cero

l

Ace

tat

Ace

tat/

Glu

cose

Eth

anol

Eth

anol

/ Glu

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Öls

äure

Lact

at

β-G

alac

tosi

dase

aktiv

ität i

n M

U

pGPR1pYCR010cpYDR384cpYNR002c

Abb. 23: Expression des LacZ-Gens unter Kontrolle des GPR1B-Promotors in Y. lipolytica (PO1d) und des YCR010c-, YDR384c- bzw. YNR002c-Promotors in S. cerevisiae (YN) in Abhängigkeit von der C-Quelle im Medium. Es wurde jeweils die Ma-ximalexpression nach 4,5 – 10 h Kultivierung dargestellt (Creuzburg, 2002; Dillschneider, 2003).

Ergebnisse

84

Die drei homologen Gene in S. cerevisiae werden durch verschiedene Kohlenstoffquellen

reguliert. So werden YCR010c und YNR002c durch Ethanol stark induziert, ebenso erfolgt

eine Induktion von YCR010c durch Glycerol. Das Gen YCR010c wird durch Glucose voll-

ständig reprimiert.

Im Gegensatz zu dem GPR1-Gen der Hefe Y. lipolytica werden die orthologen Gene

YCR010c, YDR384c und YNR002c in S. cerevisiae durch Acetat und Lactat nur schwach

induziert.

Weiterhin wurde von Creuzburg (2002) und Dillschneider (2003) untersucht, ob die drei Ho-

mologen in S. cerevisiae in ihrer Expression voneinander abhängig reguliert werden. Es

wurden die β-Galactosidaseaktivitäten unter Kontrolle der Promotoren YCR010c, YDR384c

und YNR002c im Wildtypstamm mit denen in den Deletionsstämmen verglichen. In diesen

Untersuchungen konnten keine Unterschiede der Aktivitäten der β-Galactosidase zwischen

den Stämmen festgestellt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die Homologen

YCR010c, YDR384c und YNR002c voneinander unabhängig reguliert werden.

3.3.11 Expression der mit HA getagten Homologen Ycr010cp und Ynr002cp

Da kein Antikörper gegen Ycr010cp zur Verfügung stand, wurde dieses Protein und die an-

deren beiden Homologen Ydr384cp und Ynr002cp C-terminal mit dem HA-Tag (3 x HA) fusi-

oniert, um sie immunologisch nachweisen zu können. Zur Überprüfung, ob die Funktion von

Ycr010cp und Ynr002cp durch die HA-Fusion beeinträchtigt wird, wurden ebenfalls die Mu-

tantenallele Ycr010cp-Q75, Ycr010cp-D259, Ynr002cp-Q74 und Ynr002cp-D259 mit 3 x HA

fusioniert. Das Wachstum der Transformanden wurde auf Minimalmediumplatten mit Acetat

getestet. Der Mutantenphänotyp wurde in allen Konstrukten durch die HA-Fusion aufgeho-

ben, d. h. diese Transfomanden waren in der Lage auf Medium mit Essigsäure zu wachsen

(Daten nicht gezeigt).

Eine Möglichkeit für das Wachstum der mit 3 x HA fusionierten Mutantenkonstrukte auf MA

wäre, dass diese Fusionsproteine nicht mehr in gebildet oder schnell abgebaut werden. Dies

wurde im folgenden Western-Blot überprüft. Die Analyse der Proben erfolgte im Western-Blot

mit anti-HA-AK. Die Ergebnisse (Western-Blot und Ponceau-S gefärbte PVDF-Membran) der

Expressionen im Stamm YN sind in Abb. 24 dargestellt.

Aus Abb. 24 geht hervor, dass im Stamm YN alle HA-Fusionsproteine gebildet wurden. Dies

traf ebenfalls für diese Konstrukte im Stamm YNΔycrΔydrΔynr zu (Daten nicht gezeigt). Es

war kein Unterschied in der Expressionsstärke zwischen Ycr010cp-HA und dem mit HA ge-

tagten mutierten Proteinen festzustellen. Auch im Falle von Ynr002cp gab es bezüglich der

Expressionsstärke keine Unterschiede. Ynr002cp-HA wurde aus unbekannter Ursache auf

Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle (pH4) stärker exprimiert als Ycr010cp-HA.

Ergebnisse

85

Abb. 24: Expression der Konstrukte von A) Ycr010cp-HA, D) Ynr002cp-HA sowie deren

Mutationen B) Ycr010cp-Q75-HA, C) Ycr010cp-D259-HA, E) Ynr002cp-Q74-HA und F) Ynr002cp-D259-HA im Stamm YN. Die Transformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, die Zellen einmal mit 1 x Readersalzen gewa-schen und die Hauptkulturen in Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle (pH4) überführt (OD600 = 2). Es wurden nach 2 bzw. 3 h 50 ml Probe genommen und die Zellen aufgeschlossen. Die Analyse der Proben erfolgte im Western-Blot mit anti-HA-AK. Dargestellt sind die entwickelten Western-Blots sowie die mit Ponceau-S gefärbten PVDF-Membranen.

3.3.12 Auftreten der drei Gpr1p-Orthologen in unterschiedlichen Formen

Die Auftrennung von Zellextrakten Ycr010cp-HA, Ydr384cp-HA bzw. Ynr002cp-HA exprimie-

render Zellen in der SDS-PAGE (Maxigele) ermöglichte die Separation von zwei (Ycr010cp-

HA, Ynr002cp-HA) bzw. mehreren (Ydr384cp-HA) verschieden großen Banden. Die Doppel-

banden von Ycr010cp-HA und Ynr002cp-HA liefen beide etwas schneller (bei einer Größe

von ca. 30 kDa) als ihre berechnete Größe von 34,2 kDa. Unterhalb von 26 kDa konnten die

vier Banden des Ydr384c-HA-Proteins detektiert werden. Somit lief dieses Protein ebenfalls

schneller als erwartet.

In den folgenden zwei Kapiteln sollte näher untersucht werden, ob und um welche Modifizie-

rung es sich bei diesen Banden handelt.

3.3.12.1 Deglycosylierung

Es könnte sich bei den größeren der Banden um die glycolysierte Form des jeweiligen Prote-

ins handeln. Diese Möglichkeit wurde mit Hilfe der Endoglycosidase H überprüft. Nach der

Auftrennung der mit Endoglycosidase H behandelten Proben konnte kein Unterschied zu

unbehandelten Proben (Kontrollen) im Bandenmuster festgestellt werden (Daten nicht ge-

zeigt).

2h 2h2h 2h2h 2h3h 3h 3h 3h 3h 3h

A B C D E F

2h 2h2h 2h2h 2h3h 3h 3h 3h 3h 3h

A B C D E F

Ergebnisse

86

3.3.12.2 Dephosphorylierung

Weiterhin wäre es möglich, dass Ycr010cp-HA, Ydr384cp-HA und Ynr002cp-HA phosphory-

liert werden. Um dies zu überprüfen wurden die entsprechenden Zellextrakte mit λ-Protein-

Phosphatase behandelt. Als Positivkontrolle wurde PO1d/pTSC1-HA mitgeführt. Diese

Transformande kodierte für Gpr1p-HA. Die Analyse fand mit Hilfe eines Western-Blots statt,

der in Abb. 25 dargestellt ist.

Abb. 25: Behandlung von Ycr010cp-HA, Ydr384cp-HA und Ynr002cp-HA mit λ-PPase. Gpr1p-HA aus der Hefe Y. lipolytica diente als Positivkontrolle. Die Kultivierung der Transformanden des Stammes YN erfolgte in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle, die Zellen wurden nach 2 h bis 3 h geerntet. Der Stamm PO1d/pTSC1-HA wurde üN in MMG-Medium geschüttelt und die Zellen in frisches MMG-Flüssigmedium überführt. Nach 2 bis 4 h Kultivierung wurde 30 mM Acetat zuge-geben, die Zellen nach 2 h weiterer Kultivierung geerntet und aufgeschlossen. Die Analyse der Proben erfolgte im Western-Blot mit anti-HA-AK. In den Spuren sind folgende Ansätze aufgetragen: a) Proteinextrakt eingefroren, b) Proteinextrakt bei 30 °C inkubiert, c) Dephosphorylierungsansatz mit λ-PPase, d) Dephosphorylie-rungsansatz ohne λ-PPase.

Der Kontrollansatz von Gpr1p-HA zeigte, dass Gpr1p-HA zum Teil in phosphorylierter Form

vorlag, die höhermolekulare Bande verschwand nach Zugabe von λ-PPase im Dephosphory-

lierungsansatz. Wurde im Dephosphorylierungsansatz keine λ-PPase zugegeben, so kam es

nicht zur Umwandlung der höhermolekularen Bande.

Im Falle von Ycr010cp-HA und Ydr384cp-HA konnte nach Behandlung mit λ-PPase keine

Veränderung im Bandenmuster festgestellt werden. Wurde der Ynr002cp-HA enthaltende

Proteinextrakt mit λ-PPase behandelt, so verschwand die höhermolekulare Bande. Somit ist

diese höhermolekulare Bande von Ycr010cp durch eine Phosphorylierung des Proteins be-

dingt. Nach Zugabe von Puffer und MnCl2 (Kofaktor der λ-PPase) kam es ebenfalls fast zur

vollständigen Umwandlung der höhermolekularen Form. In diesem Ansatz wurden offen-

sichtlich zelluläre Phosphatasen aktiviert, die das Ynr002c-Protein dephosphorylierten.

Für das Ycr10c-Protein konnte keine Modifizierung durch Phosphorylierung nachgewiesen

werden. Es sollte somit überprüft werden, ob es sich bei den beiden mit dem anti-HA-AK

Ycr010cp-HA Ynr002cp-HAYdr384cp-HA Gpr1p-HA

a a a ab b b bc c c cd d d d

Ycr010cp-HA Ynr002cp-HAYdr384cp-HA Gpr1p-HA

a a a ab b b bc c c cd d d d

Ergebnisse

87

detektierten Banden um das mit HA getagte Ycr010cp handelte. Die Proteinextrakte der

Stämme YN und YN/p416YCR-HA wurden im Western-Blot mittels anti-HA-AK und anti-

Ycr10cp-AK (vgl. Kapitel 3.3.14) analysiert (Abb. 26).

Abb. 26: Analyse von Proteinextrakten mit dem anti-HA-AK bzw. anti-Ycr010cp-AK. Die Stämme wurden üN in MG-Flüssigmedium kultiviert. Nach dem einmaligen Wa-schen der Zellen in 1 x Readersalzen, wurden die Hauptkulturen in Minimalmedi-um mit Ethanol angeimpft. Die Zellen wurden nach 2 bis 3 h geerntet und aufge-schlossen. Die Analyse der Proteinproben erfolgte im Western-Blot mit anti-HA-AK (1) bzw.anti-Ycr010cp-AK (2). A) YN/Ycr010cp-HA, B) YN.

Mit Hilfe des anti-Ycr010cp-AK konnten beide Banden, die auch durch den anti-HA-AK

nachgewiesen wurden, detektiert werden. Weiterhin trat in den Stämmen YN/p416YCR-HA

und YN eine weitere Bande im Bereich von 26 kDa auf, bei der es sich um das chromosomal

kodierte Ycr010cp handelte. Hier handelte es sich allerdings um keine Doppelbande.

3.3.13 Expression der Gpr1p-Orthologen in Saccharomyces cerevisiae

Creuzburg (2002) und Dillschneider (2003) befassten sich mit der Regulierung der Promoto-

ren von YCR010c, YDR384c und YNR002c durch verschiedene C-Quellen im Medium. Da-

bei wurde die β-Galactosidaseaktivität unter der Kontrolle dieser Promotoren gemessen (vgl.

Kapitel 3.3.10).

Die Expressionen der drei Homologen sollten in Northern- und Western-Blots genauer ana-

lysiert werden, da die Werte aus den Aktivitätsmessungen der β-Galaktosidase keine Rück-

schlüsse auf die tatsächlich gebildeten RNA- und Proteinmengen zulassen.

Für die Probennahme zur Northern-Blot-Analyse wurden alle Hauptkulturen mit einer OD600

von 0,1 angeimpft. Aus versuchstechnischen Gründen (Gewinnung von genügend Zellmate-

37,1 kDa

25,9 kDa

19,4 kDa

A A B

1 2

37,1 kDa

25,9 kDa

19,4 kDa

A A B

1 2

Ergebnisse

88

rial zur Proteinpräparation) wurden Hauptkulturen, die zur Probennahme für die Western-

Blot-Analysen dienten, mit einer höheren OD600 von 0,7 bzw. 1,4 gestartet.

3.3.13.1 Expressionsverlauf in Minimalmedium mit Glucose

Am Beginn der Untersuchungen der Expression der GPR1-Orthomologen YCR010c,

YDR384c und YNR002c stellte sich die Frage, wie der Verlauf der Expressionen während

des Wachstums der Zellen auf Minimalmedium mit Glucose ist. Dies wurde mittels eines

Northern-Blots überprüft, dessen Ergebnis in Abb. 27 dargestellt ist.

Abb. 27: Expression von YCR010c, YDR384c und YNR002c im Stamm YN während der

Kultivierung in Minimalmedium mit Glucose als C-Quelle. Die Vorkultur wurde üN in MG-Flüssigmedim geschüttelt, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und die Hauptkultur mit einer OD600 von 0,1 angeimpft. Zu den angegebenen Zeitpunk-ten [a) 0 h, b) 0,5 h, c) 1 h, d) 1,5 h, e) 2 h, f) 2,5 h, g) 3 h, h) 4 h, i) 6 h, k) 8 h, l) 10 h, m) 12 h, n) 24 h] wurden 30 - 50 ml Probe genommen, die Zellen abzentri-fugiert und die RNA präpariert. In A) ist die Wachstumskurve und in B) die entwi-ckelten Northern-Blots dargestellt. Der Pfeil markiert den Zeitpunkt der Abnahme der Expression von YDR384c.

YCR010c

YDR384c

YNR002c

18S RNA

Wachstum auf Minimalmedium mit Glucose

00,5

1

1,5

22,5

3

0 5 10 15 20 25

Zeit in Stunden

OD

600

YN

Abnahme der Expression von YDR384c

A

Ba b c d e f g h i k l m n

YCR010c

YDR384c

YNR002c

18S RNA

Wachstum auf Minimalmedium mit Glucose

00,5

1

1,5

22,5

3

0 5 10 15 20 25

Zeit in Stunden

OD

600

YN

Abnahme der Expression von YDR384c

A

Ba b c d e f g h i k l m n

Ergebnisse

89

Die Ergebnisse des Northern-Blots zeigen, dass alle drei Homologen in S. cerevisiae wäh-

rend der Kultivierung auf Minimalmedium mit Glucose als C-Quelle zu unterschiedlichen Zei-

ten exprimiert wurden. Zum Zeitpunkt 0 h war die Expression aller drei Homologen sehr

hoch, aber schon nach einer halben Stunde nahm diese ab. Für YCR010c ließ sich keine

Expression mehr nachweisen, im Falle von YNR002c war eine sehr geringe Expression

nachweisbar, die bis 12 h auf dem gleichen Level blieb. YDR384c verhielt sich dagegen an-

ders, hier war die Expression bis zum Zeitpunkt von 8 h detektierbar und nahm ab dem Be-

ginn des logarithmischen Wachstums ab. Nach 24 h konnte für alle drei Homologen eine

unterschiedlich starke Expression (YDR384c < YCR010c < YNR002c) nachgewiesen wer-

den.

Die im Northern-Blot gewonnenen Daten sollten für die HA-getagten Proteine im Western-

Blot überprüft werden. In Abb. 28 ist die Wachstumskurve der mit einer OD600 = 0,7 ange-

impften Stämme und Analyse der Proteinproben dargestellt. Die mit einer OD600 von 1,4 an-

geimpften Stämme zeigten die gleichen Ergebnisse (Daten nicht gezeigt).

Ergebnisse

90

Abb. 28: Expression der mit dem HA-Tag fusionierten Homologen Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp im Stamm YN während des Wachstums (0 – 12 h, 24 h) der Trans-formanden in Minimalmedium mit Glucose als C-Quelle. Die Vorkulturen wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und die Hauptkultur mit einer OD600 von ca. 0,7 angeimpft. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden jeweils 50 ml Kultur entnommen, die Zellen abzentrifugiert und aufgeschlossen. In A) sind die Wachstumskurven und in B) die entwickelten Western-Blots mit den Ponceau-S gefärbten PVDF-Membranen gezeigt.

Im Western-Blot konnte zum Zeitpunkt 0 h für Ycr010cp-HA nur eine sehr geringe Expressi-

on detektiert werden. Ab 0,5 h war bis einschließlich 12 h keine Expression mehr nachweis-

bar. Im Gegensatz dazu wurde im Northern-Blot zum Zeitpunkt von 0 h RNA nachgewiesen.

Dies deutet auf eine posttranslationale Regulation von YCR010c hin. Im Falle von Ydr384cp-

HA konnte vom Beginn des Versuches bis einschließlich 4 h das Protein nachgewiesen wer-

den, zum Zeitpunkt von 6 h (Beginn der exponentiellen Wachstumsphase) war es nur noch

schwach detektierbar. Ynr002cp-HA war bis zu 0,5 h gut detektierbar, danach war die Ex-

pression des Proteins nur noch sehr schwach. Alle drei HA-getagten Homologen konnten

zum Zeitpunkt von 24 h sehr gut nachgewiesen werden, allerdings in unterschiedlicher Ex-

pressionsstärke (YDR384c < YCR010c < YNR002c).

Im Western-Blot konnten nach 24 h alle drei homologen Proteine nachgewiesen werden,

dagegen war im Northern-Blot keine Expression von YDR384c bzw. im Falle von YNR002c

Ycr010cp-HA

Ydr384cp-HA

Ynr002cp-HA

0h 0,5h 1h 1,5h 2h 2,5h 3h 4h 6h 8h 10h 12h 24h

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25

t in h

OD

600 YN/p416YCR-HA

YN/p416YDR-HAYN/p416YNR-HA

Ydr384cp-HA nichtmehr nachweisbar

A

BYcr010cp-HA

Ydr384cp-HA

Ynr002cp-HA

0h 0,5h 1h 1,5h 2h 2,5h 3h 4h 6h 8h 10h 12h 24h

Ycr010cp-HA

Ydr384cp-HA

Ynr002cp-HA

0h 0,5h 1h 1,5h 2h 2,5h 3h 4h 6h 8h 10h 12h 24h

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25

t in h

OD

600 YN/p416YCR-HA

YN/p416YDR-HAYN/p416YNR-HA

Ydr384cp-HA nichtmehr nachweisbar

A

B

Ergebnisse

91

nur eine sehr schwache Expression nachweisbar. Wiederholungen beider Versuche bestätig-

ten diese Ergebnisse. Dies deutet darauf hin, dass die mRNA dieser beiden Gene mögli-

cherweise einem schnellen Abbau unterliegt.

Zum Zeitpunkt von 12 h war keine Expression der drei Homologen feststellbar, nach 24 h

wurden sie dagegen wieder exprimiert. Im folgenden Versuch sollte nun abgeklärt werden,

ab welchem Zeitpunkt die Expression wieder einsetzt und ob dies eventuell von der zur Ver-

fügung stehenden Glucosemenge oder von der Wachstumsphase abhängig ist. Die Wachs-

tumskurven der mit einer OD600 von 0,7 angeimpften Hauptkulturen und Ergebnisse der

Western-Blots sind in Abb. 29 dargestellt.

Abb. 29: Expression der mit dem HA-Tag fusionierten Homologen Ycr010cp, Ydr384cp

und Ynr002cp im Stamm YN während des Wachstums (0 h, 12 – 24 h) der Trans-formanden in Minimalmedium mit Glucose als C-Quelle. Die Vorkulturen wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und von diesen die Hauptkultur mit einer OD600 von ca. 0,7 angeimpft. Zu den an-gegebenen Zeitpunkten wurden jeweils 50 ml Kultur entnommen, die Zellen ab-zentrifugiert und aufgeschlossen. In A) sind die Wachstumskurven und in B) die entwickelten Western-Blots mit den Ponceau-S gefärbten PVDF-Membranen ge-zeigt. Die Pfeile markieren den Zeitpunkt an dem keine Glucose mehr im Medium nachweisbar war.

0h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h

Ycr010cp-HA

Ydr384cp-HA

Ynr002cp-HA

Zeitpunkt, ab dem keine Glucose im Mediumnachweisbar war

A

B

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25

t in h

OD

600 YN/p416YCR-HA

YN/p416YDR-HA

YN/p416YNR-HA

0h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h

Ycr010cp-HA

Ydr384cp-HA

Ynr002cp-HA


A

B

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25

t in h

OD

600 YN/p416YCR-HA

YN/p416YDR-HA

YN/p416YNR-HA

Ergebnisse

92

Zum Zeitpunkt 0 h war die Expression alle drei Homologen nachweisbar, nach 12 h konnte

keine Expression mehr detektiert werden. Im Falle der Kultivierung von YN/p416YCR-HA

und YN/p416YNR-HA war nach 18 h keine Glucose im Medium mehr vorhanden. Zu diesem

Zeitpunkt wurde Ynr002cp-HA wieder exprimiert, die Bildung von Ycr002cp-HA konnte etwas

später (nach 20 h) nachgewiesen werden.

Wurden die Hauptkulturen mit einer OD600 von 1,4 angeimpft, so konnten diese Ergebnisse

bestätigt werden (Daten nicht gezeigt). Zum Zeitpunkt 0 h konnten ebenfalls Expressionen

nachgewiesen werden, nach 12 h war keine Expression der HA-getagten Proteine mehr vor-

handen. Allerdings kam es aufgrund der höheren Zellzahl im Medium zu einem schnelleren

Verbrauch der Glucose, und die Expression der Homologen war eher nachweisbar. Nach

16 h war keine Glucose mehr im Medium nachweisbar, Ycr010cp-HA und Ynr002cp-HA

wurden ab diesem Zeitpunkt bis 24 h exprimiert. Die Expression von Ydr384cp-HA war nicht

nur von der zur Verfügung stehenden Glucose, sondern auch von der Wachstumsphase ab-

hängig (Abb. 30).

Wurde die Hauptkultur mit einer OD600 von 0,7 angeimpft, so konnte zum Zeitpunkt 0 und

nach 22 – 24 h eine Expression von Ydr384cp-HA nachgewiesen werden. Glucose war ab

22 h nicht mehr im Medium nachweisbar. Beträgt die Start-OD600 dagegen 1,4 so konnte

nach 0 und 16 – 20 h eine Expression detektiert werden, danach war keine Expression mehr

nachweisbar. Die Glucose war nach 18 h im Medium verbraucht. Daraus lässt sich schluss-

folgern, dass das Ydr384c-Protein kurz nach dem Beginn der stationären Phase wieder ge-

bildet wurde, allerdings nur für einen kurzen Zeitraum (4 bis 5 h).

Ergebnisse

93

Abb. 30: Expression des mit dem HA-Tag fusionierten Ydr384cp im Stamm YN während des Wachstums der Transformanden in Minimalmedium mit Glucose. Die Vorkul-turen wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und die Hauptkulturen mit unterschiedlichen OD600 (1: OD600 = 0,7/ 2: OD600 = 1,4) angeimpft. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden jeweils 50 ml Kultur entnommen, die Zellen abzentrifugiert und aufgeschlossen. In A) sind die Wachstumskurven und in B) die entwickelten Western-Blots mit den Ponceau-S gefärbten Membranen dargestellt. Die Pfeile markieren den Zeitpunkt, an dem keine Glucose mehr im Medium nachweisbar war.

3.3.13.2 Expression in Minimalmedium mit verschiedenen C-Quellen

Weiterhin sollte die Induktion der Expression der Homologen durch ausgewählte C-Quellen

untersucht werden. Zu diesem Zeitpunkt waren Acetat und Ethanol als Hauptinduktoren für

die GPR1-Expression bekannt (Augstein, 2001), deshalb wurde die Expression, neben Mi-

nimalmedium ohne C-Quelle, auf diesen beiden C-Quellen untersucht.

Der Stamm YN wurde 4 h auf Minimalmedium mit Glucose kultiviert, welche die Expression

der Homologen reprimiert. Danach wurden die Zellen in Minimalmedium mit unterschied-

lichen C-Quellen umgesetzt. Die Ergebnisse der Northern-Blots sind in Abb. 31 dargestellt.

Ydr384cp-HA(1)

0

1

23

4

5

6

7

8

0 10 20 30

t in h

OD6

00 YN/p416YDR-HA(1)YN/p416YDR-HA(2)

0h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h

Ydr384cp-HA(2)


A

B

Ydr384cp-HA(1)

0

1

23

4

5

6

7

8

0 10 20 30

t in h

OD6

00 YN/p416YDR-HA(1)YN/p416YDR-HA(2)

0h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h

Ydr384cp-HA(2)


A

B

Ergebnisse

94

Abb. 31: Expression von YCR010c, YDR384c und YNR002c im Stamm YN. Die Zellen wurden üN bis zu einer OD600 von 0,1 in MG-Flüssigmedium kultiviert, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und eine weitere Vorkultur 4 h in MG-Medium ge-schüttelt. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und die Hauptkulturen mit einer OD600 von 0,1 angeimpft. Es wurden 50 ml Probe von der zweiten Vorkultur (VK) und zu den angegebenen Zeiten von den Hauptkulturen jeweils 50 ml Probe genommen und die RNA isoliert. Die Ab-bildung zeigt den entwickelten Northern-Blot, der mit der YCR010c-, YDR384c- und YNR002c-Sonde beprobt wurde. Für den Vergleich der RNA-Konzentrationen diente die 18S RNA als Standard.

In der zweiten Vorkultur (VK) mit Glucose als C-Quelle konnte nur die RNA von YDR384c

nachgewiesen werden, von YCR010c und YNR002c konnte keine RNA detektiert werden.

Auf den ausgewählten C-Quellen Acetat bzw. Ethanol und Medium ohne C-Quelle wurden

alle drei Homologen exprimiert. Am stärksten wurden sie auf Minimalmedium mit Ethanol als

C-Quelle induziert. Am niedrigsten war die Expression aller drei Homologen auf Acetat. Die

Expressionsstärke auf Medium ohne C-Quelle lag zwischen der von Ethanol und Acetat,

YCR010c und YNR002c wurden etwa gleich stark induziert, die Expression von YDR384c

war dagegen etwas schwächer.

Im folgenden Versuch sollten die im Northern-Blot gewonnenen Daten im Western-Blot auf

Proteinebene überprüft werden. Es wurde die Expression der mit dem HA-Tag fusionierten

Proteine Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp im Stamm YN analysiert. Die Ergebnisse der

entwickelten Western-Blots sind in Abb. 32 dargestellt.

YCR010c

YDR384c

YNR002c

18S RNA

Acetat Ethanol ohne C-Quelle

0h 1h 2h 3h 4h 20h 0h 1h 2h 3h 4h 20h 0h 1h 2h 3h 4h 20hVK

YCR010c

YDR384c

YNR002c

18S RNA


0h 1h 2h 3h 4h 20h 0h 1h 2h 3h 4h 20h 0h 1h 2h 3h 4h 20h


0h 1h 2h 3h 4h 20h 0h 1h 2h 3h 4h 20h 0h 1h 2h 3h 4h 20hVK

Ergebnisse

95

Abb. 32: Expression der mit dem HA-Tag fusionierten Homologen Ycr010cp, Ydr384cp

und Ynr002cp im Stamm YN in Minimalmedium mit Acetat bzw. Ethanol als C-Quelle oder ohne C-Quelle. Die Vorkulturen wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und von diesen die Haupt-kultur mit einer OD600 von ca. 0,7 angeimpft. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden jeweils 50 ml Kultur entnommen, die Zellen abzentrifugiert und aufge-schlossen. Es sind die entwickelten Western-Blots mit den Ponceau-S gefärbten PVDF-Membranen dargestellt.

Im Western-Blot konnte ebenfalls auf allen ausgewählten C-Quellen eine Expression der

Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae festgestellt werden. Auf Minimalmedium mit Ethanol als

C-Quelle war die Expression von Ydr384cp-HA allerdings schwächer als die von Ycr010cp-

HA und Ynr002cp-HA. Im Northern-Blot konnte dies nicht beobachtet werden. In Wiederho-

lungen der Versuche konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Am wenigsten Protein

wurde im Falle von Ycr010cp-HA und Ynr002cp-HA auf Acetat gebildet. Die Expression von

Ydr384cp-HA nahm dagegen nach 4 h zu. Diese Daten stimmen mit den Northern-Blots ü-

berein. Auf Minimalmedium ohne C-Quelle wurden alle drei Proteine etwa gleich stark gebil-

det. Im Northern-Blot wurde allerdings weniger RNA von YDR384c gebildet als von den an-

deren beiden Genen.

3.3.13.3 Expression in Minimalmedium mit verschiedenen pH-Werten

Es wurde in Vorversuchen festgestellt, dass die Expression der Homologen in Minimalmedi-

um mit Acetat als C-Quelle abhängig vom pH-Wert im Medium war (Daten nicht gezeigt).

Dies könnte zwei Ursachen haben. Einerseits könnte die Konzentration der undissoziierten

Essigsäure, deren Konzentration abhängig vom pH-Wert ist, für die unterschiedliche Expres-

sionsstärke verantwortlich sein. Andererseits könnten diese Unterschiede auch im pH-Wert

des Mediums begründet liegen.

Ydr384cp-HA

Ynr002cp-HA

Ycr010cp-HA


20h0h 3h 4h2h1h 20h0h 3h 4h2h1h 20h0h 3h 4h2h1h

Ydr384cp-HAYdr384cp-HA

Ynr002cp-HAYnr002cp-HA

Ycr010cp-HA


20h0h 3h 4h2h1h 20h0h 3h 4h2h1h 20h0h 3h 4h2h1h

Ycr010cp-HA


20h0h 3h 4h2h1h 20h0h 3h 4h2h1h 20h0h 3h 4h2h1h 20h0h 3h 4h2h1h 20h0h 3h 4h2h1h 20h0h 3h 4h2h1h

Ergebnisse

96

Diese Möglichkeiten sollten im folgenden Versuch abgeklärt werden. Die Transformanden

wurden auf verschiedenen C-Quellen und unterschiedlichen pH-Werten kultiviert. Die Ergeb-

nisse des Western-Blots sind in Abb. 33 dargestellt.

Wurden die mit dem HA-Tag fusionierten Homologen auf Minimalmedium mit Glucose, Etha-

nol oder ohne C-Quelle kultiviert, so konnten keine Unterschiede in deren Expression festge-

stellt werden. Somit hat der pH-Wert keinen Einfluss auf die Expression. Bei der Kultivierung

auf Acetat als C-Quelle mit verschiedenen pH-Werten des Minimalmediums gab es aller-

dings Unterschiede in deren Expression. Je niedriger der pH-Wert des Mediums war, desto

niedriger fiel auch die Expression der drei Homologen aus. Dabei wird die Expression von

Ydr384cp-HA weniger durch niedrigeren pH-Wert beeinflusst als die Expression von

Ycr010cp und Ynr002cp.

Abb. 33: Expression der mit dem HA-Tag fusionierten Homologen Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp im Stamm YN in Abhängigkeit vom pH-Wert des Mediums. Die Vorkulturen wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, einmal mit 1 x Reader-salzen gewaschen und von diesen die Hauptkultur mit einer OD600 von ca. 2 an-geimpft. Es erfolgte eine Kultivierung auf verschiedenen C-Quellen (Glucose, Acetat, Ethanol) und ohne C-Quelle sowie unterschiedlichen pH-Werten (pH = 4,0, 5,5 oder 6,0) des Mediums. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden jeweils 50 ml Kultur entnommen, die Zellen abzentrifugiert und aufgeschlossen. Die Abbildung zeigt die entwickelten Western-Blots mit den Ponceau-S gefärbten PVDF-Membranen.

Glucose

Ycr010cp-HA

Ynr002cp-HA

Ydr384cp-HA

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

Acetat

Ycr010cp-HA

Ynr002cp-HA

Ydr384cp-HA

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

Ethanol

Ycr010cp-HA

Ynr002cp-HA

Ydr384cp-HA

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

ohne C-Quelle

Ycr010cp-HA

Ynr002cp-HA

Ydr384cp-HA

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

Glucose

Ycr010cp-HA

Ynr002cp-HA

Ydr384cp-HA

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

Acetat

Ycr010cp-HA

Ynr002cp-HA

Ydr384cp-HA

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

Ethanol

Ycr010cp-HA

Ynr002cp-HA

Ydr384cp-HA

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

ohne C-Quelle

Ycr010cp-HA

Ynr002cp-HA

Ydr384cp-HA

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

2h 2h 2h3h 3h 3h

pH4,0 pH5,5 pH6,0

Ergebnisse

97

3.3.13.4 Expression in Minimalmedium mit verschiedenen Essigsäurekonzentratio-nen

Im vorhergehenden Versuch wurde festgestellt, dass bei der Kultivierung in Minimalmedium

mit unterschiedlichen pH-Werten und Acetat als C-Quelle die Expression der mit dem HA-

Tag fusionierten Homologen unterschiedlich war. In Medium mit höherem pH-Wert (pH5,5

oder 6,0) war die Expression der Homologen höher als bei der Kultivierung in Medium mit

einem pH-Wert von 4,0. Diese Unterschiede könnten einerseits durch die unterschiedlichen

Mengen an Essigsäure hervorgerufen werden. Andererseits wäre es möglich, dass der pH-

Wert nur bei der Kultivierung auf Acetat als C-Quelle einen Einfluss auf die Expression hat.

Dies sollte im folgenden Versuch abgeklärt werden. Die Transformanden wurden auf Mini-

malmedium mit unterschiedlichen Konzentrationen an Essigsäure bei einem pH-Wert von 4

kultiviert und Ycr010cp-HA, Ydr384cp-HA sowie Ynr002cp-HA im Western-Blot analysiert

(Abb. 34).

Abb. 34: Einfluss der Essigsäurekonzentration im Medium auf die Expression von Ycr010cp-HA, Ydr384cp-HA und Ynr002cp-HA in den Stämmen YN/p416YCR-HA, YN/p416YDR-HA und YN/p416YNR-HA. Die Transformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und an-schließend in Minimalmedium mit unterschiedlichen Acetatkonzentrationen bei pH4 kuliviert (OD600 = 2). Nach 2 bzw. 3 h wurden 50 ml Probe genommen und die Zellen aufgeschlossen. In der Abbildung sind die entwickelten Western-Blots und die mit Ponceau-S gefärbten PVDF-Membranen dargestellt.

Alle drei Proteine zeigten eine Abhängigkeit ihrer Expressionsstärke von der Konzentration

der Essigsäure im Medium, je höher die Konzentration war, desto niedriger war die Expres-

sion dieser Proteine. Die Essigsäurekonzentration beeinflusst die Expression der Homologen

Ycr010cp-HA

Ynr002cp-HA

Ydr384cp-HA

50 40 30 25 20 0

2h 2h 2h 2h 2h 2h3h 3h 3h 3h 3h 3h

50 40 35 30 15 7,5 0

2h 2h 2h 2h 2h 2h 2h3h 3h 3h 3h 3h 3h 3h

50 40 35 30 25 20 015

2h 2h 2h 2h 2h 2h 2h 2h3h 3h 3h 3h 3h 3h 3h 3h

mM Acetat

mM Acetat

mM Acetat

Ycr010cp-HA

Ynr002cp-HA

Ydr384cp-HA

50 40 30 25 20 0

2h 2h 2h 2h 2h 2h3h 3h 3h 3h 3h 3h

50 40 35 30 15 7,5 0

2h 2h 2h 2h 2h 2h 2h3h 3h 3h 3h 3h 3h 3h

50 40 35 30 25 20 015

2h 2h 2h 2h 2h 2h 2h 2h3h 3h 3h 3h 3h 3h 3h 3h

mM Acetat

mM Acetat

mM Acetat

Ergebnisse

98

unterschiedlich. Am stärksten wird die Expression von Ycr010cp-HA durch höhere Essigsäu-

rekonzentrationen verringert, ab einer Konzentration von 15 mM Essigsäure im Medium war

die Expression geringer. Enthielt das Medium 30 mM Essigsäure war die Expression dras-

tisch reduziert und bei einer Konzentration von 50 mM konnte kein Ycr010cp-HA mehr nach-

gewiesen werden. Die Expressionen von Ydr84cp-HA und Ynr002cp-HA wurden dagegen

weniger stark beeinflusst. Bis zu einer Konzentration von 15 mM Essigsäure konnte im Ver-

gleich zu 0 mM kein Unterschied festgestellt werden, ab 30 mM waren die Expressionen et-

was geringer.

Wurde zum Minimalmedium 50 mM Essigsäure zugegeben so war die Expression der

Gpr1p-Orthologen deutlich schwächer bzw. nicht mehr nachweisbar. Diese geringeren Ex-

pressionen könnten daran liegen, dass diese Konzentrationen von Essigsäure für die Zellen

toxisch sind und somit keine Proteine mehr gebildet werden. Im folgenden Versuch erfolgte

die Überprüfung der Toxizität von Essigsäure auf S. cerevisiae. Dafür wurden die Transfor-

manden auf Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen an Essigsäure getropft und das

Wachstum beobachtet (Abb. 35).

Abb. 35: Vergleich des Wachstums von YN-Transformanden auf Minimalmedium mit un-terschiedlichen Acetatkonzentrationen (pH4). DieTransformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium kultiviert und die entsprechenden Zellmengen auf die Platten getropft. Die Platten wurden für mehrere Tage bei 28 °C inkubiert.

Die Transformanden wuchsen in Gegenwart von Glucose auf Minimalmedium mit Acetat in

unterschiedlichen Konzentrationen als C-Quelle genauso gut wie nur mit Glucose als

C-Quelle. Im Gegensatz dazu ist das Wachstum auf Minimalmediumplatten mit unterschied-

lichen Acetatkonzentrationen als C-Quelle schlechter. Bei einer Acetatkonzentration von

50 mM waren die Zellen nicht mehr in der Lage zu wachsen, somit war diese Konzentration

MA 35 mM MA 40 mM MA 50 mM

MAG 30 mM MAG 35 mM MAG 40 mM MAG 50 mM MG

MA 30 mM

YN/p416YCR-HA1 1 1 1 12 2 2 2 23 3 3 3 34 4 4 4 45 5 5 5 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 51 2 3 4 5 1 2 3 4 5

YN/p416YCR-HA

YN/p416YDR-HA

YN/p416YDR-HA

YN/p416YNR-HA

YN/p416YNR-HA


MA 35 mM MA 40 mM MA 50 mM

MAG 30 mM MAG 35 mM MAG 40 mM MAG 50 mM MG

MA 30 mM

YN/p416YCR-HA1 1 1 1 12 2 2 2 23 3 3 3 34 4 4 4 45 5 5 5 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 51 2 3 4 5 1 2 3 4 5

YN/p416YCR-HA

YN/p416YDR-HA

YN/p416YDR-HA

YN/p416YNR-HA

YN/p416YNR-HA


Ergebnisse

99

für die Zellen toxisch. Stand allerdings neben Acetat noch Glucose als C-Quelle zur Verfü-

gung, so hatten die getesteten Acetatkonzentrationen keinen toxischen Effekt auf die Zellen.

3.3.13.5 Expression der Homologen unter Stress

Bei der Kultivierung auf Minimalmedium mit unterschiedlichen C-Quellen zeigte sich, dass

die Gpr1p-Orthologen auf Medium ohne C-Quelle ebenfalls exprimiert wurden. Unter diesen

Bedingungen sind die Zellen Stress ausgesetzt, es stellte sich somit die Frage, ob eine Ex-

pression allein durch Stress hervorgerufen werden kann.

Für diese Untersuchungen wurden die Stämme W303, W303Δgis1 und W303Δmsn2Δmsn4

ausgewählt. In diesen Stämmen war GIS1 bzw. MSN2 und MSN4 deletiert. W303 war der

entsprechende Wildtypstamm zu diesen Mutantenstämmen.

Der Transkriptionsfaktor Gis1p ist notwendig, wenn eine Nährstofflimitation eintritt. Er indu-

ziert während des diauxischen Shifts Gene, die für das Überleben der Zelle benötigt werden

(Pedruzzi et al., 2000). Msn2p und Msn4p spielen als Transkriptionsfaktoren während ver-

schiedener Stressbedingungen eine Rolle (z. B. Osmostress, oxidativer Stress, N-Mangel,

schwache organische Säuren, hoher pH-Wert, Ethanol). Sie binden an STREs (stress

responsive element), deren Erkennungssequenzen im 5´-upstream-Bereich von Genen lie-

gen (Martinez-Pastor et al., 1996).

Abb. 36, Abb. 37 und Abb. 38 zeigen die Ergebnisse der Northern-Blots. In Tab. 20 sind die

Expressionsstärken der Homologen auf den verschiedenen C-Quellen zusammengefasst.

Aus dieser Tabelle ist zu entnehmen, dass die Expression von YCR010c auf Minimalmedium

mit Acetat bzw. ohne C-Quelle im Stamm W303Δmsn2Δmsn4 niedriger war als im Aus-

gangsstamm W303. Weiterhin verringerte sich die Expressionsstärke von YDR384c auf Mi-

nimalmedium mit Acetat als C-Quelle. Im Stamm W303Δgis1 kam es mit Ethanol als

C-Quelle zur Erhöhung der Expressionsstärke. Auf Minimalmedium mit Ethanol bzw. ohne

C-Quelle war die Expression von YDR384c geringer als im Wildtypstamm W303. Diese Da-

ten weisen darauf hin, dass YCR010c und YDR384c durch Stress reguliert werden. Die Re-

gulation von YNR002c ist dagegen Stress-unabhängig.

Ergebnisse

100

Acetat Ethanol ohne C-Quelle0h 1h 2h 3h 4h 20h 0h 1h 2h 3h 4h 20h 0h 1h 2h 3h 4h 20h

W303

W303Δmsn2Δmsn4

W303Δgis1

18S RNA

Expression von YCR010c

Abb. 36: Expression von YCR010c in den Stämmen W303, W303Δmsn2Δmsn4 und W303Δgis1 bei der Kultivierung in Minimalmedium mit Acetat bzw. Ethanol als C-Quelle oder ohne C-Quelle. Die Stämme wurden üN in Minimalmedium mit Glucose geschüttelt, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und die Hauptkultu-ren mit einer OD600 von 0,1 angeimpft. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden jeweils 50 ml Kultur entnommen, die Zellen abzentrifugiert und aufgeschlossen. Die Abbildung zeigt die entwickelten Northern-Blots, als Standard wurde die 18S RNA verwendet.



W303

W303Δmsn2Δmsn4

W303Δgis1

18S RNA

Expression von YDR384c

Abb. 37: Expression von YDR384c in den Stämmen W303, W303Δmsn2Δmsn4 und

W303Δgis1 bei der Kultivierung in Minimalmedium mit Acetat bzw. Ethanol als C-Quelle oder ohne C-Quelle. Die Stämme wurden üN in Minimalmedium mit Glucose geschüttelt, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und die Hauptkulu-ren mit einer OD600 von 0,1 angeimpft. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden jeweils 50 ml Kultur entnommen, die Zellen abzentrifugiert und aufgeschlossen. Die Abbildung zeigt die entwickelten Northern-Blots, als Standard wurde die 18S RNA verwendet.

Ergebnisse

101



W303

W303Δmsn2Δmsn4

W303Δgis1

18S RNA

Expression von YNR002c

Abb. 38: Expression von YNR002c in den Stämmen W303, W303Δmsn2Δmsn4 und W303Δgis1 bei der Kultivierung in Minimalmedium mit Acetat bzw. Ethanol als C-Quelle oder ohne C-Quelle. Die Stämme wurden üN in Minimalmedium mit Glucose geschüttelt, einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und die Hauptkulu-ren mit einer OD600 von 0,1 angeimpft. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden jeweils 50 ml Kultur entnommen, die Zellen abzentrifugiert und aufgeschlossen. Die Abbildung zeigt die entwickelten Northern-Blots, als Standard wurde die 18S RNA verwendet.

Tab. 20: Vergleich der Expression von YCR010c, YDR384c und YNR002c in den Stämmen

W303, W303Δmsn2Δmsn4 und W303Δgis1. Als Grundlage für diese Tabelle dien-ten die Daten der vorangegangenen Northern-Blots. Die Anzahl der „+“ steht für die Expressionsstärke. Veränderungen in der Stärke der Expression sind fett hervorge-hoben.

W303 W303Δmsn2Δmsn4 W303Δgis1 Acetat EtOH ohne

C-Quelle

Acetat EtOH ohne C-

Quelle

Acetat EtOH ohne C-

Quelle YCR010c + ++ ++ +/- ++ + + +++ ++ YDR384c ++ +++ + + +++ + ++ ++ +/- YNR002c +/- ++ ++ +/- ++ ++ +/- ++ ++

3.3.14 Herstellung von anti-Ycr010cp-Antikörpern

Die Herstellung von anti-Ycr010c-Antikörpern wurde von der Firma „Pineda“ übernommen.

Dafür wurde zuerst ein Peptid, bestehend aus den ersten 15 Aminosäuren von Ycr010cp,

synthetisiert. Dieses wurde als Antigen zur Antiserumproduktion eingesetzt. Dazu wurden

Kaninchen primär mit diesem Peptid immunisiert. Nach dreimaliger Boosterung wurde am

61. Tag Blut entnommen und das Serum auf anti-Ycr010c-AK getestet. Die Seren der drei

Kaninchen enthielten zu diesem Zeitpunkt noch keinen spezifischen Antikörper gegen

Ycr010cp (Daten nicht gezeigt). Weitere Blutentnahmen fanden nach der 4. bzw. 5. Booste-

Ergebnisse

102

rung an den Tagen 90 und 120 statt. Diese Seren wurden ebenfalls im Western-Blot auf den

vorhandenen Ycr010c-AK getestet (Abb. 39, Abb. 40 und Abb. 41).

Nach 91 Tagen wurde das Serum von Kaninchen 1 und der sekundäre Antikörper in ver-

schiedenen Verdünnungsstufen eingesetzt, um die optimale Verdünnung der Antikörper zu

ermitteln (Abb. 39).

Abb. 39: Test verschiedener Verdünnungen der primären bzw. sekundären AK unter Ver-wendung des Serums von Kaninchen 1 (nach 90 Tagen). Die Stämme a) YN und b) YNΔycrΔydrΔynr wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt. Die Vorkulturen wurden einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und in Minimalmedium mit Etha-nol als C-Quelle überführt. Nach 2 h wurden die Zellen geerntet, aufgeschlossen und die Zellextrakte im Western-Blot analysiert. Der primäre AK (anti-YCR-AK) wurde in den Verdünnungen 1) 1:500, 2) 1:1000, 3) 1:2500 bzw. 4) 1:5000 und der sekundäre AK in den Verhältnissen 1:50000, 1:10000 bzw. 1:5000 eingesetzt.

Die optimale Verdünnung des primären anti-YCR-AK war 1:2500. Der sekundäre AK konnte

in einer Verdünnung von 1:5000 oder 1:10000 eingesetzt werden.

In einem weiteren Versuch wurden die Seren aller drei Kaninchen getestet. Das Ergebnis

des Western-Blots ist in Abb. 40 dargestellt.

Der Western-Blot zeigte, dass der sekundäre AK bei der Verwendung der Seren von Kanin-

chen 1 und 3 in einer Verdünnung von 1:5000 eingesetzt werden sollte. Wurde dagegen als

primärer AK das Serum von Kaninchen 2 genutzt, so war eine Verdünnung des sekundären

AK von 1:10000 optimal. Die wenigsten Nebenbanden traten bei der Verwendung des Se-

rums von Kaninchen 1 auf.

1:50000 1:10000 1:5000

a aaa a a a a a a a ab bbbbbbbbbbb1 112 223 33 44 4 primärer AK

sekundärer AK

Stamm

Ycr10cp

1:50000 1:10000 1:5000

a aaa a a a a a a a ab bbbbbbbbbbb1 112 223 33 44 4 primärer AK

sekundärer AK

Stamm

Ycr10cp

Ergebnisse

103

Abb. 40: Test der Seren der Kaninchen (K1, K2 und K3) nach 90 Tagen. Die Stämme a) YN und b) YNΔycrΔydrΔynr wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt. Nach-dem die Vorkulturen einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen wurden, erfolgte die Kultivierung in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle. Die Zellen wurden nach 2 h geerntet und aufgeschlossen. Die Analyse der Zellextrakte erfolgte im Wes-tern-Blot. Der primäre AK (YCR-AK) wurde in einer Verdünnung von 1:2500 ein-gesetzt. A) sekundärer AK 1:5000, B) sekundärer AK 1:10000.

Die letzte Probeentnahme der Seren der Kaninchen fand nach 120 Tagen statt, diese wur-

den in einem weiteren Western-Blot hinsichtlich ihrer Qualität überprüft (Abb. 41).

Abb. 41: Test der Seren verschiedener Kaninchen (K1, K2 und K3) nach 120 Tagen. Die

Stämme a) YN und b) YNΔycrΔydrΔynr) wurden üN in MG-Flüssigmedium ge-schüttelt. Die Vorkulturen wurden einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle überführt. Nach 2 h wurden die Zellen geerntet, aufgeschlossen und die Zellextrakte im Western-Blot analysiert. Der primäre AK (YCR-AK) wurde in einer Verdünnung von 1:2500 und der sekundäre AK (Anti-Rabbit) in den Verhältnissen 1:5000 (K1 und K3) bzw. 1:10000 (K2) ein-gesetzt.

Die Seren aller drei Kaninchen ergeben im Stamm YN eine Bande im Bereich von ca.

27 kDa. Somit läuft diese Bande nicht in der Höhe der erwarteten Ycr010cp-Größe von ca.

82,2 kDa

48,8 kDa

37,1 kDa

25,9 kDa

19,4 kDa

14,8 kDa

63,2 kDa

a a ab b b

K1 K2 K3

82,2 kDa

48,8 kDa

37,1 kDa

25,9 kDa

19,4 kDa

14,8 kDa

63,2 kDa

a a ab b b

K1 K2 K3

a a aa a ab b b b bb

K1 K1K2 K2K3 K3A B

Ycr010cp Ycr010cp

a a aa a ab b b b bb

K1 K1K2 K2K3 K3A B

Ycr010cp Ycr010cp

Ergebnisse

104

31 kDa. Weiterhin konnten zwei weitere kleine Banden einer ungefähren Größe von 18 kDa

detektiert werden. Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Abbau oder eine prozessierte

Form des Ycr010cp. Hierbei ist von einer C-terminalen Prozessierung auszugehen, da das

Epitop, welches durch den anti-Ycr010cp-AK erkannt wird, noch vorhanden ist. Im Proteinex-

trakt des Stammes YNΔycrΔydrΔynr, in dem YCR010c deletiert war, konnte keine Bande

nachgewiesen werden.

In einem weiteren Versuch sollte untersucht werden, ob der anti-Ycr010cp-AK spezifisch für

das Ycr010c-Protein ist. Die verschiedenen YN-Stämme wurden in Minimalmedium mit

Ethanol kultiviert, die Zellen nach 2 bis 3 h geerntet und aufgeschlossen. Die Analyse der

Zellextrakte ist in Abb. 42 dargestellt.

Abb. 42: Test der Spezifität des anti-Ycr010cp-AKs. Die Vorkulturen der verschiedenen YN-Stämme wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, einmal mit 1 x Reader-salzen gewaschen und die Hauptkulturen in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle mit einer OD600 = 2 angeimpft. Die Probennahme erfolgte nach 2 h bzw. 3 h. Nach der Abzentrifugation wurden die Zellen aufgeschlossen und die Zellex-trakte im Western-Blot mit dem anti-Ycr010cp-AK analysiert.

Es konnten im Stamm YN und YNΔydrΔynr spezifische Banden einer Größe von etwas mehr

ca. 27 kDa nachgewiesen werden. Alle anderen Stämme in denen YCR010c deletiert ist,

115,5 kDa82,2 kDa63,2 kDa48,8 kDa

37,1 kDa

25,9 kDa

19,4 kDa

14,8 kDa6,0 kDa

2h 2h 2h 2h 2h3h 3h 3h 3h 3h

YN YNΔycr

Δycr

YNΔycr

Δynr

YNΔyd

rΔyn

r

YNΔycr

ΔydrΔ

ynr

115,5 kDa82,2 kDa63,2 kDa48,8 kDa

37,1 kDa

25,9 kDa

19,4 kDa

14,8 kDa6,0 kDa

2h 2h 2h 2h 2h3h 3h 3h 3h 3h

YN YNΔycr

Δycr

YNΔycr

Δynr

YNΔyd

rΔyn

r

YNΔycr

ΔydrΔ

ynr

Ergebnisse

105

wiesen in dieser Größe keine Banden auf. Somit ist der anti-Ycr010c-AK spezifisch für

Ycr010cp.

3.3.15 Lokalisierung der Gpr1-Orthologen

Datenbanken sagen für die Gpr1p Orthologen Ycr010cp und Ynr002cp fünf bis sechs memb-

ranspannende Domänen und für Ydr384cp vier bis sieben Membrandomänen voraus. Von

Interesse war nun, ob die Proteine in S. cerevisiae membranständig sind und in welcher

Membran der Zelle sie lokalisiert sind.

Die Homologen Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp wurden C-terminal mit GFP fusioniert

(vgl. Kapitel 2.9.13). Die integrativen Transformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium ge-

schüttelt und die Hauptkulturen auf Minimalmedium mit Glucose, Ethanol und Acetat als

C-Quellen bzw. ohne C-Quelle angeimpft. Die Zellen wurden in regelmäßigen Abständen

licht- und fluoreszenzmikroskopisch überprüft. In Abb. 43 sind die Zellen nach 2 h Inkubation

in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle dargestellt.

YN[YCR-GFP] YN[YNR-GFP]

1 12 2

Abb. 43: Nachweis der zellulären Lokalisation von Ycr010cp-GFP und Ynr002cp-GFP. Die Stämme wurden üN in Minimalmedium mit Glucose kultiviert, nach dem einmali-gem Waschen mit 1 x Readersalzen wurden sie in Minimalmedium mit Ethanol umgesetzt (OD600 = 0,2). Die mikroskopischen Aufnahmen entstanden nach 2 stündiger Kultivierung in diesem Medium. 1) fluoreszenzmikroskopische Auf-nahme, 2) Interferenzkontrastmikroskopie

Im Falle des mit GFP fusionierten Ycr010cp bzw. Ynr002cp konnte nach 2stündiger Inkuba-

tion in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle eine Fluoreszenz in der Cytoplasma-

membran detektiert werden. Dies deutet auf eine Lokalisierung der beiden Proteine in der

Cytoplasmamembran hin. Für das Ydr384cp-GFP-Konstrukt konnte keine Lokalisierung

nachgewiesen werden, da keine Fluoreszenz auf den gewählten Kohlenstoffquellen beo-

bachtet werden konnte. Bei einer Kultivierung von Hefetransformanden, die Ydr384cp-HA

exprimierten, konnte in Minimalmedium mit Ethanol, Acetat oder ohne C-Quelle in Western-

Blots eine Proteinexpression detektiert werden (vgl. Kapitel 3.3.13.2). Somit hätte das

Ydr384cp-GFP-Fusionsprotein nachgewiesen werden müssen. Möglicherweise war die Ex-

Ergebnisse

106

pression zu schwach, um sie detektieren zu können. Guaragnella and Butow (2003) konnten

das mit GFP fusionierte Ydr384cp mittels Fluoreszenzmikroskopie in der Cytoplasma-

membran nachweisen.

3.3.16 Bestimmung von sekretiertem Ammonium

Palková et al. (2002) stellten fest, dass Einzeldeletionsmutanten der GPR1-Orthologen in

S. cerevisiae eine niedrigere Ammoniumproduktion aufweisen, als der Wildtypstamm

(BY4742). Deshalb geht diese Gruppe davon aus, dass es sich bei den Homologen um Am-

moniumtransporter (Ato1-3p: ammonia transport outward) handeln könnte. Somit war von

Interesse, ob eine Doppel- und Tripeldeletion der Homologen einen weiteren Rückgang bzw.

völligen Ausfall des Ammoniumtransportes aus der Zelle zur Folge haben könnte.

3.3.16.1 Einfluss der Deletion von je zwei bzw. aller drei Gpr1p-Orthologen auf die Ammoniumproduktion

Dillschneider (2003) untersuchte in ihrer Diplomarbeit, ob in den YN-Stämmen eine doppelte

Gendisruption bzw. Disruption aller drei Gene der GPR1-Orthologen eine weitere Auswir-

kung auf die Ammoniumproduktion hat.

Nachdem die verschiedenen YN-Stämme der Hefe S. cerevisiae 12 d auf GM-Medium ge-

wachsen waren, wurde deren Ammoniumsekretion über einen Zeitraum von 25 min in MES-

Puffer untersucht. Die Ergebnisse eines repräsentativen Versuches sind in Abb. 44 darge-

stellt.

Die größte Menge an Ammonium wurde vom Wildtypstamm YN sekretiert. In den Deleti-

onsstämmen YNΔycr, YNΔydr und YNΔynr ging die Ammoniumsekretion gegenüber dem

Wildtypstamm um ein Drittel (YNΔycr) bis zur Hälfte (YNΔynr) zurück. Die Deletion von zwei

Genen der GPR1-Orthologen hatte gegenüber den Einzeldeletionen kaum einen Einfluss auf

den weiteren Rückgang der Sekretion von Ammonium, diese verringerte sich nur sehr wenig.

Überraschenderweise war die Tripelmutante ebenfalls noch in der Lage Ammonium zu

sekretieren.

Ergebnisse

107

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

YN

YNDycr

YNDydr

YNDynr

YNDycrD

ydr

YNDycrD

ynr

YNDydrD

ynr

YNDycrD

ydrD

ynr

Amm

oniu

mse

krte

ion

in m

g*m

l-1*m

in-1

Abb. 44: Ammoniumsekretion der verschiedenen YN-Stämme (nach Dillschneider, 2003). Die Stämme wurden üN in MG-Flüssigmedium kultiviert, einmal mit 1 x Reader-salzen gewaschen und auf GM-Medium getropft. Nach 12 d Inkubation bei 28 °C wurden die Zellen mit MES-Puffer gewaschen und die Ammoniumsekretion über 25 min bestimmt.

3.3.16.2 Einfluss der dominanten Mutationen in Ycr010cp und Ynr002cp auf die Pro-duktion von Ammonium

Es war weiterhin von Interesse zu prüfen, inwieweit die dominanten Mutationen von

Ycr010cp bzw. Ynr002cp (Ycr010cp-Q75, Ycr010cp-D259, Ynr002cp-Q74, Ynr002cp-D259)

eine Auswirkung auf die Ammoniumproduktion hatten. Die Wildtypallele YCR010c bzw.

YNR002c und deren Mutantenallele (YCR010c-Q74, YCR010c-D259, YNR002c-Q74,

YNR002c-D259) wurden integrativ in die Stämme YNΔycr bzw. YNΔynr transformiert. Der

Nachweis der korrekten Integration dieser Allele erfolgte mit Hilfe der Southern-

Hybridisierung.

Die genomische DNA des Ausgangsstammes YNΔycr und dessen Transformanden wurde

isoliert und mit dem Restriktionsenzym EcoRV geschnitten. Nach Auftrennung der Fragmen-

te in der Elektrophorese erfolgte ein Southern-Blot. Dieser wurde mit der YCR010c-Sonde

und anschließend mit der URA3-Sonde analysiert (Abb. 45).

Ergebnisse

108

Abb. 45: Southern-Blot zum Nachweis der Integration des YIp352-Plasmides sowie der konstruierten Vektoren YIpYCR, YIpYCR-Q75 und YIpYCR-D259 in den Stamm YNΔycr. Die genomische DNA wurde mit EcoRV geschnitten. Als Sonden wurden das YCR010c-Fragment aus p426METYCR bzw. das URA3-Fragment aus Y-Ip352 genutzt. Mit EcoRI/HindIII geschnittene λ-DNA diente als Größenstandard. In den einzelnen Spuren ist die genomische DNA folgender Stämme aufgetragen: a) YNΔycr, b) YNΔycr [YIp]1-4, c) YNΔycr [YIpYCR]1-4, d) YNΔycr [YIpYCR-Q75]1-4, e) YNΔycr [YIpYCR-D259]1-4.

Die Beprobung mit der YCR010c-Sonde ergab in allen Stämmen eine Bande in der Größe

von ca. 3 kb. Es handelte sich hierbei um Reste der genomischen Kopie des YCR010c-

Allels. Wurden die Stämme mit den YCR010c-Allelen transformiert, so konnte ein weiteres

Signal der Größe von ca. 5,9 kb detektiert werden. Dies entsprach der Größe des Vektor-

fragments, welches das YCR010c-Allel trug. Wurden die Blots mit der URA3-Sonde beprobt,

so wurden in allen Stämmen vier verschieden große Banden detektiert. Alle mit den YIp-

Plasmiden transformierten Stämme wiesen eine weitere Bande der Größe von 5,9 kb auf.

Somit konnte in allen Stämmen eine korrekte Insertion des Fragmentes bestätigt werden und

diese Stämme zur Messung der Ammoniumsekretion eingesetzt werden.

Die Stämme YN, YNΔycr sowie die Transformanden des Stammes YNΔycr wurden für 12 d

bei 28 °C auf GM-Platten kultiviert. In Abb. 46 sind die Ergebnisse der Ammoniummessung

über 25 min dargestellt.

Die Ammoniumproduktion des Stammes YNΔycr war geringer als die des Wildtypstammes

YN. Die Transformanden des Stammes YNΔycr produzierten alle weniger Ammonium als

YNΔycr, in der Menge des ausgeschiedenen Ammoniums unterschieden sie sich nicht von-

einander. Der Effekt der niedrigeren Ammoniumsekretion durch die Deletion von YCR010c

konnte nicht durch die integrative Transformation des YCR010c-Allels kompensiert werden.

Enthalten die Hefestämme mutierte YCR010c-Allele (YCR-Q75 bzw. YCR-D259), so hat dies

keinen Einfluss auf die sekretierte Ammoniummenge.

a b c d e a b c d eYCR010c-Sonde URA3-Sonde

λ-DNA

21226 bp

947 bp1375 bp1584 bp

5148/ 4973 bp4268 bp3530 bp

2027/ 1904 bp

a b c d e a b c d eYCR010c-Sonde URA3-Sonde

λ-DNA

21226 bp

947 bp1375 bp1584 bp

5148/ 4973 bp4268 bp3530 bp

2027/ 1904 bp

Ergebnisse

109

00,05

0,10,15

0,20,25

0,3

YN

YNDycr

YNDycr[Y

Ip]

YNDycr[Y

IpYCR]

YNDycr[Y

IpYCR-Q

75]

YNDycr[Y

IpYCR-D

259]

Am

mon

ium

sekr

etio

n in

mg*

ml-1

*min

-1

Abb. 46: Ammoniumsekretion der Stämme YN und YNΔycr sowie der Transformanden des Stammes YNΔycr. Die Stämme wurden üN in MG-Flüssigmedium kultiviert einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und auf GM-Medium getropft. Nach 12 d Inku-bation bei 28 °C wurden die Zellen mit MES-Puffer gewaschen und die Ammoni-umsekretion über 25 min bestimmt.

Eine Ursache für die niedrigere Ammoniumsekretion der integrativen Transformanden könn-

te darin liegen, dass in diesen Stämmen das Ycr010c-Protein nicht gebildet wurde. Dies

wurde mittels Western-Blot-Analyse überprüft (Abb. 47).

Abb. 47: Expression des Ycr010c-Proteins im YN-Wildtypstamm und in den integrativen Transformanden des Stammes YNΔycr. Die Stämme wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, die Zellen einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und die Hauptkulturen in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle überführt (OD600 = 2). Es wurden nach 2 bzw. 3 h 50 ml Probe genommen und die Zellen aufgeschlossen Die Analyse der Proben erfolgte im Western-Blot mit anti-HA-AK. A) YN, B) YNΔycr, C) YNΔycr[YIp], D) YNΔycr[YIpYCR], E) YNΔycr[YIpYCR-Q75], F) YNΔycr[YIpYCR-D259]

Abb. 47 zeigt, dass in allen integrativen Transformanden, die das YCR010c-Allel enthalten,

dieses Protein gebildet wurde. Allerdings war die Expression schwächer als im Wildtyp-

stamm YN.

2h 2h2h 2h2h 2h3h 3h 3h 3h 3h 3h

A B C D E F

2h 2h2h 2h2h 2h3h 3h 3h 3h 3h 3h

A B C D E F

Ergebnisse

110

Der Nachweis der korrekten Integration des YIp352-Plasmides sowie der Konstrukte Y-

Ip352YNR, YIp352YNR-Q74 und YIpYNR-D259 in den Stamm YNΔynr erfolgte mit Hilfe der

Southern-Hybridisierung. Dazu wurde die genomische DNA des Ausgangsstammes und von

jeweils drei der Transformanden isoliert, mit EcoRV geschnitten und die Fragmente in der

Elektrophorese aufgetrennt und geblottet. Der Southern-Blot wurde mit der YNR002c- bzw.

der URA3-Sonde beprobt (Abb. 48).

Bei der Beprobung mit der YNR002c-Sonde zeigten alle Stämme eine Bande in der Größe

von ca. 10 kb, hierbei handelt es sich um die Reste der genomischen Kopie des YNR002c-

Allels. Die mit den YNR002c-Allelen transformierten Stämme wiesen eine zweite Bande der

Größe von 5,9 kb auf, diese entspricht der Größe des integrierten Vektorfragmentes. Die

Transformande YN[YIpYNR]1 wies neben den zwei zu erwartenden Banden noch weitere

auf. Wahrscheinlich war hier das Vektorfragment mehrfach integriert. Diese Transformande

wurde verworfen und nicht für weitere Untersuchungen eingesetzt. Erfolgte eine Beprobung

mit der URA3-Sonde, wurden in allen Stämmen drei verschieden große Banden detektiert. In

den transformierten Stämmen konnte eine weitere Bande in einer Größe von 5,9 kb detek-

tiert werden. Diese Bande stammt vom URA3-Gen des integrierten Vektors. Auch in diesem

Blot war erkennbar, dass die Transformande YN[YIpYNR]1 eine Mehrfachintegration aufwies

und nicht für weitere Versuche verwendet werden konnte.

Abb. 48: Southern-Blot zum Nachweis der Integration des YIp352-Plasmides sowie der konstruierten Vektoren YIpYNR, YIpYNR-Q74 und YIpYNR-D259 in den Stamm YNΔynr. Die genomische DNA wurde mit EcoRV geschnitten. Als Sonden wurden das YNR002c-Fragment aus p426METYNR bzw. das URA3-Fragment aus Y-Ip352 genutzt. Mit EcoRI/HindIII geschnittene λ-DNA diente als Größenstandard. In den einzelnen Spuren ist die genomische DNA folgender Stämme aufgetragen: a) YNΔynr, b) YNΔynr [YIp]1-3, c) YNΔynr[YIpYNR]1-3, d) YNΔynr [YIpYNR-Q74]1-3, e) YNΔynr [YIpYNR-D259]1-3.

21226 bp

947 bp1375 bp1584 bp

5148/ 4973 bp4268 bp3530 bp

2027/ 1904 bp

a b c d e a b c d e

YNR002c-Sonde URA3-Sondeλ-DNA

21226 bp

947 bp1375 bp1584 bp

5148/ 4973 bp4268 bp3530 bp

2027/ 1904 bp

a b c d e a b c d e

YNR002c-Sonde URA3-Sondeλ-DNA

Ergebnisse

111

Die Transformanden des Stammes YNΔynr, sowie der Ausgangsstamm YNΔynr und der

Wildtypstamm YN wurden 12 Tage auf GM-Platten bei 28 °C inkubiert. Die Ammoniumsekre-

tion dieser Stämme wurde über einen Zeitraum von 25 min in MES-Puffer gemessen. Die

Ergebnisse sind in Abb. 49 dargestellt.

Der Wildtypstamm YN produzierte gegenüber dem Stamm YNΔynr mehr Ammonium. Die

Ammoniumproduktion der Transformanden des Stammes YNΔynr war vergleichbar der des

untransformierten Stammes YNΔynr. Die integrative Transformation des Stammes YNΔynr

mit dem YNR002c-Allel konnte nicht dessen geringere Ammoniumsekretion aufheben. Wur-

de der Stamm YNΔynr integrativ mit den Mutantenallelen von YNR002c (YNR-Q74 bzw.

YNR-D259) transformiert, so hatte dies keinen Einfluss auf die sekretierte Ammoniummenge

der Transformanden.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

YN

YNDynr

YNDynr[Y

Ip]

YNDynr[Y

IpYNR]

YNDynr[Y

IpYNR-Q74

]

YNDynr[Y

IpYNR-D25

9]

Amm

oniu

mse

kret

ion

in m

g*m

l-1*m

in-1

Abb. 49: Ammoniumsekretion der Stämme YN und YNΔynr sowie der Transformanden des Stammes YNΔynr. Die Stämme wurden üN in MG-Flüssigmedium kultiviert, ein-mal mit 1 x Readersalzen gewaschen und auf GM-Medium getropft. Nach 12 d Inkubation bei 28 °C wurden die Zellen mit MES-Puffer gewaschen und die Am-moniumsekretion über 25 min bestimmt.

Diskussion

112

4 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde die Charakterisierung des Gpr1-Proteins der Hefe Y. lipoly-

tica und dessen drei Orthologen in S. cerevisiae durchgeführt. Dabei war die Identifizierung

funktionell wichtiger Bereiche des C-terminalen Teils des Gpr1-Proteins von besonderem

Interesse. Erste Untersuchungen wurden zur Identifikation möglicher Interaktionspartner von

Gpr1p durchgeführt. Die funktionelle Analyse des Gpr1-Proteins wurde dadurch erschwert,

dass fünf weitere homologe Proteine in Y. lipolytica vorhanden sind. S. cerevisiae wurde in

die Untersuchungen mit einbezogen, weil diese Hefe nur drei Gpr1p-Orhologe (Ycr010cp,

Ydr384cp und Ynr002cp) enthält und Mutantenstämme mit Deletionen von ein, zwei oder

allen drei dieser Gene verfügbar waren. Im Mittelpunkt stand die Bestimmung der Regulation

dieser drei GPR1-orthologen Gene mit Hilfe von LacZ als Reportergen sowie Northern- und

Western-Blots. Weiterhin stand die Identifizierung funktionell wichtiger Bereiche dieser Prote-

ine im Vordergrund der Arbeiten. Zusätzlich wurde die Auswirkung von Doppeldeletionen

oder Deletion aller drei Homologen auf die Ammoniumsekretion dieser Deletionsstämme

überprüft.

4.1 Datenbankanalyse von Gpr1p und dessen Orthologen in Saccharo-myces cerevisiae

Die zur Verfügung stehenden Programme zur Vorhersage der Topologie berechnen für die

Gpr1p-Orthologen vier bis sieben membranspannende Domänen. Der überwiegende Teil

dieser Programme geht von sechs Membrandomänen aus. Dabei wird eine unterschiedliche

Orientierung des Proteins in der Membran angegeben, N- und C-Terminus sind entweder

extrazellulär oder cytoplasmatisch lokalisiert. Bisherige Befunde in Y. lipolytica sprechen da-

für, dass sich der N-Terminus sowie der zweite Loop von Gpr1p auf der cytoplasmatischen

Seite, der erste und dritte Loop dagegen auf der extrazellulären Seite der Cytoplasma-

membran befinden. Der ORF eines artifiziellen Phytochelatins wurde in diesen Versuchen

hinter die erste, zweite und dritte membranspannende Domäne von Gpr1p kloniert. Phyto-

chelatine können die Schwermetalltoleranz erhöhen, indem sie Metallionen wie z. B. Silber

und Cadmium binden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass Transformanden,

die das artifizielle Phytochelatin hinter der ersten und dritten Membrandomäne von Gpr1p

exprimierten, extrazellulär Silber binden konnten. Dazu waren Transformanden, die das arti-

fizielle Phytochelatin nach der zweiten Membrandomänen exprimierten nicht in der Lage

(Bär, persönliche Mitteilung). Im Gegensatz dazu wiesen Kim et al. (2003) nach, dass der N-

und C-Terminus von Ynr002cp an der extrazellulären Seite lokalisiert ist. In diesen Untersu-

Diskussion

113

chungen wurden verschiedene Membranproteine C-terminal mit His4cp fusioniert. Das Gen-

produkt von HIS4C wandelt im Cytoplasma Histinol zu Histidin um. Somit sind his4c-

auxotrophe Transformanden nur in der Lage auf Medium ohne Hisidin zu wachsen, wenn

sich der C-Terminus mit dem fusionierten His4cp im Cytoplasma befindet. Transformanden,

die mit His4p fusioniertes Ynr002cp exprimierten, konnten somit nicht wachsen (Kim et al.,

2003).

In der vorliegenden Arbeit konnten das Ycr010c- und das Ynr002c-Protein mittels GFP-

Fusion in der Cytoplasmamembran nachgewiesen werden. Guaragnella and Butow (2003)

lokalisierten mit GFP fusioniertes Ydr384cp in der Cytoplasmamembran. Allerdings konnte

dieses Protein ebenfalls in einer zweidimensionalen SDS-PAGE von einer mitochondrialen

Proteinfraktion nachgewiesen werden (Sickmann et al., 2003).

Mit Hilfe des ScanProsite-Programms1 und des ELM-Servers2 wurden potentielle Modifizie-

rungsorte in den Gpr1p-Orthologen von S. cerevisiae ermittelt.

In den Proteinen Ycr010cp und Ynr002cp konnte jeweils ein N-Glycosylierungsort nachge-

wiesen werden. Voraussetzung für eine N-Glycosylierung ist, dass sich der

N-Glycosylierungsort in einem größeren Abstand (ca. 10 Aminosäuren) zu den membran-

spannenden Domänen befindet. Weiterhin sollte der Loop, in dem sich die Glycosylierung

befindet mindestens 30 Aminosäuren groß sein (van Geest and Lolkema, 2000). Im Falle

von Ycr010cp ist dies nur in zwei der vorgeschlagenen Topologiemodelle (TMpred,

TopPred2) gegeben. Für das Ynr002c-Protein erfüllt keines der Topologiemodelle diese Vor-

aussetzungen. Untersuchungen dieser Arbeit haben gezeigt, dass eine Glycosylierung die-

ser Proteine sehr unwahrscheinlich ist (vgl. Kapitel 3.3.12.1 und 4.6).

Weiterhin wurden sechs (Ycr010cp, Ynr002cp) bis sieben (Ydr384cp) N-Myristylierungsorte

angegeben. Voraussetzung für eine Myristylierung ist ein N-terminales Glycin, dessen Ami-

nogruppe bei dieser Modifizierung acetyliert wird (Towler et al., 1988; Grand, 1989). Es wur-

den nur potentielle Myristylierungsstellen angezeigt, die innerhalb der Proteine liegen. Durch

eine mögliche N-terminale Prozessierung könnte ein myristylierbares Glycin zur N-terminalen

Aminosäure werden. Die Prozessierung von Ycr010cp hätte eine Verringerung des Moleku-

largewichtes um 5 kDa zur Folge. Tatsächlich lief dieses Protein in der SDS-Page auf einer

Höhe von 27 kDa (theoretisch erwartete Größe: 31 kDa). Gegen eine Myristylierung spricht,

dass dieses Protein mit dem anti-Ycr010cp-Antikörper, der gegen die ersten 15 Aminosäuren

des Proteins gerichtet ist, nachgewiesen werden konnte. Im Falle von Ydr384cp kann eine

N-terminale Prozessierung nicht ausgeschlossen werden, da das mit dem HA-Tag fusionier-

te Protein ein wesentlich schnelleres Laufverhalten zeigte (kleiner 26 kDa), als das theore-

tisch errechnete Molekulargewicht von 33 kDa erwarten ließ. Das Protein Ynr002c müsste

um mindestens 147 Aminosäuren verkürzt werden, um ein N-terminales Glycin zu erhalten. 1 http://us.expasy.org/cgi-bin/prosite 2 http://elm.eu.org

Diskussion

114

Dies hätte eine Verringerung des Molekulargewichtes um 15 kDa zur Folge. Somit müsste

das mit dem HA-Tag fusionierte Ynr002c-Protein im SDS-Gel in einer Höhe von ca. 20 kDa

laufen. Dieses Protein scheint aber nicht N-terminal prozessiert zu werden, da die in der

SDS-Page nachgewiesene Größe ca. 30 kDa betrug.

Das ScanProsite-Programm identifizierte in allen drei Homologen mögliche Phosphorylie-

rungsorte für die Proteinkinase C und die Caseinkinase II. In Ynr002cp befindet sich zusätz-

lich noch eine potentielle Phosphorylierungsstelle für eine Tyrosinkinase. Es konnte aller-

dings nur für Ynr002cp eine Phosphorylierung nachgewiesen werden (vgl. Kapitel 3.3.12.2).

Im Gpr1-Protein aus Y. lipolytica wird die Aminosäure S37 phosphoryliert (Gentsch and Barth,

2005). An dieser Stelle enthält Ynr002cp in seiner Aminosäuresequenz kein Serin, sondern

Threonin. Diese Aminosäure könnte jedoch auch phosphoryliert werden. Allerdings geben

die verwendeten Programme an dieser Stelle keinen potentiellen Phosphorylierungsort an.

Die Identifizierung der Phosphorylierungsstelle in Ynr002cp könnte weiteren Aufschluss über

funktionell wichtige Bereiche bzw. die Funktion des Proteins bringen.

Ycr010cp und Ydr384cp enthalten einen Sulfatierungsort (Rosenquist and Nicholas, 1993;

Nicholas et al., 1999). Das Ycr010c-Protein wird wahrscheinlich nicht durch eine Sulfatierung

modifiziert, da die Erkennungssequenz sich teilweise in einer Membrandomäne befindet. In

Ydr384c befindet sich die Erkennungsstelle für eine potentielle Modifizierung durch Sulfatie-

rung im hydrophilen N-Terminus. Es wurde nicht getestet inwieweit dieses Protein einer

möglichen Sulfatierung unterliegt.

Die Analyse der Homologen mit Hilfe des ELM-Servers ergab neben den mit dem ScanProsi-

te-Programm ermittelten N-Glycosylierungen und Phosphorylierungsorten, weitere potentielle

Modifizierungsorte (vgl. Anlagen). So konnten u. a. in allen drei Proteinen eine FHA-Domäne

(forkhead-associated domain) und ein Motiv für die Interaktion mit dem Adapter Proteinen

(AP) identifiziert werden.

Die FHA-Domäne vermittelt Protein-Protein-Interaktionen und ist an der Signaltransduktion,

der Kontrolle des Zellzyklus und der DNA-Reparatur beteiligt. Die Bindung des Interaktions-

partners ist abhängig von der spezifischen Phosphorylierung von Threonin (Durocher et al.,

1999; Durocher and Jackson, 2002). Die Kontrolle des Zellzyklus und DNA-Reparatur setzen

allerdings eine nukleäre Lokalisierung der beteiligten Proteine voraus. Dies ist jedoch für die

Gpr1p-Orthologen nicht gegeben.

Weiterhin enthalten alle drei homologen Proteine Tyrosin-basierende Sortierungssignale

(Yxxphi-Motiv), die eine Interaktion mit der MU-Untereinheit des Adapter-Protein-Komplexes

(AP-Komplex) vermitteln. Das Yxxphi-Motiv ist im cytosolischen Teil verschiedener Mem-

branproteine lokalisiert und steuert den Transport im endosomalen und sekretorischen

Pathway (Hirst et al., 1999; Dell'Angelica and Payne, 2001). Ydr384cp und Ynr002cp besit-

zen drei bzw. vier dieser Motive, dagegen enthält Ycr010cp fünf potentielle Interaktionsstel-

Diskussion

115

len für Adapter-Protein-Komplexe. Einige der Yxxphi-Motive befinden sich in den drei Homo-

logen in Membrandomänen, von funktioneller Bedeutung können jedoch nur jene in den cy-

toplasmatischen Bereichen sein. Im Ycr010c-Protein liegt eins dieser Motive im hydrophilen

N-Terminus, Ydr384cp enthält ein Yxxphi-Motiv im C-terminalen Teil. Jeweils eins dieser

Motive ist im N- bzw. C-Terminus von Ynr002cp lokalisiert.

Im Ydr384c-Protein konnten außerdem ein Cyclin-Erkennungsort (RxL-Motiv), eine Erken-

nungssequenz für 14-3-3-Proteine sowie eine WW-Domäne (Klasse IV) identifiziert werden.

Der Cyclin-Erkennungsort (RxL) ist in vielen Cyclin/CDK (cyclin dependent kinase) interagie-

renden Proteinen enthalten (Takeda et al., 2001; Lowe et al., 2002). Proteine der 14-3-3-

Familie sind in allen eukaryotischen Organismen präsent. Sie sind an wichtigen zellulären

Prozessen wie der Signaltransduktion, Regulation des Zellzyklus, Apoptose und Stressant-

wort beteiligt (Liu et al., 1997; Zhang et al., 1997; Brunet et al., 1999; Cacace et al., 1999;

Hausser et al., 1999; Zhou et al., 1999). Die WW-Domäne besteht aus etwa 38 bis 40 Ami-

nosäuren und vermittelt über die Bindung kurzer Prolin-reicher Regionen Protein-Protein-

Interaktionen. Die Unterteilung der WW-Domänen erfolgt nach ihrer Spezifität zu Liganden in

vier Klassen (Kato et al., 2002). Proteine, die WW-Domänen enthalten, sind z. B. in der

Signaltransduktion oder der Regulation der Mitose involviert (Lu et al., 1999; Myers et al.,

2001; Sudol et al., 2001; Morris et al., 1999).

Es konnten verschiedene potentielle Modifizierungs- und Interaktionsstellen in den Gpr1p-

Orthologen von S. cerevisiae mittels Datenbanken identifiziert werden. Auffällig ist, dass es

verschiedene Hinweise auf eine mögliche Beteiligung dieser Proteine in einer Signaltrans-

duktionskette gibt. Zurzeit kann jedoch keine Aussage getroffen werden, ob eines dieser

Motive eine biologische Aktivität besitzt.

4.2 Identifizierung möglicher Interaktionspartner von Gpr1p

Bisherige Befunde zum dominanten Phänotyp der Mutantenallele GPR1-1 und GPR1-2 in

Y. lipolytica sind ein Hinweis auf eine mögliche Interaktion von Gpr1p mit anderen Proteinen.

Möglicherweise ist das Gpr1-Protein in einer Signaltransduktionskette der Hefe involviert.

Somit stellte sich die Frage, wie potentielle Interaktionspartner gefunden werden können. Da

verschiedene Methoden nicht zum gewünschten Erfolg führten (vgl. Kapitel 3.2.1; Gentsch,

2003), sollte dies mit Hilfe der Gewinnung von Revertanten-Stämmen erreicht werden. Die

Isolierung der Revertanten-Stämme erfolgte über ihren Phänotyp. Dabei wurde sich auf eins

der GPR1-Mutantenallele (GPR1-2) konzentriert. Transformanden bzw. Stämme, die das

Gpr1-2-Mutantenprotein enthielten, wurden auf Minimalmediumplatten mit Acetat ausplat-

tiert. Hefen, die Gpr1-2p exprimieren, sind normalerweise nicht in der Lage auf diesem Me-

dium zu wachsen. Stämme die dennoch wachsen können, besitzen möglicherweise in einem

Diskussion

116

anderen Gen als in GPR1-2 eine Mutation, die zur Aufhebung der Essigsäure-sensitiven

Phänotyps führt. Das Genprodukt des mutierten Gens stellt somit einen potentiellen Interak-

tionspartner für Gpr1p dar und sollte anschließend identifiziert werden.

Für die Gewinnung von Revertanten wurde die Transformande PO1dΔgpr1/pYLG2 einge-

setzt. Es konnten 155 Revertantenstämme isoliert werden, die in der Lage waren auf Mini-

malmediumplatten mit Acetat als C-Quelle zu wachsen. Die Plasmide der meisten Transfor-

manden wiesen allerdings große Veränderungen im Bereich des GPR1-2 tragenden Frag-

mentes auf. Die restlichen 34 Revertantenstämme besaßen zwar ein intaktes GPR1-2-

Fragment, nach Entfernung des Plasmides und erneuter Transformation mit pYLG2 waren

diese Transformanden aber nicht in der Lage auf Minimalmediumplatten mit Acetat zu wach-

sen. Somit musste angenommen werden, dass die Reversionsmutation nicht chromosomal,

sondern auf dem Plasmid lokalisiert ist. Die Aufhebung des Mutantenphänotyps könnte ver-

schiedene Ursachen haben. Veränderungen im Promotorbereich könnten z. B. zur Folge

haben, dass das GPR1-2-Gen nicht mehr abgelesen wird und deshalb kein Gpr1-2p gebildet

wird. Somit wären Transformanden, die dieses veränderte Allel auf ihrem Plasmid tragen in

der Lage auf Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle zu wachsen. Eine Verringerung der

Expression durch Veränderungen im Promotorbereich hätte nicht die Aufhebung des Mutan-

tenphänotyps zur Folge gehabt, weil bereits niedrige Mengen an mutiertem Gpr1p zur Aus-

bildung des Essigsäure-sensitiven Phänotyps ausreichen (Augstein, 2001). Durch einen Aus-

tausch oder einer Deletion von Basen des GPR1-2-Gens könnte es zur Aufhebung des ne-

gativen Effektes des Gpr1-2-Proteins kommen. In vorhergehenden Untersuchungen konnte

gezeigt werden, dass geringfügige Veränderungen (Deletion von Aminosäuren, Fusion mit

zusätzlichen Aminosäuren) im und am C-Terminus von Gpr1-2p ausreichen, um ein Wachs-

tum der Transformanden auf Essigsäure zu ermöglichen. So wurde z. B. nachgewiesen,

dass der Stamm PO1d mit einem um 14 Aminosäuren verkürzten Gpr1-2p auf Minimalmedi-

um mit Essigsäure wachsen kann (vgl. Kapitel 3.3.7). Ähnliche Effekte wie mit mutiertem,

C-terminal deletiertem Gpr1p (Gpr1-2p) wurden durch mutiertes, C-terminal fusioniertes

Gpr1-2p hervorgerufen (Gentsch, 2003).

Aufgrund der Instabilität des verwendeten Plasmides pYLG2 wurde das GPR1-2-Allel inte-

grativ transformiert. Der konstruierte Stamm PO1d-GPR1-2 wurde anschließend zur Gewin-

nung von Revertanten, die auf Minimalmediumplatten mit Acetat als C-Quelle wuchsen, ein-

gesetzt. Von den 167 isolierten und getesteten Revertanten war keine in der Lage nach

Transformation mit dem Plasmid pYLG2 (enthält das GPR1-2-Allel) auf Minimalmediumplat-

ten mit Acetat als C-Quelle zu wachsen. Hätte in den Revertantenstämmen eine Mutation in

einem anderen Gen als GPR1-2 zur Aufhebung der Essigsäuresensitivität geführt, so hätten

diese Transformanden in Anwesenheit von Essigsäure wachsen müssen. Möglicherweise

wurde in diesen Revertanten-Stämmen nur das enthaltene GPR1-2-Allel verändert. Diese

Diskussion

117

Veränderung konnte aber nicht den negativen Effekt der erneuten Transformation des auf

einem Plasmid kodierten Mutantenallels aufheben. Die angestrebte Mutation in einem ande-

ren genomischen Gen zur Identifikation von Interaktionspartnern trat somit nicht auf.

4.3 Expression der Mutantenallele von GPR1 und dessen Orthologen in Saccharomyces cerevisiae

Zu Beginn der Untersuchungen zur Funktion der GPR1-Orthologen in S. cerevisiae stellte

sich die Frage, inwieweit die Mutantenallele von GPR1 (GPR1-1, GPR1-2) aus Y. lipolytica in

S. cerevisiae funktionell sind. Die ORFs von GPR1, GPR1-1 und GPR1-2 wurden in den

S. cerevisiae-Vektor p426MET25 unter der Kontrolle des MET25-Promotors kloniert. Trans-

formanden der Stämme YN bzw. YNΔycrΔydrΔynr, welche die entsprechenden GPR1-

Mutantenallele (GPR1-1 bzw. GPR1-2) exprimierten, waren sensitiv gegenüber Essigsäure.

Somit zeigen S. cervisiae-Transformanden, die für mutiertes Gpr1p kodieren, den gleichen

Phänotyp wie Y. lipolytica. Es lässt sich daher schlussfolgern, dass die Gpr1-Mutanten-

proteine in S. cervisiae möglicherweise die gleiche Funktion ausüben wie in der Hefe Y. lipo-

lytica.

Zur weiteren Aufklärung einer möglichen Funktion der Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae

wurde eine Ort-spezifische Mutagenese von Ycr010cp und Ynr002cp durchgeführt. Es wur-

den analog der Mutationen in GPR1-1 und GPR1-2 die Aminosäuren L74 bzw. L75 durch Q

sowie G259 durch D ausgetauscht. In dem Protein Ydr384cp konnte kein Aminosäureaus-

tausch vorgenommen werden, da es an den entsprechenden Stellen keine zu Gpr1p homo-

logen Aminosäuresequenzen besitzt. Auch die umgebenden Aminosäuresequenzen weisen

keine Homologien auf. Zum Zeitpunkt dieser Versuche lagen keine Daten zur Expression

von YCR010c und YNR002c vor. Für die Untersuchungen der Auswirkungen der Ort-

spezifischen Mutagenese musste allerdings eine Expression dieser Allele in jedem Fall erfol-

gen. Aus diesem Grund wurde zur Klonierung das Plasmid p426MET25 (Mumberg et al.,

1994), welches ein high-copy Plasmid mit dem konstitutiv exprimierenden MET25-Promotor

ist, verwendet.

Transformanden, die die mutierten Allele von YCR010c und YNR002c (YCR-Q75, YCR-

D259, YNR-Q74, YNR-D259) trugen, waren nicht mehr in der Lage auf Minimalmedium mit

Acetat oder Acetat/Glucose als C-Quellen zu wachsen. Dieser ebenfalls mit den Mutantenal-

lenen von GPR1 beobachtete Phänotyp lässt auf eine Gpr1p-ähnliche Funktion der beiden

Homologen Ycr010cp und Ynr002cp in S. cerevisiae schließen.

Weiterhin wurde getestet, ob dieser Mutantenphänotyptyp auch unter natürlichen Bedingun-

gen, d. h. unter den authentischen Promotoren, auftritt. Die Allele wurden auf einem low-

Diskussion

118

copy Plasmid unter der Kontrolle der authentischen Promotoren exprimert. In diesen Unter-

suchungen stellte sich ein wesentlicher Unterschied zu Y. lipolytica heraus. Obwohl die Mu-

tantenallele YCR010c-Q75, YCR010c-D259, YNR002c-Q74 und YNR002c-D259 eine Sensi-

tivität gegenüber Essigsäure verursachen, konnte dieser Phänotyp in Anwesenheit von Glu-

cose nicht mehr beobachtet werden. Nur auf Minimalmediumplatten mit Acetat als alleiniger

C-Quelle konnten Transformanden, welche die Mutantenallele trugen, nicht mehr wachsen.

Somit konnten, je nachdem welcher Promotor die Expression der Mutantenallele regulierte,

unterschiedliche Mutantenphänotypen auf Minimalmedium mit Acetat/Glucose beobachtet

werden. Dies könnte durch die unterschiedlichen Expressionshöhen der Mutantenallele ver-

ursacht sein. Glucose wirkt auch in gleichzeitiger Anwesenheit anderer C-Quellen (Acetat,

Ethanol) reprimierend auf die Expression von YCR010c und YNR002c in S. cerevisiae.

Durch Aktivitätsmessungen der β-Galactosidase konnte gezeigt werden, dass sich nach dem

Verbrauch der Glucose im Medium die Expression der beiden Homologen erhöht

(Creuzburg, 2002). Im Gegensatz dazu ist die Expression der YCR010c- bzw. YNR002c-

Allele unter der Kontrolle des MET25-Promotors unabhängig von der C-Quelle immer unver-

ändert hoch. Die Expressionsstärke von GPR1-Mutantenallelen hat in Y. lipolytica dagegen

keine Auswirkung auf die Ausprägung des Mutantenphänotyps. Hier reichen bereits geringe

Mengen aus, um Sensitivität gegenüber Essigsäure zu verursachen (Augstein, 2001). Wei-

terhin konnte in Y. lipolytica der Mutantenphänotyp von GPR1 auf Minimalmediumplatten mit

Essigsäure auch in Anwesenheit von Glucose beobachtet werden. In S. cerevisiae ist die

Glucose-Katabolit-Repression stärker ausgebildet als in Y. lipolytica. So ist Y. lipolytica im

Gegensatz zu S. cerevisiae z. B. in der Lage Acetat gleichzeitig mit Glucose zu verwerten

(Rodrigues and Pais, 2000). Dies könnte eine Ursache dafür sein, dass in Anwesenheit von

Glucose der Mutantenphänotyp (Essigsäuresensitivität) in S. cerevisiae nicht mehr ausgebil-

det wird.

Transformanden des Stammes YN, die auf ihrem Plasmid für Ycr010cp-Q75 kodieren, wie-

sen einen instabilen Phänotyp auf. Nur Zellen die frisch transformiert worden waren, konnten

nicht auf Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle wachsen. Ältere Transformanden prägten

diesen Phänotyp nicht mehr aus. In der Tripelmutante konnte dies nicht beobachtet werden,

sie besaßen einen stabilen Mutantenphänotyp. Stand das Allel YCR010c-Q75 allerdings

unter der Kontrolle des MET25-Promotors, so konnte dieser Effekt nicht mehr beobachtet

werden. Die Ursachen für diesen Effekt sind gegenwärtig nicht bekannt.

Diskussion

119

4.4 Ort-spezifische und zufällige Mutagenese von Gpr1p in Yarrowia li-polytica und dessen Orthologen in Saccharomyces cerevisiae

In den Y. lipolytica-Stämmen B204-12C-38 (GPR1-3), B204-12C-112 (GPR1-1), B204-12C-

124 (GPR1-4) und B204-12C-156 (GPR1-2) führte jeweils eine Punktmutation im Gpr1-

Protein zur Essigsäuresenitivität. Dabei handelte es sich im Stamm B204-12C-112 um einen

Aminosäureaustausch im C-Terminus (G248 zu D). In den anderen Y. lipolytica-Stämmen

enthielt der N-Terminus von Gpr1p jeweils einen Aminosäureaustausch (B204-12C-12-156:

L65 zu Q, B204-12C-38: G62 zu S, B204-12C-124: G63 zu D).

Augstein (2001) analysierte die Auswirkung N-terminal deletierter Gpr1p-Konstrukte auf den

Phänotyp von PO1d- bzw. PO1dΔgpr1-Transformanden. Dabei stellte sich heraus, dass der

N-terminale Bereich bis einschließlich F60 nicht bedeutend für dessen Funktion zu sein

scheint. Die Deletion von Aminosäure F61 oder deren Mutation in Glutaminsäure bewirkt eine

Essigsäuresensitivität der Transformanden. Weitere funktionell wichtige N-terminale Berei-

che im Gpr1-Protein wurden von Gentsch (2003) analysiert. Transformanden, deren Plasmid

für NPAPLGL-deletiertes Gpr1-1p bzw. Gpr1-2p kodierte, wiesen keinen Essigsäure-

sensitiven Phänotyp mehr auf.

Somit war nun von Interesse, ob der C-Terminus und insbesondere das konservierte

YNAYA-Motiv von Bedeutung für die Funktion des Gpr1-Proteins ist. Es wurden C-terminale

Deletionen durchgeführt und die Konstrukte in den Stämmen PO1d bzw. PO1dΔgpr1 expri-

miert. Dabei konnte festgestellt werden, dass gleiche C-terminal verkürzte Konstrukte unter-

schiedliche Auswirkungen auf das Wachstum dieser Stämme hatten. In der Deletionsmutan-

te PO1dΔgpr1 hob bereits die Deletion bis Aminosäure P265 den negativen Effekt (Essigsäu-

resensitivität) des GPR1-2-Allels auf. PO1d-Transformanden waren erst in der Lage auf Ace-

tat/Glucose zu wachsen, wenn Gpr1-2p bis einschließlich des YNAYA-Motivs bzw. nur das

YNAYA-Motiv deletiert wurde. Im Wildtypstamm PO1d scheint somit das Gpr1-2p in Wech-

selwirkung mit dem chromosomal kodierten Gpr1-Protein zu stehen. Dabei spielt das

YNAYA-Motiv eine entscheidende Rolle. Es wird angenommen, dass ohne dieses keine Di-

bzw. Oligomerisierung mehr stattfinden kann.

In S. cerevisiae konnten nach C-terminalen Deletionen von Ycr10cp, Ycr10cp-Q75,

Ynr002cp-Q74 bzw. Ynr002cp keine Unterschiede zwischen den Stämmen YN und

YNΔycrΔydrΔynr im Wachstum auf Minimalmediumplatten mit Acetat oder Glucose als

C-Quellen festgestellt werden. Transformanden, deren Plasmid für bis Aminosäure A258 dele-

tiertes Ycr010cp-Q75 bzw. bis A257 deletiertes Ynr002cp-Q74 kodierte, konnten auf Acetat

als C-Quelle wachsen. Wurde nur das YNAYA-Motiv deletiert, so wurde ebenfalls die Essig-

säuresensitivität aufgehoben. Somit ist das YNAYA-Motiv in Ycr010cp bzw. Ynr002cp von

funktioneller Bedeutung. Allerdings gibt es im Gegensatz zu Gpr1p in Y. lipolytica keinen

Diskussion

120

experimentellen Hinweis, dass das YNAYA-Motiv eine Di- bzw. Oligomerisierung vermittelt.

Dies kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Im Gegensatz zu Gpr1p in Y. lipolytica

scheint in S. cerevisiae nicht nur das YNAYA-Motiv, sondern ein größerer Teil der C-Termini

wichtig für die Funktion von Ycr010cp bzw. Ynr002cp zu sein. Werden die Mutantenallele

dieser beiden Proteine bis zur Aminosäure Y267 bzw. Y266 verkürzt, so trat der Mutantenphä-

notyp nicht mehr auf. In Y. lipolytica ist dagegen eine Verkürzung des C-Terminus von

Gpr1-2p bis einschließlich F242 notwendig, um im Stamm PO1d die Sensitivität gegenüber

Essigsäure aufzuheben.

Die Identifizierung funktionell wichtiger Bereiche, die durch Analysen des Gpr1-Proteins noch

nicht gefunden wurden, stand im Folgenden im Vordergrund. Dies erfolgte mittels einer zufäl-

ligen Mutagenese der Gpr1p-Orthologen Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp aus S. cerevisi-

ae. Im Falle von Ycr010cp konnten 11 und für das Ynr002c-Protein vier Transformanden

selektiviert werden, deren Plasmid für ein mutiertes YCR010c- bzw. YNR002c-Allel codierte.

Es konnten keine Essigsäure-sensitiven Transformanden isoliert werden, die in ihrem Plas-

mid ein mutiertes YDR384c-Allel enthielten. Bisher ist ein solcher Phänotyp für Ydr384cp

nicht bekannt. Möglicherweise führt ein Austausch von Aminosäuren in Ydr384cp nicht zur

Essigsäuresensitivität der Transformanden. Somit könnte dieses Protein eine andere Funkti-

on in der Zelle wahrnehmen als Ycr010cp und Ynr002cp.

Von den isolierten 11 Transformanden enthielten neun einen Aminosäureaustausch, die rest-

lichen zwei besaßen jeweils zwei Aminosäureaustausche in Ycr010cp. Das Screening der

zufälligen Mutagenese von Ynr002cp ergab drei Plasmide mit einem und ein Plasmid mit drei

Austauschen. In Proteinen, die zwei bzw. drei Aminosäureaustausche enthalten, müsste

noch geklärt werden, welche der beiden Aminosäuren oder ob beide zusammen den Mutan-

tenphänotyp herbeiführen. Dies könnte mit Hilfe einer Ort-spezifischen Mutagenese, bei der

gezielt einzelne oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht werden, erreicht werden.

Ein großer Teil der ausgetauschten Aminosäuren in Ycr010cp und Ynr002cp ist im

N-Terminus lokalisiert, die anderen Mutationsstellen befinden sich zwischen den membran-

spannenden Domänen bzw. in angrenzenden Bereichen. Da unterschiedliche Programme

verschiedene Membrandomänen vorhersagen, sind diese membranspannenden Bereiche

nicht klar abzugrenzen. Im N-terminalen Teil treten Mutationen, die zur Essigsäuresensitivität

der Transformanden führen, vor allem in und um das FGGTLN-Motiv auf. Das FGGTLN-

Motiv spielt auch im Gpr1p in Y. lipolytica eine wichtige Rolle. Es wird davon ausgegangen,

dass dieses Motiv der Übertragung eines Signals auf den C-Terminus von Gpr1p oder als

Sensor für Acetat dienen könnte (Gentsch, 2003). Weiterhin führte der Austausch der Ami-

nosäure A88 (Ycr010cp) bzw. A87 (Ynr002cp) unmittelbar vor dem Familienmotiv der

Gpr1/FUN34/yaaH-Proteinfamilie zur Sensitivität von Transformanden gegenüber Essigsäu-

Diskussion

121

re. Als ein wichtiger funktioneller Bereich in Ycr010cp und Ynr002cp ist der Loop zwischen

der zweiten und dritten Membrandomäne einzuordnen. Im vierten Loop konnten in beiden

Proteinen ebenfalls Bereiche identifiziert werden, in denen ein Aminosäureaustausch zu Es-

sigsäuresensitivität führt. Allerdings war dieser Bereich schon im Gpr1p als funktionell wich-

tig betrachtet worden, da Austausche von Aminosäuren zu einer Essigsäuresensitivität führ-

ten. Ebenfalls von Bedeutung für die Funktion ist der C-terminale Teil der Proteine. Deletio-

nen im C-Terminus von Gpr1-2p, Ycr010cp-Q75 und Ynr002cp-Q74 führen zur Aufhebung

der Sensitivität gegenüber Essigsäure.

Einige der mutierten Aminosäuren befinden sich in potentiellen Modifizierungsorten und deu-

ten somit auf eine mögliche Funktion dieser hin. Im Protein Ycr010c verursacht der Aus-

tausch von E35 zu G die Ausprägung des Mutantenphänotyps. Diese Aminosäure liegt inner-

halb einer potentiellen Phosphorylierungsstelle der Proteinkinase A, allerdings könnte trotz

des Austausches dieser Aminosäure die resultierende Sequenz durch die Proteinkinase A

erkannt werden. Somit ist der Acetat-sensitive Phänotyp nicht durch eine mögliche Änderung

des Phosphorylierungsstatus erklärbar. Weiterhin liegen die ausgetauschten Aminosäuren

E144, N145 sowie T209 in Erkennungssequenzen für potentielle Phosphorylierungen durch die

Polo-like-Kinase (E144, N145) bzw. GSK3-Kinase (T209). Es kann aber nicht gesagt werden, ob

die Mutation E35 oder T209 zur Essigsäuresensitivität führt, da beide Mutationen in der glei-

chen Transformande auftraten. Möglicherweise haben nur eine oder beide Aminosäuren

getrennt bzw. beide zusammen eine funktionelle Bedeutung. Die mutierten Aminosäuren A70

und F71 befinden sich innerhalb einer potentiellen Bindungsstelle für Adapter-Protein-

Komplexe. Alle anderen durch die zufällige Mutagenese ausgetauschten Aminosäuren liegen

außerhalb der Bereiche potentieller Modifizierungsstellen.

Einige der ausgetauschten Aminosäuren in Ynr002cp befinden sich ebenfalls in Erken-

nungssequenzen für potentielle Phosphorylierungsstellen oder Interaktionsbereichen für

Adapter-Proteine. Innerhalb eines Phosphorylierungsortes für die Polo-like-Kinase liegt die

mutierte Aminosäure G147. Die veränderte Aminosäure S265 befindet sich in einer potentiellen

Modifizierungsstelle der GSK3-Kinase. Die umgebende Sequenz der ausgetauschten Ami-

nosäure M268 stellt eine mögliche Interaktionsstelle für ein Adapter-Protein dar. Allerdings

kann hier keine Aussage getroffen werden, ob der alleinige Austausch dieser Aminosäure zu

einem Essigsäure-sensitiven Phänotyp führt, da die isolierte Transformande drei ausge-

tauschte Aminosäuren enthält. Die anderen Orte von ausgetauschten Aminosäuren befinden

sich außerhalb von potentiellen Modifizierungsstellen.

Diskussion

122

4.5 Sequenzanalyse und Regulation der Promotoren der GPR1-Orthologen

Hinweise auf die mögliche Funktion von Proteinen können durch die Analyse der Promotoren

ihrer Gene erhalten werden. Deshalb wurden die Promotorbereiche der GPR1-orthologen

Gene YCR010c, YDR384c und YNR002c mit Hilfe des MatInspectorV2.21 auf potentielle

Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren analysiert. Weiterhin wurde die Expression die-

ser homologen Gene mit Hilfe des LacZ-Reportergens, Northern-Blots und Western-Blot-

Analysen während der Kultivierung der verschiedenen YN-Stämme und deren Transforman-

den auf Minimalmedium mit unterschiedlichen C-Quellen untersucht.

Es wurden verschiedene Transkriptionsfaktoren identifiziert, die auf eine Glucose-abhängige

Regulation schließen lassen. Die Promotoren von YCR010c und YNR002c enthalten eine

Bindungsstelle für Mig1p. Dieser Transkriptionsfaktor ist für die Repression Glucose-

reprimierbarer Gene zuständig (Nehlin and Ronne, 1990; Lundin et al., 1994; Lutfiyya et al.,

1998). In den Promotoren aller drei Gene konnten Bindungsstellen für Gcr1p nachgewiesen

werden. Allerdings sind diese potentiellen Bindungsstellen wahrscheinlich nicht funktionell,

da der Transkriptionsfaktor Gcr1p für die positive Regulation glycolytischer Gene zuständig

ist (Holland et al., 1987; Willis et al., 2003). Ycr010cp wird nicht und Ynr002cp nur sehr

schwach in Anwesenheit von Glucose im Minimalmedium gebildet. Das Ydr384c-Protein wird

bis zum Beginn der exponentiellen Phase exprimiert. Zu diesem Zeitpunkt ist jedoch davon

auszugehen, dass im Kulturmedium noch viel Glucose vorhanden ist, die in der Glycolyse

verwertet werden könnte. Weiterhin werden alle drei Gene erst nach Glucoseverbrauch sehr

stark exprimiert. Haurie et al. (2001) stellten fest, dass YCR010c, das in seinem Promotor

ein CSRE-Motiv enthält, durch Cat8p positiv reguliert wird. YNR002c unterliegt dagegen ei-

ner negativen Regulation von Cat8p. Unabhängig von Cat8p wird YDR384c reguliert (Haurie

et al., 2001). Dies konnte in den durchgeführten Expressionsanalysen bestätigt werden. Die

maximale β-Galactosidaseaktivität betrug unter der Kontrolle der Promotoren von YDR384c

und YNR002c auf Minimalmedium mit Glucose als C-Quelle etwa 20 MU. Stand das LacZ-

Gen unter der Kontrolle von YCR010c, so konnte keine β-Galactosidaseaktivität nachgewie-

sen werden. Diese Ergebnisse konnten ebenfalls im Northern-Blot und in den Western-Blot-

Analysen bestätigt werden. Während der Kultivierung auf Minimalmedium mit Glucose als

C-Quelle waren weder die RNA noch das Protein von YCR010c nachweisbar. Zum Zeitpunkt

von 24 h konnten sie allerdings detektiert werden. Die Expression von YNR002c war, außer

nach 24 h (hier trat eine starke Expression auf), über den gesamten Kultivierungszeitraum (0

bis 24 h) nur sehr schwach. Interessanterweise wurde YDR384c bis zu einem Zeitpunkt von

ca. sechs bis acht Stunden exprimiert. Mit dem Beginn der exponentiellen Wachstumsphase 1 http://www.genomatix.de

Diskussion

123

nahm die Expression ab und war nicht mehr nachweisbar. Nach 24 h konnte auch dieses

Protein bzw. dessen RNA wieder detektiert werden. In einem weiteren Experiment wurde

abgeklärt, inwieweit die starke Expression zum Zeitpunkt von 24 h der drei homologen Prote-

ine abhängig von der vorhandenen Glucose im Medium oder der Wachstumsphase der Kul-

turen ist. Nach Verbrauch der Glucose setzte die Expression aller drei homologen Proteine

ein. Das Ydr384c-Protein wurde allerdings nur zu Beginn der stationären Phase exprimiert

und war nach vier Stunden nicht mehr nachweisbar. Im Gegensatz dazu wurden die anderen

beiden Proteine während der gesamten stationären Phase gebildet. Somit wurden die drei

GPR1-Orthologen in S. cerevisiae während des Wachstums der Zellen auf Minimalmedium

mit Glucose als C-Quelle zu unterschiedlichen Zeitpunkten exprimiert.

Zu Beginn wurde in β-Galactosidasemessungen weiterhin die Aktivität der β-Galactosidase

unter der Kontrolle der Promotoren der drei GPR1-Orthologen auf verschiedenen C-Quellen

im Vergleich zum GPR1-Promotor untersucht. In diesen Expressionsanalysen wurde festge-

stellt, dass die Regulation der Gene YCR010c, YDR384c und YNR002c von der jeweiligen

C-Quelle abhängig ist. Weiterhin stellte sich heraus, dass keines der Homologen in S. cere-

visiae in gleicher Weise wie GPR1 in Y. lipolytica reguliert wurde. Auf Minimalmedium mit

Acetat oder Lactat als C-Quelle wurden die Homologen im Gegensatz zu GPR1 nur schwach

induziert. YCR010c und YNR002c wurden auf Ethanol stark induziert, das Gen YDR384c

jedoch nicht. Weiterhin war Glycerol ein starker Induktor für die Expression von YCR010c. In

Nortern-Blots und Western-Blot-Analysen wurde die Expression der Homologen auf den

C-Quellen Acetat, Ethanol und in Medium ohne C-Quelle untersucht. Diese Bedingungen

wurden verwendet, da sie zum Zeitpunkt der Versuche als Hauptinduktoren für GPR1 be-

kannt waren (Augstein, 2001). Im Northern-Blot konnte für alle drei Homologen die RNA am

stärksten in Ethanol gewachsenen Kulturen nachgewiesen werden. Im Western-Blot war die

Expression von Ydr384cp-HA in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle allerdings niedrig.

Dieses Ergebnis stimmt mit den Microarray-Daten aus der „SGD“1 (Alexandre et al., 2001)

und den gemessenen β-Galactosidaseaktivitätswerten überein (Creuzburg, 2002; Dill-

schneider, 2003). Auf Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle wurden alle drei Gene indu-

ziert. Ydr384cp-HA wurde zu Beginn nur sehr schwach exprimiert, nach vier Stunden kam es

zu einer Steigerung der Expressionsstärke. Enthielt das Minimalmedium keine C-Quelle, so

konnte ebenfalls für alle drei Homologen eine Expression nachgewiesen werden.

In allen Promotoren der Gpr1p-Orthologen konnten mit Hilfe des MatInspectorV2.2 Bin-

dungsstellen für Nit2p identifiziert werden. Der Transkriptionsfaktor Nit2p aus N. crassa akti-

viert Gene, die zur Verwertung sekundärer N-Quellen benötigt werden (Chiang et al., 1994;

Chiang and Marzluf, 1995). Microarry-Daten der „SGD“1 zeigen, dass YNR002c unter diesen

Bedingungen induziert wird (Gasch, 2002). YDR384c wird dagegen reprimiert und die Regu-


Diskussion

124

lation von YCR010c ist unabhängig von der Stickstoffquelle. In der Diplomarbeit von

Dillschneider (2003) konnte nachgewiesen werden, dass in YNR002c die potentiellen Bin-

dungsstellen für Nit2p funktionell sind. Somit könnte dieses Protein direkt oder indirekt an der

Verwertung sekundärer N-Quellen beteiligt sein. Ycr010cp könnte ebenfalls in die Verwer-

tung von Stickstoffquellen unter N-Mangel involviert sein, da es in seinem 5´-upstream Be-

reich eine mögliche Bindungsstelle für Car1p enthält (Cooper et al., 1992; Smart et al.,

1996).

Der Transkriptionsfaktor Gcn4p reguliert Gene, die an der Biosynthese von Aminosäuren

beteiligt sind (Sosa et al., 2003). Aufgrund der Gcn4p-abhängigen Regulation von YDR384c

(Guaragnella and Butow, 2003), könnte das Ydr384c-Protein in der Aminosäurebiosynthese

involviert sein.

In der Promotorregion des Gens wurde eine potentielle Bindungsstelle für den Transkripions-

faktor Pho4p, der unter Phosphatmangelbedingungen aktiv ist (Springer et al., 2003), identi-

fiziert. Dies deutet darauf hin, dass Ycr010cp an der Bereitstellung von Phosphat mitwirken

könnte.

Die Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae wurden bei der Kultivierung in Minimalmedium ohne

C-Quelle exprimiert. Allein schon der Mangel einer C-Quelle bewirkt die Expression der drei

Homologen (Boer et al., 2003). Somit könnte deren Expression durch Stress, der u. a. durch

C-Mangel verursacht werden kann, ausgelöst werden. Ein weiterer Hinweis darauf ist das

Vorhandensein mehrerer STRE-Elemente (Schüller et al., 2004) in allen drei Promotoren.

Eine mögliche Regulation der homologen Gene durch Stress wurde bezüglich des diauxi-

schen Shifts (Gis1p) bzw. der allgemeinen Stressantwort (Msn2p/4p) überprüft. Die Expres-

sion von YCR010c nahm im Vergleich zum Wildtypstamm W303 im Stamm W303Δgis1 in

Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle zu, womit dieses Gen während des diauxischen

Shifts reprimiert wird. Während der Kultivierung des Stammes W303Δgis1 auf Ethanol nahm

die Expression von YDR384c ab. Diese Ergebnisse konnten in der Versuchswiederholung

bestätigt werden, sie stehen aber im Widerspruch zu den Daten der SGD1 (Causton et al.,

2001). Die Homologen YCR010c und YDR384c wurden während der Kultivierung auf Mini-

malmedium mit Acetat als C-Quelle durch allgemeinen Stress induziert, denn ihre Expressi-

onsstärken nahmen im Stamm W303Δms2Δmsn4 unter diesen Bedingungen ab. Causton et

al. (2001) beobachteten ebenfalls eine Msn2/4p-abhängige Regulation von YCR010c und

YDR384c. Das Gen YNR002c zeigte unter den getesteten Bedingungen keine Stress-

abhängige Induktion bzw. Repression und wird somit nur durch verschiedene C-Quellen re-

guliert.

Der Transkriptionsfaktor AbaAp aus A. nidulans spielt keine Rolle bei der Regulation der

GPR1-Orthologen in S. cerevisiae, da diese Hefe kein orthologes AbaA-Protein besitzt. Es


Diskussion

125

kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass ein anderes Protein dessen Funktion über-

nimmt.

In den Promotorregionen von YCR010c und YNR002c konnten Bindemotive für den

Transkriptionsfaktor StuAp aus A. nidulans identifiziert werden. Die Hefe S. cerevisiae besitzt

in Sok2p einen Transkriptionsfaktor mit signifikanter Homologie zu StuAp (Ward et al., 1995).

Das Sok2-Protein ist als negativer Regulator an der Entwicklung von Pseudohyphen betei-

ligt, (Ward et al., 1995; Pan and Heitman, 2000). Vachova et al. (2004) beobachteten, dass

die Deletion von SOK2 eine niedrigere Expression der GPR1-Orthologen zur Folge hatte.

Obwohl Bindemotive für Abf1p und Mcm1p in den Promotorregionen von YDR384c bzw.

YNR002c nachgewiesen wurden, ist nicht anzunehmen, dass diese Transkriptionsfaktoren

an der Regulation beteiligt sind. Beide Transkriptionsfaktoren sind an Prozessen im Kern

bzw. der Replikation von Minichromosomen involviert (Marahrens and Stillman, 1992; Chang

et al., 2003; Miyake et al., 2004). Bisher gibt es keinen Hinweis auf eine Lokalisierung der

GPR1-Orthologen im Zellkern oder deren Beteiligung an diesen Prozessen.

4.6 Auftreten der drei Gpr1p-Orthologen in unterschiedlichen Formen

Bei der Auftrennung von Zellextrakten, die Ycr010cp-HA, Ydr384cp-HA bzw. Ynr002cp-HA

exprimierten, konnten zwei (Ycr10cp-HA, Ynr002cp-HA) bzw. mehrere (Ydr384cp-HA) ver-

schieden große Banden detektiert werden. Mit Hilfe des ScanProsite-Programms1 wurden in

alle Proteinen potentielle Phosphorylierungsorte identifiziert. Die Proteine Ycr010cp und

Ynr002cp enthalten weiterhin jeweils einen möglichen Glycosylierungsort. Das Auftreten von

Doppelbanden könnte durch solche Modifizierungen erklärbar sein. Es wurde experimentell

unter Verwendung der Endoglucosidase H, die an verzweigten Mannose-Strukturen angreift,

überprüft, ob eine Glycosylierung der Proteine vorlag. Die Untersuchungen haben gezeigt,

dass nach dem Einwirken von Endoglucosidase H keine Veränderung des Molekulargewich-

tes der Proteine auftrat. Somit können mögliche Modifizierungen der Proteine nicht auf eine

Glycosylierung zurückgeführt werden.

Dagegen konnte festgestellt werden, dass Ynr002cp einer Phosphorylierung unterliegt. Es

müssten weitere Experimente zur Identifizierung des Phosphorylierungsortes durchgeführt

werden. Dies könnte durch Ort-spezifische Mutagenese potentieller Phosphorylierungsstel-

len und daran anschließender Überprüfung des Phosphorylierungsstatus erfolgen. Weiterhin

müsste abgeklärt werden, unter welchen Bedingungen diese Phosphorylierung auftritt. Diese

Versuche könnten weiteren Aufschluss über eine mögliche Funktion von Ynr002cp geben.

Bei elektrophoretischen Untersuchungen des mit dem HA-Tag fusionierten Ycr010cp konnte

eine Doppelbande detektiert werden. Mit Hilfe des anti-Ycr010c-Antikörpers konnte gezeigt 1 http://us.expasy.org/cgi-bin/prosite

Diskussion

126

werden, dass diese Banden eindeutig dem Ycr010c-Protein zuzuordnen sind. Allerdings war

es überraschend, dass Ycr010cp ohne HA-Tag keine Doppelbanden ausbildet, sondern im

Gel nur eine Bande nachweisbar war. Es ist nicht auszuschließen, dass diese Einzelbande

eine vollständig modifizierte Form des Ycr010c-Proteins ist und eine Fusion mit dem HA-Tag

diese vollständige Modifizierung beeinflusst bzw. verhindert. Ein ähnliches Phänomen wurde

ebenfalls für Gpr1p in Y. lipolytica beobachtet. Das Gpr1-Protein wird nach Zugabe von Ace-

tat zum Medium vollständig phosphoryliert (Gentsch and Barth, 2005). Dagegen wird ein mit

dem HA-Tag fusioniertes Gpr1p nur noch teilweise durch die Zugabe von Acetat modifiziert

und es kommt zum Auftreten von Doppelbanden (Gentsch, persönliche Mitteilung).

4.7 Expression in Minimalmedium mit verschiedenen Essigsäurekon-zentrationen

In Vorversuchen wurde festgestellt, dass die Expression der Gpr1p-Orthologen in Minimal-

medium mit Acetat als C-Quelle unterschiedlich hoch war. Je niedriger der pH-Wert war,

desto geringer war auch die Expression der drei Homologen. Enthielt das Minimalmedium

Glucose, Ethanol oder keine C-Quelle, so hatte der pH-Wert keinen Einfluss auf die Expres-

sionsstärke. Diese Beobachtungen ließen den Schluss zu, dass nur die Konzentration an

Essigsäure und nicht der pH-Wert des Mediums für die unterschiedlichen Expressionsstär-

ken verantwortlich war. Es konnte in einem weiteren Versuch festgestellt werden, dass die

Expression der Gpr1p-Orthologen unterschiedlich durch die im Minimalmedium vorhandene

Essigsäure beeinflusst wurde. Die Expression von Ycr010cp-HA verringerte sich mit steigen-

der Essigsäurekonzentration am stärksten. Ab einer Konzentration von 15 mM Essigsäure

fand eine deutlich geringere Expression statt. Die Expressionsänderungen von Ydr384cp-HA

und Ynr002cp-HA waren dagegen weniger stark. Hier nahmen die Expressionsstärken erst

ab 30 mM Essigsäure im Minimalmedium ab. Betrug die Konzentration an Essigsäure im

Minimalmedium 50 mM, so konnte keine Expression der Homologen mehr nachgewiesen

werden. Dies lag vermutlich daran, dass diese Konzentration für die Zellen toxisch war.

In einem Tropfplattentest wurde die Toxizität verschiedener Essigsäurekonzentrationen auf

Hefezellen überprüft. Enthielt das Minimalmedium 50 mM Essigsäure, waren die Zellen nicht

mehr in der Lage zu wachsen. Stand jedoch neben Essigsäure noch Glucose als C-Quelle

zur Verfügung, so war diese Acetatkonzentration nicht mehr toxisch. Glucose stellt für die

Hefezellen eine zusätzliche Energiequelle dar. Mit Hilfe dieser Energiereserven könnten sie

in der Lage sein, durch zelluläre Prozesse den toxischen Effekt von Essigsäure zu verhin-

dern. Möglicherweise weist die ATPase in zusätzlicher Gegenwart von Glucose eine höhere

Aktivität auf, und es können mehr Protonen aus der Zelle ausgeschleust werden. Somit

könnten weitaus höhere Essigsäurekonzentrationen toleriert werden. Es ist allerdings nicht

Diskussion

127

klar, inwieweit nur Glucose diesen Effekt verursacht, oder ob auch andere C-Quellen dazu in

der Lage sind. Dies könnte geklärt werden, indem in einem Tropfplattentest den Zellen ne-

ben Essigsäure z. B. Glycerin als zusätzliche C-Quelle angeboten würde.

4.8 Bestimmung von sekretiertem Ammonium

Palková et al. (2002) beobachteten, dass Mutantenstämme mit Deletionen der einzelnen der

GPR1-Orthologen weniger Ammonium sekretierten als der Wildtypstamm. Weiterhin zeigten

sie, dass Ycr010cp schwache Homologien zu einem Ammoniumtransporter in C. elegans

aufweist. Somit nahmen Palková et al. (2002) an, dass es sich bei diesen Proteinen um

Ammoniumtransporter (Ato1-3p) handeln könnte.

In dieser Arbeit wurde getestet, inwieweit eine Doppeldeletion oder Deletion aller drei Homo-

logen einen weiteren Einfluss auf die Produktion von Ammonium hatte. Es konnte festgestellt

werden, dass die Deletion zweier Homologe kaum eine weitere Erniedrigung der Ammoni-

umproduktion zur Folge hatte. Der Stamm in dem alle drei Homologe deletiert waren

(YNΔycrΔydrΔynr) schied trotzdem noch Ammonium aus. Die sekretierte Ammoniummenge

war gleich der jener Stämme mit zwei deletierten GPR1-Orthologen. Dies lässt zum einen

vermuten, dass neben den drei Gpr1p-Orthologen noch weitere Ammoniumtransporter in S.

cerevisiae existieren könnten. Zum anderen könnten die drei Homologen in S. cerevisae sel-

ber keine Ammoniumtransporter sein, sondern regulatorisch auf bisher nicht bekannte Am-

moniumtransporter wirken. Die von Palková et al. (2002) postulierten Homologien zwischen

dem potentiellen Ammoniumtransporter aus C. elegans und den drei Gpr1p-Orthologen sind

nur sehr schwach und stellen keinen eindeutigen Beweis dar (Abb. 50). In Abb. 51 ist wei-

terhin ein Alignment des potentiellen Ammoniumtransporters aus C. elegans mit weiteren

putativen Ammoniumtransportern aus diesem Organismus gezeigt. Diese Proteine weisen

weitaus mehr homologe Bereiche zueinander auf als die Gpr1p-Orthologen zu dem Amoni-

umtransporter. Weiterhin ist hier die Konsensussequenz der Ammoniumtransporter-Signatur

(ATS) (DxAGxxxVHLxGGxxxxxAxxxxxPR) völlig verschiedenen von der zwischen den

Gpr1p-Orthologen und dem Ammoniumtransporter ermittelten Konsensussequenz

(xFxGGxxxLxxGxxxxxxxxxxxxx). Somit handelt es sich in den Gpr1p-Orthologen bei dieser

Sequenz nicht um die typische Ammoniumtransporter-Signatur. Daher wird angenommen,

dass die Gpr1p-Orthologen möglicherweise regulatorisch bisher unbekannte Ammoni-

umtransporter beeinflussen.

Weiterhin wurde getestet, inwieweit die Mutantenproteine von Ycr010cp (Ycr010cp-Q75,

Ycr10cp-D259) und Ynr002cp (Ynr002cp-Q74, Ynr002cp-D259) eine Auswirkung auf die

Ammoniumproduktion von Stämmen, die diese Proteine enthielten, hatten. Dabei sekretier-

ten die Transformanden der Stämme YNΔycr und YNΔynr, die das YCR010c- bzw.

Diskussion

128

YNR002c-Allel trugen, nicht die Menge an Ammonium wie der Stamm YN. Die Integration

der Allelele YCR010c und YNR002c fand im Bereich des URA3-Genes statt und nicht an der

ursprünglichen Stelle dieser Allele. Somit fehlen angrenzende Sequenzen im Genom, die

eventuell für die Genregulation notwendig wären. Die Folge wäre eine niedrigere Expression

dieser integrierten Gene und demzufolge eine niedrigere Produktion von Ammonium. Dar-

aufhin wurden Transformanden, die das YCR010c-Allel trugen, bezüglich der Expression von

Ycr010cp überprüft. In allen Stämmen konnte dieses Protein nachgewiesen werden. Aller-

dings war die Menge an gebildetem Protein geringer als im Wildtypstamm YN. Dies könnte

durch die veränderte Lage im Genom, aufgrund der in das URA3-Gen erfolgten Integration,

verursacht worden sein. Stämme, die integrativ Mutantenallele von YCR010c oder YNR002c

trugen, zeigten keine Veränderung in der produzierten Ammoniummenge. Somit haben die

Ort-spezifischen Mutationen in diesen Genen keinen Einfluss auf die Sekretion von Ammoni-

um. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass es sich bei den Gpr1p-Orthologen nicht um

Ammoniumtransporter handelt.

Diskussion

129

Ce AT --MTTPTNFTTEIDKLHAEITRLETGFYENVNSFFLCSMALIIFFMQCGFAYLEAGAVRSKNTTNILIKN 68 Sc Ynr002cp MSDREQSSGNTAFEN-PKALDSSEG-------------------------EFISENNDQSRHSQESICK- 43 Sc Ycr010cp MSDKEQTSGNTDLENAPAGYYSSHD-------------------------NDVNGVAEDERPSHDSLGK- 44 Sc Ydr384cp --MTSSASSPQDLEKGVNTLENIET-------------------------LPQQGSIAGVSQGFPNIQE- 42 Consensus 1 Ce AT LLDSCICIIGYWAIGWALAYGDSGEGVNLFVGHSQFFLSGFSDYPRFFFQYVFSATAATIVSGAVAERCE 138 Sc Ynr002cp ------------------IYTAGKNNEYIYIGRQKFLRD----------DLFEAFG-GTLNPG-LAPAPV 83 Sc Ycr010cp ------------------IYTGGDNNEYIYIGRQKFLKS----------DLYQAFG-GTLNPG-LAPAPV 84 Sc Ydr384cp ------------------IYS---DRDFITLGSSTYRRR----------DLLNALDRGDGEEGNCAKYTP 81 Consensus Y G G A 4 Ce AT FITYVTYCTVISTFIYPVLTHWGWTENGWMAKGITSGIIDTKYDDFAGSGLVHLCGGSISFLAAWIMGPR 208 Sc Ynr002cp HKFANPAPLGLSGFALTTFVLSMFNAR---AQGITIPNVVVGCAMFYG-GLVQLIAGIWEIALENTFG-- 147 Sc Ycr010cp HKFANPAPLGLSAFALTTFVLSMFNAR---AQGITVPNVVVGCAMFYG-GLVQLIAGIWEIALENTFG-- 148 Sc Ydr384cp HQFANPVPLGLASFSLSCLVLSLINAN---VRGVTDGKWALSLFMFFG-GAIELFAGLLCFVIGDTYA-- 145 Consensus F G T F G G L G 12 Ce AT IGKFPDDEDDESDEILGHSVPFTALGGFILMFGFLAFNGGSVASISHAGDGHTVALAMINTILSGAFAAL 278 Sc Ynr002cp ------------------GTALCSFGGFWLSFGAIYIP------WFGILDAYKDKESDLGNALG------ 187 Sc Ycr010cp ------------------GTALCSYGGFWLSFAAIYIP------WFGILEAYEDNESDLNNALG------ 188 Sc Ydr384cp ------------------MTVFSSFGGFWICYGYGLTD------TDNLVSGYTDP-TMLNNVIG------ 184 Consensus GGF 15 Ce AT IYLGVHYYQHGKWTLLLTINACLSGMVAACAGCNKMEPWACIWVGLGAGLIYLAFSKLMIRLKIDDPLDA 348 Sc Ynr002cp ------FYLLGWALFTFGLSVCT------------------MKSTIMFFALFFLLAVTFLLLSIANFTGE 233 Sc Ycr010cp ------FYLLGWAIFTFGLTVCT------------------MKSTVMFFLLFFLLALTFLLLSIGHFANR 234 Sc Ydr384cp ------FFLAGWTVFTFLMLMCT------------------LKSTWGLFLLLTFLDLTFLLLCIGTFIDN 230 Consensus G C L I 19 Ce AT FAVHAGGGFWGLMSSSIISHGGVAYALADAVSGAKNSGDHLTQAFAQLGWQMICALAIIAWSLGVMLPIF 418 Sc Ynr002cp VGVTRAGGVLGVIVAFIAWYN----------------------AYAGIATRQNSYIMVHPFALPSNDKVF 281 Sc Ycr010cp LGVTRAGGVLGVVVAFIAWYN----------------------AYAGVATKQNSYVLARPFPLPSTERVI 282 Sc Ydr384cp NNLKMAGGYFGILSSCCGWYS----------------------LYCSVVSPSNSYLAFRAHTMPNAP--- 275 Consensus GG G 22 Ce AT WILKKTGKLRVSEEVEINGLDVFKHGEMAYPLRAYGHGWHDFERANKIQAFSAKITVGEGKNTRIMKIHP 488 Sc Ynr002cp F--------------------------------------------------------------------- 282 Sc Ycr010cp F--------------------------------------------------------------------- 283 Sc Ydr384cp ---------------------------------------------------------------------- 275 Consensus 22 Ce AT EMSIEQLASVYDRSGNIIPMPKKSRTLFTNSAERKMSQMMYDENKM 534 Sc Ynr002cp ---------------------------------------------- 282 Sc Ycr010cp ---------------------------------------------- 283 Sc Ydr384cp ---------------------------------------------- 275 Consensus 22

Abb. 50: Alignment der Gpr1p-Orthologen Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp aus S. cere-visiae (Sc) mit dem potentiellen Ammoniumtransporter (AT) aus C. elegans (Ce). Je nach Konservierungsgrad sind die Aminosäuren rot (identisch) bzw. blau (strukturell ähnlich) dargestellt. Die Ammoniumtransporter-Signatur ist in C. elegans gelb unter-legt. Das Alignment wurde mit Hilfe des ClustalX-1.81-Programmes (Thompson et al., 1997) erstellt.

Diskussion

130

Ce AT MTTPTNFTTEIDKLHAEITRLETGFYEN--------VNSFFLCSMALIIFFMQCGFAYLEAGAVRSKNTT 62 Ce AT1 --------------------MKEDFSEN--------DNAFFLCSMSLIIFLMQCGFAFLEAGAVRSKNTT 42 Ce AT2 MNTLQNLTLKMDRQPTIRMKPDKQLDCS-----LSQDDGVWMMASSFIIFTMTAGFGLLESGRVSSKDEV 65 Ce AT3 MAGPEGSIFNASAMQIVQIHHYAEGSVTPEVDKLYQDDAVWIISSSFIIFTMHSGFGLLESGSVSAKDEV 70 Consensus IIF M GF LE G V K 11 Ce AT NILIKNLLDSCICIIGYWAIGWALAYGDS-GEGVNLFVGHSQFFLSG--------------------FSD 111 Ce AT1 NILIKNLLDSCIAIVGYWALGWALAFGDCPNNTIGLFVGYSEFFLAN--------------------FSN 92 Ce AT2 NCMVKNVFDVIFGGLAYWMFGYGLTFGDS-KHQLGRYVGFGDFFFDPERVSDDDSTDETHRGLLPKQITD 134 Ce AT3 NIMVKNVVDVVFGGLSYWSCGFGFSYGDI-PEWRNPYVGFGKFFYDP---TRDYGTRETIN----QEGWS 132 Consensus N KN D YW G GD VG FF 24 Ce AT YPRFFFQYVFSATAAT-------IVSGAVAERCEFITYVTYCTVISTFIYPVLTHWGWTENGWMAKGITS 174 Ce AT1 YPKFFFQYVFAATSAT-------IVSGAVAERCEFANYITYCSVISTLVYPILTHWGWHPKGWMALGITS 155 Ce AT2 SESLRCQLSHNTFTFTRSHRIVKTLPTGMSERIHLKSHCFIS-FFITLVHSVAGHWVWDQEGVFRM---- 199 Ce AT3 YASFLFQLSLATTAST-------IVSGAVAERAKLKSYILLG-CIVILIQALPAHWVWDKEGVFYK---- 190 Consensus Q T ER HW W G 32 Ce AT GIIDTKYDDFAGSGLVHLCGGSISFLAAWIMGPRIGKFPDDEDDESDEILGHSVPFTALGGFILMFGFLA 244 Ce AT1 GVINTHYDDFAGSGVVHLCGGSISFLAAYMIGPRIGRFPEDDDDECDEILGHSVPFAALGGFILMFGFLA 225 Ce AT2 ----MGVVDSAGCSAVHLVGGVSGLVATLYLKPRRNRFAKNGIRTVS-----DPTKAILGFLMIWWGWLA 260 Ce AT3 ----KGVVDFAGCSAVHLVGGIIGLIATVFLKPRRNRFNEDSVHQMS-----SPTNALLGTFLLWWGWFG 251 Consensus D AG VHL GG A PR F LG G 47 Ce AT FNGGSVASISH--AGDGHTVALAMINTILSG---------------------AFAALIYLGVHYYQHGKW 291 Ce AT1 FNGGSMADIVK--PGEGHIVALAMVNTILSG---------------------AFAALTYLIAHYLYHGKW 272 Ce AT2 FNTSSNYAVTHGQWTEGMRSAVGTILASAGGVLQQSEILNLKNMYELKKLKHKFRGVVTVIITRLSTKKI 330 Ce AT3 INAGSVWGITGGRWRLGARAAVATIMASIGG------------------------GATAITISFVKTKKL 297 Consensus N S G A G K 53 Ce AT TLLLTINACLSGMVAACAGCNKMEPWACIWVGLGAGLIYLAFSKLMIRLKIDDPLDAFAVHAGGGFWGLM 361 Ce AT1 TLLLTINACLAGMVASCAGCNKMEPWACIWVGVGAGLIYLGLSKLMVRLKIDDPLDAFAVHAGGGFWGLT 342 Ce AT2 QMDMLIDGMLASLVASTGGCLYFTPWQATLVGAIGSSLALAAYPVTEWLKIDDPVGVFPVHVVGSIWGMI 400 Ce AT3 QVNFLINGILSSIVSITAICAVSRPWHALVIGSISSVFSIAVLPLLDRLHIDDPVGIVPIHLTSSIWGMI 367 Consensus I L V C PW G L IDDP H WG 68 Ce AT SSSIISHGGVAYALA---DAVSGAKNSGDHLTQAFAQLGWQMICALAIIAWSLGVMLPIFWILKKTGK-L 427 Ce AT1 SVAFIGHDGVVYSIG---NTIGGATNGGDQIAQAFAQLGWQWVCALAIVTWSILWMWPIFALLRKIGK-L 408 Ce AT2 APAIFVYRRPMNFGPPECDFQTSDEINGLLYGGGFYLLFLQSFVILVIGTYSAICAFIILFLIHHSPVGL 470 Ce AT3 AVGIFCEE-DKYLG------SATNNRSGLLYSWSFELLWVQLQCTAAILIYSATTGFLALFLISKSPLGL 430 Consensus G F L Q I S L 75 Ce AT RVSEEVEINGLDVFKHGEMAYPLRAYGHGWHDFERANKIQAFSAKITVGEGKNTRIMKIHP--------- 488 Ce AT1 RVSAEVEINGLDIYKHGESAYPLHAYGHGWHDFEAAPDSKINHSKHLP-VGRKNRIMSVHP--------- 468 Ce AT2 RVDKYTEELGADLIEHGLAGFNVMTY-----TIEKKLDTKTLSAVLMIIVRWRAKAKLGAQ--------- 526 Ce AT3 RVTDYEEQIGADVIEHGLAGTNVARY-----VLEKPLSTRTFQTVTKAITKWKMLAKKKSRQKRMEAAKL 495 Consensus RV E G D HG Y E 84 Ce AT --------------------------EMSIEQLASVYDRSGNIIPMP-----------KKSRTLFTNSAE 521 Ce AT1 --------------------------EMSLEQLASVYDRTG-SVGES-----------DQPKRLFMNQTE 500 Ce AT2 -------------------------RRKKIHDSGSVAPQQAESVEMN-----------VIHRRH------ 554 Ce AT3 KRQEEQETFTNGTAIANGNGNVLHHRTNATESNGTGAPKRSNGPAFNNQITPLAVSSTVSTARNGPSTGR 565 Consensus 84 Ce AT RKMSQMMYD---------------------------------------ENKM------------------ 534 Ce AT1 RRKSRMIEANALHALYLDDNEVPERKNTNPKTVSLQVPTTIIEAAEDEADKMTENDRM------------ 558 Ce AT2 ---------------------------------------------------------------------- 554 Ce AT3 RTESTAIEIEQPIEAVPPEVVAAAVLPPEERPGPSTNSNVSIEASVEKSPSSSTSRRSISIRSSPSIHTV 635 Consensus 84 Ce AT ---------------------------------------------------- 534 Ce AT1 ---------------------------------------------------- 558 Ce AT2 ---------------------------------------------------- 554 Ce AT3 SAISTAAPDSRPSTASATSIISKKSSKNSTVGKFVKAPAPRALSPPDNNPPV 687 Consensus 84 Abb. 51: Alignment des Amoniumtransporter (AT) aus C. elegans (Ce) mit weiteren putativen Ammoniumtransportern (AT1-3) aus C. elegans. Je nach Konservierungsgrad sind die Ami-nosäuren rot (identisch) bzw. blau (strukturell ähnlich) dargestellt. Die Ammoniumtranspor-ter–Signatur (Konsensussequenz: DxAGxxxVHLxGGxxxxxAxxxxx PR) ist gelb unterlegt. Das Alignment wurde mit Hilfe des ClustalX-1.81-Programmes (Thompson et al., 1997) erstellt.

Diskussion

131

4.9 Mögliche Funktionen der Gpr1p-Orthologen

Bisher konnte die tatsächliche Funktion der Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae nicht geklärt

werden. Augstein (2001) und Gentsch (2003) schlugen allerdings in ihren Arbeiten ein Mo-

dell zur möglichen Funktion von Gpr1p in Y. lipolytica vor. Veränderungen im Gpr1-Protein

verursachen eine Essigsäuresensitivität. Deshalb wird davon ausgegangen, dass dieses

Protein in der Adaptation der Hefezellen an Essigsäure involviert ist (Gentsch, 2003;

Gentsch and Barth, 2005). Die Gpr1p-Orthologen Ycr010cp und Ynr002cp scheinen eben-

falls am Anpassungsprozess an Essigsäure beteiligt zu sein, da Mutationen in diesen Protei-

nen zur Sensitivität gegenüber Essigsäure führen. Für das Ydr384c-Protein kann diesbezüg-

lich keine Aussage getroffen werden, da kein Essigsäure-sensitiver Mutantenphänotyp be-

kannt ist. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass Mutationen eine Sensitivität gegenüber

Essigsäure verursachen könnten. Es wird davon ausgegangen, dass das Gpr1-Protein in

Abwesenheit von Essigsäure aktiv ist und die Essigsäure-Adaptationsprozesse inhibiert. In

Anwesenheit von Essigsäure kommt es zur Deaktivierung von Gpr1p (Gentsch, 2003). Die

Gpr1p-Orthologen könnten in ähnlicher Weise wirken, da ihre Expressionsstärke mit stei-

gender Konzentration an Essigsäure abnimmt. Dies deutet darauf hin, dass unter diesen

Bedingungen keine aktiven Proteine benötigt werden. Das Ynr002c-Protein wird durch den

Transkriptionsaktivator War1p reguliert (Schüller et al., 2004) und könnte somit eine wichtige

Rolle bei der Anpassung an Säuren (Sorbat) spielen. Eine ähnliche Regulation von Gpr1p in

Y. lipolytica ist unwahrscheinlich, da diese Hefe kein War1p-homologes Protein besitzt. Au-

ßerdem enthält der GPR1-Promotor keine homologen War1p-Erkennungssequenzen. Es ist

jedoch nicht auszuschließen, dass in Y. lipolytica ein anderes Protein die Funktion von

War1p wahrnimmt.

Weiterhin besteht die Annahme, dass Gpr1p eine Rolle während der Anpassung an neue

C-Quellen spielt. Nach C-Quellen-Verbrauch lag Gpr1p nur noch in seiner dephosphorylier-

ten Form vor. Die erneute Zugabe einer C-Quelle bewirkte jedoch eine rasche Phosphorylie-

rung des Gpr1-Proteins (Gentsch, 2003; Gentsch and Barth, 2005). Aufgrund ihrer Regulati-

on scheinen die Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae nicht nur in bei der Anpassung an neue

C-Quellen, sondern auch in anderen zellulären Prozessen eine Rolle zu spielen.

In dieser Arbeit konnten wichtige Erkenntnisse zur unterschiedlichen Regulation der GPR1-

Orthologen gewonnen werden. Diese sind in Abb. 52 schematisch zusammengefasst. In

Medium mit Glucose unterliegen YCR010c und YNR002c einer Repression, zusätzlich könn-

te der Transkriptionsfaktor Mig1p diese Gene reprimieren. YDR384 wird nur bis zum Errei-

chen der exponentiellen Wachstumsphase gebildet (Abb. 52A). Nach Verbrauch der Glucose

im Medium (Abb. 52B) werden alle drei Homologen exprimiert. Cat8p induziert YCR010c,

dagegen wird YNR002c durch diesen Transkriptionsfaktor reprimiert. Enthält das Medium

Diskussion

132

Ethanol als C-Quelle (auch während des diauxischen Shifts), so werden YCR010c und

YNR002c exprimiert, YDR384 unterliegt einer Repression durch Gis1p (Abb. 52C). Nach

Verbrauch der C-Quelle (Abb. 52D) kommt es zur Expression der drei Gpr1p-Orthologen.

Weiterhin unterliegen YCR010c und YDR384c einer positiven Regulation durch Msn2/4p,

d. h. sie werden in ihrer Expression durch allgemeinen Stress beeinflusst. Sind die Zellen

Stress durch Essigsäure ausgesetzt, so werden alle drei Homologen exprimiert (Abb. 52E).

Zusätzlich deutet die Regulation von YNR002c durch War1p auf eine Beteiligung dieses Pro-

teins an der Stressantwort gegenüber Säuren hin. Allerdings wird der Transkriptionsfaktor

War1p nicht durch Essigsäure aktiviert (Schüller et al., 2004). Ist die Zelle

N-Mangelbedingungen ausgesetzt, so wird YNR002 exprimiert und YDR384c reprimiert. Die

Regulation von YCR010c ist dagegen unabhängig von der N-Quelle (Abb. 52F). Die unter-

schiedliche Regulation der drei Gpr1p-Orthologen könnte auf eine ähnliche Funktion dieser

Proteine unter verschiedenen zellulären Bedingungen hinweisen. Darauf könnte ebenfalls

die gleiche Lokalisierung aller drei Proteine in der Cytoplasmamembran hindeuten.

Abb. 52: Modell zur Regulation der Expression der GPR1-Orthologen YCR010c, YDR384c und YNR002c aus S. cerevisiae. Transkriptionsfaktoren sind mit Kreisen dargestellt. Rot steht für Induktion und grün ist die Repression der Gene dargestellt. A) Medium mit Glucose, B) Verbrauch von Glucose oder einer anderen C-Quelle, C) Medium mit Ethanol bzw. diauxischer Shift, D) Medium ohne C-Quelle, allgemeiner Stress, E) Medium mit Essigsäure (pH4) bzw. Säurestress, F) N-Mangel.

YCR010c

YDR384c

YNR002c

Mig1p

YCR010c

YDR384c

YNR002c

Cat8p

YCR010c

YDR384c

YNR002c

Gis1p

YCR010c

YDR384c

YNR002c

War1p

YCR010c

YDR384c

YNR002c

Msn2/4p

YCR010c

YDR384c

YNR002c

A B C

D E F

YCR010c

YDR384c

YNR002c

Mig1pMig1p

YCR010c

YDR384c

YNR002c

Cat8pCat8p

YCR010c

YDR384c

YNR002c

Gis1pGis1p

YCR010c

YDR384c

YNR002c

War1pWar1p

YCR010c

YDR384c

YNR002c

Msn2/4pMsn2/4p

YCR010c

YDR384c

YNR002c

A B C

D E F

Diskussion

133

Paiva et al. (2004) wiesen nach, dass Ycr010cp am aktiven Transport von Acetat in die Zelle

beteiligt ist. Jedoch ist dieses Protein nicht in der Stressantwort, die durch Acetat verursacht

wird, involviert (Paiva et al., 2004). Die YCR010c-Deletionsmutante YNΔycr müsste bei hö-

heren pH-Werten, wenn kaum noch undissoziiertes Acetat vorliegt (Abb. 53), das frei durch

die Zellemembran diffundieren kann, schlechter mit Acetat als alleiniger C-Quelle wachsen.

Vorausgesetzt es existieren neben Ycr010cp keine weiteren Acetattransporter in S. cerevi-

sae. In einem Wachstumstest mit Acetat (pH6,5) konnte kein Unterschied zwischen YNΔycr

und dem Wildtypstamm YN festgestellt werden. Auch eine Deletion aller drei Gpr1p-

Orthologen hatte keinen Unterschied im Wachstum gegenüber dem Wildtypstamm mit Acetat

(pH6,5) als alleiniger C-Quelle zur Folge. Dies deutet darauf hin, dass die drei Gpr1p-

Orthologen nicht als Acetattransporter fungieren oder andere Acetattransporter den Defekt

der Deletionen kompensieren können.

Verteilungskurve für Essigsäure und Acetat

0%20%40%60%80%

100%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

pH

Ant

eil d

er je

wei

ligen

Te

ilche

nsor

te

Acetat Essigsäure

Abb. 53: Prozentualer Anteil von Acetat und protonierter Essigsäure in Abhängigkeit vom pH-Wert (Gentsch, 2003).

Die vorliegenden Ergebnisse haben gezeigt, dass die drei Gpr1p-Orthologen in ihrer Expres-

sion durch verschiedene C-Quellen reguliert werden. Weiterhin unterliegen YCR010c und

YDR384c einer Regulation durch allgemeinen Stress.

Obwohl eine klare Korrelation zwischen mutiertem Gpr1p bzw. dessen Orthologen und Es-

sigsäure existiert, ist eine direkte Beteiligung dieser Proteine am Acetattransport eher un-

wahrscheinlich.

Die Ammoniumsekretion wird offensichtlich durch die Gpr1p-Orthologen beeinflusst. Die sehr

geringe Ähnlichkeit zu Ammoniumtransportern und die Ergebnisse mit dem Deletionsstamm

aller drei Homologen könnten aber darauf hinweisen, dass diese Orthologen nicht selbst

Ammonium aus der Zelle transportieren.

Diskussion

134

Deshalb kann eher angenommen werden, dass die Gpr1-orthologen Proteine regulatorische

Funktion haben bzw. Bestandteil einer Signaltransduktionskette sind und nicht direkt am

Transport von Acetat oder Ammonium beteiligt sind.

Zusammenfassung

135

5 Zusammenfassung

Trans-dominante Mutationen im GPR1-Gen der Hefe Y. lipolytica führen zur Sensitivität der

Hefezellen gegenüber Essigsäure. Das Gpr1p-Protein ist mit seinen sechs membran-

spannenden Domänen in der Cytoplasmamembran lokalisiert. Die Deletionsmutante

PO1dΔgpr1 zeigt gegenüber dem Wildtypstamm PO1d keine erhöhte Essigsäuresensitivität.

Der Deletionsstamm PO1dΔgpr1 wies nach Transfer in Medium mit Essigsäure eine längere

lag-Phase als der Wildtypstamm PO1d auf. Im N-Terminus hat das FGGTL-Motiv für die

Funktion des Gpr1-Proteins eine besondere Bedeutung. Die Deletion weiterer N-terminaler

Bereiche hat keinen Einfluss auf den Phänotyp von Zellen, die entsprechende Konstrukte

exprimieren. Gpr1p unterliegt in Abhängigkeit von der C-Quelle im Medium einer Phospory-

lierung. Ziel der vorliegenden Arbeit war die funktionelle Analyse und die weiterführende Charakteri-

sierung des Gpr1-Proteins aus Y. lipolytica und dessen Orthologen Ycr010cp, Ydr384cp und

Ynr002cp von S. cerevsiae. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

• Mit Hilfe der Gewinnung von Revertanten von PO1dΔgpr1/pYLG2 bzw. PO1d-GPR1-2

sollten potentielle Interaktionspartner des Gpr1-Proteins gefunden werden. Allerdings

stellte sich nach Überprüfung aller isolierten Revertantenstämme heraus, dass diese

Stämme möglicherweise nur eine Veränderung des GPR1-2-Allels selbst aufwiesen. Die

gewünschte Mutation in einem anderen Gen als GPR1-2 trat somit nicht auf. • Die Einzel-, Doppeldeletion oder Deletion aller drei Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae

hatte gegenüber dem Wildtypstamm auf den getesteten C-Quellen keine Auswirkung auf

die Phänotypen der Deletionsstämme. • S. cerevisiae-Transformanden, welche die Mutantenalle GPR1-1 bzw. GPR1-2 unter

Kontrolle des MET25-Promotors exprimierten, zeigten bei gleichzeitiger Anwesenheit von

Glucose eine erhöhte Sensitivität gegenüber Essigsäure. Die GPR1-Mutantenallele zeig-

ten somit in der Hefe S. cerevisiae die gleiche Wirkung wie in Y. lipolytica. • Durch Ort-spezifische Mutagenese wurden in den Proteinen Ycr010c und Ynr002c ana-

log der Aminosäureaustausche in Gpr1-1p bzw. Gpr1-2p die Aminosäuren L74 bzw. L75

durch Q und G259 durch D ausgetauscht. Transformanden, die diese veränderten Protei-

ne unter Kontrolle des MET25-Promotors exprimierten, wiesen bei gleichzeitiger Anwe-

senheit von Glucose eine erhöhte Essigsäuresensitivität auf. Standen die Mutantenallele

von YCR010c und YNR002c dagegen unter der Kontrolle ihres authentischen Promotors,

so wurde die Sensitivität gegenüber Essigsäure in Anwesenheit von Glucose aufgeho-

Zusammenfassung

136

ben. Der Mutantenphänotyp wurde nur ausgeprägt, wenn Acetat allein als C-Quelle zur

Verfügung stand. • Mittels C-terminaler Verkürzungen bzw. Deletionen von Gpr1p und dessen Orthologen

Ycr010cp bzw. Ynr002cp in S. cervisiae konnte in allen Proteinen das YNAYA-Motiv als

funktionell wichtig identifiziert werden. • Zur Aufklärung weiterer funktionell wichtiger Bereiche, die in Gpr1p noch nicht bekannt

waren, wurde eine zufällige Mutagenese mit den Gpr1p-Orthologen von S. cerevisiae

durchgeführt. Die Transformanden wurden auf Sensitivität gegenüber Essigsäure selek-

tiert. Es konnten 11 Transformanden isoliert werden, deren Ycr010c-Protein Aminosäu-

reaustausche enthielt. Das Screening von mutiertem YNR002c ergab vier Transforman-

den. Alle Aminosäureaustausche in Ycr010cp bzw. Ynr002cp haben einen dominanten

Mutantenphänotyp zur Folge. Im Falle des Ydr383cp konnten keine Transformanden mit

einem Essigsäure-sensitiven Phänotyp isoliert werden. Möglicherweise verursachen

Aminosäureaustausche in diesem Protein keinen solchen Phänotyp. • Die Regulation der GPR1-Orthologen in Abhängigkeit von der zur Verfügung stehenden

C-Quelle wurde mit Hilfe des LacZ-Reportergens, Northern- und Western-Blots unter-

sucht. Dabei konnte eine Abhängigkeit der Regulation von der C-Quelle festgestellt wer-

den. YCR010c und YNR002c werden durch Ethanol stark induziert, YDR384c dagegen

reprimiert. Ebenso erfolgt durch Glycerol eine Induktion von YCR010c. Im Gegensatz zu

GPR1 der Hefe Y. lipolytica werden alle drei Orthologen nur schwach durch Acetat und

Lactat induziert. In Anwesenheit von Glucose werden alle drei Homologen unterschied-

lich exprimiert. Ycr010cp wird nicht und Ynr002cp nur in sehr geringen Mengen,

Ydr384cp dagegen bis zum Beginn der exponentiellen Phase gebildet. Nach Glucose-

verbrauch ist die Expression aller drei Gene hoch.

Es konnte nachgewiesen werden, dass die Erkennungssequenzen für Nit2p im 5´-up-

stream-Bereich von YNR002c funktionell sind.

Die Expression der Homologen YCR010c und YDR384c wird durch allgemeinen Stress

induziert.

Die Gpr1p-Orthologen werden voneinander unabhängig reguliert.

• Die Expression der Gpr1p-Orthologen ist unabhängig vom pH-Wert des Mediums. Erhöh-

te Konzentrationen an Essigsäure im Kulturmedium haben eine geringere Expression al-

ler drei Homologen zur Folge. • S. cerevisiae ist nicht in der Lage bei einer Konzentration von 50 mM Essigsäure (pH4)

im Medium zu wachsen. Steht den Zellen neben Essigsäure gleichzeitig Glucose zur Ver-

Zusammenfassung

137

fügung, so ist diese bis zu einer getesteten Konzentration von 50 mM (pH4) nicht mehr

zelltoxisch. • Für das Ynr002c-Protein konnte eine Modifizierung durch Phosphorylierung nachgewie-

sen werden. • Mittels GFP-Fusionen konnten Ycr010cp und Ynr002cp in der Cytoplasmamembran loka-

lisiert werden. • Es konnte festgestellt werden, dass die Deletion zweier Homologer in S. cerevisiae eine

weitere Verringerung der Ammoniumproduktion zur Folge hatte. Waren alle drei Homolo-

gen deletiert, so erniedrigte sich die sekretierte Ammoniummenge nicht weiter. Die Mu-

tantenallele von Ycr010cp und Ynr002cp hatten keinen Einfluss auf die Produktion von

Ammonium der Transformanden.

Aufgrund der geringen Ähnlichkeit der Gpr1p-Orthologen zu Ammoniumtransportern wird

davon ausgegangen, dass sie selber keine Ammoniumtransporter darstellen. Allerdings

wird durch die Gpr1p-Orthologen die Ammoniumsekretion beeinflusst.

Es wird angenommen, dass die Gpr1p-orthologen Proteine eine regulatorische Funktion ha-

ben bzw. Bestandteil einer bisher nicht bekannten Signaltransduktionskette sind.

Literatur

138

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Anlagen

150

7 Anlagen

7.1 Plasmidkarten

In den folgenden Abbildungen sind ausgewählte Plasmide dargestellt.

Abb. 54: Das Plasmid pYLD103 enthält das GPR1-1-Allel aus dem Stamm B204-12C-112.

Abb. 55: Das Plasmid pYLG2 enthält den ORF des GPR1-2-Allels unter Kontrolle des GPR1B-Promotors aus dem Stamm PO1d.

Abb. 56: Das Plasmid p426MET25 diente zur Expression von verschiedenen GPR1-Allelen sowie YCR010c- und YNR002c-Allelen unter Kontrolle des MET25-Promotors in der Hefe S. cerevisiae.

Abb. 57: Das Plasmid p416YCR enthält das YCR010c-Allel unter Kontrolle des Originalpromotors (pYCR010c).

pYLD1039487 bps

2000

4000

6000

8000

KpnI, 187XhoI, 305

SplI, 431 HindIII, 996ClaI, 1002EcoRI, 1027

XhoI, 1973EcoRI, 1990XhoI, 2002

ApaI, 2549

NcoI, 3049

SphI, 3283

HindIII, 3827

EcoRI,4625PstI, 5377

Kpn2I, 7320

NruI, 8012

SalI, 8333EcoRI, 8467

PstI, 9057NcoI, 9440

GPR1-1

LEU2

CEN-ARS18Ampr

ORIROP

LTR

pYLG211568 bps

2000

4000

6000

8000

10000

BamHI, 447

BglII, 1297

NheI, 2445

KpnI, 3422BstEII, 3467

SplI, 3666

HindIII, 4231

Bsu36I, 5081SgrAI, 5548

ApaI, 5784Bsp120I, 5784

SphI, 6518

HindIII, 7062

ScaI, 8375PvuI, 8486PstI, 8612

NdeI, 9924

BsaAI, 9994

BspEI, 10555

NruI, 11247PshAI, 11503

SalI, 11568

GPR1-2

LEU2

CEN-ARS18

Ampr

ORIROP

pYLD1039487 bps

2000

4000

6000

8000

KpnI, 187XhoI, 305



ApaI, 2549

NcoI, 3049

SphI, 3283

HindIII, 3827


Kpn2I, 7320

NruI, 8012



GPR1-1

LEU2

CEN-ARS18Ampr

ORIROP

LTR

pYLD1039487 bps

2000

4000

6000

8000

KpnI, 187XhoI, 305



ApaI, 2549

NcoI, 3049

SphI, 3283

HindIII, 3827


Kpn2I, 7320

NruI, 8012



GPR1-1

LEU2

CEN-ARS18Ampr

ORIROP

LTR

pYLG211568 bps

2000

4000

6000

8000

10000

BamHI, 447

BglII, 1297

NheI, 2445


SplI, 3666

HindIII, 4231

Bsu36I, 5081SgrAI, 5548

ApaI, 5784Bsp120I, 5784

SphI, 6518

HindIII, 7062


NdeI, 9924

BsaAI, 9994

BspEI, 10555

NruI, 11247PshAI, 11503

SalI, 11568

GPR1-2

LEU2

CEN-ARS18

Ampr

ORIROP

pYLG211568 bps

2000

4000

6000

8000

10000

BamHI, 447

BglII, 1297

NheI, 2445


SplI, 3666

HindIII, 4231

Bsu36I, 5081SgrAI, 5548

ApaI, 5784Bsp120I, 5784

SphI, 6518

HindIII, 7062


NdeI, 9924

BsaAI, 9994

BspEI, 10555

NruI, 11247PshAI, 11503

SalI, 11568

GPR1-2

LEU2

CEN-ARS18

Ampr

ORIROP

p416YCR6424 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000

PstI, 126

BglII, 341XhoII, 341

HincII, 434SalI, 434

KpnI, 712HincII, 792

KpnI, 940HindIII, 1016

EcoRI, 1287ClaI, 1348HincII, 1354SalI, 1354XhoI, 1360

KpnI, 1621

EcoRV, 3022PstI, 3230

SacI, 6420

pYCR010c

YCR010c

CYC1ter

URA3CEN6/ARSH4

Ampr

p426MET256338 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000

384XbaISpeIBamHISmaIXmaIEcoRI414

HindIII, 426ClaI, 432SalI, 441XhoI, 447

KpnI, 710

NcoI, 2092EcoRV, 2111

PstI, 2319NdeI, 2385

XbaI, 3146

SacI, 6334

CYC1ter

URA3Ampr

pMet25

p416YCR6424 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000

PstI, 126






KpnI, 1621


SacI, 6420

pYCR010c

YCR010c

CYC1ter

URA3CEN6/ARSH4

Ampr

p416YCR6424 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000

PstI, 126






KpnI, 1621


SacI, 6420

pYCR010c

YCR010c

CYC1ter

URA3CEN6/ARSH4

Ampr

p426MET256338 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000



KpnI, 710



XbaI, 3146

SacI, 6334

CYC1ter

URA3Ampr

pMet25

p426MET256338 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000



KpnI, 710



XbaI, 3146

SacI, 6334

CYC1ter

URA3Ampr

pMet25

Anlagen

151

Abb. 58: Mit Hilfe des pUG30-Plasmids als Template wurden der ORF des GFP- und Kanamycingens amplifiziert.

Abb. 59: Das Plasmid YEp351-3HA diente bei der Amplifizierung von 3 x HA als Template.

Abb. 60: Das Plasmid p416YDR enthält das YDR384c-Allel unter Kontrolle des Originalpromotors (pYDR284c).

Abb. 61: Das Plasmid p416YNR enthält das YNR002c-Allel unter Kontrolle des Originalpromotors (pYNR002c).

p416YDR7116 bps

1000

2000

30004000

5000

6000

7000

ClaI, 576XbaI, 749

BamHI, 855

BglI, 1491HindIII, 1527ClaI, 1536HincII, 1542SalI, 1542XhoI, 1548

KpnI, 1809


SacI, 6608EcoRV, 6716

BglII, 6882SpeI, 6945

EcoRI, 7024

YDR384c

CYC1ter

URA3CEN6/ARSH4

Ampr

pYDR384c

p416YNR6415 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000

SpeI, 27BglI, 208

NdeI, 609Eco52I, 657

HindIII, 966EcoRI, 998XbaI, 1002

ClaI, 1339SalI, 1345XhoI, 1351

KpnI, 1612


SacI, 6411

pYNR002c

YNR002c

CYC1ter

URA3CEN6/ARSH4

Amp

p416YDR7116 bps

1000

2000

30004000

5000

6000

7000

ClaI, 576XbaI, 749

BamHI, 855


KpnI, 1809




EcoRI, 7024

YDR384c

CYC1ter

URA3CEN6/ARSH4

Ampr

pYDR384c

p416YDR7116 bps

1000

2000

30004000

5000

6000

7000

ClaI, 576XbaI, 749

BamHI, 855


KpnI, 1809




EcoRI, 7024

YDR384c

CYC1ter

URA3CEN6/ARSH4

Ampr

pYDR384c

p416YNR6415 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000

SpeI, 27BglI, 208




KpnI, 1612


SacI, 6411

pYNR002c

YNR002c

CYC1ter

URA3CEN6/ARSH4

Amp

p416YNR6415 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000

SpeI, 27BglI, 208




KpnI, 1612


SacI, 6411

pYNR002c

YNR002c

CYC1ter

URA3CEN6/ARSH4

Amp

pUG305785 bps

1000

2000

3000

4000

5000

BamHI, 633SmaI, 639XmaI, 639EcoRI, 651

KpnI, 1663

BglII, 1872

ClaI, 2376SacII, 3404

pMET25

EGFP3

CYC1ter

pTEF

kanMXTEFter

Ampr

YEp351-3HA5764 bps

1000

2000

3000

4000

5000

15EcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIPstI54

BamHI, 131NdeI, 141

HindIII, 186

EcoRV, 1221

EcoRI, 1332

KpnI, 1722ClaI, 1818

lacZHA

LEU2

2µ

Ampr

pUG305785 bps

1000

2000

3000

4000

5000


KpnI, 1663

BglII, 1872


pMET25

EGFP3

CYC1ter

pTEF

kanMXTEFter

Ampr

pUG305785 bps

1000

2000

3000

4000

5000


KpnI, 1663

BglII, 1872


pMET25

EGFP3

CYC1ter

pTEF

kanMXTEFter

Ampr

YEp351-3HA5764 bps

1000

2000

3000

4000

5000


BamHI, 131NdeI, 141

HindIII, 186

EcoRV, 1221

EcoRI, 1332


lacZHA

LEU2

2µ

Ampr

YEp351-3HA5764 bps

1000

2000

3000

4000

5000


BamHI, 131NdeI, 141

HindIII, 186

EcoRV, 1221

EcoRI, 1332


lacZHA

LEU2

2µ

Ampr

Anlagen

152

Abb. 62: In das Plasmid YIp352 wurden die verschiedenen YCR010c- und YNR002c-Allele kloniert. Nach dem Öffnen der entstandenen Plasmide mit dem Restriktionsen-zym StuI erfolgte die Integration des Plasmid-Fragments in S. cerevisiae.

7.2 Topologiemodelle der Gpr1p-Orthologen in Saccharomyces cerevi-siae

Mittels verschiedener, im Internet zur Verfügung stehender Programme wurden die voraus-

sichtlichen Topologien der Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae ermittelt. In Tab. 21 bis Tab. 23

sind die ermittelten Membrandomänen zusammengefasst.

Tab. 21: Verschiedene Topologiemodelle für Ycr010cp. Es sind jeweils die Sequenzen an-gegeben, die die Membrandomänen bilden.

Programm Helix 1 Helix 2 Helix 3 Helix 4 Helix 5 Helix 6 TMHMM - 117-139 151-173 186-203 210-232 242-261 HMMTOP 91-108 121-138 151-173 186-205 210-229 242-261 TMpred (N-Term. innen)

93-110 117-135 151-173 - 210-229 235-261

TMpred (N-Term. außen

90-108 112-135 151-173 186-206 213-229 240-260

TopPred2 90-110 119-139 153-173 - 208-228 240-260 DAS (cutoff 1,7) 95-107 119-139 156-171 188-205 208-230 241-254 DAS (cutoff 2,2) 97-105 120-136 159-169 189-203 209-229 242-253 PSORT II 96-112 124-140 161-177 191-207 214-230 239-255

YIp3524303 bps

1000

2000

3000

4000

15EcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIPstISphIHindIII66StuI, 728

NcoI, 957EcoRV, 976

NdeI, 1245

URA3

YIp3524303 bps

1000

2000

3000

4000

15EcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIPstISphIHindIII66StuI, 728

NcoI, 957EcoRV, 976

NdeI, 1245

URA3

Anlagen

153

Tab. 22: Verschiedene Topologiemodelle für Ydr384cp. Es sind jeweils die Sequenzen an-gegeben, die die Membrandomänen bilden.

Programm Helix 1 Helix 2 Helix 3 Helix 4 Helix 5 Helix 6 TMHMM 85-107 117-139 144-163 178-199 206-228 238-257 HMMTOP 88-105 118-140 145-164 177-199 206-225 238-257 TMpred (N-Term. innen)

87-105 117-140 144-163 182-199 208-224 235-257

TMpred (N-Term. außen)

90-107 117-136 131-159 182-202 208-228 235-252

TopPred2 87-107 119-139 143-163 182-202 205-225 237-257 DAS (cutoff 1,7) 91-106 119-143 148-158 182-202 204-227 241-247

249-252 DAS (cutoff 2,2) 94-105 121-141 - 183-200 206-226 - PSORT II 89-105 124-140 - 182-198 208-224 -

Tab. 23: Verschiedene Topologiemodelle für Ynr002cp. Es sind jeweils die Sequenzen an-

gegeben, die die Membrandomänen bilden.

Programm Helix 1 Helix 2 Helix 3 Helix 4 Helix 5 Helix 6 TMHMM - 116-138 150-172 182-204 211-230 234-256 HMMTOP 91-110 123-142 155-176 189-208 213-232 245-264 TMpred (N-Term. innen)

89-107 111-134 150-172 185-205 212-228 239-259

TMpred (N-Term. außen

92-108 116-134 150-172 185-205 209-228 235-260

TopPred2 89-109 118-138 146-166 - 207-227 239-259 DAS (cutoff 1,7) 99-110 122-141 156-174 190-207 211-233 244-257 DAS (cutoff 2,2) 101-108 123-139 161-171 192-204 213-232 245-256 PSORT II 95-111 123-139 154-170 190-206 213-229 238-254

7.3 Potentielle Modifizierungsorte der Gpr1p-Orthologen in Saccharomyces cere-visiae

Die Gpr1p-Orthologen wurden mit Hilfe des ELM-Servers (Eucaryotic Linear Motif resource

for functional sites; http://elm.eu.org) auf potentielle Modifizierungsorte untersucht. Die Er-

gebnisse sind in den folgenden Abbildungen dargestellt.

Anlagen

154

Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv von Ycr010cp MSDKEQTSGN TDLENAPAGY YSSHDNDVNG VAEDERPSHD SLGKIYTGGD NNEYIYIGRQ KFLKSDLYQA FGGTLNPGLA PAPVHKFANP APLGLSAFAL TTFVLSMFNA RAQGITVPNV VVGCAM-FYGG LVQLIAGIWE IALENTFGGT ALCSYGGFWL SFAAIYIPWF GILEAYEDNE SDLNNALGFY LLGWAIFTFG LTVCTMKSTV MFFLLFFLLA LTFLLLSIGH FANRLGVTRA GGVLGVVVAF IAWYNAY-AGV ATKQNSYVLA RPFPLPSTER VIF GPR1/FUN34/yaaH-Familienmotiv: NPAPLGLSAF Proteinkinase A-Phosphorylierungsort: ERPSHDS (35-41) Caseinkinase I-Phosphorylierungsort: SGNTDLE (8-14) SHDSLGK (38-44) Caseinkinase II-Phosphorylierungsort: SGNTDLE (8-14) Polo-like-Kinase-Phosphorylierungsort: LENTFGG (143-149) GSK3-Phosphorylierungsort: KEQTSGNT (4-11) AIFTFGLT (195-202) ALTTFVLS (99-106) TVCTMKST (202-209) LENTFGGT (143-150) GVATKQNS (259-266) FGGTALCS (147-154) N-Glycosylierungsort: DNESDL (178-183) FHA-Domäne: TFVL (102-105) TFLL (222-225) TFGL (198-201) Motiv für Interaktion mit AP (Adapter Protein): YIYI (54-57) YGGF (155-158) YQAF (68-71) YAGV (257-260) YGGL (128-131)

Abb. 63: Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv der Gpr1/Fun34/yaaH-Protein-familie von Ycr010cp. Grau unterlegt sind potentiell membranspannende Domä-nen, die mit dem Programm HMMTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/) ermittelt wurden.

Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv von Ydr384cp MTSSASSPQD LEKGVNTLEN IETLPQQGSI AGVSQGFPNI QEIYSDRDFI TLGSSTYRRR DLLNALDRGD GEEGNCAKYT PHQFANPVPL GLASFSLSCL VLSLINANVR GVTDGKWALS LFMFFGGAIE LFAGLLCFVI GDTYAMTVFS SFGGFWICYG YGLTDTDNLV SGYTDPTMLN NVIGFFLAGW TVFTFLMLMC TLKSTWGLFL LLTFLDLTFL LLCIGTFIDN NNLKMAGGYF GILSSCCGWY SLYCSVVSPS NSYLAFRAHT MPNAP GPR1/FUN34/yaaH-Familienmotiv: NPVPLGLASF (86-95) Caseinkinase I-Phosphorylierungsort: SSASSPQ (3-9) SGYTDPT (171-177) SASSPQD (4-10) SVVSPSN (255-261) Polo-like-Kinase-Phosphorylierungsort: TDPTMLN (174-180) LDLTFLL (215-221) GSK3-Phosphorylierungsort: DFITLGSS (48-55) LMCTLKST (198-205) GLASFSLS (91-98) GWYSLYCS (248-255) IGDTYAMT (140-147) SVVSPSNS (255-262) YAMTVFSS (144-151) MAPK-Phosphorylierungsort: SSASSPQD (4-10) (siehe Caseinkinase I) AKYTPHQ (77-83) SVVSPSN (255-261) (siehe Caseinkinase I) FHA-Domäne: TSSA (2-5) TWGL (205-208) TDNL (166-169) TFLL (218-221) Motiv für Interaktion mit AP (Adapter Protein): YFGI (239-242) YLAF (263-266) YCSV (253-256) Cyclin-Erkennungsort: RDLL (60-63) Erkennungsort für 14-3-3 Proteine: RAHTMP (267-272) WW-Domäne (Klasse IV): SASSPQ (4-9) AKYTPH (77-82) (siehe MAPK) SVVSPS (255-260)

Abb. 64: Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv der Gpr1/Fun34/yaaH-Protein-familie von Ydr384cp. Grau unterlegt sind potentiell membranspannende Domänen, die mit dem Programm HMMTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/) ermittelt wurden.

Anlagen

155

Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv von Ynr002cp MSDREQSSGN TAFENPKALD SSEGEFISEN NDQSRHSQES ICKIYTAGKN NEYIYIGRQK FLRDDLFEAF GGTLNPGLAP APVHKFANPA PLGLSGFALT TFVLSMFNAR AQGITIPNVV VGCAMFYGGL VQLIAGIWEI ALENTFGGTA LCSFGGFWLS FGAIYIPWFG ILDAYKDKES DLGNALG-FYL LGWALFTFGL SVCTMKSTIM FFALFFLLAV TFLLLSIANF TGEVGVTRAG GVLGVIVAFI AWY-NAYAGIA TRQNSYIMVH PFALPSNDKV FF GPR1/FUN34/yaaH-Familienmotiv: NPAPLGLSGF (88-97) Proteinkinase A-Phosphorylierungsort: SRHSQES (34-40) Caseinkinase I-Phosphorylierungsort: SGNTAFE (8-14) SQESICK (37-43) SRHSQES (34-40) SVCTMKS (201-207) Caseinkinase II-Phosphorylierungsort: SGNTAFE(8-14) LDSSEGE (19-25) Polo-like-Kinase-Phosphorylierungsort: LENTFGG (142-148) GSK3-Phosphorylierungsort: REQSSGNT (4-11) ALFTFGLS (194-201) ALTTFVLS (98-105) SVCTMKST (201-208) LENTFGGT (142-149) GIATRQNS (258-265) FGGTALCS (146-153) N-Glycosylierungsort: ANFTGE (228-233) FHA-Domäne: TFVL (101-104) TFLL (221-224) TFGL (197-200) Motiv für Interaktion mit AP (Adapter Protein): YIYI (53-56) YAGI (256-259) YGGL (127-130) YIMV (266-269)

Abb. 65: Potentielle Modifizierungsorte und Familienmotiv der Gpr1/Fun34/yaaH-Protein-familie von Ynr002cp. Grau unterlegt sind potentiell membranspannende Domänen, die mit dem Programm HMMTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/) ermittelt wurden.

Danksagung

An dieser Stelle gilt mein herzlicher Dank:

Herrn Prof. Dr. Gerold Barth für die Überlassung des interessanten Themas, für die Möglich-

keit zum selbstständigen und eigenverantwortlichen Arbeiten, seine wertvollen Anregungen

und seine stete Diskussionsbereitschaft.

Herrn Prof. Dr. Gerhard Rödel für die Korrektur des Manuskripts und wertvollen Anregungen.

Herrn Prof. Dr. Stefan Hohmann, der mir im Rahmen eines Marie-Curie-Stipendiums den

Aufenthalt in seiner Arbeitsgruppe in Göteborg ermöglichte.

Dr. Frederic Sidoux-Walter für seine Hilfsbereitschaft während meiner Zeit in Göteborg.

Dr. Marcus Gentsch für gute Hinweise und anregende Diskussionen.

Allen ehemaligen jetzigen und Mitarbeitern des Institutes für Mikrobiologie für das angeneh-

me Arbeitsklima. Mein besonderer Dank gilt Dr. Stefan Mauersberger für seine hilfreichen

Hinweise, die zum Gelingen dieser Arbeit beitrugen.

Meinen Eltern und Andreas für ihr Verständnis und ihre Unterstützung.

Lebenslauf

Name: Margret Kuschel

Geburtstag: 14.03.1976

Geburtsort: Dresden

Familienstand: ledig

seit Mai 2005 Wissenschaftliche Mitarbeiterin

Medizinische Fakultät C. G. Carus an der TU Dresden, Klinik und

Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie, Prof. Dörr

Mai 2002 – Okt. 2002 Forschungsaufenthalt in Schweden

Marie-Curie-Stipendium

Göteborg University, Microbiology, Department of Cell and Mole-

cular Biology, Prof. Hohmann

Okt. 2000 Beginn der Dissertation

TU Dresden, Institut für Mikrobiologie, Prof. Barth

Juli1999 – Sep. 2000 Wissenschaftliche Mitarbeiterin

TU Dresden, Institut für Mikrobiologie, Prof. Barth

1994 – 1999 Studium an der Technischen Universität Dresden

Abschluss: Diplom-Biologin

1992 – 1994 Gymnasium Dresden-Striesen

Abschluss: Abitur, Allgemeine Hochschulreife

1982 – 1992 24. POS Johannes R. Becher Dresden

Abschluss: mittlere Reife

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Mikrobiologie der Technischen Universität Dres-

den unter der wissenschaftlichen Betreuung von Prof. Dr. rer. nat. habil. G. Barth angefertigt.

Versicherung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und

ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus fremden

Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.

Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form

einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Die Promotionsordnung wird anerkannt.

Dresden, den 30.09.2005

Margret Kuschel

Documents

Saccharomyces cerevisiae - GWDGwebdoc.sub.gwdg.de/ebook/dissts/Dresden/Kuschel2006.pdf · Saccharomyces cerevisiae DISSERTATION Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum