Scelta della matrice e prelievo del campione

Laboratorio

Preparazione del campione

Separazione delle sostanze in esame

Trattamento pre-analisi

Analisi strumentale

Valutazione critica del risultato

Preparazione del campione

correzione del pH

omogenizzazionedeproteinizzazione

filtrazione e/o centrifugazione

idrolisi

aggiunta S.I. digestione della matrice

solubilizzazione in opportuno

solvente

“isolamento” sostanze in esame

estrazione liquido-liquido

estrazione in fase solida (SPE)

SPE su cartuccia

Dispersive SPE(D-SPE)

Solid Phase MicroExtraction(SPME)

Molecular Imprinted Polymers (MIPs)

Micro Extraction by Packed Sorbent

(MEPS)

filtrazione su appositi filtri

Estrazione liquido-liquido

Solid Phase Extraction (SPE)

Solid Phase Extraction

fenile

C-18

“fase diretta”

scambio anionico

scambio cationico ammino

ESEMPI DI FASE STAZIONARIA

“Like Dissolves Like”

“Opposites Attract”

Solid Phase MicroExtraction (SPME)

Solid Phase MicroExtraction (SPME)

Solid Phase MicroExtraction (SPME)

Solid Phase MicroExtraction (SPME)

Meccanismi di estrazione dell’analita mediante la fibra

L’absorbimento è tipico dei rivestimenti a fase liquida quali il polidimetilsilossano (PDMS)ed il poliacrilato (PA). Le molecole degli analiti si ripartiscono nella fase della fibra fino adoccuparne l’intero volume.Nell’adsorbimento che si ottiene nei substrati solidi come il Carboxen, la struttura porosadel rivestimento permette di fissare l’analita nei pori della fase solida.

Molecular Imprinted Polymers (MIPs)

SupelMIP SPE Binding Site

CROMATOGRAFIA SU FASE DIRETTA

CROMATOGRAFIA SU FASE INVERSA

CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE(GEL FILTRAZIONE)

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

Cromatografia planare

Thin Layer Chromatography (TLC)

Cromatografia su colonna

a bassa pressione (Low Pressure Chromatography-LPC)

a media pressione (MPLC)

cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC)

cromatografia in fase gassosa (GC)

Thin Layer Chromatography

(TLC)

GAS CROMATOGRAFIA

Colonne capillari: la fase stazionaria viene depositata sotto forma di film sottilissimo (0.1 -5µm) sulla parete interna di un capillare con diametro 0.1-0.75 mm e lungo da 15 a 100 m. Il carrier percorre il canale lasciato libero dalla fase stazionaria

Sistema di iniezione del campione

Il campione viene iniettato (mediante opportuna siringa) attraverso un setto di gomma o silicone nella camera riscaldata in testa alla colonna

La camera viene generalmente riscaldata circa 50°C oltre il p.e. del componente meno volatile.

Per le colonne impaccate il volume del campione varia da 0.1 a 20 µl.

Per le colonne capillari la portata è notevolmente inferiore (almeno un fattore di 100) e richiedono un sistema di ripartizione

Setto

Carrier gas

Septum purge

Splitting

Iniezione frazionata (split)

Le colonne capillari hanno una bassa portata: è quindi necessario che solo una frazione delcampione iniettato raggiunga la colonna. Il sistema di ripartizione (split) invia solo una partedel campione alla colonna e la rimanente parte viene scaricata (rapporto di frazionamentoda 1:50 a 1:100). Si usa tale tecnica quando gli analiti costituiscono almeno lo 0.1% delcampione

Iniezione non frazionata (splitless) del campione

Per campioni diluiti (gli analiti costituiscono meno dello 0.01% del campione) si utilizza la iniezione non frazionata (splitless)

Rivelatori a ionizzazione di fiamma (FID):

E’ ampiamente utilizzato e di tipo universale.

catodo

anodo

L’effluente della colonna vienedirezionato in una fiammaaria/idrogeno.La maggior parte dei compostiorganici quando pirolizzati in talefiamma producono ioni ed elettroniche generano una corrente elettrica(segnale)

Vantaggi: buona sensibilità, rangedinamico, robusto

Svantaggi: metodo distruttivo; nonsensibile a composti nonidrocarburici come ad es. N2, O2,CO2, NH3

Rivelatori a cattura di elettroni (ECD):

• Risponde in maniera selettiva a composti organici contenenti alogeni.

• Il gas che entra nel rivelatore viene ionizzato da elettroni ad alta energia (radiazioni )emessi da una lamina contenente 63Ni radioattivo.

• La ionizzazione del gas di trasporto (solitamente N2) genera un flusso di elettroni attrattidall’anodo (corrente stazionaria).

• Quando le molecole dell’analita ad elevata affinità elettronica entrano nel rivelatore,catturano gli elettroni riducendo la corrente

Vantaggi: sensibilità elevata per composti alogenati

Svantaggi: non sensibile per ammine, alcoli e idrocarburi

Derivatizzazione in GC

•La derivatizazzione è un processo che permette di modificare chimicamente un composto(es. altobollente) al fine di ottenere un nuovo composto le cui proprietà chimico-fisichesono compatibili con l’analisi GC

•La derivatizzazione permette le seguenti modifiche:- aumento la volatilità (elimina la presenza di gruppi polari come OH, SH, NH)- riduzione volatilità (permette l’analisi di composti volatili a basso pesomolecolare difficili da maneggiare e che coeluiscono con il solvente)- aumenta la stabilità- aumenta la sensibilità (inserimento di gruppi alogenati per ECD)

• Le principali reazioni di derivatizzazione sono:• Silanizzazione• Alchilazione• acilazione

DERIVATIZZAZIONE

Silylation Reagents •BSA•MSTFA•BSTFA•HMDS•MTBSTFA•TMCS•TMSI•Deriva-Sil•Hydrox-Sil

Alkylation Reagents •3N HCl in Butanol

Acylation Reagents •PFPA anidride pentafluoro propionica

•HFBA anidride eptafluoro butirrica

•TFAA anidride trifluoroacetica

•MBTFA•HFBI•PFPOH pentafluoro propanolo

GC Chiral Derivatization •TPC•MCF

Reattivi per derivatizzazione

BSTFA

N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

Reazioni di silanizzazione

es. pentafluoropropionic anhydride (PFPA)

Reazioni di acilazione

Analisi quantitativa

1) Standard esterno2) Standard interno3) Metodo dell’aggiunta

Calcolo fattore di risposta (fa):

Ss = area o altezza del picco dell’analita da determinareSsi = area o altezza dello standard internoCsi = concentrazione dello standard interno Cs = concentrazione dell’analita da determinare