MATERNAL PLAZMADAN SERBEST FETAL DNA ANALİZLERİ İLE

ANÖPLOİDİLERİN PRENATAL TANISI

Prof. Dr. Seher Başaran İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi,

Tıbbi Genetik ABD

Live born infants in relation to maternal age in

Switzerland

BEVNAT, BFS KH Nicolaides, NJ Sebire, RJM Snijders

Trizomi 21

Trizomi 18

Trizomi 13

Turner s

Triploidi s

Turner s

Trizomi 18

Trizomi 13

Triploidi s

Trizomi 21

Fetal kromozom anomalilerinin prenatal tanısı

TARAMA Testleri; 1. USG; NT ve

diğer markerler

2. MS-Tarama Testleri;

• Üçlü test, Dörtlü test

• 11-14 hafta testi

• Bunların kombinasyonları

3. MS- fetal DNA/RNA analizleri ile anöploidi

-Kantitatif yöntemler-

TANI Testleri; 1. İnvaziv Girişim (AS,CVS, KS)

sonrası • fetal kromozom analizi • FISH/QF-PCR (anöploidi) • mikroarray/a-CGH

(2. Non-invaziv Yöntem MS- fetal DNA/RNA analizleri

ile fetal cinsiyet ve paternal mutasyonun araştırılması

- Kalitatif yöntemler-)

1. TTT ile DS Yakalama Oranı

1. TTT

>1:300

82%

1. TTT

<1:300

18%

NT ile DS Yakalama Oranı

NT ↑

75%

NT normal

25%

> 35 yaş30%

< 35 yaş70%

İAY ile DS Yakalama Oranı ÜT ile DS Yakalama Oranı

ÜT riski

<1:250

40% ÜT riski

>1:250

60%

Tarama testleri ve duyarlılıkları

Tri 21 prevalansı 1:700 100 Tri 21 doğumu için 70 000 gebelik

Anne yaşı (>35)% 10 7 000 AS 30x Tri 21 70 DS’lu doğacak Üçlü test % 5 3 500 AS 60x Tri 21 40 DS’lu doğacak NT % 5 3 500 AS 75x Tri 21 25 DS’lu doğacak 1.Tri tarama % 5 3 500 AS >90x Tri 21 <10 DS’lu doğacak + USG

…… diğer biokimyasal ve ultrasonografik (burun kökü hipoplazisi, vd) parametrelerin kullanımı ile duyarlılık artmakta……

Amaç, daha az girişim yaparak daha geniş bir populasyona ulaşmak ve daha fazla anomali yakalamak.

Anne kan dolaşımında fetal hücreler (T21) 1:1 000 000

Anne beyninde fetal erkek hücreler

80’ler ve 90’lar anne dolaşımından fetal hücre avı ile geçti….

Anne karaciğerinde fetal erkek hücreler

yıl 2012 ve

PLAZMADA EKSTRASELLÜLER DNA - 1940 larda insanda plazmada ekstraselluler DNA bildirildi, -1990 larda kanser hastalarının plazmalarından elde edilen serbest DNA da tümör kökenli genetik markerler saptandı, -1997 de erkek çocuğa gebe olan kadınların plazmalarında fetusun Y kromozomuna ait markerler gösterildi (Lo et al., 1997).

Maternal Plazmada Dolaşan Fetal DNA’nın Biyolojik Özellikleri

-Serbest dolaşımdaki fDNA’nın % 80’i <200 bp küçük parçalar halinde bulunur ve plazmadaki tüm DNA’nın % 3-10 unu oluşturur, -Implantasyonu takip eden 18 inci günden itibaren maternal serumda saptanmaya başlanır ve gebelik ilerledikçe miktarı artar, -Gebelik bittikten sonra, yarı ömrü 16 dakikadır, -Genel görüş, fDNA nın maternal plazmada kalıcı olmadığıdır; ancak bir yayın fetal DNA nın uzun süre (27 yıl) maternal kanda saptanabildiğini öngörmekte ve bu durum bazı fetal hücrelerin maternal yapıda uzun yaşadığı ve plazma ayrıştırması esnasında tüm nükleuslu hücrelerin iyi uzaklaştırılamaması ile açıklanmaktadır, -fDNA, ağırlıklı olarak plasenta kaynaklı olduğundan, plasentaya ait özellikleri (plasenta ile sınırlı mozaisizm, plasental epigenetik özellikler, vs) de yansıtacaktır.

KLİNİK UYGULAMALAR Maternal kandan alınan plazma örneğinde tüm hücre yapılarının uzaklaştırılması

DNA nın ekstraksiyonu (Minör oranda fetal DNA+Major oranda maternal DNA)

Kalitatif Yöntemler; Maternal ve fetal DNA polimorfizm/değişimlerini tanır

TANI

Kantitatif Yöntemler; Normal ile karşılaştırma esasına göre tanır

TARAMA

www.nature.com/reviews/genetics

Kalitatif yöntemle PATERNAL mutasyonun fetusta TANISI;

Başlangıçtaki DNA Havuzu

Yeni nesil dizileme ile

amplifikasyon

İncelenen tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit

Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu

Anne ye ait DNA fragmanları

Fetusa ait DNA fragmanları

Kantitatif Yöntem; ÖPLOİD FETUSTA BULGULAR

Kromozom 18 13 21

Kromozom 18 13 21

1 : 1 : 1

Başlangıçtaki DNA Havuzu

Yeni nesil dizileme ile

amplifikasyon

21. Kromozom AMPLİKONLARINDA artış

Fetusa ait DNA fragmanları

Anne ye ait DNA fragmanları

Kantitatif Yöntem; ANÖPLOİD FETUSTA BULGULAR

Kromozom 18 13 21

Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu Kromozom 18 13 21

1 : 1 : 1,1

Commercial landscape of noninvasive prenatal testing in the United States Ashwin Agarwal, Lauren C. Sayres, Mildred K. Cho, Robert Cook-Deegan, and Subhashini Chandrasekharan

Prenatal Diagnosis 2013, 33, 521–531

Noninvasive prenatal testing for aneuploidy–ready for prime time? Lyn S. Chitty, Melissa Hill, Helen White, David Wright, Stephen Morris, American Journal of Obstetrics & Gynecology, APRIL 2012

Firma Son yayın

Sequenom Palomaki, 2011 ve 2012

Verinata Bianchi, 2012

Ariosa Norton, 2012 Nicolaides, 2012

Natera Zimmermann, 2012

Nicolaides, 2013

BGI Jiang, 2012

Test adı Materni21 Materni21plus

Verifi Harmony Panorama NIFTY

Teknik MP shotgun S MPSS DANSR- targeted

NGS -SNP based-targeted

MPSS

Hedef Anomaliler

21, 18, 13, X, Y Plus +DGS,5p-, 1p36 -, PW/AS

21, 18, 13, X, Y

21, 18, 13 X,Y

21, 18, 13, X, Y, triploidi

21, 18, 13, X, Y

Olgu sayısı 1971 532 3080 185 903

Duyarlılığı T21 %99,1 T18 >%99,9 T13 %91,7 X/Y %96,2

T21 %100 T18 %97,2 T13 %78,6 X, Y %93,8-100

T21 %100 T18 %97,4 T13 %80

T21 >%99 T18 >%99 T13 >%99 45,X %91,7

T21 %100 T18 %100 T13 %100 45,X %75

Yanlış negatif

T21 3/212 T13 1/12 X/Y 25/26

T18 1/36 T13 3/14 XX 232/233

T21 0/81 T18 1/38 T13 2/10

45,X 1/12

45,X 1/4

Özgüllüğü

T21 %99,9 T18 >%99,6 T13 %99,7 X/Y %99,7

T21 %100 T18 %100 T13 %100 X ,Y %99,6-100

T21 %99,97 T18 %99,93 T13 >%99

Tümü %100

T21 %100 T18 %99,7 T13 %100

Yanlış pozitif

T21, T18, T13 24/1688 ( %1,4)

T21, T18, T13 %0

T21 1/2888 T18 2/2888 T13 1/1939

0

T18 1/891

Cell Free Fetal DNA Uygulama Endikasyonları; • İleri anne yaşı (>35) • Fetal USG de anöploidi riskini arttıran bulgu varsa • Trizomili gebelik öyküsü • MS- tarama testlerinde trizomi için artmış risk •21 ve 13. kromozomlarının katıldığı Robertson tipi translokasyon için taşıyıcı ebeveynlerin gebelikleri

1. Artmış anöploidi (21, 18, 13 için) riski taşıyan gebeliklerde cff-DNA test önerilebilir. Bu teknolojinin <0,5% yanlış pozitiflik ile Down sendromlu fetusların ~ %98 ini yakalaması beklenmektedir. 2. cff-DNA testi rutin prenatal laboratuvar uygulamalarının bir parçası olmamalıdır, ancak test hasta seçimine bırakılmalıdır. 3. cff-DNA testi yeterli deneyim olmadığından düşük risk grubuna veya çoğul gebeliklere önerilmemelidir. 4. Ön danışmada, cff-DNA testinin tanı testi olmamasına rağmen yüksek duyarlılıkta olduğu, sadece sık görülen 5 kromozom anöploidisine yönelik uygulandığı ve diğer genetik hastalıklar için bilgi vermeyeceği belirtilmelidir. 5. Test öncesi aile öyküsü alınmalı ve gebelikte prenatal tanısı mümkün diğer genetik hastalıklar için risk olup olmadığı belirlenmelidir. 6. Eğer fetal USG de anomali saptanırsa invaziv prenatal tanı önerilmelidir. 7. Negativ cff-DNA testi sağlıklı fetusun garantisi değildir. 8. Pozitiv cff-DNA test sonucu alındığında genetik danışmaya yönlendirilmeli ve konfirmasyon amacı ile invaziv prenatal tanı önerilmelidir. 9. cff-DNA testi, CVS veya amniosentezin tanısının güvenilirliğini ve doğruluğunu karşılayamaz .

İnvaziv yöntemlere göre

endikasyon grublarında

saptanan kromozom

anomalileri ve % leri

cff-DNA testi ile

yakalanabilir

anomaliler

n %

cff-DNA testi ile

yakalanamayan

anomaliler

n %

Endikasyon

grublarındaki

rezidual risk

%

CVS-ileri anne yaşı

335’de 15 anomali %4,5

12

66,8

3

33,2

%0,9 1:111

CVS- Tarama testi +

282’de 53 anomali %18,8

39

73,6

14

26,4

%5 1:20

CVS- Patolojik USG

824’de 244 anomali %29,6

199

81,6

45

18,4

%5,5 1:18

AS- ileri anne yaşı

10 430’da 233 anomali %2,2

135

57,9

98

42,1

%0,9 1:111

AS- Tarama testi +

6749’da 185 anomali %2,7

120

64,9

65

35,1

%1 1:100

AS- Patolojik USG

4442’de 378 anomali %8,5

298

78,8

80

21,2

%1,8 1:56

PRETAM+PREMED serilerinde ( 2 453 CVS ve 23 338 Amniosentez) saptanan anomaliler içinde sık görülen 5 anöploidinin oranı ve cff-DNA testinin hassasiyeti %100 kabul edildiğinde hipotetik yakalama/yakalayama oranı

cff-DNA Testi Öncesi Genetik Danışma

Tarama testleri, “hedefe yönelik” testlerdir cff-DNA testlerinin PPV ve NPV değeri? Prenatal tanı = Down s. tanısı değildir Testin (–) olmasının bir garanti olmadığı, FN ve FP olasılıkları testin saptayamadığı anomali olasılıkları

(rezidual risk) anlatılmalı Gebeye NIPD ve IPD farkları anlatılmalı

Ayrıca Türkiye özelinde; Bugüne kadarki uygulamalar nasıl yürütüldü? Genetik “danışma” veriliyor mu? Sonuçlar nasıl ve bunlar kayıt altında mı? cff-DNA testinin izlemde yeri nerededir? Ekstra bir ücret ile yapılan bu testte sorumluluk kimde? Cinsiyet tanısının kötüye kullanımı nasıl

kontrol edilecek? Genetik materyalin topluca yurtdışına gönderilmesi için Sağlık Bakanlığının izni gerek bu konuların tartışılması gerekmiyor mu?

Sorular; 1. Down sendromu için “tanı” mı yoksa tarama mı? 2. Tarama testi + ise, NIPD invaziv prenatal tanının yerini alabilir mi? 3. Fetal kromozom analizinde (CVS ve AS) saptanan diğer anöploidileri saptayabilir mi? 4. FISH veya mikroarray teknikleri ile saptanan mikrodelesyon/duplikasyon sendromları? 5. Klasik tarama testlerinin yerini alır mı? Evet ise biokimyasal ve USG nin konjenital

malformasyonların erken gebeliklerdeki potansiyel faydalarını kaybeder miyiz? Cevaplar; 1. Tanı testi , %100 duyarlılığı ve özgüllüğü olmalı, NIPD çok yüksek duyarlığı olan tarama testidir, tanı testi değildir, 2. Eğer tarama testi + ise ve NIPD + ise Down sendromu riski 290 kez artmıştır, NIPD – ise risk 110 kez azalmıştır ancak çok az da olsa rezidual risk önemli ve ciddidir, 3. T21 anomalilerin yarısını oluşturur, tarama testleri ile diğer anöploidi ve triploidi için risk hesaplanabilir, ancak NIPD çalışmalarında klinik süreç tamamlanmadı, 4. NIPD ile mikrodelesyon/duplikasyon tanısının yakın gelecekte gerçekleşmesi beklenmiyor, 5. USG’nin yerini alamaz.

cff-DNA özellikle non-viable trofoblast kökenli olduğundan “CPM” riskini taşır. NIPD testleri yüksek riskli gruplarda yapılmış ve yapılmaktadır. NIPD’nin düşük ve orta risk grubunda performansı daha düşüktür, buna karşın maliyeti artıracaktır.

Tarama testi > 1:150 ise ->NIPD + ise ->CVS 1:380 Down s. Prevalansı 500 000 gebelikte 1 389 Down s. Taramada >1:150 ise 13 646 NIPD %99 DR ve %1 FPR 1 305 CVS 13 düşük ve 1 169 Down s. NIPD 200 £ ise tarama+tanı 29,7 milyon £

Duyarlılık %100 Özgüllük %99 ( 100’ de 1 yanlış pozitif) Prevelans Down sendromu %10 ise 1000 olguda; Pozitif prediktif değer %91 Prevelans Down sendromu %0,1 ise 1000 olguda; Pozitif prediktif değer %9

……coming soon …….

Bugün 10 Kasım ATAMIZI sevgi ve saygıyla anıyoruz

Yaklaşım Analitik prensip Marker Klinik Uygulama

Fetal DNA da genetik hastalığın dışlanması

Y kromozom arama RHD Paternale özgün hastalıkla ilişkili allel tarama (real time, fluorescence, konvansiyonel PCR, kütle spektrofotometresi/tek alleli çoğaltma)

Fetal cinsiyet (%100 güvenilir) Fetal RHD (rhesus blood group D-antigen) (%100 güvenilir) Fetal HLA (human lökosit antijenleri) haplotiplemesi Paternal mutasyonlar

X-e bağlı hastalıklar Rh- kadınlarda, RHD immunoglobin uygulama kararı için (kafkas ırkında Rh- anne oranı % 15) Konjenital Adrenal Hiperplazi gibi HLA ya bağlı hastalıklar (erkek fetuslar için) B-talasemi, hemoglobin E-hastalığı, kistik fibroz, konjenital adrenal hiperplazi, myotonik distrofi, Huntington hastalığı (fetal DNA yı maternal DNA dan ayırmak için allel spesifik PCR yapmak gerekiyor)

KALİTATİF YÖNTEM

Yaklaşım Analitik prensip Marker Klinik Uygulama

Gebelikle ilişkili hastalıkların takibi için fetal DNA analizi Plasental RNA analizi Epigenetik analizler

Real-time PCR ve benzeri kantifikasyon yöntemleri ile aynı gebelik yaşındaki normaller ile karşılaştırma yapmak Real-time RT- PCR ile plasentaya ait transkriptlerin kuantifikasyonu Transkriptlerin quantifikasyonu; RNA-SNP allelik oranların saptanması Real-time metilasyon spesifik PCR; epigenetik allelik oranlar

Fetal durum, Diğer gebelik komplikasyonları CGB (chorionic gonadotropin,

beta polipeptidi) CRH (Corticotropin releasing

hormone) 21. kromzomun kodladığı transkripitler Hipometile SERPINB5

Fetal aneuploidiler, intrauterin büyüme geriliği, fetomaternal kanamalar Pre-eklamsi, pre-term labour, ektopik gebelik, invazif plasentasyon, hiperemesis gravidatum, polihidramnios Gestasyonal trofoblastik hastalıklar Pre-eklampsi Fetal trisomi 21 Pre-eklampsi, fetal trisomi 18

KANTİTATİF YÖNTEM

Sequenom – LifeCodexx – Materni21 plus

Trizomiler; 21, 18, 13, X and Y ve 16 ve 22 Mikrodeletions; del 22q11.2 (DiGeorge s.), 5p- (Cri-du-chat s.), del 15q11.2 (Prader-Willi/Angelman s., del 1p36

Verinata - Verifi

ARIOSA – Harmony test

HARMONY 400 kan örneği 300 öploid 3 örnekte risk skoru belirlenememiş. 297 örnekte risk değeri < 0,01% specificity %100 50 T21 50/50 risk değeri > 99% sensitivity %100 50 T18 47/50 risk değeri > 99% 1/50 risk değeri > 98,8% 1/50 risk değeri > 88,5% 1/50 risk değeri 0,11% Toplam 49/50 sensitivity %98 FNR %2

2002 örnekten 53 ünde sonuç alınamamış, 1949 örnekte risk skoru alınmış. 10 T13 risk skoru > 99% 8/10 sensitivity 80.0% FNR 20% 1939 öploid risk skoru < 0.01% 1937/1939 specificity 99.9% 0.79% 1/1939 > 99% 1/1939 FPR 0.05% (95% CI,0.0–0.3%)

From prenatal genomic diagnosis to fetal personalized medicine: progress and challenges Diana W Bianchi, Nature Medicine, 2012

Chromosome anomalies

(including mosaics) CVS

n CBCR NIR LR AMA ST P-USG

45,X and variants 42 0 1 0 1 4 36

Polysomy X/Y 6 0 2 0 2 0 2

Tri somy 21 125 1a 0 2 7 29 86

Trisomy 18 61 1a 0 0 1 4 55

Trisomy 13 23 0 0 0 1 2 20

Uncommon trisomies 20 0 2 1 1 8 8

Poliploidies 20 1 0 0 0 2 17

Balanced structural 51 35 5 1 2 1 7

Unbalanced structural 37 21 0 0 0 3 13

Total 385 59 10 4 15 53 244

Table 4a: The number of chromosome anomalies detected in different indication groups of CVS series (385 anomalies detected in 2 453 CVS)

Table 4b: The number of chromosome abnormalities detected in different indication groups of AC series (890 anomalies detected in 23 338 AC)

Chromosome anomalies (including

mosaics) AC

n CBCR

NIR

LR

AMA

ST

P-USG

45,X and variants 58 0 1 0 6b 18bbb 33

Polysomy X/Y 68 0 0 0 32 18 18

Trisomy 21 324 0 1 1 80 75 167 aa

Trisomy 18 87 1a 0 0 13 a 7 66

Trisomy 13 21 0 0 1 4 2 14

Uncommon trisomies 20 0 0 0 5 4 11

Polyploidies 17 0 0 0 1 1 15

Balanced structural 218 64 5 6 74 47 22

Unbalanced

structural 77 11 0 3 18 13 32

Total 890 76 7 11 233 185 378