Upload
doanngoc
View
229
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BAZI SEFALOSPORİN GRUBU ANTİBİYOTİKLERİN ELEKTROKİMYASAL KARAKTERİZASYONU VE
VOLTAMETRİK TAYİNLERİ
Seher İPEKÇİ
Danışman Doç. Dr. Sabriye PERÇİN ÖZKORUCUKLU
YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI
ISPARTA - 2014
TAAHHÜTNAME Bu tezin akademik ve etik kurallara uygun olarak yazıldığını ve kullanılan tüm literatür bilgilerinin referans gösterilerek tezde yer aldığını beyan ederim.
Seher İPEKÇİ
iv
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
BAZI SEFALOSPORİN GRUBU ANTİBİYOTİKLERİN ELEKTROKİMYASAL KARAKTERİZASYONU VE VOLTAMETRİK
TAYİNLERİ
Seher İPEKÇİ
Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Sabriye PERÇİN ÖZKORUCUKLU
Sefalosporinler β-laktam antibiyotiklerinin ikinci büyük grubudur ve dört kuşakta sınıflandırılırlar. Bu antibiyotikler, uygun antibakteriyel aktivite, β-laktamaz direnci ve farmakokinetik özelliklerinden dolayı ağır enfeksiyonların tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bu çalışmada sefalosporin grubunda bulunan sefadroksil vesefoperazonun elektrokimyasal davranışları incelenip bu etken maddelerin çeşitli ortamlarda tayini için voltametrik yöntem geliştirilmiştir. Elektrokimyasal davranışları, karbon grafit elektrot kullanılarak diferansiyel puls voltametri yöntemiyle incelenmiştir. Destek elektrolit ve pH’nın, bileşiklerin elektrokimyasal davranışları üzerine etkisi incelenmiştir. Gözlenebilme sınırı (S/N=3) sefadroksil ve sefoperazon için sırasıyla 5,50×10-7M ve 7,608×10-6 M olarak bulunmuştur. Aynı şekilde alt tayin sınırı (S/N=10) sefadroksil için1,835×10-5M ve sefoperazon için 2,536×10-5 M’dır.Optimize edilen yöntem ile farmasötik ve kanörneklerinde sefoperazonun tayinigerçekleştirilmiştir. Bu uygulamalarda %100’e yakın geri kazanım değerlerielde edilmiştir. Elektrot yüzeyine kütle transferini karakterize etmek için pik akımları üzerine tarama hızının etkisi dönüşümlü voltametri yöntemi ile incelenmiş ve elektrokimyasal davranışın difüzyon kontrollü olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler:Sefalosporin, İlaç Analizi, Antibiyotik, Elektrokimyasal Biyosensör 2014, 100sayfa
v
ABSTRACT
M.Sc. Thesis
ELECTROCHEMİCAL CHARACTERİZATİON AND VOLTAMMETRİC DETERMİNATİON OF SOME CEPHALOSPORİN GROUP ANTİBİOTİCS
Seher İPEKÇİ
Süleyman Demirel University
Graduate School of Applied and Natural Sciences Department of Chemistry
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Sabriye PERÇİN ÖZKORUCUKLU
Cephalosporins are the second major group of β-lactam antibiotics, they are classified into four generations. These antibiotics are widely used in clinical therapy for the treatment of severe infections, because of their convenient antibacterial activity, β-lactamases resistance and pharmacokinetic properties. In this study, the electrochemical behaviours of cefadroxil and cefoperazone that are located in the cephalosporin group were examined and voltammetric method was developed for determining those substances in the different mediums. The electrochemical behaviours of the substances in the different mediums. The electrochemical behaviours of the substances were examined at a carbon graphite electrode by using differential pulse voltammetry. Effect on electrochemical behaviour of supporting electrolyte and pH were determined. The limit of detection (S/N=3) was found to be 5,50×10-7 M and 7,608×10-6 M, respectively for cefadroxil and cefoperazone. Similarly limit of quantification (S/N=10) was 1,835×10-5M for cefadroxil and 2,536×10-5 M for cefoperazone. The cefoperazone analysis with these optimized method was carried out in pharmaceutical and biological sample. In such applications, recovery values around 100% were reconised. To characterize the mass transfer to the electrode surface, effect of the scan rate on the peak currents was examined by the cyclic voltammetry method. It is determined that electrochemical behavior was diffusion controlled. Keywords: Cefalosporin, Drug Analysis, Antibiotic, Electrochemical Biosensors 2014, 100pages.
vi
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimine başladığım ilk günden itibaren her konuda desteğini gördüğüm, bilgi ve yaklaşımı ile örnek aldığım, çalışma azmini bana yansıtan, en önemlisi bana insani değerlerin her şeyden yüce olduğunu öğreten ve yolumu aydınlatan değerli danışman hocam Doç. Dr. Sabriye PERÇİN ÖZKORUCUKLU’ya teşekkürlerimi sunmaktan onur duyarım. Düşlediğim geleceğe ulaşmam için kilometrelerce öteden maddi manevi desteklerini esirgemeyen babam Feridun İPEKÇİ ile annem Meryem İPEKÇİ’ye ve ablam Şule ERBİL ile eniştem Orçun ERBİL’e teşekkürü borç bilirim. Yüksek lisans öğrenimim süresince karşılaştığım zorluk ve sıkıntılarda her zaman yanımda olan ve beni yüreklendirip umut veren arkadaşlarım Gizem YILDIRIM’a, Cansel ÇAKIR’a ve Elif SEKMEN’e değerli dostlukları için sonsuz teşekkür ederim. 3755-YL2-13 no’lu proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı’na teşekkür ederim.
Seher İPEKÇİ
ISPARTA, 2014
vii
ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa
Şekil 1.1. Elektroanalitik tekniklerin sınıflandırılması ....................................... 4 Şekil 1.2. Doğrusal taramalı voltamogram eğrisi................................................ 7 Şekil 1.3. (a) 1 M HCl’de 5x10-4 M Cd2+ (b) 1 M HCl çözeltisi için
pologramlar ........................................................................................... 8 Şekil 1.4. Voltameterik hücre ve bileşenleri ....................................................... 10 Şekil 1.5. Voltametride kullanılan çalışma elektrotları ....................................... 12 Şekil 1.6. Karbon grafit elektrot .......................................................................... 14 Şekil 1.7. Kalomel elektrotun şematik gösterimi ................................................ 16 Şekil 1.8. Ag/AgCl referans elektrotunun şematik gösterimi ............................. 17 Şekil 1.9. Tipik bir doğrusal taramalı voltamogram ........................................... 19 Şekil 1.10. Voltamogramın elde edilmesinde kullanılan dönüşümlü
voltametrik uyarma sinyali ................................................................... 20 Şekil 1.11. Pik potansiyellerini ve akımlarını gösteren klasik bir dönüşümlü
voltamogram ......................................................................................... 20 Şekil 1.12. Elektrot yüzeyinde oluşan elektriksel çift tabaka ............................. 22 Şekil 1.13. Elektrokimyasal çalışmalarda pik şeklini ve pik akımını etkileyen
olası dönüşümler ................................................................................... 25 Şekil 1.14. Normal puls voltametrisinde (a) uyarma sinyali ve (b) elde edilen
voltamogram ......................................................................................... 27 Şekil 1.15. Diferansiyel puls polarografisi için uyarma sinyalleri ...................... 28 Şekil 1.16. Kare dalga voltametrisinde uyarma sinyallerinin oluşumu .............. 29 Şekil 1.17. Beta laktam halkası ........................................................................... 31 Şekil 1.18. Bakteri hücre duvarındaki proteini oluşturan zincirsel yapılar ve
aminoasit bağlantıları ............................................................................ 32 Şekil 1.19. Sefalosporinlerin yapısı .................................................................... 33 Şekil 1.20. Gram (+) ve gram (-) bakterilerde sefalosporinlerin etki
mekanizması ......................................................................................... 34 Şekil 1.21. Sefalosporinlerin sınıflandırılması .................................................... 34 Şekil 1.22. Sefolasporinlerin yapısı .................................................................... 36 Şekil 1.23. Sefadroksilin yapısı ........................................................................... 37 Şekil 1.24. Biyosensörlerin yapısı ve çalışma prensibi ....................................... 38 Şekil 1.25. Analizlenecek madde-biyoaktif bilesen ilişkisine göre;
a) Biyoafinite esaslı biyosensorler, b) Biyokatalitik esaslı biyosensörler, c) İmmobilize hücre esaslı biyosensorler, d) Transmembran esaslı biyosensörler.................................................. 40
Şekil 1.26. Enzim molekülünün jel içinde veya polimer matrikste tutuklanması ............................................................................................................... 43
Şekil 1.27. Enzim molekülünün film veya tabakaya çapraz bağlanması ............ 43 Şekil 1.28. Enzim molekülünün elektrot yüzeyinde adsorpsiyonu ..................... 44 Şekil 1.29. Amperometrik esaslı bir biyosensörun şematik gösterimi ................ 45 Şekil 1.30. Potansiyometri esaslı biyosensörler .................................................. 46 Şekil 1.31. Enzim alan etki transistörü................................................................ 47 Şekil 3.1. Autolab Potentiostat/Galvanostat PGSTAT-302N cihazı ................... 62 Şekil 3.2. Elektrokimyasal cam hücre ................................................................. 63 Şekil 3.3. Deneylerde kullanılan elektrokimyasal hücrenin görünümü .............. 63 Şekil 3.4. Çalışma elektrotu olarak kullanılan 0,7 mm. HB Tombo karbon
bazlı kurşun kalem ucu ......................................................................... 64
viii
Şekil 3.5. Referans elektrot olarak kullanılan Ag/AgCl elektrot ........................ 64 Şekil 3.6. Karşıt elektrot olarak kullanılan Pt tel ................................................ 64 Şekil 4.1. a) Sefadroksil bulunmayan ve b) 0,050 mM sefadroksil içeren
çözeltide (0,2 M asetat pH 5 tamponu) alınan DPV voltamogramların karşılaştırılması ....................................................... 72
Şekil 4.2. 0,05 mM sefadroksilin asetat tamponunda pH-akım grafiği .............. 73 Şekil 4.3. 0,05 mM sefadroksilin fosfat tamponunda pH-akım grafiği .............. 73 Şekil 4.4. 0,05 mM sefadroksilin Britton Robinson tamponunda pH-akım
grafiği .................................................................................................... 74 Şekil 4.5. 0,05 mM sefadroksilin pik akımına destek elektrolit ve pH’nın etkisi
............................................................................................................... 74 Şekil 4.6. pH 5 asetat tamponunda 0,005 mM ve 0,05 mM arasında değişen
sefadroksilin derişimleri için alınan diferansiyel puls voltamogramları .................................................................................... 75
Şekil 4.7. Sefadroksilin asetat pH 5 tamponunda 0,005 mM ile 0,05 mM arasında değişen sefadroksil derişimlerine karşı DPV ile elde edilen akım değerlerinin grafiği....................................................................... 75
Şekil 4.8. 0,5 mM sefadroksil içeren çözelide farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramlar .................................................................. 76
Şekil 4.9. a) Sefoperazon bulunmayan ve b) 0,10 mM sefoperazon içeren çözeltide (0,2 M asetat pH 5,25 tamponu) alınan DPV voltamogramlarının karşılaştırılması .................................................... 77
Şekil 4.10. 0,1 mM sefoperazonun asetat tamponunda pH-akım grafiği ............ 77 Şekil 4.11. 0,1 mM sefoperazonun fosfat tamponunda pH-akım grafiği ............ 78 Şekil 4.12. 0,1 mM sefoperazonun Britton Robinsom tamponunda
pH-akım grafiği ..................................................................................... 78 Şekil 4.13. 0,1 mM sefoperazonun pik akımına destek elektrolit ve pH etkisi .. 79 Şekil 4.14. pH 5,25 asetat tamponunda 0,05 mM ve 1 mM arasında değişen
sefoperazonun derişimleri için alınan diferansiyel puls voltamogramları .................................................................................... 79
Şekil 4.15. Sefoperazonun asetat pH 5,25 asetat tamponunda 0,05 mM ile 1 mM arasında değişen sefoperazon derişimlerine karşı elde edilen akım değerinin grafiği ........................................................................... 80
Şekil 4.16. 0,1 mM sefoperazonun 0,2 M asetat tamponunda (pH 5,25), karbon grafit elektrottaki dönüşümlü voltametri voltamogramları ....... 80
Şekil 4.17. Sabit derişimde pik akımının tarama hıının karekökü ile değişimi .. 82 Şekil 4.18. Sabit sefoperazon derişiminde pik akımının logaritmasının
tarama hızının logaritması ile değişimi ................................................. 82 Şekil 4.19. Sefoperazon içeren sülperazon isimli farmasötik numunenin
pH 5,25 asetat tamponunda 0,25 mM, 0,50 mM ve 0,75 mM derişimlerinde DPV yöntemi ile alınan voltamogramları ..................... 83
Şekil 4.20. Sefoperazon içeren kan numunesinin pH 5,25 asetat tamponunda 0,25 mM, 0,30 mM ve 0,50 mM derişimleri için alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları ...................................................... 84
Şekil 4.21. İdrar numunesinin pH 5,25 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları ...................................................... 85
Şekil 4.22. İdrar numunesinin pH 5,00 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları ...................................................... 85
Şekil 4.23. İdrar numunesinin pH 5,00 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları ...................................................... 86
ix
ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 3.1. Kullanılan kimyasal maddeler ........................................................65 Çizelge 3.2. Sefadroksilin özellikleri ..................................................................66 Çizelge 3.3. Sefoperazonun özellikleri ...............................................................66 Çizelge 5.1. Sefalosporinler için elde edilen optimum çalışma koşulları ...........90 Çizelge 5.2. Sefadroksil ve sefoperazon için yükseltgenme gerilimi ve
yükseltgenme akım değerleri ................................................................90 Çizelge 5.3. Sefadroksil ve sefoperazon için gözlenebilme ve alt tayin
sınır değerleri ........................................................................................91 Çizelge 5.4. Sefoperazon için çalışılan farmasötik numunenin tayin sonuçları .92 Çizelge 5.5. Sefoperazon için çalışılan kan numunesinin tayin sonuçları ..........93
x
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
ACN : Asetonitril BR : Britton Robinson tamponu CV : Dönüşümlü voltametri DC Doğru akım DPV : Diferansiyel puls voltametri DKE : Doygun kalomel elektrot GC : Camsı karbon elektrot KDV : Kare dalga voltametri N : Gürültü NPV : Normal puls voltametri PV : Puls voltametrisi PGE : Kalem ucu grafit elektrot RSD : Bağıl standart sapma S : Sinyal SHE : Referans hidrojen elektrot
1
1. GİRİŞ
Günümüzde antibiyotiklerin yaygın ve kontrolsüz kullanılması, yoğun bakım desteği,
kemoterapi, transplantasyon olanakları sayesinde insan ömrünün uzaması, yaşlı
popülasyonunun artması antibiyotik tüketiminde artışa neden olmuştur. Beta laktam
antibiyotikler yan etkilerinin azlığı ve bakterisid olmaları nedeniyle günümüzde en
sık kullanılan antibiyotik grubudur.
Betal laktam antibiyotiklerden en çok tüketilen türlerinden sefalosporinler yarı
sentetik antibiyotiklerdir ve antimikrobiyal etki spektrumlarına göre dört ana kuşakta
sınıflandırılırlar. Genel bir kural olarak, birinci kuşak bileşikler gram (+)
organizmalara karşı daha iyi aktiviteye sahipken, diğer bileşikler gram (-) aerobik
organizmalara karşı daha iyileştirilmiş aktiviteye sahiptirler.
İlaç analiz yöntemleri, oluşturulan ilaç formunda yer alan (tablet, kapsül vb.) etken
maddenin tanımlanmasında, beyan edilen dozun nicel analizinden ve her ilaç
formundaki dozun aynı olduğunu kanıtlamak amacıyla kullanılmaktadır. Etken
maddelerin analizinin yanı sıra ilaç formunda bulunan koruyucuların nicel analizinin
yapılmasın da ilaç raf ömrünün belirlenebilmesi açısından önemlidir. Diğer yandan
ilacın saflığının ve kararlılığının sağlanabilmesi için üretim sürecinden
kaynaklanabilecek safsızlıkların izlenmesi de gereklidir. Ayrıca, klinik çalışmalar
sırasında plazma ve serum gibi fizyolojik sıvılarda ilaç ve olası metabolitlerin tayini
içinde analiz yöntemleri kullanılmaktadır.
İlaç analizleri veya biyolojik öneme sahip moleküllerin analizlerinde yöntem
geliştirilirken biyolojik ortamın karmaşık yapısı ve olası girişim etkileri de göz
önünde bulundurulmalıdır. Bu zorlukların üstesinden gelebilmek için birçok
yöntemde; ayırma, saflaştırma, özütleme, deriştirme gibi bazı ön işlemlere ihtiyaç
duyulmaktadır. Bu ön işlemler ise hem analizin maliyetini arttırmakta hem de analiz
için gerekli sürenin uzamasına sebep olmaktadır.
İlaç analizlerinde kromatografik yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu
yöntemlerin aynı anda çok sayıdaki molekülün tayinini mümkün kılması, kolay
2
uygulanabilir olması, tekrarlanabilir sonuç vermesi gibi birtakım üstünlükleri
mevcuttur. Bu üstünlüklerin yanısıra karmaşık ve pahalı cihazlara gereksinim
duyulması gibi dezavantajları da vardır. Ayrıca bu yöntemlerin uygulanmasında fazla
miktarda kimyasala ihtiyaç duyulması da ayrı bir dezavantajdır.
Son zamanlarda voltametrik yöntemlerin elektrokimyasal olarak aktif olan türlerin
tayininde yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanması oldukça dikkat çekicidir. Bu
yöntemler kolay uygulanabilmekte, diğer yöntemlerden daha az miktarlarda kimyasal
kullanılmakta ve gerekli sistemler daha ucuza kurulabilmektedir. En önemlisi,
geliştirilen elektrokimyasal yöntemlerin gözlenebilme ve alt tayin sınırları diğer
yöntemlerde bulunanlara göre oldukça düşük olabilmektedir. Ayrıca numunenin ayrı
bir ön işleme tabii tutulmaması bu yöntemlerin ilaç analizlerindeki kullanımını
arttırmaktadır.
Voltametri ve polarografi yöntemleri ilaç analizlerinde ilk kez 1954 Çekoslovak
farmakopesinde kullanılmıştır. Voltametri ile saf etkin maddenin yanında çok
kompleks bir karışım olsa bile (çözünmeyen ilaç katkı maddeleri, serum yada
plazmada bulunan endojen maddeler v.b.) aktif maddelerin analizi duyarlılıkla ve
herhangi bir girişim olmaksızın yapılabilmektedir. Polarografik veya voltametrik
yöntemlere pek çok ilaç etkin maddesi ve vücutta bulunan fizyolojik aktif maddeler
cevap vermektedir. İlaç analizlerinde kromatografik ve fotometrik yöntemlere
alternatif yöntem olarak nitelendirilen modern voltametri bu yöntemlerle yarışmalı
olmaktan çok onları tamamlayıcı niteliktedir (Wang vd., 2006).
Bu tez çalışmasında sefalosporinler grubu bazı bileşiklerin (sefoperazon, sefadroksil)
elektrokimyasal davranışları karbon grafit elektrot kullanılarak diferansiyel puls
voltametri yöntemiyle incelenmiştir. Bileşiklerin elektrokimyasal davranışları
üzerine destek elektrolitin ve destek elektrolit pH’sının etkileri incelenerek; pik
akımı ve gerilimlerinin destek elektrolit pH’sı ile değişimleri değerlendirilmiştir.
Elektrot yüzeyine kütle transferini karakterize etmek için dönüşümlü voltametri
yöntemi ile pik akımları üzerine tarama hızının etkisi bakılmıştır. Elektrokimyasal
davranışları belirlenen bileşikleri içeren farmasötik dozaj formlarında, insan idrar
veserum örneklerinde bu bileşiklerin analizleri belirlenen optimum deneysel
3
koşullardagerçekleştirilmiştir. Sefalosporin grubu bileşikler için geliştirilen metodun
doğruluğu, duyarlılığı, uygulanabilirliği ve tutarlılığını gösterebilmek için gerekli
validasyon parametreleri çalışılmıştır.
1.1. Elektroanalitik Kimya
Elektroanalitik kimya; çözeltilerin elektrokimyasal bir hücrede elektriksel
özelliklerinin ölçülmesi ve ölçülen bu özelliklerinden yararlanılarak maddelerin
kalitatif ve kantitatif analizine dayanan teknikleri içeren, Analitik Kimya biliminin
önemli bir dalıdır. Maddelerin elektrokimyasal özelliklerini analiz amacıyla
kullanılan yöntemlere de elektroanalitik yöntemler adı verilir (Skoog vd., 1996).
Elektrokimyasal tepkimelerde, yükseltgenme (elektron verme)–indirgenme(elektron
alma) reaksiyonları söz konusudur ve elektrokimyasal hücre adı verilen bir hücrede
gerçekleşir. Bir elektrokimyasal tepkimenin oluşabilmesi için, incelenecek maddeyi
içeren ve elektriksel iletkenliği sağlayan bir çözelti (tampon çözelti), maddenin
kimyasal dönüşüme uğradığı elektrot sistemi (genellikle üçlü elektrot sistemi) ve bu
elektrotları birbirine bağlayan bir çevirim sistemi (transducer) gereklidir. Hücrede
bulunan iyon ve molekül halindeki madde katot adı verilen elektrotta elektron alarak
indirgenir. Bu indirgenme ile birlikte yürüyen anot adı verilen elektrotta ise iyon
veya molekül halindeki madde ya da elektrot malzemesinin kendisi elektron vererek
yükseltgenir. Böylece elektrotlarda tepkimeye giren her bir tür, dış devrede belli
sayıda elektronun iletilmesine neden olur. Elektrik akımı elektrik yükünün akışı
nedeniyle oluşur. Elektrotları birbirine bağlayan devredeki metalik kısımlarda
elektrik yükü elektronlar tarafından taşınır. Metallerde bulunan değerlik elektronları,
bir örgü düzeni içinde bulunan ve belli bir frekans ile titreşen metal iyonları arasında
serbestçe hareket ederek yükü taşırlar. Çözeltide ise elektrik yükünün taşınması bu
ortamlarda bulunan iyonlar tarafından gerçekleştirilir. Metallerdeki elektronların
elektrik yükünü taşıması sonucu ise iyonik iletkenlik oluşur.
Elektroanalitik yöntemlerin avantajları;
• Hızlı ve tekrar edilebilirlikleri yüksektir,
• Kullanılan cihazlar diğer yöntemlerde kullanılan cihazlara göre daha ucuzdur,
4
• Analizi yapılacak maddenin çok düşük tayin sınırlarına kadar ulaşılabilir,
• Elde edilen elektrokimyasal ölçümler çoğu kez bir elementin ya da molekülün
özel bir yükseltgenme basamağı için spesifiktirler (Tural vd., 2003).
Elektroanalitik yöntemler, net akımın sıfır olduğu denge durumundaki statik (i=0)
yöntemler ve denge durumundan uzakta net akımın gözlendiği dinamik (i≠0)
yöntemler olmak üzere esas olarak iki ana grupta sınıflandırılmaktadır. Dinamik
yöntemler genelde ya potansiyel kontrollü ya da akım kontrollüdür. Potansiyel veya
akımın kontrol edildiği yöntemlerde bu parametreler, büyük genlikli veya küçük
genlikli olarak uygulanır. Elektroanalitik yöntemlerin çok çeşitli sınıflandırma yolları
vardır. En yaygın olarak kullanılan, sınıflandırma şekli aşağıda verildiği gibidir
(Kissinger ve Heineman, 1996).
Şekil 1.1. Elektroanalitik tekniklerin sınıflandırılması
1.2. Voltametri
Potansiyel kontrollü tekniklerden olan voltametri, elektroaktif türlerin bulunduğu
hücrede elektrota uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak akımın ölçülmesi
temeline dayanan elektroanalitik yöntemlerin genel adıdır (Bond, 1980; Bard ve
Rubinstein, 1999; Wang vd., 2006). Voltametride, çalışma elektrotunun potansiyeli
5
bir potansiyometre yardımıyla referans elektrota karşı değiştirilir ve hücreden (üç
elektrotlu sistemlerde çalışma elektrotu ile yardımcı elektrot arasından, iki elektrotlu
sistemlerde çalışma elektrotu ile referans elektrot arasından) geçen akım
galvonometreyle ölçülür. Ölçülen akımın uygulanan potansiyele karşı grafiği çizilir.
Bu akım potansiyel eğrilerine voltamogram adı verilir (Bond, 1980).
Voltametrinin temelleri, Çek kimyager Jaroslav Heyrovsky tarafından 1922 yılında
polarografi denen bir teknikle atılmış ve ilerleyen yıllarda bu teknik geliştirilip
yaygınlaştırılmıştır. Polarografide çalışma elektrotu olarak damlayan civa elektrot
kullanılmaktadır.
Günümüzde ise voltametrik teknikler farmasötik, biyolojik (idrar, serum, vb.) ve
çevre örneklerinin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun nedeni; düşük
derişimlerde farmasötik analizlerin yapılabilmesi, numunelerin kolayca ve çok kısa
bir sürede hazırlanabilmesi, analiz süresinin kısa olması, ortamda bulunan katkı
maddelerinin veya safsızlıkların analiz sonucunu etkilememesi ve bu tekniklerin ürün
kalite kontrolünde kullanılabilmesidir. Tablet, kapsül, süspansiyon, şurup gibi ilaç
formülasyonlarının çözünmeyen kısımlarının veya katı maddelerin genelde
elektroaktiviteleri bulunmadığı için herhangi bir ayırma işlemine gerek olmadan
analizleri yapılabilmektedir. Ayrıca diğer bir avantajı da, daha ekonomik olması ve
ilaçların analizinde çok az miktarda numuneye ihtiyaç duyulmasıdır. Çevre
örneklerinde (toprak, su) ise özellikle eser miktardaki toksik ağır metal ve bunların
farklı yükseltgenme basamağındaki türlerin analizinde yaygın olarak
kullanılmaktadır.
1.2.1. Voltametride kullanılan parametreler
1.2.1.1. Sınır akımı
Uygulanan belirli bir potansiyelden sonra akımın sabit kaldığı bir plato bölgesine
ulaşılır. Bu akıma sınır akımı adı verilir. Bu akım elektrot yüzeyinde elektroetkin
türün derişiminin sıfıra gittiği andaki akım değeridir ve potansiyelden bağımsızdır.
Sınır akımı, analitin kütle aktarım işlemiyle elektrot yüzeyine taşınma hızındaki
6
sınırlamadan kaynaklanır. Sınır akımları genellikle analitin derişimi ile doğru
orantılıdır.
İ1 = k.CA (1.1)
Burada; CA : Analit derişimi,
k : Bir sabittir.
Kantitatif doğrusal taramalı voltametri bu ilişkiye dayanır. Bunun dışında, hızlı bir
şekilde sınır akımları elde etmek için çözelti veya mikroelektrot sürekli ve
tekrarlanabilir bir hareket halinde olmalı ya da damlayan cıva elektrot gibi bir
damlayan elektrot kullanılmalıdır.
1.2.1.2. Yarı dalga potansiyeli
Akımın, sınır akımının yarısına ( is/2) karşılık gelen potansiyel değeridir ve E1/2 ile
gösterilir. Referans elektrot potansiyeline göre düzeltildikten sonra yarı dalga
potansiyeli, reaksiyonun potansiyeli ile yakından ilgilidir. Yarı dalga potansiyelleri
bazen bir çözeltideki bileşenlerin belirlenmesinde faydalıdır.
1.2.1.3. Artık akım
Elektrot üzerinde henüz reaksiyon olmadığı zaman küçük de olsa bir akım gözlenir.
Bu akıma artık akım denir. Artık akımın büyüklüğü yöntemin duyarlılığını belirler.
Bu akım giderildiği veya en aza indirildiği oranda duyarlılık artar. Sınır akımı
ileartık akım arasındaki yükseklik, dalga yüksekliğidir. Dalga yüksekliği, elektroaktif
maddenin konsantrasyonu ile doğrusal olarak artar. Bu akımın sebebi, hemen hemen
bütün çözeltilerde bulunan eser miktarlardaki safsızlıkların indirgenmesidir. Bu
safsızlıklar içinde az miktarda çözünmüş oksijen, damıtık sudan gelen ağır metal
iyonları ve destek elektrolit olarak kullanılan tuzdaki safsızlıklar sayılabilir. Şekil
1.2’de doğrusal taramalı voltamogram eğrisi üzerinde sınır akımı, yarı dalga
potansiyeli ve artık akım gösterilmiştir.
7
Şekil 1.2. Doğrusal taramalı voltamogram eğrisi
1.2.1.4. Göç akımı
Eğer incelenecek olan elektroaktif madde iyonik yapıda ise bu iyonlarla elektrot
arasında elektrostatik etkileşim söz konusudur. Herhangi bir elektrostatik etkinin
olmadığı koşullarda ölçülen sınır ile bu koşullarda elde edilen sınır akımı arasındaki
farka göç akımı denir.
Polarografide elektroaktif türün göç akımı istenmediğinden ortama yüksek derişimde
destek elektrolit eklenerek, incelenecek türün göç akımı önlenir. Bu durumda
incelenecek türün taşıma sayısı, minimuma düşürülerek elektrostatik göç
elektroinaktif olan elektrolit tarafından sağlanır.
1.2.1.5. Difüzyon akımı
Polarografide dalga yüksekliğinin en önemli bileşeni difüzyon akımıdır. Polarografik
şartlar, dalga yüksekliğinin sadece difüzyon akımından dolayı olması için ayarlanır.
Yani madde aktarımının sadece difüzyonla olması istenir. Plato bölgesinde
elektroaktif tür elektrot yüzeyine gelir gelmez indirgenir veya yükseltgenir. Bu
durumda elektrot yüzeyinin hemen yanındaki tabakada derişim sıfır olur. Elektrot
yüzeyi ile ana çözelti arasında derişim farkı olacağından difüzyon kuvveti oluşur.
Polarografide elektroaktif türün sadece bu derişim farkından dolayı elektrot yüzeyine
gelmesi istenir.
8
Polarografideki tek kütle aktarım şekli difüzyondur. İşte bu sebepten polarografik
sınır akımlarına genellikle difüzyon akımları denir. Yani; akımın büyüklüğü,
analitin damlayan cıva elektrot yüzeyine sadece difüzyon hızı ile sınırlandığı zaman
polarografide gözlenen sınır akımıdır. Difüzyon akımı, analit derişimiyle orantılıdır.
Şekil 1.3’de gösterildiği gibi difüzyon akımı, sınır akımı ile artık akımlar arasındaki
farktır.
Şekil 1.3. (a) 1 M HCl’de 5x10-4 M Cd2+(b) 1 M HCl çözeltisi için pologramlar
Genellikle sınır akımının şu akımlardan oluştuğu söylenebilir; (İd) difüzyon akımı,
(İk) cıva damlası etrafındaki çift tabakanın yüklenme veya boşalmasından oluşan
kapasitif akımı, (İf) elektrottaki önceki elektrolitik proseslere bağlı faraday akımı,
(İm) elektroliz olabilen maddenin transfer sayısının yeterince büyük olması halinde
ilettiği taşıma, (İa) çözelti-elektrot ortak yüzeyinde çözeltinin karıştırılmasında
indirgenebilir maddelerin adsorbsiyonundan ve diğer olaylardan meydana gelen
akımdır (Sakallı, 2006). Böylece şu eşitlik yazılabilir:
İi = İd + İk + İf + İm + İa (1.2)
9
1.2.1.6. Nernst eşitliği
Elektrokimyasal bir analizde elektroaktif türün elektrot yüzeyindeki
konsantrasyonunu bulmak için elektrot potansiyellerinin kullanılması Nernst
denklemine göre açıklanabilir. Çözelti ve elektrot arasındaki yüzeyden akımın iletimi
sırasında, elektrotlardan birinde yükseltgenme reaksiyonları olurken diğerinde
indirgenme reaksiyonu meydana gelir. Bu reaksiyonlarda;
O + ne-↔ R (1.3)
O ve R’nin, sırasıyla, redoks çiftinin, yükseltgenmiş ve indirgenmiş şeklini ifade
ettiği tepkime ile gösterilmektedir.
Termodinamik kurallarla kontrol edilen sistemlerde, elektrot potansiyeli, elektroaktif
türün elektrot yüzeyindeki derişiminin [C0(0,t) ve C
R(0,t)], Nernst Denklemine göre
saptanmasında kullanılabilir.
E = E0 + 2,303 RT / nF log (C0/CR) (1.4)
E0= Redoks tepkimesi için standart potansiyel
R = Gaz sabiti (8,314 JK-1mol-1)
T = Sıcaklık (K)
n = Reaksiyonda transfer edilen elektron sayısı
F = Faraday sabiti (96,487 coulombs)
1.2.2. Voltametrik kap bileşenleri Voltametrik ölçümler voltametrik hücrede yapılır. Voltametrik hücre; voltametrik
kap, çalışma elektrotu, karşılaştırma (referans) elektrotu, yardımcı elektrot ve destek
elektrolitten oluşur.
10
Şekil 1.4. Voltameterik hücre ve bileşenleri
1.2.2.1. Voltametrik kap
Voltametrik analizler cam, kuvars veya teflon kaplarda yürütülür. Kabın yapıldığı
malzeme kirlenme ve adsorpsiyon yanılgılarının en az olduğu maddelerden seçilir
(Yılmaz, 2008).
1.2.2.2. Destek elektrolit
Hücre içindeki çözeltilerde tayini yapılacak maddeden (analitten) başka bir madde
daha bulunur. Buna destek maddesi veya destek elektrolit denir. Destek elektrolit
deney şartlarında elektroaktif olmayan (elektrolizlenmeyen) maddedir. Hidrodinamik
voltametride iyonların elektrik çekim etkisiyle elektrotlara göç etmelerini en aza
indirmek için destek elektrolit ilave edilir. Destek elektrolitin konsantrasyonu, tayini
yapılan maddenin konsantrasyonunun en az 80 katı olması gerekir. Bu şartlarda
tayini yapılanın elektrik etkisiyle elektrota doğru göçü ve dolayısıyla taşıdıkları
elektrik miktarı ihmal edilecek seviyeye gelir. Bu da tayini yapılacak iyonun, zıt
yüklü elektrota doğru çekiminin veya göçünün elektrota uygulanan potansiyelden
bağımsız hale geldiğini gösterir.
Voltametride destek elektrolit, analit çözeltisine fazla miktarda ilave edilen bir
tuzdur. En yaygın tuzlar, analit tayininde kullanılan potansiyelde mikroelektrotta
reaksiyona girmeyen alkali metal tuzlarıdır. Bu amaçla ortama KCl, KNO3gibi bir
organik tuz, bir mineral asidi veya baz katılabilir. Sitrik asit/sitrat veya asetik
11
asit/asetat gibi tampon sistemleri pH kontrolünün gerektiği konularda destek
elektrolit olarak kullanılabilir. Çalışmalardaki destek elektrolit konsantrasyonu 0,01-
1,0 M arasında değişir ve genellikle 0,1 M civarında kullanılır. Ohmik düşmelerdeki
değişmelerden sakınmak için, destek elektrolit konsantrasyonu örnekten örneğe hep
aynı şekilde olmalıdır. Destek elektrolit hazırlanmasında çok yüksek saflıkta
reaktifler kullanılır. Belirli bir elektrokimyasal teknik için kullanılan özel bir
elektrolit yoktur, ancak o tekniğin şartlarına göre seçim yapılır. Örneğin polarografi
için yaygın elektrolit türleri 0,1 M KCl, LiCl, NH4Cl dür. Tampon olarak asidik
bölgede asetik asit/asetat, bazik bölgede amonyum klorür/amonyak tamponu
kullanılır. Bununla birlikte sitrat, malonat ve fosfat tamponları kullanılan diğer
destek elektrolitlerdir (Erdoğdu, 1995).
1.2.2.3. Çalışma elektrotu
Elektroanalitik kimyada çalışma elektrotu, potansiyeli zamanla değişen ve üzerinde
analitin yükseltgendiği veya indirgendiği mikroelektrottur. İndirgenme veya
yükseltgenme bu elektrotta gerçekleşir. Bu elektrota genel olarak indikatör elektrot
da denir.
Voltametrik yöntemlerde kullanılan çalışma elektrotları polarlanmanın olabilmesi
için küçük yüzey alanına sahip olmalıdır. Bunun için kullanılan çalışma elektrotları
mikroelektrotlardır. Mikroelektrotların kullanılması sonucunda örnekteki elektroaktif
türlerin çok küçük bir miktarı elektrokimyasal tepkimeye girmektedir. Böylece
örneğin bileşimi hemen hemen aynı kalır. Bunun sonucunda aynı örneğin defalarca
voltamogramı alınabilmektedir. Çalışma elektrotu ile referans elektrot arasında
potansiyel uygulanırken, çalışma elektrotu ile karşıt elektrot arasında akım kaydedilir
(Türe, 2008).
Çalışma elektrotunun malzemesi, voltametrik işlemin performansını büyük ölçüde
etkiler. Çalışma elektrotu, büyük sinyal/gürültü özelliğine sahip olmalı ve tekrarlanır
cevaplar vermelidir. Bu yüzden elektrot seçimi öncelikle iki faktöre dayanır. Bu
faktörler hedef analitin redoks davranışı ve ölçüm için gerekli olan potansiyel
bölgesindeki zemin akımıdır. Diğer faktörler ise potansiyel aralığı, elektriksel
12
iletkenlik, yüzeyin yenilenebilmesi, mekanik özellikler, maliyet, uygunluk ve toksik
etkidir. Kullanılan her malzeme kendine has avantaj ve dezavantajlara sahiptir ve
mümkün olduğunca çok gereksinime cevap verecek şekilde seçilmelidir. Elektro
analizler için çalışma elektrotu olarak birçok malzeme kullanılmaktadır. En sık
kullanılanları cıva, karbon veya platin ve altın gibi soy metallerdir (Wang, 2001).
Şekil 1.5. Voltametride kullanılan çalışma elektrotları
1.2.2.3.1. Cıva kökenli elektrotlar
Cıva elektrotlar, üzerinde hidrojenin çıkış potansiyelinin büyük olması nedeniyle
oldukça geniş bir katodik çalışma potansiyel aralığına ve her damlada yenilenen
elektrot yüzeyine sahiptirler. Metallerle amalgam oluşturma özelliğinden dolayı,
metal iyonlarının metalik halde önderiştirilmesini sağlarlar. Bu özellikleri nedeniyle
de voltametride oldukça geniş bir kullanım alanı bulurlar (Haskılıç, 2005). Damlayan
cıva elektrot, asılı cıva damla elektrot ve cıva film elektrot bu amaçla kullanılan
elektrotlardır. Bütün bu üstün özelliklerine karşın cıva elektrotların bazı sınırlamaları
da vardır. Metalik cıvanın düşük pozitif gerilimde bile kolayca yükseltgenebilmesi
(∼+0.4V ), cıva elektrotun kullanılmasını sınırlayan en önemli özelliklerden birisidir.
13
Ayrıca kullanılan cıvanın temizlenmesi, damlama süresinin ayarlanmasının zorluğu,
cıvanın damlatılmasında kullanılan kılcalların tıkanması, cıva buharlarının toksik
olması ve tekniğin doğrudan doğruya uygulanamaması bu elektrotun
kullanılmasındaki başlıca sorunlardır (Tural vd., 2003).
1.2.2.3.2. Katı elektrotlar
Civa kökenli elektrotların anodik çalışma bölgesi dardır. Elektrot yapılan
malzemenin anodik çözünmesinin daha pozitif potansiyellerde olması, bu elektrotlara
daha geniş anodik çalışma bölgesi sağlar. Bu nedenle bu özelliğe sahip platin, altın
gibi soy metaller ve karbon, elektrot yapımında kullanılır. Fakat yüzeylerinin
yenilenmemesi ve yüzeylerin kirlenmesi elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini
azaltır.
Platin elektrot, en çok kullanılan katı elektrottur. Oksit oluşumundan dolayı
kirlenebilir yüzeye sahiptir. Bu nedenle düşük tekrarlanabilirlik gösterir.
Altın elektrot, oksit oluşumundan az etkilendiği gibi adsorbsiyonu da platin elektrota
göre daha azdır.
Bizmut elektrot, hidrojenin bizmut üzerinden çıkış potansiyelinin aşırı yüksek
olması, bizmutun katodik bölgede kullanılma olasılığını ortaya koymuştur. Uçucu ve
zehirli olmaması cıvaya göre üstünlüğüdür.
Karbon elektrot, karbon geniş bir anodik potansiyel aralığına, düşük elektriksel
dirence, düşük artık akıma ve tekrarlanabilir yüzey yapısına sahip oluşu gibi birçok
özellikleri yönünden ideal bir elektrot malzemesidir. Karbon elektrot çeşitleri;
• Grafit,
• Karbon pasta,
• Camsı karbon,
• Perde baskılı karbon elektrotlar olarak sıralanabilir.
14
� Grafit elektrot;grafit ve grafit çubuklar yalnız grafit kömüründen imal edilir.
Toz ve sıkı bir yapıya sahiptir. Grafit elektrot olarak genellikle karbon grafit
elektrotlar kullanılmaktadır. Bunun sebebi oldukça kolay hazırlanabilmesi,
ucuz olması ve tek kullanımlık olmasıdır (Erdoğdu, 1995). Elektrokimyasal
çalışmalarda geniş bir kullanım alanı vardır. Analizi yapılacak maddeler,
uygun elektrokimyasal teknikler kullanılarak daha düşük tayin sınırlarına
ulaşılabilir.
Şekil 1.6. Karbon grafit elektrot
1.2.2.3.3. Modifiye elektrotlar
Voltametride kullanılan elektrotların sınırlı olması nedeniyle elektrotların kimyasal
veya elektrokimyasal özellikleri değiştirilerek çalışma şartları geliştirilmiştir.
Modifiye elektrotlar, genel olarak elektrot yüzeyinde önderiştirme sağlayan kimyasal
maddelerle işlem veya elektrot yüzeyinin elektron aktarma özelliğini değiştiren işlem
(elektrokataliz) yapılarak hazırlanır (Yılmaz, 2008).
� Kompozit Elektrotlar:Modifiye edici kimyasal doğrudan iletken
malzemesine katılıp, karıştırılarak elektrot hazırlanabilir. Bu tür elektrotlara
“kompozit elektrotlar” adı verilir.
� Kimyasal modifiye elektrotlar: Modifiye edici kimyasal elektrot yüzeyine
kimyasal bağla veya kimyasal adsorpsiyonla bağlanarak kimyasal modifiye
15
elektrotlar hazırlanabilir. Ayrıca modifiye edici uygun bir monomer
elektrotyüzeyinde elektropolimerizasyona uğratılarak ya da elektrot yüzeyinde
doğrudan polimer film oluşturularak da bu tür elektrotlar hazırlanabilir.
1.2.2.3.4. Dönen elektrotlar
Dönen elektrotlar; dönen-disk ve halka-disk elektrotlar olarak ikiye ayrılır. Bu
elektrotlar platin ve camsı karbondan yapılıp, bir motor sistemi ile dönme hızları
kontrol edilir. Kimi zaman diğer katı elektrotlar doğrudan veya cıva ile kaplanarak da
kullanılabilir.
Dönen disk elektrotlarla elektrota madde taşınması konvektif difüzyonla
sağlandığından durgun elektrotlardan daha büyük bir akım yoğunluğu sağlarlar. Bu
nedenle, bu tür elektrotlarla yapılan ölçümlerde duyarlık daha yüksektir.
Halka-disk elektrotlar, ortadaki diskten elektriksel olarak yalıtılmış ve belli bir
uzaklıkta halka şeklinde ikinci bir elektrot içerirler. Bu elektrot ikilisi
kullanıldığında, disk elektrotta elektrokimyasal olarak oluşan tür, elektrotun dönme
hareketiyle halka elektrota doğru taşınır.
1.2.2.4. Referans elektrot
Bu elektrotlar, bilinen ve sabit bir potansiyel değeri sağlayan ve incelenen çözeltinin
bileşiminden etkilenmeyen elektrotlardır. Karşılaştırma elektrotunun bileşimi
değişmez ve analiz boyunca polarlanmadan kalır. Bu amaçla Ag/AgCl veya doygun
kalomel elektrot (DKE) kullanılır.
Bu elektrotlardan anodik akım geçtiğinde metaller yükseltgenir ve ortamdaki aşırı
klorürle çökeldiklerinden, elektrot yüzeyindeki derişimleri değişmez ve böylece
potansiyelleri akımdan bağımsız olur. Bu elektrotlardan katodik akım geçtiğinde ise,
çözünürlükten gelen metal iyonları indirgenir, elektrot yüzeyinde çökelek ayrışarak
tekrar aynı denge düzeyinde metal iyonu oluşturur. Böylece potansiyel yine
değişmeden kalır.
16
İyi bir referans elektrot
� Tersinir olmalı,
� Nerst eşitliğine uymalı,
� Zamanla bağımlı olmayan sabit bir potansiyel vermeli,
� Az miktarlarda akım elde edildikten sonra yine eski haline kısa sürede dönmeli,
� Sıcaklık değişimlerinde önemli bir değişiklik göstermemelidir.
1.2.2.4.1. Kalomel elektrot, Hg/Hg2Cl2
Elektrotta gerçekleşen;
Hg2Cl2 + 2e-↔ 2Hg + 2Cl-E0 = 0,268 V ( 250 C, SHE )
bu reaksiyonun potansiyeli ortamdaki klor iyonu konsantrasyonuna bağlıdır. Kalomel
elektrot, referans elektrot olarak çok kullanılan elektrotlardan bir tanesidir.
Laboratuvarda kolaylıkla hazırlanabilir. Dengeye gelmesi için yapıldıktan sonra
birkaç gün bekletilmelidir. Sıcaklık değişimlerinden kolay etkilenen bir elektrottur.
Yarı-hücre diyagramı:
Hg | Hg2Cl2 (doygun), KCl (x M) ||
Nernst eşitliği:
E = E0 – 0,0591 log aCl- (1.5)
Şekil 1.7. Kalomel elektrotun şematik gösterimi
17
1.2.2.4.2. Gümüş/gümüş klorür elektrot
Elektrotta gerçekleşen;
AgCl (k) +e-↔ Ag (k) + Cl-E0 = 0,222 V ( 250 C, SHE )
reaksiyonuna dayanır. Bir tüpün en alt kısmında cam veya plastikten yapılmış poröz
bir tıpa, bunun üstünde çözelti sızmalarını önlemek için potasyum klorürce doymuş
bir köprü, onun üstünde katı potasyum klorür ve en üstte de içine 1–2 damla gümüş
nitrat damlatılmış doymuş potasyum klorür çözeltisi bulunur. Bu çözeltinin içine ucu
AgCl ile kaplanmış gümüş bir tel daldırılır. Gümüş-gümüş klorür referans elektrotları
da doygun kalomel elektrotlar gibi oldukça yaygın kullanılırlar. Bu elektrot doygun
kalomel elektroda göre daha yüksek sıcaklıklarda kullanılabilir ve daha az analitle
reaksiyona girer.
Yarı-hücre diyagramı:
Ag (k) | AgCl (doygun), KCl (xM) ||
Nernst eşitliği:
E = E0 – 0,0591 log aCl- (1.6)
Şekil 1.8. Ag/AgCl referans elektrotunun şematik gösterimi
18
1.2.2.5. Karşıt (yardımcı) elektrot
İki elektrotlu sistemlerdeki polarlanmayan elektrot, üzerinden yüksek akım
geçtiğinden polarlanır. Ayrıca eğer çözelti direnci yüksek ise bu direnci yenmek için
gerekli potansiyel önemli düzeye çıkacağından, çalışma elektrotunun polarizasyon
potansiyeli yanlış algılanabilir. Bu karışıklığın önlenmesi için üçüncü bir elektrotun
yani yardımcı bir elektrotun kullanılması gerekir. Çalışma elektrotu ve yardımcı
elektrottan akım geçirilip çalışma elektrotunun potansiyeli, karşılaştırma elektrotuna
karşı sıfır akım altında saptanır. Akım yardımcı elektrot üzerinden geçtiği için bu
elektrotların platin, grafit, tantal ve tungsten gibi soymetal olmaları gerekmektedir.
Ayrıca çok küçük hacimlerle çalışıldığında yardımcı elektrottaki ürünlerin çalışma
elektrotunda girişim yapmayacağı ve çalışma elektrotunun alanının en az 50 katı olan
elektrotlar seçilmelidir.
Helezon şeklinde sarılmış bir Pt tel, elektriğin kaynaktan gelerek çözelti içinden
mikroelektrota aktarılmasını sağlayan karşıt elektrot olarak çalışır. Karşı elektrotun
çalışma elektrotundaki reaksiyona etkisi olmaz, sadece onu elektronlarla besler.
1.2.3. Voltametride kullanılan uyarma sinyalleri
1.2.3.1. Doğrusal taramalı voltametri
Bu yöntemde uyarma sinyali, doğru akım potansiyelinin zamanla doğrusal bir şekilde
arttırılmasıyla elde edilir. Uygulanan bu potansiyel sonrasında analizlenen maddeye
özgü akım cevapları, potansiyelin bir fonksiyonu olarak voltamogramlarda incelenir.
Doğrusal taramalı voltametride, iyi pik maksimumları elde edebilmek için yarı–dalga
potansiyel farkı en az 0,2 V civarında olmalıdır.
19
Şekil 1.9. Tipik bir doğrusal taramalı voltamogram
Şekildeki 1.9’daki voltamograma göre, başlangıçta (A noktasında) akım çok
düşüktür. Safsızlık ve çift tabaka yükleme (elektrot yüzeyi kondansatör gibi
davrandığından) sebebiyle A ve B noktaları arasında akım yavaşça yükselir. Bu
genellikle zemin akımı olarak adlandırılır. B noktasında potansiyel, yükseltgenmiş
türlerin indirgenme potansiyeli değerine yaklaşır. Potansiyel artışı elektronların,
elektrottan yükseltgenmiş türe doğru artan bir hızla göç etmesine sebep olur.
İndirgenmedeki hız artışı hücredeki akımı da arttırır. Bu artış sürekli devam etmez
görüldüğü gibi C noktasında bir pik ile sonuçlanır.
1.2.3.2. Dönüşümlü voltametri (CV)
Dönüşümlü voltametri, durgun bir çözelti içinde bulunan çalışma elektrotuna
uygulanan potansiyel polarizasyon dalgasının düzgün bir şekilde
değiştirilmesisonucu oluşan akım-potansiyel davranışını inceleyen elektrokimyasal
yöntemdir. Dönüşümlü voltametri nitel analiz için kullanılan en yaygın
elektrokimyasal yöntemdir (Wang vd., 2006).
Çalışılan potansiyel aralığı, verilen bir deney için bir veya daha fazla analitin
yükseltgenme veya indirgenmenin meydana geldiği potansiyel aralığıdır ve buna
“çevirici potansiyeller“ de denir.
20
Şekil 1.10. Voltamogramın elde edilmesinde kullanılan dönüşümlü voltametrik uyarma sinyali
Şekilde gösterildiği gibi potansiyel doğrusal olarak değiştirilir daha sonra tarama
yönü tersine çevrilir ve orijinal değerine geri döner. Başlangıç taramasının yönü
numunenin bileşimine bağlı olarak negatif ya da pozitif olabilir.
Bu yöntemde örnek çözeltisine potansiyel uygulandığında, elektrot yüzeyi uygulanan
potansiyele göre pozitif ya da negatif bir karakter gösterir ve çevresindeki çözeltiden
elektron alır ya da çözeltiye elektron verir bu da ölçülebilir bir akım oluşmasına
neden olur. Çalışma ortamında karıştırma yapılmadığı için elektron transferi elektrot
yüzeyi ve çevresinde olur. Bu nedenle elektrot çevresindeki bileşen miktarı zamanla
azalır. Sonuç olarak oluşan akımda zamanla bir pik yapar ve azalmaya başlar. Bu
pikler indirgenme ve yükseltgenme pikleridir.
Şekil 1.11. Pik potansiyellerini ve akımlarını gösteren klasik bir dönüşümlü voltamogram
Dönüşümlü voltamogramın önemli parametreleri, katodik pik potansiyeli Epc, anodik
pik potansiyeli Epa, katodik pik akımı ipc ve anodik pik akımı ipa’ dır. Tersinir bir
21
elektrot reaksiyonu için anodik ve katodik pik akımları mutlak değer olarak yaklaşık
eşittir; fakat zıt işaretlidir. Pik potansiyellerinin farkı 0,0592/n’ dir. Burada n, yarı-
reaksiyonda yer alan elektron sayısıdır.
Tersinir bir elektrokimyasal tepkimede analite ait pik akımı aşağıdaki eşitlikle
bulunur:
İp = 0,27 n3/2 AD1/2 C v1/2 (1.7)
İp analite ait pik akımı, n transfer edilen elektron sayısı, A elektrot yüzey alanı (cm2),
D türlere ait difizyon katsayısı (cm2/s), C türlerin çözelti içerisindeki derişimleri
(mM), v ise tarama hızıdır (V/s).
Dönüşümlü voltametride analitin duyarlılık sınırı 10-5 M’dır. Dönüşümlü voltametri
rutin kantitatif analizlerde kullanılmadığı halde, özellikle organik ve metal organik
sistemlerde yükseltgenme - indirgenme işlemlerin mekanizma ve hız çalışmaları için
önemli bir araçtır. Bu yöntem, normal de elektrokimyasal olarak belirtilebilen bir
sistemin araştırılması için seçilen ilk yöntemdir (Bard ve Rubinstein, 1999).
1.2.3.2.1. Dönüşümlü voltametride akım çeşitleri ve önemli parameterler
Diğer elektrokimyasal yöntemlerde olduğu gibi voltametrik çalışmalarda da
kaynağına bağlı olarak isimlendirilen iki farklı akım vardır:
a) Faradayik akım (if): Elektrotlardan birinde yükseltgenme reaksiyonu olurken
diğerinde indirgenme reaksiyonu olur, bu sırada elektronların doğrudan aktarımı
ile akım iletilir. Bu tip işlemlere, bir elektrottaki kimyasal reaksiyon miktarının
geçen akımla orantılı olduğunu ifade eden Faraday yasalarına uygun olması
nedeniyle “Faradayik işlemler“ adı verilir. Bu şekilde oluşan akımlara “Faradayik
akımlar“ denir. Kısacası; bir elektrokimyasal hücrede elektrot/çözelti ara yüzeyi
boyunca bir yükseltgenme/indirgenme işlemiyle taşınan akımdır. Reaksiyondan
(analiz edilecek maddeden) kaynaklanan akımdır. Analizlenecek madde ve
22
ürünlerin konsantrasyonları yalnızca elektrot yüzeyinden uzaklığın bir
fonksiyonu olarak ve Nerst tabakası içinde değişir.
b) Kapasitif akım (ic): Elektrot/çözelti ara yüzeyindeki yüklü bir çift tabakada
oluşan bir yükleme akımıdır. Bir elektrotun bir elektrolit çözeltisine daldırılması
ve negatif yükle yüklenmesi ile çözeltideki pozitif yüklü iyonlar elektrota doğru
çekilir. Böylece ara yüzeyde bir gerilim farkı oluşur. Ters işaretli yüklerin ara
yüzeyin iki tarafında birikmesi ile bu bölgede bir elektriksel çift tabaka oluşur.
Oluşan bu çift tabaka, bir kapasitör gibi davranır. Bu kapasitörü yüklemek için
ortamda yükseltgenecek ve indirgenecek madde olmasa dahi bir akım oluşur. Bu
akım reaksiyona bağlı değildir; sistemden kaynaklanır ki bu akıma “kapasitif
akım“ denir. Ne kadar düşük olursa o kadar doğru ölçüm yapılır.
Şekil 1.12. Elektrot yüzeyinde oluşan elektriksel çift tabaka
Örneğin ilk önce elektrota pozitif bir potansiyel uygulandığında, elektrota bitişik
çözeltinin yapısını dikkate alalım. Potansiyel, uygulandıktan hemen sonra eğer
elektrotun yüzeyinde reaksiyona girebilecek aktif bir tür yoksa hızlı bir şekilde sıfıra
düşen anlık bir akım dalgası oluşacaktır. Bu akım her iki elektrotun da yüzeyinde bir
negatif yük fazlalığı (veya eksikliği) yaratan bir yükleme akımıdır. Fakat iyonik
hareketliliğin bir sonucu olarak elektrotlara bitişik olan çözelti tabakalarında derhal
bir zıt yüklenme oluşur. Bu etkileşim şekil 1.12’de görülmektedir. Metal elektrotun
yüzeyinde uygulanan pozitif potansiyelin bir sonucu olarak oluşan pozitif yük
fazlalığı gösterilmektedir. Yüklü çözelti tabakası iki kısımdan oluşmaktadır:
23
(1) Bir yoğun iç tabaka (d0' dan d1' e), bu tabakada elektrot yüzeyinden
uzaklaşıldıkça potansiyel mesafe ile doğrusal ilişkili olarak azalır,
(2) Bir difüze tabaka (d1' den d2' ye), burada elektrot yüzeyinden uzaklaşıldıkça
ortaya çıkan potansiyel üstel olarak azalır. Elektrot yüzeyindeki, yüzeye bitişik
çözeltideki bu yük topluluğu bir “elektriksel çift tabaka“ olarak adlandırılır
(Bond, 1980).
Toplam akım (i) = faradayik akım (if) + kapasitif akım (ic) olduğundan kapasitif
akım azalırsa duyarlılık artar. Genellikle 10-3 M ve üstünde kapasitif akım, faradayik
akımdan küçüktür ve çalışılabilir. 10-4 M da kısmen iyi sonuç alınır. 10-5 M ve
üzerinde kapasitif akım faradayik akımdan çok büyük olacağı için çalışılmaz.
Dönüşümlü voltametride çalışma elektrotuna uygulanan potansiyel için deneysel
olarak kontrol edilebilecek değişik parametreler vardır. Bunlar;
a) Başlangıç potansiyeli: Çalışma elektrotuna uygulanacak olan potansiyel
taramasının başladığı potansiyel değeridir. Çalışmalarda başlangıç potansiyelinin
elektron aktarımının olmadığı bir değer seçilmesi tercih edilir.
b) Dönme potansiyeli: Potansiyel taramasının yönünün değiştirileceği (anodik
yönden katodik yöne veya katodik yönden anodik yöne) potansiyel değeridir.
c) Bitiş potansiyeli: Potansiyel taramasının sonlandırılacağı potansiyel değeridir. Bu
değer incelenen özelliklere göre başlangıç potansiyeli ile aynı veya başlangıç
potansiyelinden farklı bir değer olabilir.
d) Anodik tarama: Başlangıç potansiyeline göre daha pozitif potansiyel değerine
doğru yapılan potansiyel taramasıdır. Bu taramada olası yükseltgenme
davranışları incelenir.
24
e) Katodik tarama: Başlangıç potansiyeline göre daha negatif potansiyel değerlerine
doğru yapılan potansiyel taramasıdır. Bu taramada olası indirgenme davranışları
incelenir.
f) Tarama hızı: Başlangıç potansiyelinden bitiş potansiyeline kadar yapılacak olan
potansiyel taramasında potansiyelin hangi hızda değişeceğini belirten
parametredir. Tepkime mekanizmasının aydınlatılmasında oldukça önemlidir.
g) Segment: Başlangıç potansiyelinden dönme potansiyeline kadar yapılan taramaya
veya bu tarama sonucu elde edilen voltamograma “segment” denir.
h) Döngü: Başlangıç potansiyelinden bitiş potansiyeline kadar yapılan, genelde iki
segmentten oluşan taramaya veya bu tarama sonucu elde edilen voltamograma
“döngü” denir.
Bu parametreler kontrol edilerek sabit tarama hızında, uygulanan potansiyele karşı
oluşturulan akım grafiğine “volt-amperogram” (voltamogram) denilir. Bir
voltamogramın çalışmalara ışık tutabilecek farklı parametreleri şunlardır:
a) Pik potansiyeli (Ep): Uygulanan potansiyelin elektron aktarımına sebep olduğu,
faradayik akımın en yüksek değere ulaştığı andaki potansiyel değeridir.
Elektrokimyasal çalışmalarda elde edilebilecek olası bir pikin potansiyeli;
incelenen molekülün yapısal özelliklerine, çalışmaların yapıldığı çalışma
elektrotuna, pH’ya, kullanılan destek elektrolit ve çözücü cinsine, sıcaklığa ve
tarama hızına göre değişiklik gösterebilir. Pik potansiyeli ve pik
potansiyelindedeneysel koşullara göre meydana gelebilecek değişiklik, yapılan
elektrokimyasal çalışmada elde edilecek termodinamik ve kinetik sonuçlar için
oldukça önemlidir.
b) Yarı pik potansiyeli (Eh, Eph, Ep1/2): Pik akımının en yüksek değerinin yarısına
ulaştığı noktadaki potansiyel değeridir. Bazı durumlarda yarı pik potansiyelinin,
pik potansiyeline göre daha spesifik ve termodinamik-kinetik sonuçlar için daha
kesin sonuçlar verdiği bilinmektedir.
25
c) Yarı pik genişliği (ypg): Pik akımının en yüksek değerinin yarısına ulaştığı
noktadaki pik genişliğidir.
d) Pik akımı (ipa, ipc): Uygulanan potansiyel sonucunda meydana gelen elektron
aktarımının oluşturduğu akımdır. Bu akımın büyüklüğü; elektron aktarımına
katılan türlerin derişimine, bu türlerin difüzyon ve adsorpsiyon özelliklerine,
kullanılan çalışma elektrotuna ve bu elektrotunun yüzey alanına, kullanılan
destek elektrolit ve çözücü cinsine ve derişimine, sıcaklığa ve tarama hızına
bağlıdır. Pik akımının ölçülmesinde farklı yaklaşımlar sergilenmekle birlikte
faradayik akımın kapasitif akımdan farklılaşmaya başladığı noktaya çizilen teğet
ile pik akımının maksimum değere ulaştığı noktaya çizilen teğet arasındaki dik
uzaklığın ölçülmesi en doğru yaklaşımdır.
e) Pik alanı (Ap): Yapılan çalışmalarda elde edilen pikin altında kalan alandır. Bazı
yazılım programlarında birimi kulon bazılarında ise voltamper olarak
verilmektedir.
Dönüşümlü voltametride çalışmaların yapıldığı moleküllere ait karakteristik pikin
şekli ve akımı Şekil 1.13’de şematik olarak gösterilen ve elektrot yüzeyinin çok
yakınındaki difüzyon tabakasında meydana gelen dönüşümlerden etkilenmektedir.
Şekil 1.13. Elektrokimyasal çalışmalarda pik şeklini ve pik akımını etkileyen olası
dönüşümler
26
1.2.3.2.2. Dönüşümlü voltametri yöntemi ile akım türünün belirlenmesi
Voltametrik yöntemlerde akım türünü belirlemek oldukça önemli ve gereklidir.
Çünkü akım türüne göre uygulanacak teknikler değişmektedir. Örneğin difüzyon
kontrollü akım türlerinde normal teknikler, adsorpsiyon kontrollü akım türlerine ise
sıyırma teknikleri uygulanır.
Voltametride akım türü çeşitli yöntemlerle belirlenebilir. Bunlardan dönüşümlü
voltametri yöntemiyle akım türünü belirlemek oldukça kolay ve yaygın bir tekniktir.
Bu yöntemde akım türünü belirlemek için yüksek konsantrasyonda (1×10-4-1×-5 M )
CV yöntemiyle 10-10000 mVs-1 aralığındaki tarama hızlarında voltamogramlar alınıp
tarama hızlarına bağlı olarak akım değişimi incelenir.
Tarama hızı-akım verilerinden yararlanarak tarama hızının kareköküne karşılık pik
akımı değerleri grafiği ve tarama hızının logaritmasına karşılık pik akımının
logaritması grafiği çizilir. Logv-logip grafiğinin eğiminin 0,5 civarında olması akımın
difüzyon kontrollü olduğunu gösterir. Ayrıca ν1/2-ip grafiğinin korelasyon
katsayısının 1’e yakın olması yine akımın difüzyon kontrollü olduğunun diğer bir
göstergesidir. Logν-logip grafiğinin eğiminin 0,75-1 aralığında olması ve ν1/2-ip
grafiğinin korelasyon katsayısının 1’den uzaklaşması akımın adsorpsiyon kontrollü
olduğunu gösterir(Yılmaz, 2008).
1.2.3.3. Normal puls voltametrisi (NPV)
Normal puls voltametrisi yönteminde şiddeti giderek artan bir seri puls istenen
zaman aralıklarında çalışma elektrotuna uygulanmaktadır. Uygulanan pulsların
şiddetleri her seferinde lineer olarak arttırılırken elektrot, pulslar arasında analitin
reaksiyonuna neden olmayacak sabit bir gerilimde tutulmaktadır. Akım puls
uygulamasının sonuna doğru, yani yükleme akımının yaklaşık sıfır olduğu durumda
ölçülmektedir. Ölçülen akım değerleri gerilime karşı grafiğe geçirildiğinde,
sigmoidal şeklinde voltamogram elde edilmektedir (Perçin, 2008). Şekil 1.14’de
normal puls voltametri yönteminde elektroda uygulanan potansiyel programı ve elde
edilen akım-potansiyel eğrisi verilmiştir.
27
Voltametrinin duyarlığı artık akıma bağlı olduğundan duyarlılığı arttırmak için artık
akımın giderilmesi gerekir. Gerilimlerin puls şeklinde uygulanması artık akımın
giderilmesine dolayısıyla duyarlığın artmasına neden olur. Çalışma elektrotuna puls
şeklinde gerilim uygulandığında artık akımın kapasitif bileşeni neredeyse sıfır
gibidir. Böylece pulsun sonundaki artık akım, faradaik akımdan kaynaklanmakta ve
duyarlık 10-6 – 10-7 M düzeyine çıkmaktadır.
Şekil 1.14. Normal puls voltametrisinde (a) uyarma sinyali ve (b) elde edilen voltamogram
1.2.3.4. Diferansiyel puls voltametrisi
Diferansiyel puls teknikleri birçok sıvı ve dokulardaki elektroaktif türlerin iz
miktarlarının tayininde geniş olarak kullanılmaktadır. Puls tekniklerisabit veya
değişen DC (doğru akım) sinyali üzerine bir kare dalganın biniştirilmesi ile oluşan
bir uyarıcı sinyalin uygulandığı tekniklerdir. En yaygın olarak kullanılan puls tekniği
diferansiyel puls polarografisi veya voltametrisi olup, yavaşça yükselen bir DC
sinyali üzerine yükseklikleri sabit pulslarının biniştirilmesi ile oluşan uyarıcı sinyal
kullanılmaktadır. Akım, pulstan hemen önce ve pulsun sonuna doğru iki kere
ölçülerek bunların farkı, çıktı olarak kaydedilmektedir. Her bir analite ait pik
potansiyeli (Ep), yarı-dalga potansiyeline (E1/2) bağlı olarak,
Ep = E1/2 – ΔE / 2 (1.8)
Eşitliğinden hesaplanabilir. Burada; ΔE, puls genliğidir. Puls genliğinin ve
potansiyelin iyi seçilmesiyle duyarlılık artırılabilir. Birçok durumda 50 mV luk bir
28
potansiyel farkı ile pikleri birbirinden ayırt edilebilir. Tersinmez redoks sistemlerinde
daha düşük ve daha geniş akımlar (duyarlılık daha zayıf) elde edilmektedir.
Diferansiyel puls polarogramın bir üstünlüğü, yarı dalga potansiyelleri 0,04-0,05V
kadar farklı olan maddeler için bile pik maksimumları elde edilmesidir, oysa klasik
ve normal puls polarografisinde yarı dalga potansiyel farkı en az yaklaşık 0,2
Volmalıdır. Aksi takdirde dalgalarda iyi bir çözüm elde edilemez. Daha da önemlisi,
diferansiyel puls polarografisi, polarografik metodun duyarlığını artırır.
Normal puls voltametrisinde puls sonundaki artık akım az da olsa kapasitif akım
içerir. Kapasitif akımın artık akım içindeki payını azaltmak, duyarlığı arttırmak
amacıyla pulsun başlangıcında ve sonunda ölçülen akımların farkları alınmış ve
diferansiyel puls voltametrisi adında yeni bir teknik elde edilmiştir. Bu teknik normal
puls voltametrisinden daha duyar olup duyarlığı 10-7–10-8 M düzeyindedir.
Şekil 1.15. Diferansiyel puls polarografisi için uyarma sinyalleri
1.2.3.5. Kare dalga voltametri
Kare dalga voltametrisi(KDV), en çok kullanılan elektroanalitik yöntemlerden biri
olup, bu yöntemde çalışma elektrotuna simetrik kare dalgalar şeklinde potansiyel
uygulanır. Her bir kare dalga döngüsü boyunca, akım iki kez ölçülür. Bu iki akım
arasındaki fark, uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak grafiğe geçirildiğinde
kare dalga voltamogramı elde edilir.
29
Kare dalga voltmetrisi diferansiyel pulstan daha çok tercih edilen elektroanalitik bir
yöntemdir ve bu yöntemin en büyük üstünlüğü oldukça hızlı bir teknik olmasıdır.
Etkin tarama hızı, kare dalganın frekansı (f) ve basamak yüksekliği (ΔEs)
değiştirilerek belirlenir. Böylece, birkaç saniye içinde voltamogramlar
kaydedilebilmektedir. Bu, ortalama 2-3 dakikayı bulan diferansiyel
pulsvoltamogramının tamamlanması ile karşılaştırıldığında, kare dalga voltametrisi
analiz süresini oldukça kısaltmaktadır (Wang, 2001). Kare dalga voltametri
yönteminin diğer bir üstünlüğü ise, kare dalga yoluyla toplam akıma kapasitif
katkıların etkisinin en aza indirilmiş olmasıdır. Böylece, tarama hızı çarpıcı bir
şekilde arttırılabilir ve 1 V/s’lik tarama hızına kolaylıkla ulaşılabilir.
Kare dalga voltametride, net akım (ΔI) hem ileri hem de geri puls akımlarından daha
büyüktür. Bu nedenle voltametrik pik akımları genellikle daha kolay okunmaktadır.
Bu da, yöntemin doğruluğunu arttırmakta ve diferansiyel puls voltametriden daha
yüksek duyarlılığın elde edilmesini sağlamaktadır (Monk, 2001). Böylece,
1,0×10−8M’a yakın çok düşük gözlenebilme sınırlarına inilebilmektedir. Kare dalga
ve diferansiyel puls voltametri karşılaştırıldığında kare dalga akımlarının, benzer
diferansiyel puls cevaplarından tersinir ve tersinmez sistemler için sırasıyla 4,0 ve
3,3 kat daha yüksek olduğu söylenebilir (Borman vd., 1982).
Şekil 1.16. Kare dalga voltametrisinde uyarma sinyallerinin oluşumu
30
1.3. Antibiyotikler
Antibiyotikler; bakteri, mantar ve aminoasitler gibi canlı mikroorganizmalar
tarafından meydana getirilen veya sentezle hazırlanan, düşük yoğunlukta bile
bakterilerin gelişmesini etkileyen ya da onları öldüren maddelerdir. Bütün
bakterilerde yavaş gelişme, hızlı gelişme ve dinlenme dönemlerinden oluşan üç
çoğalma devresi vardır. Antibiyotikler bakterilerin hızlı ve yavaş gelişme
dönemlerinde etki gösterirler. Bu etkileşim ya bakterilerin öldürülmesi (bakterisid
etki) ya da bakterilerin gelişiminin ve üremesinin durdurulması (bakteriostatik etki)
şeklinde olur. Örneğin penisilinler, aminoglikozidler, sefalosporinler, vankomisin,
florokinolonlar ve basitrasin bakterisid etkiye; tetrasiklinler, makrolidler ve
sülfonamidler ise bakteriostatik etkiye sahiptirler (Schugerl, 2001).
1.3.1. Antibiyotiklerin sınıflandırılması
Antibiyotikleri çeşitli kıstaslara göre sınıflandırmak mümkündür. Antibiyotikler,
mikroorganizmalar üzerindeki etki derecelerine, etki mekanizmalarına, kimyasal
yapılarına ve farmakokinetik özelliklerine göre çeşitli şekillerde sınıflandırılabilirler.
Vücut sıvılarında oluşturdukları konsantrasyonlarda, mikroorganizmalar üzerindeki
etki derecelerine göre de bakteriyostatikler ve bakterisidler olmak üzere iki şekilde
sınıflandırılırlar (Koç-Türkoğlu, 2008).
Bakteriyostatikler: Bunlar bakteri hücrelerinin gelişmesini veya üremesini önlerler.
Gelişmesi ve üremesi duran bakteriler, vücudun savunma mekanizmaları tarafından
kolaylıkla yok edilirler. Bakteriyostatik etki gücünün göstergesi “Minimum İnhibitör
Konsantrasyonu = MİK” dur.
� Makrolitler
� Tetrasiklinler
� Sülfonamidler
� Amfenikoller
� Linkozamidler
� Metronidazol
� Mikonazol
31
Bakterisidler: Bunlar bakteri hücresini dolaysız olarak yok ederler. Bakterisid etki
gücünün göstergesi “Minimum Bakterisid Konsantrasyon = MBK” dur (Akkan,
1997).
� Beta-Laktamlar
� Penisilinler
� Sefalosporinler
� Monobaktamlar
� Karbapenemler
� Beta-laktamaz İnhibitörleri:
� Tazobaktam
� Sulbaktam
� Klavulanik Asid
� Polipeptidler
� Florokinolonlar
� Vankomisin
� Rifamisin
� Teikoplanin
1.3.2. Beta laktam antibiyotikler
Beta laktam grubu antibiyotikler, günümüzde en yaygın kullanılan ve "betalaktam"
halkası olarak adlandırılan ortak kimyasal molekülleri ile diğer antibiyotiklerdenayırt
edilen antibiyotik grubudur. İlk olarak 1928 yılında besiyerine tesadüfen düşen
Penicillium notatum türü mantarın çevresinde stafilokok türü bakterilerin
üreyememesi nedeniyle dikkat çekmiştir. Yapılan çalışmalar sonucu 1949 yılında
penisilin G geliştirilerek klinik kullanıma sunulmuştur. Sonraki yıllarda geliştirilen
yeni beta-laktam grubu antibiyotiklerin tümü, ortak molekül olan beta laktam
halkasına bağlı aminoasitler üzerinde yapılan çeşitli modifikasyonlar sonucunda
şekillendirilmiştir (Öncül, 2002). β-laktam halkası; biri azot, üçü karbon olan 4 üyeli
doymuş heterosiklik bir halkadır (Şekil 1.17).
Şekil 1.17. Beta laktam halkası
32
1.3.2.1. Beta laktam antibiyotiklerin etki mekanizması
Beta-laktam antibiyotikler bakterilerin peptidoglikan tabakasının sentezini bozarak
etki ederler. Bakterileri hücre duvarında yer alan peptidoglikan (mürein) tabakası
mikroorganizmanın yapısını ve bütünlüğünü sağlar. Bu tabaka çapraz bağlanan kısa
peptid zincirleri ile sağlamlaşır. Bu çapraz bağlantı, N-asetil muramik asitinyapısında
yer alan D-alanin D–alanin moleküllerinin transpeptidasyon reaksiyonu
ilebirleşmeleri sonucu oluşur. Transpeptidaz reaksiyonu oluşturan enzimlere
penisilin bağlayan proteinlere “PBP” adı verilir. Beta-laktam antibiyotiklerin temel
hedefi işte bu penisilin bağlayıcı proteinlerdir.
Şekil 1.18. Bakteri hücre duvarındaki proteini oluşturan zincirsel yapılar ve aminoasit bağlantıları
Beta-laktam antibiyotiklerin yapısı ve uzaydaki konfigürasyonları D-alanin D-alanin
molekülüne çok benzemektedir. Bu benzerlik beta-laktam antibiyotiklerin PBP ile
reaksiyona girmelerini ve D-alanin D-alanin molekülünün yerini alarak
transpeptidasyonu engellemelerini sağlar (Gür, 2002). Hücre duvar yapısı bozulan
bakteride ozmotik direnç kaybı ve ölüm meydana gelmektedir (Sarı, 2005). Beta
laktam antibiyotiklerin hedeflerine bağlanmaları ve etkinlik göstermeleri için GN
bakterilerde porin (Outer Membran Protein, OMP) adı verilen içi su dolu protein
kanalcıklarından geçmeleri, sitoplazmik membranla dış membran arasındaki
periplazmik boşlukta yer alan beta-laktamazlardan etkilenmemeleri gerekmektedir
(Kfoury, 2003). Gram (+) bakterilerde dış membran tabakası bulunmayıp,
sitoplazmik kalın bir peptidoglikan tabakası uzanmaktadır. Beta-laktamazlar bu
tabakaya yapışık veya bakteri hücresi etrafında serbest olarak yer almaktadır (Opal
ve Medeiros, 2005).
33
1.3.3. Sefalosporinler
1.3.3.1. Sefalosporinlerin yapısı
Sefalosporinlerde penisilinlerinkine benzer, iki halka sisteminden oluşan bir çekirdek
yapı vardır. Beta-laktam halkası yanında penisilindeki 5 üyeli tiazolidin halkası
yerine sefalosporinlerde 6 üyeli bir dihidrotiazin halkası bulunur (Şekil 1.19).
Dihidrotiazin halkasında fazladan bulunan karbon atomu 3. pozisyonda da yeni
yandalların ilavesi ile daha değişik ve çok sayıda sefalosporinler elde edilmesine
olanak sağlamıştır (Sarı, 2005).
Şekil 1.19. Sefalosporinlerin yapısı
Sefalosporin çekirdeğinde yan zincir-2 daha çok beta laktamazlara stabiliteyi etkiler.
Buraya eklenen açil yan dalında yapılan diğer değişiklikler antibakteriyel aktivite ve
farmakolojik özelliklerde değişimlere neden olur. Yan zicir-1 de yapılan değişiklikler
ise antibakteriyel aktiviteden çok farmakolojik özellikleri etkiler (Willet, 1984).
1.3.3.2. Sefalosporinlerin etki mekanizmaları
Sefalosporinler, diğer bütün β-laktam antibiyotikler gibi bakteri hücre duvarı
yapımını bozarak etki göstermektedir. Tüm beta-laktam antibiyotiklerin hedefi hücre
duvar sentezinin transpeptidasyon evresinde rol alan penisilin bağlayan proteinleri
(PBP) inhibe etmektir. Gram (-) bakterilerde içi su dolu porinleri geçerek, gram (+)
bakterilerde ise direkt olarak bu hedefe bağlanırlar. Transpeptidasyonaşamasının
gerçekleşmemesi sonucu bakteri duvar tam olarak sentezlenemez ve iç basınçtan
34
dolayı bakteri lizisine uğrar (Şekil 1.20). Sefalosporinler bakterisidal ajanlardır
(Montesissa vd.,2003).
Şekil 1.20. Gram (+) ve gram (-) bakterilerde sefalosporinlerin etki mekanizması
1.3.3.3. Sefalosporinlerin sınıflandırılması
Sefalosporinler, antimikrobiyal etki spektrumlarına göre dört ana grupta veya
kuşakta sınıflandırılabilir (Şekil 1.21). Genel bir kural olarak birinci kuşak bileşikler
gram (+) organizmalara karşı daha iyi aktiviteye sahipken, diğer bileşikler gram (-)
aerobik organizmalara karşı daha iyileştirilmiş aktiviteye sahiptir.
Şekil 1.21. Sefalosporinlerin sınıflandırılması
35
1. kuşak sefalosporinler: Gram (+) bakterilere en etkili sefalosporin grubudur.
Gram (-) etkinlikleri E.coli, Proteus mirabilis ve K.pneumoniae gibi bakterilerle
kısıtlıdır. Bu özellikler göz önüne alındığında, yumuşak doku infeksiyonları gibi
stafilokoksik infeksiyonlarda ilk seçilecek ilaçlar arasındadır. Ayrıca, idrar yolu
infeksiyonları ve safra yolu infeksiyonlarında da kullanılabilirler. Sefazolin, cerrahi
profilaksinin seçkin ilacıdır.
2. kuşak sefalosporinler: İkinci kuşak sefalosporinler birinci kuşaklara yakın veya
eşit bir gram (+) etkinliğe sahiptir. Bunun yanında gram (-) etkinlikleri biraz daha
fazladır. Asıl çarpıcı özellikleri H.influenzae, S.pneumoniae ve M. catarrhalis gibi
solunum yolu patojenlerine olan çok iyi etkinlikleridir. Etki alanları göz önüne
alındığında başlıca kullanım alanları solunum sistemi infeksiyonlarıdır. Akut
tonsillofarenjitler, akut otits media ve akut sinüzit gibi üst solunum yolu
infeksiyonları,pnömoni vekoah alevlenmeleri gibi alt solunum yolu infeksiyonlarının
tedavisinde ilk tercih edilen ilaçlar arasında yer alırlar. Ayrıca, komplike olmayan
üriner sistem infeksiyonları, deri ve yumuşak doku infeksiyonlarında da oldukça iyi
etkinlik gösterirler.
3. kuşak sefalosporinler: Bu grup sefalosporinlerin en etkili olduğu bakteriler gram
(-) çomaklardır. Ayrıca, P aeruginosa’ya sadece seftazidim etkili olup diğerlerinin
etkinlikleri yoktur. Gram (+) bakterilere karşı etkinlikleri 1. kuşaklara oranla oldukça
azdır. Sefotaksim gram (+) etkinliği en iyi olan 3. kuşak sefalosporindir. En az etkili
olan ise seftazidimdir. Hiçbirinin iyi bir anti-anaerop etkinliği yoktur. 3. kuşak
sefalosporinler gram (-) sepsis gibi ciddi infeksiyonlarda, gram (-) bakterilerle oluşan
hastane kökenli infeksiyonlarda (nozokomiyal pnömoni, nosokomiyal üriner sistem
infeksiyonu gibi) genellikle aminoglikozitlerle kombine olarak, beyin-omurilik
sıvısına iyi geçtiklerinden ve başlıca menenjit etkenlerinin tümüne etkili
olduklarından akut bakteriyel menenjitlerde (gram (-) basil menenjitleri dahil)
kullanılırlar.
4. kuşak sefaloporinler: Bu grupta sefepim bulunmaktadır. Sefepimin gram (-)
bakterilere etkinliği mükemmeldir. 3. kuşaklardan farklı olarak Enterobactertürlerine
etkinliği de çok iyidir. Sefepimin P.aeruginosa’ya etkinliği en az seftazidim
36
kadardır. 3. kuşaklardan bir diğer farklı yönlü gram (+) bakterilere onlardan daha
etkili olmalarıdır. Yani 4. kuşak sefalosporinler, daha geniş ve dengeli bir etki
alanına sahiptirler. Ancak, antianaerop etkinlikleri iyi değildir. Sadece parenteral
kullanılır. Kullanım alanları 3.kuşak sefalosporinler gibidir.
1.3.3.4. Sefoperazon
Sefoperazon, sefalosporinlerin 3. kuşaktan yeni bir semisentetik antibiyotiktir.
Paranteral uygulamada sodyum tuzu olarak kullanılır (Kim, 1981). Aerobik ve
anaerobik gram (-) ve gram (+) bakterilere etkilidir. Etkisi, bakteri hücre duvar
sentezini inhibe etme şeklindedir. Nefrotoksik değildir ve eliminasyonu büyük
ölçüde böbrek dışı yoldan gerçekleştiği için böbrek yetersizliği olan hastalarda doz
indirimine gerek göstermez ( Bailey vd., 1981).
Şekil 1.22. Sefolasporinlerin yapısı
Sefoperazon, diğer sefalosporinlerden farklı olarak verilen dozun %70’i karaciğerden
safra ile atılır, enterokepatik siklusa girer. Yarılanma ömrü diğer sefalosporinlerden
daha uzundur. Böbrek yetmezliğinde dozun ayarlanması gerekmez. Kaynağı belli
olmayan sepsisler, obstrüktif safra yolu enfeksiyonları, Pseudomonasca bağlı
pnömonilerde 12 saatte bir intramüsküler (kas içine) veya intravenöz (damar içine)
yoldan alınır.
37
1.3.3.5. Sefadroksil
Sefadroksil geniş spektrumlu, bakterisit etkili ve yarı-sentetik bir antibiyotiktir.
Sefadroksil, gram (+) ve gram (-) çoğu mikroorganizmaya karşı bakterisid etki
gösteren bir antibiyotiktir. Sefadroksile duyarlı olan gram (+) mikroorganizmalar ise
şunlardır: Penisilinaz üreten ve üretmeyen stafilokoklar, beta-hemolitik
streptokoklar, Streptococcus pneumoniae (diplokoklar), Streptococcus pyogenes.
Sefadroksile duyarlı olan gram (-) mikroorganizmalar şunlardır: Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Salmonella ve
Shigella'nın bazı türleridir.
Şekil 1.23. Sefadroksilin yapısı
Sefadroksil mide asitlerine dayanıklı bir antibiyotik olduğundan, oral yoldan
alındıktan sonra kolayca emilerek, 1 saat içinde kanda en yüksek antibiyotik
düzeylerine ulaşır. Kandaki antibiyotik 12 saat süreyle ölçülebilir düzeylerde kalır.
Serum yarılanma süresi 1,4 saattir. Ortalama %20 oranında gevşek olarak serum
proteinlerine bağlanır. Bileşiğin değişikliğe uğramamış bölümü, 24 saat boyunca
yavaş ve sürekli bir biçimde idrarla dışarı atılır. İlk dozun alınmasından sonra 12-18
saat boyunca idrardaki antibiyotik konsantrasyonları, idrar yollarındaki bütün
patojenler için minimum inhibisyon konsantrasyonunun (MIC) üzerinde bulunur.
1.4. Biyosensörler
Biyosensörler; biyoloji, kimya, biyokimya, mühendislik gibi pek çok bilim alanının
bilgi birikiminden yararlanılarak biyolojik moleküllerin veya sistemlerin seçicilik
38
özellikleri ile modern elektronik tekniklerin işlem yeteneğinin birleştirilmesi sonucu
geliştirilen biyoanalitik cihazlar olarak tanımlanabilir (Spichiger-Keller, 1998).
Biyosensör teknolojisinin tarihsel geçmişine bakıldığında bu alandaki ilk
çalışmaların enzim sensörleriyle başladığı görülmektedir. Biyosensörlerin tarihi,
1950’li yılların ortalarında L.C. Clark’ın Cincinnati Hastanesinde ameliyat sırasında
kanın O2 miktarını bir elektrot ile izlemesiyle başlar. 1962 yılında Clark ve Lyons ile
1967’de Updike ve Hick tarafından yayınlanan glukoz tayinine yönelik glukoz
oksidaz enzim elektrotları bu konudaki ilk örnekleri oluşturmuştur (Clark ve Lyons,
1962). Böylece Clark ve Lyons, glukoz oksidaz enzimini O2 elektrotu ile birleştirerek
kanın glukoz düzeyini ölçmeyi başarmışlardır. Bu sistem bir yandan biyolojik
sistemin yüksek spesifikligini (enzim) diğer taraftan ise fiziksel sistemin (elektrot)
tayin duyarlığını birleştirmiş ve geniş bir uygulama alanı bulmuştur.
1.4.1. Biyosensörlerin yapısı ve fonksiyonu
Biyosensörler biyokomponentler (reseptör) ile fiziksel komponentlerden (transduser)
oluşurlar. Biyosensörler, genel olarak analizlenecek madde ile seçimli bir şekilde
etkileşime giren biyoaktif bir bileşenin, bu etkileşim sonucu ortaya çıkan sinyali
ileten bir iletici sistemle birleştirilmesi ve bunların bir ölçüm sistemiyle
kombinasyonuyla oluşturulurlar. Biyosensörlerde biyoaktif bileşenin tayin edilecek
madde ile etkileştiğinde oluşan sinyalin iletim ve ölçümünde, genel olarak
elektrokimyasal, optik, piezoelektrik ve kalorimetrik esaslı sistemler kullanılır. Şekil
1.24’de bir biyosensörün çalışma prensibi şematize edilmiştir.
Şekil 1.24. Biyosensörlerin yapısı ve çalışma prensibi
39
� Algılama kısmı (Biyomolekül)
Ana elamanların en önemlisi analite karşı son derece seçimli ve tersinir etkileşmeye
sahip biyoajanlardır. Biyoajanlar, biyoafinite ve biyokatalitik olmak üzere iki grupta
toplanabilir. Biyoafinite ajanları (örneğin antikorlar) analitlerle kompleks oluşturarak
analitin moleküler tanımlanmasında kullanılırlar. Bu kompleks oluşumu tabaka
kalınlığı, kırılma indisi ve elektriksel yük gibi fizikokimyasal parametrelerin
değişimine neden olur. Biyokatalitik ajanlar ise analitin molekül yapısında değişime
neden olur ve bu dönüşüm sonucunda ortamda artan veya azalan madde miktarı takip
edilerek değerlendirilir. Biyokatalitik ajan olarak enzimler, mikroorganizmalar,
organlar, tüm hücreler, bitki veya hayvansal doku parçaları kullanılmaktadır
(Piletsky ve Turner 2002).
� Çevirici kısım (Transduserler)
Biyosensörün ikinci önemli elamanı çevirici kısmıdır. Çeviriciler biyoajan-analit
etkileşimi sonucu oluşan fizikokimyasal sinyallerin elektrik sinyallerine
dönüştürüldüğü biyosensör elemanlıdır. Biyokimyasal reaksiyona göre çeviriciler
seçilir. Elektrotlar amperometrik ve potansiyometrik ölçümlerde kullanılır ve burada
hedef; analitdir (O2- elektrodunda çözünmüş O2, pH elektrotunda H⁺ iyonu gibi).
Optik sensörlerde hedef; ışık, piezoelektrik sensörlerde ise kristalin salınım
rezonansının kütle yüklenimi sebebiyle değişmesidir (Piletsky ve Turner 2002).
� Elektronik kısım
Çevirici kısmın elektrik sinyali üretmesi için gerekli osilatör, fark devresi, işlemsel
yükselteç devresi, besleme devresi, anolog-digital dönüştürücü vb. elektronik
kısımdan oluşmaktadır.
1.4.2. Biyosensörlerde kullanılan biyoaktif yapılar
Analizlenecek madde-biyoaktif bileşen ilişkisine göre biyosensörler aşağıdaki gibi
sınıflandırılabilirler (Spichiger-Keller,1998);
40
� Biyoaffinite Esaslı Biyosensörler; örneğin; iletici sistem üzerinde antikor
immobilizasyonuyla antijenlerin tayini (a),
� Biyokatalitik Esaslı Biyosensörler; örneğin, iletici sistem üzerinde enzim
immobilizasyonuyla enzimin substratı, inhibitörü, aktivatörü veya koenzimi olan
çeşitli kimyasal maddelerin tayini (b),
� İmmobilize Hücre Esaslı Biyosensörler; örneğin, iletici sistem üzerinde
hücrelerin immobilizasyonuyla o hücreler tarafından metabolize edilen çeşitli
maddelerin tayini (c),
� Transmembran Esaslı Biyosensörler; örneğin, çeşitli moleküllere spesifik
reseptör veya farklı membran proteinlerini içeren hücre membranlarının iletici
sistem üzerinde immobilizasyonuyla söz konusu moleküllerin seçimli bir şekilde
tayinleri (d).
Şekil 1.25. Analizlenecek madde-biyoaktif bilesen ilişkisine göre; a) Biyoafinite
esaslı biyosensorler, b) Biyokatalitik esaslı biyosensörler, c) İmmobilize hücre esaslı biyosensorler, d) Transmembran esaslı biyosensörler
41
1.4.3. Biyosensörlerde biyoaktif bileşen immobilizasyon yöntemleri
Enzimlerin çeşit ve sayısının fazla olması, çok farklı kullanım alanı ve amaçlarına
sahip olmaları biyoaktif bileşen olarak enzim esaslı biyosensörlerin yaygın olarak
kullanılmalarına neden olmuştur. Enzimlerin endüstriyel alanda kullanımını
arttırmak için, özellikle son otuz yılda enzim immobilizasyonu üzerine araştırmalar
yoğunlaşmıştır. Bu alanda yapılan yayınların sayısı da yıldan yıla artmaktadır
(Schugerl, 2001). Kelime anlamı olarak “immobilizasyon”, hareketi sınırlandırma
demektir. İmmobilize edilmiş enzimlerin de gerçekten hareketleri sınırlandırılmış
olmaktadır. Enzimler, suda çözünmeyen bir taşıyıcıya fiziksel veya kimyasal olarak
bağlanarak immobilize edilebilirler. Suda çözünmeyen ürün veren bir
kopolimerizasyon reaksiyonuna enzim molekülünün monomer olarak katılması ve
suda çözünmeyen bir matriks veya mikro kapsüllerde tutuklanmasıyla
immobilizasyon gerçekleştirilir. İmmobilize enzimlerin doğal (serbest) enzimlere
göre üstünlükleri aşağıdaki gibi sıralanabilir (Fagain, 2003);
� Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir (süzme, santrifujleme vb.)
ve ürünlerin enzim tarafından kirletilmesi gibi bir problem oluşturmaz.
� Çevre koşullarına (pH, sıcaklık vb.) karşı daha dayanıklıdır.
� Birçok kez ve uzun süre kullanılabilir.
� Sürekli işlemlere uygulanabilir.
� Doğal enzime kıyasla daha kararlıdır.
� Ürün oluşumu kontrol altında tutulabilir.
� Birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur.
� Bazı durumlarda serbest enzimden daha yüksek bir aktivite gösterebilir.
� Enzimin kendi kendini parçalaması (autolysis, self-digestion) olasılığı azalır.
Bir biyosensör, farklı özellikteki iki elemanın (iletici sistem (sensör) ve biyoaktif
bileşen) birleştirilmesiyle ile oluşturulur. Uygun biyoaktif materyal ve sensör
seçildikten sonra bunların birbirine bağlanması, aşılması gereken en önemli
sorundur. Bu bağlama işlemi biyosensörlerin immobilizasyonu olarak
tanımlanmaktadır. Bağlama işleminde çok değişik yöntemler kullanılabilir. Hangi
immobilizasyon yönteminin kullanılacağı seçilen sensöre, biyoaktif bileşenin
42
kimyasal yapısına ve fiziksel durumuna göre belirlenir. Enzimler protein yapısında
bileşikler oldukları için enzimlere uygulanan tüm immobilizasyon yöntemleri protein
yapısındaki diğer biyoaktif bileşenlere de uygulanabilir. Hayvan ve bitki
dokularımembran yapısında olduklarından farklı immobilizasyon yöntemleri
uygulamak gerekir (Merkoci vd., 1999.,Reddy ve Vadgama, 2002).
1.4.3.1. Kovalent bağlanma
Kovalent bağlı enzim sistemleri ile ilgili ilk çalışmalar Gruphofer ve Schleith
tarafından 1953 yılında diazoaktiflenmiş poliamino stirene; α-amilaz, pepsin ve
ribonükleazın immobilizasyonu ile başlamıştır. Kovalent bağlanma genellikle
enzimin yapısının ve fonksiyonel gruplarının bilindiği durumlarda kullanılır
(Dumitriv ve Papu,1988.,Reddy ve Vadgama, 2002).
Kovalent bağlama ile immobilizasyon, destek yüzeylerde uygun bir yöntemle etkin
bölgeler oluşturarak enzim molekülleri ile destek yüzeyler arasında kovalent bağ
oluşturur. Kovalent bağlanma yönteminin en büyük avantajı, bağların çok kuvvetli
olması böylece her türlü akış ortamında kullanılabilirliğidir. Enzim destek materyali
üzerinde yer aldığından substrat ile teması kolaydır. Ayrıca enzim molekülü ve
destek materyali birlikte genellikle ısıl kararlılık gösterirler. Yöntemin dezavantajı,
destek materyali ile enzim arasındaki sıkı etkileşim enzimin doğal konformasyonunu
bozabilmesidir (Dumitriv ve Papu, 1988., Reddy ve Vadgama, 2002).
1.4.3.2. Tutuklama
Tutuklama, biyoreseptörün bir membran veya tabaka içerisinde hapsedilmesidir.
Enzimler makromoleküler yapılı proteinler olup polimer jel tabakalarda ve daha basit
olarak diyaliz membranlarında tutuklanabilirler. Bu yöntem enzimler yanında
organeller, hücreler ve antikorlar için de uygulanabilir. Elektrokimyasal
polimerleşme diğer bir tutuklama yöntemidir (Telefoncu, 1997).
43
Şekil 1.26. Enzim molekülünün jel içinde veya polimer matrikste tutuklanması
1.4.3.3. Çapraz bağlama
Bu yöntem biyosensör hazırlanmasında daha çok tutuklama ve kovalent bağlama
yöntemlerinin kombinasyonu şeklinde uygulanır. Çapraz bağlayıcı reaktif olarak
gluteraldehit, heksametilen diizosiyanat, diflorodinitrobenzen, bismaleimidoheksan,
disüksinilsuberat sık kullanılır. İki fonksiyonlu reaktifler enzimler yanında
organeller, hücreler ve antijenlerin immobilizasyonunda da uygulanır (Telefoncu,
1997).
Şekil 1.27. Enzim molekülünün film veya tabakaya çapraz bağlanması
1.4.3.4. Adsorpsiyon
Bu yöntemde biyobileşenin film veya tabakaya adsorbe olması sağlanır.
Biyobileşenlerin kimyasal yapısı ve fiziksel durumuna göre immobilizasyon yöntemi
belirlenir. Enzimler için uygulanan tüm immobilizasyon yöntemleri protein
yapısındaki diğer biyoreseptörler için de uygulanabilir. Örneğin; hayvan ve bitki
44
dokuları zar yapısında olduklarından farklı immobilizasyon yöntemleri uygulamak
gerekir (Telefoncu, 1997).
Şekil 1.28. Enzim molekülünün elektrot yüzeyinde adsorpsiyonu
1.4.4. İletim ve ölçüm sistemlerine göre biyosensörlerin sınıflandırılması
Biyosensörlerin sınıflandırılması başta biyoaktif bileşenlere ve tayin yöntemlerine
göre olmak üzere birçok şekilde yapılmaktadır. Biyosensörler de, biyoaktif bileşenin
tayin edilecek madde ile etkileşmesiyle oluşan sinyalin belirlenme ilkesine göre
Tablo 1’de belirtildiği şekilde sınıflandırılmaktadır.
Tablo 1.1. Biyosensörlerin biyoaktif bileşenlere göre sınıflandırılması
Elektrokimyasal Esaslı Optik Esaslı
Amperometri Esaslı Sensörler Fotometri Esaslı Optik Lifler
Potansiyometri Esaslı Sensörler Fluorometri Esaslı Optik Lifler
Yarı İletken Esaslı Transistörler Biyolüminesans Esaslı Optik Lifler
Kalorimetrik Esaslı Piezoelektrik Esaslı
Termistörler Piezoelektrik Kristaller
Kuru Reaktif Kimyası Esaslı
45
1.4.4.1. Elektrokimyasal esaslı biyosensörler
1.4.4.1.1. Amperometri esaslı biyosensörler
Amperometri genel anlamda belli bir potansiyeldeki akım şiddetinin ölçümünü esas
alır. Söz konusu akım yoğunluğu, çalışma elektrotunta yükseltgenen ya da
indirgenen elektro aktif türlerin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak tanımlanır.
İkinci elektrot, referans elektrot olarak iş görür. Kalibrasyondan sonra akım
yoğunluklarından ilgili türlerin konsantrasyonlarının belirlenmesinde yararlanılır
(Şekil 1.29).
Şekil 1.29. Amperometrik esaslı bir biyosensörun şematik gösterimi
İletici sistem olarak bir amperometrik sensörün kullanılması durumunda
potansiyometrik sensörlerden en büyük fark, ürünlerden sinyal oluşturan türün
elektrot yüzeyinde tüketilmesidir. Oksijen tüketimine ilişkin reaksiyonlar aşağıda
verilmiştir.
Katodik reaksiyon;
O2 + 2H2O + 2e- → H2O2 + 2HO-
H2O2 + 2e- → 2HO-
Anodik reaksiyon;
Ag- + Cl- → AgCl + e-
Toplam reaksiyon;
4Ag + O2 + 2H2O + 4Cl-→ 4AgCl + 4HO-
A: Çalışma Elektrotu (Pt) B: Referans Elektrot (Ag/AgCl) C: Elektrolit Çözelti (KCl) D: İç gaz geçirgen membran (teflon) E: İmmobilize enzimi içeren biyoaktif tabaka F: Dış koruyucu membran (selüloz asetat v.b.) G: O-ring
46
Amperometri esaslı ve biyoaktif bileşen olarak enzimlerin kullanıldığı bazı
biyosensörlere ilişkin örnekler aşağıda verilmiştir (Telefoncu, 1997; Christie vd.,
1992).
Glukoz Oksidaz
Glukoz + O2 + H2O ����� Glukonik asit + H2O2
Laktat Oksidaz
L-Laltat + O2 ����� Piruvat + H2O2
İnvertaz
Sakkaroz + H2O����� α-D-Glukoz + D-Fruktoz
1.4.4.1.2. Potansiyometri esaslı biyosensörler
Potansiyometri bilindiği gibi en genel anlamda bir çalışma ve referans elektrot
arasındaki potansiyel farkının ölçümünü esas alır. Elektrot potansiyelinin
belirlenmesi doğrudan analit konsantrasyonunu tanımlar. Potansiyometrik
biyosensörlerde kullanılan temel sensörler; pH ya da tek değerlikli iyonlara duyar
“cam elektrotlar, anyon ya da katyonlara duyarlı iyon seçimli elektrotlar ve
karbondioksit ya da amonyağa yönelik gaz duyar“ elektrotlardır. Şeki1.30’de genel
olarak potansiyometrik esaslı bir biyosensör şematize edilmiştir.
Şekil 1.30. Potansiyometri esaslı biyosensörler
Potansiyometri esaslı ve biyoaktif bileşen olarak enzimlerin kullanıldığı
biyosensörlere ilişkin örnek aşağıda verilmiştir (Elmosallamy, 2006).
A: Elektrot dış ceketi B: İç doldurma çözeltisi C: Cam pH elektrot D: O-ring E: İmmobilize enzimi içeren biyoaktif tabaka F: Dış koruyucu membran
47
Penisilinaz
Penisilin ������Penisiloat + H+
(pH duyarlı biyosensör)
1.4.4.1.3. Yarı iletken esaslı biyosensörler
Temel sensör olarak metal oksit yarı iletken alan etki transistörlerini (MOSFET) ya
da iyon duyarlı alan etki transistörlerini (ISFET) esas alan bu tür enzim sensörleri,
enzim ile alan etki transistorlerinin birleştirilmesini ifade edecek Şekil 1.31’da enzim
alan etki transistorleri (ENFET) olarak adlandırılırlar. MOSFET’lerin, gazların
ölçümüne uygun hale getirilmesiyle oluşan gaz duyar sensörler de (GASFET)
adsorblanan gaz moleküllerinin disosiyasyonu ve oluşan yükün oksit tabakasına
transferi temel ilkeyi oluşturur. Bu durum tabakanın dielektrik sabitini değiştirir ve
geçen akımda bir değişime yol açarak ölçüme imkân verir (Eggins,1996.)
Şekil 1.31. Enzim alan etki transistörü
1.4.5. İdeal bir biyosensörün sahip olması gereken özellikler
Elektrokimyasal, optik veya diğer biyosensör türlerini en uygun bir şekilde
tasarlayabilmek için ölçüm sisteminin sahip olması gereken bazı temel fiziksel
özelliklerin olması gerekmektedir. İdeal bir biyosensörün sahip olması gereken bazı
önemli karakteristik ve özellikler şöyle sıralanabilir (Buerk, 1993).
Seçicilik: İdeal bir biyosensörde en önemli parametrelerden birisi olan seçicilik
özelliğidir. Bu da biyosensörlerdeki biyomolekül kısmı ile ilgili bir durumdur. Bir
A: Referans eletrot B: Koruyucu tabaka C: İmmobilize enzin tabakası D: İyon seçimli membran
48
biyosensörün seçimliliği üzerinde başlıca, sensörle girişimler,
biyokatalizörlegirişimler ve pH etkili olmaktadır. Sensör de meydana gelebilecek
girişimleriengellemenin en iyi yolu örnekteki diğer maddelere cevap vermeyen ve
yalnızcailgilenilen biyokatalitik tepkimeyi izleyebilecek bir sensör kullanmaktır.
Örneğin; kandaüre tayinine yönelik bir biyosensör de temel sensör olarak NH4+‘a
duyarlı bir iyonseçimli elektrotun kullanılması ortamda bulunan Na+ve K+
iyonlarının girişimineneden olur. Buna karşılık temel sensör olarak NH3’e duyarlı bir
sensör kullanılması buistenmeyen durumu ortadan kaldırır (Dinçkaya vd., 1994).
Biyomolekülün spesifik olması girişim yapabilecek türleri içeren karmaşık içerikli
ölçüm ortamlarında ön işlem yapılmaksızın analize imkan verir.
Kararlılık: Kararlılık kullanılan biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığına
bağlıdır. Biyolojik molekülün kararlı olması ise çok sayıda analize imkan vereceği
için biyosensörün ekonomik olmasına zemin hazırlar. Ayrıca biyosensörün pH, ısı,
nem, ortam O2konsantrasyonu gibi fiziksel parametrelerden olabildiğince az
etkilenmesi istenir. Bu özellik fiziksel koşulların değişebildiği laboratuvar dışı koşul
ve ortamlarda dagüvenilir analizlerin yapılabilmesine imkân verir.
Duyarlılık: Biyosensöre immobilize edilmiş biyolojik materyalin yalnız belirli
maddelere karşı duyarlı olması, ideal biyosensörlerin özelliklerindendir. Duyarlılık,
biyolojik sistemlerden gelen unsurlar kullanıldığı için genelde çoğu klasik
yöntemden daha iyidir.
Tekrarlanabilirlik: İdeal bir biyosensör için, biyosensör cevaplarının doğru ve
tekrarlanabilir olması büyük önem taşır. Tekrarlanabilirlik ne kadar iyi olursa,
biyosensörün uygulamalarının o denli iyi olduğundan söz edilebilir.
Kullanım ömrü: Biyosensörün kullanım ömrünü kısıtlayan en önemli faktör,
biyolojik çeviricinin aktivitesindeki azalmadır. Bir biyosensörde kullanılan biyolojik
elementler çoğu zaman sistemin en az kararlı olan bileşeni olmaktadır. Bir
biyosensörün önemli bir özelliği normal işlem koşulları altında
hassasiyetinikoruyabildiği kadar uzun bir kullanım ömrüne sahip olmasıdır. Bu
kullanım ömrü, yapılan toplam ölçüm sayısına veya ölçülen analitin derişiminin
49
büyüklüğüne bağlı olabilir. Daha yüksek derişimler hassasiyetin daha hızlı bir
şekilde düşmesine neden olabilir. Ayrıca analit derişimine bağlı olmaksızın analiz
ortamında aktivasyonu engelleyecek diğer kimyasal türler bulunabilir. Bir diğer
önemli özellik ise biyosensörün saklanması ve kullanılması arasında geçen zamanın
uzunluğudur. Biyosensörün bir buzdolabı ortamında muhafaza edilmesi gerektiği
gibi biyolojik bileşenin biyoaktivitesini koruyabilmesi için özel bir kimyasal ortamda
saklanması da gerekebilmektedir.
Basitlik ve ucuzluk: Tasarımı basit ve ucuz, kullanımı rahat biyosensörler ideal
biyosensörlerdir. Bu nedenle ilk biyosensörlerdeki karmaşık ve de pahalı olan
yapılar, daha sonra basitleştirilmiş ve mümkün olduğunca da ucuzlaştırılmıştır.
Ayrıca ölçüm ünitesinin ucuz ve taşınabilir olması değişik alanlarda yaygın
kullanımına imkân verir.
Kalibrasyon gereksinmesi: İdeal bir biyosensör, bilinen derişimlerdeki analiti
içeren standart çözeltiler yardımıyla kolayca kalibre edilebilmelidir. Kalibrasyon
eğrileri hassasiyeti belirlemek için çok sayıda veriye ihtiyaç duymamalıdır. İstenilen
aralığın dışında kalan güvenilir olmayan ekstrapolasyonlardan kaçınmak için
kalibrasyonda elde edilecek veri aralığı, ölçüm yapılacak değerleri içermelidir. İdeal
olarak, artarda yapılacak ölçümler için biyosensör hassasiyetinin belirlenmesinde bir
kez kalibrasyon yapılması yeterli olmalıdır. Bununla beraber, uygulamada zamanla
hassasiyette meydana gelebilecek değişimleri belirlemek amacıyla düzenli aralıklarla
kalibrasyon yapmak gerekebilmektedir.
Yeterli düzeyde tayin sınırı: Tasarlanan bir biyosensörün tayin sınırının belirli bir
konsantrasyon değerinin altında olması gerekmektedir. Belirtilen bu sınır elektrot
yüzeyinin büyüklüğü, biyolojik materyalin tayin edilecek maddeye afinitesi,
immobilize edilen madde miktarı gibi faktörlerden etkilenir. İdeal olarak, bir
biyosensör tarafından tayin edilebilen en düşük analit derişimi sadece ölçüm için
kullanılan elektronik cihazın çözünürlüğü tarafından sınırlandırılmalıdır.
Uygulamada ise, diğer etkenlerde tayin sınırını etkiler. Örneğin,
potansiyometrikölçümlerde kullanılan elektrokimyasal dönüştürücülere, diğer iyonlar
ve ölçümü sınırlayan yüzey reaksiyonları girişim yapabilir.
50
Taban sinyali: Genellikle, bir biyosensörün sinyali göz önünde bulundurulması
gereken bazı taban gürültülerine sahiptir. Akım kaçakları, elektronik cihazdaki veya
biyosensör de farklı metallerin temasından kaynaklanan küçük gerilim farklılıkları
veya pek çok elektrokimyasal etken taban gürültüsüne neden olabilir. Taban sinyali
elektriksel bir gürültü değildir. Bu nedenle doğrusal bir sistem için doğru sinyal (S)
basitçe şöyle ifade edilir.
S = Sölçülen – Staban sinyali (1.8)
Cevap süresi: Bir biyosensörün cevap süresi 3 ana aşamada meydana gelen olaylar
tarafından etkilenir. Bunlar;
� Substratın analiz ortamından zar yüzeyine ne kadar hızlı difüzlendiği,
� Substratın zar içine ne kadar hızlı difüzlendiği ve biyokatalizörün aktif
merkezi ile ne kadar çabuk tepkime verdiği,
� Oluşan ürünün ölçüldüğü yer olan sensör yüzeyine ne kadar hızlı
difüzlendiğidir.
Bu üç olayı etkileyen başlıca unsurlar da çözeltinin karıştırma hızı, substrat derişimi,
optimum pH, sıcaklık ve sensör yüzeyinde veya biyoaktif tabaka yüzeyinde herhangi
bir zarın kullanılıp kullanılmadığı ve kullanılıyorsa niteliğidir. Bu unsurlardan
karıştırma hızının artışı cevap süresini kısaltırken, substrat derişimindeki artış
uzamasına yol açar. Optimum pH’ya yakınlaşma, cevap süresini kısaltır.
Küçültülebilirlik ve sterilize edilebilirlik: Elektrotlarının sterilize edilebilmesi ve
boyutlarının küçültülmesi biyosensör tasarımında önemlidir. Buna karşın, biyosensör
yapısına giren biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığı, sterilizasyonu kısıtlayan en
önemli parametredir. Küçük ve biyouyumlu sistemlerin özellikle in vivo ölçümlere
uyarlamada önemli üstünlükleri vardır (Hall,1990).
Doğrusallık: Doğrusallık bir biyosensör de aranan önemli özelliklerden biridir.
Ölçülecek maddenin ortamdaki derişimi ile alınan cevap (voltaj, akım miktarı,
kütle,optik yoğunluk, renk vb. değişimleri) arasındaki ilişkinin doğrusal olarak
değişmesi gerekir. Başka bir ifadeyle biyosensörler doğrusal oldukları değişim
51
aralığında kalibre edildiklerinden ancak bu bölgeye sonuç verirler. Doğrusallık
biyoajan türü, çevirici ve elektronik bölümlerin yapısı ve tüm elemanların uyumu ile
ilgilidir.
1.4.6. Biyosensörlerin kullanım alanları
Biyosensörler tıp, tarım, gıda, eczacılık, çevre kirliliği, savunma ve endüstride çok
önemli rol oynarlar. Biyosensörler için mümkün uygulama alanları şunlardır:
Tıp: Biyosensörlerin ve kimyasal sensörlerin temel uygulama alanı sağlık ile
ilgili teşhislerdir. Kandaki bileşenlerin, gazların, iyonların ve vücut metabolitlerinin
ölçümü bir hastanede hastaların metabolik durumları hakkında önemli bilgiler verir
ki özellikle yoğun bakım hastalarında bunların tayini daha da önem kazanmaktadır.
Bu türlerin çoğu, tıbbi teşhis laboratuvarlarında kan ve idrardan ayrıştırılarak uzun
zaman alan klasik analizler yardımıyla belirlenmektedir. Bu yüzden alınan örneğin
doğrudan ve yerinde analizleri yapılabilirse dakikalarla veya saniyelerle ifade
edilebilecek sürelerde sonuca ulaşılabilecektir.
Gıda üretim ve analizi:Başta glikoz olmak üzere birçok monosakkarid, amino
asit, organik asit (laktik asit), üre ve alkol tayinlerinde enzim sensörleri
kullanılmaktadır. Ayrıca gıdalardaki yabancı maddeler (pestisidler, toksinler ve
yabancı maddeler) için de biyosensörler hazırlanabilir.
Tarla tarımı, bağ-bahçe tarımı ve veterinerlik:Organofosfatların tayin ve
tespitinde, patojen tayinlerinde biyosensörlerin kullanımı mevcuttur.
Çevre koruma ve kirlilik kontrolü:Hava ve su bileşen analizleri, toprak, hava
ve sudaki pestisit ve mikotoksin gibi toksiklerin tayinlerinde biyosensörlerden
yararlanılmaktadır (Chiti vd., 2001). Toprak, hava ve su kirliliğinin kontrolünde
mikrobiyal sensörler ve enzim sensörleri kullanılmaktadır.
Ayrıca; maden işletmelerinde toksik gaz analizi, askeri uygulamalar ve savunma
sanayi, proses kontrolü, biyoreaktör kontrol ve analitiği, ilaç analizi ve ilaç etki
52
mekanizmalarının aydınlatılması gibi birçok alanda biyosensörlerden
yararlanılmaktadır (Lucarelli vd., 2002).
Bazı ilaç molekülleriyle DNA’ nın etkileşmesi (özellikle antikanser özellik taşıyan
ilaç molekülleri ile etkileşim) ve bu etkileşimin geliştirilen yeni yöntemlerle tayin
edilmesi; yeni ilaç tasarımları için büyük önem taşımaktadır. İlaçların kötü amaçla
kullanımı ve uyuşturucu ile mücadelede biyosensörler kullanılabilecektir.
Uyuşturucu arayan köpeklerin yerini biyosensörler alabilir. Böylece özellikle
gümrüklerde, karakollarda zaman kazanılacaktır.
1.4.7. İlaç analiz yöntemleri
Geniş çeşitlilikteki numunelerin değerlendirilmesinde genellikle farklı kromotografik
yöntemler kullanılmakla birlikte genellikle sıvı kromotografi yöntemi tercih
edilmektedir. Bu yöntem kullanılarak elde edilen hassas, özgün, kararlı ve hızlı
sonuçların düşük dozlar içinde elde edilebilmesi ve tekniğin çoklu karışımlara
uygulanabilmesi önemli avantajıdır. Ancak, cihaz maliyetlerinin yanı sıra kullanılan
kimyasalların miktarı ve maliyeti oldukça fazladır. Sıvı kromotografi yönteminin
yanı sıra, pek çok ilaç etkin maddesinin kromofor gruplara sahip olmasından dolayı
spektrofotometrik tekniklerde sıklıkla kullanılmaktadır. Ancak kromatografik
çalışmalarda kullanılan yöntemin gözlenebilme ve alt tayin sınırı değerleri sistemde
kullanılan detektöre bağlı olduğundan sıradan dedektörler kullanıldığında plazma,
idrar ve serumda çoğu zaman eser miktarda bulunan türlerin tayini için daha gelişmiş
dedektör sisteminin kullanılması gerekmektedir ki bu gereksinim analiz yöntemini
daha karmaşık hale getirirken yöntemin ekomonik maliyetini de arttırmaktadır.
Spektrofotometrik yöntemlerde gözlenebilme ve alt tayin sınırı değerlerinin diğer
yöntemlere göre göreceli olarak daha yüksek olmasının yanında kan ve plazma
sıvılarında uygulama alanlarının oldukça kısıtlı olması yöntemin geçerliliğini
sınırlamaktadır (Taşdemir, 2011).
Voltametri, inorganik, analitik ve biyokimyacılarca çeşitli ortamlarda meydana gelen
yükseltgenme ve indirgenme işlemlerinin incelenmesi, yüzeydeki adsorpsiyon
işlemlerinin araştırılması ve kimyasal olarak modifiye edilmiş elektrot yüzeylerinde
53
cereyan eden elektron aktarım mekanizmalarının aydınlatılması gibi analitik olmayan
amaçlar için oldukça yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Voltametri özellikle
farmasötik açıdan önemli olan çok sayıda türün tayininde kullanılması bu metoda
olan ilgiyi artırmıştır.
1960’lı yılların ortalarında klasik voltametrik tekniklerde yapılan pek çok değişiklik,
yöntemin duyarlılığını ve seçiciliğini büyük ölçüde arttırmış ve özellikle tıp,
eczacılık, biyokimya ve çevre çalışmalarında yönteme geniş ve giderek artan bir
uygulama alanı sağlanmıştır. (Patriarche, 1979; Özkan vd., 1997; Şentürk vd., 1996).
Voltametrik ve polarografik yöntemlerin, eczacılık alanında ve klinik çalışmalarda
dönüşümlü kullanılmasının nedeni düşük derişimlerde farmasötik analizlerin
yapılabilmesi, numunelerin kolayca ve çok kısa bir sürede hazırlanabilmesi, analiz
süresinin kısa olması, ortamda bulunan katkı maddelerinin veya safsızlıkların analiz
sonucunu etkilememesi, bu tekniklerin ürün kalite kontrolünde kullanılabilmesine
olanak sağlamaktadır (Doğan vd., 2005). Tablet, kapsül, süspansiyon, şurup vb. ilaç
formülasyonlarının çözünmeyen kısımlarının veya katkı maddelerinin genelde
elektroaktiviteleri bulunmadığı için herhangi bir ayırma işlemine gerek olmadan
analizleri yapılabilmektedir. Ayrıca bu yöntemlerin diğer bir üstünlüğü de pahalı ve
az miktardaki ilaçların analizinde de çok az miktarda numuneyle çalışma imkanı
verdiği için kullanılabilmesidir (Brezina ve Zuman, 1958; Zuman, 1962).
54
2. KAYNAK ÖZETLERİ
Subba-Reddy vd. (1996), sefalosporinlerin tayini için 2,0-12,0 pH aralığındaki
üniversal tamponlarda ilaçlardaki azometin grubunun elektrokimyasını temel alan
diferansiyel puls polarografi metodunu geliştirmişlerdir. Kantitatif ölçümler,
sefalosporinlerin 1×10-5 ile 2,5×10-8 mM derişim aralığında başarılı olmuştur.
Geliştirilen bu yöntem ile düşük tayin limitleri elde edilmiştir. Bu metot farmasötik
numuneler ve idrar örneklerindeki sefalosporinlerin hem ayrı ayrı hem de eş zamanlı
tayinlerine uygulanmıştır.
Yılmaz vd. (1998), çalışmalarında sefotaksimin elektroksidasyonu, farklı destek
elektrolit çözeltilerinde ve farklı pH’larda spesifik olarak camsı karbon (GC), platin
ve karbon pasta (CP) elektrotları kullanarak araştırmışlardır. Voltamogram
şekillerinin ve oksidasyon basamağı sayılarının elektrotun yapısına bağlı olarak
değiştiği gözlenmiştir. Destek elektrolitin yapısı da elektrotun cevabı için oldukça
önemlidir. Aktive edilen GC elektrot ile 0,2 M H3PO4 çözeltisinde 2×10-5-1×10-4M
ve 2×10-4-6×10-4 M konsantrasyon aralıklarında eğimleri farklı iki kalibrasyon
grafiği elde edilmiştir. Geri kazanım testlerinin sonuçları ve istatistik analiz verileri
bu voltametrik metodun sefotaksimin tayininde kullanılabileceğini göstermiştir.
Analitik açıdan bakıldığında, aktif GC elektrotun uygun olduğu bulunmuştur.
El-Maali vd. (2000), yaptıkları çalışmada seftazidimin (CFZ) elektrokimyasal
davranışını dört faklı elektrot (statik damlayan cıva elektrotu (SMOE), büyüme
kontrollü cıva elektrotu (CGME), camsı karbon elektrot (GCE) ve karbon pasta
elektrot (CPE) ) kullanarak incelemişlerdir. Sulu ortamda ilacın zenginleştirilmesi ve
tayini için optimum koşullar belirlenmiştir. Karbon pasta elektrotun polivinil alkol ile
modifikasyonu, ilaç birikiminde hem seçiciliği hem de hassasiyeti artmıştır. Böylece
çok düşük seviyelerde CFZ’nin tayini yapılmıştır. CGME ile CFZ için 2×10-10 M’ın
altında tayin limiti tespit edilmiştir. İlaç birikimi için; polivinil alkol ile CPE
modifikasyonu (PVA) sonucunda duyarlılığıve seçiciliğiarttırdığı ve bu nedenle bu
elektrotun çok düşük seviyelerde kararlı olduğu bulunmuştur. Geliştirilen yöntem ile
idrar ilave edilen veya metabolizma sonrası alınan örneklerde CFZ analizi kolaylıkla
55
gerçekleştirilmiştir. 1×10-9 M konsantrasyonun altındaki CFZ içeren örneklerde de
kolayca tayin yapılmıştır.
Lin vd. (2000), sefalosporin grubunda yer alan 12 antibiyotiğin ayrımını ve çalışılan
tampon türünün, derişiminin ve pH’sının migrasyon davranışı üzerine etkisini,
kapiler bölge elektroforez kullanılarak fosfat, sitrat ve 2-(N-morfin)etansülfonat
(MES) tamponlarında incelemişlerdir. Sonuçlar özellikle aynı anda analit olarak
sefuroksim-sefazolin, sefaleksin-sefaklor veya sefotaksim-sefapirin bulunduğu
durumlardaki sefalosporinlerin ayırımında tampon pH’sının yanında tamponu
derişimininde önemli rol oynadığını göstermiştir. Sitrat tamponunda optimum
tampon derişimi (35-40 mM) küçük bir aralık ile sınırlıyken, MES tamponu 300
mM’ın üzerindeki derişimlerde kullanılabilmişlerdir. Bu üç tampon kullanılarak
çeşitli optimum koşullar altında on iki sefalosporin ayırımı gerçekleştirilmiş ve
ayırımın, fosfat tamponuna kıyasla MES ve sitrat tamponlarında daha iyi olduğu
görülmüştür. pH’sı 5’den düşük olan sitrat tamponunda sefalosporinlerin
elektroforetik mobilitelerinin, elektroosmotik mobiliteden daha büyük olması
nedeniyle bazı sefalosporinler gözlenememiştir. Sefradin, sefaleksin, sefapirinin pKa
değerlerinin ya amino yada pridinyum grubunun deprotonasyonundan kaynaklandığı
belirlenmiştir. Ayrıca sefalosporinlerin migrasyon davranışları, çalışılan pH
aralığında kantitatif olarak tanımlanmıştır.
Pajchel vd. (2000), sefazolin, sefuroksim sodyum, sefoperazon sodyum ve
seftazidimin migrasyon davranışlarını incelemişlerdir. pH 5-8 aralığında sodyum
dodesilsülfat (SDS) ilaveli ve ilavesiz fosfat-borat tamponu kullanılmıştır. Tüm
bileşiklerin kapiler elektroforez ile ayrımı gerçekleştirilememiştir. SDS eklenen pH
6,5 fosfat-borat tamponunda sefalosporinlerin ayırımının iyileştiği gözlenmiştir. pH
6,5’deki fosfat-borat tamponuna pentansülfonik asidin (17,4 g/L) ilavesi, herbir
sefalosporinin ayırımını sağlamıştır. Bu koşulda hem migrasyon zamanın hemde pik
alanın tekrarlanabilirliğinin iyi olduğu tespit edilmiştir.
Billova vd. (2003), kare dalga voltametrik yöntemi ile çeşitli tamponlarda, bakteri
kültürlerinde, süt ve idrarda sefoperazonun tayinini gerçekleştirmişlerdir.
Sefoperazonun voltametrik pikinin, pH ve çözelti bileşenlerinden etkilendiği
56
gözlenmiştir. Sefoperazon için Britton Robinson tamponunda (pH=4,4) düşük
dedeksiyon limiti ( yaklaşık 0,5 nmolL-1) elde edilmiştir. Kompleks bir ortam içinde
ise (bakteriyel 2YT ortamı pH 7,2) dedeksiyon limiti yaklaşık olarak 1,5 mmolL-
1olarak bulunmuştur. Çalışmacılar, biyokütle ayırımı olmadan yaşayan bakteri
kültüründe sefoperazon tayini için kare dalga voltametri tekniğinin uygun ve hızlı bir
metot olduğunu kanıtlamışlardır. Sefoperazon bulunan kültür içindeki metisiline
dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ve metisiline duyarlı Staphylococcus aureus
(MSSA) arasında zamana bağlı olarak büyük farklılıkların olduğu görülmüştür.
Sefoperazon penisilinaz tarafından yarıldığında, oldukça pozitif gerilimlerde yeni bir
kare dalga voltametri piki gözlenmiştir. Orjinal sefoperazonun piki eşzamanlı
azalırken gözlenen bu yeni pik, yarılma zamanı ve enzim konsantrasyonunun
artmasıyla yükselmektedir. Sefoperazonun Pathozene isimli ilaç içindeki derişimi
standart ekleme metodu ile tespit edilmiştir ve bulunan sonuç ilaç içindeki bilinen
sefoperazon değeri ile örtüşmektedir. Sefoperazonun sütteki tayininin basit bir ön
deriştirme işlemi ile gerçekleştirildiği bunun yanı sıra idrardaki tayini için ön
deriştirmenin gerekli olmadığı belirtilmiştir. Kare dalga voltametri yöntemi
kullanılarak, inek sütünde ve insan idrarında 500 nmol/L gibi düşük derişimdeki
sefoperazonun tayininin yapıldığı bildirilmiştir.
Becker vd. (2004), yaptıkları bu çalışmada, 2377/90 Konsey tüzüğünde AB
Maksimum kalıntı limitleri verilen penisilin ve sefolasporinlerin birçoğu için duyarlı
ve spesifik sıvı kromotografi-tandom kütle spektrometri (LC-MS-MS) yöntemi
geliştirilmiş ve bu yöntem sığır kası, böbrek ve sütte valide edilmiştir. Analitler,
asetonitril/su ile ekstrakte edilmiş ve tek ters-faz/katı-faz ektraksiyon adımı ile
temizlenmiştir. Amoksisilin, ampisilin, safaleksin, sefapirin, sefalonyum, sefkuinom
ve sefazolin pozitif elektrosprey iyonizasyon modunda; sefoperazon, benzilpenisilin,
fenoksimetilpenisilin, oksasilin, kloksalin ve nafsalin ise negatif elektrosprey
iyonizasyon modunda ölçüldüğünde analitler için en yüksek duyarlılık elde
edilmiştir. Kromotografi çalışması formik asit/metanol ile gerçekleştirilmiştir. Argon
ile çarpışma kaynaklı ayrışma (CID), gereken spesifikliği elde etmek için
pseudomomelekül iyonların çarpışması için kullanılmıştır. Yöntem yeni AB
direktiflerine göre valide edilmiş ve gıda örneklerindeki beta laktam kalıntılarının
tanımlanması ve miktar tayinine uygulanmıştır.
57
El-Desoky vd. (2005), yaptıkları çalışmada antibiyotik ilaçlardan sefazolin
sodyumun (CFZ) Britton Robinson tamponları (pH 2-11) içinde cıva elektrot
kullanılarak elektrokimyasal davranışını DC polarografi, dönüşümlü voltametri,
kontrollü-potansiyel, kulometri ve kare dalga adsorptif sıyırma voltametri yöntemleri
ile incelemişlerdir. Kara dalga adsorptif katodik sıyırma voltametri yöntemi ile
sefazolinin dedeksiyon ve kantitatif tayin sınırları sırasıyla 2×10-10 M ve 8,6×10-10M
olarak bulunmuştur. Bu yöntem zaman alıcı ekstraksiyon, evaporasyon gibi numune
hazırlama işlemlerine gerek duymadan farmasötik numunedeki sefazolinin tayini için
kullanılmıştır.
El-Maali vd. (2005), sefalosporin grubu antibiyotik türevlerinden olan seftriakson ve
sefoperazonu doğru akım, diferansiyel puls ve dönüşümlü voltametri teknikleri ile
incelemişlerdir. Her iki antibiyotik için iki-elektron indirgenme basamağına ait iki
tersinmez pik gözlemişlerdir. Her iki ilaç etken maddesinin elektroksidasyonu
karbon pasta elektrot ile incelenmiş ve her iki bileşik için doygun kalomel elektrota
karşı yaklaşık +1,05 V’da (pH 1,6 fosfat tampon çözeltisi) yükseltgenme piki
gözlenmiştir. Bu bileşiklerin karbon pasta elektrotla tayini için optimum pH aralığı
verilmiştir. Seftriakson ve sefoperazon için lineer kalibrasyon grafikleri, sırasıyla
0,49 ile 0,99 μg/ml ve 0,66-534 μg/ml derişim aralığında elde edilmiştir. Tayin limiti
ise seftriakson için 2,5 μg/ml, sefoperazon için 0,13 μg/ml olarak bulunmuştur.
Hammam vd. (2006), yaptıkları çalışmada sefoperazonun kantitatif tayini için kare
dalga sıyırma voltametri yöntemini kullanmışlardır. Prosedür, damlayan cıva
elektrotuna adsorbe edilen ilacın indirgenmesini temel almaktadır. Dedeksiyon limiti
4,5×10-10 M ve kantitatif tayin sınırı 1,5×10-9 M olan sefoperazonun 150 saniyede
damlayan cıva damla elektrot üzerinde ön deriştirilmesi gerçekleştirilmiştir. İnsan
serum ve plazmasındaki eser miktardaki sefoperazonun tayini için kare dalga
adsorptif katodik sıyırma voltametri yöntemi başarı ile uygulanmıştır. İlacın
dedeksiyon kantitasyon sınırları sırası ile 6×10-10 M ve 2×10-9 M olarak bulunmuştur.
Hastanede yatan gönüllülerin plazması içinde sefoperazonun farmokinetik
parametreleri başarılı bir şekilde bulunmuştur.
58
Jamasbi vd. (2006), bu çalışmada sefaleksin ve sefazolin elektrokatalitik
oksidasyonunu, kobalt salopen CoSal ile modifiye edilmiş karbon pasta elektrotun
kullanıldığı dönüşümlü voltametri yöntemi ile incelemişlerdir. Sefaleksin ve
sefazolinin tayininde CaSol ile modifiye edilen karbon pasta elektrotun seçiciliği
araştırılmıştır. Sefazolinin elektro-oksidasyonunda bir elektrokatalitik
mekanizmaönermek içn beta-laktam halkası dışında tiyol gruplarına sahip
seftriaksonun elektrokimyasal davranışı incelenmişitr. CoSal modifiye karbon
elektrotta bu antibiyotiklerin elektrokatalitik oksidasyonunun tersinmez olduğu
gözlenmiştir. Kükürt içeren sefazolinin tarama hızına bağımlılığı araştırılmış ve
sonuçlar bileşiklerin elektrokatalitik oksidasyonunun difüzyon kontrollü olduğunu
göstermiştir. Modifiye edilmiş elektrot ile modifiye edilmemiş elektrotların cevapları
karşılaştırılmış ve sefazolin tayininde modifiye elektrotun daha hassas olduğu
gözlenmiştir. Sefazolinin kronoamperometri tarafından oksidasyonuna, bütün
elektrotların katkısı olduğu belirlenmiştir. Hız kısıtlayıcı basamağa dahil olan
elektron sayısı birdir. Yüksek hassasiyetli modifiye elektrotun kullanıldığı
diferansiyel puls voltametri sonuçları, insan kanı örneklerindeki sefazolinin tayinine
uygulanmıştır. Tampon çözelti içerisinde (pH=3) sefazolinin DPV ile tayininde
1×10-5ile 1×10-3 mM derişim aralığında doğrusallık elde edilmiştir.
Puig vd. (2007), plazma içindeki sefoperazon ve seftidurun tayini için online katı-faz
ekstraksiyon-kapiler elektroforez yöntemlerinin kullanıldığı bir yöntem
geliştirmişlerdir. Katı-faz ekstraksiyon C18 mikro ön kolon kullanılarak
gerçekleştirilmiş ve sefalosporinler için 1 mL’nin üstündeki hacimlerde oldukça iyi
alıkonma özellikleri elde edilmiştir. Desorpsiyon için 426 nL kullanıldığında geri
kazanım sefoperazon için %75, seftidur %90 olarak bulunmuştur. Elüsyon hacmi
yaklaşık olarak 1,8 μL’dir. Plazma örneklerindeki analizlerde katı-faz
ekstraksiyonundan önce deproteinizasyon adımı uygulanmıştır ve sefoperazon ve
seftidur için geri kazanım sırasıyla %90 ve %57 olarak elde edilmiştir. 250 nm dalga
boyundaki UV ölçümlerinde derişim ve pik alanları arasında standartlar için 10-
50ngmL-1, plazma örnekleri için ise 200-500 ngmL-1aralığında lineer illişki
saptanmıştır. Gün içinde (n=5) ve farklı günlerde (n=5) pik alanının
tekrarlanabilirliliği %12 RSD’den daha düşüktür. Plazma için elde edilen dedeksiyon
59
limitinin (100ngmL-1 sefoperazon ve seftidur) farmokinetik çalışmalara uygulanan
metotlar için yeterli olduğu belirtilmiştir.
Doğan vd. (2009), çeşitli tampon sistemlerinde ve farklı pH değerlerinde dönüşümlü,
doğrusal taramalı, diferansiyel puls ve kare dalga voltametri tekniklerini kullanarak
camsı karbon elektrot yüzeyinde sefoperazon sodyumun tersinmez olarak
yükseltgenmesini çalışmışlardır. Sefoperazon sodyumun yükseltgenmesinin
tersinmez ve pH değerine bağlı olarak difüzyon kontrollü olduğu saptanmıştır.
Detaylı bir yükseltgenme mekanizması önerilmiş ve tartışılmıştır. Pik akımının
vepotansiyelinin pH, derişim, tarama hızı ve tampon çözeltisine bağımlılığı
araştırılmıştır. Pik akımı ile derişim arasındaki lineer ilişkiye göre farmasötik dozaj
formlarında ve biyolojik sıvılarda sefoperazon sodyum tayini için diferansiyel pulsve
kare dalga voltametri metotları geliştirilmiştir. Sefoperazon sodyumun, diferansiyel
puls voltametri tekniği ile 4×10-6-2×10-5 M, kare dalga voltametri tekniği ile 4×10-6-
6×10-5 M aralıklarında sodyum pH 2 fosfat tamponunda kantitatif tayini
gerçekleştirilmiş ve serum örneklerine 4×10-6-2×10-5 M derişim aralıklarında ilave
edilen sefoperazonun tayini her iki yöntemle yapılmıştır. Metodun tekrarlanabilirliği,
duyarlılığı, kesinliği ve doğruluğu bütün ortamlarda incelenmiştir. Geliştirilen
metodun kesinliği ve doğruluğu geri kazanım çalışmaları için kullanılmıştır. Geri
kazanım çalışmaları, standart ekleme metodu ile yapılmıştır. Farmasötik formlardaki
katkı maddelerinin ve biyolojik sıvılardaki endonojen maddelerin elektroaktif
girişimlerine rastlanmamıştır.
Ojani vd. (2010), yaptıkları çalışmalarında bazı sefalosporinlerin (sefiksim,
seftriakson, seftizoksim) elektrokatalitik oksidasyonlarını poli(o-anisidin)/SDS/Ni
modifiye karbon elektrot ile dönüşümlü voltametri, kroamperometri ve
kronoklometri metotlarını kullanarak gerçekleştirmişlerdir. İlk olarak poli(o-
anisidin), karbon elektrot yüzeyinde sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren monomer
çözeltisinde dönüşümlü voltametri yöntemi ile oluşturulmuştur. Daha sonra, amin
grubuna sahip polimerik modifiye elektrotun 0.1 mol/L Ni(II) çözeltisine
daldırılması ile Ni(II) iyonları elektrota katılmıştır. Bu elektrot yüzeyinde
Ni(OH)2/NiOH çifti için iyi bir redoks davranışı gözlenmiştir. Sefalosporinler nikel
iyonlarının bulunduğu poli(o-anisidin) modifiye karbon elektrot yüzeyinde başarılı
60
bir şekilde yükseltgenmişlerdir. Sefalosporinlerin elektrokatalitik yükseltgenme pik
akımları ve konsantrasyonları arasında lineer bir ilişki bulunmuştur. Elektrot,
farmasötik preparatlardaki sefalosporinlerin tayini için başarıyla kullanılmıştır.
Ali Ahmed vd. (2011) sefiksim, sefaleksin ve sefotaksimin farmasötik numunelerden
tayini için doğru ve kesin spektrofotometrik bir metot önermişlerdir. Önerilen metot,
sefalosporinlerin1,2naftakinon-4-sülfonik (NQS) ile türevlendirilmesini temel
almaktadır. Optimum deneysel koşullar çalışılmıştır. Sefiksim, sefaleksin ve
sefotaksim için sırasıyla 0,5-3, 0,8-2,8 ve 0,2-1,2 μg/mL derişim aralıklarında Beer
yasası geçerlidir. Sefiksim, sefaleksin ve sefotaksimin dedeksiyon limitleri ve lineer
regresyon korelasyon katsayıları sırasıyla 0,12 (0,9993), 0,168 (0,9993) ve 0,0465
(0,9994) μg/mL olarak bulunmuştur. Geri kazanım değerleri ise sefiksim için 96,5-
102,3, sefaleksin için 96,04-102,22 ve sefotaksim için 97,09-99,3 aralığındadır.
Sefiksim, sefaleksin ve sefotaksimin tayininde pH, sıcaklık, reaksiyon zamanı ve
NQS derişiminin etkisi incelenmiştir. Bu yöntemin kalite kontrol laboratuvarlarında
farmasötik numunelerden sefiksim, sefaleksin ve sefotaksimin tayini için basit ve
uygulanabilir olduğu belirtilmiştir.
Hoang vd. (2013), sefoperazonun elektro indirgenme davranışını ve tayinini,
damlayan asılı cıva elektrot ile incelemişlerdir. pH 3-6 aralığındaki Britton Robinson
tamponlarında kaydedilen sefoperazonun dönüşümlü voltamogramlarında tek
tersinmez katodik pik gözlenmiştir. Yöntemin adsorpsiyon kontrollü olduğu
belirtilmiştir. Diferansiyel puls ve kare dalga adsorplayıcı katodik sıyırma
voltametrisi ile sefoperazonun tayininde 0,04 mM pH 4 Britton Robinson tamponu
destek elektrolit olarak seçilmiştir. Deneysel voltametrik koşullar Central Composite
Face ile optimize edilmiştir. İndirgenme piki -0,7 V ile -0,8 V arasında görülmüştür.
Bu voltametrik teknikler ICH kurallarına göre valide edilmiş ve sefoperazonun tek
başına ve sülbaktam ile tayini için uygulanmıştır. Sonuçlar USP-HPLC yöntemi ile
istatiksel olarakkarşılaştırılmıştır. Sefoperazonun insan kanındaki tayini matriks
etkisi olmadan gerçekleştirilmiştir.
Quesada-Molina vd. (2013), 1:2 oranında aseton-su çözücüsüne amonyum sülfat
eklenmesiyle sulu çözeltiden aseton içerisine sefalosporinlerin iyon-çifti
61
ekstraksiyonu ters-faz kapiler sıvı kromotografi yöntemini kullanarak bu bileşiklerin
tayinini gerçekleştirmişlerdir. Analit olarak sefoperazon, sefaleksin, sefopirin,
sefolanin, sefamandol, sefazolin ve sefadroksil kullanılmıştır. İyon çifti oluşturmak
için sulu çözeltide optimum koşul olarak 10 mM fosfat (pH 8) tamponunun
kullanıldığı 0,9 mM derişim de katyonik iyon-çifti reaktifi
hekzadesiltrimetiamonyum bromür (CTAB) seçilmiştir. Sefolasporinlerin ayırımı
Luno C18 (150 mm×0,3 mm×5 μm×100 A) kolonu kullanılarak aşağıdaki koşullar
altında gerçekleştirilmiştir. A (suda % 0,1 formik asit, pH 4) ve B (asetonitril-su
(50:50, v/v)) çözücülerinin birleşimi gradient program, 20 μlmin-1 akış hızı, 350C
kolon sıcaklığı, 7 μl enjeksiyon hacmi ve 250 nm dalga boyu aralığındadır. Sığır
örnekleri için elde edilen kantitatif tayin limiti, Avrupa Birliği tarafından müsade
edilen maksimum kalıntı limitlerinden daha düşüktür. Geliştirilen metodun yüksek
duyarlılık, kesinlik ve tatmin edici geri kazanım ile sığır ve domuz kası içeren et ve
su örneklerinde yaygın olarak kullanılan antibiyotiklerin analizleri için uygun olduğu
gösterilmiştir.
62
3. MATERYAL VE YÖNTEM
Bu bölümde, bazı sefolasporinler grubu bileşiklerin elektrokimyasal
karakterizasyonu ve voltametrik tayinlerinde kullanılan cihazlar, kimyasallar ve
yöntemler hakkında bilgi verilmiştir.
3.1. Kullanılan Cihazlar
3.1.1. Potentiostat/Galvonostat cihazı
Sefolasporin grubu antibiyotiklerden sefoperazon ve sefadroksilin elektrokimyasal
davranışları, karbon grafit elektrot kullanılarak diferansiyel puls voltametri yöntemi
ile incelenmiştir. Ayrıca dönüşümlü voltametri yöntemi kullanılarak tarama hızının
pik akımları üzerine etkisine bakılmıştır. Bu çalışmalarda GPES 4.9 versiyon yazılım
programlı Autolab Potentiostat/Galvonostat PGSTAT-302N cihazı kullanılmıştır.
Şekil 3.1’de Potantiostat/Galvonostat cihazı görülmektedir.
Şekil 3.1. Autolab Potentiostat/Galvanostat PGSTAT-302N cihazı
3.1.2. Ultrasonik karıştırıcı
Tüm çözeltilerin hazırlanmasında Elmasonic S51 model ultrasonik karıştırıcı
kullanılmıştır.
63
3.1.3. Hücreler
Elektrokimyasal deneyler; beş girişli, rodajlı, aşağıdan yukarıya doğru genişleyen ve
kirlenme ile adsorpsiyon yanılgılarının en az olduğu cam hücrelerde yapılmıştır.
Şekil 3.2’ de kullanılan hücrenin resmi verilmiştir.
Şekil 3.2. Elektrokimyasal cam hücre
Rodajlı girişlerden birine çalışma elektrotu, birine referans elektrot diğerine de karşıt
elektrot yerleştirilmiştir. Şekil 3.3’de deney hücresinin resmi verilmiştir.
Şekil 3.3. Deneylerde kullanılan elektrokimyasal hücrenin görünümü
3.1.4. Elektrotlar
Deneylerde referans elektrot olarak Ag/AgCl elektrot; karşıt elektrot olarak Pt tel ve
çalışma elektrodu olarak 0,7 mm. HB Tombo karbon bazlı kalem ucundan oluşan
üçlü elektrot sistemi kullanılmıştır. Kullanılan elektrotlar Şekil 3.4, 3.5 ve 3.6 de
verilmiştir.
64
Şekil 3.4. Çalışma elektrotu olarak kullanılan 0,7 mm. HB Tombo karbon bazlı kurşun kalem ucu
Şekil 3.5. Referans elektrot olarak kullanılan Ag/AgCl elektrot
Şekil 3.6. Karşıt elektrot olarak kullanılan Pt tel
3.1.5. pH /İyon metre
Elektrokimyasal çalışmalarda kullanılan tampon çözeltilerin pH ayarlamalarında
Mettler Toledo S220 Seven Compact pH/iyon metre ve Mettler Toledo InLab 416
Ag/AgCl kombine elektrot kullanılmıştır.
65
3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler
Deneylerde kullanılan kimyasal maddeler analitik veya HPLC saflıktadır ve ticari
olarak temin edilmiştir. Çözeltiler ultra-saf deiyonize su kullanılarak hazırlanmıştır.
Kullanılan kimyasal maddeler ve özellikleri Çizelge 3.1’de verilmiştir.
Çizelge 3.1. Kullanılan kimyasal maddeler
Kimyasalın Adı Kullanım Amacı Formül ve Özellikleri
Asetik asit
Britton–Robinson ve Asetat tamponlarının hazırlanmasında
CH3COOH MA=60,05 g/mol, Merck (analitik saflıkta)
O-Fosforik asit Britton –Robinson ve Fosfat tamponlarının hazırlanmasında
H3PO4 MA=98,00 g/mol, Merck (analitik saflıkta)
Borik asit
Britton –Robinson tamponlarının hazırlanmasında
H3BO3 MA=61,83 g/mol, Merck (analitik saflıkta)
Sodyum hidroksit
Tamponların pH’ sının ayarlanmasında
NaOH MA=40,00 g/mol, Merck (analitik saflıkta)
Elektrokimyasal karakterizasyonu ve voltametrik tayinleri yapılan sefolasporin grubu
antibiyotiklerin isimleri, kapalı formülleri ve molekül ağırlıkları Çizelge 3.2 ve 3.3’
de verilmiştir.
66
Çizelge 3.2. Sefadroksilin özellikleri
Çizelge 3.3. Sefoperazonun özellikleri
Sefadroksil
Kapalı formülü Açık formülü Molekül Ağırlığı
[C16H17N3O5S] 363,39 g/mol
Sefoperazon
Kapalı formülü Açık formülü Molekül Ağırlığı
[C25H27N9O8S2]
645,6 g/mol
67
3.3. Kullanılan Çözeltiler
3.3.1. Britton-Robinson tamponu (BR) (pH 2,0-12,0)
BR tampon çözeltisi, analitik derişimleri 0,04 M olacak şekilde asetik asit, borik asit
ve fosforik asitten gerekli miktarlarda alınıp 0,50 L hacimde suda hazırlanmıştır. Bu
stok çözeltiden alınarak pH’lar, 3 M NaOH ve derişik H3PO4 çözeltileri kullanılarak
2-12 aralığında ayarlanmıştır.
3.3.2. Asetat tamponu (pH 3,5-5,5)
Asetat tamponu, derişim 0,2 M olacak şekilde asetik asittengerekli miktarda alınıp
0,250 L hacimde suda çözülerek hazırlanmıştır. Bu stok çözeltiden alınarak pH’ lar,
3 M NaOH ve derişik asetik asit çözeltileri kullanılarak 3,5-5,5 aralığında
ayarlanmıştır.
3.3.3. Fosfat tamponu (pH 2-8)
Fosfat tamponu, derişim 0,2 M olacak şekilde fosforik asitten gerekli miktarda alınıp
0,250 L hacimde suda çözülerek hazırlanmıştır. Bu stok çözeltiden alınarak pH’ lar,
3 M NaOH ve derişik fosforik asit çözeltileri kullanılarak 2-8 değer aralığında
ayarlanmıştır.
3.3.4. Sülfürik asit çözeltisi
0,1 M sülfürik asit çözeltisi, derişik sülfürik asitten gerekli miktarda alınıp hacmin
0,10 L’ye saf su tamamlanması ile hazırlanmıştır. Hazırlanan çözeltinin pH’sı
ölçülerek kaydedilmiştir.
3.3.5. Sodyum hidroksit çözeltisi
NaOH çözeltisi, katı sodyum hidroksitten 3 M olacak şekilde gerekli miktarda tartılıp
hacim 0,10 L olacak şekilde suda çözülerek hazırlanmıştır.
68
3.3.6. Stok sefadroksil çözeltisi
0,227 gram sefadroksil alınıp % 20 metanol-su içerisinde çözülmüş ve hacmi balon
jojede 25 mL’ye tamamlanarak 25 mM sefadroksil çözeltisi elde edilmiştir. DPV ve
CV çalışmaları yapılırken bu stok çözeltiden gerekli seyreltmeler yapılmıştır.
3.3.7. Stok sefoperazon çözeltisi
0,417 gram sefoperazon alınıp su içerisinde çözülmüş ve hacmi balon jojede 25
mL’ye tamamlanarak 25 mM sefoperazon çözeltisi elde edilmiştir. DPV ve CV
çalışmaları yapılırken bu stok çözeltiden gerekli seyreltmeler yapılmıştır.
3.3.8. İlaç örneğinin hazırlanması
Sefoperazon tayini için kullanılacak bir flakon içindeki sülperazonun tamamı
tartılarak kütlesi belirlenmiştir. Bir flakonda 1,1074 g sefoperazon olduğu
bilindiğinden tartılması gereken madde miktarı hesaplanmış ve bu miktarda alınan
ilaç balon jojede su ile 10 mL’ye tamamlanmıştır. İlaç örneğinde sefoperazon
derişimi 3,50×10-3 M’dır. Çözünmeyen destek ve katkı maddelerinin çökmesi için, oda
sıcaklığında 2 saat bekletilmiştir. Çökme işlemi tamamlandıktan sonra çözeltinin berrak
kısmından belirli hacimlerde alınarak deneylerde kullanılmıştır.
3.3.9. Serum örneğinin hazırlanması
Serum numunesi sağlıklı ve söz konusu ilacı kullanmayan insanlardan temin edilmiştir.
Belirli miktar serum 2000 devir/dakika hızla 15 dakika santrifüjlenerek proteinlerin
çökmesi sağlanmıştır. Proteinleri çöktürülüp ayrılan serum, filtreden geçirilmiştir.
Serumdan 2,5 mL alınıp, içerisinde 7,5 mL çalışma tamponu bulunan elektrokimyasal
hücreye eklenerek serum çözeltisi hazırlanmıştır.
3.3.10. İdrar örneğinin hazırlanması
İdrar numuneleri de söz konusu ilacı kullanmayan sağlıklı bireylerden alınmıştır. Belirli
miktar idrar 2000 devir/dakika hızla 15 dakika santrifüjlenerek proteinlerin çökmesi
69
sağlanmış ve süpernatant kısım alınarak filtreden geçirilmiştir. Her bir çalışma için
idrardan 2,5 mL alınıp, içerisinde 7,5 mL çalışma tamponu bulunan elektrokimyasal
hücreye eklenerek idrar çözeltisi hazırlanmıştır.
3.4. Yöntem
Bu çalışmada sefalosporin grubu bazı bileşiklerin (sefoperazon ve sefadroksil)
elektrokimyasal davranışları,karbon grafit elektrot kullanılarak diferansiyel puls
voltametri yöntemiyle incelenmiştir. Bileşiklerin elektrokimyasal davranışları üzerine
destek elektrolitin ve destek elektrolit pH’sının etkileri incelenerek; pik akımı ve
gerilimlerinin destek elektrolit pH’sı ile değişimleri değerlendirilmiştir. Elektrot
yüzeyine kütle transferini karakterize etmek için dönüşümlü voltametri yöntemi ile pik
akımları üzerine tarama hızının etkisi bakılmıştır. Elektrokimyasal davranışları
belirlenen bileşikleri içeren farmasötik dozaj formlarında ve insan idrar ve serum
örneklerinde bu bileşiklerin analizleri belirlenen optimum deneysel koşullarda
gerçekleştirilmiştir
3.4.1. Sefolasporin grubu bileşiklerin elektrokimyasal davranışları üzerine
destek elektrolit ve pH’ etkisinin incelenmesi
Yapılan çalışmada sefolasporinlerin elektrokimyasal davranışları, destek elektrolit
olarak 0,1 M H2SO4 (pH=1,26), pH 2,00-12,00 aralığındaki Britton-Robinson
tamponları, pH 2,00-8,00 aralığındaki fosfat tamponları ve pH 3,5-5,5 aralığında
asetat tamponları kullanılarak incelenmiştir.
Analize başlamadan önce karbon grafit elektrotunun kendi elektroaktivitesini
azaltmak amacıyla tüm tampon çözeltiler içerisinde 0 V ile +1,5 V arasında 5’er kez
diferansiyel puls voltamogramları alınmıştır.
İkinci aşamada tampon çözelti içerisine sefadroksil ve sefoperazon stok çözeltisinden
0,0005-5 mM aralığındaki derişimlerde seyreltme yaparak farklı sefadroksil ve
sefoperazon derişimleri için 3’er kez alınan diferansiyel puls voltamogramlarından
akım ve gerilim değerleri belirlenmiştir. Bileşiklere ait pik akım ve gerilimlerinin
70
farklı pH’larda hazırlanan Britton Robinson, asetat ve fosfat tamponlarındaki
değişimleri incelenmiştir.
3.4.2. Kalibrasyon grafiklerinin hazırlanması
Elektrokimyasal davranışının incelenmesi sonucunda yükseltgenme pik akımının
maksimum olduğu destek elektrolit çözeltisi ve pH’sı belirlenmiştir. Bu çözeltide
karbon grafit elektrot kullanılarak sefadroksil için 0,005-0,05 mM ve sefoperazon
için 0,05-1 mM derişim aralığında DPV yöntemi ile ölçülen yükseltgenme pik
akımları grafiğe geçirilerek kalibrasyon grafikleri elde edilmiştir.
3.4.3. İlaç örneğinde sefoperazonun elektrokimyasal tayini
Destek elektrolit çözeltisine kalibrasyon doğrusu aralığında bulunan derişimlerde ilaç
örnekleri ilave edilmiş ve numunedeki sefoperazon, karbon grafit elektrot
kullanılarak DPV yöntemi ile tayin edilmiştir.
3.4.4. Kan ve idrar örneğinde sefoperazonun eletrokimyasal tayini
Destek elektrolit çözeltisine, serum veya idrar numunelerinden 0,1-0,75 mM derişim
aralığında ilaveler yapmış ve karbon grafit elektrot kullanılarak diferansiyel puls
voltametri yöntemiyle voltamogramları kaydedilip pik akımları ölçülmüştür. Sonra,
bu çözeltiye artan derişimlerde standart ilaç etken madde katılmış ve her bir ilave
sonrası voltamogramlar alınmış ve pik akımları kaydedilmiştir. Katılan standart
etken madde derişimlerine karşı pik akımları grafiğe geçirilerek elde edilen
denklemden yararlanarak etken madde derişimleri hesaplanmıştır.
3.4.5. Dönüşümlü voltametri yöntemi ile pik akımları üzerine tarama hızının
etkisinin incelenmesi
Analizin yapılacağı sınır potansiyel değerlerinin belirlenmesi için bir takım ön
denemeler yapılmış ve çalışma potansiyel aralığı belirlenmiştir. Potansiyel sınır
değerleri belirlendikten sonra sabit sefadroksil ve sefoperazon derişimlerinde elektrot
71
yüzeyine kütle transferini karakterize etmek için karbon grafit elektrot kullanılarak
dönüşümlü voltametri yöntemi ile pik akımları üzerine tarama hızının etkisine
bakılmış ve elde edilen CV sonuçlarına göre, pik akımı ile tarama hızının karekökü
(ip-υ1/2) ve pik akımının logaritması ile potansiyelin logaritmasının (logip-logυ)
grafikleri çizilerek bu grafiklerin eğimlerinden akım türü belirlenmiştir.
72
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
4.1. Sefalosporinlerin Elektrokimyasal Davranışı
Bu çalışmada, sefalosporin grubu antibiyotiklerden; sefadroksil ve sefoperazonun
farklı destek çözeltiler içinde (Britton-Robinson, asetat ve fosfat tamponu) ve çeşitli
pH’larda diferansiyel puls voltametri yöntemi kullanılarak, karbon grafit elektrot
yüzeyindeki elektrokimyasal davranışları incelenmiştir. Ayrıca elektrot yüzeyine
kütle transferini karakterize etmek için dönüşümlü voltametri yöntemi ile pik
akımları üzerine tarama hızının etkisine bakılmıştır.
Söz konusu ilaç etken maddelerinin nicel analizi için voltametrik tayin yöntemleri
geliştirilerek ticari tabletlerden, kan ve idrar numunelerinden geri kazanım
çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalardan elde edilen bulgular ve yorumlar aşağıda
ayrıntılı bir şekilde verilmiştir.
4.1.1. Sefadroksilin elektrokimyasal davranışı
Sefadroksilin elektrokimyasal davranışını diferansiyel puls voltametri (DPV)
yöntemiyle inceleyebilmek için öncelikle yükseltgenme geriliminin belirlenmesi
gerekmektedir. Bu amaçla çalışan tamponların sefadroksil ilave edilmeden önce ve
edildikten sonra alınan voltamogramları karşılaştırılmış ve Şekil 4.1’de görüldüğü
gibi, yaklaşık +0,90 V gerilimde sefadroksile ait bir yükseltgenme piki gözlenmiştir.
Şekil 4.1. a) Sefadroksil bulunmayan ve b) 0,05 mM sefadroksil içeren çözeltide (0,2 M asetat pH 5 tamponu) alınan DPV voltamogramların karşılaştırılması
73
Sefadroksilin karbon grafit elektrotu ile yükseltgenme geriliminin belirlenmesinden
sonra bileşiğin elektrokimyasal davranışı farklı pH’larda hazırlanan Britton-
Robinson (pH 2-12), asetat (pH 3,5-5,5) ve fosfat (pH 2-8) tampon çözeltilerinde
diferansiyel puls voltametri yöntemi ile incelenmiştir. Her bir tampon için pH’ya
karşı sefadroksilin yükseltgenme pik akımları grafiğe geçirilerek bileşiğin
elektroaktivitesinin en yüksek olduğu destek elektrolit ve pH belirlenmiştir. Şekil
4.2, 4.3 ve 4.4’de sırasıyla asetat, fosfat ve Britton-Robinson tamponlarında 0,05 mM
sefadroksil için pH-akım grafikleri verilmiştir.
Şekil 4.2. 0,05 mM sefadroksilin asetat tamponunda pH-akım grafiği
Şekil 4.3. 0,05 mM sefadroksilin fosfat tamponunda pH-akım grafiği
0,00E+00
4,00E-06
8,00E-06
1,20E-05
1,60E-05
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6
Akı
m (A
)
pH
0,2 mM Asetat Tamponu
1,00E-05
1,20E-05
1,40E-05
1,60E-05
1,80E-05
2,00E-05
5 6 7 8 9 10
Akı
m (A
)
pH
0,2 M Fosfat Tamponu
74
Şekil 4.4. 0,05 mM sefadroksilin Britton-Robinson tamponunda pH-akım grafiği
Asetat, fosfat ve Britton-Robinson tamponları için elde edilen pH-yükseltgenme
akımı grafikleri değerlendirildiğinde (Şekil 4.5) sefadroksilin elektroaktivitesinin en
yüksek olduğu destek elektrolitin pH 8 fosfat tamponu olduğu gözlenmiştir ancak
voltamogramlar incelendiğinde asetat pH 5 tamponunda daha belirgin ve keskin
pikler elde edilmesinden dolayı bu tamponun sefadroksilin kantitatif tayini için daha
uygun olduğuna karar verilmiştir.
Şekil 4.5. 0,05 mM sefadroksilin pik akımına destek elektrolit ve pH’nın etkisi
4,00E-06
4,90E-06
5,80E-06
6,70E-06
7,60E-06
8,50E-06
9,40E-06
4 5 6 7 8 9 10
Akı
m (A
)
pH
0,04 M Britton Robinson Tamponu
0,00E+00
5,00E-06
1,00E-05
1,50E-05
2,00E-05
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Akı
m (A
)
pH
0,2 M Fosfat tamponu0,04 M Britton Robinson tamponu0,2 M Asetat tamponu
75
Çalışma ortamı pH 5 asetat tamponu olarak belirlenen sefadroksilin, analitik tayin
aralığını belirlemek için 0,2 M asetat ortamında 0,005 mM ve 0,05 mM
konsantrasyon aralığında DPV yöntemiyle voltamogramları alınmıştır (Şekil 4.6).
Şekil 4.6. pH 5 asetat tamponunda 0,005 mM ve 0,05 mM arasında değişen
sefadroksilin derişimleri için alınan diferansiyel puls voltamogramları
Sefadroksil derişimi ile yükseltgenme pik akım değeri arasındaki ilişkinin
değerlendirilmesi için çizilen grafik (Şekil 4.7) incelendiğinde; 0,005 mM ile 0,05
mM aralığındaki sefadroksil derişimleri ile akım arasında lineer bir ilişkinin olduğu
tespit edilmiştir.
Şekil 4.7. Sefadroksilin asetat pH 5 tamponunda 0,005 mM ile 0,05 mM arasında değişen sefadroksil derişimlerine karşı DPV ile elde edilen akım değerlerinin grafiği
y = 6,462E-04x + 5,443E-07R² = 9,999E-01
0,0E+00
7,0E-06
1,4E-05
2,1E-05
2,8E-05
3,5E-05
0,0E+00 1,0E-02 2,0E-02 3,0E-02 4,0E-02 5,0E-02
i/A
Derişim (mM)
76
Sefadroksilin elektrokimyasal davranışının incelenmesinde, destek elektrolit ve pH
değişkenlerinden sonra pik potansiyeli ve pik akımına tarama hızının etkisi
araştırılmıştır. Bu amaçla pH’sı 5’e ayarlanmış 0,2 M asetat tamponunda 0,5 mM
sefadroksil için 5-750 mVs-1 arasındaki çeşitli tarama hızlarında voltamogramlar
alınmış ve bu voltamogramlar Şekil 4.8’de verilmiştir. Diferansiyel puls
voltamogramında +0,90 V civarında gözlenen pike dönüşümlü voltamogramında
rastlanmamıştır.
Şekil 4.8. 0,5 mM sefadroksil içeren çözelide farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramlar
4.1.2. Sefoperazonun elektrokimyasal davranışı
Sefoperazonun elektrokimyasal davranışını diferansiyel puls voltametri (DPV)
yöntemiyle inceleyebilmek için öncelikle yükseltgenme geriliminin belirlenmesi
gerekmektedir. Bu amaçla çalışan tamponların sefoperazon ilave edilmeden önce ve
edildikten sonra alınan voltamogramları karşılaştırılmıştır ve Şekil 4.9’de görüldüğü
gibi yaklaşık +1,00 V geriliminde sefoperazona ait bir yükseltgenme piki
gözlenmiştir.
77
Şekil 4.9. a) Sefoperazon bulunmayan ve b) 0,1 mM sefoperazon içeren çözeltide (0,2 M asetat pH 5,25 tamponu) alınan DPV voltamogramlarının karşılaştırılması
Sefoperazonun karbon grafit elektrotu ile yükseltgenme geriliminin belirlenmesinden
sonra çalışma ortamını belirlemek amacıyla Britton-Robinson (pH 2-12), asetat (pH
3,5-5,5) ve fosfat (pH 2-8) tampon çözeltilerinde 0 V ile +1,5 V arasında DPV
yöntemiyle voltamogramları alınmıştır. Şekil 4.10, 4.11 ve 4.12’de sırasıyla asetat,
Britton Robinson ve fosfat tamponlarında0,1 mM sefoperazon için pH-akım
grafikleri verilmiştir.
Şekil 4.10. 0,1 mM sefoperazonun asetat tamponunda pH-akım grafiği
9,00E-07
1,40E-06
1,90E-06
2,40E-06
2,90E-06
3,40E-06
4 4,5 5 5,5 6
Akı
m (A
)
pH
0,2 M Asetat tamponu
78
Şekil 4.11. 0,1 mM sefoperazonun fosfat tamponunda pH-akım grafiği
Şekil 4.12. 0,1 mM sefoperazonun Britton Robinsom tamponunda pH-akım grafiği
Her bir tampon için pH’ya karşı yükseltgenme pik akımları grafiğe geçirildiğinde
(Şekil 4.13) sefaperazonun en yüksek elektroaktivite gösterdiği elektrolitin pH 5,25
olan asetat tamponu olduğuna karar verilmiştir.
1,40E-06
1,60E-06
1,80E-06
2,00E-06
2,20E-06
2,40E-06
5 6 7 8 9 10
Akı
m (A
)
pH0,2 M Fosfat tamponu
0,00E+00
3,00E-07
6,00E-07
9,00E-07
1,20E-06
1,50E-06
4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
Akı
m (A
)
pH0,04 M Britton Robinson tamponu
79
Şekil 4.13. 0,1 mM sefoperazonun pik akımına destek elektrolit ve pH etkisi
Bu çözeltide 0,05 mM ile 1 mM aralığındaki sefoperazon derişimleri için alınan
diferansiyel puls voltamogramları Şekil 4.14’de verilmiştir.
Şekil 4.14. pH 5,25 asetat tamponunda 0,05 mM ve 1 mM arasında değişen sefoperazonun derişimleri için alınan diferansiyel puls voltamogramları
Şekil 4.15’deki grafik incelendiğinde 0,05 mM ile 1 mM aralığındaki sefoperazon
derişimleri ile akım değerleri arasındaki ilişkinin lineer olduğu görülmüştür ve
regresyon katsayısı 0,9989 olarak bulunmuştur.
0,00E+00
5,00E-07
1,00E-06
1,50E-06
2,00E-06
2,50E-06
3,00E-06
3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5
Akı
m (A
)
pH0,2 M Asetat tamponu0,2 M Fosfat tamponu0,04 M Britton Robinson tamponu
80
y = 4,467E-06x + 1,974E-06R² = 9,989E-01
0,00E+00
1,00E-06
2,00E-06
3,00E-06
4,00E-06
5,00E-06
6,00E-06
7,00E-06
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Akı
m (A
)
Derişim (mM)
Şekil 4.15. Sefoperazonun asetat pH 5,25 asetat tamponunda 0,05 mM ile 1 mM arasında değişen sefoperazon derişimlerine karşı elde edilen akım değerinin grafiği
Optimum destek elektrolit ve pH belirlendikten sonra dönüşümlü voltametri yöntemi
ile pik potansiyeli ve pik akımına tarama hızının etkisi araştırılmıştır. 0,1 mM
sefoperazonun CV yöntemi ile 5-750 mVs-1 aralığındaki çeşitli tarama hızlarında
voltamogramları alınmış ve bu voltamogramlar Şekil 4.16’da verilmiştir.
Şekil 4.16. 0,1 mM sefoperazonun 0,2 M asetat tamponunda (pH 5,25), karbon grafit elektrottaki dönüşümlü voltametri voltamogramları
81
Tablo 4.1. 0,1 mM sefoperazonun tarama hızıyla akım ve potansiyel değişimi
Tarama Hızı υ(mVs-1)
Tarama Hızının Karekökü, υ1/2
Tarama Hızının Logaritması, logυ
Pik Akımı, Ip(μA)
Pik Akımının Logaritması, logip
Pik Gerilimi (V)
5
2,23
0,69
6,0
0,77
1,091
25
5,00
1,39
11,0
1,04
1,103
50
7,07
1,69
14,2
1,15
1,105
100
10,00
2,00
19,1
1,28
1,106
250
15,81
2,39
32,0
1,53
1,107
500
22,36
2,69
54,0
1,73
1,109
750
27,38
2,87
72,0
1,83
1,110
Tablo 4.1 incelendiğinde tarama hızı arttıkça yükseltgenme pik potansiyelinin daha
anodik değerlere kaydığı görülmüştür. Pik potansiyelinin artan tarama hızı ile daha
anodik değerlere kayması, herhangi bir indirgenme pikinin gözlenmemesi ile birlikte
değerlendirildiğinde sefoperazonun karbon grafit elektrot yüzeyindeki
yükseltgenmesinin tersinmez olduğu sonucu çıkartılabilir.
Tarama hızının pik potansiyeline etkisinin yanında, pik akımına etkisi de
incelenmiştir. Bu amaçla ip-υ1/2 (Şekil 4.17) ve logip-logυ (Şekil 4.18) grafikleri
çizilmiştir.
82
Şekil 4.17. Sabit derişimde pik akımının tarama hıının karekökü ile değişimi
Şekil 4.18. Sabit sefoperazon derişiminde pik akımının logaritmasının tarama hızının logaritması ile değişimi
Pik akımının tarama hızının karekökü ile doğrusal olarak değişmesi (R2= 0,997) ve
pik akımının logaritmasının tarama hızının logaritmasına karşı grafiğe geçirildiğinde
elde edilen grafiğin eğiminin 0,4942 olması sefoperazonun karbon grafit elektrot
yüzeyindeki yükseltgenmesinin difüzyon kontrollü olduğunu göstermektedir.
y = 2,453E+00x - 1,485E+00R² = 9,975E-01
0,00E+00
1,00E+01
2,00E+01
3,00E+01
4,00E+01
5,00E+01
6,00E+01
7,00E+01
0 5 10 15 20 25 30
Pik
akım
ı (μA
)
Karekök tarama hızı (mVs-1)
y = 4,942E-01x + 3,783E-01R² = 9,897E-01
0,00E+00
3,00E-01
6,00E-01
9,00E-01
1,20E+00
1,50E+00
1,80E+00
2,10E+00
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Log
pik
akı
mı
Log tarama hızı
83
4.2. Sefolasporin Grubu Antibiyotiklerin Farmasötik ve Biyolojik Numunelerde
Tayini
Bu tez kapsamında incelenen sefadroksil ve sefoperazonun elektrokimyasal
davranışlarıyla ilgili veriler, söz konusu ilaç etken maddelerin nicel tayini için
voltametrik yöntem geliştirilebileceğini göstermiştir.
İlaç etken maddelerinin kan, idrar ve farmasötik numunelerde miktarını belirlemek
ve geliştirdiğimiz yöntemin doğruluğunu kontrol etmek için ilaç etken maddelerinin
analizi ve geri kazanım çalışmaları yapılmıştır.
4.2.1. Sefoperazonun farmasötik numunelerden elektrokimyasal tayini
Farmasötik numunelerde sefoperazon tayini için öncelikle optimum ortam olduğuna
karar verilen asetat pH 5,25 tamponunda ölçülen, yükseltgenme pik akımları grafiğe
geçirilerek kalibrasyon doğrusu oluşturulmuştur. Oluşturulan kalibrasyon doğrusu
aralığına giren derişimler de hazırlanan farmasötik numunenin karbon grafit elektrot
ile voltamogramları alınmış ve numunedeki sefoperazon miktarı tayin edilmiştir.
Şekil 4.19’de farmasötik numunenin DPV ile alınan voltamogramları gösterilmiştir.
Şekil 4.19. Sefoperazon içeren sülperazon isimli farmasötik numunenin pH 5,25
asetat tamponunda 0,50 mM ve 0,75 mM derişimlerinde DPV yöntemi ile alınan voltamogramları
84
Sefoperazon içeren farmasötik numunede (sülperazon) sefoperazonun
yükseltgenmesine ait pikin belirgin olduğu ve pik akımının sefoperazonun artan
derişimi ile arttığı gözlenmiştir.
4.2.2. Sefoperazonun biyolojik numunelerden elektrokimyasal tayini
Kan numunesinde sefoperazon tayini için öncelikle optimum ortam olarak seçilen
asetat pH 5,25 tamponunda sefoperazonun 0,05 mM–1mM derişim aralığında elde
edilen yükseltgenme pik akımları grafiğe geçirilerek kalibrasyon doğrusu
oluşturulmuştur. Kan numunesinin analizi kalibrasyon doğrusu derişim aralığında
standart ekleme metodu ile gerçekleştirilmiştir. Şekil 4.20’de sefoperazon içeren kan
numunesinin DPV ile alınan voltamogramları gösterilmiştir.
Şekil 4.20. Sefoperazon içeren kan numunesinin pH 5,25 asetat tamponunda 0,30 mM, 0,50 mM ve 0,75 mM derişimleri için alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları
Kan numunesinde sefoperazonun yükseltgenmesine ait pikin belirgin olduğu ve pik
akımının sefoperazonun artan derişimi ile arttığı gözlenmiştir. Gerekli hesaplamalar
yapılarak geri kazanım değerleri hesaplanmıştır.
İdrar numunesinde sefoperazonun tayini çalışmasında sefoperazonun yükseltgenme
geriliminde herhangi bir pik gözlenmemiştir (Şekil 4.21).
85
Şekil 4.21. Kan numunesinin pH 5,25 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları
4.2.3. Sefadroksilin farmasötik ve biyolojik numunelerden elektrokimyasal
tayini
Piyasada sefadroksil içeren ilaç formülasyonu bulunmadığından, bu bileşiğin
farmasötik numuneden tayini gerçekleştirilememiştir.
Sefadroksil tayini için yapılan idrar ve kan numunelerinde sefadroksilin
yükseltgenme geriliminde (+0,90 V) herhangi bir pike rastlanmamıştır (Şekil 4.22,
Şekil 4.23).
Şekil 4.22. Kan numunesinin pH 5,00 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile
alınan voltamogramları
86
Şekil 4.23. İdrar numunesinin pH 5,00 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile
alınan voltamogramları
87
5. SONUÇ
Antibiyotiklerle yapılan tedavilerin etkinliği, antibiyotiklerin organizmalar tarafından
algılanmasına, doku ve organdaki derişimine ve organizmalardaki bozulma zamanına
bağlıdır. Ayrıca tedavinin başarısı için seçilen ilacın etki alanı, canlı bünyede
etkilediği organ/organlar, etki gücü, tedavi edici dozu, kullanım süresi, yan etkileri,
diğer ilaçlarla etkileşimi, canlı bünyeden atılma şekli ve toksik etkileri iyi
araştırılmalıdır. İlaç geliştirme ve uygulama çalışmalarında geliştirilen ilaçların bazı
kimyasal/biyokimyasal, farmakolojik ve toksikolojik özelliklerinin belirlenmesi için
bu ilaçların;
� Hedef doku ve organlarının,
� Varsa metabolit(ler)inin,
� Canlı bünyeden uzaklaştırma şekli ve yolunun
belirlenmesioldukça önemlidir. Bu parametrelerin belirlenmesinde ilaç etken
maddelerinin ve/veya ilaçlar ile etkileşen maddelerin canlı bünyede veya bünye
dışında ilacın alınmasını takip eden farklı zamanlarda yüksek doğruluk ve kesinlikte
tayin edilebilmeleri gereklidir. Bunun için validasyonu yapılmış, düşük maliyetli ve
hızlı ilaç analiz yöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadır.
Araştırma, geliştirme ve kalite kontrol çalışmalarında kullanılmak üzere bilinen pek
çok etken madde ve ilaç için geliştirilmiş analiz yöntemleri, Amerikan Farmakopesi
(USP) ile Avrupa Farmakopesi (EP) ve İngiliz Farmakopesi (BP)’de
yayınlanmaktadır.
Analiz yöntemleri, oluşturulan ilaç formunda yer alan (tablet,kapsül vb.) etken
maddenin tanımlanmasında, beyan edilen dozun nicel analizinde ve her ilaç
formundaki dozun eşit olduğunu kanıtlamak amacıyla kullanılmaktadır. Elde edilen
in-vitro değerler klinik çalışmalarda katı doz formlarındaki in-vivo bioyararlanım ile
bağdaştırılabilir.
88
Geliştirilen yeni etken maddeler için mevcut analiz yöntemlerinin daha güvenilir,
duyarlı ve uygun maliyetli hale getirilebilmesi önem taşımaktadır. Gelişen teknoloji
ile kullanımı kolay, hızlı cevap verebilen, otomasyona elverişli ve yüksek hassasiyete
sahip yeni cihaz ve teknikler kullanılarak yeni analiz yöntemleri geliştirme
çalışmaları artan bir hızla devam etmektedir.
Yeni analitik yöntemlerin geliştirilmesi, mevcut analitik yöntemlerin iyileştirilmesi
ve yöntemlerin validasyonu; maliyetinin yanında zaman ve deneyimde gerektiren bir
süreci kapsamaktadır.
1990’ların ortalarına kadar biyolojik sıvılardaki ve dokulardaki antibiyotiklerin
içeriği sıklıkla mikrobiyolojik yöntemlerle tayin edilmekteydi. Bu yöntemin en
büyük dezavantajı numune içeriğinin bilinmemesiydi. Bu durum aynı anda birden
fazla antibiyotiğin kullanılması ve organizma içinde antibiyotiğin çok fazla sayıda
metabolitinin oluşmasıyla ilişkilidir. Diğer zorluğu ise analizlerin uzun zamanda
gerçekleşmesidir.
Günümüzde ilaç analizlerinde çeşitli analitik yöntemler kullanılmaktadır. Bunlar
arasında en yaygın olarak kullanılanları kromatografik yöntemlerdir. Biyolojik
ortamlarda bulunması muhtemel hücre ve doku bileşenleri ile ilaç ve ilaç ile ilgili
bazı moleküllerin tayini için genelde kromatografik yöntemler ve bu yöntemler ile
uyum sağlayabilen bazı sistemler kombine halde kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin
aynı anda çok sayıdaki molekülün tayinini mümkün kılması, kolay uygulanabilir
olması, tekrarlanabilir sonuçlar vermesi gibi bir takım üstünlükleri vardır. Ancak bu
üstünlüklerin yanı sıra karmaşık ve pahalı cihazlara gereksinim duyulması gibi
dezavantajlarıda mevcuttur. Ayrıca bu yöntemlerin uygulanmasında fazla
miktarlarda kimyasala ihtiyaç duyulması da ayrı bir dezavantajdır.
Son zamanlarda voltametrik yöntemlerin elektrokimyasal olarak aktif olan türlerin
tayininde yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanması oldukça dikkat çekicidir. Bu
yöntemler kolay uygulanabilmekte, diğer yöntemlerden daha az miktarlarda kimyasal
kullanılmakta ve gerekli sistemler daha ucuza kurulabilmektedir. En önemlisi,
geliştirilen elektrokimyasal yöntemlerin gözlenebilme ve alt tayin sınırları diğer
89
yöntemlerde bulunanlara göre oldukça düşük olabilmektedir. Ayrıca numunenin ayrı
bir ön işleme tabii tutulmaması bu yöntemlerin ilaç analizlerindeki kullanımını
arttırmaktadır.
Beta laktam grubunda yer alan ve antibakteriyel tedavide yaygın olarak kullanılan
sefalasporinlerin tayini için geliştirilen spektrometri, kromatografi ve
elektrokimyasal yöntemler mevcuttur.
Yapılan literatür taramalarında sefadroksil ve sefoperazonun elektrokimyasal
davranışlarının incelenmesi ve voltametrik tayini için çalışma elektrotu olarak karbon
grafit elektrotun kullanıldığı çalışmaya rastlanmamıştır.
Karbon grafit elektrot,
� Ucuz olması,
� Kolay bulunabilmesi,
� Elektrokimyasal olarak inaktif özellik taşıması,
� Tek ve çok kullanımlık olması gibi özellikleriyle analizler için uygun bir
çalışma elektrotudur.
Çalışmanın ilk aşamasında sefalosporin grubunda yer alan sefadroksil ve
sefoperazonun elektrokimyasal davranışları üzerine destek elektrolit ve pH’nın etkisi
(Britton Robinson, asetat ve fosfat) karbon grafit elektrot kullanılarak DPV
tekniğiyle incelenmiştir. Daha sonra bu iki ilaç etken maddesinin çeşitli ortamlardaki
nicel tayini için voltametrik yöntem geliştirilmesi planlanmıştır.
5.1. Sefolasporinlerin Elektrokimyasal Davranışlarının İncelenmesi
Bileşiklerin elektrokimyasal tayinlerinin yapılabilmesi için öncelikle elektrokimyasal
davranışlarının bilinmesi gerekmektedir. Sefadroksil ve sefoperazonun
elektrokimyasal davranışları farklı destek elektrolitlerde (sülfürik asit, fosfat, asetat
ve Britton Robinson) incelenmiştir. Bu amaçla bileşiklerin 0,0 V ile +1,5 V gerilim
aralığında diferansiyel puls voltametri yöntemi ile 3’er kez voltamogramları alınarak
bileşiklere ait en yüksek yükseltgenme akımlarının elde edildiği destek elektrolit ve
90
pH belirlenmiştir. Pik akımları-pH grafikleri (Şekil 4.5, Şekil 4.13) incelendiğide en
yüksek akım değerleri sefoperazon için pH 5,25 asetat tamponunda, sefadroksil için
asetat pH 5,00 tamponunda elde edilmiştir.
Sefadroksil ve sefoperazon için belirlenen maksimum yükseltgenme akımlarının
gözlendiği tampon ve pH koşulları çizelge 5.1’de verilmiştir.
Çizelge 5.1. Sefalosporinler için elde edilen optimum çalışma koşulları
Bileşik Tampon Optimum pH
Sefadroksil
Sefoperazon
Asetat
Asetat
5,00
5,25
Sefadroksilin ve sefoperazonun belirlenen optimum ortamlardaki yükseltgenme pik
gerilimleri ile akımları ve N=3 için hesaplanan standart sapma değerleri Çizelge
5.2’de verilmiştir.
Çizelge 5.2. Sefadroksil ve sefoperazon için yükseltgenme gerilimi ve yükseltgenme akım değerleri
Bileşik Yükseltgenme Gerilimi Yükseltgenme Akımı
Sefadroksil
Sefoperazon
1,02 V (±0,01)
1,12 V (±0,01)
7,19 μA (±0,20)
2,28 μA (±0,34)
Optimum koşullarda sefadroksil ve sefoperazon için hazırlanan kalibrasyon grafikleri
en küçük kareler yöntemiyle değerlendirilmiş ve aşağıdaki formüller kullanılarak
gözlenebilme sınırı (LOD) ve alt tayin sınırı (LOQ) hesaplanmıştır.
LOD = (3×Sb)/m(5.1)
LOQ= (10×Sb)/m(5.2)
Burasa Sb, kalibrasyondoğrusunda başlangıç ordinatının standart sapması ve m,
kalibrasyon doğrusunun eğimidir.
91
Çizelge 5.3. Sefadroksilve sefoperazon için gözlenebilme ve alt tayin sınır değerleri
Bileşik LOD LOQ
Sefadroksil
Sefoperazon
5,506×10-7
7,608×10-6
1,835×10-5
2,536×10-5
Bileşiklerin elektrokimyasal davranışları üzerine destek elektrolit ve pH etkisinin
incelenmesinden sonra pik potansiyeli ve pik akımına tarama hızının etkisi
araştırılmıştır. Sabit derişimde dönüşümlü voltametri yöntemi 5-750 mVs-1
aralığındaki tarama hızlarında alınan voltamogramlar incelendiğinde tarama hızı
arttıkça pik potansiyelinin daha yüksek potansiyellere kayması ve herhangi bir
indirgenme pikinin gözlenmemesi, bileşiklerin karbon grafit elektrot yüzeyindeki
yükseltgenmesinin tersinmez olduğunu göstermektedir.
Voltametrik yöntemlerde akım türünü belirlemek oldukça önemlidir. Akım türünü
belirlemek amacıyla pik akımı-tarama hızının karekökü (ip-υ1/2) ve pik akımının
logaritması-tarama hızının logaritması (logip-logυ) grafikleri çizilmiştir.
Pik akımının, tarama hızının karekökü ile doğrusal değişmesi (Şekil 4.17, R2=0,997)
bileşiğin karbon grafit yüzeyindeki yükseltgenmesinin difüzyon kontrollü olduğunu
düşündürmüştür. Pik akımının logaritmasının tarama hızının logaritması ile değişimi
incelendiğinde ise elde edilen doğrusal grafiğin eğimi 0,49 olarak hesaplanmıştır
(Şekil 4.18). Bu değer difüzyon kontrollü mekanizmalar için önerilen 0,50 değerine
oldukça yakındır. Yükseltgenme absorbsiyon kontrollü olsaydı, eğimin 0,50 değil 1,0
değerine çok daha yakın olması beklenirdi. Sonuç olarak çalışma elektrotu ile bileşik
arasında gerçekleşen elektron aktarımının elektrot/çözelti arayüzeyinde gerçekleştiği
söylenebilir.
5.2. Farmasötik Numunelerden Sefalosporinlerin Tayini
Elektrokimyasal davranışı incelenen bileşiklerden sefadroksili içeren ilaç
formülasyonu piyasada bulunamadığından, bu bileşiğin farmasötik numunelerde
tayini yapılamamıştır.
92
Sefoperazonun farmasötik numunelerdeki miktarını belirlemek ve geliştirdiğimiz
yöntemin doğruluğunu kontrol etmek için Sülperazon isimli flakon formundan
sefoperazonun analizi ve geri kazanım deneyleri yapılmıştır. Numune analizi
sefaperazon için optimum ortam olan asetat pH 5,25 tamponunda gerçekleştirilmiştir.
Bu çözeltide çizilen kalibrasyon grafiği kullanılmıştır (Şekil 4.15). Farmasötik
numuneden hazırlanan çözelti, kalibrasyon aralığına giren sefoperazon
derişimlerinde seyreltilmiştir. İlaç numunesinde verilen ve elektrokimyasal olarak
tayin edilen sefoperazon miktarı Çizelge 5.4’de verilmiştir. Geri kazanım değerinin
%100’e yakın olması geliştirilen yöntemin doğruluğunu göstermektedir
Çizelge 5.4. Sefoperazon için çalışılan farmasötik numunenin tayin sonuçları
Nunune Tablet derişimi Tayin edilen derişim %BSS RF
Sülperazon 2×10-4 M 2,02×10-4 M 0,13 %101,5
5.3. Biyolojik Numunelerden Sefalasporinlerin Tayini
Sefadroksil ve sefoperazonun serum ve idrar numunelerinde tayin edilip
edilemeyeceği de araştırılmıştır. Bu amaçla serum ve idrar numunelerine, standart
sefadroksil ve sefoperazon çözeltileri eklenmiş ve DPV voltamogramları alınmıştır.
Aynı miktarda sefadroksil, destek elektrolite katıldığında elde edilen
voltamogramlarda bir yükseltgenme pikine rastlanmasına rağmen; serum ve idrar
içeren numunelerde herhangi bir pik gözlenmemiştir.
Kan ve idrar numunelerine kalibrasyon doğrusu aralığında sefoperazon katılmış ve
DPV voltamogramları kaydedilmiştir. Sefoperazon içermeyen serum numunelerinde
ilgili potansiyel bölgesinde herhangi bir pik rastlanmamakla birlikte sefoperazon
ilavesiyle pik oluşumu gözlenmiştir. İdrar numunesinde ise etken maddeye ait
herhangi bir pike rastlanmamıştır.
93
Çizelge 5.5. Sefoperazon için çalışılan kan numunesinin tayin sonuçları
Nunune Kan derişimi Tayin edilen derişim %BSS RF
Kan 2,5×10-4 M 2,57×10-4 M 0,70 %102,3
Yapılan literatür taramasında sefalosporin grubu bileşiklerin elektrokimyasal
davranışlarının incelendiği ve voltametrik tayinlerin yapıldığı az sayıda çalışmaya
rastlanmıştır. Bu çalışmalarda damlayan civa elektrot kullanılmıştır (Hammam vd.,
2006). Bu elektrot çok kolay oksitlenir ve bu yüzden civanın anot elektrot olarak
kullanılmasını büyük ölçüde sınırlar. Ayrıca damlayan civa elektrotun istenmeyen
diğer bir yanıda faradayik olmayan artık akım ve yükleme akımı vermesidir (Hoang
vd., 2013). Böyle bir akım, metotun konsantrasyon hassaslığını düşürür. Bu sebeple
karbon grafit elektrotun hem indirgenme hem yükseltgenme bölgesinde geniş
çalışma aralığına sahip olması önemli avantajlar sağlamıştır.
Sonuç olarak sefoperazon ve sefadroksilin hiçbir ön işleme tabi tutulmaksızın analiz
edilmesi, az miktarda analitle çalışılması deneyler sırasında gözlenen avantajlar olup
yöntemin kolaylığını göstermektedir. Ayrıca yapılan çalışmalar sırasında uygulanan
yöntemin hızlı, ayırt edici ve ekonomik bir yöntem olduğu belirlenmiştir.
94
KAYNAKLAR
Ali Ahmed, M.S., Elbashir A.A., Aboul-Enein, H.S., 2011. New SpectrophotometricMethod for Determination of Cephalosporinsin Pharmaceutical Formulations. Arabian Journal of Chemistry, 11, 20.
Akkan, G., 1997. Pratikte Antibiyotik Kullanımı Sempozyumu. İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp Eğitimi Etkinlikleri, 2-3 Mayıs, İstanbul, 53-62.
Bard, A.J., Rubinstein, L.F., 1999. Electrochemical Methods – Fundamantels and
Applications, John Wiley & Sons INC., 833p, New York. Bailey, R.R., Peddie, B., Blake, E., 1981. Serum and Urine Levels of Cefoperazone
in Severe Chronic Renal Failure: Single and Multible Dose. Apıs INC. 41p, New York.
Battilotti, M., Colapicchioni, C., Giannini, I., Porcelli, F., Campanella, L., Cordatore,
M., Mazzei, F., Tomassetti, M., 1989. Characterization of Biosensors Based on Membranes Containing a Conducting Polymer, Anal. Chim. Acta, 221, 157-161.
Becker, M., Zittlau, E., Petz, M., 2004. Resudie Analysis of 15 Penicillins and
Cephalosporins in Bovine Muscle, Kidney and Milk by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Analytica Chimica Acta, 520, 19-32.
Billova, S., Kizek, R., Jelen, F., 2003. Square-Wawe Voltammetric Determination of
Cefoperazone in A Bacterial Culter, Pharmaceutical Drug, Milk and Urine. Anal Bional Chem, 377, 362-369.
Bond, A.M. 1980. Modern Polarografic Methods in Analytical Chemistry, Marcel
Dekker INC., 523p, New York Borman, S.A., Osteryoung, R.A., Osteryoung J.G., O'Dea, J.J. 1982. Anal. Chemistry
Pulse Voltammetry-Today and Tomorrow, Pittsburgh Conference, 54, 698A. Brezina, M., Zuman, P., 1958. Polarography in Medicine, Biochemistryand
Pharmacy. Interscience Pyblishers, 862p, New York. Buerk, D.G., 1993. Biosensors: Theory and Applications,Technomic Publishing
Company INC., 213p, USA. Chiti, G., Marrazza, G., Macsini, M., 2001. Electrochemical DNA Biosensor for
Environmental Monitoring. Analytica Chimica Acta, 427, 155.
95
Christie, I.M., Treloar, P.H., Vadgama, P., 1992. Plasticized Poly(Vinyl Chloride) as A Permselective Barrier Membrane for High-Selective. Analytica Chimica Acta, 269, 65-73.
Clark, L. C., Lyons, C., 1962. Electrode System for Continuous Monitoring in
Cardiovascular Surgery. Ann. NY Acad. Sci., 102, 29-45. Dinçkaya, E., Çağin, M., Telefoncu, A., 1994. Enzymatic Method for The
Spectrophotometric Determination of Aspartame. Food Chemistry, 50, 95-97. Doğan B., Uslu B., Özkan S.A., 2005. Electrochemical Studies of Ganciclovir At
Glassy Carbon Electrodes and İts Direct Determination in Serum and Pharmaceutics by Square Wave and Differential Pulse Voltammetry.
Doğan, B., Gölcü, A., Dolaz, M., Özkan, S.A., 2009. Electrochemical Behaviour of
The Bactericidal Cefoperazone and İts Selective Voltametric Determination in Pharmaaceunitical Dosage Forms and Human Serum. Current Pharmaceutical Analysis, 5, 179-189.
Dumitriv, S., Papu, M., 1988. Polymeric Biomaterials As Enzyme and Drup Carriers.
J. Bioact. Compat. Pol., 3, 243-312. Eggins, B.R. 1996. Biosensors: an Introduction, John Wiley and Sons Ltd. and B.G.
Teubner, West Sussex, 210 s. El-Desoky, H.S., Ghoneim, E.M., Ghoneim, M.M., 2005. Voltammetric Behavior
and Assay of The Antibiotic Drug Cefazolin Sodium in Bulk Form and Pharmaceutical Formulation at A Mercury Electrode. Journal Of Pharmaceutical And Biomedical Analysis, 39, 1051–1056.
El-Maali, N., 2000. Voltammetric Analysis of Ceftazidime After Preconcentration at
Various Mercury and Carbon Electrodes: Application to Sub-ppb Level Determination in Urine Samples. Talanta, 51, 957–968.
El-Maali, N., Ali, A.M.M., Ghandour, M.A., 2005. Electrochemical Reducton and Oxidation of 2 Cephalosporin Antibiotics-Ceftriaxone (Rocephin) And Cefoperazone (Cefobid). Electroanalysis, 5, 599-604. Elmosallamy, M.A.F., 2006. New Potentiometric Sensors for Creatinine, Analytica
Chimica Acta, 564, 253-257. Erdem, A., Özsöz, M., 2002. Electrochemical DNA Biosensors Based on DNA Drug
İnteractions. Electroanalysis, 14, 965–974. Erdoğdu G., 1995. Bazı Biyokimyasal Moleküllerin İletken Polimer Elektrotlardaki
Voltametrik Davranışlarının İncelenmesi. İnönü Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora tezi, 122s, Malatya.
Fagain, C.O., 2003. Enzyme Stabilization-Recent Experimental Progress. Enzyme
and Microbial Technology, 33, 137–149.
96
Gür, D., 2002. Bakterilerde Antibiyotiklere Karşı Direnç. Nobel Tıp Kitabevleri, 182s, İstanbul.
Hall, E.A.H., 1990. Biosensors,Open University Press, 47s, England. Hammam, E., El-Attar M.A., Beltagi, A.M., 2006. Voltammetric studies on the
antibiotic drug cefoperazone Quantification and pharmacokinetic studies, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 42, 523–527.
Haskılıç, G., 2005. Asiklovirin Elektrokimyasal Davranışı ve İlaçlarda Voltametrik
Yöntemler İle Miktarının Belirlenmesi. Çanakkale On Sekiz Mart Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 66s, Çanakkale.
Hoang, V.D., Huyen, D.T., Phuc, P.H. 2013. Adsorptive Cathodic Strippting
Voltametric Determination of Cefoperazone in Bulk Powder, Pharmaceutical Dosage Forms and Human Urine. Analitical Methods in Chemistry, 2013, 397-914.
Jamasbi, E.S., Rouhollahi, A., Shahrokhian, S., Haghgooc, S., Aghajani, S., 2006.
The Electrocatalytic Examination of Cephalosporins at Carbon Paste Electrode Modified with Cosalophen. Talanta, 71, 1669–1674.
Kfoury, J.N.S, Araj, G.F., 2003. Recent Development in B-Lactamases and Extended
Spektrum Blactamases. British Journal Medicine, 327, 1209-13. Kim, J.P., Kim, S.P., 1981. Clinical Studies With Cefoperazone in The Treatment of
Bacterial İnfections in Surgial Practice. Drugs, 22, 87. Kissinger, P.T., Heineman, W.R., 1996. Laboratory Techniques in Electroanalytical
Chemistry, Marcel Dekker INC, 989p, New York. Koç Türkoğlu, F., 2008. Pediatri Kliniğine Başvuran Annelerin Çocuklarda
Antibiyotik Kullanımı Konusundaki Bilgi ve Tutumlarının Araştırılması. Göztepe Eğitim Ve Araştırma Hastanesi Aile Hekimliği, Uzmanlık Tezi, 14s, İstanbul.
Labuda, J., Bubnicova, K., Kovalova, L., Vanickova, M., Mattusch, J., Wennrich R.,
2005. Voltammetric Detection of Damage to DNA by Arsenic Compounds at a DNA Biosensor, Sensors, 5, 411-423.
Laux, G., Baumann, P., Hiemke, C. 2007. Therapeutic Drug Monitoring of
Antidepressants Clinical Aspects. Journal of Neural Transmission, 72, 261–267.
Lin, C., Chen, H., Lin., E. C., Lin., K., Huang., H., 2000. Optimization of Separation
and Migration Behavior of Cephalosporins in Capillary Zone Electrophoresis. Journal of Chromatography A, 879, 197–210.
Lin, T.Y., Hu, C.H., Chou, T.C., 2004. Determination of Albumin Concentration by
MIP-QCM Sensor. Biosensors and Bioelectronics, 20, 75-81.
97
Lucarelli, F., Marazza, G., Palchetti, I., Cesaretti, S., Mascici, M., 2002. Coupling of An İndicator-Free Electrochemical DNA Biosensor with Polymerase Chain Reaction for The Detection of DNA Sequences Related to The Apolipoprotein E. Analytica Chimica Acta, 469, 93-99.
Lucarelli, F., Palchetti, I., Marazza, G., Mascini, M., 2002. Electrochemical DNA
Biosensor As A Screening Tool for The Detection of Toxicants in Water and Waste Water Samples. Talanta, 56, 949-957.
Marazza, G., Chianella, I., Macsini, M., Anichini, M., 2000. Detection of Human
Apolipoprotein E Genotypes with DNA Electrochemical Biosensor Coupled with PCR. Clinica Chimica Acta, 46, 31-37.
Merkoci, A., Fabregas, E., Alegret, S., 1999. Consolidated Biocomposite Membrane
Technology for Production of Potentiometric Biosensors. Sensors and Actuators B, 60, 97-105.
Monk, P.S.M., 2001. Fundamentals of Electroanalytical Chemistry. John Wiley &
Sons INC., Wiley VHC., 362p, New York. Montesissa, C., Villa, R., Anfossi, P., Zanoni, R., And Carli, S. 2003.
Pharmacodynamics and Pharmacokinetcs of Cefoperazone and Cefamandole in Dods Following Single Dose İntravenous and İntramuscular Administration. The Veterinary Journal, 166, 170-6.
Ojani, R., Raoof, J., Zamani, S., 2010. A Novel Sensor for Cephalosporins Based on
Electrocatalytic Oxidation by Poly(O-Anisidine)/SDS/Ni Modified Carbon Paste Electrode. Talanta, 81, 1522–1528.
Opal, S.M., Medeiros, AA., 2005. Molecular Mechanisms of Antibiotic Resistance in
Bacteria. Elsevier Churchill Livingstone INC, 260p, Pennsylvania. Öncül, O., 2002. Akılcı Antibiyotik Kullanımı Ve Erişkinde Toplumdan Edinilmiş
Enfeksiyonlar. İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp Eğitimi Etkinlikleri, Kasım 2002, İstanbul, 23-28.
Quesada-Molina, C., Garcia-Campana, A.M., Olmo-Iruela, M., 2013. Ion-paired
Extraction of Cephalosporins in Acetone Prior to Their Analysis by Capillary Liquid Chromatography in Environmental Water and Meat Samples. Talanta, 115, 943-949.
Pajchel, G., Tyski, S., 2000. Adaptation of Capillary Electrophoresis to The
Determination of Selected Cephalosporins for İnjection. Journal of Chromatography A, 895, 27–31.
Patriarche, 1979. Applications of Polarography and Voltametry in Analysis for
Drugs. Analytica Chimica Acta, 196, 193-204.
98
Perçin, S., 2008. Bazı Sülfonamitlerin Elektrokimyasal ve Kromatografik Davranışlarının İncelenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 170, Isparta.
Piletsky, S.A., Turner, A.P.F., 2002. Electrochemical Sensors Based on Molecularly
İmprinting Polymers. Electroanalysis,14, 317-323. Puig, P., Tempels, A., Borrull, F., Calull, M., Aguilar, C., Somsen, G.W., J. de Jong,
G., 2007. On-Line Coupling of Solid-Phase Extraction and Capillary Electrophoresis for The Determination of Cefoperazone and Ceftiofur in Plasma, Journal of Chromatography B, 856, 365–370.
Reddy, S.M., Vadgama, P., 2002. Entrapment of Glucose in Non-Porous Poly(Vinyl
Chloride). Analytica Chimica Acta, 461, 57-64. Sakallı, D., 2006. Diferansiyel Puls Voltametrisi ile İlaç Analizleri. Ankara
Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 97s, Ankara. Sarı H.,2005. Karbapenemlere dirençli Gram-negatif Basil İzolatlarinda İmipenem-
EDTA / Meropenem-EDTA Disk Yöntemi ve Modifiye Hodge Testi ile Metallo-Beta- Laktamaz Varlığının Araştırılması. Uzmanlık tezi, İstanbul.
Schugerl, K., 2001. Progress in Monitoring, Modeling and Control of Bioprocesses
During the Last 20 Years. J. of Biotechnology, 85, 149-173. Skoog, Douglas A., West, Donald A., Holler, F. James, 1996. Fundamentals of
Analytical Chemistry. Sounders College Publishing. Skoog, M., Kronkvist, K., Johansson, G., 1992. Blocking of Chemically Modified
Graphite Electrodes by Surfactants. Analytica Chimica Acta, 269, 59- 64. Spichiger-Keller, U.E., 1998. Chemical Sensors and Biosensors for Medical and
Biological Applications. Verlag Chemie, Weinheim, 455. Subba Reddy, G.V., 1996. Estimation of Cephalosporin Antibiotics by Differantial
Pulse Polarography. Talanta, 44;627-631. Şentürk, Z., Birol, İ., Özkan, S.A., 1997 . Determination of Ornidazole in
Pharmaceutical Dosage Forms Based on Reduction at An Activated Glassy Carbon Electrode. İnternational Journal of Pharmaceutics, 157, 137-144.
Taşdemir, İ.H., 2011. Hipertansiyon Tedavisinde Kullanılan Bazı İlaçlardaki Etken
Maddelerin Tayini İçin Elektrokimyasal Yöntemlerin Geliştirilmesi ve Analitik Uygulamaları. Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 243s, Ankara.
Telefoncu, A., 1999. Biyosensörler. Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Baskı Atölyesi,
280s. İzmir.
99
Telefoncu, A., 1997. Enzimoloji, Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Baskı Atölyesi, 380s. İzmir.
Tural H., Ertan, N., Gökçel, İ., 2003. Enstrümental Analiz I Elektroanalitik
Yöntemler. Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Yayınları, 339s, İzmir. Türe, M., 2008. Fenilefrin Hidroklorür’ün Elektrokimyasal Özelliklerinin
İncelenmesi ve Ticari İlaç Formlarından Miktarının Belirlenmesi. Çanakkale On Sekiz Mart Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 99s, Çanakkale.
Wang, J., 2001. Analytical Electrochemistry, John Wiley & Sons INC., Wiley VHC.,
209p, New York. Wang, L., Zhang, Z., Baoxian Ye, B., 2006. Study on The Electrochemical
Behaviour of The Anticancer Herbal Drug Emodin. Electrochimica Acta, 51, 5961–5965.
Willet, H.P, 1984. Antibacterial Agents. Appleton-Century-Crofts, 191p, Norwalk. Yılmaz, S., Uslu, B., Özkan, S.A., 2001. Anodic Oxidation of Etodolac and İts
Square Wave and Differential Pulse Voltametric Determination in Pharmaceuticals and Human Serum. Talanta, 54, 351-360.
Yılmaz, S., 2008. Analitik Voltametri. 1.Basım, Çanakkale Onsekiz Mart
Üniversitesi Yayınları, Çanakkale, 8. Yılmaz, N., Biryol, İ., 1998. Anodic Voltammetry of Cefotaxime. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 17, 1335–1344. Zuman, P., 1962. Application of Polarography to Organic Chemistry. Journal of
Electroanalytical Chemistry, 3, 157-168.
100
ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Seher İPEKÇİ Doğum Yeri ve Yılı : Ceyhan, 1988 Medeni Hali : Bekar Yabancı Dili : İngilizce E-posta : [email protected] Eğitim Durumu Lise : Cemile Hamdi Ongum Süper Lisesi, 2006 Lisans : SDÜ, Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya, 2012 Yüksek Lisans: SDÜ, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya, 2014 Yayınları Yıldırım, G., İpekçi, S., Özkorucuklu, S.P., 2013. Investigation of Electrochemical Behaviors of Sulfamethoxazole and Trimethoprime Using Pencil Graphite Electrode. I.Internationally Participated Electrochemistry Workshop, 23-28 June 2013, Muğla, 83. İpekçi, S., Yıldırım, G., Özkorucuklu, S.P., 2013. Electrochemical Behavior and Voltametric Determination of Diclofenac. I.Internationally Participated Electrochemistry Workshop, 23-28 June 2013, Muğla, 43. İpekçi, S., Yıldırım, G., Özkorucuklu, S.P., 2013. Method Development for Voltammetric Determination of Some Cephalosporin Group Antibiotics in Pharmaceutical Formulation. I.Internationally Participated Electrochemistry Workshop, 23-28 June 2013, Muğla, 45. Özkorucuklu, S.P., Çimenkaya, A., Yıldırım, G., Sarı, M., İpekçi, S., Şahin, Y., 2012. Sülfonamitlerin Elektrokimyasal Katı-Faz Ekstraksiyonu ve Amperometrik Tayini. VI. Ulusal Analitik Kimya Kongresi, 03-07 Eylül 2012, Hatay, 160.