Characterization of Drug-Resistant Sallmonella enterica Serotype Typhimurium by Antiobiograms, Plasmids,

Integrons, Resistance Genes, and PFGE

Banacer, Douadi; Institute of biological sciences, Faculty of science, University of Malaya, Kuala Lumpur 50603 Malaysia

Maria Fernanda Marin Betancourt3th semester, Medicine

UPB2010

Introduction.

• Salmonella are composed by mobile enterobacterias. They are gram-negatives bacillus, facultative earobic organism, easy to maintain (37ºC) and resistant to external agents. According to the Kauffmann-White eschema, S. Typhimurium belongs to the group B of the genre Salmonella.

• The antibigram is a really important test, that allows you, to know the kind of treatment for a specific infection, if the microorganism is resistant or tolerant to the specific antibiotic.

• Plasmid (circular molecule DNA, which autoreplicates independently within bacteria) and integrons (group of genetic elements potentially mobiles and capable to integrate and express antibiotic resistance genes) are directed involve in the adaptation of cell to the enviroment.

General Objective

• To know the drug resistance rates of some strains of Salmonella Typhimurium to antibiotics like tetracycline, sulfonamides, streptomycin, ampicillin, nalidixic acid, kanamycin, chloramphenicol, trimethoprim and cephalosporins, through the use of PCR, PFGE, plasmid profiling, DNA sequencing and antibiogram techniques.

Materiales Y Métodos

• Cepas: se utilizaron 47 cepas:▫ Humanas (14): (1969-2006)

hospital local.▫ Zoonoticas: (33):

Aves (14) Ganado (9) Cerdo (1) Peces (1) Anfibios (1)

• Pruebas de susceptibilidad: estudio in vitro del comportamiento de antimicrobianos frente a diferentes microorganismos.

• La sensibilidad de un organismo a determinado antimicrobianos: la menor concentración antimicrobiano en pg/ml, evita el crecimiento in vitro y es la concentración mínima inhibitoria (CMI).

• El punto de corte de la CMI debe ser menor que el nivel del antimicrobiano accesible en la sangre.

• PCR: prueba de reacción en cadena de la polimerasa. Se busca obtener una amplificación de una secuencia de DNA o de RNA.

Materiales y Métodos

• Se utiliza una enzima in vitro, a partir de una muestra de DNA se pueden crear millones de copias de una secuencia especifica.

• En el proceso se desnaturaliza el DNA, para separar las hebras.

• Se le adicionan los primers, para que se unan a la hebra.

• La polimerasa empieza la replicación a partir del primer.

• PCR multiple: amplifican simultáneamente diferentes secuencias diana, lo cual permite la detección e identificación simultanea varios genes.

• Secuenciación del ADN: se basa en procedimientos con geles de secuenciación que son capaces de resolver cadenas sencillas de oligonucleotidos. Busca medir la cantidad de nucleotidos presentes en un fragmento especifico de ADN.

• Perfil de plásmidos: es una combinación de una técnica de aislamiento de ADN plasmidico, expuesto a un gel de agarosa. Se utiliza los plásmidos de E.coli como marcadores de peso molecular.

Resultados

• PCR :• 204 pb, especifico para el genero

salmonella.• 401 pb especifico para la secuencia

Typhimurium.• 102 pb secuencia DT104.

• Que identifican a la cepa como S. Typhimurium (47 positivas): 2 bandas, 204 pb y 401 pb.

• La secuecia de 102 pb es el subtipo DT104, al cual dio positivo para 20 cepas de 47.

• Antibiogramas:

• las 47 cepas, 9 fueron susceptibles para los 22 antibióticos. Mientras 33, resultaron resistentes a mas de un antibiótico. Cepas animales susceptibles a la ciproxacina, cefuroxime, ceftazidime y aztreonam.

Resultados

Antibiograma

Resultados

• Deteccion de genes de resistencia:• blaTEM, strA, aadA, sul1, sul2, tetA,

tetB y tetG.

Medicamento Genes

Ampicilina blaTEM temA temB

Estreptomicina strA aadA

Sulfonamida sul1 sul2

Tetracicilina tetA tetB tetC

• 14 ampicilino resistentes.• 25 estreptomicina resistentes.• 27 sulfonamido resistentes.• 33 tetraciclino resistentes.

Resultados

• Deteccion de integrones

• Los clase I estaban presentes en 33 cepas : 13 clinicas y 20 zoonoticas.

• 3 cepas llevaban 1 integron.• 19 cepas llevaban 2 integrones.• 11 cepas llevaban 3 integrones.

• Integron 210 pb, gen purG la enzima fosforibosilformilglicinamidina sintetasa. Casi en todas.

• Integron 650 pb, gen sat enzima: estreptomicina acetiltransferasa y confiere la resistencia a estreptomicina.

• Integron 800 pb, gen dfrA7 enzima: dihidrofolato reductasa: resistencia a trimetoprima.

• Integron 1000 pb, gen aadA2 enzima: aminoglicosido adenltransferasa, resistencia a estreptomicina y espectinomicina.

• Integron 1200 pb, gen pse-1 enzima: betalactamasa y resistencia a ampicilina.

• Integron 1900 pb, gen dfrA12: dihidrofolato reductasa y resistencia a trimetoprima, y gen aadA2 aminoglicosido adenltransferasa, resistencia a estreptomicina y espectinomicina.

Discusion

Autor Dijo/hizo lo siguiente:Si o No esta de

acuerdo

Alvarez J. Ha utilizado ampliamente la tecnica de PCR en la identificacion de Salmonella. SI

Yang S.J En corea hay mayor resistencia a la tetracicilina, por parte de cepas animales. NO

Chen, S.Mayor resistencia de salmonella humana a cefalosporinas, por que hace parte del tratamiento para salmonelosis.

SI

Antunes, P. No hay relacion entre gen sul2 e integrones I. NO

Conclusions• This article has a big importance in

medicine because we can see how the bacterias evolve and becomes more resistant to treatments.

• The application of this techniques can lead to a better treatment schema, although they are expensive.

• The drug resistance is public health problem, and it is not only in countries like Malaysia, it’s a global problem, even when the same study is realized in two places, results are not the same.

• In a near future this kind of investigation may contribute In the development of stronger antibiotics.