Univerztet u BeograduMainski fakultet

SEMINARSKI RAD

Faktor koji utie na preciznost neinvazivnog merenja glukoze u krvi kratkom talasnom duinom bliske infracrvene spektroskopije kod odreivanja glikemijskog indeksa hrane

Predmet: Spektroskopija student: Ana Nedeljkovi 1207/12Profesor: uro KorugaAsistenti: Jelena Munan Duan arac Jelena Tomi

Beograd, 2014

Sadraj1.Uvod ...............................................................................................................31.2 Materijali i metode...31.2.1 Prva faza....31.2.2. Druga faza ..61.3 Rezuktati i diskusije .....................................................................................71.4 Zakljuak ..10

1.Uvod

Neinvazivne tehnike za analizu glukoze u krvi su veoma poeljne, ne samo za klinicku upotrebu, ve i za odreivanje glikemijskog indeksa hrane. Identifikovani su faktori koji uticu na tacnost neinvazivnog merenja glukoze u krvi i ispitani za uspostavljanje optimalnih uslova za analizu. Dobijeni su kalibracioni modeli putem parcijalne regresije metodom najmanjih kvadrata. Nekoliko eksperimanata otkrilo da je da se dobar kalibracioni model moe dobiti korienjem spektra (700-1100 nm) dobijenog iz dlana ruke pomou velike interakcione sonde fiksirane za sto uz uslov da se akvizicija spektra i analiza glukoze u krvi izvode istovremeno. Tanost razvijenog kalibracionog modela je kliniki prihvatljiv. Analiza modela reenja potvrdila je da NIR spektroskopija u kratko-talasnom regionu 700-1100 nm sposobna za merenje koncentracije glukoze reda od 0,01 % (10 mgdL-1 ) u krvi. Odreivanje glikemijskog indeksa hrane korienjem sadanje metode e biti ispitano u bliskoj budunosti.

1.2 Materijali i metodeEksperimentalni opsegEksperimentalni rad ukljuuje dve faze. U prvoj fazi identifikuju se etri faktora koji utiu na preciznost neinvazivnog merenja, a zatim se poreenjem u dve metode za svaki faktor utvruje jedan ogovarajui. etri ispitivana faktora su zapravo podruja na telu izmerena NIR spektroskopijom pomou interaktivne sonde. U drugoj fazi istraivanje se zasniva na korienju modela reenja za tumaenje neivazivnog kalibracionog modela koji je razvijen u prvoj fazi i na proveri mogunosti korienja NIR spektorskopije za merenje glukoze u krvi. 1.2.1 Prva faza: neinvazivno merenje glukoze u krvi Da bi se razvio i uporedio kalibracioni model vri se test tolerancije na ugljene hidrate. U pojedinanom testu ispituje se zdrava osoba, koja nije dijabetiar izgladnjivanjem preko noi najmanje 8 asova i unoenjem porcije hrane koja sadri 50 g ugljenih hidrata. NIR spektri i koncentracije glukoze u krvi iz uboda prsta subjekta su mereni u intervalima od 10, 15 I 30 minuta u periodu od tri sata. Koncentracije eera u krvi u Eksperimentu 1 su izmerene pomou aparata Glucocard Diameter zbog njegove velike preciznosti. Komercijalno dostupan NIR spektrofotometar, NIRSystems 650 opremljen interaktivnom sondom, je korien za merenje ljudskog tkiva. NIR sonda je postavljena vertikalno iznad oblasti koja se meri i NIR difuzne refleksije spektra se skupljaju u talasnim duinama u oblasti od 700 do 1200 nm na intervalima od 2 nm. Kao referentni material koristi se teflon. Pre akvizicije spectra temperatura merne oblasti i sonde je uravnoteana na 31C dovoenjem u kontakt sa termostatikim aluminijumskim blokom u periodu od oko 30 s. Uraeno je 50 skenova u trajanju od oko 25 s. Podaci su analizirani pomou programa The Unscrambler . Primenjuju se Savitzky Golay polinomalna i parcijalna regresija. Uklanjaju se autlajeri za ta se obino koristi procena take podataka na najmanju regresiju kvadrata. Kvalitet statistikog reima kalibracije koji se zasniva na testovima tolerancije je dovedem u pitanje jer vremenski zavisna spektralna akvizicija moe dovesti do sluajne vremenske kalibracije. Da bi se izbegao ovaj problem kalibracija setova uzoraka se uzima iz nekoliko testova, zatim se validacijom procenjuju razvijeni kalibracioni modeli. Statistike karakteristike skupova uzoraka za kalibraciju, prikazani su u Tabeli 1.

Slika 1. Glucocard Diameter i NIRSystems 650Tabela 1. Statistike karakteristike skupova uzorka krvi za kalibraciju u prvoj fazi

Slika 2. Dva tipa interakcione sonde

Eksperiment 1. Oblast merenja NIR spektroskopijom Kao potencijalne oblasti za NIR merenje porede se zglob i dlan ruke. Koristi se velika sonda koja se prilikom spektralne akvizicije runo pridrava. Analiza glukoze u krvi vri se po zavretku akviczicije spektra. Za etri dana prikupljeno je 40 skupova podataka za svaku oblast merenja.Eksperiment 2. Veliina interaktivne sondeKod interaktivne metode dubina prodiranja zraenja moe se kontrolisati podeavanjem rastojanja izmeu osvetljene strane i fiber-optickog snopa iluminatora. Porede se rezultati dobijeni iz male i velike sonde koje su prikazane na Slici 2. Spektri na dlanu ruke su izmereni kao i u prvoj Eksperimentalnoj metodi i za 4 dana prikupljeno je 39 skupova podataka sa obe sonde. Eksperiment 3. Postavljanje sondeSonda se mora pravilno podesiti da bi se postigla pravilna akvizicija spektra. Posebno, varijacije pritiska u kontaktu i poloaju sonde utiu na rasipanje zraenja u tkivima to je rezultirano spektralnim promenama kao to su pomeranje bazne linije i promene jaine apsorpcije. U ovom eksperimentu porede se dve metode postavljanja sonde. U prvoj je sonda pridravana runo, u drugoj je fiksirana za sto (Slika 3). Temperatura sonde odrava se na 31C pomou digitalnog temperaturnog kontrolera. Analiza glukoze u krvi vri se po zavretku akvizicije spektra. Prikupljeno je 37 skupova podataka uzastopnog merenja za svaku od metoda, u trajanju od dva dana kod fiksirane sonde i etri dana kod runog dranja sonde.

Eksperiment 4.Vremenska razlika izmeu spektralne akvizucije i analize nivoa glukoze u krviTokom testa tolerancije koncentracija glukoze u krvi se brzo menjala. U preliminarnom eksperimentu primeena je promena od 15 mg dL-1 za 2 minuta. Vremenska razlika izmeu akvizicije spektra i analize glukoze u krvi moe da izazove poveanje greke. U ovom eksperimentu porede se sekvencijalne i simultane analize prilikom vremenske razlike izmedju akvizicije spektra i analize glukoze u krvi koje iznosie priblino 30 s i manje od 1 s. Spektri dlana ruke su mereni velikom sondom fiksiranom za sto. Prikupljeno je 62 skupova podata tokom sekvencijalnog merenja za dva dana, i isto toliko simultanim merenjem u trajanju od 4 dana.

1.2.2. Druga faza: Istraivanje strukture kalibracije i mogunost NIR merenja pomou modela reenjaJednostavna priprema:Matrica uzorka sastoji se od glukoze i goveeg serumskog albumina (BSA) i homogenizovanog mleka u 0,1 mol L -1 fosfatnog bufera (ph 7,4). BSA je korien za model proteina u krvi , a mleko za rasipanje zraenja. U kratkotalasnij NIR regiji (700-1100 nm), signali glukoze su slabi, pa se zato poveva duina optikog puta poveanjem rasipanja radijacije. Korien je potpuni faktorski eksperimentalni dizajn u razliitim koncentracijama ove dve komponente: faktora glukoze na 10 nivoa (1 mmol L- 1 , 3 mmol L- 1 , 5 mmolL- 1 , 7 mmolL- 1 , 9 mmolL- 1 , 11 mmolL- 1 ,13 mmolL- 1 , 15 mmolL- 1 , 17 mmolL- 1 or 19 mmolL- 1), BSA na 4 nivoa ( 2 gdL-1, 3 gdL-1, 4 gdL-1, 5 gdL-1 ). Za glukozu 1 mmol L-1 je jednak 18.0 mg dL-1. Ovi opsezi koncentracija pokrivaju nivoe koji se najee nalaze u humanim klinikim uzorcima. Koncentracija mleka je konstantna. Imamo ukupno 40 uzoraka (10x4). Rastvori glukoze i BSA dobijeni su razblaivajem istog reagensa sa fosfatnim puferom pripremljenog sa vodom i preienog pomou Milli- Q system-aAkvizicija spektraZabeleen je spektar modela reenja u reimu prolaska pomou epruveta, slino kao u prethodnom eksperimentu sa mlekom. Za NIR spektrofotometar korien je NIR System s6500. Debljina stakla epruvete iznosi 1,2 mm, a unutranji prenik 17,6 mm. Kao referentni materijal koriene su aluminijum keramike ploe debljine 3 mm. Pre akvizicije spektra temperatura uzorka je kontrolisana pomou evilibrium epruveta.Analiza podatakaSkup kalibracija sastoji se od 40 uzoraka, svaki sa razliitom koncentracijom glukoze i koncentracije BSA. Podaci su analizirani pomou Unsclamber programa. Primenjeni su Savitzky-Golay drugi izvod i PLS regresija.

1.3 Rezuktati i diskusije Prva faza: neinvazivno merenje glukoze u krviNa slici 3 (a) prikazan je tipian NIR spektar pod optimalnim uslovima. U drugom izvodu spektra (b) apsorpcija uoena na 760 i 964 nm pripisuju se dioksigenovanom hemoglobinu i vodi.

Slika 3. NIR spektar dlana ruke izmeren pod optimalnim uslovima, (a) original spektar i (b)drugi izvod spectraRezultati PLS regresije za svaki eksperiment prikazani su u Tabeli 2. U pogledu merenja NIR spektroskopije uoeno je da je dlan ruke daje bolje rezultate od zgloba. Struktura svake oblasti, posebno stanje krvnih sudova utie na rezultate. Koa dlana dobija krv iz mree arterija iz malog prsta i hipotenara. Ova bogata vaskularna mrea rezultira homogenizacijom informacija iz ove oblasti. U sluaju zgloba, prisustvo vidljivih vena preko koe moe izazvati varijacije spektra ukoliko se merna povrina blago pomera.

Tabela 2. Parcijalna kalibracija najmanjih kvadrata i provera rezultata kod neinvazivne analize glukoze u krvi

to se tie veliine interakcione sonde, utveno je da je vea sonda vie odgovara za neinvazivna merenja jer je potrebna vea duina optikog puta za merenje slabih signala iz glukoze. Zakljuuje se i da se stabilniji spektri dobijaju prilikom fisirane sonde za sto nego kod runog pridavanja.to se tie akvizicije spektra i vremenske razlike izmeu akvizicije i analize glukoze u krvi, spektralna akvizicija mora da se obavlja gotovo istovremeno da bi se dobile ispravne vrednosti. Najbolji PLS model pokazuje koeficijent viestruke determinacije [R 2]od 0,85 i standardnu greku za unakrsnu proveru 9,7 mgdL-1. Unakrsna provera merenja NIR spektorskopijom prikazana je na Slici 4. pomou takastog dijagrama. Tanost ovog modela je izutzetna u poreenju sa prethodnim istraivanjima kao to su merenja na prstu i podlaktici. Jedan od razloga za poboljanu tanost jeste vea duina optike putanje. Merenja na dlanu velikom interakcionom sondom obezbeuju duu optiku putanju, za razliku od merenja prsta. U ovom istraivanju najvanije pitanje je zapravo da li NIR spektroskopija moe izmeriti nivo glukoze u krvi reda 0,01 % [10 mgi L -1]. Da bi se odgovorilo na ovo pitanje, vre se eksperimenti o kojima se daljem tekstu raspravlja.

Slika 4.Takasti dijagram unakrsne provere kod merenja glukoze u krvi NIR spektroskopijom

Druga faza: Istraivanje strukture kalibracije i mogunost NIR merenja pomou modela reenjaTabela 3. prikazuje rezultate PLS kalibracije glukoze u rastvoru. Kalibracioni model koji smo razvili moe se uspeno koristiti za koncentraciju odreivanja glukoze. Da bi smo ispitali da li model kalibracije zaista koristi informacije koje se odnose na apsorpciju glukoze u krvi ispitali smo takaste dijagrame koeficijenta regresije. Koeficijenti regresije su procenjeni pomou PLS regresije i oni se najee koriste za identifikaciju apsorpcionih traka, ili talasnih duina koje imaju znaajan doprinos.

Table 3. F broj faktora, R2 koeficijent viestruke determinacije, SEC standardna greska kalibracije, SEP je korigovana standardna greka predikcije, BIAS je prosek razlike izmeu referentne vrednosti I NIR vrednosti:opseg za glukozu je 18-342 mg dL-1Slika 5.(a) Pokazuje poreenja izmeu prvog izvoda glukoze u prahu i hidratizovane glukoze izraunate oduzimanjem spektra vode iz spekra vodenog rastvora glukoze. Pik dobijen na 920 nm, dodeljen CH vibracijama, posmatran je u spektru obe glukoze (praha i hidrata). Pik na 982 nm za hidratizovanu glukozu je verovatno vezan za OH vibraciju atoma vodonika. Slika 5 (b) prikazuje dijagram koeficijenta regresije za kalibracioni model. Pikovi uoeni na 922 nm i 990 nm poklapaju se sa apsorpcionim trakama hidratizovane glukoze. Apsorpcione trake na 920 nm su koriene za odreivanje koncentracije glukoze u plazmi goveda i u odreivanju materija vezanih za ugljene hidrate u hrani kao to su suve materije luka i eera sadranog u breskvi i pomorandi. Standardne greke predvianja (SEP) sugeriu da je NIR spektroskopija sposobna za odreivanje glukoze u krvi red 0,01 %.Slika 6 prikazuje koeficijent regresije neinvazivnog PLS kalibracionog modela koji je razvijen u prvoj fazi istraivanja. Pikovi posmatrani na 918 nm i 984 nm se poklapaju otprilike sa onima iz modela reenja i odnose se na CH i OH vibracije hidratizovane glukoze. Stoga je potvreno da neinvazivna kalibracija modela sadri informacije o apsorpciji glukoze. Pik koji se pojavljuje na 746 nm moe se odnositi na stanje oksidacije hemoglobina. U ovom talasnom regionu, oksi i deoksihemoglobin pokazuju razliita svojstva apsorpcije. To nam govori da se stanje oksidacije hemoglobina odnosu i na koncentraciju glukoze u krvi. Kada se talasna duina regiona izmeu 700 nm i 800 nm ukloni ne mogu se dobiti dobri rezutati, stoga je 746 nm talsne duine takoe vano za kalibracioni model koji mo razvili. Naravno dobar kalibracioni model se ne moe dobiti iskljuivo pomou talasnog regiona duine 746 nm. Iako ovaj model kalibracija pokazuje veliku preciznost pokazuje i velika odstupanja kada se primenjuje razliitim danima jer model nije globalan. Male varijacije u uslovima merenja kao to su pomeranje prilikom pritiska sondom i drugi faktori poveavaju predvienu greku. Nije lako odrati ove faktore konstantnim u bilo kojoj lokaciji u bilo koje vreme. Kod odreivanja glikemijskog indeksa ih je manje teko odrati konstantnim jer je mogue postaviti dlan ruke tako da se ne pomera tokom testa tolerancije i zahteva samo vrednosti na osnovnim linijama, stoga je lakse primeniti ovaj postupak kod ovog odreivanja glikemijskog faktora.

1.4 Zakljuak Faktori koji utiu na preciznost neinvazivnog merenja glukoze u krvi su identifikovani i ispitani u odreenim odgovarajuim uslovima za analizu. Najbolji PLS model je dobijen skupljanjem spektara sa dlana ruke velikom interakcionom sondom fiksiranom za sto i pomou bliske simultane akvizicije spektra i analizom glukoze u krvi. Potvrdili smo da na kalibraconi model neinvazivne kratkotalasne duine NIR spektroskopije koristi informacije koje se odnose na apsorpciju glukoze. Preciznost najboljeg modela je kliniki prihvatljiva. Merenja na dlanu ruke se relativno lako obavljaju i imaju prednosti u praktinoj primeni. Takoe je neophodno da s ekoristi velika interakciona sonda. Lake je primeniti ovaj metod za odreivanje glikemijskog indeksa, nego klinikog praenja jer je lake odrati konstante vrednosti faktora koji utiu na neinvazivne metode merenja . u bliskoj budunosti, nadamo se odreivanju glikemijskoh indeksa u u hrani, predstavljenom metodom.

Slika 5. a) Drugi izvod spectra glukoze praha u poreenju sa hidratizovanom glukozom izraunati oduzimanjem spektra vode iz spektra vodenog rastvora glukoze. b) Regresija podataka kalibracionog modela za merenje koncentracije glukoze u puferu koji sadri rastvor BSA I homogenizovano mleko.

Slika 6. Regresija podataka kalibracionog modela za neinvazivno NIR merenje glukoze u krvi.

2