Embed Size (px)
Citation preview
T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI
İSHALLİ DIŞKI ÖRNEKLERİNDE CRYPTOSPORIDIUM SP.
ANTİJENİNİN ELISA YÖNTEMİ İLE ARAŞTIRILMASI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Güllü ELGÜN
DANIŞMANI
Prof. Dr. İsmail Soner KOLTAŞ
ADANA-2009
T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI
İSHALLİ DIŞKI ÖRNEKLERİNDE CRYPTOSPORIDIUM SP.
ANTİJENİNİN ELISA YÖNTEMİ İLE ARAŞTIRILMASI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Güllü ELGÜN
DANIŞMANI
Prof. Dr. İsmail Soner KOLTAŞ
Bu tez, Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TF.2007.YL.7 nolu proje ile desteklenmiştir.
ADANA-2009
ii
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimim süresince bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen, tez
konumun seçimi ve yürütülmesinde teorik ve pratik deneyimlerinden faydalandığım tez
danışmanım Parazitoloji Anabilim Dalı Başkanı Prof.Dr. İsmail Soner KOLTAŞ’a
teşekkür ederim.
Bu tezin oluşumunda ve örneklerin toplanmasında bana yardımcı olan Adana
Numune Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuarı sorumlusu Uz.Dr. Pamir CANPOLAT’a
ve diğer laboratuar çalışanlarına teşekkür ederim.
Ayrıca yüksek lisans eğitimim boyunca beni destekleyen ve çalışmalarıma
katkısı bulunan Parazitoloji Anabilim Dalı çalışanlarına teşekkür ederim.
Tez çalışmasını TF.2007.YL.7 no’lu proje ile destekleyen Ç.Ü.Rektörlüğü
Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine de teşekkür erdim.
Biyolog Güllü ELGÜN
iii
İÇİNDEKİLER Sayfa No
KABUL VE ONAY…………………………………………………………..………….i
TEŞEKKÜR………………………………………………………………………..……ii
İÇİNDEKİLER…………………………………………………………………..……...iii
ŞEKİLLER DİZİNİ……………………………………………………………..……….v
ÇİZELGELER DİZİNİ……………………………………………………..…..………vi
ÖZET…………………………………………………………………….….………….vii
ABSTRACT……………………………………………………………..…………… viii
1.GİRİŞ……………………………………………………………………….………….1
2.GENEL BİLGİLER………………………………………………………..…………..3
2.1.Cryptosporidium sp……………………………………………….……….…3
2.2.Cryptosporidium’un Sınıflaması…………………………………….……….4
2.3. Cryptosporidium’un Yapısı ve Yaşam Döngüsü…………………...……….4
2.3.1.Ekskistasyon Dönemi…………………………………………….…….…..4
2.3.2.MerogoniDönemi..........................................................................................5
2.3.3.Gametogoni Dönemi………………………………………...……….…….5
2.3.4.DöllenmeDönemi……………………………..…………………….……...5
2.3.5.Ookist Dönemi………………………………………..………..………….5
2.3.6.Sporogoni Dönemi…………………………………….………..………….6
2.4.Epidemiyolojisi………………………………………………….…………...8
2.5.Bulaşma Yolları…………………………………………............…………...9
2.6.Patogenez.……………………………………………………….…..……...10
2.7.İmmünolojisi……………………………………………………..…………10
2.8.Kriptosporidyoz Olgularında Klinik Tanısı………….……….…...…..........11
2.8.1.Enterik Kriptosporidyoz……………………………………..………..….11
2.8.2.Kolesistit………………………………………………………..……..….12
2.8.3.Solunum Sistemi Enfeksiyonu…………………………………..…..…....12
2.9.Kriptosporidyoz Olgularında Laboratuar Tanısı………………..……..…...12
2.9.1.Doğrudan Mikroskobi…………………………………………..….…….12
2.9.1.1.Modifiye Asit-Fast Boyama…………………………………....………12
2.9.1.2.Lugollü Preparat İnceleme…………………………………..…….……12
2.9.1.3.Giemsa Boyama………………………………………...………………12
2.9.2.Serolojik Yöntemler……….…………….……………….…....................13
iv
2.9.2.1.DFA(Direkt Immunfloresans Tekniği)…………………..…..…………13
2.9.2.2.EIA (Enzim Immunassay)………………………………….…………..13
2.9.2.3.Hızlı Immunokromatografik Yöntemler...................................................13
2.9.3.Moleküler Yöntemler…………………………………………….……….13
2.9.4.Kültür Yöntemleri…………………………………………….…………..14
2.10.Tedavisi…………………………………………………….……………...14
2.10.1.İmmun Sistemi Sağlam Kişilerde Tedavi…………………..……...……14
2.10.2.İmmun Sistemi Baskılanmış Kişilerde Tedavi…………………..………14
2.11.Korunma……………………………………………………..…………….15
3.GEREÇ VE YÖNTEM………………………………………………..……………...16
3.1.Gereçler………………………………………………………..……………16
3.2.Örneklerin Toplanması……………………….……………….……………16
3.3.Yöntemler……………………………………………………….………….17
3.3.1. Modifiye Asit-Fast Boyama Yöntemi……………………………..……..18
3.3.1.1.Gerekli Eriyikler……………………………………….……….………18
3.3.1.2.BoyamaYöntemi…………………………………………….….………18
3.3.2.Parazitolojik İnceleme Yöntemi………………………………..………...19
3.3.3.ELISA Testi…………………………………………………..…………..20
3.3.3.1.Örneklerin Hazırlanması…………………………………..……………20
3.3.3.2.Yıkama Solüsyonunun Hazırlanması……………………….………….20
3.3.3.3. Yöntemi……..…………………………………………….…………...21
4.BULGULAR…………………………………………………………….…………...22
5.TARTIŞMA ………………………………………………………..………………...27
6.SONUÇ VE ÖNERİLER……………………………………………………………..32
7.KAYNAKLAR…………………………………………………….…….…………...33
8.ÖZGEÇMİŞ ……………………………………………………….….………………37
v
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil.1.Ookistlerin Parçalanmasıyla Serbest Kalan Enfektif Sporozoitler………..…….5
Şekil.2.Cryptosporidium’un Ookisti…………………………….………………………6
Şekil.3.Cryptosporidium’un Yaşam Döngüsü………………………….……………….7
Şekil.4.Cryptosporidium’un evrimi ve evrim şekilleri………………………………….8
Şekil.5.Modifiye Asit-Fast Boyama Sonucu Ookistlerin Mikroskobik
Görüntüsü………………………………………………………..…………….20
Şekil.6.Cryptosporidium Microwell ELISA kiti……………………….………………21
Şekil.7.Cryptosporidium sp.’nin Ookistlerinin modifiye Asit-Fast Boyamadaki
Görünümü………………………………………………….………………….23
Şekil.8.ELISA Plağında pozitif ve negatif kuyuların görünümü
(İlk 96 Hastanın Sonucu) …………………………………...……………...25
Şekil.9.ELISA Plağında pozitif ve negatif kuyuların görünümü
(Son 58 Hastanın Sonucu)……...........................................................................26
vi
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge.1.Çalışma Gruplarındaki Kadın ve Erkek Oranı…………….…………...……18
Çizelge.2.Modifiye Asit-Fast Boyama Yöntemi ile Cryptosporidium
Ookistlerinin Saptandığı Hastaların Gruplara Göre Dağılımı………..………23
Çizelge.3.Lugollü Preparatlarda Görülen Parazit Türlerinin Dağılımı…………...........24
Çizelge.4.Cryptosporidium sp. ELISA Antijen Testinin Pozitifliğinin
Yaş Gruplarına Göre Dağılımı…………………………………………..…..26
Çizelge.5.Mikroskobi ile ELISA Sonuçlarının Karşılaştırılması…………....................27
Çizelge.6.Bazı Ülkelerde Cryptosporidium ile ilgili Yapılan Çalışmalar……………...31
Çizelge.7.Ülkemizde Cryptosporidium ile ilgili Yapılan Bazı Çalışmalar………….....32
vii
ÖZET
İSHALLİ DIŞKI ÖRNEKLERİNDE CRYPTOSPORIDIUM SP.
ANTİJENİNİN ELISA YÖNTEMİ İLE ARAŞTIRILMASI
Cryptosporidium türleri gelişmekte olan ve gelişmiş ülkelerde ishale neden
olan parazitler arasında önemli bir yere sahiptir. Özellikle bağışıklık sistemi
baskılanmış kişilerde ölümcül ishallere neden olabilmektedir. Ayrıca içme
sularıyla bulaşma olduğu için halk sağlığını tehdit edebilmektedir. Bu çalışmada
Cryptosporidium sp.’nin saptanması için iki yöntem kullanıldı. Mikroskobi ile elde
edilen sonuçlar dışkıda özgül antijen arama yöntemi ile karşılaştırılarak ELISA
yönteminin etkensel tanıya katkı sağlayıp sağlamadığı araştırılmıştır.
Bu çalışmada, Ekim 2007 ve Temmuz 2008 tarihleri arasında Adana
Numune Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı’na ve Çukurova
Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi’ne bağlı kliniklerden Parazitoloji
Anabilim Dalına ishal şikayetiyle başvuran yaşları 0-86 arasında değişen toplam
154 dışkı örneklerinde ELISA yöntemi ile Cryptosporidium sp. antijeni ve modifiye
asit-fast boyama yöntemi ile ookistlerin varlığı araştırıldı.
Toplam 8 örnekte modifiye asit-fast ile pozitiflik saptanırken, ELISA ile 37
örnekte pozitiflik saptanmıştır.
Sonuç olarak, dışkıda özgül antijen arayan ELISA’nın maliyeti yüksek
olmasına rağmen etkensel tanı yöntemlerindeki zorluklara yardımcı olduğu
görülmektedir.
Anahtar sözcükler: Cryptosporidium sp. ELISA, ishal, modifiye asit-fast.
viii
ABSTRACT
INVESTIGATION OF CRYPTOSPORIDIUM SP. ANTIGEN BY ELISA
METHOD IN STOOL SPECIMENS WITH DIARRHEA
Cryptosporidium sp. are important agents causing diarrhea in developing
and developed countries. The agent causes severe life-threatening diarrhea
especially in immunocompromised hosts. Furthermore, transmission of
Cryptosporidium sp. by of drinking water threats public health. In this study,
two methods are used for determining Cryptosporidium sp. Microscopy and
specific antigen detection methods are compared. Investigation of specific
antigen by ELISA method in stool is investigated for contributing or not
diagnosis of Cryptosporidium sp.
In this study, 154 stool specimens taken from patients- between 0 to 86
ages with diarrhea applied to Microbiology Laboratory, Adana Numune
Research Hospital and Department of Parasitology, Balcalı Hospital of
Çukurova University in Adana were investigated for Cryptosporidium sp.
antigen by ELISA and oocysts via modified acid-fast staining, between October
2007 and July 2008.
Eight specimens were found to be positive by modified acid-fast staining;
but thirty seven specimens were found to be positif by ELISA method.
In conclusion, although ELISA which investigates specific antigen in stool
samples is a costly method, it has been seen that it helps to methods for
diagnosis of agents.
Key words: Cryptosporidium spp. diarrhea, ELISA, modified acid-fast.
1
1.GİRİŞ
Cryptosporidium cinsi protozoonlar, dünyada yaygın olan küçük koksidya
parazitlerdir. Omurgalıların sindirim ve solunum yollarını kaplayan epitel hücrelerinin
mikrovillus bölgesine yerleşerek infeksiyona neden olurlar. Özellikle gelişmekte olan
ülkelerde çocuklar, beslenme yetersizliği olanlar ve immun sistemi baskılanmış kişiler
bu parazit ile infeksiyona duyarlıdır. Sağlıklı kişilerde asemptomatik infeksiyona veya
kendiliğinden geçen ishallere neden olurken, immun yetmezliği olan kişilerde ağır
seyirli kronik ishal, karın ağrısı, bulantı, kusma, subfebril ateş, halsizlik, kilo kaybı,
pankreas, safra, mide, özefagus ve solunum yolu infeksiyonlarına neden olabilmekte ve
hastalık ölümle sonlanabilmektedir. Bugüne kadar bu cinse ait, memeli omurgalılardan,
kuşlardan, sürüngenlerden ve balıkların değişik türlerinden 20 ayrı tür izole edilmiştir.
En çok tanınanları C.parvum, C.baileyi ve C. muris’tir1-5, 8-11, 13-15, 25.
İnsanlardaki infeksiyonlardan genellikle Cryptosporidium parvum sorumlu olup,
bu tür diğer omurgalı hayvanlarda da infeksiyon oluşturmaktadır. Cryptosporidium
parvum. dışında C.felis (kedi türü), C. canis (köpek türü), C. meleagridis (kuş türü) ve
C. muris (fare türü) immun sistemi baskılanmış insanlarda infeksiyon oluşturduğu
bildirilmiştir3,8,10,13,18,25. C.parvum, tüm yaşam döngüsünü tek bir konakta geçirme
yeteneğine sahiptir. C. parvum, 4-6 µm büyüklüğündeki infektif şekil ookistlerin
insandan insana fekal-oral yolla, hayvandan insana (özellikle evcil hayvanlar birincil
konaklardır) ve dışkı ile kirlenmiş yüzme havuzları, yiyecekler, eşyalar, olası hava
yoluyla, toprak ve taşıyıcı konaklarla (arthropodlar, kuşlar) dolaylı yollardan alınması
sonucu bulaşmaktadır5,6,8,12-13. Hastaneler, huzurevleri ve çocuk yuvaları gibi kalabalık
ortamlarda bulaşmanın daha sık olduğu ve infeksiyonun çocuklarda yetişkinlere göre
daha fazla görüldüğü belirtilmektedir9.
Cryptosporidium infeksiyonlarında etiyolojik tanı dışkı, balgam ve safra
örneklerinde parazitin ookistlerinin veya biyopsi materyalinde değişik gelişim
dönemlerinden birinin görülmesiyle konabilmektedir. Bu incelemelerde yoğunlaştırma
veya boyama yöntemleri (Modifiye Asit-Fast, Safranin, Auramin, İyot, Metilen
Mavisi veya Giemsa) ile ookistler araştırılabilir. Serolojik testlerden İndirekt
Fluoresan Antikor (İFA) testi ve dışkıdaki antijenleri saptamak için Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) veya Direct Immunofluorescent Assay (DFA) gibi
yöntemler de kullanılmaktadır5, 15-18, 26.
2
Bu çalışmada, Cryptosporidium için epidemiyolojik koşulların uygun olduğunu
düşündüğümüz Adana’da, Sağlık Bakanlığına bağlı Numune Araştırma Hastanesi
Mikrobiyoloji Laboratuvarı’na ve Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı
Hastanesi’ne bağlı kliniklerden Parazitoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı’na ishal
şikayeti nedeniyle gönderilen farklı yaş grubundaki hastalarda Cryptosporidium sp.
antijenlerinin ELISA yöntemiyle araştırılması ve modifiye asit-fast ile boyanmış
preparatların mikroskobi sonuçlarının ELISA sonuçlarıyla karşılaştırılması
amaçlanmıştır.
3
2. GENEL BİLGİLER
Cryptosporidium sp. özellikle bağışık yanıtı baskı altında olan insanlarda
sindirim ve solunum yolları infeksiyonu yapması ile dikkati çekmektedir10, 19.
2.1. CRYPTOSPORIDIUM SP.
Cryptosporidium, dünyada yaygın olan, 4-6 µm çapında, küçük koksidian
protozoonlarındandır. Parazitin; memeli omurgalılardan, kuşlardan, sürüngenlerden ve
balıkların değişik türlerinden 20 kadar türü izole edilmiştir. Son yıllarda AIDS’li
hastalarda yaygın olarak tespit edilmesiyle birlikte Cryptosporidium’un insan sağlığı
açısından önemi ortaya konmaya başlamıştır. İnsanlardan ve birçok memelilerden izole
edilen Cryptosporidium türü Cryptosporidium parvum’dur4, 24.
Cryptosporidium ilk kez 1895 yılında Clarke tarafından fark edilerek “ fare mide
epiteli üzerinde yer alan spor kümeleri” şeklinde tarif edilmiş ve bundan yaklaşık 12 yıl
sonra 1907 yılında Tyzzer tanımlamış ve 1910 yılında Cryptosporidium muris adı ile
hem cinsi hem de türünü tarif etmiş ve evrimini açıklamıştır. 1912’de Cryptosporidium
parvum’u bildirmiştir. Önceden bilinen koksidia parazitlerinin aksine ookistlerin
içindeki sporozoitleri çevreleyen sporokistlerin olmaması nedeni ile Cryptosporidium
(gizli sporokistler) olarak isimlendirilmiştir8,19, 20, 25.
İlk insan olguları 1976 yılında, gastroenteritli 3 yaşındaki bir kızda ve daha
sonra da immun sistemi baskılayıcı ilaç kullanan bir çiftçide görülmüş olup, bu olgu bir
çiftlikte yaşayan hayvanlarda saptanan infeksiyonla aynı zamanda ortaya çıkmıştır. Bu
nedenle Kriptosporidyoz’un bir zoonoz olabileceği düşünülmüştür. 1981-1982
yıllarında ise AIDS’li hastalarda Cryptosporidium infeksiyonları saptanmış ve şiddetli
enterite neden olduğu bildirilmiştir. Bu kişilerde görülen uzun süreli, sıklıkla bol sulu
dışkı, zayıflama gibi belirtiler infeksiyonun fırsatçı patojen olabileceğini
düşündürmüştür. Daha sonraki yıllarda yayımlanan araştırmalarda hayvan bakıcılarında,
turistlerde ve bağışıklığı sağlam kişilerde de salgınlara neden olduğu
bildirilmiştir1,8,12,18,20-23.
4
2.2. CRYPTOSPORIDIUM’UN SINIFLAMASI
Dünya Sağlık Örgütünce Cryptosporidium’un sınıflaması şöyledir8.
Alem: Protista
Altalem: Protozoa
Şube: Apicomplexa
Sınıf: Sporozoasida
Altsınıf: Coccidiosina
Takım: Eucoccidiorida
Alttakım: Eimeriorina
Aile: Cryptosporidiidae
Cins: Cryptosporidium
2.3. CRYPTOSPORIDIUM’UN YAPISI VE YAŞAM DÖNGÜSÜ
Cryptosporidium’ un gelişmesi, mide ve bağırsak mukoza epiteli hücrelerinin
fırça kenarları içinde olur. Yerleşim yeri nedeniyle diğer hücre içi parazitlerden ayrılır.
Çünkü, onlar hücrenin sitoplazması içinde yerleşirken, Cryptosporidium hücrenin
ekzositoplazmik alanında yerleşir ve birbirini izleyen eşeyli ve eşeysiz üremeyle
çoğalır. Yaşam döngüsünü tek bir konakta tamamlar. Parazitin yerleştiği ve konak hücre
orjinli bölgeye parazitoforoz vaküol denir4, 8, 16, 20, 25.
Cryptosporidium türlerinin yapısı evrim şekillerine göre değişmektedir. Bunun
evriminde merogoni, gametogoni, döllenme, ookistli duvar oluşumu, sporogoni ve
sporozoitlerin bağırsakta serbest kalması (ekskistasyon) gibi altı farklı olay vardır8, 19, 20.
2.3.1. Ekskistasyon Dönemi: Ağız yoluyla alınan kalın duvarlı sporlanmış ookistlerin
çeperlerinin ince bağırsakta safra tuzları ve pankreans enzimlerin yardımıyla
parçalanması (ekskistasyon) sonucunda sporozoitler serbest kalmakta ve bağırsak
boşluğuna dökülmektedir8.
5
Şekil.1.Ookistlerin parçalanmasıyla serbest kalan enfektif sporozoitler
2.3.2. Merogoni Dönemi: Serbest kalan sporozoitler konağın epitel hücreleri (enterosit)
içine girmektedirler. Bu hücrelerin mikrovillus bölgesinde parazitofor vakuoller içinde
trofozoitlere (tek nukleuslu merontlara ) dönüşmekte ve daha sonra eşeysiz olarak
(merogoni) çoğalarak Tip 1 merontları oluşturmaktadırlar. Tip 1 merontlar 6-8
çekirdeklidir ve her birinden 6-8 meozoit oluşur. Bu merozoitler yeni hücrelere girerek
tekrar eşeysiz çoğalama ile Tip 1 merontları veya Tip2 merontları
oluşturmaktadırlar5,8,18.
2.3.3. Gametogoni Dönemi: Tip 2 merontlardan oluşan merozoitler ise yeni bir döngü
oluşturmazlar. Bunlardan oluşan merozoitler mikrogametosite, sonra mikrogamete, bazı
merozoitler ise makrogametosite sonra makrogamete dönüşürler8, 18, 27.
2.3.4. Döllenme Dönemi: Kamçısız, fakat hareketli mikrogamet, makrogameti döller ve
sonucunda zigot oluşur5, 8.
2.3.5. Ookist Dönemi: Zigot duvarının kalınlaşmasıyla parazitin bir konaktan diğerine
bulaşmasını sağlayacak olan, dış çevre koşullarına dayanıklı ookist oluşmaktadır.
Ookistler, 4-6 µm büyüklüğünde oval yapılardır. Ookistlerin %80’i kalın duvarlı,
%20’si ince duvarlıdır4, 8, 18, 27.
6
Şekil.2. Cryptosporidium’un. Ookisti (1000 büyütme, modifiye asit-fast boyama)
2.3.6. Sporogoni Dönemi: Ookist içinde sporlanma ile 4 infektif sporozoit (4.9 x 1.2
µm büyüklüğünde, çekirdekleri 1/3 arka kısımdadır ve hücre çeperi 50 nm kalınlığında
olup düz ve renksizdir) oluşur8, 19.
Kalın duvarlı ookistler dışkı ile dışarı atılır ve yeni konaklarda infeksiyonun
bulaşmasını sağlarlar. İnce duvarlı olanlar ise konak hücreden ayrılmalarından hemen
sonra içlerindeki sporozoitler bağırsak boşluğunda serbest kalır ve diğer enterositlere
girerler ve yeni bir yaşam döngüsü başlatırlar. Bu otoinfektif ookistlerin ve Tip 1
merontların az sayıda ookistle infekte olan kişilerde, şiddetli enfeksiyonların
gelişiminden sorumlu olmaktadırlar. Bağışıklığı baskılanmış kişilerde ise etken
dışarıdan yeniden alınmasa da, uzun süren ve hastanın yaşamını tehlikeye düşürebilen
tabloların ortaya çıkmasına neden olabilecekleri düşünülmektedir8, 18, 19, 27.
7
Şekil.3. Crptosporidium’un yaşam döngüsü43
8
Şekil.4. Cryptosporidium’un evrimi ve evrim şekilleri 43
Vücuda ookist alındıktan sonra dışkıda ookistlerin görülmeye başlama süresi
insanlarda 5-21, sığırlarda 2-7, kedilerde 5-10 gündür19.
2.4. KRİPTOSPORİDYOZ’UN EPİDEMİYOLOJİSİ
Kriptosporidyoz, evcil hayvanlardan insana bulaşabilen dünyada yaygın olan bir
zoonoz hastalıktır. İnsandan insana da bulaşma olmaktadır. Su kaynaklı epidemiler de
görülmektedir. Su kaynaklı epidemilere neden olarak; parazitin kaynak sularındaki
prevalansının yüksek olması, klora dirençli olması, içme suyu süzgeçlerinden lerinden
geçebilmesi ve çok az sayıda parazitin bile infeksiyona neden olabilmesi ile
gösterilmektedir. Sessiz infeksiyonlular ve hastalık bittikten sonra hala ookist saçanlar
bulaştırıcıdırlar. Bu parazitoza çocukların, erişkinlerden; anne sütü ile
beslenmeyenlerin, anne sütü ile beslenenlerden daha sık yakalandıkları saptanmıştır.
Ayrıca, ookistlerle pislenen çiğ süt, immun sistemin yetersizliği, yaş, meslek, beslenme
9
bozukluğu ve infekte kişilerle yakın temas, risk faktörlerini oluşturmaktadır. İnfeksiyon
yaz ve sonbaharda daha sık görülmektedir4, 5, 17, 19, 24.
Endüstrileşmiş toplumlarda seroprevalans <%35, gelişmekte olan ülkelerde ise
<%100 olarak bildirilmektedir. Adana’da Ç.Ü. Parazitoloji Anabilim Dalımızda yapılan
ülkemizdeki ilk çalışmada; ishalli çocuklarda %8.20, normal çocuklarda %4.08 olarak
bulunmuştur. Mersin’de dört ilköğretim okulunda, yaşları 8-12 olan çocuklardan
toplanan 72 dışkı örneğinin 4’ünde (%5.5) Cryptosporidium ookistleri görülmüştür.
Yine Elazığ’da yapılan bir çalışmada, 0-5 yaş grubu immün yetmezliği olmayan 417
ishalli olgu ele alınmış ve 19’unda (%4.55) Cryptosporidium ookistleri saptanmıştır.
Hindistanda yapılan çalışmada 89 dışkı örneğinin 11’inde (%12.35) görülmüştür.
Mısır’da yapılan çalışmada ise 1050 dışkı örneğinin 100’ünde (%9.5), Amerika Birleşik
Devleti, Milwaukee’de 129 dışkı örneğinin 55’inde (%42.63), Florida’da 84 çocuğun
33’ünde (%39.28), Minnesota ‘da 296 dışkı örneğinin 100’ünde (%33.78), Santiago’da
105 dışkı örneğinin 58’inde (%55.23) görülmüştür4, 16, 28-33, 36, 46.
2.5. BULAŞMA YOLLARI
1. İnsandan insana (Risk altındaki kişilerle aynı evde yaşayanlar, cinsel temasta
bulunduğu kişiler, sağlık çalışanları, zirai ve veteriner çalışanları, endemik bölgelere
seyahat ve kreş çocuklarıdır)8, 25, 36, 37.
2. Hayvandan hayvana.
3.Ev hayvanları, laboratuar hayvanları ve çiftlik hayvanlarının hepsinden insanlara
bulaşma olmaktadır8, 36.
4.Oookistlerin işlenmemiş atık sular, yer altı suları ve içme suyunda, yüzey suları ve
işlenmiş içme suyunda bulunması. Havuz sularıyla bulaş özellikle küçük çocuk
havuzlarının dışkı ile kontaminasyonu sonucunda görülür.
5.Temizliğine dikkat edilmeyerek hazırlanan sosis, sucuk, sakatat ve çiğ süt gibi
tüketilen belirli gıdalarla bulaşın görülebileceği bildirilmiştir.
6. İmmun yetmezliği olan hastalarda ve AIDS’lilerde solunum yoluyla bulaşma
olmaktadır.
7. Toprak ve arthropodlar, kuşlar gibi taşıyıcı konaklarla bulaşma olabilmektedir8,18, 37, 43.
10
2.6. PATOGENEZİ
Kriptosporidyoz, bir zoonoz hastalıktır. Parazit bağırsak epitel hücrelerini
tutmakta ve en çok jejunumda yerleşmektedir. Ancak, bazı hastalarda Cryptosporidium;
yutak, mide ve kalın bağırsakta da gösterilmiştir. Otuzdan az sayıda ookistin bile
sağlıklı gönüllülerde infeksiyona neden olduğu bulunmuş olup, ortalama infektif doz
132 ookisttir. Safra kesesini tutarsa; tıkanma, kolenjit veya kolesistit gelişebilmektedir.
Kript ve villöz yapıda histolojik bozukluklar ortaya çıkar. Villöz atrofi, kriptlerin
uzaması ve lamina propriada tek çekirdekli hücre birikimi görülür. Solunum sistemini
de tutabilmektedir4, 25, 36, 37.
İshalin patofizyolojisi tam olarak açıklanamamıştır. Sonuçta oluşan ishalin hem
tanımlanamayan bir toksin nedeni ile hem de bağırsak villuslarında hasar ile oluşan
malabsorpsiyon nedeni ile olduğu var sayılmaktadır. Üç ana mekanizmanın etkili
olduğu düşünülmektedir.
1. Doğrudan sitotoksik etkiyle bağırsak yapısının bozulması.
2-Konak immun yanıtının bir parçası olarak, inflamatuar metabolit ve
hormonların salınımı.
3- Parazitin enterotoksik özellik göstermesi15, 25, 36.
2.7. İMMÜNOLOJİSİ
Kriptosporidyozda immun yanıt tam anlaşılamamıştır. Cryptosporidium ile
infekte kişilerin serumlarında IgG, IgM ve IgA tipi antikorlar bulunur. Hem T hücre
anormallikleri hem de γ-globülin eksikliklerini içeren, çeşitli immün yetmezlikleri olan
hastalarda, uzamış ve daha ciddi infeksiyonlar vardır. Özellikle AIDS’li hastalarda
CD4+ hücre sayısı immun sistemin mukoza yüzeyinde Cryptosporidium infeksiyonunu
temizleme yeteneği için en iyi göstergedir. CD4+ hücre sayısı 180 hücre ∕mm³’ten
yüksek olan kişilerde infeksiyon spontan temizlenebilirken, 180’den az olanlarda %87
oranında persistan hastalık oluşur. CD4+ hücre sayısının 50 hücre∕mm³’ün altında
olduğu durumlarda ölüm riski vardır25,36.Yaşlı hayvanların, gençlere oranla,
kriptosporidyoza dirençli olduğu bilinmekte ve bu durumun önceden geçirilen
infeksiyonun verdiği bağışıklıkla ilgili olduğu, fakat yaşlanma sonucu bu direncin de
11
gelişebildiği bildirilmektedir. Kazanılmış immünite, reinfeksiyonu önleyebilir ve primer
infeksiyonu sınırlar ama koruma mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır19, 34, 36.
Cryptosporidium parvum ile süt emen fare, keme, pamuk kemesi, kobay ve
hamsterlerde ağızdan ookist verilince ağır enfeksiyon olduğu halde bu hayvanların
erişkinlerinde ya infeksiyon yerleşememekte veya hafif bir kriptosporidyoz olmaktadır.
Timüssüz süt emen farelerde, Cryptosporidium parvum infeksiyonu sürgüne neden
olmakta ve ölünceye kadar ookist saçtıkları halde normal kardeşleri sürgüne tutulmakta
ve ancak 21-30 gün ookist çıkarmaktadırlar. Bu durum insanda da vardır. AIDS
olgularında infeksiyon süregen ve öldürücü mide-bağırsak, karaciğer ve solunum yolu
hastalığına neden olduğu halde bağışık yanıtı normal olanlarda hastalık 1-2 hafta
sürmektedir. Ayrıca, normal T lenfositli, fakat hipogammaglobülinlerde de öldürücü
infeksiyon gelişebilmektedir. Bundan dolayı hastalıktan iyileşmede bağırsakta A ve G
immunoglobulinleri ve hücre aracılığıyla olan bağışıklığın ortaklaşa etkisi kabul
edilmektedir19.
2.8. KRİPTOSPORİDYOZ OLGULARUNDA KLİNİK TANI
Enterik kriptosporidyoz, hasta populasyonunda en sık rastlanan klinik
görünümdür. Ayrıca immunkompromize hastalarda Cryptosporidium parvuma’a bağlı
kolesistit veya solunum sistemi infeksiyonlar olabilir. Belirtisiz infeksiyon da
bildirilmiştir36.
2.8.1. Enterik Kriptosporidyoz: Ookistlerin alımından bulguların başlamasına kadar
ortalama 5-7 gün geçer. Bulgular immunkompetan ve immunkompromize hastalarda
benzerdir ama kompromize hastalarda uzamakta ve daha ciddi olmaktadır. Hastalar,
ciddi dehidrasyona yol açan, günde 17 litreye varabilen değişik miktarlarda sulu
ishalden yakınırlar. Karında kramplar, kırıklık, hafif ateş ve iştahsızlık sıklıkla bildirilir.
Bulantı, kusma, baş ağrısı, kilo kaybı ve kabızlık da gelişebilir. Normal konaklarda
birkaç ayda sonlanan olgular bildirilmiş olmakla beraber, immunkompetan konaklarda
semptomlar genellikle kendini sınırlar, 5-14 günde sonlanır. Ookistler, bulguların
düzelmesinden sonra iki hafta daha dışkıda bulunabilir. Dışkı örneklerinde genellikle
eritrosit, lökosit bulunmaz, mukus olabilir5, 16, 19, 36.
12
2.8.2.Kolesistit: Kriptosporidyozlu AIDS’li hastaların %10’unda kolesistit ortaya çıkar.
Kriptosporidya kolesistiti şimdiye kadar sadece AIDS’li hastalarda tanımlanmıştır.
Hastalarda ateş, sağ üst kadran ağrısı, ishal ile birlikte veya ishal olmaksızın bulantı ve
kusma vardır36.
2.8.3. Solunum Sistemi İnfeksiyonu: Süregen öksürük, nefes darlığı, bronş ve akciğer
yangısı olarak kendini belli eder. Solunum sistemi bulgusu, Cryptosporidium
parvum’un ishalli hastalığı ile doğrudan ilişkilendirilememiştir19, 36.
2.9. KRİPTOSPORİDYOZ OLGULARINDA LABORATUVAR TANISI
Cryptosporidium infeksiyonun tanısı çoğunlukla dışkı örneklerinde ookistlerin
tanımlanmasıyla yapılmaktadır. Ayrıca balgam, duodenum sıvısı ve bağırsak biyopsi
örneklerinde de araştırılmalıdır. Dışkı taze iken veya %10 formalin veya polivynil alkol
ile tesbit edildikten sonra incelenmelidir. Ookistler, modifiye çinko sülfat santrifüj veya
Scheather’s şeker yüzdürme yöntemleriyle yoğunlaştırılıp faz kontrast mikroskobu ile
incelendiğinde iyi sonuçlar alınmaktadır. Boyama yöntemleri kullanılarak tanısı
konabilmektedir1, 4, 5, 36.
2.9.1. DOĞRUDAN MİKROSKOBİ
2.9.1.1.Modifiye Asit-Fast Boyama: Örnekler modifiye asit-fast yöntemiyle
boyanabilmektedir. Bu boya ile ookistler, kırmızı boyanırken dışkıdaki mayalar yeşil
renkte boyanırlar. Karşıt boya olarak metilen mavisi kullanılırsa, Cryptosporidium
ookistleri kırmızı, mayalar mavi renkte boyanır1,4.
1.
2.9.1.2.Lugollü Preparat İnceleme: Lugollü preparatlarda ise ookist renksiz ve
mayalar kahverengi boyanmış olarak görülür4.
2.9.1.3.Giemsa Boyama: Cryptosporidium, havada kurutulduktan ve metanolde tesbit
edildikten sonra, giemsa boyası ile boyanan dışkı preparatında da aranabilir.
Mikroskobik inceleme deneyimli mikroskopist ve yoğun laboratuar çalışması
gerektirmektedir1,4.
13
2.9.2. SEROLOJİK YÖNTEMLER
Alternatif olarak doğrudan floresan antikor (DFA), enzim immunassay (EIA) ve
benzeri hızlı tanı testleri gibi antijen arama testleri geliştirilmiş ve kullanılmaktadır.
Kriptosporidyoz tanısı için ticari olarak elde edilebilen ürünlerden DFA, IFA, EIA ve
hızlı testler mevcuttur7,43.
2.9.2.1. DFA (Doğrudan Immunfloresans Tekniği): Dışkı örneklerindeki
organizmaların yüzeyindeki antijenlerin immünolojik olarak saptanmasında kullanılan
monoklonal antikor temeline dayalı DFA yöntemi Kriptosporidyoz’un tanısında
günümüzde seçkin bir yöntemdir. Bu yöntemde şüpheli materyaldeki antijenler lam
üzerine yayılarak tesbit edilir ve antijenin üzerine özel işaretli antikorlar konulur.
Şüpheli antijenlerin işaretli özel antikorların oluşmasına neden olmuş olan antijenler
olup olmadığı araştırılır7.
2.9.2.2. EIA (Enzim Immunassay): Serolojik tanı yöntemi olarak 1980’den sonra
kullanılmaya başlanan ELISA yöntemi, bir hemaglutinasyon plağı çukuru içinde
oluşturulan antijen antikor kompleksi üzerine, enzim ile işaretli anti insan IgG, IgM ve
diğer antikorların konması ve substratın eklenmesiyle pozitif olgularda renk
oluşmasının gözlenmesi esasına dayanan ve parazit hastalıklarının tanısında güvenilir ve
klinik araştırmalar sonucu EIA kitlerinin duyarlılığı ve özgüllüğü %93-100 arasında
bildirilmiştir. EIA testlerinin yalancı pozitif sonuçlar vermesi en önemli sorundur7, 39.
2.9.2.3.Hızlı Immunokromatografik Yöntemler: Bu yöntemler kombine antijen
taraması yapabilirler. Bu yöntemin en büyük avantajı, kısa test süresine sahip olması ve
aynı reaksiyonda birden fazla sonuç vermesidir7.
2.9.3. MOLEKÜLER YÖNTEMLER
Moleküler tanı yöntemlerinden Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) analizinden de
Cryptosporidium tanısında faydalanılır. Bunun için immun sistemi baskılanmış hastalar,
yüksek riskli kişiler veya hayvanlardan ookist ile kontamine olmuş dışkı örnekleri
seçilir. Bu örneklerden ookistler temizlenir ve onların DNA’ ları çıkartılır. Bu DNA’lar,
14
PZR analizi kullanarak RNA’ nın 18s’lik gen bölgesindeki Cryptosporidium türlerini
tanımlamak için kullanılır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) tanıyı doğrulamak ve tür
ayrımı yapılabilmesi için bir basamak olarak son yıllarda giderek daha fazla kullanılan
bir yöntem olmuştur36, 52, 53.
2.9.4. KÜLTÜR YÜNTEMLERİ
Cryptosporidium’un konak hücre ortamındaki gelişimi ilk olarak 2004 yılında
tanımlanmıştır. Bu da Cryptosporidium araştırmalarında birçok görüşü
kolaylaştırabilecek önemli bir adım olmuştur. Mevcut konak hücre kültürlerinde
parazitin tüm evrim dönemlerini görmek mümkündür; ancak çok küçük boyutlarda
olduğu için yapısının tanımlanması zordur. Kültürler, 37 °C’de ve %5’lik
karbondioksitli ortamda inkübasyona bırakılır ve 48 veya 72 saat sonra alınır. Çeşitli
floresan boyama yöntemleri işlemlerinde 37°C’de 6 gün inkübe edilir54.
2.10. TEDAVİSİ
Cryptosporidium’ a karşı henüz etkili bir tedavi bulunmadığı için hastalardaki
infeksiyon süregenleşerek yaşamı tehdit edebilmektedir10, 37.
2.10.1. İmmun Sistemi Sağlam Kişilerde Tedavi
İmmun sistemi sağlam kişilerde infeksiyon genellikle ağır seyretmez ve 1-2 hafta
içerisinde kendiliğinden geçer. Dehidratasyon tablosu durumunda sıvı ve elektrolit
kaybını karşılamak tedavi için yeterlidir. Bu grup olguların çoğunda başka bir tedaviye
gerek yoktur10, 35.
2.10.2. İmmun Sistemi Baskılanmışlarda Tedavi
• İmmun sistemi baskılanmış hastalarda daha fazla oranda sıvı, elektrolit, kalori,
yağ, karbonhidrat ve amino asit replasmin yanı sıra ilaç tedavisine de
başlanmalıdır.
15
• İmmunsuprese ilaç uygulanan hastalarda (kanser, transplantasyon tedavileri) bu
tedavilere ara verilmelidir.
• Özellikle AIDS’li hastalarda CD4 hücre sayısı 200/mm³’ün altına düştüğünde
Kriptosporidyoz yaşamı tehdit edebilmektedir. Bu gibi durumlarda
Kriptosporidyoz için tedavi uygulanmadan önce antiretroviral tedavilerle CD4
sayısının yükseltilmesi gereklidir10.
İmmun supresif hasta grubunda temelde kullanılabilecek ilaçlar şunlardır:
İmmun sistemi düzenleyiciler (İnterlökin 2, bovin transfer faktör, hiperimmun
kolostrum), antimikrobikler (paramomisin, spiramisin, nitazoksanid, roksitromisin,
letrazuril, azitromycin, lasalocid, maduramycin, aprinocid) ve antidiyareikler (morfin
sülfat, somostain analogları, difenoksilat) tedavi amaçlı kullanılabilir10.
2.11. KORUNMA
İnsan ve hayvan dışkısındaki ookistlerin çevreye yayılması önlenmelidir.
Ookistlerin oda sıcaklığında 2-6 ay kadar canlı kaldıkları ve 65°C’nin üstündeki suda
30 dakikada, hangi yükseklikte olursa olsun kaynayan suda 1 dakikada öldükleri
unutulmamalıdır. Her ne kadar 20°C’nin altındaki sularda 30 dakikada ookistlerin
öldüğü bildirilmişse de, son bilgiler ookistlerin donmaya zannedildiğinden daha dirençli
olduğudur. %5.25 sodyum hipokloritli çamaşır suyunda 30 dakikada ölürler; fakat 5
misli sulandırılmış çamaşır suyu buz banyosunda 12 dakikada bozulmamaktadır. İçme
sularının rutin klorlanması yeterli olmaz4, 5, 19, 36.
Hijyen koşullarını düzeltilmesi, en çok insandan insana bulaşmayı, aynı zamanda
hayvandan insana bulaşmayı azaltmaktadır; çünkü ev içi bulaşma ikincil olguların
%50’sinden sorumludur. Tuvaleti kullandıktan sonra ve ishalli hayvanlara dokunduktan
sonra eller iyice yıkanmalıdır. İshalli kişiler herhangi bir eğlence suyuna girmemelidir.
Kontamine olmuş suların yutulmasından kaçınılmalıdır. Yüzme havuzları güvenlik için
sürekli kontrol edilmelidir. Uluslararası seyahat sırasında yiyecek ve içeceklerin
güvenilirliğine dikkat edilmelidir. Besinler iyi pişirilmeli ve sular klorlandıktan sonra
kullanılmalıdır. Immun sistemi baskılanmış kişilerin infeksiyona yakalanma riskini
azaltmak için içme sularını kaynatmaları önerilir. Riskli cinsel ilişkiden kaçınılmalı
veya önlem alınmalıdır36, 38, 43.
16
3.GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. GEREÇLER
1- Cihazlar:
• ELISA yıkayıcı
• ELISA okuyucu
2- İshalli dışkı örnekleri: Sağlık Bakanlığı Adana Numune Araştırma Hastanesi
Mikrobiyoloji Laboratuvarı’na ve Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı
Hastanesi’ne bağlı kliniklerden Parazitoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı’na başvuran
hastalardan alındı.
3- Kimyasal maddeler:
• Sülfürik Asit
• Metil Alkol
4- Boyalar:
• Karbol fuksin
• Metilen mavisi
• Lugol
5- ELİSA Test Kiti
6- Diğerleri:
• Plastik kapaklı dışkı kapları
• Kürdan, lam, lamel
3.2. ÖRNEKLERİN TOPLANMASI
Ekim 2007-Temmuz 2008 tarihleri arasında Sağlık Bakanlığı Adana Numune
Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı’na ishal şikayetiyle başvuran
kişilerin dışkı örnekleri ağzı kapaklı kaplara alındı, Ç.Ü. Parazitoloji Anabilim Dalı
laboratuvarına getirildi. Boyama için preparatlar hazırlandıktan sonra, kalan dışkı
örnekleri ELISA çalışılması için ependorf tüplerine alındı ve -20°C’de saklanması
için derin dondurucuya kaldırıldı. Aynı işlemler, Ç.Ü. Tıp Fakültesi Balcalı
17
Hastanesi’ne bağlı kliniklerden Parazitoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı’na ishal
nedeni ile başvuran kişilerin ishalli dışkı örneklerine de uygulandı.
3.3. YÖNTEMLER
Bu çalışma, Sağlık Bakanlığı Adana Numune Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji
Laboratuvarı ve Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi’ne bağlı
kliniklerden Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuvarına ishal şikayetiyle gelen üç farklı
yaş grubundan oluşan toplam 154 ishalli kişiden alınan dışkı örnekleri üzerinde yapıldı.
Çalışmadaki grupların kadın-erkek oranları ve yaş ortalamaları Çizelge-1’de verilmiştir.
Çalışmada, 1. grup 0-12 yaş grubu, 2. grup 13-30 yaş grubu ve 3. grup 30 yaş
üstü kişilerden oluşturuldu.
Çizelge 1. Çalışma gruplarındaki kadın ve erkek oranları
Kadın Erkek Genel Toplam
0-12 yaş 37 43 80
13-30 yaş 12 14 26
30 yaş üstü 25 23 48
Hastalar hakkında gerekli bilgiler (kimlik ve klinik bilgiler) alındıktan sonra
ishalli dışkı örnekleri su sızdırmayan kapaklı plastik kaplara alınarak laboratuvara
getirildi. Bekletilmeden her dışkı örneğinden;
1-Makroskobik inceleme (renk, koku, kıvam, kan, mukus)
2- Fizyolojik tuzlu su ve lugol kullanılarak lam lamel arası preparat yapılarak
Parazitolojik olarak incelendi..
3-Yayma preparat hazırlanarak havada kurutuldu, metil alkol ile tespit edildi,
modifiye asit-fast boyası ile boyandı.
18
3.3.1. Modifiye Asit- Fast Boyama Yöntemi
3.3.1.1. Gerekli Eriyikler:
1- Kinyoun Karbol fuksin eriyiği:
• Bazik fuksin 4 gr
• Fenol (kristalize) 8 gr
• Alkol (%95) 20 ml
• Damıtık su 100 ml
2- Asit Alkol eriyiği:
• Sülfürik asit 1 ml
• Etil alkol 99 ml
3-Malaşit Yeşili:
• Malaşit Yeşili 4 gr
• Alkol %90 50 ml
4-Metilen Mavisi:
• Metilen mavisi 0.3 gr
• Damıtık su 100 ml
3.3.1.2. Boyama Yöntemi
a. Yayma yapılan ve havada kurutulan preparatlar metil alkol ile 3
dakika tespit edildi. Sonra preparatların üzerini kaplayacak şekilde
Kinyoun’un Karbol fuksin eriyiği konuldu. Isıtılmaksızın 8-10 dakika
boyandı.
b. 3-5 saniye çeşme suyunda yıkandı.
c. % 1’lik sülfürik asit ile dekolore edildi. Çeşme suyuyla yıkandı.
d. Metilen mavisi ile 1 dakika boyandı.
e. Çeşme suyu ile yıkandı ve kurutuldu.
f. Mikroskopta X40, X100 büyütmeli objektiflerde incelendi.
Cryptosporidium ookistleri mavi zemin üzerinde pembe-kırmızı renkte görüldü.
19
Şekil.5. Modifiye asit- fast boyama sonucu ookistlerin mikroskobik görüntüsü (X100)
3.3.2. Parazitolojik İnceleme Yöntemi
Su sızdırmayan kapaklı plastik kaplara alınan taze dışkı örneklerinden öncelik
sırasıyla:
1-Makroskop incelemesi (renk, koku, kıvam, kan, mukus).
2- Fizyolojik tuzlu su ve lugollü lam lamel arası preparat yapılarak bağırsak
parazitleri yönünden incelendi.
3- Aynı zamanda bir yayma preparat yapılarak metil alkol ile tespit edildi,
modifiye asit-fast boyama yapılarak Cryptosporidium yönünden incelendi.
20
3.3.3. ELISA Testi
Şekil.6. Cryptosporidim Microwell ELISA Kiti
Örneklerin değerlendirilmesinde Cryptosporidium sp. antijenlerini belirlemeye
yönelik Microwell ELISA kiti kullanıldı. ELISA çalışması üretici firmanın önerdiği
biçimde uygulandı.
3.3.3.1. Örneğin Hazırlanması: Çalışma zamanına kadar -20°C’de saklanan dışkı
örnekleri oda ısısına getirildi. Bir ependorf tüpü içerisine yaklaşık 1:4 (1gr veya bezelye
büyüklüğünde dışkı örneğine 3 ml dilusyon solüsyonu ) oranında olacak şekilde yeterli
miktarda dilusyon solüsyonu eklendi ve vortekslenerek üstte toplanan sıvı kısım alındı
ve ELISA testi için kullanıldı.
3.3.3.2. Yıkama Solüsyonunun Hazırlanması: Bir şişe (25 ml) konsantre yıkama
solüsyonu, içerisinde 425 ml damıtık su bulunan dar bir şişeye eklendi.
21
3.3.3.3. Yöntemi
1-İstenilen sayıda kuyucuk hazırlandı (pozitif ve negatif kuyucuklar için fazladan iki
kuyucuk) ve plağa yerleştirildi.
2- 1. kuyucuğa 2 damla (yaklaşık 100 µl ) negatif kontrol, 2. kuyucuğa 2 damla pozitif
kontrol eklendi.
3-Her test kuyucuğuna 2’şer damla hazırlanan dışkı örneğinden eklendi.
4- Oda sıcaklığında (15-25°C) 30 dakika inkübasyona bırakıldı ve sonra yıkama işlemi
yapıldı (Yıkama işlemi 3 defa her bir kuyucuğun taşana kadar doldurulup
boşaltılmasıyla yapıldı).
5- Her kuyucuğa 2’şer damla Reagent 1 (mavi solüsyon) eklendi.
6- 5 dakika inkübasyona bırakıldı, sonra yıkandı.
7- Her kuyucuğa 2’şer damla Reagent 2 (kırmızı solüsyon) eklendi.
8- 5 dakika inkübasyona bırakıldı, sonra yıkandı.
9- Her kuyucuğa 2’şer damla Kromojen eklendi.
10-5 dakika inkübasyona bırakıldı.
11- Her kuyucuğa 2’şer damla Stop (durdurma) solüsyonu eklendi. İşaret parmağı ile
plağın yan tarafına hafifçe vurarak kuyucukların karışması sağlandı.
12- Havaya karşı 450 nm’de ELISA okuyucusunda okundu.
22
4.BULGULAR
Çalışmamızda, toplam 154 dışkı örneğinin 8’inde (%5.19) modifiye asit-fast
boyama yöntemi ile Cryptosporidium sp.’ye ait ookistler görüldü. Mikroskop altında
tespit edilen bu 8 örnekte Cryptosporidium ookislerinin yoğunluğu örnekler arasında
farklılık gösterdi.
Çizelge 2. Modifiye Asit-Fast Boyama Yöntemi ile Cryptosporidium 0okistlerinin Saptandığı Hastaların
Gruplara Göre Dağılımı
Modifiye Asit-Fast Boyama (+)
0-12 yaş 8
13-30 yaş -
30 yaş üstü -
Toplam 8
(1000 büyütme, modifiye asit-fast boyama)
Şekil.7.Cryptosporidium sp.’nin ookistlerinin modifiye asit-fast boyamadaki görünümü
23
Lugol ile incelenen preparatların sadece 2’sinnde Cryptosporidium sp.’ye ait
ookistler tespit edildi. Ayrıca inceleme yapılan örneklerde 11 tane Giardia intestinalis,
5 tane Entamoeba coli ve 10 tane Blastocystis hominis gibi bağırsak protozoonları da
görüldü (Çizelge 3).
Çizelge 3. Lugollü Preparatlarda Görülen Protozoon Türlerinin Dağılımı
ELISA yöntemi ile toplam 154 dışkı örneğinin 37’sinde Cryptosporidium sp.
antijeni tespit edildi. ELISA test kiti prosedürüne göre pozitif ve negatif kontrol
kullanılarak uygulanan yöntem ile çalışılan örneklerin bulunduğu plak ELISA
okuyucusunda havaya karşı 450 nm’de okunduktan sonra elde edilen değerlerden Cut
off 0.500 OD ve bu değerin üstü pozitif olarak değerlendirildi. Bu pozitif olguların 25’i
0-12 yaş grubunda, 4’ü 13-30 yaş grubunda ve 8’i de 30 yaş üstündeki grupta olduğu
tespit edildi. Cryptosporidium sp. antijenlerinin dağılımı yaş gruplarına göre sırasıyla
%.16.23, %2.59 ve %5.19 olarak belirlendi (Çizelge 4).
Cryptosporidium sp. 2 % 1.29
Giardia intestinalis 11 % 7.14
Entamoeba coli 5 %3.24
Blastocystis hominis 10 % 6.49
24
Şekil.8. ELISA plağında pozitif ve negatif kuyuların görünümü (ilk 96 hastanın sonucu)
25
Şekil.9. ELISA plağında pozitif ve negatif kuyuların görünümü (Son 58 hastanın sonucu)
Çizelge 4. Cryptosporidium sp. ELISA Antijen Testinin Pozitifliğinin Yaş Gruplarına Göre Dağılımı
Yaş aralığı Genel Toplam (%)
0-12 yaş 25 (%16.23)
13-30 yaş 4 (%2.59)
30 yaş üstü 8 (%5.19)
Toplam 37 (%24.02)
26
Çizelge 5. Mikroskobi ile ELISA Sonuçlarının Karşılaştırılması
MİKROSKOBİ
pozitif
MİKROSKOBİ
negatif
TOPLAM
ELISA pozitif 8 29 37
ELISA negatif 0 117 117
TOPLAM 8 146 154
ELISA Testinin Duyarlılığı: 8/(8+0)x100=100
ELISA Testinin Özgüllüğü: 117/(29+117)=80.1
Mikroskobik inceleme ile ELISA yöntemi karşılaştırıldığında ELISA’nın
duyarlılığı %100, özgüllüğü %80.1 olarak saptanmıştır.
27
5.TARTIŞMA
Her geçen yıl, gerek bağışıklık sistemi baskılanmış olguların sayısındaki artış,
gerekse bağışıklık sistemi sağlam kişilerde büyük salgınların saptanması,
Kriptosporidyoz’un önemini arttırmaktadır8.
Cryptosporidium parvum’un dünyada, özellikle gelişmekte olan ülkelerde,
insanlarda ishale neden olan en fazla yaygın olan üç patojenden biri olduğu
düşünülmektedir36, 40.
Börekçi ve arkadaşlarının9 Mersin’de yaptıkları çalışmada, bir gecekondu
mahallesinde yaşayan ve rastgele örnekleme yöntemi ile seçilen ailelerde
Cryptosporidium prevalansını belirlemek amacıyla ishal şikayeti bulunmayan toplam 76
aileyi (466 kişi) çalışmaya almışlar. Örnek vermeyi kabul eden 361 kişinin dışkı
örneklerini modifiye asit-fast boyama yöntemi ile boyayarak ışık mikroskobunda
incelemişler ve 76 ailenin dokuzunda (%11.8), en az bir kişide Cryptosporidium
ookistleri görmüşlerdir.
Michel ve arkadaşlarının44 Mısır’da yaptıkları çalışmalarında modifiye asit-fast
boyama ve ELISA’ya karşı co-aglutinasyon metodunun daha üstün olduğunu
bildirmişlerdir.
Jayalakshmi ve arkadaşları28 Hindistan’da yaptıkları bir çalışmada, ishali olan 89
HIV’li hastanın dışkı örneklerini ELISA ve modifiye asit-fast boyama yöntemleriyle
incelemişler ve 11 (%12.4) örnekte pozitif sonuç elde etmişlerdir. ELISA testinin
duyarlılığını %99.9 ve özgüllüğünü %98.7 olarak bulmuşlardır. Kriptosporidyoz üzerine
yapılan geniş çaplı çalışmalarda, basit, hızlı ve güvenilir sonuçlar veren ELISA’nın
rutin çalışmalarda kullanılmasının faydalı olacağını bildirmişlerdir.
Çalışmamızda ise ELISA ile boyalı preparatların mikroskobik inceleme
yöntemlerinin her ikisi bir arada uygulandığı durumda ELISA testinde duyarlılığın
%100, özgüllüğün %80.1 olduğu saptandı (Çizelge 5). Sonuçlarımızda, Jayalakshmi ve
arkadaşlarının çalışmasından farklı olan olgularımızın hiç birisinde HIV pozitifliği
bulunmayışı idi. Bu da göstermiştir ki özellikle çocuk populasyonunda HIV pozitifliği
bulunmasa dahi Cryptosporidium sp. ookistlerinin saptanma olasılığı yüksek
olabilmektedir ve Cryptosporidium sp. mutlaka hatırda tutulması gerekmektedir.
Kehl ve arkadaşları30 ABD’de yaptıkları bir çalışmada, iki ELISA yöntemi, DFA,
Asit-Fast boyama yöntemlerini Cryptosporidium ookistlerini saptamak amacıyla
28
kullanmışlardır. 129 dışkı örneği incelenerek 55 örnekte pozitif sonuç elde edilirken 74
örnekte ookist saptanamamıştır. ELISA yönteminin duyarlılığının %94.5, asit-fast
boyama ve DFA birlikte kullanıldığında ise duyarlılığın %96.4 olduğunu saptamışlardır.
Tek başına asit-fast boyamada tanı koymak zor olabilir. Boyama ile DFA yönteminin
birlikte kullanıldığı durumlarda ELISA yöntemine tercih edilebildiği bildirilmiştir.
El Shazly ve arkadaşlarının29 Mısır’da yaptıkları bir çalışmada, ishalli 1050
çocuğun 90’ında modifiye asit-fast boyama ile ookist saptanırken ELISA ile bu sayı
100’ü bulmuştur. Çalışmamızda ise boyama yöntemi ile 8 olguda pozitiflik saptanırken
ELISA ile 37 olguda pozitiflik saptanmıştır (Çizelge 5).
Rosenblatt ve arkadaşları31, ABD’de Mayo Kliniği’ne başvuran hastalardan temin
ettikleri 296 ishalli dışkı örneğinin 100 tanesinde ELISA ve IFA yöntemleriyle
Cryptosporidium sp. olduğunu saptamışlardır ve ELISA’nın duyarlılığının %93,
özgüllüğünün ise %99 olduğunu bildirmişlerdir.
Baveja45, Delhi Hastanesinde yaptığı çalışmada, 216 dışkı örneğinde
Cryptosporidium’u saptamak amacıyla modifiye asit-fast ve ELISA yöntemlerini
kullanmıştır. Cryptosporidium sp.’yi saptamak için altın standart mikroskobik inceleme
gibi ELISA’nın duyarlılığının %100, özgüllüğünün ise %99.7 olduğunu bildirmiştir.
Weitz32, Şili’de yaptığı çalışmada, akut ishalli 105 dışkı örneğinde
Cryptosporidium’u, ELISA yöntemi ile araştırmış ve bunların 58’inde pozitiflik
saptamıştır.
Su kaynaklı Cryptosporidium sp. bulaşması, en önemli bulaşma yolu olarak
düşünülmektedir ve en büyük salgınlar bu yol ile oluşmuştur. Su ile bulaşmanın olduğu
ilk olgular 1983’te Finlandiya’dan Rusya’nın St. Petersburg kentine seyahat eden ve
ishali bulunan Finlandiyalı kişilerde tanımlanmıştır36.
Akyön ve arkadaşları41, Ankara’da 12 yaşın altındaki çocuklarda Kriptosporidyoz
yaygınlığını saptamak amacıyla, IFA, DFA, Giemsa boyama ve modifiye asit-fast
boyama ile ishalli 200 çocuktan alınan dışkı örnekleri ve sağlıklı çocuklardan alınan 50
dışkı örneğini incelemişlerdir ve 7 çocukta (%3.5) Cryptosporidium ookistini
saptamışlardır. Kontrol gruptaki örneklerin hiçbirinde parazite rastlanmamıştır. Dolayısı
ile ishal öyküsü bulunmayan olgularda parazite rastlamak çok mümkün olmamaktadır
ve Kriptosporidyoz klinikte ishal oluşturmaktadır. Olgularımız bu nedenden dolayı ishal
öyküsü bulunanlar arasından seçilmiştir (Çizelge 1).
Van’da yapılan diğer bir çalışmada ise Çiçek ve arkadaşları42 Van Belediye
Mezbahasında çalışan 87 işçinin dışkı örnekleri ve kesimi yapılan 167 koyun, 56 keçi ve
29
86 sığır olmak üzere toplam 309 hayvanın dışkı örneklerini Cryptosporidium sp.
ookistleri yönünden incelemişlerdir. Bunun için RIDA Quik Cryptosporidium Strip
Testi (R-Biopharm, Almanya) ve modifiye asit-fast boyama yöntemlerini
kullanmışlardır. Strip testiyle pozitif bulunan dışkı örnekleri ELISA yöntemi ile
doğrulanmıştır. Koyunların 22’sinde (%13.17), keçilerin 6’sında (%10.71), sığırların
7’sinde (%8.13), işçilerin ise 1’inde (%1.14) Cryptosporidium sp. ookistleri
saptanmıştır (42). Çalışmamızda da mikroskobi yönteminde pozitif bulduğumuz
sonuçlar ELISA yöntemi ile doğrulanmıştır (Çizelge 5).
Otağ ve arkadaşları46, Mersin’de dört ilköğretim okulunda, yaşları 8-12 olan 72
çocuktan toplanan dışkı örneklerini modifiye asit-fast ve Auromin O boyama
yöntemleriyle incelemişler ve hiçbir belirtisi olmayan 4 çocukta Cryptosporidium
ookistlerini saptamışlardır.
Ungar47, çalışmasında Kriptosporidyozlu 62 hastanın 51’inde ELISA pozitiflik
saptamış, Cryptosporidium infeksiyonu belirgin olmayan 182 örneğin ise 176’sında
ELISA sonucunu negatif bulmuştur. Sonuçta ELISA yönteminin duyarlılığının %89.5,
özgüllüğünün ise %96.7 olduğunu bildirmiştir.
Direkel ve arkadaşları48, yaptıkları çalışmalarında Malatya Huzurevi sakinleri ile
İnönü Üniversitesi Turgut Özal Tıp Merkezi’ne başvuran ishalli toplam 92 kişiden
aldıkları dışkı örneklerinde, ELISA yöntemi ile Cryptosporidium parvum
koproantijenlerini ve modifiye asit-fast boyama yöntemi ile ookistlerini araştırmışlardır.
Toplam 5 örnekte hem ELISA hem de boyama yöntemi ile pozitiflik saptamışlardır.
ELISA yönteminin duyarlılığını ve özgüllüğünü bu çalışmada %100 olarak
saptamışlardır.
Yılmaz ve arkadaşları49, Van’da yaptıkları çalışmalarında yaşları 0-15 arasında
olan, 870’i kız, 1130’u erkek olan ishalli toplam 2000 çocuktan dışkı örnekleri temin
etmişler ve aynı yaşlarda rastgele seçilen 100 çocuğu da kontrol grubu olarak
kullanmışlardır. Bunları modifiye asit-fast boyama ve ELISA yöntemiyle incelemişler.
Sonuşta ELISA ile 2000 çocuğun 97’sinde (%4.9), boyama ile sadece 39’unda (%1.95)
ookistleri görmüşler. Kontrol grubunda her iki yöntemle de parazit saptanmadığını
bildirmişledir.
Doğan ve arkadaşları50, Eskişehir’de yaptıkları çalışmalarında, Osmangazi
Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Çocuk Polikliniği’ne başvuran 0-6 yaş arası ishalli
540 çocuk ile yetiştirme yurdunda bir gastroenterit salgını sırasında aynı yaş grubu 67
çocuktan alınan dışkı örnekleri Sheather’in flotasyon tekniğine göre hazırlanarak
30
doğrudan taze inceleme, Gram, Giemsa, Modifiye asit-fast yöntemleri kullanılarak
Cryptosporidium ookistlerinin varlığı ve mevsimsel periyodisitesi yönünden
araştırılmıştır. Toplam 607 örneğin %3.6’sında Cryptosporidium ookistleri
saptamışlardır.
Sönmez ve arkadaşları51, çalışmalarında 80 dışkı örneğini Kriptosporidyoz
yönünden modifiye asit-fast boyama yöntemi ve dışkıda Cryptosporidium sp.
antijenlerini aramaya yönelik hazırlanmış ELISA (r-biopharm, Germany) ile
incelemişler ve modifiye asit-fast ile 3 örnekte (%3.75) Cryptosporidium sp. ookistleri,
ELISA ile 5 örnekte (%6.25) Cryptosporidium sp. özgül antijenleri saptamışlardır.
Bizim yapmış olduğumuz çalışma, farklı ülkelerde yapılan diğer çalışmalarla
karşılaştırıldığında birçok çalışmada elde edilen görülme sıklığı yüzdesiyle uyumlu
sonuçlar bulunurken, ülkemizde yapılan çalışmaların görülme sıklığı yüzdesinden
yüksek olduğu görülmüştür (Çizelge 6-7).
Çizelge.6. Bazı ülkelerde Cryptosporidium ile ilgili yapılan çalışmalar
Araştırıcı
kaynak
Ülke, Şehir Grup Sayı Prevalans %
Jayalakshmi ve
ark.(28)
Hindistan İshalli HIV(+) 89 12.4
Kehl ve ark.
(30)
ABD İshalsiz kişiler 129 42.63
El Shazly ve
ark.(29)
Mısır İshalli çocuklar 1050 9.52
Rosenblatt ve
ark.(31)
ABD İshalli çocuklar 296 33.78
Weitz ve
ark.(32)
ABD İshalli kişiler 105 55.23
31
Çizelge.7.Ülkemizde Cryptosporidium ile ilgili yapılan bazı çalışmalar
Araştırıcı
kaynak
Şehir Grup Sayı Prevalans %
Börekçi ve
ark.(9)
Mersin İshalsiz kişiler 361 11.8
Akyön ve
ark.(41)
Ankara İshalli kişiler 200 3.5
Direkel ve
ark.(48)
Malatya İshalli kişiler 92 5.93
Doğanve ark
(50)
Eskişehir İshalli çocuklar 607 3.6
Ayrıca yaptığımız her iki yöntemin sonuçlarına baktığımızda 0-12 yaş
grubundaki kişilerde pozitiflik değerlerin diğer gruplara göre sayıların daha yüksek
olduğu görüldü. Modifiye asit-fast ile sadece bu grupta 8 pozitif sonuç bulunurken,
ELISA ile aynı grupta %16.23, 13-30 yaş grubunda olanlarda daha düşük yani %2.59
ve 30 yaş üstü olan grupta ise %5.19 oranında görülmüştür (Çizelge 2- 4).
Çalışmamızda mikroskobik incelemede pozitif olan tüm olgular ELISA ile tespit
edilebilmiştir.
32
6. SONUÇ VE ÖNERİLER
Dışkıda özgül antijen arayan ELISA yönteminin maliyeti yüksek olmasına
rağmen etkensel tanı yöntemlerindeki zorluklara yardımcı olacağı sonucu çalışmamızda
elde edilmiştir.
Çalışmamız, özellikle çocuk populasyonunda (0-12 yaş arası) HIV pozitifliği
bulunmasa dahi Cryptosporidium sp. ookistlerinin saptanma olasılığının yüksek
olduğunu göstermiştir ve Cryptosporidium sp.’nin mutlaka hatırda tutulması gerektiğini
ortaya koymuştur. Bunun yanında, günümüz koşullarında tek başına mikroskobi bakı
tanı için yetersiz kalmakta, ikinci bir doğrulama testi olarak ELISA yönteminin rutinde
kullanılmasının çok uygun olacağı kanısına varılmıştır.
33
7.KAYNAKLAR
1. Markel EK, Voge M, John DT. Medical Parasitology. Sixth Edition. W. B. Saunders Company,
London, 1986:72-75.
2. Dirim D, Turgay N, Alkan MZ. Bir Cryptosporidiosis olgusunun Kinyoun Asit Fast Boyası ve PCR
ile Takibi. Ege Üniversitesi, Bornova, İzmir, 2003:328.
3. Willke TA, Söyletir G, Doğanay M. İnfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi. 2002:1919-1920
4. Özcan K. Tıbbi Parazitoloji Ders ve Laboratuar Notları, Adana, 1998: 77-79.
5.Altıntaş K. Tıbbi Genel Parazitoloji ve Protozooloji. 1997: 167-170.
6. White AC. Infectious Diseases Society of America. Cryptosporidiosis. 2006.
7. www.duzen.com.tr/ artfiles/ parazitoloji Erişim Tarihi: 10.09.2008
8. Özcel MA, Özbel Y, Ak M. Özcel’in Tııbi Parazit Hastalıkları. Tıbbi Parazitoloji Derneği Yayın
No:22 İzmir, 2007: 363-376
9. Börekçi G, Otağ F, Emekdaş G. Mersin’de Bir Gecekondu Mahallesinde Yaşayan Ailelerde
Cryptosporidium Prevalansı. İnfeksiyon Dergisi. 2005:19(1):39-46.
10. Akısü Ç, Korkmaz M. Tıbbi Parazitolojide Tedavi. Ed Özcel MA. Tıbbi Parazitoloji Derneği,Ege
Üniversitesi,Yayın No:20. İzmir, 2005:40-41
11. Hashmey R, Simith NH, Cron S, Graviss EA, Chappell CL, White AC. Cryptosporidiosis in
Houston, Texas. Medicine(Baltimore), 1997; 76(2): 118-139.
12 .Döşkaya M, Dayangaç N, Kuman HA. Cryptosporidium parvum. T Paraziol Derg, 2003; 27(1):64-
70
13. Chacin- Bonilla L. Cryptosporidiosis in humans. Invest Clin 1995;36(4):207-50.
14. Kramer MF, Vesey G, Look NL, Herbert BR, Simpson-Stroot JM, Lim DV. Development of a
Cryptosporidium oocyst assay using an automated fiber optic-based biosensor. Journal of Biological
Engineering, 2007; 1(1):3.
34
15. Clark DP, Sears CL. The Pathogenesis of Cryptosporidiosis. Parasitology Today, 1996; 12(6):221-
222.
16. Saygı G. Temel Tıbbi Parazitoloji. Cumhuriyet Üniversitesi Yayınları, İkinci Baskı, 1998:94-96.
17. Tabak F. Enfeksiyon Hastalıkları. 2. Baskı, İstanbul: Nobel Tıp Kiabevi, 2003:178.
18..Berger SA. Human Parasitic Diseases Sourcebook.. Jones and Barttlett Publishers, 2006:116-121.
19. Unat EK, Yücel A, Atlaş K, Samastı M. Unat’ın Tıp Parazitoloıjisi. 5. Baskı, İstanbul: Cerrahpaşa
Tıp Fakültesi Vakfı Yayınları, 1995: 595-600.
20. http://biology.kenyon.edu.tr Erişim Tarihi: 10.09.2008.
21. Dillingham RA, Lima AA, Guerrant RL. Cryptosporidiosis. Microbes and Infection, 2002; 4(10):
1059-1066.
22. Delibaş SB, Kurugöl Z, Pektaş B, Vardar F, Özen S, Turgay N. Diarrhea Due to Cryptosporidium
in a Hypogammaglobulinemic Child, Acta Parasitologia Turcica, 2001; 25(2):113-114.
23. Çetinkaya F, Cryptosporidium parvum’un Bulaşmasında Su ve Gıdaların Rolü. Uludağ Üniversitesi
Vet. Fak. Der, 2004; 23(1-2-3): 103-109.
24. http://www.epi.state.com.tr Erişim Tarihi: 10.09.2008.
25. Özcel MA, Turgay N, İnci A, Köroğku E. Tıbbi ve Veteriner İmmunoparazitoloji. Türkiye
Parazitoloji Derneği Yayınları No:21, 2007:93-97.
26. Felek S. Sistemik İnfeksiyon Hastalıkları. Nobel Tıp Kitabevleri, 1997: 182.
27. Ash LR, Orihel TC. Atlas of Human Parasitology. Third Edition, Chicago: ASCP Pres, 1990:94-95.
28. Jayalakshmi J, Appalaraju B, Mahadevan K. Evaluation of an Enzyme- Linked İmmunoassay for
the Detection of Cryptosporidium Antigen in Fecal Specimens of HIV∕AIDS Patients. İndian J Pathol
Microbiol, 2008; 51(1):137.
29. El Shazly AM, Soltan DM, El-Sheikha HM, Sadek GS, Morsy AT. Correlation of ELISA Copro-
Antigen and Oocysts Count to the Severity of Cryptosporidium parvum in Children. J Egypt Soc
Parasitol, 2007; 37(1):107-20.
35
30. Kehl KS, Cicirello H, Havens PL. Comparison of Four Different Methods for Detection of
Cryptosporidium Species. J Clin Microbiol, 1995; 33(2):416-418.
31. Rosenblatt JE, Sloan LM. Evaluatin of an Enzyme-Linked İmmunosorbent Assay for Detection of
Cryptosporidiumspp. İn Stool Specimens. J Clin Microbiol, 1993; 31(6): 1468-1471.
32. Weitz JC. Detection of Fecal Cryptosporidium parvum Antigens Using an ELISA Teechinique. Rev
Med Chil, 1995; 122(3): 330-333.
33. http:// tipdizini.türkiye klinikleri.com/tr Erişim Tarihi: 18.10.2008.
34. Heywarth MF. Immunology of Giardia and Cryptosporidium infections. J Infect. Dis. 1992;
166:465-472.
35. http:∕∕www.avianbiotech.com∕ Disease∕ Cryptosporidium.htm Erişim Tarihi: 18.10.2008.
36. Wilson WR. Enfeksiyon Hastalıkları Tanı ve Tedavi, Nobel Tıp Kitabevi, 2004:824-827.
37. Tünger Ö, Tünger A. Enfeksiyon Hastalıkları Elkitabı, HYB Basım Yayın, 2007:545-546.
38. Bannister BA, Begg NT, Gillespie SH. İnfectious Desease, Second Edition, Blackwell Science Ltd.,
2007: 183-184.
39. Özcel MA. Tıbbi Parazit Hastalıkları. Türkiye Parazitoloji Derneği, No:2, İzmir, 2007: 55.
40. Current WL, Garcia LS. Cryptosporidiosis. Clin Microbiol Rev. 1991; (4): 225-228.
41. Akyön Y, Ergüven S, Arıkan S, Yurdakök K, Günalp A. Cryptosporidium parvum Prevalans in a
Group of Turkish Children. Turk J Pediatr, 1999; 41(2): 189-196.
42. Çiçek M, Körkoca H, Gül A. Van Belediye Mezbahasında Çalışan İşçilerde ve Kesimi Yapılan
Hayvanlarda Cryptosporidium sp.’nin Araştırılması. Türkiye Parazitol Derg, 2008; 32(1): 8-11.
43.Goldoft MJ, Todd D. Cryptosporidiosis. Epitrens, 2008; 13(7): 1-4.
44. Michel MY, Khalif AM, Ibrahim IR. Detection of Cryptosporidium parvum antigen by Co-
Agglutination Test and ELISA. East Mediter Health J. 2000; 6(5-6): 898-907.
45. Bajeva UK. Acid fast staining versus ELISA for detection of Cryptosporidium in stool. J Commun
Dis, 1998; 30(4): 241-244.
36
46. Otağ F, Aslan G, Emekdaş G, Aydın E, Özkan AT, Ceber K. İnvestigation of Cryptosporidum
oocysts in elemantary school students in Mersin. Türkiye Parazitol Derg, 2007; 31(1): 17-19.
47. Ungar BL. Enzyme-Linked Immunoassay for detection of Cryptosporidium antigens in fecal
specimens. J Clin Microbiol, 1990; 28(11): 2491-2495.
48. Direkel Ş, Özerol İH, Durmaz R. İshalli Hastalarda Cryptosporidum parvum’un ELISA ve Modifiye
Ehrlich-Ziehl-Neelsen Boyama Yöntemleriyle Araştırılması. Mersin Üniv. Sağlık Bilim Derg, 2008;
1(1): 20-25.
49. Yılmaz H, Tas CZ, Çiçek M. Investigation of Cryptosporidiosis by enzyme- linked immunosorbent
assay and microscopy in children with diarrhea. Saudi Med J. 2008; 29(4): 526-529.
50. Doğan N, Akgün Y. İshalli Olgularda Cryptosporidium Ookistlerinin Araştırılması. Türkiye Parazitol
Derg, 1998; 22(3): 243-246.
51.Tamer GS, Gülenç S. ELISA ile Dışkıda Cryptosporidium spp. Antijenlerinin Araştırılması. 14.
Ulusal Parazitoloji Kongresi. Özet Kitabı, İzmir, 2005: 240.
52. Moghaddam DD, Azami M, Salehi R, Salehi M. The identification of Cryptosporidium species by
PCR-RFLP analysis of the 18s RNA gene. International Journal of Infectious Disease, 2008; 12(1):
380-381.
53. Usluca S, Aksoy Ü. İshalli dışkılarda Cryptosporidium sp.’nin saptanmasında mikroskobi ve PCR
yöntemlerinin karşılaştırılması. 15. Ulusal Parazitoloji Kongresi 18-23 Kasım, Kayseri ve Ürgüp,
2007:212-213.
54. Boxell A, Hijjawi N, Monis P, Ryan U. Comparison of various staining methods fort he detection of
Cryptosporidium in cell-free culture. Experimental Parasitology, 2008; 120(1): 67-72.
37
8.ÖZGEÇMİŞ
20.01.1982 yılında Tokat ilinin Almus ilçesine bağlı Akarçay Kasabası’nda
doğdum. İlkokulu, Turhal’da Gazi Osman Paşa İlkokulu’nda, ortaokulu, Cumhuriyet
Ortaokulu’nda ve liseyi Cumhuriyet Lisesi’nde (Yabancı Dil Ağırlıklı) okudum.
Öğrenci Seçme ve Yerleştirme Merkezi’nin 2001 yılında yaptığı üniversite giriş sınavı
sonucunda Çukurova Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü’nde
öğrenim görmeye hak kazandım. Bu bölümden 2005 yılında mezun oldum. Aynı yıl
içerisinde Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü’ne bağlı Parazitoloji
Anabilim Dalı’nda yüksek lisansa başladım ve hala aynı bölümde öğrenimime devam
etmekteyim.
