Sissejuhatus Kromatograafiasse

Sügis 2012

KROMATOGRAAFIA

kromatograafia on meetod, mille abil saab segusid üksikuteks komponentideks lahutada

kromatograafia teostatakse kolonnis, mis on täidetud statsionaarse (liikumatu) faasiga

läbi kolonni voolab mobiilne (liikuv) faas. proovi sisestamisel kolonni jaotuvad proovi komponendid mobiilse ja

statsionaarse faasi vahel ainete üksteisest lahutumine pŏhineb erinevate analüütide erineval

jaotumisel statsionaarse ja mobiilse faasi vahel kromatograafia avastas 1903 a. Tsvett (vene/itaalia päritoluga keemik,

töötas Varssavis, Tartus ja Voronezis. Kaasaegse variandi leiutasid Martin ja Snyge (Nobeli preemia 1953 a.)

kasutamine: 30% kôigist analüüsidest tehakse kromatograafia abil Kromatograafilised meetodid: gaasikromatograafia (gaas/vedelik, gaas/adsorbtsioon) vedelikkromatograafia (vedelik/vedelik, vedelik/adsorbtsioon, ioonvahetus,

eksklusioon, affiinsus, ŏhukese kihi kromatograafia)

Kromatogrammi saamine

Proov lahustatakse mobiilses faasis. Proov viiakse kolonni ühte otsa. Mobiilne faas kannab proovitsooni läbi kolonni. Osakesed jaotuvad palju kordi mobiilse ja statsionaarse faasi vahel. Need proovi komponendid, mis interakteeruvad statsionaarse

faasiga tugevamini väljuvad kolonnist hiljem kui need osakesed, mis interakteeruvad nŏrgemini.

Ideaaljuhul on pärast teatud aja möödumist kŏik proovi komponendid üksteisest lahutunud ja jŏuavad erinevatel ajamomentidel kolonni teise otsa, kus nad detekteeritakse.

Saadud detektorisignaali (analüüsiaja vŏi mobiilse faasi ruumala funktsioonina) nimetatakse kromatogrammiks.

Piigi kuju funktsioon

h tA

et tR

( )( )

2

2

22

Kaks efekti:

1. erinevad ained lahutuvad üksteisest kromatograafilise analüüsi käigus,

2. ainetsoonid laienevad. Piikide laienemine vŏib hävitada lahutuvuse. Lahutuvuse parandamiseks tuleks: muuta selektiivselt migratsiooniaegu suruda ainetsoonide laienemist maha

Põhimõisteid

Kromatograafilise lahutamise pôhiidee: mitmekordne sorbtsioon/desorbtsioon

Mobiilne faas e. eluent Statsionaarne faas e. kolonni täidismaterjal Aine retensiooniruumala; mobiilse faasi ruumala, mis on vajalik

poole aine koguse elueerimiseks kolonnist

Tähiste selgitused

VR - retentsiooniruumalaVm - mobiilse (liikuva) faasi ruumalaVS - statsionaarse (liikumatu) faasi ruumalaK - jaotuskonstant (näitab kuidas aine jaguneb mobiilse ja statsionaarse faasi

vahel)k' - mahtuvusfaktor (näitab aine kontsentratsiooni erinevust mobiilses ja

statsionaarses faasis) - mobiilse ja statsionaarse faasi ruumalade suheCS - aine kontsentratsioon statsionaarses faasisCm - aine kontsentratsioon mobiilses faasisF, u - liikuva faasi kiirustR - aine retentsiooniaeg (aeg, mille jooksul elueerub pool ainest)tm - "surnud aeg" (aeg, mille jooksul elueeruvad ained, mis ei sorbeeru tahkesse

faasi)N -efektiivsus e. teoreetiliste taldrikute arv - kromatograafilise tsooni laienemist näitav tegurH - teoreetilise taldriku kõrgusR - lahutuvus - selektiivsus

Kromatograafia pôhivalemid Retentsiooniaeg tR

tR=tm(1+k')

Lahutuvus R

Rt t

w wR R

2 1

1/21

1/22

RN k

k

4

1

1( )( )

'

'

Efektiivsus N

Nt

wR5541/2

2. ( ) NtR( )

2

Teoreetilise taldriku kõrgus H H = L/N Selektiivsus

t t

t tR m

R m

2

1

Efektiivsus ja selektiivsus

: s u u rN : s u u r

: v ä i k eN : s u u r

: s u u rN : v ä i k e

: v ä i k eN : v ä i k e

Van Deemteri võrrand:

H AB

uC u C u

H dD

uC C u

mobii e statsionaarne

pM

mob st

ln

( ) 2

van Deemteri võrrandi üldkuju

H=A+B/u+(Cm+Cs)u A - aine molekulide teepikkuste erinevus (kapillaarkolonnide korral paraboolne vooluproofil) B - ainetsooni difusiooniline laienemine kolonnis Cm - massivahetus liikuvas faasis Cs - massivahetus liikumatu ja liikuva faasi vahel

Vedelikkromatograafia (HPLC)

HPLC mobiilne faas on vedelik gaasikromatograafia piirid: MW=400, (20% ainetest); vedelikkromatograafia objektid: makromolekulid, ioonsed ühendid,

labiilsed looduslikud ühendid Kromatograafilisi lahutamisprotsessi eesmärk vŏib olla: kvalitatiivne analüüs (ret. aegade vŏrdlus, standardi lisamine) kvantitatiivne analüüs (kalibratsioon) preparatiivne lahutamine (järgneb analüüs teise meetodiga, puhta

aine saamine) Mobiilset faasi vedelikkromatograafias kutsutakse sageli ka eluendiks.

Optimiseerimine

Vedelikromatograafiliste analüüside optimiseerimine taandub sageli ŏige mobiilse faasi leidmisele.

Mobiilse faasi puhul on olulisteks parameetriteks: viskoosus (väiksema viskoossusega solvendid pŏhjustavad kolonnis

väiksemaid rŏhkusid) keemistemperatuur (madala keemistemperatuuriga solventidest on

kergem vabaneda) sobivus detektoriga (madal UV-neelduvus UV detektori puhul, etc.) mürgisus

Eelistatud solvendid:

Solvent keemistC viskoosus UVCut-off heksaan 69 0.31 195 diklorometaan 40 0.44 233 etüülatsetaat 77 0.45 256 kloroform 61 0.57 245 atseetonitriil 82 0.38 190 metanool 65 0.55 205 vesi 100 1.00 <190

Eluendid

Vedelikkromatograafias kasutatavad eluendid on sageli 2 vŏi enama solvendi segu. Eluendi koostis mŏjutab nii analüütide retentsiooniaegu kui selektiivsuskoefitsienti.

Mida suurem on tugevama solvendi kontsentratsioon eluendis, seda kiiremini väljub aine kolonnist.

Selektiivsust saab samuti mŏjutada muutes eluendi koostist. Selektiivsuste erinevuste eest vastutavad: vesiniksidemete teke,

molekulidevahelised interaktsioonid. Kui 2 piigi vaheline selektiivsus on 1 vŏi sellele lähedane suurus,

siis on neid piike vŏimatu vŏi raske teineteisest lahutada. Gradientelueerimine: eluendi koostise muutmine analüüsi käigus.

Kolonnide tüübid

kolonni tüüp sise-diameeter (mm)

pikkus (cm)

proovi kogus (mg)

voolu-kiirus (ml/min)

mikro-kolonnid

1-2 7-30 0.01 0.1

standard- kolonnid

3-5 7-30 0.1 1.0

preparatiivsed kolonnid

5-20 25-50 10.0 10.0

Statsionaarne faas I

Kolonni täidise (statsionaarse faasi) tähtsamad näitajad: Osakeste suurus: 3-20 micronit. Mida väiksem on statsionaarse

faasi osake, seda suurem on efektiivsus, rŏhk kolonnis, lahutuvus. Suurused ei tohiks keskmisest üle 25% erineda.

Osakeste kuju: sfääriline vŏi ebakorrapärane. Efektiivsus ei sŏltu osakeste kujust, aga rŏhk kolonnis sŏltub.

Statsionaarne faas II

Poorsus: osakesed on kas läbinisti poorsed vŏi kaetud poorse kihiga (pellikulaarsed). Pooride d=60-500 Ǻ.

Läbinisti poorsete osakeste juhul on kolonnide mahtuvus suurem, pellikulaarsete osakeste korral on efektiivsused kŏrgemad ja kolonnide läbitavused paremad.

Pind: kolonni retentsiooni ja selektiivsuse määravad liikumatu faasi funktsionaalrühmad. Proovi molekulid interakteeruvad funktsionaalrühmadega vesiniksideme tekkimise, dipool-dipool ja elektrostaatiliste interaktsioonide kaudu.

Kolonnide täidis vŏib olla looduslik (silikageel) vŏi modifitseeritud. Vedelikromatograafia jagatakse kolonni täidiste järgi eriliikidesse.

Erinevatel vedelikkromatograafia kolonnidel on erinev lahutusmehhanism ja rakendusalad.

Sobiva kromatograafia alaliigi (statsionaarse faasi) valik sŏltub konkreetsest proovist

MW<2000Neutraalsed molekulid Nŏrga polaarsusega molekulide puhul kasutatakse pööratud faasi

kromatograafiat, liikuvaks faasiks on vesilahused Keskmise vŏi tugeva polaarsusega molekulide puhul kasutatakse

normaalfaasi kromatograafiat, liikuvaks faasiks on orgaanilised lahustid (n. heksaan)

Ioonid Anioonide puhul kasutatakse anioonvahetuse kromatograafiat vŏi ioon-

paar kromatograafiat. Eluendiks on puhverlahused. Katioonide puhul kasutatakse katioonvahetuse kromatograafiat vŏi ioon-

paar kromatograafiat. Eluendiks on puhverlahused.

MW>2000Kasutatakse geelfiltratsiooni, ja afiinsuskromatograafiat. Vees lahustuvate ainete puhul on eluendiks vesilahused. Vees mittelahustuvate ainete puhul orgaanilised lahustid.

Vedelikkromatograafi ehitus I

Eluendi pumbad: kolb-, süstal-, konstantse gaasirôhu pumbad; rŏhud kuni 8000 psi voolukiirused 0.2-10 ml/min

Dosaatorid

Kolonnid: standard-, väikese diameetriga-, eelkolonnid Eelkolonnid on lühikesed (1-3 cm) ja odavad kolonnid, mis on

täidetud sama statsionaarse faasiga kui vastav analüütiline lahutuskolonn.

Eelkolonnide mŏte on kinni püüda ained, mis pöördumatult adsorbeeruvad antud statsionaarsesse faasi.

Vedelikkromatograafi ehitus II

Detektorid: UV-VIS fotomeetrid (fikseeritav, varieeritav, skaneeritav lainepikkus), fluorestsents, elektrokeemiline, refrakomeetriline, juhtivus, mass-spektromeetriline

Detektori ülesandeks on produtseerida elektriline signaal, mis oleks proportsionaalne proovi kontsentratsiooniga.

Detekteerimispiiriks loetakse kontsentratsiooni, mis annab mürast 3 korda suurema signaali.

Liiga suurtel kontsentratsioonidel muutub sŏltuvus kontsentratsiooni ja detektori signaali vahel mittelineaarseks.

Detektori lineaarne ulatus. Detektori raku ehitus peaks minimiseerima mullide tekkimise

vŏimalikkuse.

Proovi ettevalmistus

Tahked ained tuleb sobivas solvendis lahustada. Parim solvent on eluent ise.

Kontsentreeritud proovid tuleb eelnevalt lahjendada. Mŏnikord on proove vaja eelnevalt puhastada vŏi modifitseerida.

Kolonni valik

kas proov lahustub eluendis, mis sobib antud statsionaarse faasiga, kas analüüdid on ioonsed vŏi neutraalsed ühendid milline on molekulmasside erinevus lahutatavate analüütide vahel Kolonni valik sŏltub proovi struktuurist. Vees lahustuvaid aineid

peaks analüüsima pööratud faasi kromatograafia abil. Ioonide jaoks sobib ioonvahetus- vŏi ioonpaarkromatograafia. Kui proovis sisaldub isomeere vŏi kui aine ei lahustu vees peaks esimene valik olema normaalfaasikromatograafia, jne.

Detektori valik.

Enamus aineid absorbeerib UV kiirgust lainepikkuste vahemikus 190-220 nm. Paljud ained ka kŏrgematel lainepikkustel. Seetŏttu on esimene valik enamasti UV-detektor. Tuleb valida kŏigi huvipakkuvate komponentide jaoks optimaalne lainepikkus.

Kui proovi komponendid fluorestseeruvad ja on vaja määrata väga väikeseid kontsentratsioone tuleks kasutada fluorestsentdetektorit.

Refraktsiooniindeksi detektorit kasutatakse kui ükski teine detektori tüüp ei sobi.

Eluendi valik.

Eluent peaks vŏimaldama saada mŏistlikud retentsiooniajad kŏigi huvipakkuvate analüütide jaoks (k’=1-20).

Kui ükski eluent seda ei vŏimalda, siis tuleb kasutada gradientelueerimist.

Analüüsi optimiseerimine.

Kui lahutuvus (R) on enam kui piisav kŏigi huvipakkuvate proovi komponentide jaoks, siis on otstarbekas analüüsiaega vähendada kasutades lühemat kolonni vŏi suuremat voolukiirust.

Kui lahutus mingite huvipakkuvate komponentide jaoks on ebapiisav tuleks tŏsta efektiivsust (N), vähendades voolukiirust, suurendades kolonni pikkust vŏi kasutades peeneteralisemat täidist.

Kui lahutuvuse puudulikkus on tingitud liiga väikesest selektiivsusest, tuleb muuta eluendi koostist vŏi statsionaarset faasi.

Vedelikkromatograafia erimeetodid

suurt osa lahutamises omab analüüdi vastasmôju mobiilse faasiga lahutamise mehhanismid: vedelik/adsorbtsioon, vedelik/vedelik,

ioon-paar, ioonvahetus, eksklusioon, afiinsus täidiste tüübid: mittepoorsed klaasist kuulikesed, kaetud poorse

kihiga; poorsed osakesed; makropoorsed polümeerid

Normaalfaasi kromatograafia

Lahutamispõhimõte: mittepolaarne eluent/ polaarne statsionaarne

faas

Kolonni täidis: kolonni täidisosakeste (reeglina silikageel) külge on

keemiliselt seotud polaarsed funktsionaalrühmad (näiteks

tsüaanorühmad).

Liikuv faas: orgaaniline lahusti (metanool, atseetonitriil).

Elueerumise järjekord polaarsuse kasvu järgi

Pööratud faasi kromatograafia (reversed phase)

Polaarne mobiilne faas (vesi+modifikaator) ja mittepolaarne statsionaarne faas (C2 - C18)

Mehhanism: polaarsed molekulid lahustuvad paremini eluendis, kui statsionaarses faasis ja elueeruvad varem, kui mittepolaarsed molekulid, mis lahustuvad paremini statsionaarses faasis.

Elueerimise järjekord on "pööratud" vôrreldes normaalse faasiga. Orgaaniliste modifikaatorite (metanool, atsetonitriil,

tetrahüdrofuraan) lisamine muudab eluenti tugevamaks Rakendatakse alifaatsete vôi aromaatsete rühmadega molekulide

lahutamisel

Ioonvahetuskromatograafia

kolonni täidisele on kantud laenguga rühmad, mis on neutraliseeritud vastasioonidega

anioonvahetajad - kvaternaarsed amiinid katioonvahetajad - sulfonaatrühmad môlemad rühmad dissotseeruvad täielikult ja sôltuvus pH-st puudub

Ioonkromatograafia:

anorgaaniliste ioonide analüüs Kasutusel on spetsiaalne täidis: polümeerne alus (divinüülstüreen,

diameeter 10 m), mis on sulfoneeritud vôi amineeritud. Elektrostaatiliselt seotakse sellega amineeritud vôi sulfoneeritud polümeeri kile (100-300 nm kiht).

supressorkolonn vähendab eluendi juhtivust: anioonkromatograafias - katioonvahetus kolonn (H+-vormis) vahetab

eluendi (nôrga happe soolad) katioonid H+ ioonidega ja tekkinud nôrka hapet juhtivusdetektor ei detekteeri

katioonkromatograafias - anioonvahetuskolonn (OH- - vormis) vahetab eluendi (HCl) aniooni OH- rühmadega ja vett ei detekteerita

eluendid: anioonkromatogaafias: salitsülaat, boraat, bikarbonaat katioonkromatograafias: HCl detektorid: juhtivusdetektor, UV detektor

Ioonkromatograafia rakendused

laialt kasutatav anioonide määramiseks vee analüüsil, (näit.

elektrijaamades)

Ioon-paarkromatograafia

Alternatiiv ioonkromatograafiale. Sageli efektiivsem. Viiakse läbi pööratud faasi kolonnis, eluendile lisatakse

hüdrofoobset vastasiooni. (N. sulfoonhappeid saab pööratud faasi kolonnis lahutada kui eluendile on lisatud tetrabutüülammoonium soola)

Ioonpaari lahutusmehhanism: hüdrofoobsed vastasioonid adsorbeeruvad liikumatusse faasi ning moodustavad ekvivalendi ioonvahetuskolonnile.

Eluentideks on enamasti vesilahustest puhvrid, mis vŏivad sisaldada orgaanilist solventi.

Puhvri pH ja orgaanilise aine sisaldus mŏjutavad osakeste elueerumist.

Eluendi tugevus kasvab orgaanilise solvendi kontsentratsiooni kasvuga.

Analüütide retentsiooniajad pikenevad vastasiooni kontsentratsiooni kasvamisega.

Eksklusioonkromatograafia (exclusion chromatography, gel permeation chromatography)

kasutatakse makromolekulide molekulaarkaalu jaotuse analüüsil kolonni täidised on poorsed materjalid: silikageel, poorne klaas,

stüreendivinüül polümeer, kolonni täidise poorsus varieerub suurtes piirides (4 m – 250 m) väga suured molekulid ei sisene pooridesse – elueeruvad kiiresti väikesed molekulid jäävad kinni paljudesse pooridesse ja

elueeruvad aeglaselt vahepealse suurusega molekulid sisenevad osadesse pooridesse ja

osadesse nad ei mahu ning nende retentsiooniaeg on suurte ja väikeste molekulide vahepealne

analüüsitavate molekulide molekulkaal 4m pooridel 1000 – 8000 250 m pooridel 200 000 – 1 500 000 eluent: pH < 9, peab lahustama analüüsitavaid aineid detektor: HPLC detektorid

Afiinsuskromatograafia:

Tahke kandjaga on seotud kovalentselt afiinsusligand (biokeemiline

ühend), mis selektiivselt seob teatud proovi komponendid.

Ülejäänud proov elueerub kolonnis sorbeerumata.

Väga suur selektiivsus, mis on kasulik preparatiivseks tööks.

Tahked kandjad on hüdrofoobsed: agaroos, tselluloos,

polüakrüüamiid

ligandid: ensüümid, antikehad

seotud ühendite elueerimine: ligandi lahuse abil