Skelettet i käkar och annorstädes - Tandläkartidningen 0408_lerner.pdf · 42 tandläkartidningen årg 96 nr 8 2004 ulf h lerner referentgranskad. accepterad för publicering 4

tandläkartidningen årg 96 nr 8 200442

ulf h lerner

referentgranskad. accepterad för publicering 4 april 2004

vetenskap & klinik ● ulf h lerner

ulf h lerner, professor, Oral cellbiologi, Umeå universitet, Umeå

Skelettet i käkar och annorstädesEn benhård vävnad fylld av liv och rörelse både vid hälsa och sjukdom

1. Benets fysiologiska uppbyggnad och omsättning

� Denna översiktsartikel sammanfattar vad vi cellbiologiskt vet om de celler sombildar ben, osteoblaster och de som resorberar ben, osteoklaster.

Den moderna cellbiologin har kunnat visa att osteoblaster är en slags ben-vävnadens Dr Jekyll och Mr Hyde. De inte bara bildar ben utan kontrollerar ävenbildandet och aktiveringen av bennedbrytande osteoklaster. Även om man anatdetta under de senaste 20 åren är det inte förrän under de allra senaste 3–4 årensom samspelet mellan osteoblaster och osteoklaster fått sin molekylära för-klaring.

Med ytterligare molekylärbiologisk kunskap om specifika reglersystem förbenresorption och benbildning kommer man att kunna utveckla nya läkemedelför behandling av patienter med sjukdomar som primärt eller sekundärt drabbarremodellering av skelettet.

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2242

43tandläkartidningen årg 96 nr 8 2004

Benbiologi

et är många av oss som när vi tittar på enröntgenbild och ser att marginala benkan-ten är sänkt eller upptäcker att det finns ett

radiolucent område kring roten säger till patien-ten (eller kolleger) att benet är resorberat kringtanden. På samma sätt är det vanligt att röntgeno-loger, ortopeder och andra som tittar på röntgen-bilder från patienter med misstanke om osteo-porossjukdom säger till varandra att benet är ”ur-kalkat” när röntgen visar ett mindre opakt nätverkav kompakt eller trabekulärt ben. Hos samtligadessa patienter beror röntgenbildens mindre ra-dioopaka struktur, eller ökade radiolucens, på för-lust av mineral.

I denna översikt vill jag dock försöka förmedladels att ett skelett aldrig enbart kan urkalkas vidpatologiska tillstånd och dels att det inte bara ärökad nedbrytning av ben som äger rum vid sjukli-ga processer som parodontit, periapikal osteit,reumatoid artrit, periimplantit eller metastaser avmaligna tumörer i skelettet. Vid dessa patologiskaprocesser förekommer också ökad benbildning,det vill säga ökad remodellering.

När en död kropp har förruttnat återstår till slutbara skelettet. Detta faktum har lett till att mångabetraktar skelettet som en kroppsdel som är resi-stent mot biologiska processer och vars funktionhos oss ryggradsdjur endast är att vara armerings-järn för att hålla oss upprätta och för att fästamuskler och senor på. Det är naturligtvis förståe-ligt att denna tanke uppkommer men i själva ver-ket är den benvävnad som skelettet består av likalevande som alla andra vävnader i en levandekropp. Skelettet har celler vars liv och leverne reg-leras av gener, hormoner, omgivningsfaktorer ochtill och med av nervsystemet.

Det är min avsikt att översiktligt beskriva denkunskap vi har idag om benets biologi och att i ensenare artikel redogöra för hur dess celler påverkasav sjukliga processer som inflammation, tumöreroch osteoporossjukdom.

Den som drar sig till minnes tidigare kunskaperi benbiologi kommer att kunna konstatera att ettmycket stort dogmskifte har ägt rum, nämligen attde benbildande osteoblasterna inte enbart ägnarsig åt att bilda ben utan att det är dessa celler somockså reglerar bildandet och aktivering av benre-sorberande osteoklaster. Jag kommer att ägna spe-ciell uppmärksamhet åt att förklara de landvin-ningar under senaste 3–4 åren och som har lett tilldenna nya uppfattning.

Det är viktigt inte minst på grund av att kunska-perna redan har lett till utvecklande av nya läke-medel för antiresorptiv behandling. Kunskapernahar också lett till att man nu genetiskt och mole-kylärt kan förklara flera skelettsjukdomar, bådesådana som leder till ökad bentäthet (osteopetros)

och sådana som leder till minskad bentäthet gene-rellt (osteoporos) eller lokalt (osteolys).

BencellerBenvävnaden innehåller tre olika celltyper somtillsammans är ansvariga för den ständiga remo-delleringen av skelettet med vilka skelettets formoch benmassa (=mängden mineraliserad benväv-nad) ständigt kan anpassas till olika fysiologiskakrav. Förändringar av dessa cellers aktiviteter ärockså orsaken till att benvävnadens form och mas-sa förändras vid vissa patologiska processer inutieller i anslutning till skelettet; till exempel par-odontit, reumatoid artrit och osteoporos.

Osteoblaster är de celler som bildar ben genomatt syntetisera en icke mineraliserad matrix bestå-ende av benproteiner som senare, genom osteo-blasters kontroll, mineraliseras (Figur 1). Dessaceller förekommer som ett enda lager av celler somtäcker all benvävnad, såväl kompakt som trabeku-lärt ben.

Osteoblaster är bindvävsceller och närmastsläkt med odontoblaster i dentin och cementoblas-ter i cement men också med fibroblaster i slemhin-nor och hud och de speciella fibroblastliknanderothinnecellerna. Osteoblaster kan också bildas

D

Figur 1. Benvävnad bildas av osteoblaster som bildar ett endalager av sammanhängande celler som täcker alla ytor påbenvävnaden, såväl i kortikalt som trabekulärt ben. Aktivaosteoblaster är kubiska celler med hårt färgad cytoplasmamedan inaktiva osteoblaster är mycket smala celler.● Osteoblasterna bildar initialt ben genom att frisättaolika proteiner (huvudsakligen kollgena fibrer) som bildarbenmatrixen eller osteoiden (röd färg).● Osteoiden saknar mineralkristaller men när den fått enviss tjocklek impregneras den med hydroxylapatitkristallerså att den hårda benvävnaden bildas (blågrön färg).● Osteoiden mineraliseras inte fullständigt. Det finns alltiden zon av osteoid mellan mineraliserad benvävnad och osteo-blaster.

Aktivaosteoblaster

Osteoid

Osteocyter

Mineraliseradosteoid

Inaktivaosteoblaster”Lining cells”

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2243


ulf h lerner

lätt urskiljbara från enkärniga osteoblaster (Figur3). Bildandet av dessa högspecialiserade jättecellerfrån enkärniga förstadier är en mycket komplice-rad process som styrs av signalsubstanser, trans-kriptionsfaktorer och olika gener.

Intensiv forskning inom akademier och läkeme-delsindustrin stimulerad av den ökade benresorp-tion som ses vid stora folksjukdomar som osteopo-ros, cancer, reumatoid artrit och parodontit har letttill att vi i dag har en mycket mer detaljerad kun-skap om cell- och molekylärbiologin i sambandmed osteoklaster än vi har för osteoblaster.

En fundamental skillnad mellan osteoblaster ochosteoklaster är inte bara att osteoblaster bildar benoch osteoklaster bryter ned ben utan att osteoklas-ter är en typ av vit blodkropp (leukocyt), som där-med inte alls är släkt med osteoblaster och osteocy-ter, utan närmast med monocyter/makrofager. Kun-skapen har haft stor betydelse på så sätt att patientermed defekter i osteoklaster har kunnat behandlasgenom transplantation av benmärgsceller.

Avsikten med denna översikt är att samman-fatta vad vi cellbiologiskt vet om de celler sombildar ben, osteoblaster, och de som resorberarben, osteoklaster. En fascinerande aspekt äratt den moderna cellbiologin har kunnat visaatt osteoblaster är en slags benvävnadens DrJekyll och Mr Hyde på så sätt att de inte barabildar ben utan också kontrollerar bildandeoch aktivering av bennedbrytande osteoklaster.Även om vi anat detta under de senaste 20 årenär det inte förrän under de senaste 3–4 årensom samspelet fått sin molekylära förklaring.

Osteoblastisk benbildningOsteoblaster är celler som ligger som ett enda lagerav celler närmast själva benvävnaden, såväl i perios-tet, som täcker det kortikala benets yttre begräns-ning som i endostet, som täcker såväl den inre ytanav kortikala benet som alla ytor av det trabekulärabenet (Figur 1, 2). Detta gäller både för de ben sombildas via så kallad enkondral benbildning (Faktaru-ta 1) som de ben som bildas via så kallad intramem-branös benbildning (Faktaruta 1).

Ett olöst problem är vad som skiljer osteoblastersom bildar kortikalt ben från dem som bildar tra-bekulärt ben. En annan intressant fråga som intefått sin lösning är om det finns några skillnadermellan osteoblaster i ben som embryonalt bildatsvia enkondral benbildning jämfört med i ben sombildats intramembranöst. Styrs osteoblaster idessa ben av olika hormoner och gener? Är osteo-blaster i ben från skallen känsliga för mekaniskbelastning? Frågorna är aktuella inte bara av aka-demiska skäl utan också i kliniska sammanhangframför allt i samband med bentransplantation.

från primitiva stromaceller i benmärg; celler somockså kan ge upphov till fettceller, muskelcelleroch broskceller beroende på vilka gener som förtillfället är aktiverade. Detta regleras av hormoneroch andra signalsubstanser som i sin tur reglerarolika transkriptionsfaktorer inne i cellen. Dessasenare proteiner är ofta inaktiva i cellernas cytosol.Men när de aktiveras ”vandrar” de från cytosolenin i kärnan (translokation) och binds där till start-motorer (promotorer) för olika gener (Figur 2).

Som en följd av att dessa transkriptionsfaktorer(startnycklar) passar till startmotorer för olika generkommer specifika gener att aktiveras. Detta ledersedan till att budbärar-rna syntetiseras (transkrip-tion) och tjänar som en mall eller kod för riboso-mernas ihopkopplande av aminosyror till olikaproteiner (translation). Som en följd av den ändra-de uppsättningen av proteiner inne i cellen kom-mer cellens egenskaper (fenotyp) att förändras så atttill exempel stromaceller kan bli osteoblaster ellerfettceller beroende på vilka gener som är aktiva.

Forskning under senaste 20 åren har lett till attkunskapen om vilka proteiner som osteoblastersyntetiserar för att bilda benmatrix är relativt om-fattande även om vår kunskap om vilka funktio-ner som dessa proteiner har är bristfällig. Vår kun-skap om vilka transkriptionsfaktorer som styrbenbildning är också bristfällig men under de se-naste 3–4 åren har man funnit ett par sådana”startnycklar” som är kritiska för osteoblasternasbildande av skelettet.

Osteocyter är en bencell som förekommer inutibenvävnaden där de har hamnat genom att vissaosteoblaster inkorporeras in i benvävnaden underbenbildningen. Det är en gåta hur det kommer sigatt vissa osteoblaster fortsätter att bilda ben medanandra inkorporeras i hålrum inne i benet och om-vandlas till osteocyter. Väl inne i dessa lakuner kansedan osteocyterna inte förökas. De befinner sigsom ändceller i en återvändsgränd som de inte kanlämna.

Till antalet är osteocyterna den dominerandebencellen men trots detta har vi ingen väl styrktuppfattning om deras funktion. En intressant teo-ri, för vilken det finns experimentell evidens, är attosteocyter fungerar som mekanoreceptorer somkan känna av olika grad av fysisk belastning påskelettet och sedan överföra detta till osteoblasterså att de bildar mer ben. Det är utanför ramen fördenna översikt att närmare gå in på osteocyternasbiologi.

Osteoklaster är den tredje bencellen och dencell som bryter ned, eller resorberar, ben. Medosteoklaster avses mångkärniga jätteceller som lik-som osteoblaster förekommer på benvävnadensytor om än i mycket mindre antal än osteoblaster.De är genom sin storlek och flerkärnighet mycket

Faktaruta 1

Enkondralbenbildning:Långa rörben somembryonalt bildasförst som broskbenoch senare ersättsmed benvävnad.

Intramembranösbenbildning:Skallens platta bensom inte föregås avbrosk utan bildasdirekt i bindväven.

•

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2244


Benbiologi

Även om osteoblaster har många släktdrag medfibroblaster i hud och slemhinnor är en fundamen-tal skillnad att osteoblaster bildar ben i en endariktning (polariserat). Till skillnad från fibroblasterbildar de alltså inte matrix runt omkring sig (peri-cellulärt). Benvävnadens matrix, nätverket av olikaextracellulära matrixproteiner, har stora likhetermed matrix i hud och slemhinna eftersom det hu-vudsakligen består av kollagena fibrer av typ i.

Benets matrix består till 90 procent av sådana fib-rer. Resterande 10 procent består av så kallade ickekollagena proteiner (alltså inga fibrer). Det är enfamilj av proteiner vars medlemmar utökas för var-je år genom upptäckten av nya benmatrixproteiner(Figur 2). Dessa proteiner är egentligen kemisktinte medlemmar av samma familj eftersom mångaav dem uppvisar stora strukturella skillnader.

Proteinerna har framför allt upptäckts av bioke-

Figur 2. Benvävnad bildas av osteoblaster som en icke mineraliseradosteoid. Osteoiden består av matrixproteiner som senare impreg-neras med hydroxylapatitkristaller till den mineraliserade benväv-naden.● Osteoblasternas benbildande aktivitet stimuleras av vissahormoner och mekanisk belastning medan de hämmas av andrahormoner och fysisk inaktivitet.● Förmågan att bilda hydroxylapatitkristaller är starkt beroendeav tillgången på kalcium som regleras dels av födointaget och delsav d-vitamin som behövs för att kalcium ska kunna tas upp fråntarmen till blodet. Brist på d-vitamin leder hos vuxna till ett dåligtmineraliserat skelett och så kallad osteomalaci eller rakitis(engelska sjukan) hos barn.● Intracellulärt styrs benbildningen av transkriptionsfaktorer somi sin tur styrs av hormoner och andra signalsubstanser. De senarebinds till specifika receptorer på osteoblasternas cellmembraner

vilket resulterar i olika signalsystem inne i cellerna aktiveras.● Många av signalsystemen fungerar så att de kopplar på fosfatgrup-per på transkriptionsfaktorer som vandrar från cytosolen in i kärnandär de binds till promotorer, så kallade startmotorer i dna. Därefterbildas mrna (budbärar-rna) genom transkription och en kopia avgenen skapas som tjänar som mall för syntes av proteiner i ribosomer.● Det protein som bildats deltar i benbildningsprocessen antingengenom att ingå i osteoiden eller genom att i sin tur reglera andrabenbildande aktiviteter intracelulärt.● Lrp5 är ett membranbundet protein som nyligen påvisats i osteo-blasters cellmembran. När Lrp5 binds till proteinet Wnt aktiveras ettannat membranbundet protein som kallas Frizzled och som aktiverasignaltransduktion. Detta leder till aktivering av transkriptionsfaktornb-catenin som sedan aktiverar hittills ej identifierade gener som ärinblandade i benbildning. Ju mer aktivt detta system är desto störrebenmassa bildas.

tarm

D-vitaminKortisonInaktivitet

Intermittent parathormonÖstrogenT3/T4Mekanisk belastning

OsteoidMatrixproteiner Kollagena fibrer (90 %) Icke kollagena fibrer (10 %) osteocalcin osteopotin med flera igf-1, igf-ii

tgf-β

Osteoblaster

Osteoid

Mineraliserad benvävnad

Transkriptionsfaktorer cbfa1 osterix β-catenin

hormonreceptor

signaltransduktion

translokation

Lrp5 WntFrizzled

β-catenin dna

benbildning

dna

mrna

transkription

translation protein biologisk aktivitet/benbildning

Mineraliserad benvävnadMatrixproteinerHyroxylapatitkristaller

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2345


ulf h lerner

● Vad är det som gör att vi inte omvandlastill saltstoder?

Man kan ju till exempel tänka sig att det kanbero på de proteiner som bildar den så kallade ickekollagena proteinfamiljen. Vissa av dessa protei-ner skulle alltså bidra till förkalkning medan andrakanske har motsatt effekt? Närmast till hands atttro är att osteoblaster skiljer sig från fibroblastergenom att kunna bilda vissa typer av benspecifikaproteiner och genom att kunna kontrollera bil-dandet av kristallerna.

När det gäller icke kollagena proteiner i ben ärdet dock ganska få som har visat sig vara benspeci-fika. Till dessa hör osteokalcin, ett protein varsfunktion är okänd men som har stor klinisk bety-delse eftersom koncentrationen av osteokalcin iserum är en mycket god indikator på graden avbenbildning i skelettet. Ännu har ingen kunnatförklara mineraliseringsprocessen med hjälp avicke kollagena benspecifika proteiner. Men uteslu-ter inte att de kan ha en sådan roll.

Finns det då några proteiner inne i osteoblastersom skulle kunna förklara varför de kan deponerahydroxylapatitkristaller i benvävnadens matrix? Ja,det protein som mest har associerats till mineralise-ring är enzymet alkaliskt fosfatas. Redan på 1920-talet visades att osteoblaster bildar ovanligt storamängder av en variant av detta enzym som iblandkallas ben-specifikt alkaliskt fosfatas och ibland tnap(tissue non-specific alkaline phosphatase). Som detsenare namnet antyder finns det andra celler somockså kan bilda enzymet. Ju mer benbildande oste-oblaster är, desto mer finns det av detta enzym innei cellerna. Denna kunskap används idag kliniskt påså sätt att mängden av detta enzym i serum (i likhetmed osteokalcin) generellt sett är en bra markör påbenbildningshastigheten i skelettet.

Att enzymet verkligen har en kritisk roll har JoseLuis Millan och hans tidigare forskningsgrupp iUmeå, delvis i samarbete med vår egen, kunnat visaeftersom osteoblasters förmåga att mineralisera benär kraftigt nedsatt när genen för detta enzym slagitsut hos möss med hjälp av modern molekylärgene-tisk teknik. Enzymets betydelse visas också genomatt patienter med mutationer i genen för enzymetfår defekt bildning av skelett och tänder.

Vad har då enzymet för roll?Det finns två huvuduppfattningar:i) Den ena teorin gör gällande att enzymetfungerar som en producent av fosfatjoner,vilka behövs för att bilda hydroxylapaptit-kristaller (som består av kalcium, fosfat ochhydroxyljoner).

Figur 3. Benvävnaden resorberas av flerkärniga jättecellersom kallas osteoklaster. De biladas av enkärniga celler i peri-ost eller endost i kortikalt eller trabekulärt ben. De enkärnigaprekursorcellerna har hematopoetiskt ursprung i benmärgeller mjälte, men den färdiga osteoklasten bildas endast längsbenytorna. Osteoklasterna är rödfärgade i cytoplasman pågrund av att de innehåller stora mängder av ett enzym(tartratresistent surt fosfatas) som här har påvisats med hjälpav en teknik som gör att det kan observeras som en röd färg.Bilden har ställts till förfogande av docent Sven Sjögren,Astra-Zeneca, Mölndal.

mister genom allt mer förfinade system att renaproteiner från extrakt av ben. Vilken funktion deicke kollagena proteinerna har är i stort okänt. Menvi börjar förstå att många av dem binds dels tillvarandra, dels till kollagena fibrer och dels till celler.På så sätt bildas ett sammanhängande nätverk mel-lan matrix, olika proteiner och benets celler.

Ett mycket oväntat fynd är att matrixen i benetinnehåller stora mängder av tillväxtfaktorer sominsulinliknande tillväxtfaktorer (igf-i, igf-ii) ochtransforming growth factor ß (tgf-ß). Varför depo-nerar osteoblaster sådana signalsubstanser inne iden mineraliserade vävnaden frågade sig alla ben-biologer initialt? De har ingen betydelse för benväv-nadens struktur men det har visat sig att de kom-mer till användning den dag benet remodelleras.

En speciell egenskap hos osteoblaster som dedelar med odontoblaster och cementoblaster är attkunna mineralisera matrixen till en hård vävnadsom ben, dentin eller cement. Hårdheten beror påatt det i matrixen inkorporerats kristaller av hy-droxylapatit.

● Hur kommer det sig att dessa hydroxyl-apatitkristaller enbart bildas i benets,dentinets och cementets matrix och intei andra bindvävsmatix?

Trabekulärt ben

Osteoklaster

Benmärg

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2346


Benbiologi

ii) Den andra uppfattningen gör gällande attenzymets roll är att degradera pyrofosfat, ensubstans som finns överallt i bindväven föratt förhindra saltstodsbildning, men som kandegrageras av osteoblaster så att mineralise-ring kan ske.

Den senare uppfattningen baseras på en teori attdet finns överskott av kalcium och fosfat i all bind-väv så att kristaller skulle bildas men att det ärpyrofosfatet som förhindrar detta.

I områden där mineralisering sker kan man oftamed hjälp av eletronmikroskopi påvisa intracellu-lära små vesiklar som är omgivna av membran.Dessa vesiklar frisätts så småningom ut i den ex-tracellulära matrixen.

Det finns en del data som tyder på att kristallbild-ningen initieras ai vesiklarna. När de sedan frisättsoch kristallen vuxit sig tillräckligt stor brister vesi-keln extracellulärt. Vesiklarna skulle alltså enligtdenna uppfattning fungera som lokal ackumulatorav kalcium och fosfat för att möjliggöra att hyroxyl-apatitkristallen fälls ut. När väl detta skett kan kris-tallerna växa sig större även extracellulärt.

Trots att mineralisering är en så fundamentalprocess i bildandet av ben (dentin, cement ochemalj) är kunskaperna om mekanismerna för hurdet kommer sig att hydroxylapatitkristaller fallerut i benmatrix i stort sett obefintliga.

Sammanfattningsvis bildas benvävnaden avosteoblaster som först bildar en matrix somframför allt innehåller kollagena fibrer menockså en mängd andra proteiner med i stortsett okänd funktion.

Osteoblasterna deponerar sedan en stormängd hydroxylapatitkristaller i den matrixde bildat.

Faktorer som styr benbildningI likhet med alla andra celler regleras osteoblaster-nas aktivitet med hjälp av signalsubstanser somfinns runt omkring cellen och som sedan medhjälp av ett signalöverföringssystem inne i celleråstadkommer effekter genom att slå på och avolika gener. Dessa signalsubstanser är dels sådanasom cirkulerar i blodet, hormoner, och dels sådanasom bildas lokalt i vävnaden, till exempel cytoki-ner, tillväxtfaktorer och prostaglandiner. Det allrasenaste är att nervsystemet också med hjälp av sinasignalsubstanser kan påverka osteoblaster.

Det finns inget hormon som är specifikt för oste-oblaster; det vill säga det finns inget unikt benbild-ningshormon. Flera hormoner har dock visat sig haeffekter. Till dessa hör d-vitamin (eller egentligenden till hormon omvandlade metaboliten

1,25(oh)2-vitamin d3), parathormon (pth), köns-

hormoner, tyroideahormon och kortison. Föränd-ringar av nivåerna av dessa hormoner kan ge upp-hov till osteoporotiska tillstånd, så kallade sekundärosteoporos och osteomalaci (normal mängd benmed dålig mineraliseringsgrad). 1,25(oh)

2-vitamin

d3) är kanske det hormon som har störst betydelseför den fysiologiska benbildningen. Det verkarframför allt indirekt genom att det är nödvändigtför upptag av kalcium i tarmen så att benmatrix kanmineraliseras (Figur 2). Det finns också receptorerför 1,25(oh)

2-vitamin d3) i osteoblaster men dessa

har störst betydelse för resorption av ben.För att bilda och mineralisera ben är det nöd-

vändigt att tillföra mängder mängder av d-vita-min och kalcium via födan. I Sverige är det mycketsällsynt att det inte sker med hjälp av normal kost.Men det finns en stor fara föra tt det håller på attförändras på grund av den allt sörre konsumtio-nen av snabbmat och coca-cola.

Parathormon som benbildningsstimulator ärden senaste behandlingsmetoden för osteoporos.Det är den enda metod som hittills inriktar sig påatt skapa mer ben. Övriga terapier riktar sig hu-vudsakligen mot att minska ytterligare nedbryt-ning. Eftersom parathormon är det mest välkändaresorptionsstimulerande hormonet var denna be-handlingsform mycket ifrågasatt initialt. Hormo-net bildas vid brist på kalcium i blodet för attfrisätta kalcium från skelettet.

Metoden bygger på kunskapen om att det finnsreceptorer för parathormon i osteoblaster. Någotsom varit känt cirka 20 år men som kopplats tilldess förmåga att stimulera osteoklaster. Om re-ceptorerna aktiveras genom en kontinuerligt för-höjd nivå av parathormon stimuleras resorptio-nen. Men om receptorerna i stället aktiveras ge-nom dagliga injektioner av parathormon bildarosteoblaster mer ben i stället för att stimuleraosteoklaster. Hur detta går till molekylärt vet manännu inte. Men det fungerar såväl på försöksdjursom på människor och introduceras nu världenöver som behandling mot osteoporos.

Fysisk belastning har också stor betydelse förreglering av mängden benvävnad. Det illustrerassärskilt tydligt av att tennisspelare har mycket högrebenmassa i racketarmen. Liknande benmasseför-höjande effekt har påvisats också inom andra spor-ter. Inaktivitet leder omvänt till en minskning avbenmassa som orsakar dramatiska förluster av ben-vävnaden hos till exempel viktlösa astronauter. Pa-tienter som blir långvarigt sängliggande drabbasockså av förluster av benmassa.

Hur förändrad belastning registreras avbencellerna och överförs molekylärt till

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2347


ulf h lerner

är bunden till Wnt/Frizzled i stället för att dennabindning slås av och på för att reglera aktiveringenav ß-catenin allt efter ”behov”. Samtidigt sommutationens betydelse för hög benmassa upptäck-tes fann en annan forskargrupp genom ett heltosannolikt sammanträffande i tiden att patientermed syndromet osteoporosis-pseudoglioma syn-drome (oppg) har så kallad ”loss-of-function”-mutation i just Lrp5-genen.

Patienterna har som ett av flera symtom ävenlåg benmassa vilket ju ytterligare styrker betydel-sen av detta signalsystem för benbildning. Senarehar man genom att manipulera genomet för Lrp5och introducerat de olika mutationerna som finnshos människa i möss ytterligare kunnat stärka evi-densen för den nära kopplingen mellan Lrp5/Wnt/Frizzled-signalering och benmassa.

En annan teknik för att förstå geners betydelseför benbildning är att på inavlade möss försökahitta gener som är associerade till hög benmassa.Ett antal regioner på olika kromosomer har lokali-serats och på American Society for Bone and Mi-neral Researchs möte i september 2003 rapporte-rades att genen för enzymet 12/15-lipoxygenase ären gen associerad till ökad benbildning. Motsva-rande strategier används också i ett svenskt forsk-ningsprojekt på höns med hög benmassa.

Andra forskargrupper har letat efter proteinersom förekommer intracellulärt i osteoblaster ochsom specifikt kontrollerar dessa cellers benbildan-de förmåga. De har funnit två transkriptionsfakto-rer (startmotorer för gener) som är helt avgörandeför bildande av skelettet (Figur 2). Möss som sak-nar båda generna för transkriptionsfaktorn corebinding factor 1a (cbfa1) kan embryonalt inte bildanågon benvävnad över huvud taget. De bildar ettnormalt ”broskskelett” men de kan inte omvandladetta via så kalld enkondral benbildning till ben-vävnad. De bildar inte heller ben i skallen via såkallad intramembranös benbildning och dör därförstrax efter födelsen. Om mössen saknar den enagenen för cbfa1 kan de bilda ett defekt skelett medförändringar som påminner om de som patientermed Cleidocranialis dysostosis har. Det har ocksåvisat sig att dessa patienter har mutationer just igenen för cbfa1. En annan transkriptionsfaktorsom är nödvändig för bildanden av benvävnad ärosterix.

Avsikten med studieran är inte enbart attkunna förstå genetiken bakom benbildningutan att leta efter mekanismer och molekylersom kan användas som mål för behandling.Det blir möjligt när man kartlagt i detalj hurde olika proteiner som dessa gener kodar fördeltar i osteoblasternas benbildande aktivitet.

reglering av benbildande gener är en olöstgåta. För närvarande arbetar en del forskar-grupper med hypotesen att osteocyternaspelar en kritisk roll för registrering av belast-ning via så kallade mekanoreceptorer.

Gener som reglerarosteoblasternas benbildande aktivitetDen delvis resultatlösa jakten på signalsubstansersom kan reglera benbildning via aktivering av re-ceptorer på osteoblaster har skapat nya strategierför att hitta reglerande signaler. Detta har nyligenlett till upptäckten av ett helt nytt signalsystem avstor betydelse för benbildning. Genom klassisktgenetiska studier har man kunnat beräkna att ben-massans storlek till 60–70 procent bestäms gene-tiskt. Ett sätt att studera genomets betydelse är att istora kohortstudier av friska och sjuka individerundersöka hur polymorfismer (”felstavningar”,Faktaruta 2) är kopplade till exempelvis hög eller lågbenmassa, eller osteoporossjukdom.

Dessa studier har kunnat associera många såkallade ”single nucleotide polymorphisms” till ben-massa. Men eftersom benmassan är polygenetisktbetingad kommer inte dessa studier att kunna geen fullständig bild innan alla polymorfismer i oli-ka populationer i världen har sekvenserats ochderas inbördes kopplingar kartlagts. Detta pågårför närvarande som ett stort globalt projekt sompåminner om hugo-projektet vilket initialt kart-lade genomet i sin helhet.

Genom att studera familjer till patienter somvisat sig ha en osedvanligt hög bentäthet har mankunnat lokalisera en region på kromsom 11q, 13(kromosom 11:s långa arm, band 13) som miss-tänkt ställe. Så småningom har man visat att denhöga bentätheten var kopplad till en enda muta-tion för genen kodande för ”lipoprotein receptor-related protein 5” (Lrp5). Det är en mutation somleder till att aminosyran glycin i position 171 ärutbytt mot valin. Lrp5 förekommer i de flesta cell-ers cellmembraner och signalerar tillsammansmed lösliga proteiner som kallas Wnt in till cellermed hjälp av ytterligare ett signalöverförande pro-tein som kallas Frizzled (Figur 2).

Denna signalering leder till aktivering av trans-kriptionsfaktorn ß-catenin som i sin tur, på någothittills okänt sätt, reglerar benbildning. Wnt är engen som är nära besläktad med bananflugans genWingless som reglerar utvecklingen av vingarnahos flugan. Att Lrp5/Wnt/Frizzled-systemet är be-tydelsefullt för benbildning är nog en av de störstaöverraskningarna hittills inom benbiologin. Mu-tationen i Lrp5 får till följd att Lrp5 blir överaktivoch signalerar kontinuerligt, så kalld ”gain-of-function”-mutation. Det betyder att Lrp5 ständigt

Faktaruta 2

Polymorfismer”Felstavningar”Variationer i dengenetiska kod somfinns i de databasersom genereratsgenom den världs-omfattande kart-läggningen av detmänskliga genomet.

•

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2348


Benbiologi

Benresorption med hjälp av osteoklasterOsteoklaster är den enda cell som hittills visats kun-na bryta ned ben. Dessa celler är lätt identifierbara imikroskop eftersom de är så kallde jätteceller medmånga kärnor och endast förekommer på benytor-na, insprängda här och var mellan osteoblaster. De”suger fast” i benet genom att speciella vidhäft-ningsmolekyler, så kallade integriner, uttrycks påosteoklasternas cellmembran i den så kallde ”seal-ing zone” (Figur 4). Integrinerna binds till en struk-tur om tre aminosyror (rgd) i benmatrixproteinetosteopontin (pons=brygga). Detta leder sedan till attosteoklasten blir polariserad och ombildar cell-membranet i ett starkt veckat ”ruffled border” inn-anför ”sealing zone” (Figur 4, 5). Det är i detta såkallade ruffled border som resorptionsprocessenäger rum inte genom att osteoklaster ”äter upp”(fagocyterar) benet utan genom att den löser uppbenvävnadens beståndsdelar.

● Resorptionsprocessen startas på så sättatt osteoklaster frisätter protoner (h+)genom att en protonpump anrikas i cell-membranet i ruffled border (Figur 5).

Figur 4. Här ses delar av två osteoklaster i en elektromikroskopisk bildsom resorberar benvävnaden från två håll. Benvävnaden är mycket tunnoch består av os parietale från en nyfödd mus. Det mycket speciella cell-membran, ruffled border, som osteoklaster utvecklar i resorptionszonensyns tydligt i båda cellerna. Vidhäftningszonen, sealing zone, känns lättigen eftersom den ser strukturlös ut ( kallas därför ibland för clear zone).Även delar av några cellkärnor kan observeras. Bilden har ställts tillförfogande av professor Åke Larsson, oral patologi, Tandläkarhögskolan,Malmö.

Figur 5. Benvävnaden kan endast brytas ner eller resorberas av osteoklaster; mångkärniga jätteceller som i den del av cellen somutövar resorptionsprocessen är polariserad med ett veckat cellmembran kallat ruffled border.● I membranet finns en protonpump med vars hjälp osteoklaster pumpar ut protoner och en kloridkanal genom vilken kloridjonerpasserar. Som en följd av detta sänks pH i resorptionslakunen till cirka 4,5 och hydroxylapatitkristallerna löses upp. Parallellt frisätterosteoklaster proteolytiska enzymer i lakunen. Dessa bryter ner matrixproteinerna.● Resorptionsprocessen består av både mineralutlösning och matrixnedbrytning; det vill säga all benvävnad försvinner. Det lågapH:t i resorptionslakunen upprätthålls genom att osteoklasten suger fast, adhererar till, benvävnaden med hjälp av sealing zone.”Klistret” består molekylärt av en bindning mellan så kallade vitronectinreceptorer som sticker ut från cellmembranet i sealing zoneoch som binds till de tre aminosyrorna arginin (r), glycin (g) och asparaginsyra (d) i matrixproteinet osteopontin.

Ben

Ruffled border

Cellkärna

Sealingzone

CellkärnorOsteoklast

Ruffledborder

H+ CL–

pH4,5

Utlösning avmineralkristaller

Benresorption

Osteoklast

Vitronectin-receptor(ανβ3)

sealingrgd Osteopontin

Ben

Sealing zone

Frisättning avproteolytiska enzymer

kloridkanal

Nedbrytning avmatrixproteiner

Proton

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2349


ulf h lerner

● Protonerna genereras intracellulärtfrån vätebikarbonat med hjälp av enzymetkarbanhydras ii.● Parallellt med frisättningen av protonerläcker kloridjoner ut i resorptionslakunen.● Det låga pH på cirka 4,5 som skapats utei lakunen får till följd att hydroxylapatit-kristallerna löses upp, det vill säga ben-matrixen urkalkas.● För att resorbera den återstående matrix-en frisätts en cocktail av proteolytiska enzy-mer som degraderar kollagena fibrer ochövriga proteiner. Detta innebär att när benetresorberas försvinner inte enbart mineralutan all benvävnad.

Det finns ingen biologisk mekanism med vilkenskelettet enbart kan urkalkas. Om en patient harförlorat radioopakt ben på röntgen är således inteskelettet urkalkat. Det har försvunnit. Observeradock att det finns situationer då osteoblaster harnedsatt förmåga att mineralisera matrixen, såkalld osteomalaci, vilket ju också leder till mindreradioopakt ben.

Det pågår för närvarande en intensiv forsk-ning, framför allt inom läkemedelsindustrinmen även vid vår egen avdelning, för attkartlägga vilka enzymer som är involveradevid matrixdegradation. Flera cysteinpro-teaster och matrix metalloproteaser har visatsvara betydelsefulla. Det är troligt att inhibi-torer av osteoklastspecifika enzymer kankomma att bli intressanta verktyg för farma-kologisk intervention vid omfattande ben-nedbrytning. Detta gäller också för inhibi-torer vid protonpumpen och inhibitorer avvidhäftningsmekanismen. Redan i dag testasinhibitorer av enzymet katepsin k i olikamodellsystem.

Bildning av osteoklasterDe stora flerkärniga osteoklasterna bildas genomatt enkärniga prekursorceller slår sig samman.Länge trodde man att prekursorceller var osteo-blaster och att dessa celler alltså ändrade sin tillva-ro då och då från att vara benbildande till att varabennedbrytande. Genom bland annat pionjär-arbeten i Sverige under 1970-talet av patologen JanEricsson och ortopeden Gustav Göthlin vid Sab-batsbergs sjukhus kunde man visa att osteoklaster-nas förstadier cirkulerar i blod och att de kommerfrån blodbildande vävnader (benmärg, lever,mjälte). På senare tid har man kunnat visa attosteoklastprekursorerna är mycket nära släkt medprekursorer som ska bilda makrofager. Det inne-

bär att osteoklaster är leukocyter. Cirka 0,5 procentav leukocyterna i blod består av osteoklastprekur-sorer.

Osteoklasterna bildas genom att stamceller ibenmärgen differentieras till förstadier som är ge-mensamma för osteoklaster och makrofager (Fi-gur 6). Under ett visst skede i dessa cellers utveck-ling får de signaler som gör att de antingen kom-mer att få egenskaper (det vill säga aktivera gener)som gör att de utvecklas mot osteoklaster ellerandra egenskaper som leder till utveckling motmonocyter. Sedan kommer dessa celler att vandraut i blodkärl och cirkulera som monocyter (första-dier till makrofager) eller osteoklastprogenitorer.

Exakt vad som skiljer dessa celler åt i cirkulatio-nen vet vi ännu inte och det finns inga markörermed vilka vi säkert kan särskilja dem åt. Vid deställen i skelettet som ska remodelleras, eller vidpatologiska processer som är förenade med ökadbenresorption, vandrar osteoklastprogenitorcellerut ur blodkärlen med en så kallad ”homing-process”som är helt okänd men som sannolikt påminnerom de mer välkända för andra leukocyter, inklusivemonocyter (Figur 6). På så sätt hamnar osteoklast-prekursorer ute i periost och endost. Här får deytterligare information (signalsubstanser) från cel-ler i omgivningen, det vill säga osteoblaster, så att dedifferentieras till ett stadium då de fusioneras tillflerkärniga vilande osteoklaster. Dessa celler påver-kas sedan ytterligare så att de kan fästa till benytan,polariseras och resorbera ben.

Det faktum att osteoklaster är en typ av vitblodkropp innebär bland annat att de är cellermed stor förmåga att röra på sig. De utnyttjardenna egenskap när de förflyttar sig utmed ben-ytor för att när resorptionsprocessen avslutats påett ställe flytta sig till ett nytt resorptionsställe. Detbehövs därför inte så många osteoklaster för attbryta ned ben i ett område.

Det finns patienter med genetiska defekter somleder till att de inte kan bilda osteoklaster. Detfinns andra patienter som visserligen bildar fler-kärniga osteoklaster men dessa celler kan inteaktiveras. Oavsett om patienterna har mindre an-tal osteoklaster eller mindre funktionella osteo-klaster blir resultatet detsamma, nämligen att benackumuleras i skelettet och de får så kallat ”mar-morben” eller osteopetros. Om den genetiska de-fekten är lokaliserad i osteoklaster eller deras pre-kursorer och inte i omgivande celler (stromacellereller osteoblaster) vars signaler också är nödvändi-ga för osteoklastutveckling kan patienter medosteopetros behandlas med benmärgstransplanta-tion. Metodiken har ännu inte optimerats. Där-med är lyckandefrekvensen tyvärr begränsad. Menmed hjälp av den allt mer förfinade molekylärakunskapen kommer detta snart att förbättras.

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2350


Benbiologi

Osteoblaster kontrollerar bildning av osteoklasterNär den moderna molekylärbiologin introducera-des inom bencellsbiologin under slutet av 1970-taletblev det ganska snart uppenbart att hormoner somstimulerar benresorption (till exempel parathor-mon och 1,25(oh)

2-vitamin d3) inte kan stimulera

osteoklasterna eller deras prekursorceller direkt ochatt receptorerna för dessa hormoner endast kundepåvisas i stromaceller/osteoblaster. Detta var natur-ligtvis i början mer eller mindre en paradox ochmycket svårförståeligt. I början på 1980-talet lanse-rade Gideon Rodan och Jack Martin en teori för huraktivering av osteoblaster initialt i resorptionspro-cessen skulle kunna vara rationellt och förutsägbartoch att osteoblaster på något sätt sedan kommuni-cerade med osteoklastprekursorer.

Under slutet av 1980-talet visade Tatsuo Sudaoch medarbetare i Tokyo att det krävdes inte bara

hematopoetiska celler för att osteoklaster ska bil-das utan även stromaceller från märgen som diffe-rentierats till osteoblastliknande celler (Figur 6).Alternativt kunde man tillsätta ”färdiga” osteo-blaster från periost till osteoklastprogenitorceller.Man visade också elegant att det krävdes cell-till-cellkontakt mellan dessa supporterceller och osteo-klastprogenitorerna. Dessa observationer kundeunder 90-talet konfirmeras av många laboratorieroch ett stort antal forskargrupper inom akademinoch läkemedelsindustrin sökte efter de molekylersom förmedlade signaleringen mellan supporter-cellerna och osteoklastprogenitorerna.

Det visade sig att cytokinen macrophage colonys-timulating factor (m-csf) var en sådan faktor somstromaceller/osteoblaster bildar men att dess rollsnarast är att stimulera proliferation av osteoklast-progenitorer i stället för att vara den förmedlande

Figur 6. De enkärniga primitiva celler som osteoklaster bildas från finns i blodbildande vävnader och är nära besläktade med deceller som senare ska utvecklas till makrofager.● Osteoklastprogenitorceller utvecklas genom att de som enkärniga celler prolifererar och differentierar i den hematopoetiskavävnaden i en riktning så att de successivt blir allt mer ”osteoklastiska”.● Utan att vara färdiga osteoklaster lämnar dessa förstadier den hematopoetiska vävnaden och börjar cirkuleera som en av mångavita blodkroppar i blodet.● Genom en process som ännu inte är kartlagd lämnar de blodbanan på olika ställen och hamnar i det periost och endost sombekläder all benvävnad. Här differentieras de successivt i en osteoklastisk riktning för att till slut nå ett stadium då de kan slå sigsamman till en stor mångkärnig osteoklast.● Den färdiga osteoklasten förekommer alltså inte i blodet och kan aldrig proliferera. Proliferationen och differentieringen i benmär-gen styrs av tillväxtfaktorer och cytokiner som produceras av så kallade stromaceller i märgen. Det krävs också att stromacellerna ochosteoklastprogenitorceller etablerar fysisk cell-till-cellkontakt med varandra. På samma sätt krävs att osteoklastprogenitorcelleretablerar cell-till-cellkontakt med osteoblaster i periost/endost för att de slutligen ska differentieras.

stamcell

osteoklast-progenior/monocyt

Benmärg

osteoklast-progenitor

monocyt

stromacell

monocyti blod

monocyter vandrargenom kemotaxi uti vävnader, homing

osteoklast-progeitor i blod

osteoklastprogenitorvandrar ut ur kärlenin i benhinnan, homing

osteoklast-progenitori benhinnan

osteoblast

makrogfagOsteoklast

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2351


ulf h lerner

länken vid cell-till-cellkontakten. Med hjälp avupptäckten att fibroblaster bildar en löslig inhibitorav osteoklastbildning, initialt kallad ”osteoclast inhi-bitory factor” (ocif) och senare osteoprotegerin(opg) lyckades två grupper i usa respektive Japan,visat att opg binds till en molekyl på stromaceller /osteoblaster, som fick namnet opg-ligand (opgl).

Såväl genen för opg som den för opgl klonadesmed en rasande fart och med moderna molekylär-genetiska tekniker kunde man snart visa att omgenen för opgl slås ut i möss (opgl knockout mice)blir mössen osteopetrotiska (på grund av att det intebildas några osteoklaster). Man kunde också visa attom genen för opg slås ut blir mössen osteoporotiska(på grund av att det bildas stora mängder osteoklas-ter). Ganska snart kunde man därefter visa att opglbinder till en receptor på osteoklastprekursorernasyta och som kallades ”receptor activator of nfßb’(rank). Då ändrades nomenklaturen så att opglfick namnet rankl (Figur 7).

Möss hos vilka genen för rank slagits ut får

egenskaper (klinisk fenotyp) som är identiska medrankl-knockoutmöss, det vill säga osteopetros.rankl och rank upptäcktes under samma tidockså av immunologer som kallade rankl förtrance. Eftersom rankl och rank uttrycks ocksåav lymfoida och dendritiska celler i immunsystemetfår också möss som saknar rankl eller rankförändringar i immunsystemet.

Upptäckten av rankl-rank-opg-systemet inne-bar att man äntligen funnit de molekyler i stroma-celler/osteoblaster som instruerar monocyter/osteoklastprogenitorceller att differentieras tillosteoklaster (Figur 8). Detaljerad kartläggning avmolekylernas struktur och funktion har visat attrankl är en cytokin som är nära släkt med dentumörnekrotiserande faktorn (tnf) och att den ären ovanlig ligand på så sätt att den i likhet medmånga receptorer är förankrad i cellmembranet.Till skillnad från receptorer har den dock ingen”svans” inne i cellen som kan signalera. ranklbinds till sin receptor rank som är förankrad på

Figur 7. DStromaceller i benmärgen är primitiva celler som med hjälp av olika signalsubstanser kan utvecklas tillflera olika typer av celler som osteoblaster, kondroblaster, muskelceller och fettceller.● De stromaceller som utvecklas i en osteoblastisk riktning deltager i bildandet av osteoklaster genom att deetablerar cell-till-cell kontakt med osteoklastprogenitorceller. Detta är nödvändigt för att den cellmembran-bundna cytokinen rankl ska kunna aktivera receptorn rank på osteoklastprogenitorcellernas yta.● När receptorn aktiveras kommer en kaskad av olika signalsystem och transkriptionsfaktorer inne i osteoklast-progenitorcellerna att stimuleras vilket leder till aktivering av hundratals gener som är nödvändiga för att såsmåningom dessa celler ska kunna bilda de mångkärniga osteoklasterna.● Stromaceller/osteoblaster bildar också opg, en löslig receptor som kan binda sig till rankl och förhindra attden aktiverar RANK. Stromaceller/osteoblaster bildar också en löslig tillväxtfaktor m-csf som via sin receptorc-fms, stimulerar proliferation av osteoklastprogenitorceller. De flesta hormoner och cytokiner som stimulerarosteoklastbildning verkar via stromaceller/osteoblaster där de reglerar mängden rankl och opg. Endast ett parhormoner är kända som verkar direkt via osteoklastprogenitorcellerna nämligen calcitonin och östrogen.

parathormonD-vitaminT3/T4kortisonA-vitamin

östrogen

calcitoninöstrogen

differentieringtill osteoklastervia intracellulärsignalering osteoklast-

progenitor

proliferationav osteoklast-progenitor

rankl

rank

opg

m-csf

c-fmsparathormon

Intracellulärsignaleringrankl

ranktraf 6

nf-κb mapk c-src

ap-1 nfat-2

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2352


Benbiologi

osteoklastprekursorernas cellyta. rank har en cyto-plasmatisk svans inne i cellen som kan aktiveraolika signalsystem i osteoklastprekursorer närrank aktiveras av rankl (Figur 7).

rank är nära släkt med receptorerna för tnfoch dess släktingar. Till denna familj hör ocksåopg som i likhet med rank har affinitet till rankl.opg är en så kallad löslig receptor som inte sitterpå cellmembranet och som inte kan signalera icellen utan i stället hindrar rank från att aktiverasgenom att binda sig till rankl. Den relativa mäng-den rankl och opg blir på så sätt avgörande förhur många rank-molekyler som kan aktiveras ochdärmed hur många osteoklaster som bildas.Alla hittills påvisade stimulatorer av osteoklast-bildning verkar genom att påverka rankl ochopg-uttrycken. Starka stimulatorer som parathor-mon och 1,25(oh)

2-vitamin D3 stimulerar uttryck-

et av rankl samtidigt som opg-uttrycket minskar.

Kunskaperna om rankl-rank-opg och deintracellulära signalvägarna med vilka rankpåverkar osteoklastprogenitorceller innebäratt läkemedelsindustrin nu fått nya mål föratt rikta intervention mot vid sjukdomarmed hög benresorptionsaktivitet, till exem-pel osteoporos, reumatoid artrit, cancermeta-staser i ben och parodontit. Med rekordfarthar inhibitorer utvecklats och kliniska pröv-ningar pågår redan.

Vi har i Umeå upptäckt att en familj av enzy-mer, så kallde cysteinproteaser, deltar i osteoklast-bildning. Dessa enzymer, framför allt katepsin k,är väl kända för att vara viktiga i den cocktail avenzymer som osteoklaster frisätter ut i resorp-tionslakunen för att bryta ned den organiska ma-trixen. Genom att använda olika typer av inhibito-rer har vi kunnat visa att också cysteinproteaser ärviktiga för osteoklastdifferentiering och fusionoch att det är olika proteaser som är viktiga förresorptionsprocessen respektive differentiering-en. Vilka cysteinproteaser som är involverade iosteoklastbildning vet vi ännu inte även om vikunnat visa att det inte är katepsin k. I nuvarandestadium vet vi inte heller vad enzymerna har förroll men det är ett mycket spännande projekt somäven engagerar medicinska kemister i Lund, pro-teinkemister i Gdansk, Polen och molekylärbiolo-ger i Kiel, Tyskland och som finansierats av Stra-tegiska Stiftelsen.

Faktorer som styr bildandet av osteoklasterDe hormoner som är de mest potenta stimulato-rerna av osteoklastbildning är parathormon och1,25(oh)

2-vitamin d3. En överproduktion av dessa

leder till minskad mängd benvävnad på grund av

ökad benresorption. Andra hormoner som kan sti-mulera osteoklastisk differentiering är tyroideahor-mon, glukokortikoider (kortison) och retinoider (a-vitamin) (Figur 7). Calcitonin från tyroideas c-cel-ler är det resorptionshämmande hormon som ärmest väldokumenterat. Calcitonin verkar direkt påreceptorer på osteoklasternas cellmembran. Vi harnyligen visat att calcitonin också hämmar diffe-rentieringen av osteoklastprogenitorceller. Diffe-rentiering och aktivitet av osteoklaster hämmasockså av östrogen och androgen med mekanismersom dels är direkta på osteoklaster och dels medie-ras av andra celler (till exempel stromaceller, lymfo-cyter). Detta är förklaringen till att postmenopau-sala kvinnor liksom andra kvinnor med brist påöstrogen får fler och mer aktiva osteoklaster.

Osteoklastbildning och benresorption styrs intebara av systemiska hormoner utan även av lokalafaktorer. Dessa har studerats framför allt av fors-kare som intresserat sig för lokal bennedbrytningoch patologiska processer, till exempel kronisk in-flammation och metastaserande maligna tumörer.Många av dessa ”patologiska” molekyler somupptäckts har så småningom visat sig vara av bety-delse även för fysiologisk remodellering. De flestaav dem är cytokiner, det vill säga peptider sominitialt upptäcktes av immunologer och som harstor betydelse för kommunikationen mellan celleri immunsystemet.

Cytokiner kan bildas av många celler, inklusivebenceller. Cytokiner som visat sig kunna stimuleraosteoklastdifferentiering är interleukin-1 (il-i),il-6, il-7, il-ii, il-17, tnf, leukemia inhibitory factor(lif) och oncostatin m (osm). Av dessa är il-i denmest potenta stimulatorn även om man räknar instimulerande hormoner. Samtliga dessa stimulato-rer utövar sina effekter genom att först reglera ut-trycken för rankl och opg i stromaceller ochosteoblaster.

Det finns även cytokiner som hämmar osteo-klastdifferentiering. Dessa har dock studerats imycket mindre omfattning än de stimulatoriska.Till de hämmande hör il-4, il-10, il-i2, il-i3, il-i8,γ-interferon (γ-ifn) och α-ifn. Mekanismerna ärrelativt okända men själva har vi nyligen visat attil-4 och il-13 hämmar differentiering av osteoklas-ter dels genom att minska rank i osteoklastproge-nitorceller, dels genom att inhibera rankl ochstimulera opg i stromaceller och osteoblaster.

Gener som reglerarosteoklasternas bildande och aktivitetSom framgått styrs osteoklastutveckling av bådestromaceller/osteoblaster och osteoklastprogeni-torceller. Därför är olika gener i dessa celler viktiga.Framför allt studier med hjälp av möss där olikagener slagits ut med modern molekylärgenetisk

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2353


ulf h lerner

för osteoklastdifferentiering och aktivitet kartlagtsmed hjälp av så kallad ”gene knockout”.

Kartläggandet av musgener har nu också lett tillatt flera olika ärftliga skelettsjukdomar hos männi-ska kunnat kartläggas. Dessa studier har inte baramolekylärgenetiskt kunnat förklara etiologin ochpatogenesen för sjukdomarna utan också visat påhur lika musens och människans gener är.

Patienter med de ärftliga sjukdomarna familialexpansile osteolysis and expansile skeletal hyper-phosphatasia har ökat antal hyperaktiva osteo-klaster och därmed ökad remodellering av skelettet.Detta har nu visat sig bero på mutationer i genen förrank. Receptorn blir mer aktiv än normalt, så kal-lad gain-of-function mutation, och därmed ökadsignalering till osteoklastbildning. Patienter medhyperostosis corticalis deformans juvenilis har ökadbennedbrytning och stora besvär med frakturer ochdeformiteter i skelettet som beror på en inaktive-rande mutation i genen för opg. Detta leder tillminskad hämning av rank-signalering.

Fysiologisk remodellering av skelettetUnder fysiologiska förhållanden byggs skelettetständigt om via så kallad remodellering. Detta sker idiskreta ombyggnadsplatser; så kallade ”bone mul-ticellular units”. Man räknar med att det finns 1–2miljoner ombyggnadsplatser i skelettet. Det finnsfler ombyggnadsplatser i trabekulärt ben än i korti-kalt ben och därför är remodelleringen hög i tillexempel ryggkotor, distala radius och lårbenshal-sen som innehåller stora mängder trabekulärt ben.Totalt har man beräknat att under friska förhållan-den resulterar remodellering i att 10 procent avskelettets benvävnad byts ut varje år.

● Remodelleringscykeln startar med attosteoklaster identifierar ett område som skabytas ut varvid den fäster till benytan ochsedan resorberar detta område (Figur 9).● Den resorptionslakun som den lämnarefter sig när den flyttar till ett nytt remodel-leringsställe invaderas av osteoblaster sombildar nytt ben i lakunen.● Det är nu som de tillväxtfaktorer somosteoblaster tidigare deponerat i benväv-naden kommer till användning (figur 2).De frisätts och aktiveras när osteoklasternabryter ned ben och läcker sedan ut till om-givningen där igf-s och tgf-β aktiverarosteoblaster så att nytt ben kan bildasi resorptionslakunen; de fungerar som såkallade coupling factors (Figur 9).● Om mängden ben som bildas är likastor som den som bryts ned blir benmassani fortsättningen oförändrad. Om däremot

teknik som gett förändringar i skelettet har kunnatvisa på den kritiska betydelsen av ett stort antalgener. Vissa av dessa genutslagningar har varit rik-tade mot gener som man genom in vitro studierförstått vara av betydelse för osteoklastbildning.Men flera gener har mer av en slump upptäckts varaviktiga för skelettet. De har slagits ut av forskaresom varit intresserade av helt andra celler och pro-cesser men som till sin stora förvåning funnit attskelettet sett helt annorlunda ut hos de möss somsaknar den gen de varit intresserade av. Andra generav betydelse för osteoklaster har påvisats genom attman med mer traditionella genetiska metoder un-dersökt musstammar där man sedan länge känt tillatt de har skelettala defekter.

En möjlighet som nu har öppnat sig är att medolika tekniker studera vilka gener som slås på iosteoklaster när man aktiverar receptorn rank(Figur 7). Detta är intressant inte bara ur grundve-tenskaplig synpunkt utan även för läkemedels-industrin som söker nya och kanske ännu merspecifika mål för utvecklande av osteoklasthäm-mare. Sålund har man påvisat gener som behövsför att initiera differentiering av osteoklaster.Dessa är dels sådana som behövs för intercellulärkommunikation som till exempel rankl, rank,opg och m-csf, dels sådana som är nödvändigaintracellulärt för differentiering av osteoklaster,till exempel olika transkriptionsfaktorer som nf-κb och nfat2 (Figur 7).

Gener involverade i vidhäftning, polariseringoch utvecklande av ruffled border har också kart-lagts, till exempel proteinerna αv och β3 som bil-dar integrinen αvβ3 (Figur 5) och tyrosinkinasetc-src (Figur 7). För resorptionsprocessen är genenför enzymet katepsin k avgörande för proteolytisknedbrytning av matrixproteiner (Figur 5). Manhar också funnit en gen som kodar för en osteo-klastspecifik subenhet i protonpumpen samt dengen som kodar för kloridkanalen (kloridkanal 7)(Figur 5). I samtliga dessa fall har genens betydelse

Figur 8. På bilden till vänster ses många rödblå celler med långautskott som representerar osteoklstprogenitorceller som hållerpå att slå sig samman till flerkärniga osteoklaster. Några smårunda celler kan åckså ses. Det är tidiga osteoklastprogenitorersom ännu inte hunnit till det stadium då de kan slå sig samman.Påbilden till höger ses stora flerkärniga osteoklaster. Dessa fotonär tagna från en cellodling där cellerna isolerats från mjälte ochsedan stimulerats med m-csf och rankl i fyra dagar.

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2354


Benbiologi

nedbrytningen är större än nybildningen,som fallet är vid till exempel osteoporos,minskar benmassan.● Vid ärftliga sjukdomar förenade meddefekt osteoklastbildning eller -aktivitetblir resorptionsaktiviteten mindre än ben-bildningen och resultatet blir osteopetros.

Hur remodelleringen regleras är en intres-sant fråga som vi vet mycket lite om.● Varför måste vissa områden bytas ut?● Vad har hänt med den extracelluläramatrixen och hur kan osteoklasternaidentifiera sådana områden?● Hur vet osteoklaster att de har resorberatfärdigt i remodelleringsstället?

Det vi vet är att den fysiska belastningen ärnödvändig på något sätt. Om vi inte belastar ske-lettet överväger resorptionen över benbildningenoch vi förlorar benmassa. Hos viktlösa astronauterkan detta gå mycket snabbt. Omvänt vet vi ocksåatt belastning av skelettet ökar benmassan i detbelastade benet. En intressant fråga är om denökade benmassa som vi på så sätt förvärvar kvar-står genom livet? Viss forskning tyder på att så ärfallet. En kanske ännu viktigare frågeställning ärom den maximala benmassa som man förvärvarunder uppväxten har någon betydelse för osteo-porossjukdom när man blir äldre?

All forskning tyder på att ju mer ben man harskapat under uppväxten desto långsammare för-lorar man ben vid osteoporossjukdom. Detta gördet än viktigare att argumentera för mer fysiskaktivitet hos ungdomar liksom att påpeka hur vik-tigt det är med kalciumtillförseln under tider närallt fler dricker mindre och mindre mjölk.

Hjärnan och nervsystemetsom regulatorer av benmassanTraditionellt anses skelettet vara en vävnad somsaknar nerver så när som på ett ganska stort antalsensoriska nerver i periostet. Modern immunhis-tokemisk teknik har dock avslöjat att det finns ettväl utbrett nervsystem såväl i kortikalt och trabeku-lärt ben som inne i benmärgen. Dessa nerver inne-håller signalsubstanser som neuropeptider och kate-kolaminer. Till viss del har dessa nerver en sensoriskfunktion men vi har frågat oss om signalsubstanser-na också skulle kunna reglera bencellernas aktivite-ter? Det är väl studerat i immunsystemet att signal-substanser i nervfibrer påverkar immunkompeten-ta celler. Att en liknande neuro-osteologisk interak-tion förekommer antyds av studier både hos män-niska och djur. Studierna visar att förlust av skelet-tal innervation leder till förändringar i skelettal re-

modellering. Vi har kunnat visa att både osteoblas-ter och osteoklaster har mrna (budbärarrna) förreceptorer för neuropeptiden vasoaktiv intestinalpeptid (vip), en av signalsubstanserna i skelettalanerver.

Receptorerna för vip i osteoblaster och osteo-klaster är inte desamma. Olika receptortyper före-kommer i de olika cellerna. I samarbete med blandannat Michael Horton i London har vi också visatatt de olika mrna för dessa receptorer leder till attolika receptorproteiner uttrycks på bencellernascellmembran.

I flera olika in vitro-system har vi sedan kunnatvisa att om receptorerna aktiveras med vip ochnärbesläktade peptider leder detta till stora föränd-ringar i benbildning och benresorption. Andraforskargrupper har visat att neuropeptiderna calci-tonin gen-relaterad peptid (cgrp) och substans p (sp)samt katekolaminer kan påverka osteoblasters och

Figur 9. Benvävnaden i skelettet hos en vuxen individ byggs ständigt om,remodelleras. Detta sker i högre takt i det trabekulära jämfört med i detkortikala benet.● Remodelleringen initieras av att osteoklaster identifierar det områdesom ska resorberas och adhererar till området med hjälp av sealing zone.● Nedbrytningen av benvävnaden pågår i cirka tre veckor sedanförflyttar sig osteoklasten till ett nytt remodelleringsställe. Underresorptionsfasen bryts de flesta matrixproteinerna ned, men tillväxtfak-torer som igf-i, igf-ii och tgf-β aktiveras i stället och kommer attaktivera de osteoblaster som finns i närheten av resorptionslakunen.Osteoblasterna vandrar in i lakunen och börjar att fylla upp den mednybildat ben; en långsam process som tar flera månader.● Om osteoblasterna kan bilda lika mycket ben som osteoklasternaresorberat påverkas inte benmassan. Om däremot benbildningen inteförmår ersätta allt nedbrutet ben minskar benmassan och skelettet blirosteoporotiskt.● När osteoklasterna inte bildas i normal omfattning, eller inte kanfungera normalt samtidigt som osteoblasterna bildar ben som vanligtökar benmassan och skelettet blir sklerotiskt.

Benremodellering resorptionsfas

benbildningsfas

Osteoblaster

couplingfactors; igf-i,

igf-ii, tgf-β

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2455


ulf h lerner

osteoklasters aktiviteter. Vi har nyligen själva påvi-sat att cgrp också hämmar bildning av osteoklaster.Dessa studier visar hur det perifera nervsystemetkan tänkas påverka skelettal remodellering.

Helt nyligen har två grupper kunnat visa hurdet centrala nervsystemet i hjärnan påverkar ben-massan hos möss. Gerhard Karsenty et al i Hous-ton har visat att receptorer för fetthormonet leptini hypotalamus är betydelsefulla för benmassan.Möss som saknar leptin eller receptorer för leptinhar högre benmassa än kontrollmössen. Detta be-ror på leptinreceptorer i kärnor i hypotalamussom är skilda från de som reglerar leptinets aptit-nedsättande förmåga. I ett mycket elegant arbetevisar gruppen också att effekten medieras av detsympatiska nervsystemet och β-adrenerga recep-torer i osteoblaster som aktiveras av noradrenalin(Figur 10).

En forskargrupp vid Garvan Institute i Sydneyhar på ett annat sätt visat på hypotalamus roll förbenbildning. De har nyligen rapporerat att mösssom saknar en viss receptortyp för neuropeptid y(npy, så kallade npy-receptorer typ 2) specifikt ihypotalamus får ökad benmassa pga ökad ben-bildningsaktivitet i osteoblaster. Hur npy-recep-torer i hypotalamus sedan via nervsystemet påver-kar osteoblaster perifert ute i skelettet är för närva-rande inte känt.

Det kommer att bli mycket spännandeatt följa de studier som pågår för att studeradet sympatiska nervsystemets betydelse förbenmassan hos oss människor, inte minstpga att många patienter behandlas med an-tagonister för β-adrenerga receptorer.

Figur 10. Det centrala nervsystemets betydelse för skelettet.● Fettceller bildar flera olika signalsubstanser inklusive hormonet leptin. Leptin är mest känt för att ha enaptitnedsättande effekt som medieras via hypotalamus i hjärnan.● I specifika regioner i hypotalamus finns neuron som har receptorer för leptin och dessa neuron är involveradei den aptitnedsättande funktionen. Möss som saknar leptin, eller leptinreceptorer, utvecklar därför fetma. Bådadessa olika typer av möss får också högre benmassa än normalt på grund av att de enskilda osteoblasternabildar ben i högre takt än normalt. Detta normaliseras om leptin injiceras i hypotalamus.● Effekten av leptin i hypotalamus medieras av helt andra neuron än de som påverkar aptiten. Perifertpåverkar dessa neuron det sympatiska nervsystemet som sedan ute i skelettet verkar genom att noradrenalinaktiverar β-adrenerga receptorer på osteoblaster. Dessa receptorer har en hämmande effekt på osteoblastersbenbildande förmåga.

Hypotalamus

leptinreceptor

leptinreceptor

pro-opiomeoanocortinneuron icke

identifieradneuron

Sympatiskanerver

leptin

Fettvävnad

neuron medmelanocortin-4receptor

aptit

Osteoblast Benbildning

β-adrenergreceptor

noradrenalin

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2456


Benbiologi

SammanfattningBenvävnaden är ett vitalt organ som ständigt re-modelleras genom väl integrerade aktiviteter mel-lan bennedbrytande osteoklaster och benbildandeosteoblaster.

Modern cell- och molekylärbiologisk forskninghar kartlagt många extra- och intracellulära signal-substanser som reglerar bildande av benceller ochderas aktiviteter. Till dessa hör hormoner, cytokineroch transkriptionsfaktorer. Sålunda har man visat attcytokinen rankl som produceras av stromaceller ibenmärg och osteoblaster i periost är helt nödvän-dig för differentiering av osteoklaster genom att denaktiverar receptorn rank på osteoklatprogenitor-celler. Denna interaktion hämmas av en löslig re-ceptor som kallas opg.

Flera ärftliga skelettsjukdomar hos människaberor på mutationer i generna för rank och opg.Dessa studier visar att osteoblaster inte bara är deceller som bildar ben utan också de celler somkontrollerar bildningen av osteoklaster. Flera in-tracellulära signalvägar med vilka rank stimulerardifferentiering av osteoklaster har också klarlagts,till exempel transkriptionsfaktorerna NF-κB ochnfat2, samt fosforylerande enzymer som map-kinaser.

Den benbildande aktiviteten i osteoblaster re-gleras också av extra- och intracellulära signalsys-tem. Ur klinisk synpunkt är dagliga injektionermed parathormon den mest intressanta stimula-torn av benbildning.

Cbfa1 och osterix är två transkriptionsfaktorersom är nödvändiga för att osteoblaster ska kunnabilda benvävnad. Helt oväntat har det visat sig attdet membranbundna signalsystmet Lrp5/Wnt/Frizzled förekommer i osteoblaster och reglerarbenmassans storlek och mutationer i Lrp5-genensom ger upphov till hög respektive låg benmassahar nyligen påvisats.

Med ytterligare molekylärbiologisk kunskapom specifika reglersystem för benresorptionoch benbildning kan vi förhoppningsvis sefram emot utvecklande av mer specifikafarmaka för att kunna behandla patientermed sjukdomar som primärt eller sekundärtdrabbar remodellering av skelettet.

ReferenserReferenslistan utgörs av ett antal nyskrivna reviewartik-lar där den intresserade läsaren ytterligare kan fördjupasig. Det går även bra att kontakta författaren förnärmare information om de originalartiklar som dennaöversikt är baserad på.

1. Karsenty G. The complexities of skeletal biology.Nature 423: 316–8, 2003.

2. Mariani FV, Martin GR. Deciphering skeltal pattern-ing: clues from the limb. Nature 423: 319–25, 2003.

3. Helms JA, Schneider RA. Cranial skeletal biology.Nature 423: 326–31, 2003.

4. Kronenberg HM. Developmental regulation of thegrowth plate. Nature 423: 332–6, 2003.

5. Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differen-tiation and activation. Nature 423: 337–42, 2003.

6. Zelzer E, Olsen BR. The genetic basis for skeletaldiseases. Nature 423: 343–8, 2003.

7. Harade S-I, Rodan GA. Control of osteoblast functionand regulation of bone mass. Nature 423: 349–55,2003.

8. Teitelbaum SL, Ross FP. Genetic regulation of osteo-clast development and function. Nat Rev Genet4: 632–49, 2003.

9. Lerner UH. Osteoclast formation and resorption.Matrix Biol 19: 107–20, 2003.

10. Lerner UH, Lundberg P. Kinins and neuropeptides.In: Bilezikian JP, Raisz LG, Rodan GA, editors.Principles of Bone Biology, 2nd edition. AcademicPress, San Diego, USA; 2002, pp. 773–99.

11. Lerner UH. New molecules in the tumor necrosisfactor ligand and receptor superfamilies withimportance for physiological and pathological boneresorption. Crit Rev Oral Biol Med, 15: 64–81, 2004.

12. Lundberg P, Lerner UH. The expression and regulato-ry role of receptors for vasoactive intestinal peptidein bone cells. Microscopy Res Tech 58: 98–103, 2002.

fotnot: Studier vid författarens laboratorium harstötts av Vetenskapsrådet, Svenska Stiftelsen förStrategisk Forskning, Reumatikerförbundet, KonungGustav V:s 80-årsfond, Västerbottens läns landsting,Patentmedelsfonden, Arbetslivsinstitutet, Anna-Greta Craafords Stiftelse, Tandläkarsaällskapet,Umeå Universitet, Astra-Hässle och Pharmacia-Upjohn.

Adress:

Ulf H Lerner,Oral cellbiologi,Umeå universitet,901 87 Umeåe-post:[email protected]

•

TLT 0408_lerner 04-06-03, 11.2457

Documents

Skelettet i käkar och annorstädes - Tandläkartidningen 0408_lerner.pdf · 42 tandläkartidningen årg 96 nr 8 2004 ulf h lerner referentgranskad. accepterad för publicering 4