Soluzioni di analisi del metabolismo di cellule vive Agilent Seahorse XF per la ricerca sul cancro

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Il cancro è un insieme eterogeneo di malattie correlate ad alterazioni genetiche che incidono sulla normale funzione cellulare; in questo contesto, la riprogrammazione del metabolismo è riconosciuta come un target chiave delle terapie. Le cellule tumorali sono fortemente dipendenti dalle vie metaboliche per produrre l'energia necessaria per vari processi oncogenici (rapida proliferazione, sopravvivenza, invasione e metastasi) e riprogrammano il proprio metabolismo per sostenerli. 

Al giorno d'oggi, i ricercatori fanno ricorso a svariate analisi basate su cellule, tra cui espressione genica e dell'RNA, quantificazione delle proteine, citofluorimetria a flusso e spettrometria di massa, per una migliore comprensione della biologia del cancro. L'uso di misure funzionali in tempo reale per studiare la natura dinamica del metabolismo cellulare e il modo in cui le cellule tumorali riprogrammano il proprio metabolismo per adattarsi e sopravvivere può mettere in luce vulnerabilità metaboliche. Tali vulnerabilità metaboliche possono quindi essere sfruttate come target terapeutici.

Hanahan 2011 Cell. doi:10.1016/j.cell.2011.02.013. Ristampa da Cell, 144(5), Douglas Hanahan e Robert A. Weinberg, Hallmarks of Cancer: The Next Generation, p. 646-74, © 2011, con l'autorizzazione di Elsevier

La riprogrammazione del metabolismo è uno dei tratti distintivi, o hallmark, del cancro e promotore chiave degli altri hallmark

Hallmark emergenti

Caratteristiche emergenti

Deregolazione energetica cellulare

Evita l'immuno-distruzione

Infiammazione che promuove il tumore

Instabilità e mutazione del genoma

Sfruttamento delle vulnerabilità metaboliche come target terapeutici

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Ottieni misure funzionali in tempo reale

La piattaforma Agilent Seahorse XF permette di ottenere misure simultanee dirette dei tassi di fosforilazione ossidativa e glicolisi, su cellule vive, in tempo reale. Tramite questa tecnologia è possibile valutare il fenotipo delle cellule tumorali in risposta a diversi substrati metabolici o inibitori.

Soluzioni di analisi cellulare Agilent Seahorse XF per la ricerca sul cancro

Scopri perché chi fa ricerca sul cancro utilizza la tecnologia di analisi cellulare Agilent XF per studiare:

– promotori del metabolismo dei fenotipi oncogenici

– malignità e plasticità delle cellule tumorali

– utilizzo di substrati nel microambiente tumorale

– vulnerabilità metaboliche per guidare l'identificazione dei target dei farmaci

– sopravvivenza delle cellule tumorali

Caratteristiche dell'analisi cellulare Agilent XF – Cellule vive

– Tempo reale

– Senza marcatura

– Porte di iniezione dinamiche

– Misura simultanea dei tassi di consumo di ossigeno e glicolisi

– Misura quantitativa dei tassi di glicolisi

– Misura quantitativa dei tassi di produzione di ATP

Respirazione

Ciclo TCA

GlicolisiATP

ATP

Glucosio

Lattato

Piruvato

Catenadi trasporto

dell'elettrone

Amminoacidi

Acidi grassi

Acetil-CoA

Betaossidazione

4

ECAR(Glicolisi)

OCR(OXPHOS)

Organizzazione bioenergetica

IOSE

80

IOSE

120

PEO

1A2

780

PEO

4O

VCAR

5O

VCAR

3UW

B.BR

CAUW

B1.2

89C2

00SK

OV3

SKO

V3ip

CaO

V3

ECAR (mpH/min)

0

1.000

500

1500

2.000

0 20

SKOV3

PEO4

IOSE80C200 OVCAR3

40 60 80 100

BIOSE120

CaOV3

OVCAR5

PE01

A2780

ROS

ECAR (mpH/min)

0

50

100

150

0 50

SKOV3PEO4

IOSE80IOSE120 C200

OVCAR3CaOV3

OVCAR5PE01

A2780

100 150

Tem

po d

i rad

dopp

iam

ento

A

IOSE 80IOSE 120PEO1A2780PE04OVCAR5OVCAR3UWB1.289BCRAUWB1.289C200SKOV3SKOV3ipCaOV3Tempo (min)

0

100

200

300

400

0 20 40 60 80

OCR

(pm

ol/m

in)

ECAR(Glicolisi)

OCR(OXPHOS)

Organizzazione bioenergetica

IOSE

80

IOSE

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PEO

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PEO

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ROS

ECAR (mpH/min)

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SKOV3PEO4

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IOSE 80IOSE 120PEO1A2780PE04OVCAR5OVCAR3UWB1.289BCRAUWB1.289C200SKOV3SKOV3ipCaOV3Tempo (min)

0

100

200

300

400

0 20 40 60 80

OCR

(pm

ol/m

in)

Le dipendenze e strategie di adattamento delle cellule tumorali non sono limitate alla glicolisiMisura le variabilità nei fenotipi metabolici che promuovono le vulnerabilità del cancroIl cancro è una malattia del metabolismo, spesso caratterizzata da un “effetto Warburg” con up-regulation della glicolisi. I fenotipi metabolici, tuttavia, presentano una sostanziale variabilità e possono servire da predittori critici della proliferazione e delle vulnerabilità del cancro nonché della resistenza alle terapie. L'analisi cellulare Agilent permette la misura diretta del metabolismo funzionale in cellule vive, portando alla luce le vulnerabilità del cancro che promuovono la progressione e proliferazione delle cellule tumorali.

Il rapporto glicolisi:fosforilazione ossidativa (OXPHOS) è variabile

Organizzazione bioenergetica

I tassi di ossidazione sono variabili

La bioenergetica si riferisce alla proliferazione e alle vulnerabilità del cancro

Figura 2. Le cellule tumorali pancreatiche passano a un fenotipo glicolitico. Adattato da Hardie, R. A., et al. Mitochondrial mutations and metabolic adaptation in pancreatic cancer. Cancer Metab. 2017. 5 2.

Figura 1. La determinazione del profilo bioenergetico cellulare di 13 linee di cellule tumorali ovariche ha rivelato una significativa diversità bioenergetica. Adattato da Dar, S., et al. Bioenergetic Adaptations in Chemoresistant Ovarian Cancer Cells. Sci Rep. 2017. 7 (1): 8760.

Il profilo metabolico delle cellule tumorali riflette l'alterazione dei requisiti bioenergetici a sostegno della proliferazione

Fenotipo metabolico e vulnerabilità del cancro presentano un'elevata variabilità

0

6

12

18

0 1 2 3

Cons

umo

di o

ssig

eno

(OCR

) (pm

ol/m

in/µ

g)

Acidificazione extracellulare (ECAR) (mpH/min/µg)

Normale

Linee di celluletumoralipancreatiche (PDCL)

OXPHOS

GLICOLITICO

5

Le cellule tumorali sono dinamiche

Le cellule tumorali sfruttano rapidamente il metabolismo per adattarsi e sopravvivere grazie alla plasticità metabolica

Le vulnerabilità metaboliche possono rivelare i target terapeutici per la chemioresistenza

Rapide alterazioni del metabolismo sono una strategia cruciale per la chemioresistenza La proliferazione del cancro è un processo rapido e dinamico con un'alta domanda di energia biochimica. Di conseguenza, le cellule tumorali manifestano alterazioni del metabolismo che possono basarsi su una sola o su entrambe le vie metaboliche principali, vale a dire glicolisi e fosforilazione ossidativa. La capacità che alcune cellule tumorali possiedono di alternare tra le vie è una strategia chiave che ne promuove l'adattamento. I prodotti per l'analisi cellulare Agilent consentono la misura simultanea delle due vie metaboliche principali in cellule vive e in tempo reale.

ECAR (mpH/min)

0

100

50

150

0 20

OXPHOS alto metabolismo

Chemioresistenzacontroparteisogenica

Chemiosensibile

C200

A2780

glicolitico

40 60 80

OCR

(pm

ol/m

in)

ECAR (mpH/min)

0

20

30

40

10

50

0 10

OXPHOS alto metabolismo

Chemioresistenzacontroparteisogenica

Chemiosensibile

PEO4

PEO1glicolitico

20 30 40

OCR

(pm

ol/m

in)

Cisplatino (µM)

Cellule HCT116

IDH1WT

IDH1MUT

0

200

300

100

0,0 2,5 5,0

****

7,5 10,0 15,0

OCR

bas

ale

(pm

ol/m

in/f

luor

)

Figura 3. Linee di cellule tumorali ovariche chemiosensibili (A2780 e PEO1) presentavano un fenotipo glicolitico. Al contrario, le loro controparti isogeniche chemioresistenti (C200 e PEO4) evidenziavano un fenotipo con elevata attività metabolica con la capacità di alternare tra fosforilazione ossidativa e glicolisi (plasticità). Adattato da Dar, S., et al. Bioenergetic Adaptations in Chemoresistant Ovarian Cancer Cells. Sci Rep. 2017. 7 (1): 8760.

Figura 4. L'analisi Agilent Seahorse XF rivela che l'aumentata chemiosensibilità al cisplatino nelle cellule del tumore del colon IDH1MUT è dovuta a una maggiore vulnerabilità del metabolismo della fosforilazione ossidativa. Il trattamento con cisplatino nelle cellule IDH1MUT HCT116 ne ha ridotto in misura dipendente dalla dose il tasso di consumo di ossigeno (OCR). Adattato da Khurshed, M., et al. IDH1-mutant cancer cells are sensitive to cisplatin and an IDH1-mutant inhibitor counteracts this sensitivity. FASEB J. 2018. fj201800547R.

6

Figura 5. L'analizzatore Agilent Seahorse XF rivela il ruolo cruciale di Nur77 e TPb nell'adattamento delle cellule di melanoma all'ossidazione degli acidi grassi (FAO) in condizioni di scarsità di glucosio. Poiché l'adattamento al FAO facilita la sopravvivenza delle cellule di melanoma, ne consegue che Nur77 è un potenziale target terapeutico nel melanoma. Adattato da Li, X. X., et al. Nuclear Receptor Nur77 Facilitates Melanoma Cell Survival under Metabolic Stress by Protecting Fatty Acid Oxidation. Mol Cell. 2018. 69 (3): 480-492 e7.

Figura 6. L'analizzatore Seahorse XF ha determinato in primo luogo che, a differenza dell'inibitore del lattato AR-C155858, il composto 7ACC2 svolge i ruoli di blocco dell'uso del lattato e, contemporaneamente, di prevenzione del metabolismo ossidativo del glucosio (6A, cellule intere di cancro della cervice uterina). Utilizzando mitocondri isolati, l'analizzatore Seahorse XF rivela inoltre che 7AAC2 inibisce la captazione del lattato tramite l'inibizione del trasportatore del piruvato nei mitocondri, un nuovo meccanismo (6B, mitocondri isolati). Adattato da Corbet, C., et al. Interruption of lactate uptake by inhibiting mitochondrial pyruvate transport unravels direct antitumor and radiosensitizing effects. Nat Commun. 2018. 9 (1): 1208.

Scopri le dipendenze dal substrato delle cellule tumorali

Le cellule tumorali possono variare il metabolismo dei lipidi o degli aminoacidi o mutare l'equilibrio tra processi anabolici e catabolici per adattarsi alle condizioni nutritive del microambiente tumorale. Questi processi possono essere analizzati direttamente tramite misure del metabolismo.

Scopri come la fenotipizzazione metabolica e la tecnologia di analisi cellulare Agilent possono far luce su:

– dipendenze cellulari, inclusi nutrienti e microambiente

– vulnerabilità metaboliche per guidare l'identificazione dei target dei farmaci

– sviluppo ed efficacia dei farmaci antitumorali

La tecnologia Agilent Seahorse XF rivela i potenziali target e meccanismi dei farmaci antitumorali e radiosensibilizzanti

La tecnologia Agilent Seahorse XF differenzia tra i meccanismi di due inibitori della captazione del lattato e farmaci antitumorali in cellule intere e mitocondri isolati 

TPβ-KDNur77-KD

0

20

30

40

10

**

*

OCR

(pm

ol/m

in)

(Pal

:BSA

- BS

A)

***

*****

***NS

***DMSO AR-C1558587ACC2

DMSO

7ACC2

OCR

indo

tto d

a su

bstr

ato

(pm

ol/m

in/m

g pr

otei

na)

A B

0

10

20

30

Mezzi: Latt Glc Latt + glc

InibitoreBasale Pir/Mal

Tempo (min)

0

30

20

10

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120

OCR

(pm

ol/m

in)

Cellule intere Mitocondri isolati

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Le analisi gold standard per le misure sul cancro

Kit di analisi del tasso di ATP in tempo reale Agilent Seahorse XF

Tass

o di

pro

duzio

ne d

i ATP

(pm

ol/m

in)

Mito

Glico

Totale

25%

75%

65%

35%

50%

50%

TestComposto

mitoATP

glicoATPTass

o di

pro

duzi

one

di A

TP(p

mol

/min

)

20 40 60Tempo (minuti)

80 1000

800

600

400

200

0

Profilo del test di stress delle cellule mitocondriali Seahorse XFRespirazione mitocondriale

Tempo (minuti)

Tass

o di

con

sum

o os

sige

no (O

CR)

(pm

ol/m

in)

Oligomicina FCCPRotenone eantimicina A

0

40

80

160

240

120

200

280

320

360

0 20 40 60 8010 30 50 70 90 110100

Consumo di ossigeno non mitocondriale

Respirazionebasale

Respirazionecorrelataad ATP

Respirazionemassima

Perdita di protoni

Capacitàresidua

Kit per il test di stress mitocondriale Agilent Seahorse XF

Permeabilizzante membrana plasmatica Agilent Seahorse XF (N. cat. 102504-100)

Profilo del saggio della velocità glicolitica Seahorse XF

Efflusso totale di protoni

Efflusso glicolitico di protoni

Acidificazionemitocondri

Glicolisi basale

Glicolisi compensatoria

0

100

200

300

400

Tass

o di

eff

luss

o di

pro

toni

(pm

ol/m

in)

0 10 20 30 40 50 60 70

Tempo (minuti)

Rot/AA 2-DG

Velocità glicolitiche

Permeabilizzante membrana plasmatica XFSaggio del flusso di elettroni XF PMP

Tempo (minuti)

Tass

o di c

onsu

mo o

ssige

no (p

mol/

min)

Rotenone

Respirazionecorrelata

al complesso I

Respirazionecorrelata

al complesso IIRespirazione

correlataal complesso IV

Succinato Antimicina AAscorbato/

TMPD

0

200

100

300

400

500

0 20 40 60 8010 30 50 70 90

Kit per saggio del tasso glicolitico Agilent Seahorse XF

LCFAOendogeno

Profilo di ossidazione degli acidi grassi a catena lunga Seahorse XFOssidazione esogena ed endogena degli acidi grassi a catena lunga

Tass

o di

con

sum

o os

sige

no (O

CR)

(pm

ol/m

in)

Ossidazionepalmitatoesogena

180

160

140

120

100

80

60

40

20

00 10 20 30 40 50 60

Tempo (minuti)

Oligomicina

Basale

Massima

FCCPRotenone e

antimicina A

LCFAO endogeno

Ossidazionepalmitatoesogena

Palm:BSA, –Eto

BSA, –Eto

Palm:BSA, +Eto

BSA, +Eto

Substrato FAO palmitato-BSA Agilent Seahorse XF (N. cat. 02720-100)

Scopri le vulnerabilità e la plasticità del cancro ed esegui la fenotipizzazione metabolica tramite misure simultanee di fosforilazione ossidativa e glicolisi per ottenere un quadro completo dei fattori che determinano la funzione cellulare. Ora puoi eseguire misure quantitative con i kit Agilent Seahorse XF per l'analisi del tasso di glicolisi e del tasso di ATP in tempo reale.

Analizzatore Agilent Seahorse XFe96

Le analisi in tempo reale Seahorse XF offrono gli strumenti per studiare le dipendenze, gli oncogeni, i target terapeutici e altro ancora.

Modellizzazione del microambiente tumorale:

– gli analizzatori Agilent Seahorse XFe24 e XFe96 sono compatibili con camera per ipossia

– l'analizzatore Seahorse XFe96 offre un'opzione sferoidi-3D

Valuta l'utilizzo di nutrienti e substrati utilizzando il kit di test dello stress mitocondriale Agilent Seahorse XF e il substrato Palmitate-BSA FAO.

Esegui le stesse analisi che eseguiresti su mitocondri isolati, senza però isolarli.

N. cat. 103592-100 (XF/XFe) e 103591-100 (XFp)

N. cat. 103015-100 (XF/XFe) e 103010-100 (XFp)

N. cat. 103344-100 (XF/XFe) e 103346-100 (XFp)

Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabile per procedure diagnostiche.

Le informazioni fornite possono variare senza preavviso.

© Agilent Technologies, Inc. 2019 Pubblicato negli Stati Uniti, martedì 16 aprile 2019 5994-0741ITE

Gamma Agilent per l'analisi cellulareLe nostre tecnologie all'avanguardia nel campo dell'analisi su cellule vive in tempo reale hanno aiutato i ricercatori a varcare nuovi confini in svariate aree di ricerca. Scopri la gamma completa di soluzioni visitando il nostro sito web all'indirizzo www.agilent.com/chem/discoverxf

Database di pubblicazioni www.agilent.com/publications-database/

Database di riferimento per l'analisi cellulare www.agilent.com/cell-reference-database/

Webinar www.agilent.com/en-us/training-events/eseminars/seahorse-xf-technology-webinars

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