STRESS OSSIDATIVO

STRESS OSSIDATIVO

Stress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente,

di un eccesso di specie chimiche reattive, generalmente centrate

sull’ossigeno (reactive oxygen species, ROS), secondario ad

un’aumentata produzione delle stesse e/o a una ridotta

efficienza dei sistemi fisiologici di difesa antiossidanti.

Radicali liberiAntiossidantiProtezione

dalle malattieDanno cellulare

(invecchiamento e malattie)

Radicali liberiAntiossidanti Radicali liberiAntiossidantiProtezione



Protezione dalle malattieProtezione



Danno cellulare(invecchiamento

e malattie)

PRO-OSSIDANTI ANTIOSSIDANTI

STRESS OSSIDATIVO

Sbilanciamento dell’equilibrio tra pro-ossidanti e antiossidanti

nell’organismo a favore dei pro-ossidanti

Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi pro-ossidanti e processi antiossidanti (Sies, 1991)

Specie reattive Difese antiossidanti

Radiazioni, farmaci, metalli pesantiFumo di sigaretta, alcool, inquinamentoEsercizio fisico inadeguato, sedentarietà

Infezioni ed altre malattie

Ridotta assunzione e/o diminuita sintesi

e/o ridotta capacità di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti

Danno cellulare

Invecchiamento precoce

Malattie cardiovascolari

Altre malattie

Demenza, M. di Parkinson

Infiammazioni,tumori

Danno tissutale

Danno d’organo

Danno sistemico

Reazioni del metabolismo dell’ossigeno

L’ossigeno è una molecola biatomica solitamente rappresentata come

O::O

In realtà alla temperatura corporea l’ossigeno è un biradicale

.O : O.

con due elettroni spaiati, ciascuno localizzato su un orbitale diverso. A causa quindi della sua configurazione elettronica l’ossigeno va incontro a riduzione monovalente ( 1 e-)

Quando un ossigeno guadagna un elettrone, si trasforma in radicale anione superossido, O2

- . L’aggiunta di un secondo elettrone (insieme con due protoni) trasforma quest’ultimo in perossido di idrogeno, H2O2. Il perossido non è un radicale ma guadagna facilmente un altro elettrone dando spazio ad un radicale idrossilico, OH che è una particella chimica molto attiva che inizia facilmente reazioni a catena incontrollabili.

I principali ROS sono: O2

- (anione superossido),

O2H (radicale idroperossido); OH (radicale idrossilico);

NO (monossido d’azoto);

ONOO- (anione perossinitrito).

Esistono altre molecole, quali H2O2 (perossido d’idrogeno) e HOCl (acido ipocloroso) che pur non essendo radicali di per sé, producono facilmente il radicale idrossilico, altamente reattivo

Nei sistemi biologici, i radicali liberi dell’ossigeno o ROS (Reactive Oxygen Species) vengono generati ed eliminati continuamente.

Le specie chimiche reattive, radicaliche, agiscono come ossidanti

L’ossidazione, ovvero il trasferimento di uno o più elettroni, è la base chimica dello stress ossidativo

++

Radicale (ossidante)

A A

Nuova molecola (ridotta, stabile)

Molecola bersaglio (doppio legame C-C)

C C

Nuovo radicale(ossidante)

CC

Elettrone spaiatoOSSIDAZIONE

REAZIONI DI RADICALI LIBERI

INIZIO: formazione di radicali liberi

PROPAGAZIONE: i radicali liberi reagiscono con altre

molecole per produrre altri

radicali liberi

TERMINAZIONE: i radicali liberi reagiscono tra loro per

formare molecole

REAZIONI DI RADICALI LIBERI

CH4 + Cl2 CH3Cl + HCl

INIZIO

Cl Cl Cl Cl

• Richiesta luce UV per questo primo stadio

• Formazione di radicali liberi

PROPAGAZIONE

• Non è richiesta luce

• Ogni reazione produce radicali liberi

La propagazione è caratterizzata da reazioni in ciascuna delle quali si consuma un radicale libero e se ne forma un altro

Molecole H

Cl + H C H

H

Radicali liberi

H

Cl H + C H

H

H

H C + Cl Cl

H

H

H C Cl + Cl

H

TERMINAZIONE

La terminazione è caratterizzata dalle reazioni dei radicali liberi per produrre molecole

Cl + Cl

H H

C H C H H H

H

Cl + C H

H

H

Cl C H

H

Cl Cl

H H

H C C H

H H

Diverse specie chimiche reattive sono implicate nella patogenesi dello STRESS OSSIDATIVO

Non radicale

HOClOAcido ipocloroso

Radicale-STiile

Non radicale

ROONO(Alchil)perossinitrito

Non radicale

NO2+Catione nitronio

Non radicale

ONOOHAcido perossinitroso

Non radicale

ONOO-Perossinitrito

Non radicale

N2O3Triossido nitrico

Non radicale

N2O4Tetrossido nitrico

Non radicale

HNO2Acido nitroso

RadicaleNOOssido nitricoNon

radicaleO3Ozono

RadicaleE-OFenossile (dalla vitamina E)

RadicaleQSemichinone (dal Coenz. Q)

Non radicale

ROOH(Alchil)idroperossido

RadicaleROO(Alchill-)perossil radicale

RadicaleRRadicale alchilico

RadicaleHORadicale ossidrile

Non radicale

H2O2Perossido di idrogeno

Radicale (?)1O2*Ossigeno singoletto

RadicaleO2Anione superossido

ClasseFormulaSpecie chimica ClasseFormulaSpecie chimica

I ROS vengono prodotti sia attraverso una serie di reazioni

catalizzate da enzimi che attraverso reazioni di natura non

enzimatica.

I ROS possono essere prodotti anche in seguito ad esposizione

a radiazioni ionizzanti, xenobiotici, agenti chemioterapici.

reazione di Fenton: H2O2 + Fe2+ (Cu+ ) Fe3+ (Cu2+) + HO + OH-

reazione di Haber-Weiss: H2O2 + O2

- HO + OH- + O2 Il perossido di idrogeno in presenza di ioni Fe2 + o Cu2+ reagisce con l’anione superossido prendendo parte alla:

I mitocondri vengono considerati la fonte principale di ROS cellulari poiché i radicali del superossido vengono generati costantemente durante la fosforilazione ossidativa e possono essere convertiti in H2O2 ed altre specie reattive dell’ossigeno

Durante i processi di fosforilazione ossidativa, il 4-5% dell’ossigeno non viene completamente ridotto ad H2O, ma forma prodotti intermedi dell’O2 altamente reattivi

Nella cellula, i ROS oltre che nei mitocondri, vengono generati anche in altri compartimenti e da molti enzimi.

Numerose attività metaboliche sono in grado di generare ROS

Citocromo P450

Citocromo b5

NADH deidrogenasiCitocromo ossidasi

NADPH ossidasiLipoossigenasi

Xantina ossidasi Aldeide ossidasi

Stress ossidativoda modificazioni reattivedella superficie cellulare

Stress ossidativo da induzione

farmacometabolica

Stress ossidativo da variazioni

intracellulari della pO2

Stress ossidativoda ridotta efficienza del-la respirazione cellulare

Citocromo P450

Citocromo b5

Xantina ossidasi Aldeide ossidasi

NADPH ossidasiLipoossigenasi

NADH deidrogenasiCitocromo ossidasi

Produzione di ROS dal catabolismo purinico

Xantina Xantina ossidasiossidasi

ipoxantinaipoxantina xantinaxantina xantinaxantina Acido uricoAcido urico

HH22O + OO + O22 HH22OO22 OO22 OO22..

Meccanismo d’azione della NADPH ossidasi

Biosintesi dell’NO

Agisce come importante

messaggero intra ed inter

cellulare regolando molte

funzioni: pressione arteriosa,

respirazione, coagulazione

del sangue ed alcune attività

cerebrali.

Ha un ruolo determinante

nella difesa dalle infezioni

batteriche e nella

prevenzione dei tumori

MECCANISMI DI PRODUZIONE DI ROS

Negli organismi viventi i ROS sono generati nel corso della normale attività metabolica cellulare

A concentrazioni elevate i ROS sono dannosi per l’organismo in

quanto attaccano i maggiori costituenti della cellula (proteine, acidi

nucleici, lipidi) partecipando così a processi complessi quali

l’invecchiamento e le patologie ad esso correlate.

A concentrazioni moderate i ROS partecipano attivamente ad una

varietà di processi biologici complessi, implicati nella normale

crescita cellulare quali la trasduzione del segnale, il controllo

dell’espressione genica, la senescenza cellulare, l’apoptosi

Effetto dei ROS sulle macromolecole

I ROS causano danni ossidativi, chimici alle biomolecole Il radicale idrossilico OH reagisce con le biomolecole tramite reazioni di sottrazione o addizione di H. Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi

Il radicale idrossilico OH reagisce con vari amminoacidi per formare derivati idrossilati

Il radicale idrossilico OH reagisce con le basi azotate I ROS reagiscono anche con i carboidrati per formare composti dicarbonilici

La matrice cellulare rappresenta uno dei principali target

delle specie reattive dell’ossigeno

Il danno della matrice extracellulare gioca un ruolo determinante nella patogenesi dello stress ossidativo

Gli effetti dello stress ossidativo sulla struttura e sulle funzioni cellulari

Cellula normale(senza lesioni)

Cellula dopo l’attacco dei ROS

Perossidazione di lipidi

Modificazioni enzimatiche

Modificazioni del DNA

Denaturazionedi proteine

Perossidazione ammi-noacidi e proteine

(Per)ossidazione di carboidrati

Alterazioni dellaomeostasi ionica


Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi.

Il radicale idrossilico OH sottrae un atomo di idrogeno ad un acido grasso poliinsaturo, iniziando così una catena di reazioni di perossidazione lipidica.

I perossidi lipidici formati in questa reazione vengono degradati per formare dei prodotti caratteristici quali la malonildialdeide (MDA) o l’idrossinonenale (HNE)

Questi composti reagiscono con le proteine formando legami crociati e addotti chimici con esse (prodotti finali di lipoossidazione avanzata)

DANNO INDOTTO DALLA LIPOPEROSSIDAZIONE ALLE MEMBRANE BIOLOGICHE

RADICALI LIBERI

ridotta fluidita’ di membrana

perossidazione dei PUFA

(acidi grassi polinsaturi)

compromessa attività cellulare

NEOPLASIE

MALATTIE

CARDIOVASCOLARI

INVECCHIAMENTO


Il radicale idrossilico OH reagisce con vari amminoacidi per formare derivati idrossilati

H2O2 e HOCl e ONOO- reagiscono con la metionina e la tirosina per formare nitro-e-clorotirosina e metionina solfossido


Il radicale idrossilico OH reagisce con le basi azotate. I maggiori prodotti dell’ossidazione sono la 8-ossiguanosina (il principale indicatore di danno al DNA), timinaglicole, 5-idrossimetiluracile

RADICALI LIBERI E ACIDI NUCLEICI

EFFETTI DEI RADICALI LIBERI NEI

SISTEMI BIOLOGICI

Difese antiossidanti Per evitare i danni ossidativi, la cellula ha sviluppato un sofisticato sistema di difesa

nei confronti dei ROS di natura enzimatica e non (attività “scavenger”). Tali meccanismi di difesa sono fondamentali per l’omeostasi redox cellulare che dipende dal bilancio tra generazione dei ROS e sistemi antiossidanti. Quando l’equilibrio si sposta a favore dei primi oppure la cellula si trova in uno stato di carenza di difese antiossidanti si crea la condizione di stress ossidativo.

I principali enzimi responsabili dell’omeostasi redox cellulare sono: la superossido dismutasi (SOD) la catalasi la glutatione perossidasi la tioredossina la perossiredossina

Questi enzimi funzionano come “scavengers” dei ROS, ma non possono intervenire direttamente sulle macromolecole biologiche a rimuovere un danno già avvenuto.

Il sistema antiossidante è regolarmente distribuito nella cellula

ANTIOSSIDANTI

ENDOGENI

Enzimi: SOD, catalasi, glutatione perossidasi

Proteine: proteine-SH, leganti metalli (Fe, Cu)

Altre molecole: acido urico, bilirubina ...

Vitaminici:

• Vitamina C

• Vitamina E

• Carotenoidi (-carotene)

Non vitaminici:

• Carotenoidi

• Polifenoli

ESOGENI

Meccanismo d’azione degli antiossidanti

Antiossidanti preventivi

Bloccano la formazione dei

radicali

Antiossidanti

scavenger

Bloccano la reazione di inizio

Bloccano la reazione di propagazione

Riparano il danno e ricostituiscono le membrane

Antiossidanti di riparo e de novo

Inquinanti, fumo, radiazioni, metalli pesanti,farmaci, alcool, ischemia-riperfusione, …

Specie Chimiche Reattive

Attacco di biomolecole(glicidi, lipidi, proteine,

ecc)

Reazioni radicaliche a catena

Danno ossidativo

Invecchiamento, malattie

ANTIOSSIDANTI PREVENTIVI

Prevengono la formazione dei radicali liberi

Classe Esempi Meccanismo d’azione Transferrina, lattoferrina, ferritina Sequestro di ferro Aptoglobina Sequestro di emoglobina Emopessina Stabilizzazione dell’eme

Sequestratori di metalli

Ceruloplasmina, albumina Sequestro di rame Carotenoidi Quenching dell’ossigeno singoletto “Quencher”

di ROS Superossido dismutasi 2O2• + 2H+ H2O2 + O2

Catalasi

2 H2O2 2 H2O + O2

Perossidasi H2O2 + AH2 2 H2O + A LOOH + AH2 LOH + H2O + A

Glutatione perossidasi (plasmatica)

PLOOH+2GSH PLOH+H2O+GSSG

Glutatione perossidasi (dei perossidi fosfolipidici)

H2O2 + 2 GSH 2 H2O + GS–SG PLOOH+2GSH PLOH+H2O+GSSG

Glutatione perossidasi (intracellulare)

H2O2 + 2 GSH 2 H2O + GS–SG LOOH+2GSH LOH+H2O+GS–SG

Inattivatori di perossidi

Glutatione–S–trasferasi

Scissione dei perossidi lipidici

ANTIOSSIDANTI SCAVENGER

Riducono la concentrazione di radicali liberi rimuovendoli dal mezzo in cui si trovano

Natura idrofila: albumina, acido urico, vitamina C

Natura lipofila: carotenoidi, vitamina E, coenzima Q

AGENTI DI RIPARO

Enzimi che intervengono dopo il danno effettuato dai radicali liberi

Idrolasi, transferasi, polimerasi

AGENTI DI ADATTAMENTO

Sostanze o tecniche attraverso le quali è possibile potenziare il sistema antiossidante fisiologico di un organismo

esercizio fisico, regime alimentare corretto ed equilibrato

ANTIOSSIDANTI SOLUBILITA’ RDA M/F DOVE

VitaminaA

Vitamina C

Vitamina E

Licopene

Bioflavonoidi

GTE (green tea extract)

Sali di Mg,Zn

Se, Cr

Grassi poliinsaturi

Acidi grassi (Omega 6)

Acidi grassi (Omega 3)

liposolubile

idrosolubile

liposolubile

liposolubile

Idrosolubile

1000/800

60/60mg

10/8 mg

1.7/1.3 mg

5 gr

5-6 gr

Frutta gialla, arancione o verde scura

Frutta, ortaggi a gemma

Fegato, uova

Pomodoro

Cereali, carne, latte

Te’ verde

Olio d’oliva

Semi vegetali

Pesce

ANTIOSSIDANTI ENDOGENI

ENZIMATICI, CELLULARI

SUPEROSSIDO DISMUTASI

(SOD)

Principale antiossidante cellulare, mantiene bassa la concentrazione di anione superossido (O2

-• )

Converte l’anione superossido in perossido d’idrogeno

Agisce in collaborazione con la catalasi e la glutatione perossidasi

La superossido dismutasi (SOD)

La SOD catalizza la reazione di dismutazione dell’anione superossido:

2 O2- + 2H+ H2O2 + O2

Se ne conoscono varie forme isoenzimatiche.Nei mitocondri l’isoenzima utilizza come cofattore il manganese (MnSOD). Altri isoenzimi, di cui alcuni anche a localizzazione nucleare hanno come cofattori rame o zinco (Cu/ZnSOD). Esiste anche un isoenzima Cu/ZnSOD extracellulare secreto (EC-SOD)

La catalasi (appartiene alla classe delle ossido-reduttasi), localizzata nei perossisomi, inattiva l’H2O2 catalizzando la reazione:

2H2O2 O2 + 2H2Ocontiene un gruppo eme

CATALASI (CAT)

2 H2O2 2 H2O + O2

Eme-proteina presente nei perossisomi e nel citosol degli RBC

Agisce con la SOD per la rapida detossificazione dell’anione superossido (O2

-•)


ENZIMATICI, CELLULARI

PEROSSIDASI (Px)

Diverse forme, diverse localizzazioni, diversi substrati

Difesa cellulare primaria contro i perossidi (R-OOH, H2O2)

Convertono i perossidi in H2O in presenza di riducenti

R-OOH + AH2 R-OH + A + H2O

La glutatione perossidasi

GLUTATIONE PEROSSIDASI (GSH-Px)

2 H2O2 2 H2O + O2

2 GSH GSSG

ROOH ROH + H2O

GLUTATIONE REDUTTASI

NADPH2NADP+

ANTIOSSIDANTI ENDOGENIENZIMATICI, CELLULARI

Richiede selenio (cofattore) e glutatione (riducente)

Tripeptide (Glu-Cys-Gly) endogeno idrofilo a basso PM Cofattore della glutatione-perossidasi (GPx) Consente alla GPx di svolgere il suo ruolo antiossidante

GLUTATIONE (GSH)

GLUTATIONE (GSH)

Azione disintossicante

Attività immunitaria

Attività protettiva nei riguardi del SNC

E’ presente in alimenti quali: cocomero, avocado, asparagi,

pompelmo, patate, fragole, pomodori, arance, spinaci.

Ciclo del glutatione

2 NADP+

2 NADPH + H+

2 GSH

GS – SG 2 H2O

H2O2

GS – SG TRASLOCASI

ESCREZIONE

Pr – SH Pr – SG + GSH

H2O + ½ O2

O2•

GSH–R GPx

SOD

CAT

Agenti esogeni/metabolismo

SOD: superossidodismutasiCAT: catalasiGPx: glutatione perossidasiGSH-R: glutatione reduttasi

La vitamina C e la vitamina E agiscono in maniera coordinata e sinergica: la vitamina C rigenera l’-tocoferolo trasformandosi in radicale ascorbile, e viene riconvertita ad acido ascorbico da una reduttasi NADPH-dipendente.

L’-tocoferolo protegge le membrane dal danno ossidativo in quanto blocca le reazioni a catena caratteristiche del processo di perossidazione lipidica delle membrane biologiche.

Le principali molecole non enzimatiche che contribuiscono all’equilibrio redox cellulare sono:

la vitamina C (o acido ascorbico),

la vitamina E (o -tocoferolo),

vitamina A (o -carotene),

l’urato, il piruvato, e infine il GSH

ANTIOSSIDANTI ENDOGENINON ENZIMATICI

PROTEINE -SH:

• Agiscono come antiossidanti plasmatici.

• Acquistano un e- generando un radicale sulfidrilico (-S•) più stabile.

PROTEINE LEGANTI Cu-Fe:

• Proteine di trasposto: transferrina (2Fe+++) e ceruloplasmina (Cu++)

• Proteine di deposito: ferritina (FeOOH)


NON ENZIMATICI

BILIRUBINA:

• Prodotto di degradazione dell’eme

• Blocca i radicali perossilici a livello plasmatico

ACIDO URICO:

• Prodotto finale del catabolismo delle purine (adenina e guanina)

• Chela i metalli e riduce l’ozono (antiossidante del tratto respiratorio)

ACIDO URICO

Sostanza a basso peso molecolare, idrofila Potente scavenger contro vari ossidanti (HO•,O2*, O3, HClO)

Chelante nei confronti di metalli di transizione (Fe, Cu) Previene l’ossidazione Fe-dipendente dell’ascorbato

N

N

H

N

N

OH

HO

OH

N

N

H

N

N

OH

HO

OH

ANTIOSSIDANTI ESOGENIVITAMINICI

ACIDO ASCORBICO (Vitamina C)

Principale antiossidante extracellulare idrosolubile

Può bloccare O2-•, HO•, H2O2,

1 O2

Riducendo il radicale tocoferile rigenera la vitamina E

Il radicale ascorbile è rigenerato dalla NADPH deidroascorbato reduttasi, mentre il deidroascorbico dall’ascorbico reduttasi-GSH.

Vitamina C

VITAMINA E

ANTIOSSIDANTI ESOGENI

VITAMINICI

Attività antiossidante vitamina E

VITAMINA E

• Sostanza liposolubile.

• Principale radical-scavenger delle membrane e delle

lipoproteine.

• Agisce bloccando i radicali perossilici formatisi durante la

perossidazione lipidica.

• Può essere rigenerata dall’acido ascorbico e dal GSH.


ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE

Molecola liposolubile associata alle membrane biologiche e alle lipoproteineprotegge i grassi poliinsaturi dalla perossidazione

ATTIVITA’ NON ANTIOSSIDANTE

A carico di RRR- tocoferil succinatopotente agente antitumorale

VITAMINA E

INIBISCE LA PROLIFERAZIONE

DI CELLULE MALIGNE

CAUSA APOPTOSI

È ANTI-ANGIOGENICA

INIBISCE VEGF(fattore di crescita vascolare)

Vit. E

VITAMINA E e neoplasieVITAMINA E e neoplasie

CAROTENOIDI

• Gruppo di pigmenti rossi, arancio e giallo presenti soprattutto nella frutta e vegetali.

• Sostanze liposolubili.

• Alcuni hanno attività vitaminica (-carotene).

• Presenti nelle membrane cellulari e veicolati dalle lipoproteine.

• Interrompono le reazioni a catena dei radicali perossili (R-OO•)

• Bloccano i radicali tra cui anche l’1O2 (ossigeno singoletto) tramite due meccanismi:

• trasferimento del e-

• addizione del radicale alla molecola


• Antiossidante naturale della famiglia dei carotenoidi,

presente in elevate concentrazioni nel pomodoro maturo e in

misura minore nel cocomero, albicocca, uva e papaia

• Chimicamente costituito da carbonio e idrogeno ed in natura

è rinvenibile nella struttura “trans”

• Tempo di emivita 2-3 giorni, maggior metabolita 5,6-

diidrossi-5,6diidrolicopene

LICOPENE

LICOPENE

Sembra avere un ruolo importante nella prevenzione di

alcune malattie degenerative quali il cancro e le malattie

vascolari, che sembrano in parte dipendere da fenomeni

ossidativi

Il meccanismo di azione alla base dell’attività antitumorale del

licopene è ancora sconosciuto

LICOPENE

In pazienti con tumore della prostata la supplementazione con

licopene per sole 3 settimane ha determinato una riduzione dei

valori sierici di PSA (un marker usato comunemente per

monitorare l’andamento della malattia), suggerendo un effetto

antiproliferativo specifico sulle cellule neoplastiche prostatiche

POLIFENOLI

Ampia classe di composti derivati dal metabolismo secondario

delle piante

Chimicamente sono derivati ciclici del benzene sostituiti con

gruppi idrossilici

Comprendono molecole sia semplici come gli acidi fenolici

oppure altamente polimerizzate come i tannini

Scavenger nei confronti dei radicali HO• e O2•

ANTIOSSIDANTI ESOGENI

NON VITAMINICI

• bloccare i radicali liberi

• legare i metalli di transizione

• inibire l’ossidazione delle LDL

• rigenerare il radicale tocoferile

O

A

B

C

1'2

3

45

6

7

8

2'

3'

4'

5'

6'

Struttura dei flavonoidi

O

OH

R1R2

R3

R4

R1R2

R3

R4

O

OH

Struttura degli acidi fenolici

Sostanza a basso peso molecolare, relativamente idrofila Scavenger di vari ossidanti (HO•, O2*, HClO)

Chelante nei confronti dei metalli di transizione (Fe, Cu) Consente la rigenerazione delle vitamine C ed E Prodotto nell’organismo, è coinvolto nel complesso della piruvato deidrogenasi, funzionando da accettore di elettroni, grazie al suo ponte disolfuro, reattivo

SH

COOH

SHSH

COOH

SH S

COOH

SS

COOH

S

Forma ridotta (attiva) Forma ossidata

ACIDO LIPOICO

Ac. LIPOICO

(25-100µM) induce

ATTIVITA’ antiossidanti:Catalasi (+55%)Superossido dismutasi Glutatione reduttasiGlutatione perossidasiGlutatione transferasiEffetto dose

dipendente

Ac. LIPOICO(25-100µM) riduce

ACCUMULO ROS(-55%)

DIMOSTRAZIONE IN VITRO DELL’ EFFETTO PROTETTIVO

DELL’AC.LIPOICO IN Saccaromycetes cerevisiae

Perossido di Idrogeno (H2O2)

4-5mM

Ossidante (H2O2) + Acido

Lipoico 0.01-0.1mM

Riduce le possibilità di

sopravvivenza della

cellula (Saccaromycetes

cerevisiae)

Riduce il n delle

generazioni

successive

Aumenta il n

delle generazioni

successive

Aumenta la possibilità

di sopravvivenza della

cellula

Coenzima Q10

Sostanza lipofila a basso peso molecolare Scavenger nei confronti dei radicali perossilici (ROO•) Consente la rigenerazione dei tocoferoli

OH3CO

H3COO

CH3

(CH2 – CH = C – CH2)10H

CH3

OH3CO

H3COO

CH3

(CH2 – CH = C – CH2)10H

CH3

Ruolo del Coenzima Q e della vitamina E nell’inibizione della perossidazione lipidica

INIZIO

Fe3+ O2

Fe3+ H2O2 UQ•

UQH2

UQ•

L – H

L•

O2

LOO•

LOOH

E – OH

E – O AH- UQH2

A• UQ•

UQH2

L – H

L•

PROPAGAZIONE

INIZIO

Fe3+ O2

Fe3+ H2O2 UQ•

UQH2

UQ•

L – H

L•

O2

LOO•

LOOH

E – OH

E – O AH- UQH2

A• UQ•

UQH2

L – H

L•

PROPAGAZIONE

ZINCO

Componente essenziale di numerosi enzimi, in cui svolge un

ruolo strutturale, di regolazione e catalitico: l’amminoacil-

RNA-sintetasi, la DNA e l’RNA polimerasi, la fosfatasi

alcalina, la lattico deidrogenasi, la superossido dismutasi

e le carbossipeptidasi A e B

Attività antiossidante, prevenendo la perossidazione

lipidica e riducendo la formazione dei radicali liberi

MANGANESE

E’ un cofattore dell’attività di numerosi enzimi (arginasi, piruvato carbossilasi, superossido dismutasi)

SELENIO

Componente dell’enzima glutatione perossidasi, che

impedisce l’ossidazione dell’emoglobina e quindi l’emolisi

degli eritrociti. Agisce in sinergismo con la vitamina E

Azione antiforfora e antimicotica

In laboratorio, per valutare lo stato redox, è possibile dosare:

Alcuni enzimi antiossidanti (SOD, GPx, glutatione reduttasi,

catalasi)

Vitamine

Potere antiossidante totale del siero

Prodotti di lipoperossidazione (malonildialideide MDA,

sostanze reattive all’acido tiobarbiturico TBARS)

Metaboliti reattivi dell’ossigeno (ROM’s)

Valutazione dello stress ossidativo ed idroperossidi

Gli idroperossidi sono marker ed amplificatoridelle lesioni da STRESS OSSIDATIVO

Aumentata produzione

di ROS (O2., HO., H2O2,…)

Compromissione della barriera antiossidante (vit. C, vit. E,…)

Perossidazione di biomolecole con produzione di idroperossidi

R-OOH(una classe di ROM)

IDROPEROSSIDI (MARKER ED AMPLIFICATORI DEL DANNO)NEI LIQUIDI EXTRACELLULARI

INVECCHIAMENTO E PATOLOGIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO (ictus, infarto, diabete, demenza, m. di Parkinson, cancro, …)

STRESS OSSIDATIVO: valutare per riequilibrare

VALUTAZIONE GLOBALE DELLO STRESS OSSIDATIVO

Valutare l’“attacco”Status pro-ossidante

Valutare la “difesa”Status antiossidante

PREVENZIONE E MONITORAGGIODELLE MALATTIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO

d-ROMs test, MDAOXY-Adsorbent test, BAP test, -SHp test…

Valutazione dello stress ossidativo

TEST DI LABORATORIO PER LA VALUTAZIONE

DELLO STATUS PRO-OSSIDANTE

d-ROMs test

- Test spettrofotometrico che consente di determinare, in un

campione biologico, la concentrazione degli idroperossidi

(ROOH) su diversi substrati biochimici

- Gli analiti misurati nel test sono metaboliti reattivi

dell’ossigeno (reactive oxygen metabolites, ROM)

Gli idroperossidi presenti in un campione biologico, dopo

aver reagito con un apposito cromogeno sviluppano un

derivato colorato (dal rosa al rosso) rilevabile e

quantificabile per via spettrofotometrica.

La concentrazione degli idroperossidi, direttamente

proporzionale all’intensità del colore rilevato, viene espressa

in unità di U CARR (Carratelli)

1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL

Reazione di Fenton: un metallo di transizione in forma ionica (Fe o Cu) catalizza la scissione di un idroperossido (ROOH), generando nuove specie radicaliche (idroperossili (ROO*) o alcossili (RO*), a seconda che lo ione catalizzante si ossidi (Fe2+ Fe3+ o Cu+ Cu2+) o si riduca.

Nel test gli idroperossidi, nelle condizioni previste dalla reazione di Fenton, generano in vitro radicali idroperossilici ed alcossilici.

1a) R-OOH + Fe2+ R-O* + Fe3++ OH-

1b) R-O* + A-NH2 R-O- + [A-NH2*]+

2a) R-OOH + Fe3+ R-OO* + Fe2+ (Cu+) + H+

2b) R-OO* + A-NH2 R-OO- + [A-NH2*]+

Principio del d-ROMs test

Procedura sperimentale:

Un’aliquota di siero viene diluita in una soluzione tampone (acetato)

pH 4.8; il ferro ionico legato alle sieroproteine, si rende disponibile in

forma libera catalizzando la scissione degli idroperossidi in radicali

idroperossilici ed alcossilici.

Alla soluzione viene aggiunto un cromogeno (N,N-dietil-

parafenilendiammina) che ha la proprietà di cambiare colore (dal

rosa al rosso) quando viene ossidato.

E’ necessario preparare lo standard (o calibratore), fornito

all'interno di un kit commerciale sottoforma di siero liofilo a titolo

noto (U CARR).

Procedura cinetica standard: si preparano 3 soluzioni (bianco,

campione (preferibilmente siero fresco) e calibratore)

incubazione delle soluzioni per 1 min a 37°C;

lettura fotometrica (abs a 505 o 546 nm) a 0, 1, 2 e 3 min.

Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il calibratore si

sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco.

Procedura endpoint: si preparano 3 soluzioni (bianco, campione

(siero o plasma eparinato) e calibratore).

incubazione delle soluzioni a 37°C per 75 min;

lettura fotometrica (abs a 505 o 546 nm).

Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il

calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco.

Valori di riferimento nell’uomo:

250-300 U CARRcioè 20.08-24.00 mg/dL di H2O2

Un aumento delle U CARR indica una gravità crescente di stress ossidativo

Unico test disponibile per la valutazione complessiva della

componente lesiva, pro-ossidante, dello stress ossidativo che unisce a

questa specificità una standardizzazione utile nella pratica clinica

routinaria e la possibilità di integrarsi con altri test sullo stress

ossidativo.

· preciso e affidabile;

· richiede una strumentazione relativamente semplice (un

fotometro termostatato ed una centrifuga);

· possiede tutti i vantaggi di un mono test (rilevazione fotometrica

diretta di un’unica miscela di reazione, contenente il campione e il

reattivo cromogeno);

· richiede una minima manualità, con notevole riduzione delle

possibilità di errore.

• nella perossidazione lipidica si formano prodotti di degradazione;

• essi sono utilizzati per misurare il grado di perossidazione; si misura la formazione della malonildialdeide (dialdeide malonica, MDA)

MDA (malonilaldeide o malonildialdeide, CHO-CH2-

CHO): prodotto finale delle reazioni a catena innescate

nelle membrane cellulari dall’attacco ossidativo, da parte

di alcuni ROS (radicale idrossile), degli acidi grassi

poliinsaturi (acido arachidonico, costituente dei fosfolipidi

di membrana).

MDA test

MDA: indicatore piuttosto tardivo di stress ossidativo.

Svantaggi: non è sempre in grado di poter svelare

precocemente uno stato ossidativo alterato.

La MDA è scarsamente specifica; è un prodotto di

decomposizione ossidativa di amminoacidi, di

carboidrati e di prostaglandine;

E’ un prodotto di ossidazione dell’acido ascorbico,

risulta inutilizzabile il suo dosaggio ai fini di un

eventuale monitoraggio terapeutico in corso di

trattamenti antiossidanti.

TOTAL ANTIOXIDANT STATUS

Valutazione dell’efficacia della barriera ossidante, che si oppone all’azione lesiva dei radicali

PRINCIPIO DEL METODO

Rilevazione della capacità del siero in esame di opporsi ed inibire la cascata di reazioni che portano alla formazionedei radicali liberi

Nel plasma è identificabile una “barriera antiossidante”, alla cui costituzione contribuiscono sostanze esogene ed endogene.

Questi componenti, “donando” elettroni, bloccano la potenziale lesività dei radicali liberi.

Qualsiasi “insulto” a carico di tale barriera consente ai radicali liberi di attaccare e danneggiare le strutture cellulari.

Rappresentazione schematica della barriera antiossidante plasmatica

L’efficienza della barriera antiossidante plasmatica può essere

valutata saggiandone la capacità di ridurre un determinato

substrato, ossia di donare elettroni ad un agente ossidante

(avido di elettroni), che funge da “sensore”.

Il potere antiossidante è, in termini rigorosamente chimici,

un’attività riducente, cioè elettron-donatrice.

BAP-TEST

BAP test (biological antioxidant potential, determinazione

del potenziale biologico antiossidante): test fotometrico.

Si basa sulla capacità che ha una soluzione di ioni ferrici (Fe3+)

complessati ad un cromogeno di colorarsi, quando gli ioni Fe3+

sono ridotti a ioni ferrosi (Fe2+), come accade se si aggiunge ad

essa un adeguato sistema riducente, ossia antiossidante, quale il

plasma.

Il campione di plasma (ottenuto dal sangue intero mediante

centrifugazione) viene aggiunto ad una soluzione colorata

(FeCl3, cloruro ferrico + cromogeno, un tiocianato).

Dopo un’incubazione (5 min) la soluzione si decolorerà e la

decolorazione sarà tanto più marcata quanto più i componenti

del plasma ridurranno gli ioni ferrici presenti, responsabili

della formazione del complesso cromatico.

Valutando per via fotometrica l’entità della decolorazione, sarà

possibile risalire alla quantità di ioni ferrici ridotti e alla

capacità riducente, ossia al potere antiossidante del plasma

testato.

I risultati del BAP test sono espressi in moli di ferro ridotto per L di plasma esaminato.

Test affidabile, preciso, ripetibile, con un coefficiente di variazione (CV) inter-serie ed intra-serie assolutamente accettabile, anche con metodica manuale (<5%).

Interferenza segnalata è legata alla concentrazione lipidica: un

plasma iperlipemico può indurre una sottostima dei valori.

Il test va obbligatoriamente eseguito a digiuno o dopo un congruo

intervallo di tempo rispetto ad un pasto copioso o all’assunzione

massiva di antiossidanti per os.

Il BAP Test viene eseguito su siero o plasma eparinato

fresco, con lettura fotometrica a 505 nm a 37°C.

Data l’esigua quantità di campione necessaria (10 µl per

l’analisi manuale) il prelievo può essere venoso o

capillare.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Il range stimato del BAP test negli individui normali è 2200-4000 moli/L.

Una riduzione dei valori del test al di sotto dell’intervallo indicato è direttamente correlato con una ridotta efficienza della barriera antiossidante plasmatica.

Test fotometrico che valuta la capacità del plasma di opporsi all’azione ossidante di una soluzione di acido ipocloroso, HClO (ossidante). Il campione di plasma viene sottoposto all’azione di HClO a titolo noto, in evidente eccesso rispetto alle capacità di essere “adsorbito” dalla barriera antiossidante da valutare.

Dopo un intervallo di tempo stabilito, l’HClO residuo reagisce con la N,N-dietilparafenilendiammina che, ossidandosi a spese dell’acido, si trasforma in un derivato colorato in rosa.

OXY-Adsorbent test

La concentrazione del complesso colorato sarà

direttamente proporzionale alla concentrazione di HClO

rimasta in eccesso ed inversamente proporzionale alla

capacità antiossidante del plasma analizzato;

più bassa è la concentrazione residua dell’acido e più

elevata è la capacità antiossidante del campione di plasma

esaminato, e viceversa.

Il valore di riferimento del test è al di sopra di 350 moli/mL di HClO. In condizioni normali, 1 mL di plasma umano è in grado di “adsorbire” e, quindi, neutralizzare, almeno 350 moli di HClO.

Valori inferiori a questa soglia indicano una riduzione dello “spessore” della barriera antiossidante e correlano direttamente con la gravità del danno da questa subito.

Il test viene eseguito su siero o plasma eparinato fresco con lettura fotometrica a 505 o 546 nm a TA.

Il prelievo può essere venoso o capillare.

Test affidabile, preciso, ripetibile, con un coefficiente di variazione (CV) inter-serie ed intra-serie assolutamente accettabile, anche con metodica manuale (<5%).

Il test va eseguito a digiuno o dopo un congruo intervallo di tempo rispetto ad un pasto copioso o all’assunzione massiva di antiossidanti per os.

I tioli rappresentano una componente qualitativamente significativa della barriera antiossidante plasmatica

Si basa sulla capacità dei gruppi -SH di sviluppare un complesso colorato determinabile fotometricamente (405 nm) quando reagiscono con l’acido 5,5ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB).

Il “titolo” di tioli è direttamente proporzionale all’intensità del colore rilevato.

Grado accettabile di imprecisione analitica. Infatti, il CV intra-serie su 20 aliquote di siero fresco è stato pari a 1.7%, quello inter-serie su 20 aliquote di siero congelato 3.3%.

SHp test

Il range negli individui normali è 450-650 moli/L.

Una riduzione dei valori del test al di sotto di questo

intervallo si correla direttamente con una ridotta

efficienza della barriera antiossidante tiolica.

Sistema analitico integrato che consente di eseguire qualsiasi tipo di analisi chimica basata sul principio della fotometria

Sistema FREE (Diacron)

Predisposto per l’esecuzione di test per la valutazione globale dello stress ossidativo (d-ROMs test, l’OXY-adsorbent test, il BAP test e l’-SHp test).

Sistema analitico integrato costituito da un fotometro con

centrifuga incorporata progettato per consentire

l’esecuzione del d-ROMs test su sangue intero, ottenuto

mediante prelievo di sangue capillare. Viene fornito

insieme al kit del d-ROMS test che ne costituisce parte

integrante.

SISTEMA FRAS (Diacron)

Una goccia di sangue, prelevata per digitopuntura, è raccolta in un piccolo capillare e, insieme a questo tubicino, immersa in una provetta contenente una soluzione tampone lievemente acida.

Il campione, dopo una delicata agitazione, è trasferito in cuvetta, ove viene aggiunta una goccia di reattivo cromogeno. La soluzione è sottoposta a centrifugazione e alla lettura fotometrica.

Il fotometro trasformerà l’intensità del colore (proporzionale alla quantità di radicali e, quindi, di idroperossidi presenti nel campione) in unità di concentrazione (U CARR), a cui possono corrispondere determinati livelli di stress ossidativo.

dROM test: errori da evitare

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STRESS OSSIDATIVO