DSB

Double-Strand Breaks

causate da

radiazioni

stress ossidativo

farmaci

DSBe CROMATINA

• Higher-order chromatin packaging is a barrier to the detection and repair of DNA damage

• DSBs induce a local decrease in the density of the chromatin fibre, in addition to altering the position of nucleosomes

• DSBs also elicit post-translational modifications on the protruding histone tails

Chromating remodelling and DSBs

RSC remodels the DSB chromatin

The PIKKs Mec1 and Tel1 phosphorylate H2A(X), and RSC

accumulates in the regions flanking the DSB

SWI/SNF is recruited and remodels the donor template chromatin

RSCcomplex RSC (remodels the structure of chromatin) ATP-dependent chromatin-remodellingRSC can mediate nucleosome sliding, alter histoneDNA contacts

and remove histones from DNA.

The chromatin-remodelling activity of RSC is important for transcriptional regulation of genes that are involved in stress responses and cell-cycle progression

Chromating remodelling and DSBs

Phosphorylated H2A recruits cohesin, which helps to bridgeinteractions between sister chromatids

The HDAC complex Sin3–Rpd3 removes acetylation from H4. The protein kinase CK2 is also recruited and this phosphorylates H4

The INO80 complex enters the region of the DSB and removes some nucleosomes.

MODIFICAZIONE ISTONI• Eukaryotes have several histone variants, which, as a

result of their altered amino-acid composition, can affect both the structure of individual nucleosomes and the ability of nucleosomes to form higher order chromatin structure

• The earliest and most robust modification induced by DSB is phosphorylation of the histone H2A variant H2AX on its extended C-terminal tail.

• Within seconds, phosphorylated H2AX (known as γ-H2AX) spreads over a region spanning thousands to millions of bases surrounding a DSB

H2AX extended Ctail

PIKKs =phosphatidylinositol-3OH-kinase-like kinases

DNA-damage sensor proteinsKu70–Ku80, MRN, RPATOPBP1

DDR proteins initially accumulate at DSB sites and then spread at distance via a positive feedback loop involving MDC1, which binds gH2AX, the MRN complex, and ATM

kinase, which phosphorylates additional H2AX molecules further away from the break site.

DDR signal spreading

Temporal regulation of DDR protein accumulation at DNA breaks

Proteine piattaforma

Nbs1, a subunit of a complex that recognizes DNA DSBs

Mre, Rad50

kinase signaling

HRR

SSB

ATMP

The MDC1 TQXF motifs are ATM targetsrequired for 53BP1 IRIF. (A) Domain architecture

of MDC1, with ATM consensus sites (dots).

Specialized binding modules for recognition of post-translational

modifications (PTMs) at DNA breaks.

• FHA-(R42A) and • RING finger (C406s) mutants.

Ubiquitin ligase activityForkhead associated(FHA) domain bind phosphothreonine-bearing epitopes

interaction with ATM-phosphorylated MDC1.

Domain architecture of RNF8

Forkhead domain

• Cells respond to DSBs by recruiting the DNA-damage mediator protein MDC1, the p53-binding protein 1 (53BP1), and the breast cancer susceptibility protein BRCA1 to sites of damaged DNA.

Orchestration of the DNA-Damage Response by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)

Orchestration of the DNA-Damage Response by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)

• Cells respond to DSBs by recruiting the DNA-damage mediator protein MDC1, the p53-binding protein 1 (53BP1) to sites of damaged DNA.

• 53BP1 is an established player- important role in modulating chromatin structure surrounding the break site- in the cellular response to DNA damage and is a canonical component of ionizing-radiation induced foci (IRIF)

Orchestration of the DNA-Damage Response by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)

Orchestration of the DNA-Damage Response by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)

Ranking by z score of 500 siRNAs giving the least53BP1 foci from a siRNA screen

• Cells respond to DSBs by recruiting the DNA-damage mediator protein MDC1, the p53-binding protein 1 (53BP1), and the breast cancer susceptibility protein BRCA1 to sites of damaged DNA.

Orchestration of the DNA-Damage Response by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)

Orchestration of the DNA-Damage Response by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)

Irradiated (10 Gy) HeLa cells transfected with the indicatedsiRNAs were stained with antibodies to gH2AX, BRCA1

• Cells respond to DSBs by recruiting the DNA-damage mediator protein MDC1, the p53-binding protein 1 (53BP1), and the breast cancer susceptibility protein BRCA1 to sites of damaged DNA.

• The ubiquitin ligase RNF8 mediates ubiquitin conjugation and 53BP1 and BRCA1 focal accumulation at sites of DNA lesions.

MDC1 recruits RNF8 through phosphodependent interactions between the RNF8 forkhead-associated domain and motifs in MDC1 that are phosphorylated by the DNA-damage activated protein kinase ataxia telangiectasia mutated (ATM).

Depletion of the E2 enzyme UBC13 impairs 53BP1 recruitment to

sites of damage, which suggests that it cooperates with RNF8. RNF8 promotes the G2/M DNA damage checkpoint and resistance to

ionizing radiation. the DNA-damage response is orchestrated by ATM-dependent

phosphorylation of MDC1 and RNF8-mediated ubiquitination.

Orchestration of the DNA-Damage Response by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)

Orchestration of the DNA-Damage Response by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)

Mutazioni in BRCA 1 o 2 inattivazione meccanismo HRR predisposizione allo sviluppo di Carcinoma mammario ereditario, con insorgenza precoce tumore seno e ovaie

BRCA 1: 50% mutazioni tumore mammario famigliare

Eredità di un allele mutante predisposizione al tumore, che insorge solo quando la seconda copia del gene è persa o mutata (perdita di eterozigosità)

BRCA 2: 35% mutazioni tumore mammario famigliare

• impairment of homologous repair in Brca1-deficient mouse embryonic stem cells

• increase in the frequency of NHEJ in Brca1-deficient cells

BRCA 1BRCA 1

Riparazione per ricombinazione omologa (HRR)

Riparazione per ricombinazione omologa (HRR)

Ripara le DSBs (Double-Strand Breaks) causate da radiazioni, stress ossidativo, farmaci

Replicazione e trascrizione vengono bloccate nel sito della DSB e le estremità esposte sono soggette a degradazione con perdita di materiale genetico importanza HRR

HRR utilizza come stampo il cromatidio fratello protezione dagli errori

HRR avviene in tarda fase S o in G2, quando i cromatidi fratelli sono vicini

RPA

(ss DNA replication binding protein)

la polimerizzazione di RAD51 sul 3’ libero è BRCA1/2-dipendente

RAD51 (aiutata dall’elicasi RAD54) cerca la sequenza omologa sul cromatidio fratello e invade la doppia elica; le regioni 3’ a singola elica si appaiano con quelle complementari

Sensor MRN

La DNA polimerasi allunga l’estremità 3’ libera (in cui si trova la nucleoproteina RAD51) utilizzando come stampo il cromatidio omologo non danneggiato

L’altra regione 3’ a singola elica attorno alla zona danneggiata si appaia all’elica ormai corretta e gli eventuali gap sono riempiti da polimerasi e ligasi

BRCA1/BRCA2

Human BRCA2 is a mediator that interacts directly with approximately eight RAD51 molecules and transports them to the site of ss-DNA

bound by RPA

PALB2 and BRCA1 are co-mediators that directly and indirectly, respectively, interact with BRCA2 and assist in localizing it, with RAD51 bound, to the sites of DNA damage

Determination of regions required for the

BRCA1-PALB2 interaction.

(A) Graphical projection ofassociation between PALB2 (residues 9 – 42) and BRCA1 (residues 1393–1424) coiled-coil domains. Positions of the heptad repeat (positions a to g) were predicted by the Coil programBoxed residues were experimentally demonstrated to be responsible for the hetero-oligomeric interaction between PALB2 and BRCA1.

• The BRCA1 tumor suppressor exists as a heterodimeric complex with BARD1, and this complex is thought to mediate many of the functions ascribed to BRCA1, including its role in tumor suppression.

• The two proteins share a common structural organization : an N-terminal RING domain and two C-terminal BRCT motifs

• • the BRCA1/BARD1 heterodimer enhances chromosome

stability by promoting homology-directed repair (HDR) of double strand DNA breaks.

BRCA 1BRCA 1

BRCA 1BRCA 1- Gene oncosoppressore, localizzato sul cromosoma 17

N-ter: dominio RING FINGER, coordina il legame con 2 ioni zinco contatta DNA

C-ter: dominio BRCT induce / reprime geni; interazione con RNA pol II

- Espressione nel nucleo di molti tipi cellulari

BRCA 1BRCA 1

Ubc13 and Rnf8are recruited to sites of DNA damage through DNA-damage-induced phosphorylation of a chromatin-associated protein

• An E3 ubiquitin ligase mediates the transfer of activated ubiquitin from an E2 ubiquitin-conjugating enzyme to its substrate lysine residues.

• BRCA1 has the ability to direct the synthesis of specific polyubiquitin chain linkages, depending on the E2 bound to its RING.

BRCA 1BRCA 1

•Inibisce la trasduzione del segnale da parte del recettore per l’estrogeno

•Lega Rad50/51 e BRCA2 Riparazione HRR

Reprime la proliferazione dell’epitelio mammario che è

estrogeno-dipendente

Mutazioni in BRCA1 possono determinare un’incontrollata proliferazione, in particolare delle cellule che rispondono all’estrogeno tumore

•Lega p53 attivando p21 Regolazione delle proliferazione cellulare•Attiva TNF

BRCA1 regulates human mammary stem/progenitor cell fate

PNAS February 5, 2008

Red, ubiquitylationRed, ubiquitylation; Blue, transcriptionBlue, transcription; Green, cell cyclecheckpoint Green, cell cyclecheckpoint

control;control; Light blue, DNA repairLight blue, DNA repair; Gray, chromatin modificationsGray, chromatin modifications.

BRCA1 is implicated in multiple cellular functions

Riparazione per ricombinazione non omologa (NHEJ)

Riparazione per ricombinazione non omologa (NHEJ)

E’ il meccanismo prevalente per la riparazione delle DSBs, soprattutto negli organismi con elevato numero di sequenze ripetute identiche (l’HRR rischierebbe di appaiare sequenze ripetute di cromosomi diversi)

Può causare l’introduzione di errori nel codice genetico (perdita o aggiunta di nucleotidi)

La via nota è quella Ku-dipendente, ma il NHEJ può avvenire, con meno efficienza, anche in estratti cellulari privi di Ku e DNA-PK esistenza di vie Ku-indipendenti non note

• Mammals have evolved at least two genetically discrete ways to mediate DNA DSB repair: homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ).

• In mammalian cells, most DSBs are preferentially repaired by NHEJ.

• NHEJ consists of at least two sub-pathways—

• the main Ku heterodimer-dependent or “classic” NHEJ (C-NHEJ) pathway and

• an “alternative” NHEJ (A-NHEJ) pathway, which usually generates microhomology-mediated signatures at repair junctions.

L’eterodimero Ku 70/80 lega le DSBs, in tal modo proteggendo le estremità libere dalla degradazione finchè la giunzione non è completa

Ku recluta DNA-PK DNA-PK ha siti di legame sia per le DSBs sia per il DNA a doppia elica adiacente ad esse e promuove l’allineamento delle regioni che hanno microomologie

Autophosphorylation of the DNA-PKcatalytic subunit (DNA-PKcs) after recruitment of DNA-PKcs to

DSBs by Ku

cornerstone of the NHEJ pathway

Ku translocates inwards

synaptic complex

DNA-PKcs interacts with the nuclease Artemis

Dati sperimentali: Davydov et al, 2003

Analisi su omogenati estratti dal cervello di 39 pazienti affetti da Alzheimer (AD) e 7 soggetti sani di pari età (C)

EMSA: electrophoretic mobility shift assay

Utilizza una sonda radioattiva contenente la sequenza di legame per la proteina di interesse (in questo caso Ku) e incubata con estratti nucleari

Principio: in un gel di PAA i complessi DNA-Proteine migrano più lentamente rispetto a DNA libero

Supershift: per confermare che la proteina che si è legata è Ku-80, si aggiunge nell’EMSA un anticorpo specifico. L’anticorpo andrà a legare la proteina Ku e se questa è legata al DNA marcato, il legame dell’anticorpo causerà un ulteriore ritardo nella corsa eleettrofeoretica

Sonda libera

Sonda - Ku

Sonda – Ku - anticorpo

Controllo sano

Paziente Alzheimer

Capacità di legame di Ku al DNA

Alterazione di una delle proteine coinvolte nel meccanismo di NHEJ può determinare invecchiamento precoce

Dati sperimentali: Vogel et al., 1999

Topi privi di entrambe le copie del gene per Ku-86 (Ku 86-/-)

Vita media Ku 86 -/-: 3814 wksVita media controlli: 9717 wks

Età massima raggiunta da un topo Ku 86 -/-: 87 wks

Età massima raggiunta da un topo di controllo: 127 wks

Topi Ku 86-/-: insorgenza precoce di tumori, atrofia della pelle e dei follicoli, chiusura delle epifisi, curvatura della spina dorsale, assottigliamento della pelle

Topi DNA-PK-/-: non vanno incontro ad invecchiamento precoce, forse perché l’attività fosforilante di DNA-PK può essere svolta da altre chinasi presenti nella cellula

•Sindrome di Werner: vita media di 50 anni, alopecia, osteoporosi, arteriosclerosi, cataratte, atrofia della pelle,…

Alterazioni nel NHEJ possono determinare invecchiamento precoce anche nell’uomo:Alterazioni nel NHEJ possono determinare invecchiamento precoce anche nell’uomo:

E’ causata da mutazioni nella proteina WRN, una DNA elicasi/nucleasi. WRN ha un ruolo sia nel HRR sia nel NHEJ (interagisce con Ku)

IPOTESI: nei soggetti sani, quando la ricombinazione omologa non è possibile, WRN lega Ku e facilita la riparazione della DSB mediante NHEJ

Nei pazienti affetti, invece, la ricombinazione omologa diventa meno efficiente e anche l’alternativa offerta dal NHEJ non è più favorita dal legame tra WRN e Ku