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INFORME TÉCNICO DEL PROYECTO CGPI-20061598

SUSCEPTIBILIDAD ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS DE ARROZ AISLADAS DE DOS VARIEDADES

Directora: M.C. MA. ISABEL CORTÉS VÁZQUEZ

RESUMEN

El arroz que se produce en México en el Estado de Morelos, es

ampliamente reconocido por su alta calidad. En ello ha contribuido de manera

importante el INIFAP realizando, desde hace varias décadas, diversas

investigaciones orientadas al mejoramiento genético de la subespecie Indica,

con resultados muy importantes en la obtención de genotipos de alta

productividad como son las variedades Morelos A98, utilizada en el 95 % de la

superficie cultivada en Morelos, y la Morelos A92. En este marco de referencia,

con el fin de caracterizar el potencial de estas variedades de arroz, es de interés

caracterizar el efecto de las mejoras genéticas obtenidas en las propiedades

estructurales, químicas y bioquímicas de las proteínas de las variedades

Morelos A98 y A92: ambas de interés económico por su alta productividad. La

generación de más conocimiento en esos aspectos es especialmente importante

por sus posibles implicaciones en la funcionalidad resultante de la fracción

proteínica y por el significado que esto puede tener en sus aplicaciones

alimentarias, incluido el desarrollo de nuevas aplicaciones como ingredientes de

alimentos funcionales.

La susceptibilidad a la proteólisis con enzimas altamente específicas se

utiliza eficazmente en la fisicoquímica de proteínas como herramienta para

probar el efecto de modificaciones químicas o moleculares en la conformación

proteínica. Esta estrategia de análisis de las propiedades estructurales y

conformacionales contribuye de manera importante al entendimiento de las

relaciones estructura-función de proteínas, y en consecuencia, a un mejor

aprovechamiento de sus propiedades. Los estudios bioquímicos de

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susceptibilidad proteolítica permiten obtener un patrón de productos de hidrólisis

específica que sirve como huella de las propiedades conformacionales de una

proteína.

En la investigación propuesta interesa determinar las posibles diferencias

causadas por efecto del mejoramiento genético de la productividad del arroz; y,

complementariamente, conocer la funcionalidad y actividad biológica de las

fracciones resultantes de la proteólisis limitada. En el presente documento se

informan los resultados obtenidos en el aislamiento de las proteínas del arroz

Morelos A92, incluida la separación de las fracciones que la componen, el

análisis preliminar de la funcionalidad de las proteínas aisladas, así como, el

patrón electroforético resultante de la tripsinólisis.

Generalidades.

Las proteínas y el almidón son dos de los mayores componentes del

arroz, con aproximadamente 8 y 80% respectivamente (Marshall y Wordsworth,

1994). Las proteínas del arroz tiene importancia por sus propiedades

hipoalergénicas únicas y alta calidad nutritiva: contenido de lisina (Bean y

Nishita, 1985). Se han desarrollado varios métodos diferentes para extraer las

proteínas del arroz. Generalmente, en una primera operación, la harina es

desengrasada. El contenido proteínico del arroz consiste de cuatro fracciones

con diferente grado de solubilidad: albúminas (solubles en agua), globulinas

(solubles en sal), glutelinas (solubles en álcalis) y prolaminas (solubles en

alcohol). Las globulinas (alrededor del 12%) y las glutelinas (80%) son las dos

proteínas más abundantes; y, la albúmina (5%) y la prolamina (3%) son las

menores (Juliano, 1994). De todas estas fracciones, las glutelinas son las más

importantes. La distribución de las diferentes fracciones solubles en el grano es

desigual. Las albúminas y las globulinas están concentradas en el embrión y la

capa de aleurona. El mayor almacenamiento ocurre en el endospermo.

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La variedad de arroz Morelos A98 (Oryza sativa L.) se puso a disposición

de los productores en 1998 por el INIFAP a través del Campo Experimental de

Zacatepec, Morelos. Proviene de la cruza triple entre los siguientes progenitores:

IR62/LP4-86//LP34-86 efectuada en 1987, y de 1989 a 1992 se resultaron como

ciclos de selección para formar la línea uniforme CAEZ 202-111-87, misma que

de 1993 a 1995 fue evaluada para medir su rendimiento, estabilidad y calidad

industrial del grano. En 1996 y 1997 se validó en parcelas de productores

cooperantes, y en 1998 fue liberada como nueva variedad para riego por

trasplante. La variedad Morelos A98 se adapta a las condiciones de clima y

suelo de las dos zonas arroceras del estado de Morelos así como en las zonas

sur de los estados de México y Puebla y norte de Guerrero (Montaña) así como

en el Valle de Apatzingán, Mich. A través del cultivo de Morelos A98 se puede

contribuir a la sustentabilidad del cultivo del arroz en la región Centro-Sur y

simultáneamente se incrementarán los rendimientos para lograr mayor

rentabilidad del mismo en beneficio de los productores y se producirá más arroz

de la “calidad Morelos” el cual por las características del grano tiene gran

demanda en el mercado nacional. Los pruebas experimentales con el tipo de

arroz A98 demuestran la alta versatilidad de éste en la agronomía. Para

contribuir con las investigaciones de este tipo de arroz, que es el que tiene mas

trascendencia en el país, y por consecuencia el que mas se exporta, los estudios

bioquímicos de las proteínas que lo conforman son de gran importancia para

conocer su propiedades funcionales y con base en este conocimiento conocer el

potencial de aplicación en otros ramos de la industria.

MÉTODOS Y MATERIALES. Condiciones de la muestra.- El arroz A98 se recibió sin procesar, es decir,

completo grano y cascarilla. Se eliminó la cascarilla de manera manual para que

obtener una muestra los más limpia posible. Los granos obtenidos se molieron y

tamizaron para obtener una harina homogeneizada.

Desengrasado. (Wang et al, 1999). La harina de arroz fue desengrasada con

hexano (99.8% pureza) en una relación 1:4, se agitó a 250 rpm durante 30

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minutos y se separo el hexano sucio del resto de la harina. La harina ya

desengrasada se dejo airear por 24 horas.

Extracción de proteínas. (Ju y Hettiarachchy, 2001; Sugimoto et a.,l 1986).

Extracción de albúmina (extracción acuosa).- A la harina ya desengrasada se

le adicionó agua destilada a 20ºC en una relación de 1:4 y se mantuvo en

agitación por 4 horas y fue centrifugado a 3000 g x min. (1500 rpm), el

sobrenadante obtenido se separó y filtró ya que ahí se contenía la mayor parte

de las fracciones solubles en agua, principalmente albúmina. Extracción de

globulina (Extracción salina).- Al residuo obtenido se le añadió una solución

de NaCl al 5% (1:4) a 20ºC con agitación de 4 horas y posteriormente se

centrifugó en las mismas condiciones, los sobrenadantes obtenidos se filtraron.

Extracción de glutelina (Extracción alcalina). El residuo resultante de la

fracción anterior se le añadió NaOH al 0.02M (1:3, pH 11.0), a 20ºC, se sometió

a agitación por 30 minutos; se centrifugó y se filtraron su sobrenadantes.

Figura 2.- Diagrama de flujo de extracción de proteína.

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Separación de las proteínas de los extractos.- Todas las fracciones fueron

precipitadas de los sobrenadantes por el ajuste de pH en sus puntos

isoeléctricos (pI). Los valores de pH para obtener la precipitación isoeléctrica

fueron determinados experimentalmente tomando porciones de cada

sobrenadante, ajustándolas a distintos pHs (3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 y 7.0);

diseprsiones que fueron sometidas a centrifugación para obtener los

sobrenadantes y realizar la medición de la Absorbancia a 320. El pH del

sobrenadante con la menor absorbancia fue tomado como el de precipitación

isoeléctrica. Utilizando estas condiciones se precipitaron las proteínas de los

extractos, se centrifugo a 10000 rpm y los sedimentos obtenidos se lavaron con

agua destilada dos veces y ajustados a pH 7.0. Finalmente, las proteínas

separadas se sometieron a liofilización.

Determinación de proteína soluble (método de Bradford).- El método que se

utilizó consiste en la reacción de las proteínas y el reactivo de Bradford (1976)

preparado de la siguiente manera. Primero, se obtiene una solución concentrada

que incluye 100 mg de azul de Coomasie G-250 (sigma) con 50 ml de etanol al

95% y 100 ml de ácido fosfórico al 65% pureza al 85%, se homogeniza y se

afora posteriormente a 1 L con agua desionizada. El procedimiento de método

consiste en hacer reaccionar 100 µL del sobrenadante de las dispersiones de las

enzimas con 2 ml del reactivo de Bradford, agitar brevemente en un vortex, dejar

reposar durante 5 min y leer a 595 nm, en un espectrofotómetro utilizando como

blanco 2ml de reactivo de Bradford mas 100 µL de agua. Para obtener la

concentración de proteína en las muestras se realizó una curva tipo albúmina de

bovino (BSA, 2.5 mg/ 10 ml agua). Los análisis se realizaron por triplicado.

Hidrolizados trípticos.- De cada aislado de proteína y sus fracciones (proteína

total, albúmina, globulina y glutelina) se pesaron 100 mg, excepto para globulina

en que se utilizaron 200 mg, y se dispersaron en 10 ml de agua destilada. A los

10 ml de sustrato se añadieron, para iniciar la hidrólisis, 1 ml con 5 mg de

tripsina disuelta en regulador de fosfatos. El tiempo de hidrólisis fue de 120

minutos a 35ºC. Se tomaron alícuotas de 400 microlitros, de las cuales se

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separaron 8 microlitros que se colocaron en un vial que contenía 8 microlitros de

regulador de electroforesis. Las alícuotas se tomaron en distintos tiempos (0, 10,

30, 60 y 120 minutos). El hidrolizado final (120 min) se sometió inmediatamente

a congelación para la ulterior determinación de propiedades funcionales.

Propiedades funcionales.

Actividad antioxidante.- Esta propiedad funcional se determino utilizando como

muestra los hidrolizados finales de cada fracción obtenida (120 min). Las

muestras se dispersaron al 2% en agua destilada y se hicieron reaccionar con el

radical DPPH (1mM); después se agitaron vigorosamente en un vortex (Genie 2)

y se dejaron reposar 30 min en la oscuridad. Posteriormente se centrifugaron a

10000 rpm x 10 min y se lee el sobrenadante a 517 nm. Se utilizo metanol como

blanco y la solución de DPPH como testigo.

Índice de actividad emulsionante.- Se utilizo el método de Pearce y Kinsella

(1982) utilizando dispersiones al 0.1% (p/v) de proteína en regulador de fosfatos

0.05M pH 7.6. Los hidrolizados fueron dispersados en una homogeneizadora de

cocina a velocidad 5 durante 1 min. Para obtener las emulsiones se hicieron

mezclas de aceite de maíz y los hidrolizados (1:3), y se sometieron a

homogeneización, se tomaron alícuotas y se diluyeron con dodecil sulfato de

sodio (SDS) al 2% en regulador de fosfatos y finalmente se midieron sus

absorbancias a 517 nm.

RESULTADOS Los rendimientos de proteína y de las fracciones extraídas se muestra en el

Cuadro 1.

Se determinó que los valores de pH para la precipitación isoeléctrica se

encontraron en los límites de 4 a 5 de pH (Figura 3).

Los hidrolizados trípticos produjeron perfiles de avance de la reacción muy

variados, siendo la hidrólisis de globulinas la reacción que consumió más NaOH

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0.1 N, es decir con la que se obtuvo un mayor grado de hidrólisis; mientras que

con las albúminas, se obtuvo el menor consumo de base, es decir fue la fracción

con mayor resistencia a la proteólisis tríptica (Figura 4).

Los datos obtenidos en la separación electroforética de los hidrolizados trípticos

se muestra en el Cuadro 3. Todos los hidrolizados a excepción de la globulina

dieron fracciones menores de 5 kDa. En general, cada fracción muestra un perfil

de proteínas característico, resultante de la hidrólisis tríptica.

En cuanto a su actividad antioxidante (AOX), la proteína total fue la que generó

el mayor nivel (Figura 5); mientras que la preparación de proteína testigo (sin

adición de tripsina) fue la menos antioxidativa.

La proteína total y las globulinas resultaron con el mejor índice de actividad

emulsionante (en tiempo cero, to) y mejor estabilidad de emulsión (Figura 6). Las

glutelinas mostraron la actividad emulsionante más baja pero con buena

estabilidad.

En suma, los resultados antes descritos, muestran lo siguiente. Las proteínas de

arroz, que incluye a las albúminas, globulinas y glutelinas, pueden ser extraídas

con base en su solubilidad y recuperadas por precipitación isoeléctrica. Aunque

los rendimientos no fueron los óptimos, se logró obtener preparaciones

homogéneas que pudieron diferenciarse en el análisis de funcionalidad. La

caracterización electroforetica mostró de manera objetiva las diferencias de

susceptibilidad enzimática de cada fracción de proteínas. Las proteínas totales

precipitadas isoeléctricamente mostraron buena funcionalidad; siendo, de las

fracciones proteínicas, las globulinas las que mostraron la menor resistencia a la

tripsinólisis y la fracción que que mostró las mejores propiedades funcionales.

IMPACTO No obstante que el proyecto todavía se encuentra en proceso (recurrente en

2007), los resultados obtenidos en la parte preliminar que se informa, muestran

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resultados de interés científico y práctico: la susceptibilidad a la tripsinólisis, cuyo

patrón electroforético la identifica por el número y proporción de sus

componentes más abundantes, y que es una información que permitirá su

ulterior comparación con el de otras variedades de arroz; así commo los

resultados de las fracciones proteínicas que componen el complejo de proteínas

del arroz Morelos A90, que muestran un patrón de susceptibilidad enzimática

distinto, una resistencia a la proteólisis específica; y una mezcla de productos de

hidrólisis que se puede correlacionar con una funcionalidad diferenciada según

el tipo de fracción proteínica. En general, estas determinantes conformacionales,

son de interés para el potencial desarrollo de preparaciones proteínicas o

fracciones peptídicas con funcionalidad o bioactividad realzada.

Cuadro 1.- Rendimientos de proteínas extraídas.

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Figura 3. Determinación de los puntos isoelectricos.

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Cuadro 2.- Contenido de proteína (Bradford) de las preparaciones liofilizadas.

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Figura 4. Curva de hidrólisis de las muestras analizadas

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Cuadro 3. Patrón de proteínas de las proteínas totales y de las fracciones separadas. Caracterización electroforética.

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Figura 5. Actividad antioxidante de los extractos de proteína.

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Figura 6. Índice de actividad emulsionante. y estabilidad de la emulsión.

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BIBLIOGRAFÍA.

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