Synthese 18F-markierter aromatischer Aminosäuren durch nukleophile Kupfer-vermittelte Radiofluorierung

Daniel Josef Modemann

Institut für Neurowissenschaften und MedizinNuklearchemie (INM-5)

Jül-4412

Berichte des Forschungszentrums Jülich 4412

Synthese 18F-markierter aromatischer Aminosäuren durch nukleophile Kupfer-vermittelte Radiofluorierung

Daniel Josef Modemann

Institut für Neurowissenschaften und MedizinNuklearchemie (INM-5)

Berichte des Forschungszentrums JülichJül-4412 • ISSN 0944-2952Institut für Neurowissenschaften und MedizinNuklearchemie (INM-5)

D 38 (Diss., Köln, Univ., 2018)

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I

Abstract

Positron emission tomography (PET) using the positron emitter fluorine-18 has become an im-

portant diagnostic tool in nuclear medicine. This technique enables the in vivo visualization of phys-

iological processes at the molecular level. For this purpose appropriate radiotracers addressing dif-

ferent molecular targets are required. Therefore, novel 18F-fluorination methods, in particular tran-

sition-metal mediated reactions, are highly sought after. These methods enable the preparation of 18F-labelled arenes which were previously hardly available using multi-step syntheses or were not

accessible at all.

The aim of this work was to develop a new strategy for the synthesis of [18F]fluorophenylamino

acids by means of copper-mediated radiofluorination of aryl(mesityl)iodonium salts (AMI) or bo-

ronic acid pinacol esters (BPE) as labelling precursors. The examination of the pharmacological

behaviour of these [18F]fluorophenylamino acids is still incomplete owing to their limited availabil-

ity.

First, the utilization of aryl(mesityl)iodonium salts as labelling precursors was examined for the

synthesis of L-2-[18F]fluorophenylalanine (2-[18F]FPhe). Different [18F]fluoride pre-processing

methods were applied. It turned out, that the precursor racemised under basic, protic conditions,

presumably promoted by a cyclic stabilization of the deprotonated α-carbon leading to low enan-

tiomeric purities. Finally, under optimized low-base conditions, using weak bases instead of the

precursor for [18F]fluoride elution, 2-[18F]FPhe was produced in 48% ± 8% radiochemical yield

(RCY) with an enantiomeric excess (ee) of > 99%.

Next, Cu(II)-mediated radiofluorination of BPE substrates was investigated. Especially, using

n-butanol as a co-solvent increased RCYs significantly. In the case of 6-[18F]fluoro-L-3,4-dihydrox-

yphenylalanine (6-[18F]FDOPA), RCY increased from 8% (conventional radiosynthesis) to 40%

using alcohol-enhanced Cu(II)-mediated radiofluorination. Thus, 6-[18F]FDOPA, 2-[18F]FPhe,

L-4-[18F]fluorophenylalanine (4-[18F]FPhe), 2-[18F]fluoro­phenylethylamine (2-[18F]FPEA),

6-[18F]fluoro-L-meta-tyrosine (6-[18F]FMT) and 5-[18F]fluoro-L-meta-tyrosine (5-[18F]FMT) were ob-

tained in 40–66% RCY and up to > 99% ee.

Furthermore, the radiosynthesis of 2-[18F]FPhe, 2-[18F]FPEA, 6-[18F]FMT and 5-[18F]FMT using

boronic acid pinacol esters was transferred to a remote-controlled synthesis device. High RCYs

lead to product activities of 2.4–18.8 GBq enabling the accomplishment of preclinical studies.

II

Kurzzusammenfassung

Die Positronen-Emissions-Tomografie (PET) unter der Verwendung des Positronenstrahlers

Fluor-18 ist zu einem wichtigen Instrument in der modernen diagnostischen Medizin geworden,

da mit ihr physiologische Prozesse in vivo visualisiert werden können. Die Entwicklung von neuar-

tigen 18F-Fluorierungsmethoden, insbesondere Übergangsmetall-vermittelte Radiofluorierungen,

sind in den letzten Jahren in den Mittelpunkt des radiochemischen Forschungsinteresses gerückt.

Diese ermöglichen die Synthese ungeträgerter [18F]Fluorarene unter Umgehung komplexer Auf-

bausynthesen in wenigen Reaktionsschritten (sogenannte „late-stage“ 18F-Fluorierungsreaktionen).

Des Weiteren werden mit diesen neuen Methoden hohe radiochemische Ausbeuten (RCA) erzielt

und diese Verfahren ermöglichen die Herstellung von 18F-markierten Verbindungen, die auf ande-

ren Wegen nur schwer oder gar nicht zugänglich sind.

Das Ziel dieser Arbeit war es, die bislang, aufgrund ihrer beschränkten Zugänglichkeit, pharmako-

logisch wenig untersuchte Klasse der [18F]Fluorphenylaminosäuren mittels der Cu-vermittelten Ra-

diofluorierung zu synthetisieren. Dabei wurden Arylmesityliodoniumsalze (AMI) und Boronsäure-

pinakolester (BPE) als Markierungsvorläufer untersucht und miteinander verglichen.

Die Verwendung von Arylmesityliodoniumsalzen als Markierungsvorläufer wurde am Beispiel von

L-2-[18F]Fluorphenylalanin (2-[18F]FPhe) untersucht. Insbesondere die unterschiedlichen Vorberei-

tungsmethoden des [18F]Fluorids hatten dabei einen erheblichen Einfluss auf die enantiomere Rein-

heit von 2-[18F]FPhe. Der Vorläufer racemisierte unter basischen und protischen Bedingungen, was

wahrscheinlich durch eine cyclische Stabilisierung des deprotonierten α-Kohlenstoffs begünstigt

wurde. Unter den optimierten low-base Bedingungen, bei dem der Vorläufer durch eine schwache

Base in der [18F]Fluoridaufarbeitung ausgetauscht wurde, konnte 2-[18F]FPhe in 48 % ± 8 % RCA

mit einem Enantiomerenüberschuss (ee) von > 99 % hergestellt werden.

Im nächsten Schritt wurden die Kupfer-vermittelte Radiofluorierung von BPE-Substraten als Aus-

gangsverbindungen für die Radiosynthese von [18F]Fluorphenylaminosäure-Derivaten untersucht.

Dabei konnte gezeigt werden, dass der Zusatz von n-Butanol einen ausbeutesteigernden Effekt auf

die Cu(II)-vermittelte Radiofluorierung hatte. Im Fall von 6-[18F]fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin

(6-[18F]FDOPA) erhöhte sich die RCA von 8 % (konventionelle Radiosynthese) auf 40 % durch

die Verwendung der Alkohol-unterstützten Cu(II)-vermittelten Radiofluorierung. Mittels dieser

Cu-vermittelten 18F-Fluorierungsmethode wurden die [18F]Fluorphenylaminosäure-Derivate

6-[18F]FDOPA, 2-[18F]FPhe, L-4-[18F]Fluorphenylalanin (4-[18F]FPhe), 2-[18F]Fluorphenylethyla-

min (2-[18F]FPEA), 6-[18F]Fluor-L-meta-tyrosin (6-[18F]FMT) und 5-[18F]Fluor-L-meta-tyrosin

(5-[18F]FMT) in RCA von 40–66 % und ee bis > 99 % synthetisiert werden.

Des Weiteren konnten die Radiosynthesen von 2-[18F]FPhe, 2-[18F]FPEA, 6-[18F]FMT und

5-[18F]FMT, ausgehend von BPE-Substraten, auf ein fernbedienbares Synthesemodul übertragen

werden. Durch diese war es möglich, hohe Aktivitätsmengen (2,4–18,8 GBq) der [18F]Fluorphe-

nylaminosäure-Derivate zu erhalten, so dass diese in präklinischen Studien eingesetzt werden konn-

ten.

III

Inhaltsverzeichnis

Abstract ...................................................................................................... I

Kurzzusammenfassung ........................................................................... II

Inhaltsverzeichnis ................................................................................... III

1 Einleitung ......................................................................................... 1

1.1 Positronenzerfall und seine Anwendung in der Positronen-Emissions-Tomographie ................................................................................................ 1

1.2 Fluor-18.............................................................................................................. 3

1.3 Markierungsreaktionen mit Fluor-18 ................................................................ 6

1.3.1 Elektrophile Radiofluorierung ................................................................................. 6

1.3.2 Nukleophile Radiofluorierung ................................................................................. 7

1.3.3 Mehrstufige Synthese von 18F-markierten Aromaten ......................................... 12

1.3.4 18F-Markierung von Makromolekülen .................................................................. 13

1.3.5 Übergangsmetall-vermittelte Radiofluorierung von Aromaten ........................ 16

1.4 Radiofluorierte aromatische Aminosäuren: Herstellung und Anwendung in der PET-Bildgebung .................................................................................. 20

1.4.1 Fluor in endogenen Stoffen ................................................................................... 20

1.4.2 18F-Markierte Radiotracer zur Untersuchung des Aminosäuretransports und der Proteinsynthese ................................................................................................ 21

1.4.3 Tracer für das dopaminerge System ...................................................................... 25

2 Problemstellung ............................................................................. 29

3 Ergebnisse & Diskussion .............................................................. 31

3.1 Kupfer-vermittelte Synthese von n.c.a. 2-[18F]Fluorphenylalanin über Arylmesityliodoniumsalzen als Markierungsvorläufer .............................. 31

3.1.1 Vorläufer und Referenzsynthese von 2-[18F]FPhe .............................................. 31

3.1.2 Radiosynthese von 2-[18F]FPhe ............................................................................. 32

3.1.3 Untersuchung der Enantiomerenreinheit von 2-[18F]FPhe ............................... 35

3.1.4 Reinigung und isotopische Verdünnung von 2-[18F]FPhe ................................. 39

3.1.5 Entwicklung einer Methode zur Alkohol-unterstützten Cu-vermittelten Radiofluorierung von 2-[18F]FPhe unter minimalistischen Bedingungen ....... 42

3.2 Kupfer-vermittelte Synthese über Boronsäurepinakolester als Markierungsvorläufer ................................................................................. 45

3.2.1 Radiosynthese von n.c.a. 6-[18F]Fluor-3,4-dihydroxyphenylalanin .................... 45

3.2.2 Kupfer-vermittelte und Alkohol-verstärkte Synthese weiterer 18F-markierter Verbindungen über Boronsäurepinakolester als Markierungsvorläufer .......... 52

IV

4 Material und Methoden ................................................................. 62

4.1 Allgemeines ..................................................................................................... 62

4.1.1 Chemikalien .............................................................................................................. 62

4.1.2 Reinigung .................................................................................................................. 62

4.1.3 Charakterisierung ..................................................................................................... 62

4.2 Organische Synthesen ..................................................................................... 63

4.3 Radiochemie ................................................................................................... 79

4.3.1 Relevante Definitionen ........................................................................................... 79

4.3.2 Radio-DC .................................................................................................................. 80

4.3.3 Radio-HPLC ............................................................................................................. 80

4.3.4 Herstellung von Fluor-18 ....................................................................................... 86

4.3.5 18F-Radiomarkierung unter der Verwendung von Iodoniumsalzen (Kapitel 3.1) .............................................................................................................. 86

4.3.6 18F-Fluorierung unter der Verwendung von Iodoniumsalzen (Kapitel 3.1.5) 87

4.3.7 Radiosynthese n.c.a. 6-[18F]FDOPA (Kapitel 3.2.1) ............................................ 88

4.3.8 18F-Fluorierung unter der Verwendung von Boronsäurepinakolestern (Kapitel 3.2.2) ........................................................................................................... 89

5 Zusammenfassung ......................................................................... 96

6 Anhang - Präklinische Studien .................................................... 100

6.1 Zellversuche .................................................................................................. 100

6.2 Tierexperimentelle Studien ........................................................................... 102

7 Abkürzungsverzeichnis ................................................................ 104

8 Literaturverzeichnis ..................................................................... 108

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Die Möglichkeit, molekulare Ereignisse in vivo in Echtzeit abzubilden, ist eine große Errungenschaft

des letzten Jahrhunderts. Das Tracer-Prinzip, welches auf den Chemiker George de Hevesy zu-

rückgeht, stellt die Basis für die moderne nuklearmedizinische Diagnostik dar. George de Hevesy

bestimmte die Löslichkeit von Bleisalzen durch die Gleichverteilung einer unbekannten, gelösten

Masse des Bleisalzes und einer bekannten Menge radioaktiver Isotope in einer Lösung.[1] Einige

Jahre später veröffentlichte er Arbeiten, die dieses Prinzip nutzten, um den Metabolismus in Pflan-

zen[2] und Tieren[3] zu erforschen. Im Jahr 1943 wurde er mit dem Nobelpreis für Chemie ausge-

zeichnet „für seine Arbeiten über die Anwendung der Isotope als Indikatoren bei der Erforschung

chemischer Prozesse“.

Basierend auf diesem Prinzip besteht heutzutage die Möglichkeit, mithilfe der Verwendung von

Radiotracern durch Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT, engl. single photon

emission computed tomography) und Positronen-Emissions-Tomographie (PET) die physiologische in

vivo Prozesse darzustellen. Dies erfolgt durch die Detektion der emittierten Strahlung von Radi-

otracern außerhalb des zu untersuchenden Körpers. Somit können Stoffwechselvorgänge, Rezep-

torexpressionen und vieles mehr dargestellt werden. Im Gegensatz zu SPECT und PET zeigen

Ultraschall, Computer-Tomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) vorwiegend

morphologische Eigenschaften des untersuchten Körpers. Beim Ultraschall wird die Schallreflek-

tion gemessen, beim Röntgen oder CT werden die unterschiedlichen Absorptionen von Röntgen-

strahlen dargestellt und bei der MRT wird die Kernspinresonanz dargestellt. All diese Verfahren

der morphologischen Bildgebung sind nur sehr eingeschränkt in der Lage, physiologische Prozesse

darzustellen.

1.1 Positronenzerfall und seine Anwendung in der Positronen-Emissions-

Tomographie

Bei der PET-Untersuchung wird der β+-Zerfall für die diagnostische Bildgebung genutzt. Beim β+-

Zerfall wandelt sich in einem protonenreicher Kern (X) ein Proton in ein Neutron um. Dabei wird

ein Positron (β+) und ein Elektron-Neutrino (υe) emittiert. Durch die Emission von zwei Teilchen

und dem Impuls auf den Atomkern ist es zu erklären, dass die Teilchen des β+-Zerfalls kein dis-

kretes, sondern ein kontinuierliches Energiespektrum zeigen. Die Zerfallsenergie verteilt sich je

nach Orientierung des Impulses unterschiedlich auf die drei Teilchen.

𝑋𝑍𝐴

𝑁 → 𝑌𝑍−1𝐴

𝑁+1 + 𝛽+ + 𝜈𝑒

Das Positron bewegt sich in Abhängigkeit von seiner Energie einige Millimeter durch die Materie,

wobei es durch Kollisionen und Streuungen immer mehr von seiner kinetischen Energie verliert.

Die Reichweite des Positrons ist dabei von seiner Energie und der Dichte des zu durchdringenden

Materials abhängig.[4] Nachdem das Positrons thermalisiert wurde, kommt es zur Rekombination

2 1 Einleitung

von Positron und Elektron. Die Masse von Elektron und Positron wird in Energie umgewandelt

und zwei Photonen mit einer jeweiligen Energie von 511 keV werden in einem Winkel von 180°

abgestrahlt. Dieser Prozess wird Annihilation genannt.

Der β+-Zerfall steht in direkter Konkurrenz zum Elektroneneinfang, bei dem ein Proton im Kern

ein Elektron aus einem kernnahen Orbital einfängt und dabei ein Elektron-Neutrino emittiert. Das

Verhältnis zwischen β+-Zerfall und Elektroneneinfang wird durch die Zerfallsenergie bestimmt.

Schema 1: Schematische Darstellung einer [18F]FDG PET-Untersuchung[5]

(aus The American Physiological Society)

Um diese Annihilationsstrahlung messen zu können, wird bei der PET ein Detektorring um das zu

untersuchende Objekt positioniert. Durch die Ringstruktur können die zwei Photonen der Anni-

hilation simultan detektiert werden. Für PET müssen keine Kollimatoren verwendet werden, um

den Ursprung der Strahlung festzustellen. Wird von zwei Detektoren zur selben Zeit ein Zerfall

registriert, wird dies als eine Annihilation auf einer gedachten Linie zwischen den signalgebenden

Detektoren interpretiert (engl. line of response). Beim Kombinieren der hypothetischen Koinzidenz-

linien entsteht durch die Überlagerung ein Bild, das Aufschluss über die Anreicherung eines Tracers

gibt. Die Koinzidenzmessung sorgt für eine hohe Sensitivität und Spezifität der PET-Messung und

macht eine Quantifizierung der Radioaktivität im zu untersuchenden Objekt möglich (Schema 1).

Aktuelle PET-Scanner erreichen ein Auflösungsvermögen von wenigen Millimetern.[6] Der PET-

Scanner erfasst jedoch nicht die Position des radioaktiven Teilchens, sondern lediglich die der An-

nihilation. Da das Positron, abhängig von seiner Energie und der Materie, sich wenige Millimeter

durch den Körper bewegt bevor es sich vernichtet, kann eine Verbesserung der Auflösung bei einer

PET kaum noch einen Informationsmehrgewinn erbringen.

1 Einleitung 3

1.2 Fluor-18

Fluor-18 wird in der molekularen PET-Bildgebung am häufigsten eingesetzt. Dies basiert auf sei-

nen günstigen Zerfallseigenschaften. Fluor-18 besitzt mit 109,8 min eine im Vergleich zu anderen

Positronenstrahlern lange Halbwertszeit (Tabelle 1). Die längere Halbwertszeit ermöglicht es, nicht

nur aufwendigere Synthesen mit dem Radionuklid durchzuführen, sondern auch die Beobachtung

von Stoffwechselvorgängen über einen längeren Zeitraum. Darüber hinaus sind längere Transport-

wege des Radiopharmazeutikums vom Ort der Herstellung zum Ort der Anwendung möglich.

Tabelle 1: Auflistung der gängigsten PET-Nuklide[7]

Nuklid t1/2 Herstellung Zerfallsenergie Durchschnittliche Eβ+ Anteil β+

11C 20,4 min 14N(p,α) 1,982 MeV 386 keV 99,7 %

13N 10,0 min 16O(p,α) 2,220 MeV 492 keV 99,8 %

15O 2,0 min 14N(p,n) 2,754 MeV 735 keV 99,9 %

18F 109,8 min 18O(p,n) 20Ne(d,α)

1,656 MeV 249 keV 96,7 %

68Ga 67,6 min 69Ge(p,2n) 68Ge → 68Ga

2,921 MeV 836 keV, 352 keV 88,9 %

Die relativ geringe β+-Energie von Fluor-18 reduziert den Weg des Positrons bis zur Annihilation

in der Materie und bewirkt dadurch eine bessere Auflösung der PET-Bilder im Vergleich zu β+-

Emittern mit höherer Zerfallsenergie. Ein weiterer Vorteil von Fluor-18 ist die Abwesenheit von

γ-Strahlung beim Zerfall. Letztere würde zu einer verminderten Bildqualität und damit zu Fehlin-

terpretationen der PET-Scans führen. Neben Fluor-18 kommen noch Kohlenstoff-11, Stickstoff-

13 und Sauerstoff-15 für die PET in Frage, welche praktisch auch keine γ-Strahlung beim Zerfall

zeigen, aber deutlich höhere β+-Energien aufweisen. Ein weiteres häufig bei PET-Untersuchungen

eingesetztes Radionuklid ist Gallium-68. Dieses emittiert aber neben der β+-Strahlung auch eine

ganze Reihe an γ-Strahlen (1883 keV, 1077 keV, …)[7]. Gallium-68 wird durch Komplexbildner an

ein zuvor funktionalisiertes Makromolekül gebunden. Durch die Einführung eines Chelatorsystems

führt dies zu großen Veränderungen in den Molekülen, so dass die biologischen Eigenschaften

stark verändert werden, was den Einsatz von Gallium-68 größtenteils auf Makromoleküle be-

schränkt. Kohlenstoff-11, Stickstoff-13 und Sauerstoff-15 besitzen sehr kurze Halbwertszeiten,

was ihre Anwendung ebenfalls einschränkt. Kohlenstoff-11 mit einer Halbwertszeit von 20,4 min

ermöglicht noch relativ komplexe Radiosynthesen, während die sehr kurzen Halbwertszeiten von

Stickstoff-13 und Sauerstoff-15 nur einfache, zumeist einstufige Synthesen erlauben.[8]

Die einzelnen Produktionsmethoden weisen große Unterschiede in ihrer molaren Aktivität auf.

Die molare Aktivität bezeichnet die Aktivität von einem bestimmten Isotops an einer bestimmten

Stelle in einem Molekül, geteilt durch die Stoffmenge (mol) dieses Moleküls (engl. “For a specified

isotope, the activity […] of a molecule incorporating the radionuclide divided by its molecular weight […] expressed

in moles.”[9]). Die spezifische Aktivität bezeichnet die Radioaktivität eines Isotops oder einer Mi-

schung von Radioisotopen, dividiert durch die Masse (kg) der Gesamtzahl der darin vorhandenen

4 1 Einleitung

Atome (engl. “The activity […] of a specified radionuclide, or of a mixture of radioisotopes, in an amount of substance divided by the mass […] of the total number of atoms present in it.”[9]).

Die molare Aktivität ebenso wie die spezifische Aktivität beschreibt die Isotopenverunreinigung von einem radioaktiven Produkt. Je nach Herstellungsmethode wird das Radionuklid durch seine Isotope verunreinigt. Die Folgen können für einen diagnostischen Tracer ganz erheblich sein. Durch die große Menge an nichtradioaktiven Träger wird z.B. ein Rezeptorsystem gesättigt und seine biologische Funktion kann nicht mehr abgebildet werden.

Erstmals wurde Fluor-18 im Jahr 1936 hergestellt; man hielt es jedoch fälschlicherweise für ein radioaktives Argon-Isotop. Dennoch war man schon zum damaligen Zeitpunkt in der Lage eine Halbwertszeit von 110 min ± 1 min zu ermitteln.[10] Seither sind mehr als 20 verschiedene Kernre-aktionen zur Herstellung von Fluor-18 bekannt geworden, die Herstellung erfolgt größtenteils am Zyklotron.[11]

Ein Zyklotron ist ein zylindrischer Teilchenbeschleuniger, der aus zwei Duanden besteht, die von einem Magnetfeld, senkrecht zur Ebene, umgeben sind. Die zwei Duanden sind an ein elektrisches Wechselfeld angeschlossen (Schema 2).

Schema 2: Schematische Darstellung eines Zyklotrons (I: Ionenquelle, U~: elektrische Wechselspannung)

Die Ionenquelle im Zentrum des Zyklotrons gibt Ionen in den Spalt zwischen den beiden Duanden ab. Je nach Ladung werden nun die Ionen im elektrischen Feld zu einer Duande hin beschleunigt. Innerhalb der Duanden beschreiben die Ionen durch die Lorenz-Kraft eine kreisförmige Bahn. Durch die Wechselspannung ändert sich das elektrische Feld, und die Ionen werden im Spalt zwi-schen den Duanden erneut beschleunigt. Ihre kontinuierlich steigende Energie vergrößert den Bahnradius der Ionen in den Duanden. Zum Schluss werden die Ionen aus ihrer Bahn abgelenkt und auf ein Target geschossen, wo sie Kernreaktionen auslösen können.

U~

I

1 Einleitung 5

Das grundlegende Prinzip eines Zyklotrons ist, dass die Periode eines Ions, das in diesem Magnet-

feld kreist, unabhängig von seiner Energie ist. Nur so ist es möglich, einen kontinuierlichen Teil-

chenstrom zu erzeugen (Dieses Prinzip gilt nur bei nicht-relativistischen Teilchenenergien, bei hö-

heren Energien erhöht sich die Umlaufzeit und der Teilchenstrom kommt aus der Phase). Ein

Zyklotron kann sowohl positive wie auch negative Ionen beschleunigen, je nachdem werden dann

unterschiedliche Vorrichtungen zum Ablenken den Ionenstrahls verwendet.[12]

In Tabelle 2 sind die wichtigsten Produktionsverfahren von Fluor-18 am Zyklotron aufgelistet.

Tabelle 2: Unterschiedliche Herstellungsweg für Fluor-18[11]

Bei den Kernreaktionen 20Ne(d,α) und 18O(p,n) entsteht als Produktkern Fluor-18, als Target-Ma-

terial wird Neon- bzw. [18O]O2-Gas verwendet. Fluor-18 wird stark von den Targetwänden adsor-

biert. Daher werden geringe Mengen an Fluorgas ([19F]F2) benötigt, um das radioaktive Isotop von

den Wänden abzulösen. Das Fluor-18 bindet sich durch Isotopenaustausch an das Fluorgas, wobei

es zu einer starken Isotopenverdünnung kommt, die sich deutlich auf die molare Aktivität auswirkt.

Darüber hinaus wird durch den großen Überschuss an Fluor-19 praktisch nur ein Fluoratom pro

F2 radioaktiv sein, somit beträgt die maximale, theoretische Ausbeute bei einer elektrophilen Ra-

diofluorierung nur 50 %. In diesem Fall spricht man von einem geträgerten (engl. carrier-added, c.a.)

Radionuklid. In der Praxis sind molare Aktivitäten von bis zu 0,6 GBq/μmol möglich. Dies impli-

ziert, dass diese Methoden nur für Tracer angewendet werden können, welche keine hohen mola-

ren Aktivitäten erfordern.[13]

Bei der Bestrahlung von natürlichem Wasser mit 3He-Kernen wird folgende Kernreaktion indu-

ziert: 16O(3He,p)18F. Die Verwendung von natürlichem Wasser kann als Vorteil für diese Reaktion

verbucht werden, jedoch erfordert sie hohe Teilchenenergien und die Möglichkeit, Helium-3 am

Zyklotron zu beschleunigen. Die Kernreaktion 18O(p,n)18F erfordert zwar das Bestrahlen von an-

gereichertem [18O]H2O, jedoch können Protonen mit relativ geringen Energien (16 MeV) zur Aus-

lösung der Kernreaktion verwendet werden. In den beiden letzten Kernreaktionen wird das Fluor-

18 über ein Wassertarget hergestellt. Im Wasser wird das entstehende [18F]Fluorid hydratisiert. Da

hierbei kein Fluorgas eingesetzt werden muss, um das radioaktive Produkt von den Targetwänden

Kernreaktion Target Teilchen

Energie

[MeV]

Chemische

Form

Erwartete Ausbeute

[GBq/µAh]

Molare Aktivität

[GBq/µmol]

18O(p,n)18F [18O]O2, Kr

(50 μmol F2)

16 → 3 [18F]F2 1,0 0,6

20Ne(d,α)18F Ne

(0,2 mmol F2)

14 → 0 [18F]F2 0,4 0,1

16O(3He,p)18F H2O 36 → 0 18F–(aq) 0,26 ca. 50

18O(p,n)18F [18O]H2O 16 → 3 18F–(aq) 2,22 ca. 600

6 1 Einleitung

zu lösen, erhält man Fluor-18 in hohen molaren Aktivitäten. In diesem Fall spricht man von einem

ungeträgerten (engl. no-carrier-added, n.c.a.) Radionuklid.

Das Tracer-Prinzip von George de Hevesy basiert darauf, dass der Tracer das zu beobachtende

System nicht beeinflusst. Im menschlichen Körper gibt es jedoch Systeme, die schon durch ge-

ringste Konzentrationen abgesättigt werden, z.B. Rezeptorliganden. Hierfür hat sich eine molare

Aktivität von 37 GBq/μmol (1 Ci/μmol) als praktischer Grenzwert etabliert, um geträgerte und

ungeträgerte Produkte zu unterscheiden.[14]

Fluor-18 kann neben der Produktion durch den Beschuss von geladenen Teilchen auch über eine

Neutronen-induzierte Kernreaktion hergestellt werden. In einem 1 MW Forschungsreaktor wurde

[6Li]LiOH·H2O als Target verwendet. Durch die Kernreaktion 6Li(n,α)3H entstehen Tritium-Kerne

die dann weiterreagieren, 16O(3H,n)18F. Die Produktion von Fluor-18 war jedoch durch den be-

grenzten Neutronenfluss des Forschungsreaktors auf ca. 1,48 GBq (40 mCi) begrenzt.[15]

1.3 Markierungsreaktionen mit Fluor-18

1.3.1 Elektrophile Radiofluorierung

Für elektrophile Synthesen wurde die zu radiofluorierende Substanz üblicherweise mit radioakti-

vem [18F]Fluorgas umgesetzt. Durch die hohe Reaktivität des [18F]Fluorgases werden zahlreiche

Nebenprodukte gebildet. Deshalb ist die Isolierung des reinen Produkts häufig extrem aufwändig.

Um die Selektivität der Markierung zu erhöhen, wurden [18F]Acetylhypofluorit[16, 17] und [18F]Xe-

nondifluorid[18] als selektivere 18F-Fluorierungsreagenzien eingesetzt. Im Jahr 1984 wurde dann die 18F-Fluorierung von aromatischen Trialkylzinn-Verbindungen veröffentlicht, welche zu einer wei-

teren Selektivitätserhöhung führte und bis heute vielfach für die Synthese von Radiopharmaka ein-

gesetzt wird.[19]

Coenen et al.[20] untersuchten die direkte elektrophile Radiofluorierung von Phenylalanin, Tyrosin

und DOPA. Durch die hohe Reaktivität des Fluors wurde eine Mischung unterschiedlicher Iso-

mere erhalten (Schema 3). Nur durch aufwendige Trennverfahren war es möglich, ein bestimmtes

Isomer in hoher radiochemischer Reinheit herzustellen.

Die radiochemische Reinheit beschreibt das Verhältnis von der Radioaktivität eines Nuklids in

einer spezifischen Position in einem Molekül, bezogen auf die gesamte Radioaktivität dieses Nuk-

lids in der Probe (engl. “Ratio of the activity of a radionuclide in a stated chemical species in a material over the

total activity of all species containing that radionuclide in this material.”)[9].

Nach demselben Prinzip, der direkten elektrophilen Radiofluorierung, wurde 1988

die Radioaminosäure 4-[18F]Fluorphenylalanin (4-[18F]FPhe) hergestellt, welche als Tracer für Pro-

teinsynthese verwendet wurde.[21] Beinah zeitgleich wurde die gleiche Synthese von einer japani-

schen Arbeitsgruppe veröffentlicht.[22]

1 Einleitung 7

Schema 3: Elektrophile Radiofluorierung von Phenylalanin[20]

Um den Nachteil der niedrigen molaren Aktivität bei der Herstellung von [18F]F2 zu überwinden,

wurde im Jahr 1997 eine alternative Methodik entwickelt (Schema 4).[23] Zunächst wurde [18F]Flu-

orid über 18O(p,n)18F hergestellt und das n.c.a. Fluor-18 mit Kryptofix®222 (K222) und Kaliumcar-

bonat getrocknet. Das [18F]Fluorid wurde mit Methyliodid zu [18F]Methylfluorid umgesetzt und

mittels GC gereinigt. Das hergestellte [18F]CH3F wurde dann durch elektrische Entladung und der

Zugabe von sehr geringen Mengen Fluorgas in 20 min zu [18F]F2 mit einer molarer Aktivität von

> 50 GBq/μmol umgesetzt.

Schema 4: Herstellung von [18F]F2 mit verbesserter spezifischer Aktivität[23]

Diese Methodik für die Synthese von trägerarmem [18F]F2 wurde von einer anderen Arbeitsgruppe

aufgegriffen und damit das elektrophile, radioaktive Selectfluor hergestellt (Schema 5).[24] Durch

dieses milde 18F-Fluorierungsmittel konnten dann weitere Tracer radiomarkiert werden.

Schema 5: 18F-Fluorierung von Selectfluor[24] (Tf: Triflat (Trifluormethansulfonyl))

6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin (6-[18F]FDOPA), ein wichtiger Tracer für das dopami-

nerge System, konnte durch diese Methode mit einer radiochemische Ausbeute (RCA) von

6 % ± 2 % und einer molaren Aktivität von 3,7 GBq/μmol hergestellt werden.[25]

1.3.2 Nukleophile Radiofluorierung

Bei der Herstellung von Fluor-18 über 18O(p,n) liegt das 18F– als Anion in der wässrigen Lösung

vor. Das Wasser-Molekül solvatisiert das [18F]Fluorid-Anion und macht es so für nukleophile Re-

aktionen unzugänglich. Durch die Zugabe von Kaliumcarbonat und Kryptofix®222 (K222) wird das

8 1 Einleitung

[18F]Fluorid in Lösung gehalten und durch azeotrope Destillation mit Acetonitril kann das Wasser

entfernt werden. Die Base ist wichtig, um das Fluor-18 als Anion in Lösung zu halten und zu

verhindern, dass es zur Bildung von [18F]HF kommt. Der Kryptand dient als Phasentransferkata-

lysator und komplexiert das Kalium-Kation, wodurch [18F]Fluorid als „nacktes“ Anion vorliegt und

somit sehr reaktiv in Lösung bleibt. Neben K222/K2CO3 finden auch Tetraalkylammoniumsalze

Verwendung.

Der Markierungsvorläufer für eine aliphatische Radiofluorierung besitzt eine nukleofuge Abgangs-

gruppe, wie Sulfonsäureester oder Halogene. Die Reaktion folgt zumeist dem SN2-Mechanismus

und wird in einem aprotisch-polaren Lösungsmittel wie; N,N-Dimethylformamid (DMF), Dime-

thylsulfoxid (DMSO) oder Acetonitril (MeCN), durchgeführt. Durch die basischen Bedingungen

ist die Einführung von Schutzgruppen für alle leicht deprotonierbaren Gruppen notwendig, da

diese sonst Nebenreaktionen mit dem [18F]Fluorid eingehen könnten. In Schema 6 sind einige Syn-

thesebeispiele für klinisch relevante Tracer aufgeführt.

Schema 6: Radiosynthese von 2-[18F]Fluor-2-desoxy-D-glucose[26] (I), O-(2-[18F]Fluorethyl)-L-tyrosin[27] (II), 8-Cyclopentyl-3-(3-[18F]Fluorpropyl)-1-propylxanthin[28] (III) (Tos: Tosyl (para-Toluolsulfonyl), Tr: Trityl-

(Triphenylmethyl-), POM: Pivaloyloxymethyl)

2-[18F]Fluor-2-desoxy-D-glucose ([18F]FDG, Schema 6, I) ist das erfolgreichste und wichtigste

PET-Radiopharmaka. [18F]FDG ist ein Glucoseanalogon, bei dem die Hydroxylgruppe am

2-Kohlenstoff durch ein Fluor-18 ersetzt wurde. [18F]FDG wird durch Transporter in die Zellen

geschleust und anschließend durch die Hexokinase phosphoryliert. Im Gegensatz zu Glucose wird

[18F]FDG durch seine Fluorsubstitution in 2-Position nicht weiter verstoffwechselt und reichert

sich in den Zellen an.[26] Durch den Einsatz des Phasentransferkatalysators Kryptofix®222 und

nukleophilem 18F– konnten die radiochemischen Ausbeuten von [18F]FDG erheblich gesteigert

werden. Dadurch war es erst möglich, [18F]FDG in hohen Radioaktivitätsmengen zur Verfügung

zu stellen, was sicherlich einen signifikanten Beitrag zum Erfolg von [18F]FDG geleistet hat.[29]

1 Einleitung 9

Bei O-(2-[18F]Fluorethyl)-L-tyrosin ([18F]FET) handelt es sich um Aminosäureanalogon, das vor

allem für die Hirntumorbildgebung eingesetzt wird. Dafür wurde an Tyrosin eine

2-[18F]Fluorethyl-Gruppe an der phenolischen Position gekoppelt.[27]

8-Cyclopentyl-3-(3-[18F]fluorpropyl)-1-propylxanthin ([18F]CPFPX) ist ein A1-Adenosin-Rezeptor

(A1AR) Antagonist, der ebenfalls über eine aliphatische 18F-Fluorierung markiert wird.[28]

[18F]CPFPX wird verwendet, um die A1AR Verteilung im Gehirn zu messen und neuropathologi-

sche Zustände wie Epilepsie, Alzheimer Erkrankungen, den Schlaf und ischämischer Schlaganfälle

zu erforschen.[30]

Die sehr starke, aromatische Kohlenstoff-Fluor-Bindung ist ein interessantes Ziel für die Radiotra-

cer, die eine mögliche Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften bringen könnte.

Die ersten nukleophilen, aromatischen Radiofluorierungen erfolgten über eine Balz-

Schiemann-[31] oder Wallach-Reaktion[32]. Bei der thermischen Zersetzung vom Aryldiazoniumtet-

rafluorborat (Balz-Schiemann) und Aryltriazenen (Wallach) entsteht ein Arylkation, welches in ei-

ner nukleophilen aromatischen Substitution weiterreagiert. Das Arylkation reagiert dabei jedoch

nicht selektiv, deshalb entstehen viele Nebenreaktionen, die die spärliche Anwendung dieser Me-

thodik erklärt. Das Tetrafluorboratsalz der Balz-Schiemann Reaktion führte darüber hinaus noch

zu einem Isotopenaustausch, der wiederum zu einer Abnahme der spezifischen Aktivität führt.[11]

Die nukleophile aromatische Substitution nach dem SNAr-Mechanismus war daher zunächst die

Methode der Wahl zur erfolgreichen Markierung aromatischer Verbindungen ausgehend von

[18F]Fluorid. Durch die hohe Elektronendichte im Aromaten ist eine Aktivierung durch Elektro-

nen-ziehende Gruppen (EZG) in ortho- oder para-Position zur Abgangsgruppe (AG) erforderlich.

Als aktivierende Gruppen werden die –M- (mesomeren) und –I-Effekte (induktiven) von Nitro-

Gruppen, Cyaniden, Carbonylen und Halogenen verwendet. Als Abgangsgruppe fungieren Halo-

gene, Nitro- und Trimethylammoniumgruppen. Die Struktur der aktivierenden Gruppen unter-

scheidet sich aber in der Regel vom angestrebten Produkt und somit müssen diese aktivierenden

Gruppen wieder entfernt werden.

Schema 7: Aromatische Radiofluorierung über SNAr-Mechanismus

Eine Anwendung dieser Methode zeigt die Synthese von 2-[18F]Fluor-L-phenylalanin

(2-[18F]FPhe) und 2-[18F]Fluor-L-tyrosin (2-[18F]FTyr).[33] Als erstes erfolgte die Radiofluorierung

durch einen Isotopenaustausch am Aromaten, mit anschließender Entfernung der aktivierenden

Gruppe durch einen Rhodium-Komplex (Wilkinson-Katalysator) an die sich schließlich die Hyd-

rolyse des chiralen Auxiliars anschloss. 2-[18F]FPhe und 2-[18F]FTyr wurden in RCAs von 43 %

bzw. 49 % erhalten.

10 1 Einleitung

Schema 8: Synthese von 2-[18F]FPhe und 2-[18F]FTyr über Isotopenaustausch[33] (TBAF: Tetrabutylammoni-

umfluorid, Boc: tert-Butyloxycarbonyl)

Eine ähnliche Methode wurde auch für die Radiosynthese von 6-[18F]Fluor-meta-tyrosin angewen-

det, welches mit 8–18 % RCA hergestellt werden konnte.[34] Eine Automatisierung dieser Metho-

den scheiterte unter anderem an den harschen Bedingungen der Hydrolyse des chiralen Auxiliars.

Schema 9: Synthese von 2-[18F]FMT über Isotopenaustausch[34]

Eine Alternative zur klassischen SNAr-Reaktion bietet die Verwendung von Iodoniumsalzen als 18F-Markierungsvorläufer. Der erste Versuch, Iodoniumsalze für die nukleophile Radiofluorierung

zu verwenden, wurde im Jahr 1995 unternommen.[35] Iodoniumsalze reagieren mit einer Vielzahl

an Nukleophilen. Das Iod geht bei der thermischen Zersetzung dabei auf den elektronenreicheren

Aromaten über, im Gegenzug reagiert dann der elektronenärmere Aromat mit einem Nukleophil.

Schema 10: Radiofluorierung von Diaryliodoniumsalzen

Zunächst wurden verschiedene, mit wenig funktionellen Gruppen versehene Diaryliodoniumsalze

hergestellt und als Vorläufer für Radiofluorierungen verwendet; die radiochemischen Ausbeuten

lagen zwischen 11–90 %. Durch diese Methode war es möglich, [18F]Fluorbenzol in einem einzigen

Schritt mit guten Ausbeuten herzustellen. Jedoch zeigten die RCAs sehr große Schwankungen, für

1 Einleitung 11

die keine nähere Erklärung gegeben werden konnte. Dieser Arbeit folgten viele weitere Arbeiten

zum Thema Radiofluorierung durch Iodoniumsalze.[11, 36, 37]

Schema 11: Radiomarkierung von heterocyclischen Iodoniumsalzen

Ross et al.[38] veröffentlichten ihre Arbeit im Jahr 2007 über die Radiomarkierung von heterocycli-

schen Iodoniumsalzen. So wurde Aryl(2-thienyl)-iodoniumsalzen verwendet, welches aufgrund sei-

ner sehr hohen Elektronendichte besonders gut für diese Reaktion geeignet schien. Je nach Sub-

stituent wurden 20–60 % RCA erzielt. In einer weiteren Arbeit gelang es, mit dieser Methodik in

einer zwei-stufigen Synthese 4-[18F]Fluorphenol mit guten Ausbeuten herzustellen.[39] Über ein

symmetrisches Diaryliodoniumsalz konnte ebenfalls 4-[18F]Fluorphenol durch konventionelles

Heizen und durch den Einsatz einer Mikrowelle mit guten Ausbeuten erhalten werden.[40]

Schema 12: Radiosynthese von 6-[18F]FDOPA[41, 42] und [18F)DAA1106[43] über

Diaryliodoniumsalzvorläufer

Neben Modell-Verbindungen konnte ein geschütztes 6-[18F]FDOPA über ein Diaryliodoniumsalz

hergestellt werden, jedoch mit mäßigen Ausbeuten (Schema 12, I).[41] In einer weiteren Arbeit konn-

ten hingegen 14 % ± 4 % RCA vom entschützten 6-[18F]FDOPA erhalten werden (Schema 12,

12 1 Einleitung

II),[42] ebenso wie [18F]DAA1106, einem PET Liganden für die Bildgebung von peripheren Ben-

zodiazepin Rezeptoren. Es wurden gute, allerdings nur über analytische HPLC bestimmte Ausbeu-

ten erzielt, wobei eine Verteilung von 71 % [18F]DAA1106 und 29 % 4-[18F]Fluoranisol beobachtet

wurde (Schema 12, III).

1.3.3 Mehrstufige Synthese von 18F-markierten Aromaten

Bei mehrstufiger Radiosynthese wird zunächst ein 18F-Markierungssynthon hergestellt, das im Fol-

genden zur Synthese der 18F-markierten Zielverbindung eingesetzt wird. In Schema 13[11] ist sub-

stituiertes para-[18F]Fluorbenzaldehyd als Ausgangsstoff für eine mehrstufige Synthese gezeigt. Die

in para-Stellung zum 18F stehende Aldehydfunktion aktiviert das aromatische System für die Ra-

diofluorierung. Die Aldehydfunktion kann nach der Markierung entweder mit einen Rh-Komplex

((PPh3)3RhCl) entfernt werden oder über die Bayer-Villiger-Oxidation zum Phenol umgewandelt

werden. Der Markierungsbaustein kann auch mit Diiodsilan (SiH2I2) versetzt werden, so dass eine

reduktive Iodierung erfolgt und man Benzyliodid erhält. [18F]Fluorbenzaldehyd kann jedoch auch

mit Natriumborhydrid (NaBH4) zum Benzylalkohol reduziert werden, welcher dann mit

Thionylbromid (SOBr2) zum Benzylbromid umgesetzt werden kann.

Schema 13: substituiertes para-[18F]Fluorbenzaldehyd als prosthetischen Gruppe[11]

Die Aldehydfunktion am substituierten para-[18F]Fluorbenzaldehyd kann in eine Vielzahl weiterer

funktioneller Gruppen umgewandelt werden. Auch weitere Markierungssynthone sind bekannt, die

zu diversen Zielmolekülen umgesetzt werden können.[44]

So wurde beispielsweise 6-[18F]FDOPA, dessen Aromat aufgrund seines Elektronenreichtums

schwierig zu markieren ist, in einer fünfstufige Aufbausynthese über einen Aryltrimethylammo-

nium-Vorläufer in 23 % RCA erhalten (Schema 14).[45]

1 Einleitung 13

Schema 14: Fünfstufige Aufbausynthese[45] und eine dreistufige von 6-[18F]FDOPA[46]

(MOM: Methoxymethyl-)

Ein grundsätzlicher Nachteil von mehrstufigen Radiosynthesen liegt darin, dass eine Automatisier-

barkeit oft sehr aufwendig ist. Für die klinische Routine ist jedoch eine vollautomatisierte, fernbe-

dienbare Synthese zwingend erforderlich, um mit großen Radioaktivitätsmengen umgehen zu kön-

nen und das Personal vor Strahlung zu schützen. Die Synthesen sollten daher so einfach wie mög-

lich sein (wenige Reaktionsschritte, hohe Ausbeuten, schnelle Reaktionen, Reinigung mittels SPE

etc.), um eine Übertragung auf Synthesemodule zu ermöglichen. Trotz der schwierigen Realisier-

barkeit von mehrstufigen Radiosynthesen, gibt es auch Beispiele bei denen komplexe Synthesepro-

zesse in einem vollautomatisierten Modul umgesetzt wurden.[47]

6-[18F]FDOPA kann hier als Referenzsynthese für die Radiofluorierung von elektronenreichen

Aromaten gezählt werden; aufgrund der Bedeutung des Tracers gibt es eine Vielzahl an Arbeiten

zu dem Thema[48]. Die fünfstufige Synthese von 6-[18F]FDOPA (Schema 14) konnte z.B. auf dem

Modular-Lab Standardmodul von Eckert & Ziegler nicht automatisiert werden. Es waren zu viele

unterschiedliche Reaktionsschritte unter teils sehr harschen Bedingungen. Die dreistufige Synthese

ausgehend von einem Nitro-Vorläufer (Schema 14), dessen aktivierende Aldehyd-Funktion durch

Bayer-Villiger-Oxidation umgeformt werden kann, ließ sich jedoch auf dem Modul umsetzen.

6-[18F]FDOPA konnte mit guten RCA isoliert werden.[46]

In der klinischen Routine werden demgegenüber einfache Radiosynthesen, die idealerweise aus

zwei Reaktionsschritten bestehen, durchgeführt. Ein Beispiel für dieses Syntheseprinzip stellt die

Herstellung von [18F]FET (Schema 6, Seite 8) dar. Der entsprechende Vorläufer wird radiofluoriert,

anschließend hydrolysiert und danach schließt sich noch eine HPLC-Reinigung an.

1.3.4 18F-Markierung von Makromolekülen

Da eine Direktmarkierung von Makromolekülen in der Regel nicht möglich ist, erfolgt deren Mar-

kierung zumeist über prosthetische Gruppen. Bedingt durch die Größe des Makromoleküls hat die

Einführung einer mit 18F-markierten prosthetischen Gruppe wenig Einfluss auf das Bindungs- und

pharmakokinetische Verhalten des Biomakromoleküls.

Bei einer prosthetischen Gruppe handelt es sich um ein Synthon, das zuerst radiomarkiert und

dann über eine Kupplungsreaktion mit der Zielstruktur verbunden wird. Es gibt eine Vielzahl an

prosthetischen Gruppen die für die Markierung von Makromolekülen Verwendung finden. Die

14 1 Einleitung

Radiofluorierungen erfolgen an aliphatische, aromatische und heterocyclische Positionen.[11] Durch

die Trennung von Markierung und Kupplung an die Makrostruktur können bei der Radiomarkie-

rung auch harsche Reaktionsbedingungen eingesetzt werden, die zur Zerstörung des Makromole-

küls führen würden.

Schema 15: Synthese von N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoat als prosthetische Gruppe (SG: Schutzgruppe,

TSTU: N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uroniumtetrafluorborat)

Ein Beispiel ist die am weiten verbreitetste prosthetische Gruppe, N-Succinimidyl-4-[18F]fluorben-

zoat ([18F]SFB). [18F]SFB ist ein Aktivester, der sich durch Acylierung an ein Amin in einem Mak-

romolekül binden kann.[49] Die Synthese (Schema 15) umfasst 3 Stufen; die Radiomarkierung, ge-

folgt von der Hydrolyse und der Umsetzung zum Aktivester.[50]

Neben einer Kohlenstoff-Fluor-Bindung gibt es noch weitere Möglichkeiten ein Molekül zu ra-

diofluorieren. Die erste Silizium-Fluor-Radiomarkierung wurde von Rosentahl et al.[51] im Jahr 1985

am Beispiel des [18F](CH3)3SiF aus (CH3)3SiCl untersucht. Bemerkenswert war, dass die Synthese

in 65 % MeCN(aq) durchgeführt wurde, wobei Wasser eigentlich das Fluorid solvatisiert und die

Nukleophilie so ganz erheblich absenkt. Darüber hinaus ist das Edukt in Wasser instabil, was da-

rauf hindeutet, dass die Fluorierung schneller ablaufen muss als die Zersetzung der Ausgangsver-

bindung in Wasser.

Bei in vivo Experimenten in Ratten konnte beobachtet werden, dass sich ein Großteil der Radio-

aktivität im Skelett des Tieres sammelt, was auf eine Defluorierung hinweist (Schema 16).

Schema 16: Vermuteter Mechanismus der Defluorierung von Si-F in Wasser[52]

In der folgenden Zeit wurde weiter an der in vivo Stabilität von Fluor-Silicium-Bindungen gearbeitet.

Weiterentwickelt wurde das Konzept von Schirrmacher et al.[53] im Jahr 2006. Diese Arbeitsgruppe

prägte auch die Bezeichnung SiFA (engl. silicon-based fluoride acceptor) für diese Verbindungsklasse. In

ihrer Arbeit untersuchten sie die Stabilität von SiFA Molekülen und fanden die im Schema 17

aufgeführte Reihenfolge, die zeigt, dass die sterisch anspruchsvollen tert-Butyl-Gruppen die Deflu-

orierung in vivo deutlich reduzieren, wobei die Akzeptoraffinität noch ausreichend hoch war. Dar-

über hinaus liefern diese Synthesen hohe Ausbeuten mit sehr kleinen Vorläufermengen (80–95 %

mit 4,1 nmol Vorläufermengen).

1 Einleitung 15

Schema 17: In vivo Stabilität von SiFAs

Die Möglichkeit, [18F]Fluorid an ein Aluminiumatom zu binden und dann über einen Chelator zu

komplexieren, wurde erstmals im Jahr 2009 veröffentlicht (Schema 18).[54] Dieser Chelator (z.B.

NOTA) wurde über einen Linker an ein Peptid gebunden und konnte in dieser Form für die präk-

linische Bildgebung verwendet werden. Im Jahr 2013 wurde diese Markierungsmethode in einer

humanen PET-Studie von Patienten mit Lungenkrebs eingesetzt.[55]

Schema 18: Fluor-Aluminium-Komplex

Eine Radiofluorierung über Kaliumtrifluorborat ist ebenfalls eine prominente Methode (Schema

19). Im Jahr 2008 wurde diese Arbeit veröffentlicht, indem ein Boronsäureester mit Kaliumhydro-

gendifluorid (KF·HF) umgesetzt und anschließend an Biotin gekoppelt wurde. Der Zusatz von

Träger zeigte sich jedoch für diese Reaktion als essentiell, um moderate Ausbeuten zu erzielen. Die

in vivo Stabilität konnte in einem Rattenmodell nachgewiesen werden und damit auch das Potential

als möglicher Tracer für die PET.[56]

Schema 19: Radiofluorierung über ein Kaliumtrifluorborat

Die Radiomarkierung von großen Makromolekülen bietet eine Vielzahl an Möglichkeiten, um das

Fluor-18 an die Zielstruktur zu binden. Eine 18F-Markierung von kleinen Molekülen ist mit derar-

tigen Methoden möglich, jedoch machen die strukturellen Änderungen die Tracer in PET oft un-

brauchbar.

16 1 Einleitung

1.3.5 Übergangsmetall-vermittelte Radiofluorierung von Aromaten

Schema 20: Pd- und Ni-vermittelte Radiofluorierung[57, 58]

Die Methode der Übergangsmetall-vermittelten, aromatischen Radiofluorierung findet in der Regel

im letzten Schritt (engl. late-stage) statt. Hierbei geht es darum, das [18F]Fluor möglichst am Ende

der Synthese in ein Molekül einzuführen. Nach der Radiomarkierung sollte möglichst nur noch

eine Abspaltung der Schutzgruppen mit einem finalen Reinigungsschritt erfolgen.

Die erste Übergangsmetall-vermittelte Radiofluorierung wurde von Ritter et al. im Jahr 2011 veröf-

fentlicht[57] (Schema 20). Zunächst wurde ein elektrophiles, radiofluorierendes Reagenz aus einem

speziell entwickelten Pd(IV)-Komplex und 18F– hergestellt. Dieses reagierte dann weiter mit einem

Pd(II)-Arylkomplex, der schlussendlich durch reduktive Eliminierung den radiofluorierten Aroma-

ten freigab. Kurz danach folgte dann von der gleichen Arbeitsgruppe eine weitere Arbeit zur Ra-

diofluorierung durch Nickelaryl-Komplexe.[58] Hierbei wurde ein Arylnickel(II)-Komplex mit ei-

nem Oxidationsmittel und 18F– umgesetzt, der dann durch reduktive Eliminierung den radiofluo-

rierten Aromaten herstellte.

Eine praktische Anwendung dieser Methode erfolgte durch Zischler et al.[59] In dieser Arbeit wurde

über die Radiosynthese von 6-[18F]Fluordopamin (6-[18F]FDA), 6-[18F]FDOPA und 6-[18F]Fluor-

L-meta-tyrosin (6-[18F]FMT) in moderaten radiochemischen Ausbeuten berichtet.

Im Jahr 2012 wurde über eine Pd-katalysierte Radiofluorierung zur Synthese von 1-[18F]Fluornaph-

thalin berichtet (Schema 21).[60] Die Synthese lieferte 33 % RCA. Jedoch musste eine geringe Menge

Träger in Form von CsF (20 μmol) zugegeben werden.

Die drei Übergangsmetall-vermittelten Methoden waren aufwendig, respektive von akademischem

Interesse.

1 Einleitung 17

Schema 21: Radiosynthese von 1-[18F]Fluornaphthalin[61]

Die Radiofluorierung mithilfe von Boronsäurepinakolestern (Schema 22, I) wurde im Jahr 2012

beschrieben.[61] Diese Radiomarkierung war relativ stabil und die Handhabung der Reagenzien er-

forderte keine besondere Vorsicht. Somit war die Radiofluorierung von aromatischen Systemen

zugänglich, wobei das Upscaling noch Probleme aufwies. Die 18F-Markierung unter Verwendung

von Arylmesityliodoniumsalzen (Schema 22, II) wurde von Ichiishi et al.[14] im Jahr 2014 veröffent-

licht. Die Arbeit basiert auf einer allgemeinen Fluorierungsmethode, die ein Jahr zuvor von dersel-

ben Arbeitsgruppe beschrieben wurde.[62] Im Jahr 2015 folgte dann noch die Radiofluorierung mit

Boronsäuren (Schema 22, III)[63] und zuletzt die 18F-Markierung mit Trialkylstannylen als Markie-

rungsvorläufer (Schema 22, IV)[64] im Jahr 2016.

Schema 22: Unterschiedliche Übergangsmetall-vermittelte, aromatische Radiofluorierungen

Die Kupferkomplexe ((py)4Cu(II)(OTf)2, (MeCN)4Cu(I)OTf und Cu(II)(OTf)2) sind unter basi-

schen Bedingungen nicht stabil. Dies führte dazu, dass viele der Kupfer-vermittelten Methoden in

der Praxis nicht durchführbar waren.[65] Die Synthese mit Kaliumcarbonat und Kryptofix®222

führte zu ganz erheblichen Ausbeuteeinbußen. In vielen Arbeiten wurde eine größere Menge

[18F]Fluorid mit Kaliumcarbonat und Kryptofix®222 getrocknet und nur eine Aliquot der Lösung

für die Reaktion verwendet. Für die Bestimmung der radiochemischen Ausbeute wurde dann je-

weils ein Aliquot aus der Reaktionslösung genommen und mittels HPLC oder DC analysiert. Da

in der Eintopfsynthese jedoch wesentlich höhere Basenmengen zum Einsatz kommen, erklärt sich

die große Differenz zwischen den bei Tredwell et al. [66] erzielten Ausbeuten von 55 % (kleiner An-

satz) und 12 % (großer Ansatz) RCA im Fall von 6-[18F]FDOPA.

18 1 Einleitung

Es zeigte sich, dass der Basenzusatz zu deutlich reduzierten Ausbeuten führte, was wahrscheinlich

auf eine Zersetzung des Cu-Komplexes im basischen Milieu zurückzuführen ist. Daher wurde die-

ser Syntheseansatz von Zlatopolskiy et al.[65] im Jahr 2015 einer umfangreichen Modifizierung un-

terworfen. Das neue Syntheseprotokoll erlaubte die Cu-vermittelte Radiofluorierung verschiedener

Iodoniumsalz- bzw. Boronsäurepinakolester-Substrate in hohen Ausbeuten. Die drastische Redu-

zierung von Base beim Trocknen von Fluor-18 ermöglichte dies, z.B. durch die minimalistische

Methode[67], bei der das [18F]Fluorid ohne Basenzusatz mit einem Onium-Vorläufer von einer An-

ionenaustauscher-Phase in alkoholischer Lösung eluiert wird. Der Alkohol wird in vacuo entfernt

und die Radiofluorierung kann in einem passenden Lösungsmittel begonnen werden. Bei dieser

Methode waren keine azeotrope Trocknung und auch kein Zusatz von Basen oder Phasentrans-

ferkatalysatoren erforderlich, was eine deutliche Zeitersparnis bietet.

Durch diese Methoden war es erstmals möglich, relativ unabhängig von ihrer elektronischen Kon-

figuration, aromatische Systeme mit hohen Ausbeuten zu radiofluorieren. Die Reaktionen finden

alle unter relativ milden Bedingungen statt, sodass sich diese Methode auch für die Radiofluorie-

rung von komplexeren Molekülen eignen sollte.

Im Allgemeinen erwartet man bei der Reaktion eine Produktverteilung von A und B (vgl. Schema

23). Die Zersetzung des Iodoniumsalzes führt ohne den Kupferkomplex zu einem Produktge-

misch, worin [18F]Fluormesitylen (B) das dominierende Produkt ist. Experimentell wurde ein Ver-

hältnis von 20:80 (A:B) erhalten (R = H).[62, 69] Die Begründung für dieses Versuchsergebnis basiert

auf dem elektronenreicherem aromatischen System von Mesityl und auf dem ortho-Effekt[70, 71]. Der

ortho-Effekt beschreibt, dass das Nukleophil den weniger in ortho-Position methylierten Aromaten

angreift. Durch die vermutete Anordnung (vgl. Schema 23) der hypervalenten Iodverbindung sollte

die Umsetzung zu [18F]Fluormesitylen begünstigt sein.

Schema 23: Allgemeines Reaktionsschema der 18F-Fluorierung unter der Verwendung von

Diaryliodoniumsalzen[11, 68] (Mes: Mesityl-)

1 Einleitung 19

Bei Einsatz von Kupferkomplexen bei der 18F-Fluorierung kehrt sich das Produktverhältnis um.

Zwei vermutete, reaktive Zwischenstufen sind in Schema 23 aufgeführt. Durch den sich bildenden

Kupferkomplex läuft die Reaktion nun selektiv, so dass Iodmesitylen entsteht und der Aromat 18F-

fluoriert wird.[68]

Die Methoden I–IV (Schema 22) werden über einen Kupfer(I)- oder Kupfer(II)-Komplex vermit-

telt. Über den Mechanismus ist noch nicht viel bekannt. Ichiishi et al.[68] postulierten einen

Cu(I)/Cu(III) katalytischen Zyklus für die Radiofluorierung von Arylmesityliodoniumsalzen

(Schema 24).[68] Diese Vermutung wurde durch Experimente und DFT-Berechnungen (Dichte-

funktionaltheorie) unterstützt.

Schema 24: Vermuteter katalytischer CuI/III Zyklus der Fluorierung von Aromaten über

Diaryliodoniumsalzen[68]

Zunächst addiert das [18F]Fluorid über einen Ligandenaustausch an das Kupfer. Darauf folgt die

oxidative Addition bei der sich der Aromat an das Kupfer bindet, bei gleichzeitiger Eliminierung

von Iodmesitylen (IMes). Der 18F-fluorierte Aromat wird dann durch reduktive Eliminierung über

einen π-Komplex gebildet.

Es wurde gezeigt, dass die 18F-Markierungen der Diaryliodoniumsalze sowohl mit Cu(I)- als auch

mit Cu(II)-Komplexen funktionieren.[14, 62, 65] In einer weiteren Arbeit wurde experimentell nachge-

wiesen, dass DMF in der Lage ist, Cu(II) zu Cu(I) zu reduzieren.[68] All dies macht eine Mechanis-

tische Aufklärung sehr schwierig.

Ein Punkt, der bis jetzt in der Literatur wenig Beachtung gefunden hat, ist, dass die Reaktion erst

mit guten Ausbeuten in der Anwesenheit von Luft-Sauerstoff (trockene, synthetische Luft) abläuft.

Eine große Ähnlichkeit lässt sich hier zur Chan[72]-Evans[73]-Lam[74]-Kopplung erkennen.[75] Diese

Kopplungsreaktion zwischen aromatischen Boronsäuren und Alkoholen oder Aminen führt zu

den entsprechenden aromatischen, sekundären Aminen oder Ethern. Diese Reaktion wird vermut-

lich durch einen Kupfer(II)-Komplex unter Luft katalysiert. Dabei oxidiert vermutlich der Sauer-

stoff das Kupfer(0) nach der reduktiven Eliminierung wieder zu Kupfer(II), so dass der katalytische

Zyklus geschlossen ist.

20 1 Einleitung

Diese Kupfer-vermittelte/katalysierte Arylierung ist die Basis für die jetzigen Arbeiten der Kupfer-

vermittelten Radiofluorierungen. Schon 1998 nannte David A. Evans diese Methode „copper-promo-

ted arylation“[73]. Der Mechanismus ist bis heute nicht vollständig aufgeklärt und wird weiterhin kont-

rär diskutiert.[68, 76, 77]

Ein chemischer Katalysator beeinflusst die Kinetik einer Reaktion, ohne sich dabei zu verbrauchen.

Die Thermodynamik einer chemischen Reaktion kann ein Katalysator jedoch nicht verändern. In

der präparativen-organischen Chemie werden Katalysatoren im Unterschuss eingesetzt, da sie sich

nicht verbrauchen. Die äquimolaren Mengen, die vom Kupfer-Komplex der radiochemischen Re-

aktion zugesetzt werden, wären da jedoch kein Ausschluss für eine Katalyse. Das [18F]Fluorid liegt

in sehr geringen Konzentrationen vor, und es wäre möglich, dass der Kupfer-Komplex erst eine

bestimmte Konzentration erreichen muss, um diese Reaktion zu beeinflussen. Ob es sich bei der

Reaktion um eine Kupfer-vermittelte oder katalysierte Reaktion handelt, wird erst durch weitere

Untersuchungen geklärt werden können.

1.4 Radiofluorierte aromatische Aminosäuren: Herstellung und

Anwendung in der PET-Bildgebung

1.4.1 Fluor in endogenen Stoffen

Im natürlichen Stoffwechsel des Menschen kommen praktisch keine fluorhaltigen Moleküle vor.[78]

Aus diesem Grund kann die Derivatisierung durch die Substitution von Fluor zu einer möglichen

metabolischen Veränderung des in vivo Verhaltens des Moleküls führen. In Tabelle 3 sind einige

Werte über die Bindung von Kohlenstoff zu Wasserstoff, Kohlenstoff, Sauerstoff und Fluor auf-

gelistet.

Tabelle 3: Eigenschaften einer C-X Bindung[52, 79]

X Van-der-Waals-Ra-

dius

Elektronegativität Bindungslänge C-X Bindungsstärke

H 120 pm 2,1 109 pm 413 kJ/mol

C 170 pm 2,5 154 pm 348 kJ/mol

O 152 pm 3,5 143 pm 351 kJ/mol

=O 123 pm 356 kJ/mol

F 147 pm 4,0 135 pm 441 kJ/mol

Der Vergleich der Van-der-Waals-Radien zeigt, dass Fluor ca. 20 % größer ist als Wasserstoff und

dass die Radien von Fluor und Sauerstoff sehr ähnlich sind. Die Bindungslängen von Hydroxy und

Carbonyl-Funktion ähneln auch sehr der Bindungslänge einer Kohlenstoff-Fluor-Bindung. Im

Vergleich der Elektronegativität ähneln sich Fluor und Sauerstoff auch sehr. Wasserstoff hingegen

weist eine deutlich niedrigere Elektronegativität auf, was sich im Dipolmoment einer Verbindung

1 Einleitung 21

wiederspiegelt. Jedoch ist eine C-F-Bindung immer noch lipophiler als eine

C-H-Bindung und sehr viel lipophiler als eine Hydroxy- oder Carbonyl-Bindung. Im Gegensatz zu

anderen Halogeniden ist Wasserstoff nicht polarisierbar, kann jedoch Wasserstoff-Brücken-Bin-

dungen aufbauen. Fluor weist eine hochkomplexe Eigenschaften auf, die eine breite Anwendung

in der Arzneimittelentwicklung findet.[80]

Zwei Verbindungen sind isoster, wenn sie in vivo ein ähnliches Verhalten zeigen. Diese Bioisosterie

macht man sich bei der Medikamentenentwicklung zunutze, z.B. wird ein Wasserstoffatom gegen

ein Fluor oder ein Deuterium ausgetauscht, um pharmakologische Eigenschaften einer Verbindung

zu modifizieren.[80] Beim Austausch von Wasserstoff gegen Fluor an einer Bindung, die der meta-

bolischen Oxidation unterliegt, könnte somit dieser Metabolismus gehindert werden.

1.4.2 18F-Markierte Radiotracer zur Untersuchung des Aminosäuretransports und der

Proteinsynthese

Die Hirn-PET-Bildgebung stellt eine besondere Herausforderung dar. Um eine Veränderung der

Proteinsyntheserate im Gehirn nachzuweisen, muss der Tracer nach der Injektion im Blutkreislauf

stabil bleiben und die Blut-Hirn-Schranke (engl. blood-brain barrier, BBB) überwinden können. Die

Blut-Hirn-Schranke ermöglicht es allen Landwirbeltieren, für das Nervengewebe im Gehirn und

Rückenmark spezielle Bedingungen aufrechtzuerhalten. Trotz ihrer Schutzfunktion müssen die

Nährstoffe zum Gehirn und Metaboliten aus dem Gehirn über die BBB transportiert werden.

Diese Vorgänge vollziehen sich passiv über Diffusion oder aktiv über Transporter.

Aminosäuren werden über einen Transporter ins Gehirn geschleust. Dies erfolgt im Fall von aro-

matischen Aminosäuren über den L-Typ-Aminosäure-Transporter (LAT-1).[81] LAT-1 ist im Allge-

meinen für die Aufnahme von proteinogenen, neutralen Aminosäuren wie Phenylalanin, Tyrosin,

Tryptophan, Valin, Leucin und Isoleucin ins Gehirns verantwortlich.[82]

Der Einbau von natürlichen Aminosäuren in Proteine erfolgt, nachdem sie die Zellwand durch

einen Transporter passiert haben. Um diesen Vorgang abzubilden, sollten die radiofluorierten Ami-

nosäurederivate ebenso die Blut-Hirn-Schranke passieren, in die Zellen transportiert und dann in

die Proteine eingebaut werden. Idealerweise sollte zwischen den Transporteigenschaften und Sub-

stratspezifitäten des markierten und endogenen Substrats keine Unterschiede bestehen. Das Ver-

halten der derivatisierten Aminosäuren kann sich jedoch ganz erheblich von den natürlichen Ami-

nosäuren unterscheiden und steht in Konkurrenz zum natürlichen Stoffwechsel der Aminosäuren.

In Hirn-Penetrations-Studien hat sich gezeigt, dass L-Phenylalanin ein hervorragender Kandidat

für die Überwindung der BBB im direkten Vergleich mit anderen Aminosäuren ist.[83]

22 1 Einleitung

Tabelle 4: Gehirn-Aufnahme-Index von L-Aminosäuren in Ratten[83]

Aminosäure Injizierte Konz. Gehirn Aufnahme Index

[3T]H2O - 100 %

Phenylalanin 0,003 nmol 55 % ± 5 %

Leucin 0,008 nmol 54 % ± 2 %

Tyrosin 0,006 nmol 50 % ± 2 %

Methionin 0,021 nmol 38 % ± 2 %

Valin 0,010 nmol 21 % ± 3 %

DOPA 0,202 nmol 20 % ± 1 %

O-(2-[18F]Fluorethyl)-L-tyrosin

Das erste 18F-fluorierte Diagnostikum, das routinemäßig für die

Detektion von Gehirntumoren eingesetzt wurde, ist O-(2-[18F]Flu-

orethyl)-L-tyrosin ([18F]FET).[84] [18F]FET passiert die Blut-Hirn-

Schranke und reichert sich in Tumorzellen mit einer hohen Ami-

nosäureaufnahme an. Dabei wird es jedoch im Gegensatz zu sei-

nen natürlichen Aminosäuren nicht in Proteine eingebaut.[85] Dies resultiert vermutlich aus der

Markierung über einen Linker (2-[18F]Fluorethylether), der eine ganz erhebliche strukturelle Verän-

derung darstellt. Durch die 18F-Fluorierung über einen Linker konnte jedoch eine aromatische 18F-

Fluorierung umgangen werden, die zwar prinzipiell möglich, jedoch mit großen Schwierigkeiten

verbunden ist. Die Synthese von [18F]FET erfolgt über einen geschützten tosylierten Vorläufer, der

nach Einführung von Fluor-18 entschützt wird.[27]

In Abbildung 1 sind die MRT- und PET-Aufnahmen eines Patienten mit einem anaplastischen

Astrozytom zu sehen, einem häufig auftretenden Tumor im Gehirn. In den MRT-Bildern ist eine

Veränderung sichtbar, jedoch erlaubt dieses Bild keine Abgrenzung des Tumors gegenüber dem

gesunden Hirngewebe. In der PET-Aufnahme mit [18F]FDG (Schema 6) ist eine deutliche, unspe-

zifische Anreicherung des Radiotracers im Gehirn zu erkennen. Durch den hohen Glucose-Umsatz

im Hirn ist eine Mehranreicherung im Tumorgewebe nicht oder nur sehr schwer sichtbar. Im Ge-

gensatz dazu ermöglicht das [18F]FET-PET Bild die genaue Lokalisation des Tumorgewebes.

Schema 25: [18F]FET

1 Einleitung 23

Abbildung 1: „Anaplastisches Astrozytom WHO Grade III. Das T1-gewichtete MRI nach Gabe von Gd-

DTPA (links) und das T2-gewichete MRI zeigen ausgedehnte Veränderungen, die jedoch keine Abgrenzung des

Tumors erlauben. Die FET-PET (rechts) erlaubt eine klare Darstellung des soliden Tumorgewebes während der

Glukose-Stoffwechsel (FDG-PET) im Tumorbereich vermindert ist.“[86] (Zur Verfügung gestellt von

Prof. Dr. K. H. Langen, INM-4, Forschungszentrum Jülich GmbH, Deutschland)

4- und 2-[18F]Fluor-L-phenylalanin

Die erste Arbeit über [18F]Fluorphenylalanin wurde 1971 veröffentlicht.[87]

In dieser Arbeit wurden die verschieden substituierten (ortho-, meta- und

para-) Fluorphenylalanine in unterschiedlichen Tiermodellen evaluiert. Da-

bei wurde die Bioverteilung des Tracers in den Organen und im Blut be-

stimmt.

Die verschiedenen Fluorphenylalanine zeigten jedoch unterschiedliche

Toxizitätsprofile (Tabelle 5). Beim 3-Fluorphenylalanin wird als Abbauprodukt die Bildung von

Fluoressigsäure postuliert, die hochtoxisch ist. Diese ist ein Essigsäuresurrogat im Citrat-Zyklus

und führt dort zu einer Enzymblockade. 2- und 4-Fluorphenylalanin bilden in ihrem weiteren Stoff-

wechsel keine Fluoressigsäure, was ihre relativ geringe Toxizität erklärt.[88]

Tabelle 5: Toxizität von Fluorphenylalanin[88]

Verbindung LD50 (Maus)

2-Fluorphenylalanin > 1000 mg/kg

3-Fluorphenylalanin 5,9 mg/kg

4-Fluorphenylalanin > 1000 mg/kg

Coenen et al. beschäftigten sich im Jahr 1985 mit der Bioverteilung und dem Proteineinbau von

ortho- und para-[18F]Fluorphenylalanin und setzten zum Vergleich 14C-markiertes para-Fluorphe-

nylalanin ein.[89] Sie konnten den Beweis erbringen, dass 4-[18F]FPhe in Proteine im Gehirn von

Mäusen eingebaut wird.[21] Die frühzeitige Defluorierung von 4-[18F]FPhe durch Leberenzyme

wurde jedoch bereits 1961 beschrieben.[90]

Coenen et al. veröffentlichte die direkte Radiofluorierung von Phenylalanin, Tyrosin und DOPA.[20]

Im selben Jahr wurde ebenfalls eine direkte Synthese von radiofluoriertem Phenylalanin von der

Schema 26:

2-/4-[18F]FPhe

24 1 Einleitung

Arbeitsgruppe Murakami et al.[22] mit [18F]F2 und [18F]AcOF veröffentlicht. Dieser Arbeit folgten

metabolische Untersuchungen von 2-[18F]FPhe in Ratten,[91] bei dem die Hirngängigkeit und der

langsame Metabolismus von 2-[18F]FPhe beschrieben wurde.[92] Im direkten Vergleich von

2-[18F]FPhe zu endogenen Phenylalanin konnte der verlangsamte Metabolismus von

2-[18F]FPhe durch Vergleich mit 2,6-[3H]Phe beschrieben werden. In einer Untersuchung der Hirn-

gängigkeit von 2-[18F]FPhe im Vergleich zu [14C]Phe, konnte nachgewiesen werden, dass

2-[18F]FPhe und [14C]Phe fast in identischer Geschwindigkeit über die BBB transportiert werden.[93]

2-[18F]FPhe und 2,6-[3H]Phe wurden auch verwendet, um den anabolen Stoffwechsel im Cerebrum

und im Cerebellum zu untersuchen. Auch hier konnte 2-[18F]FPhe sein Potential als Tracer für den

Aminosäuremetabolismus beweisen.[94]

Einige Jahre später wurde 2-[18F]FPhe erfolgreich für die Bildgebung von zerebralen Infarkten[95]

und Tumoren[96] beim Menschen eingesetzt. Eine Altersabhängigkeit der neutralen Aminosäureauf-

nahme über die Blut-Hirn-Schranke beim Menschen wurde zwar vermutet, konnte aber in PET-

Untersuchungen durch 2-[18F]FPhe nicht bestätigt werden.[97]

2-[18F]FPhe wurde in allen Fällen durch elektrophile Radiofluorierung hergestellt. Die ersten nuk-

leophilen Radiofluorierungen zur Synthese von 2-[18F]FPhe wurden über einen Isotopenaustausch

(Fluor als Abgangsgruppe) erreicht.[33]

Im Jahr 2016 konnte die nukleophile Synthese von 4-[18F]FPhe in einem automatisierten Modul

mit 56 % RCA innerhalb von 60 min aus dem entsprechenden Arylmesityliodoniumsalz über die

Kupfer-vermittelte Radiofluorierungsmethode realisiert werden.[98]

Die Defluorierung in vivo von 4-[18F]FPhe erwies sich als Nachteil für die Bildgebung. Demgegen-

über scheint 2-[18F]FPhe ein vielversprechender Tracer für die Bildgebung des Aminosäurestoff-

wechsels zu sein. Neben der Anwendung des 2-[18F]Fluorphenylalanins als Tracer für den Amino-

säure-Stoffwechsel, könnte es auch als Modell-Substanz für die Synthese von ähnlichen aromati-

schen Derivaten genutzt werden.

Schema 27: Stoffwechsel von 2-[18F]FPhe

1 Einleitung 25

1.4.3 Tracer für das dopaminerge System

Dopamin ist ein biogenes Amin, das durch Decarboxylierung von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin

(L-DOPA) in vivo gebildet wird. Es fungiert im menschlichen Körper als Neurotransmitter. Bei

einer Parkinson-Erkrankung sterben die dopaminergen Areale im Striatum ab, welche unter ande-

rem für die Umwandlung des L-DOPAs verantwortlich sind. Es kommt im Gehirn zu einem Ab-

sinken der Dopaminkonzentration. Im Gegenzug wird eine erhöhte Konzentration von Dopamin

im Gehirn z.B. mit Schizophrenie in Verbindung gebracht.[99]

Dopamin kann aufgrund seiner Struktur nicht die BBB passieren. Deshalb wird zunächst die Vor-

stufe, das L-DOPA über die BBB vom Gehirn durch den Transporter LAT-1 aufgenommen

(Schema 28). L-DOPA kann jedoch schon vor dem Passieren der Blut-Hirn-Schranke metabolisch

weiter umgesetzt werden. Genannt sei hier die Oxidation zum ortho-Chinon bzw. Dopachinon, was

sowohl unter basischen Bedingungen als auch enzymatisch (Tyrosinase) ablaufen kann. Über das

Dopachinon kann nun zum Beispiel der Metabolismus weiter bis zum Melanin laufen. Zusätzlich

kann das L-DOPA auch noch über die Aromatische-L-Aminosäure-Decarboxylase (AADC) außer-

halb des Gehirns zu Dopamin umgesetzt werden. Über die Catechol-O-Methyltransferase (COMT)

kann L-DOPA zu L-3-OMe-DOPA umgesetzt werden. Im Gegensatz zum Dopamin kann

L-3-OMe-DOPA die Blut-Hirn-Schranke wiederum passieren.[100]

Bei der Behandlung von Parkinson-Patienten mit L-DOPA soll durch die Gabe der Vorstufe zum

Dopamin, die Dopaminkonzentration im Gehirn erhöht werden. Durch die beschriebenen Stoff-

wechselvorgänge unterliegt L-DOPA einer Vielzahl von Transformationsprozessen. So muss dem

Patienten ein Decarboxylase-Hemmer (Carbidopa, Benserazid) und/oder ein Catechol-O-Methyl-

transferase-Hemmer (Entacapon, Tolcapon) gegeben werden, damit L-DOPA überhaupt das Ge-

hirn erreichen kann.[101]

In striatalen Neuronen im Gehirn wird L-DOPA decarboxyliert und dadurch in Dopamin umge-

wandelt.[102] Dieser Schritt wird durch die aromatische L-Aminosäure-Decarboxylase (AADC) ka-

talysiert.[103] Dopamin wird durch den vesikulären Monoamin-Transporter Typ 2 (VMAT2) in die

Vesikel transportiert.[102] Anschließend wird gespeichertes Dopamin durch Exozytose in den sy-

naptischen Spalt transportiert und dort wieder vom Dopamintransporter aufgenommen.

26 1 Einleitung

Schema 28: In vivo Dopamin-Stoffwechsel (AADC: Aromatische-L-Aminosäure-Decarboxylase, TH: Tyrosin-

hydroxylase, COMT: Catechol-O-Methyltransferase, MAO: Monoaminooxidase, ADH: Aldehyd-Dehydro-

genasen, HVA: Homovanillinsäure, engl. Homovanillic acid).

Dopamin wird durch COMT und die Monoamino-Oxidase (MAO) + Aldehyd-Dehydrogenasen

(ADH) zu 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC), im weiteren zu L-3-O-Methyldopamin und

letztlich zu Homovanillinsäure (HVA) umgesetzt.[104] Im Weiteren werden die sauren Metaboliten,

DOPAC und HVA, vom Gehirn relativ schnell abgebaut.[105]

6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin

6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin (6-[18F]FDOPA) verhält sich

ähnlich zu L-DOPA und wird daher als Surrogatmarker für die Bildgebung

vom dopaminergen System eingesetzt (Schema 28). Im Speziellen wird es

in der Diagnostik von Schizophrenie und Parkinson aber auch zur Detek-

tion von neuroendokrinen Tumoren eingesetzt.[42, 106]

Die Synthese von 6-[18F]FDOPA erweist sich bis heute noch sehr an-

spruchsvoll, und es wurde jahrzehntelang versucht, eine einfache Synthese dieses so wichtigen Ra-

diotracers zu etablieren.

5-[18F]FDOPA war das erste radiofluorierte DOPA-Derivat, welches im Jahr 1973 veröffentlicht

wurde.[107] Im Jahr 1981 folgte dann die erste Synthese von 6-[18F]FDOPA unter Zuhilfenahme von

Xenondi[18F]fluorid.[108] Die erste bildgebende Untersuchung von 6-[18F]FDOPA stammt aus dem

Jahre 1983.[109] Seitdem ist 6-[18F]FDOPA ein weit verbreiteter Tracer und wird vielseitig einge-

setzt.[106]

Im Jahr 2002 wurde eine Untersuchung über das in vivo Verhalten von 2-, 5- und

6-[18F]FDOPA im Menschen veröffentlicht.[110] Dabei stellte sich heraus, dass 2-[18F]FDOPA die

Schema 29:

6-[18F]FDOPA

1 Einleitung 27

BBB nicht überwinden kann und 5-[18F]FDOPA zeigte eine schwächere Aufnahme im Striatum im

Vergleich zu 6-[18F]FDOPA.

Für L-DOPA sowie 6-[18F]FDOPA existieren verschiedene metabolische Pfade, welche zu ver-

schiedenen Bioverteilungen führen und damit Einfluss auf die Bildgebung haben (Schema 28).

L-DOPA und 6-[18F]FDOPA können aus diesem Grund nur mit Hilfe von ADCC-Hemmern beim

Patienten zur Diagnostik und Therapie eingesetzt werden, um den peripheren Abbau zu hemmen

und die Konzentration von L-DOPA und 6-[18F]FDOPA im Gehirn zu erhöhen. In Abbildung 2

ist das Absterben der für die Decarboxylierung verantwortlichen Zellen im Striatum in Patienten

mit Morbus Parkinson zu erkennen.

Bis heute ist die geträgerte, elektrophile Synthese von 6-[18F]FDOPA die weitverbreitetste. Die

nukleophilen Synthese von 6-[18F]FDOPA hat jedoch vor allem in den letzten Jahren große Fort-

schritte gemacht.[46, 48] So sind aufwendige Aufbausynthesen auf kommerziell erhältlichen Modulen

etabliert worden.[47] Der Einsatz von trägerarmem 6-[18F]FDOPA, welches über eine nukleophile

Synthese hergestellt wurde, scheint jedoch zu keiner Verbesserung in der Bildqualität zu führen.[42,

59] Trotzdem ist die nukleophile Synthese von 6-[18F]FDOPA durch die einfachere Herstellung des

[18F]Fluorids in sehr viel höheren Aktivitätsmengen ein erstrebenswertes Ziel. Viele der Übergangs-

metall-vermittelte Radiofluorierungsmethoden haben die Synthese von 6-[18F]FDOPA zum Ziel

gehabt.[14, 59, 61, 111]

Abbildung 2: Axiale PET-Bilder von einer gesunden Kontrollperson (engl. healthy control), einer Person mit Par-

kinson im Anfangsstadium (engl. early parkinson) und einer Person mit Parkinson im fortgeschrittenen Stadium

(engl. advanced parkinson) mit 6-[18F]FDOPA[112] (Zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Philippe Remy,

l'Hôpital Henri Mondor, Frankreich)

28 1 Einleitung

6-[18F]Fluor-L-meta-tyrosin

6-[18F]Fluor-L-meta-tyrosin (6-[18F]FMT) weist im Unterschied zu

L-DOPA keine Hydroxyfunktion in para-Position auf. Dadurch ist der

Metabolisierungsweg über Catechol-O-Methyltransferase blockiert

(Schema 28) wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis für die PET-Bildge-

bung, im Vergleich zu 6-[18F]FDOPA, deutlich verbessert wird. Durch

den Metaboliten L-[18F]F-3-OMe-DOPA, der einen anderen Transport-

weg als 6-[18F]FDOPA aufweist, kann das von 6-[18F]FDOPA herrührende Signal nicht vom Me-

taboliten Signal unterschieden werden.[100] L-6-[18F]F-3-OMe-DOPA wurde synthetisiert[113] und in

vitro als Tumormarker untersucht[114].

Die bessere Abgrenzung des Striatums in der Bildgebung mit 6-[18F]FMT im Vergleich zu

6-[18F]FDOPA ist nicht das Ergebnis einer verbesserten striatalen Retention, sondern die Folge

einer deutlich geringeren Retention der Radioaktivität in nicht-dopaminergen Geweben.[115]

Die erste Synthese von radiofluorierten meta-Tyrosinen erfolgte 1990.[116] Im Jahr 1993 wurden

4- und 6-[18F]FMT durch Trimethylzinn-Vorläufer mit moderaten RCA hergestellt.[117] So stellte

die Arbeitsgruppe von Coenen et al.[34] 6-[18F]FMT durch Isotopenaustausch und Bayer-Villiger-

Oxidation mit 8–13 % RCA her. Durch die Nickel-vermittelte Methode konnte der Tracer mit 5 %

± 1 % RCA ebenso darstellt werden.[59]

Die diagnostische Überlegenheit von 6-[18F]FMT gegenüber 6-[18F]FDOPA das dopaminerge Sys-

tem abzubilden konnte in mehreren Studien gezeigt werden.[118] Auch wurden erste Human-Studien

mit Parkinson-Patienten durchgeführt.[119] meta-Tyrosin wurde auch in der 6-Position mit [11C]CH3I

über eine Pd(0)-vermittelte Reaktion markiert und mit 6-[18F]FDOPA verglichen.

6-[11C]Methyl-m-tyrosin wies im Vergleich zu 6-[18F]FDOPA, ebenfalls einen größeren Kontrast

von Striatum zu Cerebellum auf.[120]

6-[18F]FMT wurde auch verwendet, um einen Zusammenhang zwischen niedriger, dorsaler, stria-

taler, präsynaptischer Dopaminsynthesekapazität und übermäßigem Essverhalten zu untersu-

chen.[121]

Schema 30:

6-[18F]FMT

2 Problemstellung 29

2 Problemstellung

Die Einführung von [18F]Fluorid in elektronenreiche, aromatische Systeme stellt immer noch eine

große Herausforderung dar. Das ungebrochene Interesse von Biologen und Medizinern an aroma-

tisch radiofluorierten Phenylaminosäuren für die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wie

dem 6-[18F]Fluor-L-DOPA (6-[18F]FDOPA) verdeutlicht den Stellenwert dieser chemischen Reak-

tion. Die bislang entwickelten Synthesewege für das 6-[18F]FDOPA sind dadurch charakterisiert,

dass sie entweder im Falle einer elektrophilen 18F-Fluorierung nicht genügend Radioaktivitätsmen-

gen, häufig gepaart mit einer geringen molaren Aktivität, liefern oder im Falle von nukleophilen 18F-Fluorierungen durch ihre Vielzahl an Reaktionsschritten schwierig zu automatisieren sind bzw.

nicht zuverlässig funktionieren. Durch Übergangsmetall-vermittelte Radiofluorierungsmethoden

ist es in den vergangenen Jahren erstmal möglich geworden, auch elektronenreiche [18F]Fluorarene

durch „late-stage“-Markierungen zu erhalten. Diese Methoden haben vielversprechende Ergebnisse

für die Grundlagenforschung erbracht, jedoch mangelt es an der praktischen Umsetzung von Mo-

dellverbindungen auf klinisch relevante 18F-Tracer mit ausreichend großen Produktaktivitäten.

Im Mittelpunkt der hier vorgestellten Arbeit standen die aromatisch radiofluorierten Aminosäuren

2-[18F]Fluor-L-phenylalanin (2-[18F]FPhe), 6-[18F]FDOPA und 6-[18F]Fluor-L-meta-tyrosin

(6-[18F]FMT), die mittels Cu-vermittelter Radiofluorierung ausgehend von nukleophilem [18F]Flu-

orid synthetisiert werden sollten.

Im ersten Teil der Arbeit sollte die Synthese von 2-[18F]FPhe über die Kupfer-vermittelte 18F-Flu-

orierung ausgehend von Arylmesityliodoniumsalz als Markierungsvorläufer untersucht werden.

Dafür sollten zunächst die entsprechenden Iodoniumsalze hergestellt werden. Anschließend sollte

damit die Radiosynthese von 2-[18F]FPhe durchgeführt und optimiert werden. Im Zuge der Arbeit

zeigt sich, dass der Vorläufer unter den gewählten Reaktionsbedingungen racemisierte. Dieses

Problem musste erforscht und gelöst werden, um enantiomerenreine Tracer im Hinblick auf die

Humananwendung herstellen zu können. Eine wichtige Fragestellung war hierbei, welchen Ein-

fluss das Tetrafluorboratgegenion des Iodoniumsalzes auf die molare Aktivität von 2-[18F]FPhe

hat.

Im zweiten Teil der Arbeit sollte zunächst am Beispiel des 6-[18F]FDOPA, stellvertretend für die

Klasse der elektronenreichen, aromatischen [18F]Fluorphenylaminosäuren, eine Methode für deren

Herstellung unter Verwendung der Kupfer-vermittelten Reaktion mit Boronsäurepinakolestern

entwickelt und optimiert werden. Dazu stand zunächst die Synthese eines geeigneten Markierungs-

vorläufers im Mittelpunkt. Anschließend musste ein entsprechendes 18F-Markierungsprotokoll er-

arbeitet werden.

Darüber hinaus sollte die Kupfer-vermittelte Radiofluorierungsmethode ausgehend von Boronsäu-

repinakolestern auch für die Synthese von 2-[18F]FPhe untersucht werden. Dies sollte einen Ver-

gleich der Synthese von 2-[18F]FPhe über Arylmesityliodoniumsalzvorläufern mit der über Boron-

säurepinakolestern ermöglichen.

30 2 Problemstellung

Nach Ausarbeitung eines Markierungsprotokolls sollte die bessere Methode dann auf ein automa-

tisiertes Modul übertragen werden. Diese sollte schließlich ermöglichen präklinische Untersuchun-

gen mit diesen 18F-markierten Derivaten durchzuführen. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit

(ortho-Substitution) von 2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT, sollten die gewonnenen Erkenntnisse dafür

genutzt werden, den wenig verbreiteten Tracer 6-[18F]FMT über die optimierte Radiofluorierungs-

methode für eine Produktion im großen Aktivitätsmaßstab zugänglich zu machen. Darüber hinaus

sollten weitere Aminosäurederivate wie das 2-[18F]Fluor-phenylethylamin (6-[18F]FPEA) und

5-[18F]Fluor-L-meta-tyrosin (5-[18F]FMT) hergestellt werden.

3 Ergebnisse & Diskussion 31

3 Ergebnisse & Diskussion

3.1 Kupfer-vermittelte Synthese von n.c.a. 2-[18F]Fluorphenylalanin über

Arylmesityliodoniumsalzen als Markierungsvorläufer

Die Möglichkeiten der Kupfer-vermittelten Radiofluorierung über Arylmesityliodoniumsalze[14]

wurde zunächst an 2-[18F]Fluorphenylalanin (2-[18F]FPhe) studiert. Die Iodoniumsalze bieten den

Vorteil, dass das [18F]Fluorid bei der Trocknung ohne Basenzusatz von der QMA-Kartusche auf-

grund des Gegenions eluiert werden kann.[65] Darüber hinaus wurde im Jahr 2015 eine Arbeit über

die Synthese von Iodoniumsalzvorläufern in sehr hohen Ausbeuten unter sehr milden Bedingun-

gen veröffentlicht,[122] die auch labilere Schutzgruppen toleriert.

3.1.1 Vorläufer und Referenzsynthese von 2-[18F]FPhe

Der entsprechende Iodoniumsalzvorläufer wurde in vier Schritten ausgehend von L-Phenylalanin-

tert-butylester Hydrochlorid hergestellt. Zunächst wurde das primäre Amin im Ultraschallbad lö-

sungsmittelfrei in quantitativer Ausbeute mit einer Boc-Gruppe versehen (N-tert-Butoxycarbonyl-

L-phenylalanin-tert-butylester, 1, vgl. Schema 31),[123] gefolgt von einer Iodierung mit BTI und Iod,

welche sowohl das ortho- (tert-Butyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(2-iodphenyl)propionat,

2) als auch das para-iodierte Produkt (tert-Butyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(4-iodphe-

nyl)propionat, 7) in 43 % bzw. 40 % lieferte. Die Reaktion[124] wurde dahingehend optimiert, dass

unter quantitativem Verbrauch des Edukts 1 fast ausschließlich die ortho- und para-iodierten Pro-

dukte 2 und 7 die dominierenden Reaktionsprodukte waren und mehrfach iodierte Verbindungen

praktisch kaum gebildet wurden.

Anschließend wurde das Amin 2 mit 4-(Dimethylamino)pyridin (4-DMAP) als Base in 88 % Aus-

beute mit einer zweiten Boc-Gruppe versehen. Schließlich wurde die Verbindung tert-Butyl-(2S)-2-

([(tert-butoxy)carbonyl]amino)-3-(2-iodphenyl)propionat (3) durch die Synthese an einer Schlenk-

Linie in 82 %iger Ausbeute in das gewünschte Iodoniumsalz, (2-[(2S)-2-(Bis[(tert-butoxy)car-

bonyl]amino)-3-(tert-butoxy)-3-oxo-propyl]phenyl)(2,4,6-trimethylphenyl)iodoniumtetrafluorborat

(4), überführt.[122] Die Gesamtausbeute für diese Synthese lag bei etwa 31 % (Schema 31).

Die Referenzsubstanz 6 wurde beginnend mit 2-Fluorphenylalanin in einer 3-Stufensynthese, bei

der tert-Butyl und zwei Boc-Schutzgruppen eingeführt wurden und tert-Butyl-2-(bis[(tert-

butoxy)carbonyl]amino)-3-(2-fluorphenyl)propanoat (6) in 56 % Gesamtausbeute erhalten wurde.

Die beiden Boc-Schutzgruppen wurden nacheinander eingeführt, so dass neben Verbindung 6

auch tert-Butyl-2-((tert-butoxycarbonyl)-amino)-3-(2-fluorphenyl)-propionat (5) als Referenz zur

Verfügung stand.

32 3 Ergebnisse & Diskussion

Schema 31: a) Boc2O, > 99 %. b) BTI, I2 in DCM, (ortho-)2 43 % und (para-)7 40 %. c) Boc2O, Et3N,

4-DMAP in DMF, 88 %. d) Selectfluor, TMSOAc (Trimethylsilylacetat), Kalium-2,4,6-trimethylphenyltriflu-

orborat (KBF3Mes) in MeCN, 82 %. e) AcOtBu, HClO4. f) Boc2O, 64 %. g) Boc2O, Et3N, 4-DMAP in

DMF, 88 %.

Ein interessanter Aspekt ist die finale Umsetzung zum Iodoniumsalz mit sehr hohen Ausbeute.[122]

In Schema 32 ist der Reaktionsmechanismus für diese Synthese aufgezeigt. Zunächst erfolgt die

Oxidation des Iods von +I zu +III durch Selectfluor. Diese doppelt fluorierte, hypervalente Iod-

Verbindung ist hochreaktiv, dadurch ist das Arbeiten unter Schutzgasatmosphäre unerlässlich. Der

Ligandenaustausch mit Trimethylsilylacetat (TMSAc) führt in situ zu einer relativ stabilen Zwi-

schenstufe, die dann mit Kalium-2,4,6-trimethylphenyltrifluorborat (KBF3Mes) zum Tetrafluorbo-

ratiodoniumsalz umgesetzt wird. Diese Art der Synthese wird im Eintopfverfahren durchgeführt

und liefert sehr hohe Ausbeuten bei gleichzeitiger Toleranz gegenüber labiler Schutzgruppen.

Schema 32: Reaktionsmechanismus für die Iodoniumsalzsynthese nach Qin et al.[122]

3.1.2 Radiosynthese von 2-[18F]FPhe

Die minimalistische Methode beschreibt den Vorgang, bei dem zunächst das

[18F]Fluorid auf einer QMA-Kartusche fixiert, durch Spülen mit einem Lösungs-

mittel (in der Regel MeOH) die Reste des Targetwassers entfernt und schließlich

[18F]Fluorid mit einem Iodoniumsalz gelöst in MeOH eluiert wird.[67] In diesem

Zusammenhang ist die Bezeichnung Iodoniumsalz jedoch etwas irreführend.

Röntgenstrukturanalysen von Iod(III)-Verbindungen lassen auf eine T-förmige

Struktur des Moleküls schließen, wobei sich zwei Liganden (L) eine hypervalente

Bindung zum Iod teilen (Schema 33). Die Struktur in Lösung wird kontrovers diskutiert, besonders

Schema 33: Struk-

tur einer hypervalen-

ten Iod(III)-

Verbindung

3 Ergebnisse & Diskussion 33

im Fall von Diaryliodoniumsalzen. Diese könnte sowohl vom Lösungsmittel als auch vom Ge-

genion abhängen.[125]

Die Möglichkeit, [18F]Fluorid mit einem Iodoniumsalz von einer Anionenaustauscherphase zu elu-

ieren, deutet jedoch auf eine teilionische Struktur hin. Ein genaues Verständnis dieses Mechanis-

mus gibt es jedoch nicht.[67]

Schema 34: Verschiedene Reaktionsprodukte die bei der 18F-Fluorierung über Iodoniumsalz 4

Zunächst wurde die Reaktion unter den zuvor veröffentlichten Bedingungen[14] (85 °C, 1 Äq.

(MeCN)4Cu(I)OTf in DMF) mit Verwendung der minimalistischen Methode untersucht, wobei

das [18F]F– auf eine QMA-Kartusche in Carbonat-Form gebunden und durch den Iodoniumsalz-

vorläufer in MeOH eluiert wurde. Danach wurde MeOH in vacuo entfernt.[65] Die Radiomarkie-

rungsreaktion lieferte jedoch geringe Ausbeuten. Daher wurde die Reaktion bei unterschiedlichen

Temperaturen und Cu-Komplexmengen untersucht. Die Abhängigkeit der Radiofluorierung von

der Reaktionstemperatur (Diagramm 1) zeigt, dass 95 °C für die 18F-Markierung unter Verwendung

von Vorläufer 4 optimal ist. Höhere und niedrigere Temperaturen führen zu einer verminderten

Bildung von [18F]6 (Schema 35). Interessanterweise konnte neben [18F]6 und [18F]Fluormesitylen

([18F]Mes), die Bildung eines weiteren radioaktiven Produktes nachgewiesen werden. Das Neben-

produkt konnte als [18F]5 identifiziert werden, indem während der Markierung eine der Boc-

Gruppe abgespalten wurde, was schon während der Radiomarkierung in der

6-[18F]FDOPA-Synthese vermutet wurde.[98]

Die Optimierung der Kupferkomplexmenge ((MeCN)4Cu(I)OTf) ergab, dass zwei Äquivalente die

besten Ergebnisse lieferten. Ein weiterer Anstieg führte zu einer Zunahme von [18F]5. Die Menge

der doppelten Boc-geschützten [18F]6 ging drastisch zurück, was zu einer Gesamtrückgang der

beiden 18F-markierten Zwischenprodukte ([18F]6 + [18F]5) führte. Sowohl bei steigender Tempe-

ratur wie auch bei steigender Kupferkomplexmenge ist eine gestiegene Teilentschützung von [18F]6

zu beobachten. In der Literatur ist diese Reaktion bereits bekannt, mit katalytischen Mengen

Cu(II)(OTf)2 konnte eine von zwei Boc-Schutzgruppen selektiv hydrolysiert werden.[126]

34 3 Ergebnisse & Diskussion

Diagramm 1: Temperaturabhängigkeit der RCA unter Verwendung von Vorläufer 4 (n = 3, 10 μmol 4 und 10 μmol (MeCN)4Cu(I)OTf in 300 μL DMF, 20 min, RCA*: nicht isolierte radiochemische Ausbeute, be-

stimmt durch HPLC, Aliquot aus wässrig gequenchter Reaktionslösung)

Diagramm 2: Abhängigkeit der RCA unter Verwendung von Vorläufer 4 von der Menge des Kupferkomplexes (n = 3, 10 μmol 4 und (MeCN)4Cu(I)OTf in 300 μL DMF, 20 min, RCA*: nicht isolierte radiochemische

Ausbeute, bestimmt durch HPLC, Aliquot aus wässrig gequenchter Reaktionslösung)

3 Ergebnisse & Diskussion 35

Beim Quenchen der Reaktion mit Wasser kommt es zum Ausfällen des Vorläufers im Reaktions-

gemisch, was immer wieder zu Problemen bei der Festphasenreinigung (engl. solid phase extraction:

SPE) führte. Immer wieder verstopften die Kartuschen oder das mitausgefällte, radiofluorierte

Zwischenprodukt ließ sich nicht fixieren. Durch die Zugabe von geringen Mengen an Methanol

konnte dieses Problem gelöst werden. Damit wurde die Polarität der Lösung geringfügig reduziert,

so dass das Zwischenprodukt auf der Phase gebunden wurde. Die Elution von der RP-Phase er-

folgte dann mit MeCN.

Nach Entfernung des Lösungsmittels in vacuo wurde zur Entschützung das Reaktionsgemisch mit

konz. HCl(aq) versetzt. Aufgrund der hohen Konzentration der Salzsäure, der unter milden Bedin-

gungen hydrolysierbaren Schutzgruppen und der Stabilität von L-Phenylalanin (Phe) unter diesen

Bedingungen erfolgte eine quantitative Hydrolyse. Neben dem 2-[18F]FPhe konnte kein weiteres

radioaktives Produkt detektiert werden.

3.1.3 Untersuchung der Enantiomerenreinheit von 2-[18F]FPhe

Unerwarteterweise führte die radioaktive 18F-Markierung unter den minimalistischen Bedingungen

zur Bildung von bis zu 20 % D-Enantiomer (vgl. Tabelle 6, Zeile 1 und Diagramm 3).

Fig. 6: Synthese von 2-[18F]FPhe

Diagramm 3: Untersuchung der Enantiomerenreinheit von 2-[18F]FPhe (minimalistische Methode); Crownpak

(+) (4,6x150 mm); 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min); Radioaktivkanal; 20 μL Probenschleife

Als Ursache für diese Racemisierung kamen die gewählten 18F-Markierungsbedingungen in Frage.

Interessanterweise wurde bei der Synthese von 4-[18F]FPhe unter den gleichen Bedingungen keine

Racemisierung (Tabelle 6, Zeile 2) beobachtet, was die Ergebnisse der Literatur reproduzierte.[65]

Eine Racemisierung während der Vorläufersynthese wurde daher als unwahrscheinlich angenom-

men.

Integration C:\GINA_NT\DM\ERMERT1\SEP2\160425.02

00"00 05'00 10'00 15'00 min

Ch2

00"00 05'00 10'00 15'00 min

0

200

400 cps

2-[18F]F-D-Phe

2-[18F]F-L-Phe

00"00 05'00 10'00 15'00 min

UV2

00"00 05'00 10'00 15'00 min

0

10

20 mV

36 3 Ergebnisse & Diskussion

Die Racemisierung läuft grundsätzlich über die Abstraktion des Protons am α-ständigen Kohlen-

stoff unter basischen Bedingungen.[127] Es wurde vermutet, dass die Racemisierung durch die elekt-

ronenziehenden Effekte der beiden Boc-Schutzgruppen auf dem Amin begünstigt wird. Ähnliche

Resultate in Bezug auf die Racemisierung und die Substitution des Amins sind auch in der Literatur

bekannt.[128] Durch einen elektronegativen Effekt der Substitution wird die Acidität des Protons

am α-Kohlenstoff der Aminosäure deutlich erhöht. Dennoch scheint die Position des Iodoni-

umsalzes am Aromaten auch eine entscheidende Rolle zu spielen.

Der Austausch der Schutzgruppen, die eine geringere elektronenziehende Wirkung auf das Amin

haben, sollte die Acidität verringern und damit die Enantiomerenreinheit verbessern. Es wurde

festgestellt, dass der Schutz des Amins mit Boc und MOM (Methoxymethyl-) zu einer deutlichen

Reduktion der Racemisierung (ca. 10 % D-Enantiomer) führte. (Tabelle 6, Zeile 3). Die radioche-

mische Ausbeuten waren mit 14–25 % leicht rückläufig. Die Einführung einer Trityl- (Tr) (12) oder

Dibenzosuberyl-Schutzgruppe (Sub) (13), die beide einen elektronenschiebenden Effekt aufweisen,

an der Aminofunktion war zwar erfolgreich, führte jedoch bei der Umsetzung zum Iodoniumsalz

zu keinem isolierbaren Produkt.

Schema 35: a) Boc2O, Et3N, 4-DMAP in DMF, 88 %. b) Selectfluor, TMSOAc, KBF3Mes in MeCN,

89 %. c) PFA, TMSCl, in DCM + MeOH + Et3N, 79 %. d) Selectfluor, TMSOAc, KBF3Mes in MeCN,

78 %. e) 4 M HCl in Dioxan, Et3N, TrCL/SubCl in MeCN, 70 %/72 %. f) Ionenaustauschersäule

(TsO–), > 99 %.

3 Ergebnisse & Diskussion 37

Schema 36 & Tabelle 6: Synthese von 2-/4-[18F]FPhe mit unterschiedlichen Vorläufer und Elutionsmethoden

Zeile Vorläufer

→ Tracer

Elutionsmethode RCA ee [2-FPhe]

1 4 R = Boc

X = BF4–

→ 2-[18F]FPhe

Minimalistisch 32 % ± 14 % (n = 3)

63 % ± 7 %

2 9 R = Boc

X = BF4–

→ 4-[18F]FPhe

Minimalistisch 35 % ± 6 % (n = 3)

> 99 %

3 11 R = MOM

X = BF4–

→ 2-[18F]FPhe

Minimalistisch 25 %, 14 % (n = 2)

77 %, 80 %

4 4

→ 2-[18F]FPhe

Azeo. Trocknung mit MeCN + Et4NHCO3

43 % ± 14 % (n = 3)

> 99 % 210, 340 nmol

(n = 2)

5 4

→2-[18F]FPhe

QMA NaTs, Minimalistisch

42 %, 35 % (n = 2)

92 %, 98 %

6 4

→ 2-[18F]FPhe

QMA TsOH, Mi-nimalistisch

27 %, 28 % (n = 2)

> 99 %

7 4

→ 2-[18F]FPhe

low-base 48 % ± 8 % (n = 3)

> 99 % 220, 190 nmol (n = 2)

8 14 R = Boc

X = TsO–

→ 2-[18F]FPhe

low-base 18 % ± 11 % (n = 3)

> 99 % 1, 4, 5 nmol (n = 3)

Es wurde festgestellt, dass keine Racemisierung während der klassischen, azeotropen Trocknung

von [18F]F– in H2[18O]O ohne vorherige Kartuschenfixierung mit Acetonitril erfolgte, wobei nur

geringe Mengen Tetraethylammoniumhydrogencarbonat (Et4NHCO3) der Mischung als Base zu-

gesetzt wurden (Tabelle 6, Zeile 4).

Ausgehend von diesen Erkenntnissen wurde angenommen, dass die Racemisierung bei der Metha-

nol-Entfernung und der daraus resultierenden Volumenreduktion unter minimalistischen Bedin-

gungen aufgrund der basischen Carbonationen erfolgte, welche bei der Elution der QMA-Kartu-

sche in die Reaktion gelangten.

38 3 Ergebnisse & Diskussion

Schema 37: Postulierter Mechanismus, der zur Racemisierung führt

Die Verwendung von heißen, protischen Lösungsmitteln, das Vorhandensein von basischen Car-

bonationen und die Position des Iodoniumsalzes in ortho-Position verstärken offensichtlich die

Racemisierung von 2-[18F]FPhe. Hierbei wäre eine ringförmige Zwischenstufe denkbar, wie in

Schema 37 gezeigt. Als Beispiel aus der Literatur für eine pseudocyclische Stabilisierung kann Ben-

ziodoxol angeführt werden (Schema 38).[129, 130]

Schema 38: Pseudocyclische Stabilisierung von Benziodoxol

Dies wurde dadurch bestätigt, dass durch die Vorkonditionierung der QMA-Kartusche mit ver-

dünnter TsOH(aq) die Carbonationen vollständig von der Phase entfernt wurden und die Racemi-

sierung erfolgreich unterdrückt wurde. Leider führten die sauren Bedingungen während des Trock-

nungsprozesses zu einem erheblichen Verlust von [18F]Fluorid und einer signifikanten Verringe-

rung der radiochemischen Ausbeute (Tabelle 6, Zeile 5−6).

Unter low-base-Bedingungen (engl. wenig Base), wobei das[18F]F− durch eine geringe Menge Tetra-

ethylammoniumhydrogencarbonat (Et4NHCO3) in Methanol von der QMA eluiert wurde, wurde

die Racemisierung ebenfalls komplett unterdrückt. Unter diesen Bedingungen konnte 2-[18F]FPhe,

enantiomerenrein mit einer RCA von 48 % ± 8 % erhalten werden (Tabelle 6, Zeile 7).

Die Verwendung von trockenem Methanol hat sich bei der Wiederfindungsrate des [18F]Fluorids,

über den Prozess der Kartuschenfixierung und Elution, als kontraproduktiv erwiesen. Durch die

Verwendung von p.A. Methanol (99,5 % Reinheit; Wasser ≤ 0,1 %) konnten die [18F]Fluorid-Reste

auf der QMA noch weiter reduziert werden. Die Wiederfindungsrate der Radioaktivität lag bei der

QMA-Fixierung und Elution bei über 90 %. Eine genaue Bestimmung des Wassergehalts im Me-

thanol ist nicht vorgenommen worden. Durch seine hygroskopischen Eigenschaften sollte dieser

jedoch über die Zeit ansteigen. Beim Eindampfen werden geringe Wassermengen vom Methanol

mitgeschleppt und so aus dem Reaktionsgefäß entfernt. Ein negativer Effekt von verbleibendem

3 Ergebnisse & Diskussion 39

Wasser im Reaktionsgefäß konnte nicht beobachtet werden. Die Verwendung von trockenem Me-

thanol hatte darüber hinaus keinen ausbeutesteigernden Effekt.

3.1.4 Reinigung und isotopische Verdünnung von 2-[18F]FPhe

Die analytische Identifikation von 2-[18F]FPhe wurde über RP-HPLC bewerkstelligt. Durch den

Austausch von Essigsäure (AcOH) gegen Trifluoressigsäure (TFA, engl. trifluoroacetic acid) im Lauf-

mittel konnte die Selektivität deutlich verbessert werden.[131] Die Verbesserung der Trennleistung

beruht dabei nicht nur auf dem niedrigen pH-Wert. Vergleichsmessungen bei gleichem pH-Wert

mit wässriger Salzsäure machen dies deutlich (Diagramm 4).

Diagramm 4: 3 Chromatogramme mit unterschiedlichen Laufmittelzusätzen: Phe + 2-FPhe + 4-FPhe; Hydro-

RP 4 μm 110 Å (4,6x250 mm); a) 6 % EtOH(aq) + 0,1 % AcOH (pH: 3,2; o.) / 0,1 % TFA (pH: 1,9;

m.) / 0,08 % 12 M HCl(aq) (pH: 1,9; u.) (1,0 mL/min); 210 nm; 20 μL Probenschleife

Bei den Synthesen von 2-[18F]FPhe wurden nach der HPLC-Reinigung neben dem Träger auch

eine geringe Menge von Phenylalanin (Phe) gefunden (Diagramm 5). Diese Ergebnisse decken sich

Integration C:\GINA_NT\DM\ERMERT1\SEP2\171213.05

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

Ch2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

0,00

0,20

0,40

0,60 cps

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

UV2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

0

5

10 mV

Phe

2-FPhe

4-FPhe

Integration C:\GINA_NT\DM\ERMERT1\SEP2\170428.06

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

Ch2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

0,00

0,20

0,40

0,60 cps

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

UV2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

0,0

5,0mV

Phe

2-FPhe

4-FPhe

Integration C:\GINA_NT\DM\ERMERT1\SEP2\171213.06

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

Ch2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

0,00

0,20

0,40

0,60 cps

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

UV2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

0,0

5,0

mV

Phe

2-FPhe

4-FPhe

40 3 Ergebnisse & Diskussion

mit den Nebenprodukten bei der Radiofluorierung von Boronsäureester- und Boronsäure-Vorläu-

fern.[132] Darüber hinaus lässt sich dieses Rektionsschema mit der Chan-Lam-Aminierung verglei-

chen, bei der ganz ähnliche Nebenprodukte identifiziert wurden.[76]

Schema 39: Nebenreaktion bei der Radiosynthese von 2-[18F]FPhe

Diagramm 5: HPLC –Chromatogramm von 2-[18F]FPhe; Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm);

6 % EtOH(aq) + 0,1 % TFA (1,0 mL/min); 210 nm; 20 µL Probenschleife

Durch die Protonierung, des Vorläufers (4, 9, 11 oder 14) als Nebenreaktion entsteht ein sehr

schwer zu trennendes Produktgemisch (vgl. Diagramm 4). Bei der Reinigung von 4-[18F]FPhe

konnte das protonierte Nebenprodukt deutlich besser abgetrennt werden als im Fall von

2-[18F]FPhe.

Ein weiterer interessanter Aspekt ist die molare Aktivität des Endproduktes. In den hier beschrie-

benen Versuchen fanden sich relativ geringe molare Aktivitäten von unter 0,3 GBq/µmol. Die

Ursache der geringen molaren Aktivitäten ist durch die geringen Anfangsradioaktivitäten von

200−300 MBq zu erklären, die bei manuellen Synthesen zum Einsatz kamen. Aus diesem Grund

wurde der 2-FPhe-Gehalt der Gesamtreaktion in nmol als Parameter für diese Untersuchung fest-

gelegt. Dieser kann zuverlässig die Isotopenverdünnung 18F/19F beschreiben. Die Trägerkonzent-

ration wurde zu 190−220 nmol 2-FPhe bestimmt für den Iodoniumtetrafluorboratvorläufer 4 (Ta-

belle 6, Zeile 7).

Integration C:\GINA_NT\DM\ERMERT1\SEP2\170427.04

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

Ch2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

0,00

1,00

2,00 cps *10002-[18F]FPhe

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

UV2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

-2,0

0,0

2,0

mV

Phe

2-FPhe

3 Ergebnisse & Diskussion 41

Die Isotopenverdünnung wird vermutlich hauptsächlich durch das Tetrafluorborat verursacht.

Deshalb wurde das Tetrafluorboration von Verbindung 4 durch ein Tosylatanion (14) ausgetauscht,

um einen Vorläufer ohne die Möglichkeit einer isotopischen Verdünnung zu erhalten. Der Träger-

gehalt reduzierte sich dadurch um den Faktor 60 bis auf 1−5 nmol 2-FPhe (Tabelle 6, Zeile 8).

Die Begründung dafür lässt sich in der Bindungsstärke finden. In Tabelle 7 sind Bindungsstärken

für verschiedene Bor-Fluor und Kohlenstoff-Fluor-Bindungen aufgelistet.

Tabelle 7: Bindungsstärken von B-F und C-F

Bindung Bindungsstärke

F3B-F 330 kJ/mol

Cali.-F (Fluormethan) 460 kJ/mol

Caro.-F (Fluorbenzol) 530 kJ/mol

F2B-F 630 kJ/mol

Die Bindungsstärke von Bor-Fluor beträgt im Tetrafluorborat 330 kJ/mol. Eine aliphatische Koh-

lenstoff-Fluor-Bindung liegt bei 460 kJ/mol und eine aromatische bei 530 kJ/mol.[133] Als mögliche

Fluor-Quellen bei der Synthese mit Vorläufer 4 während der Cu-vermittelten Radiofluorierung

kommen Tetrafluorborat des Iodoniumsalzes und das Triflat des Kupferkomplexes

((MeCN)4Cu(I)OTf) in Frage. Bei der Synthese mit dem Vorläufer 14 enthält die Reaktionsmi-

schung nur noch das Triflat des Kupferkomplexes als Fluor-Quelle. Durch die geringere Bindungs-

energie im Tetrafluorborat zwischen Bor und Fluor kann das radioaktive Fluor-18 leichter gegen

ein nicht-radioaktives Fluor-19 ausgetauscht werden und somit den Trägergehalt erhöhen.

In einer anderen Arbeit wurde 4-[18F]FPhe ausgehend von einem ähnlichen Vorläufer hergestellt

und eine molare Aktivität von 86 GBq/µmol bestimmt.[98] Berücksichtigt man die Radioaktivität

des Produktes lässt sich daraus eine Trägerkonzentration von 170 nmol 4-FPhe berechnen, was die

hier erhaltenen Ergebnisse unterstützt. Wie dieses Beispiel anschaulich zeigt, ist es möglich, sehr

hohe Aktivitätsmengen von Radiotracern zu produzieren, so dass sich der Träger-Einfluss durch

das Tetrafluorboration bei einer hohen Startaktivität stark reduziert.

Im Hinblick auf präklinische Anwendungen von 2-[18F]FPhe wurde die Cu-Konzentration im End-

produkt mittels Massenspektrometrie mit induktiv-gekoppeltem Plasma (engl. inductively coupled

plasma mass spectrometry, ICP-MS) bestimmt. Die Kupferkonzentration im HPLC-Lösungsmittel

wurde als Vergleichsprobe mit 2 µg/L Cu bestimmt, die die Ausgangbedingung definierte. Die

gemessenen Produktproben enthielten 2–8 µg/L Kupfer (n = 4). Gemäß der ICH-Richtlinie für

elementare Verunreinigungen (2016) sind 340 µg Kupfer unbedenklich, die täglich parenteral zu-

geführt werden. Da die Produktvolumina unter 5 mL liegen, befindet sich der Kupfergehalt des

gesamten Produktes weit unter der zulässigen täglichen Exposition für einen Menschen.

42 3 Ergebnisse & Diskussion

3.1.5 Entwicklung einer Methode zur Alkohol-unterstützten Cu-vermittelten

Radiofluorierung von 2-[18F]FPhe unter minimalistischen Bedingungen

Schema 40: Radiosynthese von 4-[18F]Fluoranisol ausgehend von 15

Basierend auf der Arbeit von Ichiishi et al.[14] und entsprechenden fortführenden Arbeiten,[65] wurde

in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Krasikova (St. Petersburg, Russland) eine Methode

entwickelt, bei der auf eine Trocknung des [18F]Fluorids durch Destillation vollständig verzichtet

werden konnte.

Dabei wurde [18F]Fluorid auf einer QMA-Kartusche fixiert und dann mit dem Iodoniumsalzvor-

läufer in einer DMF/Methanol-Mischung eluiert. Zuvor wurde der Kupfer-Komplex in DMF ge-

löst und im Reaktionsgefäß vorgelegt. Nach der Elution konnte das Reaktionsgemisch sofort er-

hitzt werden und die Radiofluorierungsreaktion beginnen. Dies bedeutet für die gesamte Synthese

eine deutliche Zeitersparnis.

Die Radiofluorierungen wurden unter Schutzgasatmosphäre (Argon) durchgeführt, ohne weitere

Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, um Feuchtigkeit oder Luft auszuschließen. In der Theorie sollte

das Iodoniumsalz, welches im Vergleich zum [18F]Fluorid in sehr hohem Überschuss vorliegt, sel-

ber als Oxidationsmittel fungieren und so die oxidativen Eigenschaften von Luft-Sauerstoff erset-

zen.

Die Synthese ließ sich in ersten Versuchen einfach mit sehr hohen RCA durchführen. In Diagramm

6 ist die Wiederfindungsrate von [18F]Fluorid bei der Elution durch Mesityl-(4-methoxyphenyl)io-

doniumtetrafluorborat (15) und die entsprechenden radiochemischen Umsätze in Abhängigkeit der

n-ständigen Alkohole und Wasser zusammengefasst.

Die höchste [18F]Fluorid-Wiederfindungsrate von 83 % wurde mit Verbindung 15, gelöst in 19 %

Wasser in DMF (620 µL), erbracht. Allerdings konnte keine Reaktion zu 4-[18F]Fluoranisol beo-

bachtet werden. Wurde hingegen Methanol als Alkohol in DMF genommen, sank zwar die Wie-

derfindungsrate bei der Elution auf 73 %, jedoch stieg die RCA auf 94 %. Mit zunehmender Ket-

tenlänge wurde die Wiederfindungsrate stetig niedriger, bis bei Verwendung von n-Butanol nur

noch 21 % der Startaktivität wiedergefunden werden konnten. Eine ähnlich schlechter Wert für

die Wiederfindungsrate wurde auch mit reinem DMF (620 µL DMF ohne ROH) erhalten. Ver-

mutlich führt DMF in der QMA zu einem Kollaps der Phase, ähnlich dem von hydrophoben Al-

kylphasen, die mit sehr wässrigen Laufmitteln betrieben werden.[111, 134] Dieser Kollaps führt dann

dazu, dass sich das auf der Phase befindliche [18F]Fluorid nur noch sehr schlecht eluieren lässt.

Der Einfluss des Alkohols auf die Reaktionsausbeute war hingegen relativ gering. Die nicht isolier-

ten radiochemischen Ausbeuten lagen zwischen 94−98 %.

3 Ergebnisse & Diskussion 43

HOH MeOH EtOH n-PrOH n-BuOH w/o ROH0

20

40

60

80

100

Elut

ion/

RC

A* [%

]

Lösungsmittel

Elution RCA*

Diagramm 6: Wiederfindungsraten 18F− und RCA von 4-[18F]Fluoranisol; 18 µmol 15 gelöst in 620 µL,

19 % ROH in DMF (RCA*: nicht isolierte radiochemische Ausbeute, bestimmt durch HPLC, Aliquot aus

wässrig gequenchter Reaktionslösung)

500 uL DMF 250 uL DMF0

20

40

60

80

100

Elut

ion/

RC

A* [%

]

Lösungsmittel

Elution RCA*

Diagramm 7: Elution von [18F]F− von einer QMA; 18 µmol 15 gelöst in 500 bzw. 250 µL DMF und

120 µL MeOH (RCA*: nicht isolierte radiochemische Ausbeute, bestimmt durch HPLC, Aliquot aus wässrig

gequenchter Reaktionslösung)

44 3 Ergebnisse & Diskussion

Eine Möglichkeit, den Phasenkollaps zu reduzieren, war, das DMF-Volumen zu verringern (Dia-

gramm 7). Wurde nicht mit 500 µL DMF und 120 µL MeOH eluiert, sondern mit 250 µL DMF

und 120 µL MeOH, so stieg die Wiederfindungsrate von 73 % auf 90 %, ohne die RCA deutlich

zu verändern.

Diese Radiofluorierungsmethode wurde für Herstellung von 2- und 4-[18F]FPhe mit den Vorläu-

fern 4 und 9 (Kapitel 3.1) eingesetzt. Die Elution zeigte mit 81−96 % sehr hohe Wiederfindungs-

raten. (Tabelle 8) Bei der Elution mit Verbindung 15 (Schema 40, Seite 42), wurden unter gleichen

Bedingungen nur 73 % ± 3 % erreicht. Eine Erklärung für diese Diskrepanz konnte nicht gefunden

werden.

2-[18F]FPhe konnte mit den oben beschriebenen Bedingungen in einer RCA von 22 % bis 30 %

RCA hergestellt werden. 4-[18F]FPhe wurde in radiochemischen Ausbeuten von 67 % bis 69 %

erhalten (Tabelle 8, Zeile 2). Die Ausbeuten von 4-[18F]FPhe waren hierbei bemerkenswert hoch.

In einer automatisierten Synthese auf einem Modul konnte 4-[18F]FPhe in 56 % RCA innerhalb

von 60 min hergestellt werden.[98]

Die Synthese von ortho-substituierten aromatischen Systemen, im Vergleich zu para-substituierten

aromatischen Systemen, gestaltet sich grundsätzlich schwieriger. Dies ist zum einen durch die ste-

risch anspruchsvollen Reaktionen, bedingt durch die Abschirmung der ortho-Position zu erklären.

Zum anderen können Nebenreaktionen auftreten, wie die im vorrangegangenen Kapitel beschrie-

bene Racemisierung. Die hier beschriebene Synthese von 2-[18F]FPhe lieferte vergleichbare RCAs,

wie über die minimalistischen Methode (Tabelle 6, Zeile 1, Seite 37). Durch die direkte Elution des

[18F]Fluorids ohne das Entfernen eines protischen Lösungsmittels konnte die Racemisierung von

2-[18F]FPhe auf 1–2 % gedrückt werden (Tabelle 8, Zeile 1). Diese Erkenntnisse decken sich mit

den Interpretationsversuchen aus dem vorangegangen Kapitel.

Schema 41 & Tabelle 8: Synthese von 2- und 4-[18F]Phe über Arylmesityliodoniumsalze (RCA*: nicht isolierte

radiochemische Ausbeute, bestimmt durch DC, Aliquot aus wässrig gequenchter Reaktionslösung)

Zeile Tracer/Methode Elution RCA* RCA ee (L:D)

1 4 → 2-[18F]FPhe

(n = 2)

Minimalistisch

96 %, 87 % 28 %, 59 %

(DC)

22 %, 30 %

ca. 110 min

96 %, 98 %

(2:98, 1:99)

2 9 → 4-[18F]FPhe

(n = 2)

Minimalistisch

86 %, 81 % 80 %, -

(DC)

69 %, 67 %

ca. 110 min

> 99 %

3 Ergebnisse & Diskussion 45

3.2 Kupfer-vermittelte Synthese über Boronsäurepinakolester als

Markierungsvorläufer

3.2.1 Radiosynthese von n.c.a. 6-[18F]Fluor-3,4-dihydroxyphenylalanin

Tredwell et al.[66] veröffentlichten 2014 eine neue Methode, die es ermöglicht, Aromaten mit 18F−

über eine Kupfer-Vermittlung zu markieren. Dabei gelang es dieser Arbeitsgruppe, eine Reihe von

[18F]Fluorarenen als Modellverbindungen zu synthetisieren. Unter anderem konnte ein geschütztes

6-[18F]FDOPA-Derivat erhalten werden. Die Synthese mit Entschützung lieferte 12 % RCA, was

u.U. auf die Hydrolyse des eingesetzten Methylesters gelegen haben könnte. Moleküle jedoch, die

ungeschützte Alkohol- und Aminofunktionen besitzen, konnten mit dieser Methode nicht in ho-

hen Ausbeuten 18F-markiert werden. Dies wurde mit einer möglichen C-O- bzw. C-N-Konkurrenz-

Kupplung begründet (Chan[72]-Evans[73]-Lam[74]-Kopplung).

Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit wurde ein modifizierter 18F-

Markierungsvorläufer für 6-[18F]FDOPA basierend auf der oben be-

schriebenen Arbeit entwickelt,[66] bei dem der Methylester durch einen

leichter hydrolysierbaren tert-Butylester ersetzt wurde. Dies hatte sich

in der Vergangenheit bereits bei der Synthese von [18F]FET bewährt.[27]

Vorläufersynthese

Als Ausgangssubstanz für die Vorläufersynthese diente 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA),

das mit tert-Butylacetat und Perchlorsäure zum tert-Butylester umgesetzt wurde, gefolgt von einer

dreifachen Boc-Schützung (tert-Butyloxycarbonyl). Das Produkt, tert-Butyl-(S)-3-(3,4-bis((tert-

butoxycarbonyl)oxy)phenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl)-amin)-propionat (16, Schema 43), wurde mit

einer Gesamtausbeute von 50 % erhalten. Das in Position-6 iodierte Produkt, (tert-Butyl-(S)-3-(4,5-

bis((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-iodphenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propionat 17), wurde

durch Umsatz mit [Bis(trifluoracetoxy)iod]benzol (BTI) und Iod in einer Ausbeute von 53 % er-

halten. Das Boronsäurepinakolester-Derivat tert-Butyl-(S)-3-(4,5-bis((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-

(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propionat (18)

wurde schließlich über eine Miyaura-Borylierung[66, 135] in 40 % Ausbeute gebildet. Die Isolierung

des Produktes nach der Miyaura-Borylierung musste erarbeitet werden, da sich die Abtrennung als

schwierig herausstellte. Neben dem Boronsäurepinakolester (18) zeigte das iodierte Molekül (17)

und das protonierte Molekül (16) ein sehr ähnliches Laufverhalten bei der Dünnschichtchromato-

grafie (DC) auf Silika. Eine Trennung war auch durch die Verwendung verschiedenster Laufmitteln

nicht oder nur teilweise möglich. Erst die Trennung mittels RP-DC (engl. Umkehrphasen DC)

brachte ein zufriedenstellendes Ergebnis. Der letzte Schritt, eine zweite Boc-Schützung am Amin,

erfolgte durch die Katalyse mit 4-(Dimethylamino)pyridin (4-DMAP) mit 30 % Ausbeute zu tert-

Butyl-(S)-3-(4,5-bis((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phe-

nyl)-2-(bis(tert-butoxycarbonyl)amino)propionat (19). Eine doppelte Boc-Schützung vor der Bory-

lierung ist eine weitere mögliche Syntheseroute, die getestet wurde, jedoch konnte eine Trennung

Schema 42: Angestrebter

Vorläufer für

6-[18F]FDOPA

46 3 Ergebnisse & Diskussion

der dabei entstehenden Produkte nicht realisiert werden. Der finale 6-[18F]FDOPA-Vorläufer 19

wurde in 3 % Ausbeute über fünf Stufen erhalten.

Schema 43: a) AcOtBu, HClO4. b) Boc2O (Di-tert-butyldicarbonat) , 50 %. c) [Bis(trifluoracetoxy)iod]benzol

(BTI), I2 in DCM, 53 %. d) B2pin2 (Bis(pinakolato)diboran), Pd(dppf)Cl2 ([1,1′-Bis(diphenylphosphino)fer-

rocen]dichlorpalladium(II)), KOAc in DMF, 40 %. e) 4-(Dimethylamino)-pyridin

(4-DMAP), Boc2O in MeCN, 30 %.

Radiosynthese von 6-[18F]FDOPA

Zur Radiomarkierung wurde [18F]Fluorid auf einer QMA-Kartusche fixiert und mit 1 mg Tetra-

ethylammoniumhydrogencarbonat in Methanol eluiert und das Methanol abgedampft. Der Vor-

läufer 19 wurde, wie in der Literatur[66] beschrieben, mit [18F]Fluorid zur Reaktion gebracht (10 mg

Vorläufer 19; 2,6 mg (py)4Cu(II)(OTf)2; in 30 µL MeCN und 300 µL DMF; 20 min; 110 °C). Dabei

wurde die Kinetik der Reaktion untersucht (Diagramm 8).

Die Bestimmung der nicht isolierten, radiochemischen Ausbeute (RCA*) wurde mittels Radio-DC

durchgeführt, nachdem jede Reaktion vor der Messung mit Wasser gequencht wurde. Durch das

Quenchen mit Wasser wurde das an den Wänden des Reaktors adsorbierte [18F]Fluorid wieder in

Lösung gebracht. Eine DC-Analytik ohne Quenchen mit Wasser lieferte Messwerte mit einer sehr

großen Streuung (Standardabweichung > 20 %).

Je nach Beschaffenheit des Glasreaktors werden unterschiedliche Mengen an [18F]Fluorid an den

Gefäßwänden adsorbiert. Dies hat natürlich Auswirkungen auf die Aktivitätsbilanzierung und da-

mit auf die nicht-isolierten, radiochemischen Ausbeuten. Der Bereich der adsorbierten [18F]Fluo-

ridmenge an den Reaktorwänden variiert in der Literatur von 10 %[65] bis 95 %[60].

3 Ergebnisse & Diskussion 47

Diagramm 8: RCA* der 18F-Fluorierungsreaktion (n = 3, SA < 5 %) in Abhängigkeit von Temperatur und

Zeit (10 mg 19; 3,6 mg (py)4Cu(II)(OTf)2; in 30 μL MeCN und 300 μL DMF, RCA*: nicht isolierte radio-chemische Ausbeute, bestimmt durch DC, Aliquot aus wässrig gequenchter Reaktionslösung)

Die radiochemische Ausbeute wird definiert als: „Das Verhältnis der Aktivität eines spezifizierten Radionuklids, eines spezifizierten Elements nach seiner radiochemischen Abtrennung und seiner Aktivität, die ursprünglich in der Substanz vorlag, die sich der radiochemischen Trennung unter-zieht." (engl. „The ratio of the activity of a specified radionuclide of a specified element after its radiochemical separation and its activity originally present in the substance undergoing the radiochemical separation.“).[9] Die nicht isolierte, radiochemische Ausbeute (RCA*) beschreibt das Verhältnis von gelöster, radiofluorierter Zielverbindung im Verhältnis zu nicht reagiertem [18F]F– und weiteren radiofluorierten Nebenpro-dukten.

Die T- und t-Abhängigkeit in Diagramm 8 zeigt, dass die optimale Temperatur für die Reaktion bei 110 °C liegt. Eine Reaktionstemperatur von 100 °C liefert schlechtere Umsätze, wohingegen bei 120 °C eine deutliche Abnahme des RCA* mit der Zeit gefunden wurde. Wie aus Diagramm 8 ersichtlich, werden maximale RCA* schon nach einer Reaktionszeit von 15–20 min beobachtet.

Auf der Radio-DC ließ sich, neben einem Peak auf der Basislinie, bei längeren Reaktionszeiten mehr als ein radioaktiver Peak erkennen (Schema 44). Dies deutet darauf hin, dass es zu einer Boc-Entschützung des Vorläufers während der Markierungsreaktion gekommen ist.

Für das radiofluorierte Zwischenprodukt wurde keine Referenzverbindung synthetisiert, sondern der Nachweis erfolgte indirekt über die Isolierung von 6-[18F]FDOPA nach der Hydrolyse.

48 3 Ergebnisse & Diskussion

Schema 44: Radio-DC des gequenchten Reaktionsgemisches nach der Radiomarkierung der Verbindung 19

(Silika DC, 20 % EtOAc in n-Hexan)

Hydrolyse und Produktisolierung von 6-[18F]FDOPA

Zunächst wurde die Reaktion nach der 18F-Markierung mit konzentrierter Salzsäure versetzt und

für 10 min bei 80 °C hydrolysiert. Potentiell kann bei dieser Vorgehensweise gasförmiges H[18F]F

austreten. Dies konnte dadurch verhindert werden, dass während der Entschützung ein Gasstrom

durch das Reaktionsgefäß geleitet wurde. Das ausgetriebene H[18F]F wurde durch zwei angeschlos-

sene, mit KOH(aq) gefüllten Gaswaschflaschen zurückgehalten.

Die Entschützung, auch in der Anwesenheit von N,N-Dimethylformamid (DMF), verlief quanti-

tativ. Es konnten nach der Hydrolyse bis auf 6-[18F]FDOPA keine radioaktiven Nebenprodukte

festgestellt werden.

Schema 45: Radiosynthese von 6-[18F]FDOPA

Dennoch wurde eine Kartuschenaufreinigung entwickelt, um DMF und [18F]HF abzutrennen. Die

Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Diethylether (Et2O) versetzt. Das radio-

markierte Produkt wurde in Et2O gelöst über eine Silika Kartusche geleitet, die [18F]F– und DMF

retardierte. Das Eluat wurde im Unterdruck aufkonzentriert und wie beschrieben hydrolysiert.

Bei der HPLC-Trennung wurde eine Polymer-HPLC-Säule (Hamilton PRP-C18 (10x250 mm)) mit

einer Lösung von 0,05 M HCl(aq) als Laufmittel eingesetzt. Die Isolierung von 6-[18F]FDOPA funk-

tionierte nahezu quantitativ, nur der niedrige pH-Wert des HPLC-Laufmittels machte die direkte

Verwendung als Injektionslösung nicht möglich. Aus diesem Grund wurde dem Peakschnitt der

semi-präparativen HPLC eine wässrige Natriumacetatlösung beigemengt, um ein Puffersystem mit

F Z - J ü l i c hD a t e i : 1 5 1 0 2 2 .1 8 M e t h o d e : F L O U R D a tu m : 2 2 . 1 0 .2 0 1 5 Z e i t : 1 4 : 3 1 : 0 6 Z ä h l z e i t : 6 0 0 s G l ä t t u n g s k o n s t a n t e : 0 . 0 m m H V : 1 5 6 0 V L L : 5 k e V U L : 2 5 0 k e VA u f t r a g s p u n k t : 0 . 0 m m L ö s u n g s m i t t e l f ro n t : 8 0 . 0 m m

m m0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0 3 0 . 0 4 0 . 0 5 0 . 0 6 0 . 0 7 0 . 0 8 0 . 0 9 0 . 0 1 0 0 . 0

Cnt

s

0 . 0

1 0 0 0 .0

2 0 0 0 .0

3 0 0 0 .0

3 Ergebnisse & Diskussion 49

passendem pH-Wert (4,00–5,50) gemäß den Anforderungen der European Pharmacopoeia zu er-reichen (Diagramm 9).

Diagramm 9: pH-Wert-Titration einer Natriumacetat-Lösung (49,2 mg (0,60 mmol) NaOAc in 500 μL Wasser) mit HPLC-Laufmittel (0,05 M HCl(aq)) im pH-Bereich von 4,00–5,50 (grün), der Vorgabe der European

Pharmacopoeia

Die funktionelle Gruppe des 1,2-Dihydroxybenzols wird durch basische Bedingungen zum 1,2-Benzochinon irreversible oxidiert. Deshalb ist es wichtig, das 1,2-Dihydroxybenzolderivat über die ganze Reaktion hinweg in einem leicht sauren Milieu (pH < 5,5) zu halten.

Schema 46: Oxidation zum 6-[18F]FDopachinon

Um dies zu erreichen, durfte die Natriumacetatlösung nicht im Produktgefäß vorgelegt werden. Die höheren pH-Werte in den ersten 1,5 mL des Peakschnitts würden zur Oxidation des 6-[18F]FDOPA in den ersten Mililitern des Peakschnitts führen (vgl. Diagramm 9, Schema 46).

6-[18F]FDOPA konnte nach einer Reinigung mittels semi-präparativer HPLC mit 8 % ± 2 % ra-diochemischer Ausbeute isoliert werden. Die radiochemische Reinheit lag bei über 99 % ebenso wie der Enantiomerenüberschuss (ee). Durch die recht geringen radiochemischen Ausbeuten ist eine Automatisierung basierend auf dieser Methode jedoch nicht weiter verfolgt worden.

50 3 Ergebnisse & Diskussion

Radiosynthesen von 6-[18F]FDOPA im Literaturvergleich

In Schema 47 sind drei nukleophile Synthesen zur Herstellung von 6-[18F]FDOPA aufgeführt. Zu-

nächst eine fünfstufige Aufbausynthese, darunter eine dreistufige Synthese und zuletzt die in die-

sem Kapitel beschriebene zweistufige Synthese. Die fünfstufige Aufbausynthese konnte aufgrund

ihrer Komplexität nicht auf ein kommerziell erhältliches Standardsynthesemodul übertragen wer-

den. Die drastischen Bedingungen bei der Hydrolyse (konzentrierte Iodwasserstoffsäure erhitzt

weit über ihren Siedepunkt1) führen zu einer Zerstörung von Teilen des Moduls. Die dreistufige

Synthese konnte hingegen leichter auf ein Standardmodul übertragen werden.[46]

Schema 47: Zwei etablierte 6-[18F]FDOPA Synthesen[46] im Vergleich zu der in dieser Arbeit entwickelten Syn-

these

Die Vorteile der in dieser Arbeit vorgestellten Synthese sind: zweistufige Syntheseprozedur, quan-

titative Hydrolyse unter sehr milden Bedingungen, kurze Synthesezeit. Dieser Prozess erlaubt die

Übertragung der Synthese in nahezu sämtliche, kommerziell erhältliche Standardsynthesemodule

für nukleophile Radiosynthesen und erlaubt prinzipiell auch die Übertragung auf ein 18F-Kassettenmodul, wie das FastLAB von GE.

1 Siedepunkt von 57 % Iodwasserstoffsäure(aq) beträgt 127 °C, Angabe des Herstellers Sigma Aldrich

3 Ergebnisse & Diskussion 51

Alkohol-verstärkte und Cu-vermittelte Synthese von 6-[18F]FDOPA

Die Boronsäurepinakolester zeigten jedoch in einer neuen, Alkohol-unterstützen und Kupfer-ver-

mittelten Radiofluorierung ihr eigentliches Potential.[111] Die entsprechenden Radiosynthesen wur-

den an der Uniklinik Köln durchgeführt. Die Verwendung von N,N-Dimethylacetamid (DMA)

und einem Zusatz von n-Butanol (n-BuOH) konnten die radiochemische Ausbeuten von

6-[18F]FDOPA auf 40 % ± 4 % RCA mit einer molaren Aktivität von 37 GBq/µmol (Produktak-

tivität: 278 MBq) deutlich erhöht werden.[111] Mit diesen Ausbeuten kann die Synthese ohne weite-

res mit den zwei etablierten Synthesen in Schema 47 konkurrieren.

Neben der Radiomarkierung von Verbindung 19 wurde auch Verbindung 18 getestet. Die doppelte

N,N-Boc-Schützung scheint für die ortho-substituierten aromatischen Aminosäuren von entschei-

dender Bedeutung zu sein. Es wurde berichtet, dass der einfach N-Boc-geschützte

6-[18F]FDOPA Vorläufer nur 5 % Ausbeute lieferte, wohingegen der doppelt N,N-Boc-geschütze

Vorläufer 83 % Ausbeute zeigte.[66] Der einfach N-Boc-geschütze Vorläufer 18 ließ sich mit 30 %

± 5 % RCA* markieren, wohingegen Vorläufer 19, 68 % ± 3 % RCA* zeigte.[111]

Der ausbeutensteigernde Effekt von n-BuOH deckt sich mit vergleichbaren Ergebnissen. Kim et

al.[136, 137] führten den Begriff „flexibles Fluorid“ (engl. „flexible fluorid“) ein.

Sie machten die Entdeckung, dass tert-Butanol mit Fluorid einen stabilen

Komplex bildet. Sie konnten sogar eine Kristallstrukturanalyse von

(t-BuOH)4F(n-Bu)4N durchführen. Sie kamen zu der Erkenntnis, dass die

Komplexierung von Fluorid die Reaktivität ebenso wie die Selektivität deut-

lich verbesserte. Darüber hinaus stellten sie fest, dass

(t-BuOH)4F(n-Bu) 4N deutlich weniger hygroskopisch ist als F(n-Bu)4N.[137]

Durch die mögliche Komplexierung des Fluorids von n-BuOH bei der Al-

kohol-verstärkten Methode, wird vermutlich ein starkes Nukleophil und

ebenso aber eine moderate Base erhalten, was für die Radiofluorierung be-

sonders vorteilhaft wäre.

Schema 48: Struktur

von (t-BuOH)4F

(n-Bu)4N

52 3 Ergebnisse & Diskussion

3.2.2 Kupfer-vermittelte und Alkohol-verstärkte Synthese weiterer 18F-markierter

Verbindungen über Boronsäurepinakolester als Markierungsvorläufer

Da die kürzlich veröffentlichte Alkohol-unter-

stützte, Kupfer-vermittelte Radiofluorierungsme-

thode[111] hohe radiochemische Ausbeuten bei gerin-

gem experimentellen Aufwand lieferte, wurde diese

Methode für die Produktion weitere [18F]Fluorphe-

nylaminosäuren untersucht.

Im Mittelpunkt des Interesses stand hierbei wiede-

rum 2-[18F]FPhe, da bei der Herstellung von ortho-

[18F]Fluorphenylaminosäuren, wie bereits in den

vorherigen Kapitels erläutert, immer besondere

Schwierigkeiten zu erwarten sind. Außerdem wurden noch 6-[18F]FMT, 5-[18F]FMT und

2-[18F]FPEA mit Hilfe der Alkohol-unterstützten Radiofluorierungsmethode an Boronsäurepina-

kolestern untersucht. Nun sollte die 18F-Markierung dieser Verbindungsklasse mit der Alkohol-

verstärkten, Kupfer-vermittelten Methodik getestet werden. 6-[18F]FMT soll, wie in der Einleitung

beschrieben, den dopaminergen Stoffwechseln im Menschen aufklären. Die Verbindungen 2-

[18]FPEA und 5-[18F]FMT (Schema 49) sind in der Literatur noch nicht beschrieben worden und

wurden noch nie in vivo als PET-Tracer getestet.

Vorläufer und Referenz Synthese

Der Vorläufer tert-Butyl-(S)-2-(bis(tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-diox-

aboran-2-yl)phenyl)propionat (21) wurde aus dem Boc- und tert-Butyl-geschützten

L-2-Iodphenylalanin (2) synthetisiert.[111] Eine Miyaura-Borylierung[66, 135] wurde verwendet, um Ver-

bindung tert-Butyl-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)-

phenyl)propanoat (20) zu erhalten. Die doppelt N,N-Boc-geschützte Verbindung 21 wurde durch

die Katalyse mit 4-DMAP erhalten. Eine Änderung der Reihenfolge der beiden Reaktionsschritte

(zu 20 und 21) wirft wieder dasselbe Problem auf, wie für Verbindung 19 in Kapitel 3.2.1 beschrie-

ben. Die Reaktionsprodukte lassen sich nicht voneinander trennen. Die Gesamtausbeute für Vor-

stufe 21 ausgehend von L-Phenylalanin-tert-butylester Hydrochlorid beträgt über vier Stufen 10 %.

Der Vorläufer Di-tert-butyl(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenylethyl)imiddicar-bo-

nat (25) für 2-[18F]FPEA konnte ausgehend von 2-Bromphenylethylamin in drei Stufen, in analoger

Herangehensweise wie für Verbindung 21 beschrieben, in einer Gesamtausbeute von 50 % herge-

stellt werden. Zunächst wurde das 2-Bromphenylethylamin im Ultraschallbad quantitativ zu tert-

Butyl-(2-bromphenylethyl)carbamat (23) umgesetzt.[123] Dann folgte die Borylierung[66, 135] zu tert-

Butyl-(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenylethyl)carbamat (24), gefolgt von der

Einführung einer zweiten N-Boc-Gruppe zu Di-tert-butyl(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-

2-yl)phenylethyl)imiddicarbonat (25).

Schema 49: 2-[18F]FPhe (o.l.), 2-[18F]FPEA

(o.r.), 6-[18F]FMT (u.l.) und 5-[18F]FMT (u.r.)

3 Ergebnisse & Diskussion 53

Die ersten zwei Stufen der FMT-Vorläufersynthese, die zu tert-Butyl-(S)-2-((tert-butoxycar-

bonyl)amino)-3-(3-((tert-butoxy-carbonyl)oxy)phenyl)propionat (26) führen, wurden bereits in der

Literatur beschrieben.[77] Die darauf folgenden Syntheseschritte wurden analog wie für Verbindung

21 durchgeführt. Dabei führte die Iodierung zu tert-Butyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(5-

((tert-butoxy-carbonyl)oxy)-2-iodphenyl)propionat (27) zu 81 % Ausbeute, die Borylierung zu tert-

Butyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(5-((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-(4,4,5,5-tetramethyl-

1,3,2-dioxa-boran-2-yl)phenyl)propionat (28) zu 40 % Ausbeute und als letzte Stufe die zweite N-

Boc-Schützung zu tert-Butyl-(S)-2-(bis(tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(5-((tert-butoxycarbonyl)-

oxy)-2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenyl)propionate (29) zu 69 % Ausbeute.

Schlussendlich konnte der 6-[18F]FMT-Vorläufer 29 in 17 % über 5 Stufen hergestellt werden. Das

Tetrakispyridinkupfer(II)triflat (21) wurde ausgehend von Kupfer(II)triflat, nach Literaturvor-

schrift hergestellt.[138]

Schema 50: a) B2pin2, Pd(dppf)Cl2, KOAc in DMF, 47 %. b) Boc2O, Et3N, 4-DMAP in MeCN, 48 %. c)

Boc2O, > 99 %. d) B2pin2, Pd(dppf)Cl2, KOAc in DMF, 65 %. e) Boc2O, Et3N, 4-DMAP in DMF,

78 %. f) AcOtBu, HClO4. f) Boc2O, 58 %. h) BTI, I2 in DCM, 81 %. i) B2pin2, Pd(dppf)Cl2, KOAc in

DMF, 40 %. j) 4-DMAP, Boc2O in MeCN, 65 %.

54 3 Ergebnisse & Diskussion

Alkohol-unterstütze Radiofluorierung zur Darstellung von 2-[18F]FPhe,

2-[18F]FPEA, 5-[18F]FMT und 6-[18F]FMT

Die 18F-Markierung erfolgte in N,N-Dimethylacetamid und n-Butanol (2:1) zusammen mit

(py)4Cu(II)(OTf)2.[111] Das [18F]Fluorid wurde in Analogie zu der in Kapitel 3.1 beschriebenen „low-

base“-Methode, auf einer QMA-Kartusche fixiert und mit Tetraethylammoniumhydrogencarbonat

(Et4NHCO3) in Methanol eluiert. Um die Effizienz der Reaktion zu erhöhen, wurden zwei Ände-

rungen an der Methode vorgenommen. Die verwendete Vorläufermenge wurde von 60 µmol auf

10 µmol reduziert und zur Elution wurden 4 µmol Et4NHCO3 statt 14 µmol, wie ursprünglich in

der Veröffentlichung angegeben, verwendet. Darüber hinaus wurde der Cu-Komplexanteil auf

zwei Äquivalente gegenüber dem Vorläuferanteil erhöht. Die weitere Aufarbeitung in der

2-[18F]FPhe-Synthese erfolgte wie bereits in Kapitel 3.1 beschrieben.

2-[18F]FPhe konnte in einer RCA von 57 % ± 6 % innerhalb von 110 min hergestellt werden. Dar-

über hinaus konnte keine Racemisierung beobachtet werden; auch der Trägergehalt war sehr gering

(Tabelle 9).

Schema 51 & Tabelle 9: Synthese von 2-[18F]FPhe über Arylmesityliodoniumsalze (Kapitel 3.1) und Boronsäu-

repinakolestervorläufer

Vorläufer Cu-Komplex RCA ee 2-FPhe

(MeCN)4Cu(I)OTf

in DMF

48 % ± 8 %

110 min

(n = 3)

> 99 % 220, 190 nmol

(n = 2)

(py)4Cu(II)(OTf)2

in DMA/n-BuOH

57 % ± 6 %

110 min

(n = 3)

> 99 % 1, 9, 13 nmol

(n = 3)

Die Trägermenge an 2-FPhe konnte mit 1-13 nmol (bezogen auf die vollständige Produktisolation)

bestimmt werden. Die Produktaktivität betrug bei einer manuellen Synthese auf der Hand

ca. 50 MBq, was einer theoretischen Stoffmenge von 790 fmol entspräche. Somit bestand die Tra-

cerlösung aus lediglich 0,006 % radioaktivem 2-[18F]FPhe und 99,994 % nicht radioaktivem

3 Ergebnisse & Diskussion 55

2-[19F]FPhe (für den Fall von 13 nmol 2-FPhe). Dieser Trägergehalt basiert auf Fluorverunreini-

gungen, die mit dem Fluor-18 in Kontakt kommen. Aus diesem Grund wird von Synthesen ohne

Trägerzusatz (engl. no-carrier-added) und nicht von trägerfreien Synthesen gesprochen.

Wenn man nun die Methoden der Radiomarkierung über Diaryliodoniumsalzen und Boronsäure-

pinakolestern für 2-[18F]FPhe vergleicht (Tabelle 9), sind die Unterschiede in der radiochemischen

Ausbeute mit lediglich 9 % relativ gering. Beide Syntheserouten ermöglichen die Produktion von

2-[18F]FPhe innerhalb von 110 min mit einer RCA von ca. 50 %.

Die Radiosynthese mit Boronsäurepinakolestern wird, im Gegensatz zu den Radiosynthesen mit

Iodoniumsalzen mit Tetrafluorborat-Gegenion, ein sehr geringer Trägergehalt beobachtet (vgl. Ta-

belle 9). Ein Faktor von 40 (220−190 nmol im Vergleich zu 1-13 nmol 2-FPhe, Tabelle 9) konnte

ermittelt werden, was mit den Ergebnissen aus Kapitel 3.1 vergleichbar ist.

Die Radiosynthese für 6-[18F]FMT wurde analog zu 2-[18F]FPhe durchgeführt. Es wurden lediglich

ein anderer Vorläufer und ein anders HPLC-Laufmittel verwendet. 6-[18F]FMT konnte ebenfalls in

110 min in einer RCA von 48 % ± 5 % hergestellt werden.

Die Methode der Kupfer-vermittelten Radiosynthese liefert deutlich höhere Ausbeuten, wenn der

Reaktion ein Alkohol zugesetzt wird. In der Literatur wurden ohne Alkoholzugabe nur Ausbeuten

von 26% für 6-[18F]FMT in DMF erhalten. In DMA ohne Alkohol wurden 17 % bis 25 % RCA

gefunden (in der Veröffentlichung sind die radiochemischen Ausbeuten ohne Zerfallskorrektur

angegeben).[139]

2-[18F]FPEA wurde analog zu 2-[18F]FPhe umgesetzt, lediglich die Reinigung wurde über eine SPE

durchgeführt. 2-FPEA konnte mit 49 % ± 7 % RCA in knapp 100 min hergestellt werden.

Der Vorläufer für die Synthese von 5-[18F]FMT wurde freundli-

cherweise durch einen Kooperationspartner (PD Dr. Zlatopolskiy,

Institut für Radiochemie und Exp. Molekulare Bildgebung, Unikli-

nik Köln) hergestellt und im Zuge dieser Arbeit radiomarkiert, hyd-

rolysiert und isoliert.

Um eine spätere Übertragung auf ein automatisiertes Synthesemo-

dul zu ermöglichen, wurde eine zweistufige Hydrolyse der Schutzgruppen erwogen. Es gibt Vor-

schriften, in denen der Methylester unter sehr harschen Bedingungen gespalten werden kann (12 M

HCl(aq), 140 °C, 10 min)[98]. Jedoch kann ein Methylester unter milderen Bedingungen basisch quan-

titativ verseift werden. Der Methylester wurde deshalb in 1 M NaOH in einer wässrigen Methanol-

Lösung in 5 min verseift und dann in vacuo aufkonzentriert. Danach erfolgten die saure Hydrolyse

der Boc-Schutzgruppen und die Reinigung analog zum 2-[18F]FPhe. 5-[18F]FMT konnte auf diese

Weise in einer RCA 66 % ± 1 % innerhalb von 120 min hergestellt werden. Die geringere Enanti-

omerenreinheit des 5-[18F]FMT von 94 % beruht auf der Vorläufersynthese.

Der direkte Vergleich der Tracer zeigt deutlich den Einfluss der Radiofluorierungsposition auf die

radiochemische Ausbeute hat. 5-[18F]FMT weist im Gegensatz zu den drei anderen Tracern eine

meta- und keine ortho-Substitution auf, bezogen auf die radioaktive Markierung und die Aminosäure.

Schema 52: Vorläufer für

5-[18F]FMT

56 3 Ergebnisse & Diskussion

5-[18F]FMT konnte vermutlich deshalb mit den höchsten Ausbeuten hergestellt werden, und das

obwohl der Vorläufer keine doppelte Aminschützung aufwies.

Tabelle 10: Ergebnisse der automatisierten Radiosynthesen mittels Alkohol-verstärkten, Cu-vermittelter

Radiofluorierung

Automatisierung der Alkohol-verstärkten, Cu-vermittelte Radiofluorierung

Die Automatisierung (auto.) der Alkohol-unterstützten Kupfer-vermittelten Radiofluorierung der

vier Tracer (Schema 49) basierte auf den Methoden, die in der manuellen (manu.) Synthese erar-

beitet wurden. Für die Etablierung der Synthesemethode wurde ein am INM-5 des Forschungs-

zentrums Jülich konstruiertes Modul eingesetzt. In der folgenden Abbildung ist der schematische

Aufbau der Syntheseapparatur für die Synthesen von 2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT dargestellt

(Schema 53).

Vorläufer

→Tracer RCA (manu.) RCA (auto.)

Mol. Akt. / Träger

(auto.) ee

→ 2-[18F]FPhe

57 % ± 6 %

110 min

(n = 3)

31 % ± 6 %

110 min

(n = 3)

185 GBq/µmol

→ 13 nmol

(P.: 2,4 GBq)

> 99 %

→ 2-[18F]FPEA

49 % ± 7 %

100 min

(n = 4)

45 % ± 11 %

100 min

(n = 4)

597 GBq/µmol

→ 31 nmol

(P.: 18,8 GBq)

-

→ 6-[18F]FMT

48 % ± 5 %

110 min

(n = 3)

41 % ± 8 %

110 min

(n = 4)

251 GBq/µmol

→ 21 nmol

(P.: 5,3 GBq)

> 99 %

→ 5-[18F]FMT

66 % ± 1 %

120 min

(n = 3)

50 % ± 2 %

120 min

(n = 3)

121 GBq/µmol

→ 33 nmol

(P.: 4,0 GBq)

94 %

3 Ergebnisse & Diskussion 57

Schema 53: Schematischer Aufbau der Syntheseapparatur für 2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT

Durch die spezielle Verschlauchung von den Ventilen 2, 3 und 4 (Schema 53) ist es möglich, die

QMA-Kartusche mit dem [18F]Fluorid aus dem Target vom Zyklotron über den männlichen An-

schluss zu beladen. Danach wird von derselben Seite die Kartusche mit Methanol gespült, um

verbliebenes Wasser wegzuwaschen und die Kartusche dann mit dem Eluat von der weiblichen

Anschlussseite, also in entgegengesetzter Richtung zum Aufbringen der [18F]Fluoridlösung, zu elu-

ieren. Dieses Vorgehen steigert die Wiederfindungsrate von [18F]Fluorid bei der Elution mit gerin-

gen Basenmengen um ca. 10–15 %. Die Vorläufermenge wurde von 10 μmol (manu.) auf 15 μmol

(auto.) und im Fall des Cu-Komplexes von 20 μmol (manu.) auf 30 μmol (auto.) erhöht. Da die

Radiosynthese mit 10 μmol Vorläufer keine reproduzierbaren Ausbeuten lieferte, mussten diese

Reaktionsparameter angepasst werden. Durch die Erhöhung der Vorläufermenge wurden valide

und reproduzierbare Ergebnisse erhalten. Das Modul wurde auch mit einem Gasanschluss für syn-

thetische Luft ausgestattet.

Alle Reaktionsschritte wie Radiofluorierung, Fest-Phasen-Extraktion, Entschützung und HPLC-

Isolierung konnten ohne Probleme auf das Modul übertragen werden. Die Synthesen für

2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT wurden vollständig automatisiert. Die Unterschiede bei den Synthe-

senabläufen von 2-[18F]FPEA und 5-[18F]FMT wurden durch manuellen Eingriff in das automati-

sche Protokoll von 2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT realisiert. Die Ausbeuten für die manuellen

(manu.) und automatisierten (auto.) Synthesen sind in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet

(Tabelle 10).

Von allen Tracern wurde die molare Aktivität bestimmt, die in allen Fällen bei über 37 GBq/µmol

(1 Ci/µmol) lag. Im Vergleich zu den manuellen Synthesen (1–13 nmol) waren die Trägermengen

bei den automatisierten Synthesen (13–33 nmol) etwas höher.

58 3 Ergebnisse & Diskussion

Im Hinblick auf präklinische Anwendungen von den hergestellten Tracern wurde die Cu-Konzent-

ration im Endprodukt mittels ICP-MS bestimmt. Die Kupferkonzentration im HPLC-Lösungs-

mittel wurde als Vergleichsprobe mit 1−3 µg/L Cu gemessen. Die gemessenen Produktproben

enthielten 1−11 µg/L Kupfer (n = 8). Gemäß der ICH-Richtlinie sind diese Werte völlig unbe-

denklich (für metallische Verunreinigungen (2016) sind 340 µg Kupfer täglich an zulässiger paren-

teraler Exposition zugelassen). Da die Produktprobenvolumina unter 5 mL liegen, befindet sich

der Kupfergehalt weit unter der zulässigen täglichen Exposition. Im Falle der Applikation der voll-

ständigen Injektionslösung läge die Kupfermenge im schlechtesten Fall bei 0,055 µg Kupfer.

2-[18F]FPhe 2-[18F]FPEA 6-[18F]FMT 5-[18F]FMT0

10

20

30

40

50

60

70

RC

A [%

]

Tracer

manu. auto.

Schema 54: Vergleich von manuellen und automatisierten radiochemischen Ausbeuten (RCA) von 2-[18F]FPhe,

2-[18F]FPEA, 5-[18F]FMT und 6-[18F]FMT

Die, im Vergleich zu den manuell durchgeführten Synthesen, um 15−50 % verschlechterten radio-

chemischen Ausbeuten für die Tracer 2-[18F]FPhe, 2-[18F]FPEA, 6-[18F]FMT und 5-[18F]FMT, lie-

gen dennoch in einem akzeptablen Rahmen (Schema 54).

Als Injektionslösung für die präklinischen Studien wurde die mittels HPLC abgetrennte Fraktion

verwendet. Geringe Mengen von HCl, die durch die HPLC nicht abgetrennt werden konnten, ver-

ursachten größere pH-Wert Schwankungen. Aus diesem Grund wurde der Injektionslösung noch

ein Phosphatpufferkonzentrat zugesetzt, um den pH-Wert auf ca. 7,3 einzustellen. Die Injektions-

lösung von 2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT enthält somit ca. 1 % bzw. 2 % Ethanol und ca.

12 mmol/L Phosphat-Ionen bei einem pH-Wert von 7,0−7,3.

Neben der vollständigen Automatisierung von 2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT wurden für die Syn-

thesen Standard Operating Procedures (SOP) eingeführt, so dass eine routinemäßige Herstellung

dieser Produkte möglich ist.

3 Ergebnisse & Diskussion 59

Metabolitenstudie von 2-[18F]FPhe - Entwicklung analytischer Methoden

Schema 55: Ausschnitt aus dem für 2-FPhe angenommenen Metabolismus (AADC: Aromatische-L-Amino-

säure-Decarboxylase, AAAH: aromatische Aminosäurehydroxylase, MAO: Monoaminooxidase, ADH: Alde-

hyd-Dehydrogenasen, PNMT: Phenylethanolamin-N-methyltransferase, AAMAT: Aralkylamin-N-acetyltrans-

ferase)

Im Zuge der präklinischen Studien von 2-[18F]FPhe und 2-[18F]FPEA soll zum einen eine Metabo-

litenanalyse durchgeführt werden und zum anderen die Hirnaufnahme von 2-[18F]FPhe bestimmt

werden. Diese Studie soll zeigen, welche Metaboliten vorliegen und wie die Hirnaufnahme verläuft.

In Schema 55 sind die angenommenen Metabolisierungspfade von 2-FPhe dargestellt. Dabei geht

man davon aus, dass 2-FPhe sich analog zum Metabolismus von L-Phenylalanin verhält.[140]

2-FPhe sollte durch die Aromatische-L-Aminosäure-Decarboxylase (AADC) zu

2-Fluorphenylethylamin (2-FPEA) umgesetzt werden. Ebenso sollte die aromatische Aminosäure-

hydroxylase (AAAH) das 2-FPhe zu 2-Fluor-L-tyrosin (2-FTyr) und weiter zu 6-Fluor-L-DOPA

(6-FDOPA) verstoffwechseln. AADC sollte dann analog zum 2-FPhe auch das 2-FTyr zum

2-Fluortyramin (2-FTA) umsetzen. 2-FPEA sollte, analog zum Phenylethylamin, ebenso eine sehr

kurze biologische Halbwertszeit aufweisen. Es sollte von der Monoaminooxidase (MAO) zum

2-Fluorbenzaldehyd und von der Aldehyd-Dehydrogenasen (ADH) zur 2-Fluorphenylessigsäure

(2-FPA, engl. 2-fluorophenyl acetic acid) umgesetzt werden, von der Phenylethanolamin-N-Methyl-

transferase (PNMT) zum 2-(2-Fluorphenyl)-N-methylethan-1-amin (NMe-2-FPEA) und von der

Aralkylamin-N-Acetyltransferase (AAMAT) zum N-(2-fluorphenyl-ethyl)acetamide (NAc-2-

FPEA).

60 3 Ergebnisse & Diskussion

Bei der Studie soll der Ratte nach der Tracerinjektion mehrfach Blut entnommen werden und das

Blut auf seine Metaboliten untersucht werden. Zusätzlich soll das Gehirn der Ratte homogenisiert

und ebenfalls auf seine Metaboliten untersucht werden. Für die Analyse der Proben wurde eine

geeignete Trennmethode entwickelt, die es ermöglicht alle Metaboliten voneinander zu trennen.

Durch den Zusatz von Trifluoressigsäure zum HPLC-Laufmittel konnten alle Metaboliten auf ei-

ner HPLC-Säule (Hydro-RP) getrennt werden (Diagramm 10, Seite 61). NAc-2-FPEA (III) und

2-FTA (IV) zeigten im HPLC-System unter isokratischen Bedingungen Retentionszeiten von weit

mehr als 1 h. Um eine DC-Methode für die Trennung aller Metaboliten zu finden, bedurfte es einer

systematischen Testung verschiedener Phasen (Normal und RP-Phase) und Laufmittelsysteme.

Eine 75 %ige wässrige Phenollösung erwies sich schließlich als sehr gut geeignet (Schema 56). Nur

NAc-2-FPEA (III) und 2-FTA (IV) konnten nicht durch die chromatographische Entwicklung mit

75 %-iger wässriger Phenollösung eindeutig identifiziert werden, die Substanzen flossen mit der

Laufmittelfront über die Phase. Sie wurden mit einer anderen Laufmittelzusammensetzung, näm-

lich einer Mischung von 50 % EtOAc in CHCl3, identifiziert.

Schema 56: Silika-DC vom 2-FPhe Metabolismus (Zuordnung siehe Schema 55)

Die starke Hydrophobie der 2-FPA (III) lässt sich über eine intramolekulare Wasserstoffbrücken-

bindung zwischen dem Wasserstoff der Carbonsäure und dem Fluor erklären.

Metabolitentrennung aus Blut

Eine Metabolitenanalyse ist nicht aus dem Vollblut möglich. Daher müssen zuvor Stoffe abge-

trennt werden, die die spätere Analytik und Trennung stören. Dafür wurde das Vollblut zunächst

zentrifugiert und das Serum separiert. Dem Serum wurde eine konzentrierte Lösung der Metabo-

liten zugesetzt und darauf folgte die Entproteinierung mit Acetonitril. Durch den hohen Aceto-

nitrilgehalt war eine HPLC-Trennung nicht möglich, woran auch eine 1:4 Verdünnung mit dem

Laufmittel nichts änderte.

. . . . . . . .I II III IV V VI VII VIII

75

% P

he

no

l (aq

)

. . . . . . . .I II III IV V VI VII VIII

50

% E

tOA

c in

CH

Cl 3

3 Ergebnisse & Diskussion 61

Um die Proben nicht unnötig zu verdünnen (Aktivitätskonzentration), ist eine Ultrafiltration ange-

wendet worden, die störende Makromoleküle entfernt. Mit dieser Methode war es möglich, die

sechs Metaboliten des 2-FPhe aus humanem Blutserum abzutrennen und zu analysieren (Dia-

gramm 10). Im Vergleich zu einer Blindprobe konnten 81−99 % der Metaboliten im Blutserum

wiedergefunden werden.

Diagramm 10: 2-FPhe Metaboliten im HPLC-Laufmittel (o.) und aus Humanblut extrahiert (u.), Hydro-RP

4 µm 80°Å (4,6x250 mm); 7 % EtOH(aq) + 0,2 % TFA (1,5 mL/min); 210 nm; 20 µL Probenschleife

Metabolitenstudie von 2-[18F]FPhe mit Lebermikrosomen

Durch eine Metabolitenstudie mit Lebermikrosomen von Ratten wurde die in vitro Stabilität von

2-[18F]FPhe untersucht. In einem Zeitraum von 45 min, zu unterschiedlichen Messzeitpunkten,

konnten keine radioaktiven Metaboliten des 2-[18F]FPhe nachgewiesen werden. Durch die vollstän-

dige Bilanzierung während den Messungen konnten auch radioaktiven Metaboliten, die durch die

Proteinfällung abgetrennt würden, ausgeschlossen werden. Somit liegt der Schluss nahe, dass die

Leber der Ratte nicht für den metabolischen Abbau des 2-[18F]FPhe verantwortlich ist.

Integration C:\GINA_NT\DM\HPLC RAU\TEST\180129.06

0,00 5,00 10,00 15,00 min

F-18

0,00 5,00 10,00 15,00 min

10

12

14

16

18

20

22

24 CPS

0,00 5,00 10,00 15,00 min

UV1

0,00 5,00 10,00 15,00 min

80

100

120

140

160mV

6-FDOPA

2-FTA 2-FTyr

2-FPhe

2-FPEA

NMe-2-FPEA

Integration C:\GINA_NT\DM\HPLC RAU\TEST\180129.07

0,00 5,00 10,00 15,00 min

F-18

0,00 5,00 10,00 15,00 min

12

14

16

18

20

22

24

26 CPS

0,00 5,00 10,00 15,00 min

UV1

0,00 5,00 10,00 15,00 min

80

100

120

140

160mV

6-FDOPA

2-FTA

2-FTyr

2-FPhe

2-FPEA

NMe-2-FPEA

62 4 Material und Methoden

4 Material und Methoden

4.1 Allgemeines

4.1.1 Chemikalien

Die verwendeten Chemikalien wurden von den folgenden Firmen bezogen und ohne weitere Rei-

nigung verwendet; Sigma Aldrich GmbH (Taufenkirchen, Deutschland), Fluorochem (Hadsfield,

UK), Chempur (Karlsruhe, Deutschland) und Fluka AG (Taufkrichen, Deutschland). Mögliche

Ausnahmen wurden in der Synthesevorschrift näher erläutert.

4.1.2 Reinigung

Für die manuelle Flash-chromatographische Reinigung[141] wurde als stationäre Phase, Kieselgel 60

(Merck, Korngröße 63−200 μm) verwendet. Zusätzlich wurden einige Verbindungen durch Re-

versed-Phase Flash-Säulenchromatographie mit LiChroprep RP-18 (25−40 μm Korngröße, Merck,

Darmstadt) durchgeführt.

Neben der manuellen Reinigung wurde auch ein Säulenautomat, Grace Reveleris® X2 (Alltech,

Lokeren, Belgien/Jetzt: Büchi, Essen) für die Trennung verwendet. Je nach Trennungsaufwand

wurden Korngrößen von 40 μm oder 20 μm (HP-Kartusche) benutzt. Die mobilen Phasen sind

der jeweiligen Synthesevorschrift zu entnehmen.

4.1.3 Charakterisierung

Dünnschichtchromatographie (DC) wurden in einer mit Lösungsmitteldämpfen der jeweiligen mo-

bilen Phase gesättigten Kammer durchgeführt. Als stationäre Phase fand Silica gel on TLC Al foils

(Sigma Aldrich, Taufkirchen) Verwendung. Darüber hinaus wurden für Reversed-Phase DC, DC

Kieselgel 60 RP-18 F254s Platten (Merck, Darmstadt) verwendet. Die Auswertung erfolgte durch

eine UV-Lampe (256 nm) oder mittels Anfärbung durch eine Ninhydrin-Lösung oder Permanga-

nat-Lösung.

Schmelzpunkte (Smp.) wurden mit einem vollautomatischem Büchi Melting Point B-540 (Büchi

Labortechnik GmbH, Essen) in offenen Glaskapillaren gemessen.

Zur Charakterisierung wurden die chemischen Verbindungen auf verschieden NMR-Geräten ge-

messen. Die Verschiebung im NMR wurde in ppm angegeben. Als interner Standard wurden die

Signale des deuterierten Lösungsmittels verwendet. Die Verschiebungen im 19F und 13C NMR, bei

Messungen in D2O, sind ohne Korrektur durch einen Standard angegeben.

4 Material und Methoden 63

1H-NMR: Bruker Avance 200 (200 MHz)

Varian Inova (400 MHz)

Bruker Avance III HD (600 MHz)

13C-NMR: Bruker Avance 200 (50 MHz)

Varian Inova (101 MHz)

Bruker Avance III HD (151 MHz)

19F-NMR: Bruker Avance 200 (188 MHz)

Bruker Avance III HD (565 MHz)

Hochauflösende Massenspektren wurden auf einem FTICR “LTQ FT Ultra” (Thermo Fisher Sci-

entific, Germany) und einfache Massenspektren auf einem Finnigan Automass Multi III gemessen.

Elementaranalysen wurden durch Dreifachbestimmungen an einem Vario EL cube gemessen.

4.2 Organische Synthesen

1 - N-tert-Butoxycarbonyl-L-phenylalanin-tert-butylester

L-Phenylalanin-tert-butylester Hydrochlorid (2,50 g; 9,70 mmol) wurde zu

100 mL einer K2CO3(aq) hinzugefügt und dreimal mit DCM extrahiert. Die

organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel in

vacuo entfernt. Danach wurden Boc2O (2,33 g; 10,67 mmol; 1,1 Äq.) zugegeben und der Reaktions-

kolben in ein Ultraschallbad gestellt und dort 20 min bei 30 °C bestrahlt. Das Reaktionsgemisch

wurde in vacuo eingeengt und aus MeOH/Wasser umkristallisiert. Die verbleibende Fraktion wurde

in vacuo von Lösungsmitteln befreit und durch Flash-Chromatographie (5 → 10 % EtOAc in PE)

aufgereinigt. Das Produkt 1 wurde mit 3,10 g (> 99 %) als weiße Kristalle erhalten.

Rf: 0,4 (10 % EtOAc in n-Hexan). Smp.: 47 °C. 1H NMR (600 MHz; CD2Cl2; 2 Rotamere [R] sind

im Verhältnis von 8:2 sichtbar) δ 7,20 (t; J = 7,4 Hz; 2H); 7,15 (t; J = 7,3 Hz; 1H); 7,09 (d; J = 7,2

Hz; 2H); 4,90 (d; J = 6,6 Hz; 0,8H); 4,60 (br; 0,2H; [R]); 4,35 – 4,22 (br; 0,8H); 4,16 (br; 0,2H; [R]);

2,98 (dd; J = 13,8; 6,0 Hz; 1H); 2,91 (dd; J = 13,8; 6,2 Hz; 0,8H); 2,84 (br; 0,2H; [R]); 1,32 (2 s; J =

2,5 Hz; 18H). 13C NMR (151 MHz; CD2Cl2) δ 171,3; 155,3; 137,1; 129,9; 128,7; 127,1; 82,2; 79,7;

55,4; 38,7; 28,4; 28,1. HRMS (ESI+) [M+H]+ berechnet für C18H28NO4+: 322,20129; gefunden:

322,20101; [M+Na]+ berechnet für C18H27NO4Na+: 344,18323; gefunden: 344,18293. Elementar-

analyse berechnet für C18H27NO4: C: 67,26 %; H: 8,47 %; N: 4,36 %; gefunden: C: 67,29 ± 0,06 %;

H: 8,45 ± 0,09 %; N: 4,39 ± 0,02 %.

64 4 Material und Methoden

2 - tert-Butyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(2-iodphenyl)propionat

Verbindung 1 (1,13 g; 3,52 mmol) wurde in eisgekühltem DCM aufgelöst,

ebenso wie [Bis(trifluoracetoxy)iod]benzol (1,25 g; 2,90 mmol; 0,83 Äq.) und

Iod (0,67 g; 2,64 mmol; 0,75 Äq.), und für 15 min bei 0 °C gerührt. Anschlie-

ßend wurde die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 3 h gerührt. Die Reaktion

wurde mit Na2SO3(aq) gequencht, mit Wasser und gesättigter NaCl(aq) gewaschen und über Na2SO4

getrocknet. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und das Rohprodukt durch Flash-Chroma-

tographie (10 % EtOAc in PE) gereinigt. 0,67 g (44 %) des gewünschten Produktes 2 wurden als

klares, leicht gelbliches Öl erhalten.

Rf: 0,3 (10 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (200 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R] sind im Verhältnis

von 8:2 sichtbar) δ 7,82 (d; J = 7,7 Hz; 1H); 7,32 – 7,12 (m; 2H); 6,99 – 6,80 (m; 1H); 5,05 (d; J =

8,4 Hz; 0,8H); 4,92 – 4,70 (br; 0,2H; [R]); 4,66 – 4,30 (m; 1H); 3,23 (dd; J = 13,9; 5,8 Hz; 1H); 3,03

(dd; J = 13,7; 8,7 Hz; 0,8H) 2,86 (br; 0,2H; [R]); 1,40 (s; 9H); 1,36 (s; 9H). 13C NMR (50 MHz;

CDCl3) δ 171,1; 155,1; 139,9; 139,7; 130,6; 128,7; 128,3; 101,4; 82,2; 79,7; 54,2; 43,8; 28,4; 28,1.

HRMS (ESI+) [M+H]+ berechnet für C18H27INO4+: 448,09793; gefunden: 448,09781; [M+Na]+ be-

rechnet für C18H26INO4Na+: 470,07987; gefunden: 470,07976.

3 - tert-Butyl-(2S)-2-([(tert-butoxy)carbonyl]amino)-3-(2-iodphenyl)propionat

Verbindung 2 (0,66 g; 1,48 mmol), Triethylamin (0,61 mL; 4,43 mmol;

3,0 Äq.), 4-DMAP (0,04 g; 0,30 mmol; 0,2 Äq.) und Boc2O (0,97 g;

4,43 mmol; 3,0 Äq.) wurden in 20 mL MeCN gelöst. Die Reaktion wurde auf

50 °C für 5:15 h erhitzt. Danach wurde die Reaktion auf Raumtemperatur abgekühlt, Et2O

zugegeben und die Mischung mit gesättigter NH4Cl(aq), Wasser und gesättigter NaCl(aq) gewaschen.

Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und die Lösungsmittel in vacuo entfernt. Das

Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (0 → 10 % EtOAc in PE) aufgereinigt und

0,71 g (88 %) des gewünschten Produktes 3 als ein klares Öl erhalten.

Rf: 0,4 (10 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (200 MHz; CDCl3) δ 7,78 (dd; J = 7,9; 1,1 Hz; 1H);

7,21 (dd; J = 7,3; 1,2 Hz; 1H); 7,11 (dd; J = 7,6; 1,9 Hz; 1H); 6,95 – 6,77 (m; 1H); 5,12 (dd; J =

10,8; 4,3 Hz; 1H); 3,54 (dd; J = 14,2; 4,2 Hz; 1H); 3,35 (dd; J = 14,2; 10,8 Hz; 1H); 1,48 (s; 9H);

1,38 (s; 18H). 13C NMR (50 MHz; CDCl3) δ 169,0; 152,0; 141,1; 139,5; 131,2; 128,5; 128,3; 101,3;

82,8; 81,8; 58,6; 40,4; 28,1; 28,0. HRMS (ESI+) [M+Na]+ berechnet für C23H34INO6Na+: 570,13240;

gefunden: 570,13285.

4 Material und Methoden 65

4 - (2-[(2S)-2-(Bis[(tert-butoxy)carbonyl]amino)-3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl]phenyl)-

(2,4,6-trimethylphenyl)iodoniumtetrafluorborat

Alle Feststoffe (benötigte Menge vorher eingewogen) wurden für mehrere

Tage in einem Exsikkator über Phosphorpentoxid gelagert. MeCN (wasser-

frei) als Lösungsmittel wurden mit Helium entgast. Die Reaktion wurde mit

einer Schlenk-Linie durchgeführt.

Die intensiv getrocknete Verbindung 3 (1,06 g; 1,94 mmol) wurde in ent-

gastem, wasserfreiem MeCN, in einem getrockneten Schlenk-Kolben gelöst

und mit TMSOAc (0,76 mL; 5,03 mmol; 2,6 Äq.) versetzt. Anschließend wurde Selectfluor (0,89 g;

2,52 mmol; 1,3 Äq.) vorsichtig im Gegenstrom von Argon zugegeben. Der Kolben wurde versie-

gelt und die Mischung unter Argon für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde Kalium-

2,4,6-trimethylphenyltrifluorborat (MesBF3K, 0,44 g; 1,94 mmol; 1 Äq.) im Argon Gegenstrom zu-

gegeben und die Reaktion für eine weitere Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in vacuo

getrocknet und mittels Flashchromatographie gereinigt (0 → 10 % MeOH in DCM). Der ge-

wünschte Vorläufer 4 (1,20 g; 82 %) wurde als weißes Pulver dargestellt.

Rf: 0,6 (10 % MeOH in DCM). 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,55 – 7,46 (m; 2H); 7,39 (d; J = 8,2

Hz; 1H); 7,21 – 7,15 (m; 1H); 7,09 (s; 2H); 4,94 (dd; J = 8,7; 4,9 Hz; 1H); 3,67 (dd; J = 14,1; 8,8

Hz; 1H); 3,29 (dd; J = 14,1; 4,8 Hz; 1H); 2,60 (s; 6H); 2,33 (s; 3H); 1,51 (s; 18H); 1,44 (s; 9H). 13C

NMR (151 MHz; CDCl3) δ 169,7; 152,3; 144,5; 142,4; 140,9; 134,0; 132,8; 132,6; 131,0; 130,7; 121,1;

118,2; 84,3; 84,0; 59,6; 40,1; 28,2; 28,0; 27,1; 21,2. 19F NMR (565 MHz; CDCl3) δ -150,18; -150,23.

HRMS (ESI+) [M-BF4]+ berechnet für C32H45INO6

+: 666,22805; gefunden: 666,22826. Elementar-

analyse berechnet für C32H45BF4INO4: C: 51,01 %; H: 6,02 %; N: 1,86 %; gefunden: C: 51 % ± <

0,1 %; H: 6,19 % ± 0,02 %; N: 1,88 % ± 0,02 %.

5 - tert-Butyl-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(2-fluorphenyl)propionat

HClO4(aq) (70 %; 1,42 mL; 16,38 mmol; 1,5 Äq.) wurde langsam einer eiskal-

ten Suspension von 2-Fluorphenylalanin (2,00 g, 10,92 mmol) in AcOtBu (20

mL) zugesetzt. Das Eisbad wurde entfernt und die Reaktionsmischung für

24 h gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert mit einer K2CO3(aq) auf

8–9 eingestellt und die Mischung mit EtOAc (3x) extrahiert. Die organischen Phasen wurden ver-

einigt, über Na2SO4 getrocknet und in vacuo konzentriert. Das Rohprodukt wurde im nächsten

Schritt ohne weitere Reinigung eingesetzt.

Der Kolben mit dem Rohprodukt wurde in ein Ultraschallbad getaucht. Das Bad wurde auf 30 °C

erwärmt, Boc2O (2,38 g; 10,92 mmol; 1 Äq.) zugegeben und die Mischung 20 min mit Ultraschall

bestrahlt, gefolgt von der Einengung in vacuo. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie

(10 % EtOAc in PE) gereinigt und Verbindung 5 (2,56 g, 64 %) als klares Öl erhalten, welches

über mehrere Tage auskristallisierte.

Rf: 0,4 (10 % EtOAc in n-Hexan). Smp.: 87 °C. 1H NMR (200 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R] sind

im Verhältnis von 9:1 sichtbar) δ 7,30 – 6,88 (m; 4H); 5,08 (d; J = 7,5 Hz; 0,9H); 4,81 (br; 0,1H;

66 4 Material und Methoden

[R]); 4,59 – 4,20 (m; 1H); 3,23 – 2,80 (m; 2H); 1,39 (2s; 18H). 13C NMR (50 MHz; CDCl3) δ 170,9;

161,5 (d; J = 246 Hz); 155,1; 131,8 (d; J = 132 Hz); 128,7 (d; J = 129 Hz); 124,0 (d; J = 124 Hz);

123,7; 115,3 (d; J = 116 Hz); 82,2; 79,7; 54,3; 32,1; 28,4; 28,0. 19F NMR (188 MHz; CDCl3; 2 Rota-

mere [R] sind im Verhältnis 9:1 sichtbar) δ -116,85 (s; 0,9H); -117,03 (br; 0,1H; [R]). HRMS (ESI+)

[M+H]+ berechnet für C18H27FNO4+: 340,19186; gefunden: 340,19174; [M+Na]+ berechnet für

C18H26FNO4Na+: 362,17381; gefunden: 362,17364. Elementaranalyse berechnet für C18H27FNO4:

C: 63,70 %; H: 7,72 %; N: 4,13 %; gefunden: C: 63,8 % ± < 0,1 %; H: 7,75 % ± 0,07 %; N: 4,30

% ± 0,04 %.

6 - tert-Butyl-2-(bis[(tert-butoxy)carbonyl]amino)-3-(2-fluorphenyl)propanoat

4-DMAP (0,07 g; 0,59 mmol; 0,2 Äq.) wurde einer Lösung aus 5 (1,00 g;

2,95 mmol), Boc2O (1,93 g; 8,84 mmol; 3 Äq.) und Et3N (1,23 mL;

8,84 mmol; 3 Äq.) in wasserfreiem MeCN (20 mL) zugegeben und die

Reaktionsmischung wurde für 16 h gerührt. Danach wurde die Reaktion mit EtOAc verdünnt, mit

gesättigter NH4Cl(aq), Wasser und gesättigter NaCl(aq) gewaschen. Die organische Phase wurde über

Na2SO4 getrocknet und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie

(5 → 10 % EtOAc in PE) gereinigt, wobei die Verbindung 6 (1,15 g; 89 %) als klares Öl erhalten

wurde, das langsam auskristallisierte.

Rf: 0,5 (10 % EtOAc in n-Hexan). Smp.: 58 °C. 1H NMR (200 MHz; CDCl3) δ 7,24 – 6,85 (m; 4H);

5,08 (dd; J = 10,6; 4,8 Hz; 1H); 3,43 (dd; J = 14,1; 4,6 Hz; 1H); 3,24 (dd; J = 13,8; 10,9 Hz; 1H);

1,47 (s; 9H); 1,39 (s; 18H). 13C NMR (50 MHz; CDCl3) δ 169,0; 152,0; 141,1; 139,5; 131,2; 128,5;

128,3; 101,3; 82,8; 81,8; 58,6; 40,4; 28,1; 28,0. 19F NMR (188 MHz; CDCl3) δ -117,53. HRMS (ESI)

[M+H]+ berechnet für C23H35FNO6+: 440; gefunden: 440. Elementaranalyse berechnet für

C23H34FNO6: C: 62,85 %; H: 7,80 %; N: 3,19 %; gefunden: C: 63,2 % ± < 0,1 %; H: 7,89 % ± 0,01

%; N: 3,36 % ± 0,02 %.

7 - tert-Butyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(4-iodphenyl)propionat

Verbindung 7 konnte als Nebenprodukt, der für die für Verbindung 2

beschriebenen Reaktion, isoliert werden. Die para-iodierte Verbindung

wurde mit 0,63 g (40 %) als schwach gelbes Öl gewonnen, das langsam

auskristallisierte.

Rf: 0,3 (10 % EtOAc in n-Hexan). Smp.: 68 °C. 1H NMR (600 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R] sind

im Verhältnis 9:1 sichtbar) δ 7,60 (d; J = 8,2 Hz; 2H); 6,92 (d; J = 8,3 Hz; 2H); 4,98 (d; J = 7,4 Hz;

0,9H); 4,71 (br; 0,1H; [R]); 4,42 (dd; J = 13,4; 6,2 Hz; 0,9H); 4,22 (br; 0,1H); 3,02 (dd; J = 13,8; 6,2

Hz; 1H); 2,97 (dd; J = 13,8; 5,8 Hz; 1H); 1,41 (2 s; 18H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3) δ 170,8;

155,2; 137,5; 136,3; 131,7; 130,8; 92,4; 82,5; 80,0; 54,8; 38,2; 28,5; 28,1. HRMS (ESI+) [M+H]+

berechnet für C18H27INO4+: 448,09792; gefunden: 448,09813; [M+Na]+ berechnet für C18H26IN-

NaO4+: 470,07987; gefunden: 470,08009; [M+K]+ berechnet für C18H26IKNO4

+: 486,053802 ge-

funden: 486,05407. Elementaranalyse berechnet für C18H26FNO4: C: 48,33 %; H: 5,86 %; N: 3,13

%; gefunden: C: 48,2 % ± < 0,1 %; H: 5,71 % ± 0,04 %; N: 3,19 % ± 0,02 %.

4 Material und Methoden 67

8 - tert-Butyl-(2S)-2-([(tert-butoxy)carbonyl]amino)-3-(2-iodphenyl)propionat

Verbindung 7 (0,70 g; 1,56 mmol) wurden in 20 mL MeCN mit

Triethylamin (0,65 mL; 4,69 mmol; 3 Äq.), 4-DMAP (0,04 g; 0,31 mmol;

0,2 Äq.) und Boc2O (1,02 g; 4,69 mmol; 3 Äq.) gelöst. Die Reaktion wurde

auf 50 °C für 6 h erwärmt. Dann wurde das Reaktionsgemisch auf

Raumtemperatur abgekühlt, Et2O zugesetzt und die Mischung mit gesättigter NH4Cl(aq), Wasser

und gesättigter NaCl(aq) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und die

Lösungsmittel in vacuo entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie

(0 → 10 % EtOAc in PE) gereinigt und Verbindung 8 mit 0,64 g (75 %) als klares Öl erhalten.

Rf: 0,4 (10 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,57 (d; J = 8,3 Hz; 2H); 6,93 (d;

J = 8,3 Hz; 2H); 4,98 (dd; J = 10,3; 5,2 Hz; 1H); 3,31 (dd; J = 14,2; 5,2 Hz; 1H); 3,14 (dd; J = 14,2;

10,3 Hz; 1H); 1,46 (s; 9H); 1,41 (s; 18H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3) δ 169,27; 152,33; 137,98;

137,44; 131,72; 91,82; 82,94; 81,84; 59,89; 35,48; 28,09; 28,07. HRMS (ESI+) [M+H]+ berechnet

für C23H35INO6+: 548,15035; gefunden: 548,15100; [M+Na]+ berechnet für C23H34INNaO6

+:

570,13229; gefunden: 570,13289; [M+K]+ berechnet für C23H34IKNO6+: 586,10623 gefunden:

586,10690.

9 - (4-(3-(tert-Butoxy)-2-((tert-butoxy(hydroxy)methyl)(tert-butoxycarbonyl)amino)-3-

oxopropyl)phenyl)(mesityl)iodoniumtetrafluorborat

Die Reaktion wurde vorbereitet und durchgeführt, wie für Verbin-

dung 4 beschrieben.

Die intensiv getrocknete Verbindung 8 (0,32 g; 0,58 mmol) wurde

in entgastem, wasserfreiem MeCN, in einem getrockneten Schlenk-

Kolben gelöst und mit TMSOAc (0,23 mL; 1,51 mmol; 2,6 Äq.)

versetzt. Anschließend wurde Selectfluor (0,26 g; 0,75 mmol;

1,3 Äq.) vorsichtig im Argon Gegenstrom zugegeben. Der Kolben wurde versiegelt und die Mi-

schung unter Schutzgas für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ablauf der Reaktionszeit

wurde MesBF3K (0,13 g; 0,58 mmol; 1 Äq.) vorsichtig wieder im Gegenstrom zugegeben und die

Reaktion für eine weitere Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Unterdruck eingeengt

und mittels Flash-Chromatographie (0 → 10 % MeOH in DCM) gereinigt. Der gewünschte Vor-

läufer 9 (0,39 g; 89 %) wurde als weißes Pulver erhalten.

Rf: 0,5 (10 % MeOH in DCM). 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,57 (d; J = 8,5 Hz; 2H); 7,29 (d; J

= 8,5 Hz; 2H); 7,13 (s; 2H); 4,97 (dd; J = 9,5; 5,5 Hz; 1H); 3,42 (dd; J = 14,4; 5,5 Hz; 1H); 3,17

(dd; J = 14,4; 9,5 Hz; 1H); 2,62 (s; 5H); 2,38 (s; 3H); 1,43 (2 s; J = 9,2 Hz; 9H); 1,41 (s; 18H). 13C

NMR (151 MHz; CDCl3) δ 168,9; 152,3; 145,3; 144,1; 143,0; 134,0; 132,9; 130,9; 118,9; 107,9; 83,5;

82,27; 59,5; 35,6; 28,1; 28,1; 27,4; 21,3. 19F NMR (565 MHz; CDCl3) δ -147,92; -147,97. HRMS

(ESI+) [M-BF4]+ berechnet für C32H45INO6

+: 666,22805; gefunden: 666,22837.

68 4 Material und Methoden

10 - tert-Butyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)(methoxymethyl)amino)-3-(2-iodphenyl)-

propionat

Die Reaktion wurde gemäß der allgemeinen Vorschrift in der Literatur durch-

geführt.[142] 7 (0,46 g; 1,03 mmol) und Paraformaldehyd (0,05 g; 1,54 mmol;

1,5 Äq.) wurden in 10 mL DCM gelöst und auf 0 °C abgekühlt. Anschließend

wurde Trimethylsilylchlorid (TMSCl) (0,39 mL; 3,09 mmol; 3 Äq.) zugesetzt

und das Reaktionsgemisch 5 h lang gerührt. Nach dem Erwärmen der Reaktion auf Raumtempe-

ratur wurden 2,7 mL MeOH mit 0,3 mL Et3N gemischt und hinzugefügt, danach wurde das Reak-

tionsgemisch eine weitere Stunde lang gerührt. Die Reaktion wurde mit 15 mL gesättigter

NaHCO3(aq) gequencht und dreimal mit DCM extrahiert. Die organischen Phasen wurden über

Na2SO4 getrocknet und mittels Flash-Chromatographie (5 % EtOAc in n-Hexan) gereinigt. Die

gewünschte Verbindung 10 wurde als klares Öl (0,40 g; 79 %) erhalten.

Rf: 0,3 (10 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R] sind im Verhältnis

von 1:1 sichtbar) δ 7,84 – 7,76 (m; 1H); 7,23 (dd; J = 13,7; 6,9 Hz; 1H); 7,18 – 7,12 (m; 1H); 6,90

(dd; J = 15,1; 7,5 Hz; 1H); 4,69 (d; J = 10,8 Hz; 0,5H); 4,50 (d; J = 11,2 Hz; 0,5H); 4,39 – 4,28 (m;

0,5H); 4,23 (dd; J = 10,8; 4,8 Hz; 0,5H); 3,95 (d; J = 10,2 Hz; 0,5H); 3,82 (d; J = 11,2 Hz; 0,5H);

3,53 – 3,38 (m; 1,5H); 3,32 – 3,24 (m; 0,5H); 3,17 (s; 1,5H); 3,11 (s; 1,5H); 1,49 (2s; 18H). 13C NMR

(151 MHz; CDCl3) δ 169,86; 169,64; 155,31; 154,41; 141,51; 141,00; 139,71; 139,57; 131,41; 131,26;

128,62; 128,46; 128,31; 100,75; 81,79; 81,59; 81,38; 80,77; 80,12; 79,65; 59,31; 59,19; 56,15; 55,71;

40,84; 39,90; 28,50; 28,46; 28,26; 28,14. HRMS (ESI+) [M+Na]+ berechnet für C20H30INNaO5+:

514,10664; gefunden: 514,10631.

11 - (S)-(2-(3-(tert-Butoxy)-2-((tert-butoxycarbonyl)(methoxymethyl)amino)-3-

oxopropyl)phenyl)-(mesityl)iodoniumtetrafluorborat

Die Reaktion wurde vorbereitet und durchgeführt, wie für 4 beschrieben.

Die intensiv getrocknete Verbindung 10 (0,37 g; 0,75 mmol) wurde in ent-

gastem, wasserfreiem MeCN in einem getrockneten Schlenk-Kolben gelöst

und mit TMSOAc (0,29 mL; 1,96 mmol; 2,6 Äq.) versetzt. Anschließend

wurde Selectfluor (0,35 g; 0,98 mmol; 1,3 Äq.) vorsichtig im Argon-Gegen-

strom zugegeben. Der Kolben wurde versiegelt und die Mischung unter

Schutzgas für 24 h gerührt. Danach wurde MesBF3K (0,17 g; 0,75 mmol; 1 Äq.) vorsichtig im Ge-

genstrom zugegeben und die Reaktion für eine weitere Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch

wurde im Unterdruck eingeengt und mittels Flash-Chromatographie (0 → 10 % MeOH in DCM)

gereinigt. Der gewünschte Vorläufer 11 (0,41 g; 78 %) wurde als weißes Pulver erhalten.

Rf: 0,6 (10 % MeOH in DCM). 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,53 (t; J = 7,3 Hz; 1H); 7,49 (t; J =

7,3 Hz; 1H); 7,40 (dd; J = 23,1; 8,2 Hz; 1H); 7,17 (t; J = 8,1 Hz; 1H); 7,09 (s; 2H); 4,87 – 4,62 (m;

2H); 4,40 – 4,20 (m; 1H); 4,20 – 3,96 (m; 1H); 3,78 (dd; J = 13,5; 9,5 Hz; 1H); 3,63 (dd; J = 14,3;

8,0 Hz; 1H); 3,37 (s; 1H); 3,25 (s; 2H); 2,64 – 2,57 (m; 6H); 2,33 (s; 3H); 1,64 – 1,56 (m; 6H); 1,48

– 1,43 (m; 12H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3) δ 170,5; 170,1; 154,4; 154,2; 144,4; 144,3; 142,5;

4 Material und Methoden 69

142,2; 141,2; 140,9; 134,0; 134,0; 132,4; 132,4; 132,3; 132,1; 130,7; 130,5; 130,4; 121,3; 120,4; 118,4;

118,3; 84,3; 83,6; 82,9; 81,8; 80,0; 79,4; 61,6; 60,4; 56,1; 55,9; 40,9; 39,6; 28,5; 28,2; 28,0; 27,9; 27,0;

21,1. 19F NMR (565 MHz; CDCl3) δ -149,91; -149,97. HRMS (ESI+) [M-BF4]+ berechnet für

C29H41INO5+: 610,20184; gefunden: 610,20222.

12 - tert-Butyl-(S)-3-(2-iodphenyl)-2-(tritylamino)propionat

Verbindung 2 (0,28 g; 0,63 mmol) wurden zu 4 mL eisgekühlter HCl in

Dioxan (4 M) zugegeben und für 2:15 h bei 0 °C gerührt. Anschließend

wurde das Reaktionsgemisch im Unterdruck getrocknet und 4 mL MeCN,

TrCl (0,21 g, 0,76 mmol, 1,2 Äq.) und Et3N (0,26 mL; 1,89 mmol; 3 Äq.)

zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann über Nacht gerührt. Anschließend wurde das

Reaktionsgemisch mit Et2O verdünnt, mit gesättigter NH4Cl(aq), Wasser und gesättigter NaCl(aq)

gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und die Lösungsmittel im

Unterdruck entfernt. Danach wurde das Rohprodukt durch Flash-Chromatographie (0 → 10 %

EtOAc in PE) gereinigt. Das Produkt (12) wurde als klares Öl mit 0,26 g (70 %) hergestellt.

Rf: 0,5 (10 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R] sind im Verhältnis

von 9:1 sichtbar) δ 7,87 (d; J = 7,9 Hz; 0,9H); 7,85 (d; J = 7,9 Hz; 0,1H; [R]); 7,39 – 7,27 (m; 9H);

7,19 – 7,08 (m; 8H); 6,97 (td; J = 7,8; 1,6 Hz; 1H); 3,70 (dd; J = 8,4; 6,3 Hz; 1H); 3,08 (dd; J = 13,6;

6,0 Hz; 1H); 3,02 (dd; J = 13,6; 9,0 Hz; 1H); 2,78 (br; 1H); 1,38 (s; 0,9H; [R]); 1,02 (s; 8,1H). 13C

NMR (151 MHz; CDCl3) δ 174,0; 146,3; 141,4; 139,6; 132,1; 129,0; 128,5; 128,2; 128,1; 127,9; 127,4;

126,4; 101,9; 80,6; 71,0; 57,1; 47,3; 27,9. HRMS (ESI+) [M+Na]+ berechnet für C32H32INNaO2+:

612,13699; gefunden: 612,13755; [M+K]+ berechnet für C32H32INKO2+: 628,11092; gefunden:

628,11168. Elementaranalyse berechnet für C32H32INO2: C: 65,20 %; H: 5,47 %; N: 2,38 %; gefun-

den: C: 65,6 % ± < 0,1 %; H: 5,51 % ± 0,04 %; N: 2,31 % ± 0,02 %.

13 - tert-Butyl-(S)-2-((10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d][7]annulen-5-yl)amino)-3-(2-

iodphenyl)propionat

Verbindung 2 (0,24 g; 0,54 mmol) wurden zu 4 mL eisgekühlter HCl in Di-

oxan (4 M) zugegeben und für 2:10 h bei 0 °C gerührt. Anschließend wurde

das Reaktionsgemisch im Unterdruck getrocknet und 4 mL MeCN, SubCl

(0,21 g; 0,76 mmol; 1,2 Äq.) und Et3N (0,26 mL; 1,89 mmol; 3 Äq.) zugegeben. Anschließend

wurde das Reaktionsgemisch mit Et2O verdünnt, mit gesättigter NH4Cl(aq), Wasser und gesättigter

NaCl(aq) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und die Lösungsmittel

im Unterdruck entfernt. Danach wurde das Rohprodukt durch Flash-Chromatographie (0 → 10 %

EtOAc in PE) gereinigt und 0,21 g (72 %) des gewünschten Produktes 13 wurden als klares Öl

erhalten.

Rf: 0,5 (10 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,74 (d; J = 7,8 Hz; 1H); 7,30 (d;

J = 7,4 Hz; 1H); 7,20 – 6,99 (m; 9H); 6,87 (t; J = 7,5 Hz; 1H); 4,72 (br; 1H); 3,74 (br; 1H); 3,50 –

3,28 (m; 2H); 3,06 – 2,93 (m; 1H); 2,93 – 2,74 (m; 2H); 2,54 (br; 1H); 2,12 (br; 1H); 1,48 (s; 9H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3) δ 174,2; 141,1; 139,4; 131,1; 130,9; 130,0; 128,1; 127,9; 127,6; 126,1;

70 4 Material und Methoden

125,7; 101,1; 81,3; 59,4; 44,5; 33,3; 31,5; 28,3. HRMS (ESI+) [M+H]+ berechnet für C28H31INO2+:

540,13939; gefunden: 540,13975.

14 - (2-[(2S)-2-(Bis[(tert-butoxy)carbonyl]amino)-3-(tert-butoxy)-3-oxopropyl]phenyl)-

(2,4,6-trimethylphenyl)iodoniumtosylat

Verbindung 4 (0,10 g; 0,13 mmol) wurden in MeOH gelöst und durch eine

mit AG1-X8 gefüllte Glassäule (TsO–, 100–200 Mesh) geleitet. Das Lö-

sungsmittel wurde im Unterdruck entfernt und 14 (0,11 g; > 99 %) als wei-

ßes Pulver erhalten.

Rf: 0,6 (10 % MeOH in DCM). 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,49 (d; J =

8,0 Hz; 2H); 7,45 – 7,37 (m; 2H); 7,35 (d; J = 8,1 Hz; 1H); 7,11 – 7,05 (m;

1H); 6,99 (d; J = 7,9 Hz; 2H); 6,95 (s; 2H); 4,98 – 4,92 (m; 1H); 3,64 (dd; J = 14,1; 8,0 Hz; 1H);

3,30 (dd; J = 14,2; 6,3 Hz; 1H); 2,61 (s; 6H); 2,29 (2s; 6H); 1,49 (s; 18H); 1,45 (s; 9H). 13C NMR

(151 MHz; CDCl3) δ 169,1; 152,4; 143,3; 143,2; 142,0; 140,9; 138,9; 134,2; 132,4; 131,7; 130,1;

130,0; 128,3; 126,1; 124,7; 119,4; 84,0; 83,3; 59,4; 39,3; 28,2; 28,1; 27,2; 21,4; 21,2. HRMS (ESI+)

[M-BF4]+ berechnet für C32H45INO6

+: 666,22805; gefunden: 666,22835.

15 - Mesityl(4-methoxyphenyl)iodoniumtetrafluorborat

Die Verbindung 15 wurde von Herrn PD Dr. Zlatopolskiy synthetisiert

und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.

Rf: 0,5 (10 % DCM in MeOH). 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,71 – 7,65

(m; 2H); 7,06 (s; 2H); 6,95 – 6,88 (m; 2H); 3,78 (s; 3H); 2,62 (s; 6H); 2,31 (s; 3H). 13C NMR (151

MHz; CDCl3) δ 162,8; 144,6; 142,6; 135,9; 130,6; 118,4; 99,0; 55,9; 27,1; 21,1, 19F NMR (565 MHz;

CDCl3) δ -147,8; -147,9. HRMS (ESI+) [M+H]+ berechnet für C16H18IO+: 353,03968; gefunden:

353,03935. Elementaranalyse berechnet für C16H18BF4IO: C: 43,67 %; H: 4,12 %; gefunden: C: 44,1

% ± < 0,1 %; H: 4,38 % ± 0,04 %.

16 - tert-Butyl-(S)-3-(3,4-bis((tert-butoxycarbonyl)oxy)phenyl)-2-((tert-

butoxycarbonyl)amino)propionat

HClO4(aq) (60 %, 0,83 mL; 7,61 mmol; 1,5 Äq.) wurde langsam in eine

eisgekühlte Lösung aus 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA)

(1,00 g; 5,07 mmol) in AcOtBu (12 mL) gegeben. Das Eisbad wurde

entfernt und das Reaktionsgemisch für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde der

pH-Wert mit einer wässrigen K2CO3 Lösung auf 8–9 eingestellt und die Mischung dreimal mit

EtOAc extrahiert. Die extrahierten organischen Phasen wurden kombiniert, über Na2SO4 getrock-

net und in vacuo die Lösungsmittel entfernt. Das erhaltene Rohprodukt (1,28 g) wurde ohne weitere

Reinigung im Folgenden weiter umgesetzt.

Das Rohprodukt wurde in 25 mL wasserfreiem DMF gelöst und mit Hilfe eines Eisbades auf 0 °C

gekühlt. Boc2O (3,98 g; 18,25 mmol; 3,6 Äq.) und Et3N (2,53 mL; 18,2 mmol; 3,6 Äq.) wurden zu

4 Material und Methoden 71

der Mischung hinzugefügt, nach einigen Minuten wurde das Eisbad entfernt und die Reaktion

wurde für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde die Reaktions-

mischung mit 50 mL EtOAc verdünnt und mit Wasser und gesättigter NaCl(aq) extrahiert. Die or-

ganische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und in vacuo eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt

wurde durch Flash-Chromatographie (5 → 10 % EtOAc in Petrolether + 0,1 % Et3N) gereinigt

und das Produkt 16 als ein hoch viskoses, farbloses Öl erhalten (1,41 g; 50 %).

Rf: 0,4 (20 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7,16 (m; J = 8,3 Hz; 1H); 7,07

(br; 1H); 7,02 (dd; J = 8,3; 1,8 Hz; 1H); 5,01 (d; J = 7,7 Hz; 1H); 4,41 (m; 1H); 3,04 (m; 2H); 1,52

(s; 18H); 1,40 (m; 18H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3) δ 170,7; 155,2; 150,8; 150,7; 142,3; 141,5;

135,2; 127,4; 124,2; 122,9; 83,7; 82,4; 79,9; 54,7; 37,8; 28,4; 28,0; 27,7; 27,7. HRMS (ESI+) [M+Na]+

berechnet für C28H43O10NNa+: 576,27792; gefunden: 576,27759. Elementaranalyse berechnet für

C28H43NO10: C: 60,74 %; H: 7,83 %; N: 2,53 %; gefunden: C: 60,45 % ± 0,14 %; H: 7,87 % ± 0,06

%; N: 2,58 % ± 0,05 %.

17 - tert-Butyl-(S)-3-(4,5-bis((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-iodphenyl)-2-((tert-

butoxycarbonyl)amino)propionat

Bis(trifluoracetoxy)iodbenzol (BTI, 1,89 g; 4,40 mmol; 1,2 Äq.) und I2

(0,93 g; 3,67 mmol; 1,0 Äq.) wurden in eine eisgekühlte Lösung von 16

(2,03 g; 3,67 mmol) in trockenem DCM (15 mL) aufgelöst. Die Reak-

tion wurde für 15 min bei 0 °C gerührt, danach wurde das Eisbad entfernt und die Reaktionsmi-

schung wurde für 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit Na2S2O3(aq) bis zur

Entfärbung gequencht und mit Wasser und gesättigter NaCl(aq) ausgeschüttelt. Die verbleibende

DCM-Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und in vacuo eingeengt. Das erhaltene, gelbliche Öl

wurde durch Flash-Chromatographie (5 → 10 % EtOAc in Petrolether + 0,1 % Et3N) gereinigt

und das Produkt 17 wurde als farbloses Öl erhalten (1,31 g; 53 %).

Rf = 0,4 (20 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,72 (s; 1H); 7,15 (s; 1H); 5,03

(d; J = 8,3 Hz; 1H); 4,50 (m; 1H); 3,19 (dd; J = 14,1; 6,0 Hz; 1H); 3,05 (dd; J = 14,0; 8,5 Hz; 1H);

1,53 (s; 18H); 1,9 (s; 18H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3) δ 172,0; 170,8; 155,2; 150,4; 150,3; 142,6;

141,6; 138,6; 134,1; 133,6; 124,4; 123,6; 95,7; 84,3; 84,1; 82,5; 79,9; 54,0; 43,0; 28,4; 28,1; 27,7.

HRMS (ESI+): [M+H]+ berechnet für C28H42INO10+: 697,21916; gefunden: 697,21786. Elementar-

analyse berechnet für C28H42INO10: C: 49,49 %; H: 6,24 %; N: 2,06 %; gefunden: C: 49,49 % ±

0,24 %; H: 6,22 % ± 0,04 %; N: 1,81% ± 0,01 %.

72 4 Material und Methoden

18 - tert-Butyl-(S)-3-(4,5-bis((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-

dioxaboran-2-yl)phenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propionat

Ein Rundkolben mit Bis(pinakolato)diboran (B2pin2; 0,29 g;

1,13 mmol; 1,1 Äq.); Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2 (0,08 g; 0,10 mmol; 0,1 Äq.)

und KOAc (0,30 g; 3,09 mmol; 3,0 Äq.) wurde in vacuo getrocknet und

mehrfach mit Argon gespült. Anschließend wurde eine Lösung von 17

(0,70 g; 1,03 mmol) in wasserfreiem DMF (10 mL) zugegeben und das

Reaktionsgemisch 3 h bei 80 °C gerührt. Danach wurde das Gemisch auf Umgebungstemperatur

abgekühlt, gefiltert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Et2O

(5 mL) aufgenommen und mit n-Hexan (50 mL) verdünnt. Der sich dabei bildende Niederschlag

wurde durch Filtration mittels Kieselgur entfernt und die Lösung in vacuo konzentriert. Der ölige

Rückstand wurde durch RP-Flash-Chromatographie (90 % MeCN(aq)) gereinigt. Verbindung 18

(0,28 g; 40 %) wurde als farbloser Schaum dargestellt.

Rf = 0,3 (20 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,66 (s; 1H); 7,19 (s; 1H); 5,75

(d; J = 8,1 Hz; 1H); 4,22 (m; 1H); 3,19 (m; 2H); 1,53 (s; 18H); 1,44 (s; 9H); 1,36 (m; 21H), 13C NMR

(151 MHz; CDCl3) δ 171,9; 155,6; 150,9; 150,4; 144,8; 143,1; 140,8; 130,5; 124,9; 84,4; 83,9; 83,7;

81,4; 79,3; 56,8; 36,7; 28,4; 28,1; 27,8; 27,8; 25,1; 24,8. HRMS (ESI+): [M+H]+ berechnet für

C34H54O12BNNa+: 702,36313; gefunden: 702,36298. Elementaranalyse berechnet für C34H54BNO12:

C: 60,09 %; H: 8,01 %; N: 2,06 %; gefunden: C: 59,90 % ± 0,07 %; H: 8,00 % ± 0,04 %; N: 1,97

% ± 0,02 %.

19 - tert-Butyl-(S)-3-(4,5-bis((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-

dioxaboran-2-yl)phenyl)-2-(bis(tert-butoxycarbonyl)amino)propionat

4-(Dimethylamino)-pyridin (4-DMAP) (0,01 g; 0,10 mmol; 0,2 Äq.)

wurde einer eiskalten Lösung von 18 (0,35 g; 0,52 mmol), Boc2O

(0,34 g, 1,55 mmol; 3,0 Äq.) und Et3N (0,21 mL; 1,55 mmol; 3,0 Äq.)

zugesetzt. Anschließend wurde das Eisbad entfernt, die Mischung auf

40 °C erwärmt und bei dieser Temperatur für weitere 2 h gerührt.

Dann wurde das Reaktionsgemisch mit EtOAc verdünnt, mit gesättigter NH4Cl(aq), Wasser und mit

gesättigter NaCl(aq) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und unter vermindertem Druck

konzentriert. Der Rückstand wurde in Et2O aufgenommen, die entstandene Lösung durch ein

kleines Kieselgel-Pad gefiltert und erneut unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand

wurde mittels RP-Flash-Chromatographie (90 → 95 % MeCN(aq)) gereinigt, wobei Verbindung 19

(0,17 g; 30 %) als farbloser Schaum erhalten wurde.

Rf = 0,5 (20 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (400 MHz; CDCl3) δ 7,63 (s; 1H); 6,97 (s; 1H); 5,28

(dd; J = 11,1; 4,3 Hz; 1H); 3,92 (dd; J = 13,6; 4,3 Hz; 1H); 3,14 (dd; J = 13,4; 11,2 Hz; 1H); 1,52 (s;

18H); 1,48 (m; 9H) 1,36 (s; 18H); 1,32 (s; 12H). 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169,6; 152,4; 150,8;

150,3; 144,2; 144,2; 140,5; 130,5; 127,3; 125,5; 83,9; 83,5; 83,4; 82,5; 81,0; 60,1; 35,2; 28,2; 28,0;

27,8; 27,7; 25,1; 24,9. HRMS (ESI+) [M+H]+ berechnet für C39H62O14BNNa+: 802,41555; gefunden:

4 Material und Methoden 73

802,41497. Elementaranalyse berechnet für C39H62BNO14: C: 60,08 %; H: 8,01 %; N: 1,80 %; ge-

funden: C: 59,93 % ± 0,12 %; H: 8,11 % ± 0,02 %; N: 1,74 % ± 0,01 %.

20 - tert-Butyl-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-

2-yl)phenyl)propanoat

B2pin2 (0,64 g; 2,52 mmol, 1,5 Äq.), Pd(dppf)Cl2 (0,37 g; 0,50 mmol; 0,1 Äq)

und KOAc (1,47 g; 15,00 mmol; 3 Äq.) wurden im Unterdruck getrocknet

und wiederholt mit Schutzgas gespült. Verbindung 2 (0,75 g; 1,68 mmol)

wurde in 10 mL DMF (wasserfrei) gelöst und hinzugefügt. Die Reaktion

wurde für 2 h bei 110 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser

gequencht und mit 40 mL Et2O versetzt. Die Mischung wurde zweimal mit 1 M NaOH(aq) und

jeweils einmal mit Wasser und gesättigter NaCl(aq) gewaschen. Die organische Phase wurde über

Na2SO4 getrocknet und mittels Flash-Chromatographie (0 → 20 % EtOAc in n-Hexan) und

RP-Flash-Chromatographie (75 → 100 % MeCN(aq)) gereinigt. Das Produkt 20 (0,35 g; 47 %)

wurde als klares Öl dargestellt.

Rf: 0,2 (10 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R] sind im Verhältnis

von 8:2 sichtbar) δ 7,73 (d; J = 7,3 Hz; 1H); 7,32 (t; J = 7,4 Hz; 1H); 7,21 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 7,16

(t; J = 7,3 Hz; 1H); 5,76 (d; J = 8,2 Hz; 0,8H); 5,35 (d; J = 5,9 Hz; 0,2H; [R]); 4,25 – 4,13 (m; 0,8H);

4,09 (br; 0,2H; [R]); 3,24 – 2,95 (m; 2H); 1,39 (s; 9H); 1,34 – 1,28 (m; 12H); 1,27 – 1,18 (m; 9H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R] sind sichtbar) δ 172,2; 155,7; 144,1; 136,4 [R]; 136,2;

131,5; 131,4 [R]; 130,5 [R]; 130,4; 126,2 [R]; 126,1; 84,2; 81,2; 79,1; 58,3 [R]; 57,1; 38,2 [R]; 37,5;

28,4; 28,2 [R]; 28,1; 25,2; 24,8. HRMS (ESI+) [M+H]+ berechnet für C24H39BNO6+: 448,28649;

gefunden: 448,28614.

21 - tert-Butyl-(S)-2-(bis(tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-

dioxaboran-2-yl)phenyl)propionat

Verbindung 20 (0,22 g; 0,49 mmol), Boc2O (1,07 g; 4,92 mmol; 10 Äq.) und

4-DMAP (0,07 g; 0,59 mmol; 1,2 Äq.) wurden in 5 mL MeCN gelöst und das

Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde am

nächsten Morgen im Unterdruck entfernt und das verbleibende Öl in 40 mL

n-Hexan aufgenommen. Die organische Phase wurde mit gesättigter

NH4Cl(aq), Wasser und gesättigt NaCl(aq) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 ge-

trocknet und durch Flash-Chromatographie (10 % EtOAc in n-Hexan) gereinigt. Verbindung 25

(0,13 g; 48 %) wurde als klares Öl erhalten, das über Nacht auskristallisierte.

Rf: 0,3 (10 % EtOAc in n-Hexan). Smp.: 108–109 °C. 1H NMR (600 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R]

sind im Verhältnis von 8:2 sichtbar) δ 7,77 (dd; J = 7,3; 1,0 Hz; 1H); 7,29 (td; J = 7,5; 1,4 Hz; 1H);

7,21 – 7,15 (m; 1H); 7,02 (d; J = 7,5 Hz; 1H); 5,21 (dd; J = 11,3; 3,7 Hz; 1H); 3,95 (dd; J = 13,5;

3,7 Hz; 1H); 3,09 (dd; J = 13,5; 11,3 Hz; 1H); 1,49 (s; 9H); 1,37 – 1,29 (m; 30H). 13C NMR (151

MHz; CDCl3) δ 169,6; 152,0; 145,2; 136,3; 131,0; 130,9; 125,8; 83,7; 82,4; 80,9; 61,0; 35,6; 28,2;

28,0; 25,1; 25,0. HRMS (ESI+) [M+H]+ berechnet für C29H47BNO8+: 548,33879; gefunden:

74 4 Material und Methoden

548,33892; [M–Boc+H]+ berechnet für C24H39BNO6+: 448,28649; gefunden: 448,28634. Elemen-

taranalyse berechnet für C29H46BNO8: C: 63,62 %; H: 8,47 %; N: 2,56 %; gefunden: C: 63,8 ± <

0,1 %; H: 8,49 ± 0,15 %; N: 2,57 ± < 0,01 %.

22 - Tetrakispyridinkupfer(II)triflat

Das Präparat 22 wurde gemäß der Literatur hergestellt.[138] Kupfer(II)triflat (2,00 g; 5,53 mmol)

wurde in, im Rückfluss kochenden, 11 mL MeOH gelöst. Tropfenweise wurde Pyridin (10 mL)

zugegeben und die Reaktionsmischung färbte sich tief blau. Die Reaktionsmischung wurde für

weitere 30 min bei Siedetemperatur erhitzt und dann die Lösungsmittel in vacuo entfernt. Das Pro-

dukt wurde aus einer Lösung von Pyridin in Methanol (1:4 v/v) umkristallisiert. 3,00 g (80 %) des

Produktes 22 wurden als blaue Kristalle erhalten.

Elementaranalyse berechnet für C22H20CuF6N4O6S2: C: 39,0 %; H: 2,97 %; N: 8,26 %; gefunden:

C: 39,0 % ± < 0,1 %; H: 3,18 % ± 0,02 %; N: 8,30 % ± 0,03 %.

23 - tert-Butyl-(2-bromphenylethyl)carbamat

2-Bromphenylethylamin (2,00 g; 10,00 mmol) wurde in einen Rundkolben gege-

ben und Boc2O (2,80 g; 12,00 mmol; 1,2 Äq.) zugesetzt. Der Kolben wurde in

ein Ultraschallbad gestellt, welches auf 30 °C erwärmt wurde und dann für 20 min mit Ultraschall

behandelt. Danach wurde die Reaktion in vacuo eingeengt und durch Flash-Chromatographie gerei-

nigt (10 % EtOAc in n-Hexan). Verbindung 23 (3,00 g; > 99 %) wurde als klares Öl dargestellt, das

über Nacht auskristallisierte.

Rf: 0,5 (20 % EtOAc in n-Hexan). Smp.: 71-72 °C. 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,55 – 7,51 (m;

1H); 7,26 – 7,19 (m; 2H); 7,11 – 7,06 (m; 1H); 4,59 (br; 1H); 3,49 – 3,22 (m; 2H); 2,94 (t; J = 6,9

Hz; 2H); 1,43 (s; 9H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3) δ 156,0; 138,5; 133,0; 131,2; 128,3; 127,7; 124,8;

79,4; 40,4; 36,5; 28,5. HRMS (ESI+) [M+Na]+ berechnet für C13H18O2NBrNa+: 322,04131; gefun-

den: 322,04153; [M+Na]+ berechnet für C13H18O2N81BrNa+: 324,03927; gefunden: 324,03948. Ele-

mentaranalyse berechnet für C13H18BrNO2: C: 52,01 %; H: 6,04 %; N: 4,67 %; gefunden: C: 52,2 %

± 0,11 %; H: 5,9 % ± 0,02 %; N: 4,76 % ± 0,02 %.

24 - tert-Butyl-(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenylethyl)carbamat

B2pin2 (1,90 g; 7,50 mmol; 1,5 Äq.), Pd(dppf)Cl2 (0,37 g; 0,50 mmol; 0,1 Äq.) und

KOAc (1,47 g; 15,00 mmol; 3 Äq.) wurden in vacuo getrocknet. Verbindung 23

(1,50 g; 5,00 mmol) wurde in 10 mL DMF (wasserfrei) gelöst und unter

Schutzgasbedingungen hinzugefügt. Dann wurde die Reaktionsmischung für 2 h

bei 110 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser gequenched und mit 40 mL Et2O

versetzt. Die Mischung wurde zweimal mit 1 M NaOH(aq), jeweils einmal mit Wasser und gesättigter

NaCl(aq) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und mittels Flash-

Chromatographie (10 % EtOAc in n-Hexan) und RP-Flash-Chromatographie (90 % MeCN(aq))

gereinigt. Das Produkt 24 (1,13 g; 65 %) wurde als schwach gelbes Öl gewonnen, das über Nacht

auskristallisierte.

4 Material und Methoden 75

Rf: 0,6 (20 % EtOAc in n-Hexan). Smp.: 75 °C. 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,81 (dd; J = 7,4;

1,1 Hz; 1H); 7,38 (td; J = 7,5; 1,5 Hz; 1H); 7,24 – 7,17 (m; 2H); 5,00 (br; 1H); 3,45 – 3,28 (m; 2H);

3,04 (t; J = 6,6 Hz; 2H); 1,39 (s; 9H); 1,36 (s; 12H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3; Car-B konnte nicht

lokalisiert werden) δ 156,1; 146,3; 136,4; 131,4; 130,0; 125,8; 83,9; 78,9; 43,2; 35,5; 28,5; 25,0. HRMS

(ESI+) [M+H]+ berechnet für C19H31O4NB+: 348,23407; gefunden: 348,23459; [M+Na]+ berechnet

für C19H30O4NBNa+: 370,21601; gefunden: 370,21642. Elementaranalyse berechnet für

C19H30BNO4: C: 65,72 %; H: 8,71 %; N: 4,03 %; gefunden: C: 65,6 % ± < 0,1 %; H: 8,5 % ±

0,03 %; N: 4,11 % ± 0,03 %.

25 - Di-tert-butyl(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenylethyl)imiddicarbonat

Verbindung 24 (0,50 g; 1,44 mmol), Boc2O (0,94 g; 4,32 mmol; 3 Äq.),

4-DMAP (0,04 g; 0,29 mmol; 0,2 Äq.) und Et3N (0,60 mL; 4,32 mmol; 3 Äq.)

wurden in 10 mL MeCN gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde für 24 h bei

Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und mit

40 mL n-Hexan versetzt. Die organische Phase wurde mit gesättigter NH4Cl(aq), Wasser und

gesättigter NaCl(aq) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und durch

Flash-Chromatographie (10 % EtOAc in n-Hexan) gereinigt. Verbindung 25 (0,50 g; 78 %) wurde

als klares Öl gewonnen, das über Nacht auskristallisierte.

Rf: 0,7 (20 % EtOAc in n-Hexan). Smp.: 70 °C. 1H NMR (600 MHz; CDCl3) δ 7,79 (dd; J = 7,4;

1,3 Hz; 1H); 7,31 (td; J = 7,5; 1,5 Hz; 1H); 7,19 (td; J = 7,4; 1,1 Hz; 1H); 7,12 (d; J = 7,6 Hz; 1H);

3,87 (t; J = 6,7 Hz; 2H); 3,17 (t; J = 6,7 Hz; 2H); 1,40 (s; 18H); 1,34 (s; 12H). 13C NMR (151 MHz;

CDCl3; Car-B nicht gefunden) δ 152,5; 146,1; 136,4; 131,0; 130,2; 125,6; 83,6; 81,8; 48,2; 35,1; 28,1;

25,00. HRMS (ESI+) nicht gefunden. Elementaranalyse berechnet für C24H38BNO6: C: 64,43 %; H:

8,56 %; N: 3,13 %; gefunden: C: 64,3 % ± 0,14 %; H: 8,36 % ± 0,04 %; N: 3,00 % ± 0,04 %.

26 - tert-Butyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(3-((tert-butoxycarbonyl)oxy)phenyl)

propionat

Das Präparat 26 wurde gemäß der Literatur hergestellt.[77] 70 %

Perchlorsäure(aq) (0,5 mL; 8,3 mmol) wurde zu einer eisgekühlten Sus-

pension aus meta-L-Tyrosin (0,95 g; 5,24 mmol) und tert-Butylacetat

(11 mL) tropfenweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt

und für 4 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mehrfach mit Wasser und 1 M HCl(aq) extrahiert.

Der pH-Wert der wässrigen Phase wurde mit K2CO3(aq) auf 9 eingestellt und die Phase dreimal mit

DCM extrahiert. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im

Unterdruck entfernt. Das Rohprodukt wurde für die nächste Stufe ohne weitere Reinigung ver-

wendet.

Das Rohprodukt wurde in 4 mL DMF gelöst und mit Et3N (2,3 mL; 16,5 mmol) und Boc2O

(3,00 g; 13,75 mmol) versetzt. Danach wurde die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtempe-

ratur gerührt. Am folgenden Morgen wurden 50 mL Et2O hinzugegeben und alles mit gesättigter

NH4Cl(aq), Wasser und gesättigter NaCl(aq) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4

76 4 Material und Methoden

getrocknet und mittels Flash-Chromatographie (10 % EtOAc in n-Hexan) gereinigt. 1,32 g (58 %)

der Verbindung 26 wurden als klares Öl dargestellt.

Rf: 0,2 (10 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R] sind im Verhältnis

von 8:2 sichtbar) δ 7,28 (t; J = 7,9 Hz; 1H); 7,04 (d; J = 7,8 Hz; 1H); 6,99 (s; 1H); 5,00 (d; J = 7,6

Hz; 1H); 4,74 (s; 1H; [R]); 4,44 (dd; J = 13,2; 6,1 Hz; 1H); 4,25 (s; 1H; [R]); 3,13 – 2,92 (m; 2H);

1,55 (s; 9H); 1,42 (s; 9H); 1,39 (s; 9H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3) δ 170,9; 155,2; 151,9; 151,2;

138,3; 129,3; 127,0; 122,5; 119,9; 83,6; 82,4; 79,9; 54,8; 38,4; 28,5; 28,1; 27,8. HRMS (ESI+) [M+H]+

berechnet für C23H36NO7+: 438,24863; gefunden: 438,24877; [M+Na]+ berechnet für

C23H35NNaO7+: 460,23057; gefunden: 460,23081.

27 - tert-Butyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(5-((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-

iodphenyl)propionat

Verbindung 26 (1,32 g; 3,02 mmol) wurde in 15 mL DCM gelöst und

auf 0 °C abgekühlt. [Bis(trifluoracetoxy)iod]benzol (BTI; 1,07 g;

2,49 mmol; 0,83 Äq.) und Iod (0,57 g; 2,26 mmol; 0,75 Äq.) wurden

hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für 15 min bei 0 °C gerührt. Anschließend wurde die Re-

aktion auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 3 h gerührt. Danach wurde die Reaktion mit

Na2S2O3(aq) bis zur Entfärbung gequencht. Das DCM wurde in vacuo entfernt und n-Hexan zuge-

setzt. Die organische Phase wurde mit Na2S2O3(aq), Wasser und gesättigter NaCl(aq) gewaschen. Die

organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und durch Flash-Chromatographie (10 % EtOAc

in n-Hexan) gereinigt. 1,37 g (81 %) des Produktes 27 wurden als schwach gelbliches Öl dargestellt.

Rf: 0,2 (10 % EtOAc in n-Hexan). Smp.: 103 °C. 1H NMR (600 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R] sind

im Verhältnis von 8:2 sichtbar) δ 7,80 (d; J = 8,6 Hz; 1H); 7,07 (d; J = 2,5 Hz; 1H); 6,88 – 6,73 (m;

1H); 5,04 (d; J = 8,4 Hz; 0,8H); 4,84 (br; 0,2H; [R]); 4,53 (dd; J = 14,6; 8,3 Hz; 0,8H); 4,41 (br;

0,2H; [R]); 3,22 (dd; J = 14,0; 6,0 Hz; 1H); 3,03 (dd; J = 13,9; 8,7 Hz; 0,8H); 2,89 (br; 0,2H; [R]);

1,54 (s; 9H); 1,41; 1,38 (2s; 18H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3) δ 170,9; 155,1; 151,4; 151,4; 141,4;

140,2; 123,5; 121,8; 96,7; 84,0; 82,4; 79,9; 54,0; 43,7; 28,4; 28,1; 27,8. HRMS (ESI+) [M+H]+ be-

rechnet für C23H35INO7+: 564,14527; gefunden: 564,14527; [M+Na]+ berechnet für C23H35IN-

NaO7+: 586,12722; gefunden: 586,12722; [M+K]+ berechnet für C23H35INKO7

+: 602,10115; gefun-

den: 602,10115, Elementaranalyse berechnet für C23H34INO7: C: 49,03 %; H: 6,07 %; N: 2,49 %;

gefunden: C: 48,7 % ± < 0,1 %; H: 5,88 % ± 0,02 %; N: 2,54 % ± < 0,04 %.

4 Material und Methoden 77

28 - tert-Butyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(5-((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-

(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenyl)propionat

B2pin2 (0,28 g; 1,12 mmol; 1,5 Äq.), Pd(dppf)Cl2 (0,05 g; 0,07 mmol;

0,1 Äq.) und KOAc (0,22 g; 2,24 mmol; 3 Äq.) wurden im Unterdruck

getrocknet. 27 (0,42 g; 0,75 mmol) wurde in 10 mL DMF (wasserfrei)

unter Schutzgasbedingungen gelöst und zu den getrockneten Chemi-

kalien hinzugefügt. Dann wurde die Reaktionsmischung für 2 h bei

110 °C gerührt. Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser gequencht

und mit 40 mL Et2O versetzt. Die Mischung wurde zweimal mit 1 M NaOH(aq), jeweils einmal mit

Wasser und gesättigter NaCl(aq) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet

und mittels Flash-Chromatographie (0 → 10 % EtOAc in n-Hexan) und RP-Flash-Chromatogra-

phie (80 % MeCN(aq)) gereinigt. Das Produkt 28 (0,17 g; 40 %) wurde als klares Öl hergestellt.

Rf: 0,1 (10 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz; CDCl3; 2 Rotamere [R] sind im Verhältnis

von 8:2 sichtbar) δ 7,82 (d; J = 8,2 Hz; 1H); 7,13 – 7,01 (m; 2H); 5,78 (d; J = 8,2 Hz; 0,8H); 5,46

(br; 0,2H; [R]); 4,28 – 4,18 (m; 0,8H); 4,18 – 4,10 (br; 0,2 H); 3,28 – 3,11 (m; 2H); 1,55 (s; 9H); 1,47

(2s; 9H); 1,36 (2s; 12H); 1,29 (2s; 9H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3) δ 172,0; 155,6; 153,5; 151,5;

146,1; 137,7; 122,8; 119,0; 84,2; 83,7; 81,4; 79,2; 56,8; 37,3; 28,4; 28,1; 27,9; 25,2; 24,8. HRMS (ESI+)

[M+Na]+ berechnet für C29H46BNNaO9+: 586,31578; gefunden: 586,31639; [M+K]+ berechnet für

C29H46BNKO9+: 602,28972; gefunden: 602,29057.

29 - tert-Butyl-(S)-2-(bis(tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(5-((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-

(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenyl)propionat

Verbindung 28 (0,16 g; 0,28 mmol), Boc2O (0,62 g; 2,84 mmol;

10 Äq.) und 4-DMAP (0,04 g; 0,34 mmol; 1,2 Äq.) wurden in 5 mL

MeCN gelöst und über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde in

vacuo entfernt und 40 mL n-Hexan zugesetzt. Die organische Phase

wurde mit gesättigter NH4Cl(aq), Wasser und gesättigter NaCl(aq) gewa-

schen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und durch Flash-Chromatographie

(10 % EtOAc in n-Hexan) gereinigt. Der fertige Vorläufer 29 (0,12 g; 65 %) wurde als klares Öl

hergestellt.

Rf: 0,3 (10 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (400 MHz; CDCl3) δ 7,78 (d; J = 8,2 Hz; 1H); 7,01

(dd; J = 8,2; 2,3 Hz; 1H); 6,87 (d; J = 2,3 Hz; 1H); 5,26 (dd; J = 11,1; 4,1 Hz; 1H); 3,96 (dd; J =

13,5; 4,1 Hz; 1H); 3,13 (dd; J = 13,5; 11,2 Hz; 1H); 1,53 (s; 9H); 1,49 (s; 9H); 1,35 (s; 18H); 1,34 –

1,32 (m; 12H). 13C NMR (101 MHz; CDCl3) δ 169,5; 153,2; 152,3; 151,4; 147,3; 137,6; 123,4; 118,4;

83,7; 83,4; 82,4; 81,0; 60,4; 35,7; 28,2; 28,0; 27,8; 25,1; 25,0. HRMS (ESI+) [M+Na]+ berechnet für

C34H54BNNaO11+: 686,36876; gefunden: 686,36821; [M+K]+ berechnet für C34H54BKNO11

+:

702,34270; gefunden: 702,34216.

78 4 Material und Methoden

30 – Methyl-(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(3-((tert-butoxycarbonyl)oxy)-5-

(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenyl)propionat

Die Verbindung 30 wurde als gereinigtes Rohprodukt von Herrn PD Dr.

Zlatopolskiy synthetisiert und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.

Das Rohprodukt wurde zusätzlich durch RP-Flash-Chromatographie

(80 → 100 % MeCN(aq)) gereinigt.

Rf: 0,4 (20 % EtOAc in n-Hexan). 1H NMR (600 MHz; CDCl3; 2 Rota-

mere [R] sind im Verhältnis von 8:2 sichtbar) δ 7,47 (s; 1H); 7,43 (s; 1H); 7,00 (s; 1H); 5,15 (d; J =

8,2 Hz; 0,2H; [R]); 4,99 (d; J = 7,9 Hz; 0,8H); 4,66 – 4,59 (m; 0,2H; [R]); 4,59 – 4,50 (m; 0,8H); 3,72

(2s; 3H); 3,16 – 3,03 (m; 2H); 1,55 (s; 9H); 1,42 (s; 9H); 1,32 (s; 12H). 13C NMR (151 MHz; CDCl3;

Car-B konnte nicht lokalisiert werden) δ 172,3; 155,2; 152,1; 150,9; 137,2; 133,4; 126,0; 125,2; 84,3;

83,5; 80,1; 54,6; 52,4; 38,0; 28,4; 27,9; 25,1; 25,0. HRMS (ESI+) [M+Na]+ berechnet für

C26H40BNNaO9+: 544,26883; gefunden: 544,26878; [M+H]+ berechnet für C26H41BNO9

+:

522,28689; gefunden: 522,28712.

31 - 2-Amino-3-(2-fluor-5-hydroxyphenyl)propansäure

Die Verbindung 31 wurde von Herrn PD Dr. Zlatopolskiy synthetisiert

und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.

1H NMR (600 MHz; D2O) δ 7,08 (t; J = 9,3 Hz; 1H); 6,88 – 6,76 (m; 2H);

4,01 (dd; J = 7,9; 5,5 Hz; 1H); 3,31 (dd; J = 14,6; 5,3 Hz; 1H); 3,09 (dd; J = 14,6; 7,9 Hz; 1H). 13C

NMR (151 MHz; D2O) δ 173,51 (s; J = 2612,3 Hz); 153,15 (d; J = 448,3 Hz); 122,89 (d; J = 17,7

Hz); 117,68 (d; J = 4,1 Hz); 116,39 (d; J = 23,9 Hz); 115,97 (d; J = 8,3 Hz); 55,1; 33,2. 19F NMR

(188 MHz; CDCl3) δ -129,1. HRMS (ESI+) [M+H]+ berechnet für C9H11FNO3+: 200,07175; gefun-

den: 200,07176.

32 - 2-Amino-3-(3-fluor-5-hydroxyphenyl)propansäure

Die Verbindung 32 wurde von Herrn PD Dr. Zlatopolskiy synthetisiert

und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.

1H NMR (600 MHz; D2O) δ 5,89 – 5,81 (m; 3H); 3,61 (dd; J = 7,5; 5,8 Hz;

1H); 2,46 (ddd; J = 22,2; 14,6; 6,6 Hz; 2H). 13C NMR (151 MHz; D2O) δ

163,0 (d; J = 243,6 Hz); 156,9 (d; J = 12,3 Hz); 136,5 (d; J = 10,0 Hz); 111,9 (d; J = 9,9 Hz); 107,7

(dd; J = 22,1; 9,8 Hz); 102,1 (dd; J = 24,4; 12,9 Hz); 53,2 (d; J = 53,2 Hz). 19F NMR (565 MHz;

D2O) δ -112,2. HRMS (ESI+) [M+H]+ berechnet für C9H11FNO3+: 200,07175; gefunden:

200,07169.

4 Material und Methoden 79

4.3 Radiochemie

4.3.1 Relevante Definitionen

Elution

Die Elution bezeichnet in der Chromatografie den chemischen Vorgang des Auswaschens. Also

das Herauslösen aus einer festen Phase von bestimmten Stoffen unter Zuhilfenahme einer mobilen

Phase (Lösungsmittels).

In der Chemie mit Fluor-18 bezieht sich die Elution auf den ersten Fixierungsschritt des [18F]Flu-

orids auf einer Anionenaustauscherphase und die darauf folgende Elution. In dieser Arbeit wurde

zur Bestimmung der Wiederfindungsrate des [18F]Fluorids in diesem Schritt zunächst die Startakti-

vität in einem Mikroreaktionsgefäß (Eppendorf) gemessen. Dann wurde die Radioaktivität auf der

Phase fixiert und eluiert (detaillierte Beschreibungen sind der Synthesevorschrift zu entnehmen).

Die Radioaktivität des Eluats wurde dann bestimmt und nach Zerfallskorrektur mit der Startakti-

vität verglichen.

Radiochemische Ausbeute (RCA)

Die Ausbeute an radioaktiv markiertem, isoliertem, über die Reaktionszeit zerfallskorrigiertem Pro-

dukt bezogen auf die Gesamtaktivität am Anfang der Synthese (engl. „The ratio of the activity of a

specified radionuclide of a specified element after its radiochemical separation and its activity originally present in the

substance undergoing the radiochemical separation.“ [9]).

Enantiomerenüberschuss

Der Enantiomerenüberschuss (ee) gibt den Überschuss eines Enantiomers (mL) in einem Enantio-

merengemisch (mL + mD) an.

𝑒𝑒 =|𝑚𝐿 − 𝑚𝐷|

(𝑚𝐿 + 𝑚𝐷)

80 4 Material und Methoden

4.3.2 Radio-DC

Diagramm 11: Beispiel-DC-Chromatogramm einer 18F-Verbindung

2–3 μL der gequenchten Reaktionsmischung wurden auf eine DC-Platte (Silica gel on TLC Al foils,

Sigma Aldrich, Taufkirchen) aufgetragen. Die Platte wurde getrocknet und mit einem Laufmittel

entwickelt. Das Laufmittelgemisch wurde dabei so eingestellt, dass das 18F-markierte Produkt un-

gefähr einen Rf-Wert von 0,5 ergibt. Die chromatographische Verteilung der Radioaktivität auf

DC-Platte wurde auf einer Raytest Minigita (Raytest, Straubenhardt, Deutschland) gemessen (Dia-

gramm 11).

4.3.3 Radio-HPLC

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Separationen und Analytik wurden mit einer

Knauer-Pumpe, einem Knauer K-2500 UV/VIS Detektor (Knauer, Berlin, Deutschland), einem

manuellen Rheodyne Injektor (20 µL Probenschleife) und einem NaI (Tl) Szintillationsdetektor

(EG&G Ortec; Modell 276 Photomultiplier Base) mit einem ACE Mate Verstärker und BIAS (Or-

tec Ametek, Meerbusch, Germany) zur Radioaktivitätsdetektion. Die Datenerfassung und

-interpretation wurde mit Gina Software (Raytest) durchgeführt. Die Totzeit des HPLC-Systems

wurde mit Thioharnstoff gemessen.

Die HPLC-Ventile im Falle der analytischen HPLC-Anlage waren wie in Schema 57 aufgebaut.

Durch diese Anordnung war es möglich, eine Probe zu injizieren, ohne die Säule zu passieren, was

am Ende der Messung erfolgte. Mit Hilfe dieser Technik wurden die radiochemische Ausbeute und

die radiochemische Reinheit berechnet, durch die Teilung der Peak-Fläche des Produkts und die

Peak-Fläche der Referenz (Ref).

F Z - J ü l i c hD a t e i : 1 5 1 0 2 0 .5 M e t h o d e : F L OU R D a t u m : 2 0 . 1 0 . 2 0 1 5 Z e i t : 1 0 : 0 2 : 2 2 Z ä h l z e i t : 6 0 0 s G l ä t t u n g s k o n s t a n t e : 0 . 0 m m H V : 1 5 6 0 V L L : 5 k e V U L : 2 5 0 k e VA u f t r a g s p u n k t : 0 . 0 m m L ö s u n g s m i t t e l f ro n t : 8 0 . 0 m m

m m0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0 3 0 . 0 4 0 . 0 5 0 . 0 6 0 . 0 7 0 . 0 8 0 . 0 9 0 . 0 1 0 0 . 0

Cnt

s

0 . 0

1 0 0 . 0

2 0 0 . 0

3 0 0 . 0

4 0 0 . 0

4 Material und Methoden 81

Schema 57: Aufbau des HPLC-Systems

Diagramm 12: 2-[18F]FPhe; Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm); 6 % EtOH(aq) + 0,1 % TFA

(1,0 mL/min); Aktivkanal; 20 µL Probenschleife

Zur Identifizierung der radioaktiven Tracer wird die HPLC benutzt, da die Stoffmengen des Tra-

cers für eine chemische Analyse mittels NMR-Spektroskopie oder MS-Spektrometrie nicht ausrei-

chen würden. Durch den Vergleich der Retentionszeiten (bzw. k-Werte) erhält man eine Eingren-

zung, um welche Verbindung es sich dabei handelt. Die Berechnung von k wird durch die nach-

folgende Formel beschrieben, dabei werden zwei gemessene Retentionszeiten gebraucht. Zum ei-

nen die Retentionszeit der gesuchten Verbindung (tR) und die Totzeit des HPLC-Systems (t0). Die

Totzeit beschreibt die Zeit, die die Flüssigkeit von der Injektion bis zur Detektion braucht, und

kann annähernd mit Thioharnstoff bestimmt werden.[131]

𝑘 = 𝑡0

(𝑡𝑅 − 𝑡0)

Durch eine Co-Injektion (Mischung des Tracers mit der Referenz, Diagramm 13 − Diagramm 16)

kann die Sicherheit der Identifikation weiter erhöht werden. Alle isolierten Tracer wurden zusätz-

lich mit einer zweiten, Phasen-unabhängigen HPLC-Säule untersucht. Durch die Identifizierung

über zwei Phasen-unabhängige HPLC-Säulen wird das Risiko einer falschen Identifikation noch

einmal gesenkt.

Integration C:\GINA_NT\DM\ERMERT1\SEP2\170427.04

00"00 10'00 20'00 30'00 min

Ch2

00"00 10'00 20'00 30'00 min

0,00

2,00

4,00 cps *1000

2-[18F]FPhe

Ref

00"00 10'00 20'00 30'00 min

UV2

00"00 10'00 20'00 30'00 min

-2,0

0,0

2,0

mV

Phe

2-FPhe

82 4 Material und Methoden

Diagramm 13: 2-[18F]FPhe; Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm); 6 % EtOH(aq) + 0,1 % TFA

(1,0 mL/min); 210 nm; 20 µL Probenschleife

Diagramm 14: 2-[18F]FPhe + Ref.; Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm); 6 % EtOH(aq) + 0,1 % TFA

(1,0 mL/min); 210 nm; 20 µL Probenschleife

Integration C:\GINA_NT\DM\ERMERT1\SEP2\170427.04

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

Ch2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

0,00

1,00

cps *1000

2-[18F]FPhe

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

UV2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

-2,0

0,0

2,0mV

2-FPhe

Integration C:\GINA_NT\DM\ERMERT1\SEP2\170427.06

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

Ch2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

0,00

0,50

1,00

cps *1000

2-[18F]FPhe

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

UV2

00"00 05'00 10'00 15'00 20'00 25'00 min

0

2

4

6

8

10 mV

2-FPhe

4 Material und Methoden 83

Diagramm 15: 2-[18F]F-L-Phe; Crownpak (+) (4,6x150 mm); 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min); 210 nm;

20 µL Probenschleife

Diagramm 16: 2-[18F]F-L-Phe + Ref.; Crownpak (+) (4,6x150 mm); 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min);

210 nm; 20 µL Probenschleife

Integration C:\GINA_NT\DM\ERMERT1\SEP2\170427.08

00"00 05'00 10'00 15'00 min

Ch2

00"00 05'00 10'00 15'00 min

0

200

400

cps

2-[18F]F-L-Phe

00"00 05'00 10'00 15'00 min

UV2

00"00 05'00 10'00 15'00 min

0,00

mV

Integration C:\GINA_NT\DM\ERMERT1\SEP2\170427.07

00"00 05'00 10'00 15'00 min

Ch2

00"00 05'00 10'00 15'00 min

0,00

0,50

1,00 cps *1000

2-[18F]F-L-Phe

00"00 05'00 10'00 15'00 min

UV2

00"00 05'00 10'00 15'00 min

0,0

5,0

mV

2-F-D-Phe

2-F-L-Phe

84 4 Material und Methoden

Tabelle 11: Auflistung der Referenzverbindungen mit ihrer HPLC-Analytik

Verbindung k Säule Laufmittel

6-FDOPA 1,3 Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm) 0,1 % Essigsäure(aq) (1,0 mL/min)

D-6-FDOPA 1,9 Crownpak (+) 5 µm (4,0x150 mm) 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min)

L-6-FDOPA 3,2 Crownpak (+) 5 µm (4,0x150 mm) 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min)

9 1,1 Gemini 5 µm C18 110 Å (4,6x250 mm) 85 % MeCN(aq) (1,0 mL/min)

FMes 1,4 Gemini 5 µm C18 110 Å (4,6x250 mm) 85 % MeCN(aq) (1,0 mL/min)

10 2,6 Gemini 5 µm C18 110 Å (4,6x250 mm) 85 % MeCN(aq) (1,0 mL/min)

Phe 5,0 Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm) 6 % EtOH(aq) + 0,1 % TFA (1,0 mL/min)

2-FPhe 5,5 Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm) 6 % EtOH(aq) + 0,1 % TFA (1,0 mL/min)

2-F-D-Phe 1,2 Crownpak (+) 5 µm (4,0x150 mm) 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min)

2-F-L-Phe 2,1 Crownpak (+) 5 µm (4,0x150 mm) 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min)

4-FPhe 6,8 Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm) 6 % EtOH(aq) + 0,1 % TFA (1,0 mL/min)

4-F-D-Phe 1,6 Crownpak (+) 5 µm (4,0x150 mm) 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min)

4-F-L-Phe 2,3 Crownpak (+) 5 µm (4,0x150 mm) 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min)

4-Fluoranisol 2,6 Gemini 5 µm C18 110 Å (4,6x250 mm) 85 % MeCN(aq) (1,0 mL/min)

2-FPEA 4,2 Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm) 10 % EtOH(aq) + 0,2 % TFA (1,0 mL/min)

2-FPEA 3,8 Luna 5 µm PFP(2) 100 Å (4,6x250 mm) 6 % EtOH(aq) + 0,1 % TFA (1,0 mL/min)

6-FMT 5,4 Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm) 4 % EtOH(aq) + 0,1 % TFA (1,0 mL/min)

D-6-FMT 2,2 Crownpak (+) 5 µm (4,0x150 mm) 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min)

L-6-FMT 3,8 Crownpak (+) 5 µm (4,0x150 mm) 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min)

5-FMT 4,2 Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm) 6 % EtOH(aq) + 0,1 % TFA (1,0 mL/min)

D-5-FMT 3,0 Crownpak (+) 5 µm (4,0x150 mm) 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min)

L-5-FMT 5,2 Crownpak (+) 5 µm (4,0x150 mm) 0,025 M HClO4(aq) (1,0 mL/min)

4 Material und Methoden 85

Für die Bestimmung der molaren Aktivität [μmol/GBq] wurde zunächst eine Verdünnungsreihe

mit der Referenzsubstanz im zu untersuchenden Konzentrationsbereich aufgenommen. Hierfür

wurde eine Stammlösung mit 2-Fluorphenylalanin angesetzt. Durch die lineare Korrelation der

Peakfläche zur Referenzkonzentration konnte dann die Konzentration des Trägers (nmol/mL) im

Produkt errechnet werden. Vom Produkt wurde eine Probe mit einem definierten Volumen (durch

eine Eppendorf Research plus), entnommen und dessen Aktivität bestimmt. Durch dieses Vorge-

hen konnte die Aktivitätskonzentration (MBq/mL) berechnet werden. Durch die Konzentration

des Trägers und die Aktivitätskonzentration konnte dann die molare Aktivität (zum Zeitpunkt des

Syntheseendes) berechnet werden.

Für den Fall, dass die Konzentration des Trägers den definierten Bereich der Verdünnungsreihe

unterschritt, wurde die Probe bei 80 °C im Unterdruck aufkonzentriert. Der aufkonzentrierten

Probe wurde dann erneut ein definiertes Volumen (durch eine Eppendorf Research plus) entnom-

men und erneut die Aktivitätskonzentration bestimmt. Durch den Vergleich der beiden ermittelten

Aktivitätskonzentrationen wurde ein Faktor bestimmt. Durch diesen konnte dann später auf die

Konzentration des Trägers im Produkt zurückgerechnet werden. Bei den Aufkonzentrationen

konnte keine Veränderung der radiochemische Reinheit festgestellt werden, somit konnte eine Zer-

setzung des Tracers ausgeschlossen werden.

Diagramm 17: Verdünnungsreihe für 2-FPhe und einem 2-[18F]FPhe Produkt

0 mVs

1 mVs

2 mVs

3 mVs

4 mVs

5 mVs

6 mVs

7 mVs

8 mVs

9 mVs

10 mVs

86 4 Material und Methoden

4.3.4 Herstellung von Fluor-18

Die Produktion von wässrigem [18F]Fluorid erfolgte am Babyzyklotron BC 1710 (JSW) im Institut für

Neurowissenschaften und Medizin INM-5: Nuklearchemie der Forschungszentrum Jülich GmbH. Das

Fluor-18 wurde über eine protoneninduzierte 18O(p,n)18F Kernreaktion an einem Flüssigtarget mit

hoch angereichertem [18O]H2O in einem Titantarget hergestellt.

4.3.5 18F-Radiomarkierung unter der Verwendung von Iodoniumsalzen (Kapitel 3.1)

Allgemeines Vorgehen

[18F]F– (150–350 MBq, für die Optimierung wurden ca. 20 MBq verwendet) in [18O]H2O wurde mit

1 mL MeOH verdünnt und von der männlichen Seite auf die QMA geladen (Sep-Pak Accell Plus

QMA Carbonate Plus Light Cartridge, 46 mg, Waters). 1 mL MeOH wurde zusätzlich von der

männlichen Seite durch die QMA gespült, um verbleibendes Wasser auf der Kartusche zu entfer-

nen. Das [18F]Fluorid wurde von der weiblichen Seite mit Et4NHCO3 (low-base: 5 µmol in 1 mL

MeOH) oder Vorläufer (minimalistisch: 10 µmol Vorläufer in 0,5 mL MeOH) in die Reaktorgefäß

eluiert, anschließend wurde die QMA mit 1 mL MeOH in den Reaktor nachgespült. Der Reaktor

wurde auf 80 °C erhitzt und das MeOH unter reduziertem Druck mit einem konstanten Fluss

(trockener) synthetischer Luft entfernt. Der Cu-Komplex ((MeCN)4Cu(I)OTf), bei low-base auch

der Vorläufer, wurde in 300 µL, wasserfreiem DMF (low-base: 20 µmol (MeCN)4Cu(I)OTf, mini-

malistisch: 20 µmol (MeCN)4Cu(I)OTf und 10 µmol Vorläufer) gelöst und für 20 min auf die ent-

sprechende Reaktionstemperatur erhitzt.

Bestimmung des RCA* zur Optimierung der Radiomarkierung

Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde die Reaktion mit 4 mL 50 % MeOH(aq) gequencht und für

30 sec. gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch entnommen und dessen Aktivität ge-

messen, ebenso die Aktivitätsmenge vom entleerten Reaktor (< 10 %). Eine kleine Fraktion wurde

in die HPLC injiziert (Gemini 5 µm C18 110 Å (4,6x250 mm); 85 % MeCN(aq) (1,0 mL/min);

210 nm; 20 µL Probenschleife). Nach 15 min wurde eine zweite Probe in die HPLC injiziert, jedoch

durch den Bypass, um eine Referenz ohne Radioaktivitätsabsorption auf der HPLC-Säule zu erhal-

ten.

Hydrolyse und Isolierung des Produktes

Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde der Reaktor mit 4 mL 50 % MeOH(aq) gequencht und 30 s

gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dem Reaktor entnommen und durch eine RP-Kartusche

geleitet (Strata-X 33 µm Polymeric Reversed Phase, 200 mg/3 mL, Phenomenex), der Reaktor

wurde mit 2 mL Wasser gespült, die ebenfalls durch die RP-Kartusche geleitet wurden. Die RP-

Kartusche wurde mit weiteren 4 mL Wasser gespült und mit 3 mL MeCN in einen zweiten Reaktor

eluiert. Das MeCN wurde in vacuo unter einem Strom von Argon entfernt. Es wurden 0,8 mL kon-

zentrierte HCl(aq) zugegeben und der Reaktor für 10 min auf 80 °C erhitzt. Anschließend wurde das

Reaktionsgemisch unter einem Strom von Argon auf ein Volumen von ca. 0,2−0,3 mL in vacuo

reduziert. Die Mischung wurde in eine HPLC-Spritze aufgezogen. Der Reaktor wurde mit weiteren

4 Material und Methoden 87

0,3 mL Wasser gespült. Das Reaktionsgemisch und die 0,3 mL der Reaktor-Spülung wurden mittels

HPLC (Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm); 2 % EtOH(aq) (1,0 mL/min); 210 nm; 5000 µL Pro-

benschleife) aufgereinigt.

4.3.6 18F-Fluorierung unter der Verwendung von Iodoniumsalzen (Kapitel 3.1.5)

Allgemeine Vorschrift

Die Radiofluorierungen wurden unter Schutzgasatmosphäre (Argon) ohne besondere Vorsichts-

maßnahmen durchgeführt, um Feuchtigkeit oder Luft auszuschließen.

Die entsprechende Menge an Radioaktivität (15−25 MBq [18F]F– in H2[18O]O, bei isolierten Tra-

cern wurden 200−300 MBq verwendet) wurde zu 1 mL reinem Wasser hinzugefügt. Diese Aktivität

wurde gemessen und das Wasser wurde von der „männlichen“ Seite durch eine QMA-Kartusche

(Sep-Pak Accell Plus QMA Carbonate Plus Light Cartridge, 46 mg, Waters) gesaugt und die Kar-

tusche für 5 min mit Argon gespült. Anschließend wurde 1 mL wasserfreies Methanol durch die

QMA geleitet und diese erneut für 2 min mit Argon gespült.

Die QMA wurde von der „weiblichen“ Seite mit 18 μmol Vorläufer, gelöst in 120 μL wasserfreiem

Methanol und 500 wasserfreiem DMF, in das Reaktionsgefäß eluiert. Die Radioaktivität im Reak-

tionsgefäß wurde gemessen und mit dem Ausgangspunkt verglichen (inkl. Zerfallskorrektur), um

die Wiederfindungsrate (Elution) zu berechnen. Das Reaktionsgefäß enthielt bereits 18 μmol

(MeCN)4Cu(I)OTf gelöst in 600 μL wasserfreiem DMF. Die Reaktion wurde für 20 min bei 85 °C

erhitzt.

Berechnung von RCA* mittels HPLC von 4-[18F]Fluoranisol

Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde die Reaktion mit 2 mL 20 % MeOH(aq) gequencht und 30 s

gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch in einer Spritze entnommen und deren Radi-

oaktivität gemessen. Die entnommene Radioaktivität wurde mit der im Reaktionsgefäß verbliebe-

nen Radioaktivität verglichen. In allen Fällen blieben weniger als 10 % ungelöst im Reaktionsgefäß.

Eine kleine Fraktion wurde dann in die HPLC injiziert (Gemini 5 µm C18 110 Å (4,6 x 250 mm); 50 % MeCN(aq) (1,0 mL/min); 210 nm; 20 µL Probenschleife). Nach 15 min wurde eine zweite

Probe in den HPLC-Bypass injiziert, um eine Referenz ohne Radioaktivitätsabsorption auf der

HPLC-Säule zu erhalten. Nach der Zerfallskorrektur wurde der Peak (inkl. Zerfallskorrektur) mit

dem Referenzpeak verglichen, um die nicht isolierte radiochemische Ausbeute (RCA*) zu berech-

nen.

RCA*-Bestimmung (DC), Hydrolyse und Isolierung von 2-[18F]FPhe und 4-[18F]FPhe

2−3 μL der wässrig gequenchten Reaktionsmischung wurden auf eine Silica-Platte (Silica-Gel auf

TLC-Al-Folien, Sigma Aldrich, Taufkirchen) aufgetragen. Die Platte wurde getrocknet und in eine

Kammer entwickelt, die mit 20 % Ethylacetat in n-Hexan gesättigt war.

88 4 Material und Methoden

Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde der Reaktor mit 4 mL 20 % MeOH(aq) gequencht und 30 s

gerührt. Die flüssige Fraktion im Reaktor wurde entnommen und durch eine RP-Kartusche (Strata-

X 33 µm Polymeric Reversed Phase, 200 mg/3 mL, Phenomenex) geleitet, der Reaktor wurde mit

2 mL Wasser gespült, welches ebenfalls durch die RP-Kartusche geleitet wurde. Die RP-Kartusche

wurde mit 4 mL Wasser gespült und mit 3 mL MeCN in einen zweiten Reaktor eluiert. Das Lö-

sungsmittel wurde in vacuo unter einem leichten Strom von Argon entfernt. Es wurden 0,8 mL

konz. HCl(aq) zugegeben und der Reaktor für 10 min auf 80 °C erhitzt. Anschließend wurde das

Reaktionsgemisch unter einem Strom von Argon auf ein Volumen von ca. 0,2−0,3 mL im Unter-

druck reduziert. Die Mischung wurde in eine HPLC-Spritze aufgezogen. Der Reaktor wurde zu-

sätzlich mit 0,3 mL Wasser gespült. Das Reaktionsgemisch und die 0,3 mL zum Spülen wurden

mittels HPLC (Hydro-RP (4,6x250 mm); 2 % EtOH(aq) (1,0 mL/min); 210 nm; 5000 µL Proben-

schleife) gereinigt. Die radiochemische Ausbeute wurde durch die Division der Radioaktivität des

isolierten Produktes durch die verdünnte Ausgangsradioaktivität (inkl. Zerfallskorrektur) berech-

net.

4.3.7 Radiosynthese n.c.a. 6-[18F]FDOPA (Kapitel 3.2.1)

Allgemeines Vorgehen

[18F]F– (150–350 MBq, für die Optimierung wurden ca. 20 MBq verwendet) in [18O]H2O wurde mit

500 μL Methanol verdünnt und über eine QMA-Kartusche gespült (Sep-Pak Accell Plus QMA

Carbonate Plus Light Cartridge, 46 mg, Waters). Das verbleibende Wasser wurde mit 1 mL MeOH

von der QMA entfernt. Die Radioaktivität wurde dann mit 1 mg Et4NHCO3 in 1 mL Methanol

eluiert. Das eluierte [18F]Fluorid wurde im Unterdruck bei 80 °C getrocknet. Zur Belüftung durch

das Septum des Reaktionsgefäßes eine Belüftungskanüle mit Filter gesteckt (Aeration cannula,

1,10x30 mm Braun).

Der Vorläufer 19 (10 mg, 13 µmol) und (py)4Cu(II)(OTf)2 (3,6 mg, 5 µmol) wurden in 300 μL tro-

ckenes DMF und 30 μL trockenes MeCN gelöst und bei der entsprechenden Temperatur zur Re-

aktion gebracht.

Bestimmung des RCA* zur Optimierung der Radiomarkierung

Für die Bestimmung des RCA* wurde die Reaktion mit 2 mL Wasser gequencht und ein Aliquot

(1−2 µL) auf eine DC-Platte aufgebracht. Die Platte wurde getrocknet und in einer gesättigten DC-

Kammer (20 % EtOAc in n-Hexan) entwickelt.

Hydrolyse und Isolierung des Produktes

Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 5 mL Diethylether versetzt.

Die gequencht Reaktion wurde über eine Silikakartusche in ein neues Reaktionsgefäß geleitet. Das

Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und 1 mL konz. HCl(aq) hinzugegeben. Die Verbindung

wurde bei 80 °C für 10 min hydrolysiert und dann durch semi-präparative HPLC (Hamilton PRP-

C18 (10x250 mm); 0,05 M HCl(aq) (3,0 ml/min); 200 nm; 5000 µL Probenschleife) gereinigt. Dem

4 Material und Methoden 89

aufgefangenen Peak-Schnitt wurden dann zur pH-Wert Regulierung 0,5 mL einer Natriumacetat-

Lösung (49,2 mg NaOAc in 0,5 mL Wasser) hinzugegeben.

4.3.8 18F-Fluorierung unter der Verwendung von Boronsäurepinakolestern

(Kapitel 3.2.2)

Allgemeine Vorschrift

[18F]F– (150−350 MBq) in [18O]H2O wurde mit 1 mL MeOH verdünnt und von der männlichen

Seite auf die QMA geladen (Sep-Pak Accell Plus QMA Carbonate Plus Light Cartridge, 46 mg,

Waters). 1 mL MeOH wurde zusätzlich von der männlichen Seite durch die QMA gespült, um

verbleibendes Wasser auf der Kartusche zu entfernen. Das [18F]Fluorid wurde von der weiblichen

Seite mit Et4NHCO3 (4 µmol in 0,8 mL MeOH) in das Reaktorgefäß eluiert, anschließend wurde

die QMA mit 1 mL MeOH in den Reaktor nachgespült. Der Reaktor wurde auf 80 °C erhitzt und

das MeOH unter reduziertem Druck mit einem konstanten Fluss (trockener) synthetischer Luft

entfernt.

Gleichzeitig wurden Vorläufer (10 μmol) und Kupfer(II)-Komplex (20 μmol (py)4Cu(II)(OTf)2) in

500 μL DMA und 250 μL n-Butanol gelöst zugegeben und für 20 min auf 110 °C im Reaktor zur

Reaktion gebracht. Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde der Reaktor mit 4 mL 20 %

MeOH(aq) gequencht und 30 s gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dem Reaktor entnommen und

durch eine RP-Kartusche (Strata-X 33 µm Polymeric Reversed Phase, 200 mg/3 mL, Pheno-

menex) geleitet, der Reaktor wurde mit 2 mL 20 % MeOH(aq) gespült, die ebenfalls durch die RP-

Kartusche geleitet wurden. Die RP-Kartusche wurde mit weiteren 4 mL Wasser gespült und mit

3 mL MeCN in einen zweiten Reaktor eluiert. Das MeCN wurde in vacuo unter einem Strom von

Argon entfernt.

Weiterführende Vorschrift für 2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT

Es wurden 0,8 mL konzentrierter HCl(aq) zugegeben und der Reaktor für 10 min auf 80 °C erhitzt.

Anschließend wurde das Reaktionsgemisch unter einem Strom von Argon auf ein Volumen von

ca. 0,2−0,3 mL in vacuo reduziert. Die Mischung wurde in eine HPLC-Spritze aufgezogen. Der

Reaktor wurde mit zusätzlichen 0,3 mL Wasser gespült. Das Reaktionsgemisch und die 0,3 mL der

Reaktor-Spülung wurden mittels HPLC (Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm); 2 % EtOH(aq)

(2-[18F]FPhe) bzw. 1 % EtOH(aq) (6-[18F]FMT) (1,0 mL/min); 210 nm; 5000 µL Probenschleife) ge-

reinigt. Nach der Abtrennung wurde dem Peak-Schnitt 350 µL Phosphatpuffer-Konzentrat

(20 mL, Zul.-Nr.: 6729712.00.00, B. Braun-Melsungen, in 100 mL Wasser) zugesetzt, um den pH-

Wert auf 7,0−7,5 einzustellen.

90 4 Material und Methoden

Weiterführende Vorschrift für 5-[18F]FMT

Der konzentrierte radiofluorierte Vorläufer wurde mit ca. 1 M NaOH in 80 % MeOH(aq)2 versetzt

und für 5 min auf 80 °C erhitzt. Die Lösungsmittel wurden in vacuo bei 80 °C entfernt und 1 mL

7 M HCl(aq) hinzugegeben und für weitere 10 min bei 80 °C hydrolysiert. Die Reaktion wurde bis

zum Ausfallen von NaCl eingedampft und mit einer geringen Menge Wasser in eine HPLC-Spritze

aufgenommen und der Reaktor mit 0,2 mL zusätzlichem Wasser ausgespült. Das Reaktionsgemisch

und die 0,2 mL der Reaktor-Spülung wurden mittels HPLC (Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm);

2 % EtOH(aq) (1,0 mL/min); 210 nm; 5000 µL Probenschleife) gereinigt. Nach der Abtrennung

wurde dem Peak-Schnitt 350 µL Phosphatpuffer-Konzentrat (20 mL, Zul.-Nr.: 6729712.00.00,

Braun, in 100 mL Wasser) zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,0−7,5 einzustellen.

Weiterführende Vorschrift für 2-[18F]FPEA

Der Reaktion wurde 1 mL, 6 M HCl(aq) hinzugefügt und für 10 min auf 80 °C für die Hydrolyse

erwärmt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit 10 mL, 1 M NaOH(aq) versetzt und über

eine RP-Kartusche geleitet (Strata-X 33 µm Polymeric Reversed Phase, 200 mg/3 mL, Pheno-

menex). Der Reaktor wurde mit 2 mL, 1 M NaOH(aq) ausgespült und über die Kartusche geleitet.

Durch 4 mL 0,01 M NaOH(aq) wurde die konzentrierte Base von der Kartusche gewaschen und das

Produkt dann mit 2,5 mL, 6 % Ethanol(aq) + 0,2 % Essigsäure von der Kartusche eluiert. Nach der

Abtrennung wurde dem Peak-Schnitt 350 µL Phosphatpuffer-Konzentrat (20 mL, Zul.-Nr.:

6729712.00.00, Braun, in 100 mL Wasser) zugesetzt, um den pH-Wert anzuheben.

Massenspektrometrie mit induktiv gekoppelter Plasmaionenquelle (ICP-MS) zur Kupfer-

Bestimmung

Die Bestimmung der Kupferkonzentration in der Tracer-Injektionslösung wurde in der Zentral-

analytik (ZEA-3) des Forschungszentrums Jülich durchgeführt.

2 Die Lösung hat je nach Temperatur ihre Sättigung überschritten. Die Konzentration der Lösung wird knapp unter 1

M NaOH in 80 % MeOH(aq) liegen.

4 Material und Methoden 91

Automatisierung der Radiosynthese von 2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT

Schema 58: Schematischer Aufbau der Syntheseapparatur für 2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT

Tabelle 12: Befüllung der Gefäße in der Apparatur (Schema 58)

Gefäß Befüllung

30 2 mL Methanol

31 1 mL Et4NHCO3 in Methanol (1 mg/mL)

32 15 µmol Vorläufer + 30 µmol (py)4Cu(II)(OTf)2

in 500 µL DMA und 250 µL n-Butanol

33 Synthetische Luft

34 4 mL 20 % Methanol(aq)

35 2 mL 20 % Methanol(aq)

37 4 mL Wasser

38 2,5 mL MeCN

40 1 mL 12 M HCl(aq)

41 300 µmol Wasser

49 300 µmol Phos.-Puffer-Konzentrat

Der Aufbau der Apparatur ist Schema 58 zu entnehmen. Die Gefäße wurden entsprechend der

Angaben in Tabelle 12 befüllt. An den entsprechenden Positionen (Schema 58) wurden eine QMA-

(Sep-Pak Accell Plus QMA Carbonate Plus Light Cartridge, 46 mg, Waters) und eine RP-Kartusche

(Strata-X 33 µm Polymeric Reversed Phase, 200 mg/3 mL, Phenomenex) nicht vorkonditioniert

eingebaut. Eine Hydro-RP HPLC Säule (Hydro-RP 4 µm 80 Å (4,6x250 mm)) wurde eingebaut

92 4 Material und Methoden

und mit dem entsprechenden Laufmittel (1 % bzw. 2 % EtOH(aq) (1,0 mL/min); 210 nm) einlaufen

gelassen.

Die Steuerung des Moduls erfolgte vollautomatisch nach einem programmierten Ablauf. Nach der

Überleitung in das entsprechende Auffanggefäß wurde das [18F]Fluorid im Targetwasser über die

QMA-Kartusche geleitet. Danach folgte die Spülung der QMA mit 2 mL Methanol aus Gefäß 30.

Die QMA wurde mit der Lösung aus Gefäß 31 in den Reaktor eluiert und das Methanol bei 80 °C

im Heliumstrom entfernt. Nach der Trocknung wurden Vorläufer und Kupferkomplex aus Gefäß

32 in den Reaktor 1 geleitet und der Reaktor mit synthetischer Luft gespült. Die Radiofluorierung

erfolgte dann bei 110 °C innerhalb von 20 min.

Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde das Reaktionsgemisch mit 4 mL 20 % Methanol(aq) (Gefäß

34) gequencht und über die RP-Kartusche geleitet. Der Reaktor 1 wurde mit weiteren 2 mL 20 %

Methanol(aq) (Gefäß 35) gespült und ebenfalls über die RP-Kartusche geleitet. Die Kartusche wurde

dann mit 4 mL Wasser gespült und mit 2,5 mL MeCN in Reaktor 2 eluiert. Das Lösungsmittel

wurde im Unterdruck bei 100 °C entfernt und das Konzentrat mit 1 mL HCl(aq) bei 80 °C innerhalb

von 10 min hydrolysiert. Das Reaktionsgemisch wurde im Unterdruck bei 100 °C auf 200−300 µL

konzentriert und ins Spritzengefäß überführt. Der Reaktor wurde mit weiteren 300 µL Wasser ge-

spült und ebenfalls ins Spritzengefäß geleitet.

Der Inhalt des Spritzengefäßes wurde in die Probenschleife der HPLC überführt und der Tracer

chromatographisch gereinigt. Der erhaltene Peakschnitt wurde im Endgefäß aufgefangen. In das

Endgefäß wurden noch 300 µL des Phos.-Puffer-Konzentrates geleitet, um den pH-Wert der Tra-

cer-Lösung einzustellen. Das Volumen der Tracer-Lösung betrug ca. 3,5−4,5 mL und wurde aus

der Bleizelle ausgeschleust. Die Tracer-Lösung (2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT) wurde dann für die

präklinischen Studien verwendet.

Die Synthesen von 2-[18F]FPEA und 5-[18F]FMT unterscheiden sich geringfügig von den Synthe-

sen von 2-[18F]FPhe und 6-[18F]FMT. Die Unterschiede bei den Synthesen wurden durch manuelle

Eingriffe in das Syntheseprotokoll, analog zu der Beschreibung in Kapitel 4.3.8 (Seite 89), durch-

geführt.

4 Material und Methoden 93

2-FPhe Metabolitenstudie

33 - N-(2-Fluorphenylethyl)acetamid

2-Fluorphenylethylamin (0,30 g; 2,16 mmol) wurden in 10 mL DCM gelöst und

Essigsäureanhydrid (0,41 mL; 4,31 mmol; 2 Äq.) hinzugefügt. Das Reaktions-

gemisch wurde für 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ablauf der Reak-

tion wurde die Reaktionsmischung in vacuo eingeengt und mittels Flash-Chromatographie

(0 → 10 % EtOAc in PE) gereinigt. Das Produkt 33 wurde in > 99 % (0,39 g; 2,15 mmol) Ausbeute

als gelbliches Öl dargestellt, welches langsam kristallisierte.

Rf: 0,4 (EtOAc). Smp. 48 °C. 1H NMR (200 MHz; CDCl3) δ 7,27 – 6,93 (m; 4H); 6,00 (br; 1H);

3,48 (dd; J = 13,0; 6,8 Hz; 2H); 2,85 (t; J = 6,8 Hz; 2H); 1,94 (s; 3H). 13C NMR (50 MHz; CDCl3)

δ 161,4 (d; J = 245 Hz); 131,2 (d; J = 5 Hz); 128,4 (d; J = 8 Hz); 125,9 (d; J = 16 Hz); 124,3 (d; J =

4 Hz); 115,4 (d; J = 22 Hz); 39,8 (d; J = 1 Hz); 29,2 (d; J = 2 Hz). 19F NMR (188 MHz; CDCl3) δ -

118,58. HRMS (ESI+) [2M+H]+ berechnet für C20H25BNF2N2O2+: 363; gefunden: 363;

[M+MeCN+H]+ berechnet für C12H16FN2O+: 223; gefunden: 223; [M+H]+ berechnet für

C10H13FNO+: 182; gefunden: 182.

Trennung aus Human-Serum

Bei der Zentrifugation wurde eine Centrifuge 5427 R (Eppendorf, Deutschland) verwendet.

2-FTA wurde von Enamine (USA) und 2-FPEMA wurde von abcr (Deutschland) erworben.

Humanblut wurde in NH4-Heparin Monovetten (Sarstedt, 7,5 mL) abgenommen und 10 min bei

800xg zentrifugiert. Das Serum wurde separiert und bei − 20 °C eingefroren.

Eine konzentrierte Lösung aller 2-FPhe Metaboliten (2-FPhe, 2-FPEA, 2-FPA, NMe-2-FPEMA,

NAc-2-FPEMA, 2-FTyr, 2-FTA und 6-FDOPA) wurde mit dem Blutserum gemischt (5:95).

100 µL der Mischung wurden mit 100 µL Acetonitril versetzt, 2 min geschüttelt und bei 20 000 g

für 1 min zentrifugiert. Die Flüssigkeit wurde abgenommen und auf der HPLC analysiert. Die

HPLC-Trennung brach jedoch zusammen, eine Identifizierung der Substanzen war nicht möglich.

100 µL der Mischung (2-FPhe Metaboliten Lösung 5:95 humanes Blutserum) wurde in einen

Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters (30 kDa) pipettiert und bei 14 000 g für 20 min zentrifu-

giert. Das Filtrat wurde durch HPLC analysiert (Diagramm 10, Seite 61).

94 4 Material und Methoden

Tabelle 13: Auflistung der k-Werte und Rf-Werte der 2-FPhe Metaboliten; HPLC: Hydro-RP 4 µm 80 Å

(4,6x250 mm) 7 % EtOH(aq) + 0,2 % TFA (1,5 mL/min); DC: Silika 1) 75 % Phenol(aq) (8 cm, 2:10 h) 2) 50 % EtOAc in CHCl3 (8 cm, 23 min)

Verbindung k (HPLC) Rf (DC)

2-FPhe (I) 7,5 0,3 1

2-FPEA (II) 8,7 0,6 1

2-FPA (III) - 0,7 2

NMe-2-FPEA (IV) 9,9 0,4 1

NAc-2-FPEA (V) - 0,4 2

2-FTyr (VI) 4,6 0,6 1

2-FTA (VII) 3,5 0,7 1

6-FDOPA (VIII) 1,7 0,8 1

Metabolitenstudie mit Leber-Mikrosomen

Tabelle 14: Zusammensetzung des Leber-Mikrosomen Assays (NADP: Nicotinamidadenindinukleotidphosphat)

Zusammensetzung des Leber-Mikrosomenassays

Leber-Mikrosomen (Ratte, 50 µL Stammlösung)

Soll-Proteinkonzentration: 0,8 mg/mL

Puffer (748 µL Stammlösung)

Na-Phosphat, pH 7,4; 0,1 M

MgCl2 (50 µL Stammlösung)

3,3 mM im Assay

NADP (50 µL Stammlösung)

1,3 mM im Assay

Glucose-6-Phosphat (50 µL Stammlösung)

3,3 mM im Assay

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (50 µL Stammlösung)

0,4 U im Assay

2-[18F]FPhe-Injektionslösung (2 µL, ca. 5 MBq)

Das Mikrosomenassay wurde nach Tabelle 14 vorbereitet und zuletzt die Tracerinjektionslösung

hinzupipettiert. Der Analtz wurde bei 37 °C für 45 Minuten bei 550 RPM (Umdrehungen pro Mi-

nute, engl. revolutions per minute) inkubiert. Bei 5, 10, 20, 30 und 45 min wurden Proben für die

Analytik aus dem Ansatz gezogen. Dabei wurde jeweils 5 µL als Referenz auf eine vorbereitete DC-

Platte aufgetragen. Weitere 60 µL des Ansatzes wurden mit 60 µL MeCN, zum Fällen der Proteine,

versetzt und für 2 min geschüttelt. Die Proben wurden bei 20 000 g und Rt. für 2 min zentrifugiert

und vom Überstand wurden 5 µL als Referenz und 5 µL zur chromatographischen Entwicklung

4 Material und Methoden 95

auf die DC-Platte aufgetragen. Zur Identifizierung wurden die Metaboliten ebenfalls für die chro-

matographische Entwicklung aufgetragen.

Die DC-Platte wurde in 75 % Phenol(aq) entwickelt und die Auswertung wurde am

InstantIMAGER der Firma Packard (Dreieich, Deutschland) durchgeführt.

96 5 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Radiotracer für die Positronen-Emissions-Tomografie sind wichtige Instrumente in der modernen

diagnostischen Medizin, die es ermöglichen, physiologische Prozesse im Körper in vivo zu visuali-

sieren. Der Positronenstrahler Fluor-18 ist hierbei aufgrund seiner idealen Zerfallseigenschaften

von herausragender Bedeutung. Fluor-18 kann in Form eines geträgerten Elektrophils ([18F]F2)

oder als ungeträgertes Nukleophil ([18F]Fluorid) am Zyklotron produziert werden. Dabei sind die

ungeträgerten nukleophilen Synthesen von Radiotracern mit 18F− in den Mittelpunkt des Interesses

gerückt, da diese Tracer aufgrund ihrer äußerst geringen Konzentrationen das zu untersuchende

System praktisch nicht beeinflussen oder stören. Radiofluorierte aromatischen Aminosäuren sind

eine besonders interessante Substanzklasse, da sie am Aminosäurestoffwechsel (L-Phenylalanin)

und Metabolismus des dopaminergen Systems (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin) teilnehmen und Ver-

änderungen durch pathologische Prozesse in vivo erfassen können. Die Fortschritte in der nukleo-

philen aromatischen Radiofluorierung von Arylverbindungen sollten einen einfachen Zugang zu 18F-markierten aromatischen Aminosäuren ermöglichen, so dass dadurch ein routinemäßiger Ein-

satz möglich erscheint. Vor allem Übergangsmetall-vermittelte Radiofluorierungsmethoden, die

eine aromatische Radiofluorierung unabhängig von den elektronischen Eigenschaften des aroma-

tischen Systems ermöglichen, standen im Mittelpunkt der in dieser Arbeit untersuchten Verfahren.

Das Ziel dieser Arbeit war es, [18F]Fluorphenylaminosäuren und Derivate durch Verwendung der

Cu-vermittelten Radiofluorierungsmethode unter dem Einsatz von Arylmesityliodoniumsalz und

Boronsäurepinakolester als Markierungsvorläufer zugänglich zu machen. Dabei sollte nicht nur

eine manuelle Synthesestrategie sondern auch eine automatisierter Syntheseprozess erarbeitet wer-

den, um auch hohe Aktivitätsmengen herstellen zu können, damit präklinischen Studien mit diesen

Tracern durchgeführt werden können.

Im ersten Teil der Arbeit wurde die Cu-vermittelte Synthese von [18F]Fluorphenylaminosäuren

über Arylmesityliodoniumsalzen als Markierungsvorläufer untersucht. Dabei stand zunächst die

Synthese von L-2-[18F]Fluorphenylalanin (2-[18F]FPhe) im Vordergrund. In einer vierstufigen Syn-

these konnte der Markierungsvorläufer (2-((2S)-2-(Bis((tert-butoxy)carbonyl)amino)-3-(tert-

butoxy)-3-oxo-propyl)phenyl)-(2,4,6-trimethylphenyl)iodonium-tetrafluorborat (4), ausgehend von

L-Phenylalanin-tert-butylester Hydrochlorid, mit 31 % Gesamtausbeute hergestellt werden. Die Ra-

diosynthese wurde mit der minimalistischen Methode durchgeführt, bei der das [18F]Fluorid nach

der Fixierung auf einer Anionenaustauscherphase mit dem in Methanol gelösten Vorläufer eluiert

wurde. Die Reaktionsbedingungen wurden auf 2 Äq. (MeCN)4Cu(I)OTf und 95 °C Reaktionstem-

peratur optimiert, so dass radiochemische Ausbeuten (RCA) von bis zu 40 % möglich waren. Je-

doch zeigte sich, dass das Endprodukt 2-[18F]FPhe, trotz enantiomerenreiner Ausgangsverbindung

bei der Vorläufersynthese, 20 % D-Enantiomer enthielt. Aus dem analog hergestellten Vorläufer

für L-4-[18F]Fluorphenylalanin (4-[18F]FPhe) (9) konnte jedoch enantiomerenreines 4-[18F]FPhe

hergestellt werden. Durch den Austausch von einer der beiden Boc-Schutzgruppen in 4 zu einer

Methoxymethyl-Schutzgruppe konnte die Racemisierung halbiert werden. Dadurch konnte belegt

5 Zusammenfassung 97

werden, dass die Racemisierung durch die zwei elektronenziehenden N,N-Boc-Schutzgruppen be-

günstigt wird. Die Struktur des Iodoniumsalzes in ortho-Position spielte dabei offensichtlich auch

eine große Rolle. Dabei ist zu vermuten, dass die Racemisierung durch eine cyclische Stabilisierung

des deprotonierten α-Kohlenstoffs begünstigt wird. Aber erst durch den Verzicht auf die Verwen-

dung der minimalistische Methode, bei der das [18F]Fluorid im Targetwasser direkt mit MeCN mit

dem Zusatz von geringen Mengen Tetraethylammoniumhydrogencarbonat (Et4NHCO3) destillativ

getrocknet wurde, konnte die Racemisierung von 2-[18F]FPhe vollständig unterdrückt werden.

Durch die Abwesenheit des Vorläufers 4 bei der Trocknung vom [18F]Fluorid im protischen Lö-

sungsmittel unter basischen Bedingungen konnte die Racemisierung soweit unterdrückt werden,

so dass kein D-Enantiomer von 2-[18F]FPhe mehr nachgewiesen werden konnte. In 110 min konnte

so 2-[18F]FPhe in 48 % ± 8 % RCA mit einem Enantiomerenüberschuss (ee) von > 99 % hergestellt

werden. Aufgrund der manuellen Synthesen mit geringen Startaktivitäten lag die molare Aktivität

bei weniger als 0,3 GBq/µmol (bestimmt bei einer Produktaktivität von < 100 MBq). Der Gesamt-

trägergehalt für das isolierte Produkt von 2-FPhe wurde mit 190–220 nmol pro Synthese bestimmt.

Durch den Austausch des Iodoniumsalzgegenions von Tetrafluorborat zu Tosylat (14) konnte der

Trägergehalt von 2-FPhe auf 1–5 nmol gesenkt werden. Dies lässt sich durch die schwächere B-F

Bindung im Tetrafluorborat erklären, welche für den Isotopenaustausch und dem daraus resultie-

renden höheren Trägergehalt (Faktor 60) verantwortlich gemacht werden kann.

In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Frau Dr. Krasikova (St. Petersburg, Russland)

konnte die minimalistische Methode unter der Verwendung Arylmesityliodoniumsalze als Markie-

rungsvorläufer weiterentwickelt werden, sodass auf eine azeotrope Destillation vollständig verzich-

tet werden kann. Das auf einer Anionenaustauscherphase fixierte [18F]Fluorid wurde mit dem in

DMF und MeOH gelösten Vorläufer in den Reaktor eluiert, in dem bereits (MeCN)4Cu(I)OTf in

DMF gelöst vorgelegt wurde. Eine Optimierung der Alkohole zeigte, dass mit zunehmender Koh-

lenstoffkettenlänge des Alkohols die Elutionsrate immer geringer wurde. Dies deutet auf ein Kol-

labieren der Phase aufgrund des lipophiler werdenden Lösungsmittels hin. Die Reduktion des

DMF-Volumens bei der Elution führte zu deutlich besseren Elutionen bei fast gleichbleibenden

radiochemischen Ausbeuten, was diese Hypothese bestärkt. Mit dieser Methode konnten mithilfe

der Vorläufer 4 und 9 2- und 4-[18F]FPhe in 22–30 % bzw. 67–69 % RCA hergestellt werden. Dabei

konnte im Fall von 4-[18F]FPhe keine Racemisierung nachgewiesen werden. Im Falle von

2-[18F]FPhe konnten jedoch noch 1–2 % D-Enantiomer (ee = 96–98 %) detektiert werden.

Im zweiten Teil der Arbeit stand die Optimierung der Cu-vermittelte 18F-Fluorierung unter der

Verwendung von Boronsäurepinakolesterabgangsgruppen für die Synthese von [18F]Fluorphenyl-

aminosäuren und Derivate im Vordergrund. Diese wurde zunächst an der Synthese von

6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin (6-[18F]FDOPA) untersucht. Dazu wurde zunächst in ei-

ner fünfstufigen Synthese ausgehend von 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin der Markierungsvorläufer

für 6-[18F]FDOPA, tert-Butyl-(S)-3-(4,5-bis((tert-butoxycarbonyl)oxy)-2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-

dioxaboran-2-yl)phenyl)-2-(bis(tert-butoxy-carbonyl)amino)propionat (19), mit 3 % Gesamtaus-

beute hergestellt. Nach weitreichender Syntheseoptimierung konnte 6-[18F]FDOPA durch die

98 5 Zusammenfassung

Kupfer-vermittelte Radiofluorierung in 8 % ± 2 % radiochemischer Ausbeute (RCA) isoliert wer-

den. Die radiochemische Reinheit und der Enantiomerenüberschuss lagen bei über 99 %. Durch

die Verwendung der neuentwickelten, durch n-Butanol-verstärkten, Kupfer-vermittelten Methode

konnte die RCA auf 40 % ± 4 % erhöht werden, bei einer molaren Aktivität von 37 GBq/µmol

(gemessen mit einer Produktaktivität von 278 MBq).[111]

Zum Vergleich mit den im ersten Teil der Arbeit untersuchten Iodoniumsalzvorläufern wurden

zusätzlich noch, analog zum 6-[18F]FDOPA-Vorläufer (19), die Boronsäurepinakolestervorläufer

für die Radiosynthese von 2-[18F]FPhe, 2-[18F]Fluorphenylethylamin (2-[18F]FPEA) und

6-[18F]Fluor-meta-tyrosin (6-[18F]FMT) hergestellt. 6-[18F]FMT ist ein Derivat vom 6-[18F]FDOPA,

was durch seine strukturelle Veränderung einen deutlich verminderten Metabolismus (Kapitel

1.4.3, Seite 25) aufweist, der eine bessere PET-Bildgebung ermöglicht. 2-[18F]FPEA ist ein Derivat

des 2-[18F]FPhe-Stoffwechsels, welches zur Metabolismusaufklärung eingesetzt werden soll und in

der Literatur noch nicht beschrieben wurde. Darüber hinaus wurde der Vorläufer Methyl-(S)-2-

((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(3-((tert-butoxycarbonyl)oxy)-5-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxa-

boran-2-yl)phenyl)propionat (30) für die Synthese vom 5-[18F]FMT, welches in der Literatur

ebenfalls noch nicht beschrieben wurde, für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.

Die Synthese des Markierungsvorläufers für 2-[18F]FPhe wurde in Anlehnung an die Synthese vom

Markierungsvorläufer 4 und 19 durchgeführt. Die Gesamtausbeute für den Vorläufer tert-Butyl-(S)-

2-(bis(tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenyl)propio-

nat (21) beträgt 10 % über vier Stufen. Der Vorläufer Di-tert-butyl(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-di-

oxaboran-2-yl)phenylethyl)imiddicarbonat (25) für die Synthese von 2-[18F]FPEA konnte mit 51 %

Gesamtausbeute über drei Stufen aus 2-Bromphenylethylamin hergestellt werden. Der Vorläufer

für die Synthese von 6-[18F]FMT, tert-Butyl-(S)-2-(bis(tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(5-((tert-

butoxycarbonyl)-oxy)-2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaboran-2-yl)phenyl)propionate (29) wurde

in 17 % über 5 Stufen ausgehend von meta-L-Tyrosin hergestellt.

2-[18F]FPhe konnte nach Optimierung unter manuellen Bedingungen in 57 % ± 6 % RCA in

110 min und enantiomerenrein hergestellt werden. Die Trägerkonzentration lag bei 1–13 nmol

2-FPhe pro Synthese, was im Vergleich zu den vorher beschriebenen Synthesen ausgehend von 4

um den Faktor 40 geringer ist. 2-[18F]FPEA konnte manuell mit 49 % ± 7 % RCA in 100 min

hergestellt werden, 6-[18F]FMT mit 48 % ± 5 % RCA in 110 min und 5-[18F]FMT mit 66 % ± 1 %

RCA in 120 min. Die Radiosynthesen mit den Boronsäurepinakolestervorläufern wurden aufgrund

ihrer guten Performance auf ein automatisiertes Synthesemodul übertragen und die Radiotracer in

großen Aktivitätsmengen hergestellt.

Die radiochemischen Ausbeuten von den Synthesen auf dem Synthesemodul waren 15–50 % ge-

ringer als die der manuellen Synthesen. Trotzdem konnten mit 31–50 % RCA die Tracer in multi-

Gigabequerell-Mengen hergestellt werden (2,4–18,8 GBq). Dabei wurden molare Aktivitäten von

121–597 GBq/µmol bei den vier Tracern gemessen. Dies entspricht einer Trägermenge (2-FPhe,

2-FPEA, 6-FMT und 5-FMT) von 13–33 nmol pro Synthese.

5 Zusammenfassung 99

In dieser Arbeit wurde eine Vielzahl an [18F]Fluorphenylaminosäuren und deren Derivaten, durch

Übergangsmetall-vermittelte, aromatische Radiofluorierung hergestellt. Die Racemisierung der

Iodoniumsalzvorläufer bei der Radiofluorierung wurde aufgeklärt und eine Lösung präsentiert, die

sehr gute radiochemische Ausbeuten lieferte. Dennoch zeigte die Alkohol-verstärkte, Übergangs-

metall-vermittelte, aromatische Radiofluorierung von Boronsäurepinakolestern die höheren Aus-

beuten, den geringsten Träger-Gehalt und die höhere Stabilität. Durch sie konnten 2-[18F]FPhe,

2-[18F]FPEA, 6-[18F]FMT und 5-[18F]FMT im großen Maßstab hergestellt werden und in der präk-

linischen Evaluierung untersucht werden.

100 6 Anhang - Präklinische Studien

6 Anhang - Präklinische Studien

6.1 Zellversuche

Im Institut für Radiochemie und Experimentelle Molekulare Bildgebung in der Uniklinik Köln liefen und laufen präklinische Untersuchungen, unter Leitung von Frau PD Dr. Heike Endepols, der in dieser Arbeit entwickelten Tracer.

Im Zuge dessen wurde die Zellaufnahme bei vier verschiedenen Krebs-Zell-Reihen von 2-[18F]FPhe im Vergleich zu [18F]FET getestet. MCF7 (Michigan Cancer Foundation - 7) ist eine Brustkrebszelllinie. HDMB03 (Medulloblastoma) ist eine Zellelinie aus einem bösartigen, embryo-nalen Tumor des Kleinhirns. PC-3 und LNCaP C4-2b sind Zelllinien aus Prostata Krebs. Die Tra-cer wurden mit den jeweiligen Zellen inkubiert (für 1 bzw. 2 h) und dann die aufgenommene Ra-dioaktivität der Zellen gemessen.

2-[18F]FPhe konnte, in allen vier Zellinien und zu allen gemessenen Zeitpunkten, ein höheres Auf-nahmeverhalten zeigen als [18F]FET. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass 2-[18F]FPhe, im Gegensatz zu [18F]FET,[85] in Proteine eingebaut wird.

Diagramm 18: Zellaufnahme von [18F]FET

6 Anhang - Präklinische Studien 101

Diagramm 19: Zellaufnahme von 2-[18F]FPhe

Diagramm 20: Verhältnis von 2-[18F]FPhe/[18F]FET bei der Zellaufnahme

102 6 Anhang - Präklinische Studien

MCF-7 PC-30,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Prot

eine

inba

u vo

n 2-

[18F]

FPhe

[%]

Zellen

2 h

Diagramm 21: Proteineinbau von 2-[18F]FPhe

6.2 Tierexperimentelle Studien

Neben den in vitro Versuchen sind alle Tracer in größeren Produktmengen auf dem Modul produ-

ziert und in vivo getestet worden.

Der Stoffwechsel von 2-[18F]Fluorphenylalanin zeigte sich dabei sehr interessant. Es konnte eine

recht gleichmäßige Verteilung von 2-[18F]FPhe im Gehirn der Ratte beobachtet werden, im Ge-

gensatz zu 4-[18F]FPhe, dass defluoriert wird. Die Applikation von Benserazid als Decarboxyla-

sehemmer führte jedoch zu einer Blockade der 2-[18F]FPhe-Aufnahme im Gehirn. Ein solches

Verhalten wurde bereits für das natürliche Phenylalanin beschrieben.[143] Durch die Gabe unter-

schiedlicher Metabolismushemmer kann man in ganz erheblichen Maße, Einfluss auf das Verhalten

der Tracer nehmen, z.B. im Fall von 6-[18F]FDOPA.

Der Anreicherungspunkt zwischen den Augen der Ratte, im Fall von 2-[18F]FPEA, spiegelt ver-

mutlich die Trace-Amin-assoziierten Rezeptoren (TAARs) im olfaktorischen Zentrum der Ratte

wieder. Diese Rezeptoren sind für die Anzeige vom Phenylethylaminen (Raubtiergeruch) bei Na-

getieren verantwortlich.[144]

Ebenso konnte in einer Gegenüberstellung von 6-[18F]FDOPA, 6-[18F]FMT und dem noch unbe-

kannten 5-[18F]FMT die unterschiedlichen Eigenschaften aufgezeigt werden.

In zukünftigen Studien soll untersucht werden, wie sich 2-[18F]FPhe und 2-[18F]FPEA im Gehirn

verhalten.

6 Anhang - Präklinische Studien 103

Schema 59: PET-Messungen in gesunden Ratten (Gemessen und zur Verfügung gestellt von PD Dr. H.

Endepols und ihrer Arbeitsgruppe, Institut für Radiochemie und Experimentelle Molekulare Bildgebung,

Uniklinik Köln, Deutschland) (AADC: Aromatische-L-Aminosäure-Decarboxylase, AAAH: aromatische

Aminosäurehydroxylase, MAO: Monoaminooxidase, ADH: Aldehyd-Dehydrogenasen, COMT: Catechol-O-

Methyltransferase)

min max

104 7 Abkürzungsverzeichnis

7 Abkürzungsverzeichnis

AAAH Aminosäurehydroxylase

AAMAT Aralkylamin-N-acetyltransferase

AADC Aromatische-L-Aminosäure-Decarboxylase

AcOH Essigsäure

AMI Arylmesityliodoniumsalze

X(aq) Wässrige Lösung

Äq. Äquivalente

auto. automatisiert

Azeo. azeotrop

Boc tert-Butyloxycarbonyl

Boc2O Di-tert-butyldicarbonat

BPE Boronsäurepinakolester

B2pin2 Bis(pinakolato)diboran

bzw. beziehungsweise

c.a. geträgert (engl. carrier-added)

COMT Catechol-O-Methyltransferase

[18F]CPFPX 8-Cyclopentyl-3-(3-[18F]fluorpropyl)-1-propylxanthin

DC Dünnschichtchromatographie

DFT Dichtefunktionaltheorie

4-DMAP 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin

DMA N,N-Dimethylacetamid

DMF N,N-Dimethylformamid

L-DOPA 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin

ee Enantiomerenüberschuss

engl. Englisch

EtOH Ethanol

[18F]FDG 2-[18F]Fluor-2-desoxy-D-glucose

6-FDOPA 6-Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin

7 Abkürzungsverzeichnis 105

2-[18F]FDOPA 2-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin

5-[18F]FDOPA 5-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin

6-[18F]FDOPA 6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin

[18F]FET O-(2-[18F]Fluorethyl)-L-tyrosin

2-FPA 2-Fluorphenylessigsäure (engl. 2-fluorophenyl acetic acid)

2-FPhe 2-Fluorphenylalanin

2-[18F]FPhe L-2-[18F]Fluorphenylalanin

4-FPhe 4-Fluorphenylalanin

4-[18F]FPhe L-4-[18F]Fluorphenylalanin

2-FPEA 2-Fluorphenylethylamin

2-[18F]FPEA 2-[18F]Fluorphenylethylamin

FMes Fluormesitylen

6-FMT 6-Fluor-L-meta-tyrosin

6-[18F]FMT 6-[18F]Fluor-L-meta-tyrosin

5-FMT 5-Fluor-L-meta-tyrosin

5-[18F]FMT 5-[18F]Fluor-meta-tyrosin

2-FTA 2-Fluortyramin

2-FTyr 2-Fluor-L-tyrosin

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chroma-

tography)

HVA Homovanillinsäure (engl. Homovanillic acid)

ICP-MS Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (engl. inductively coupled

plasma mass spectrometry)

IMes Iodmesitylen

inkl. inklusive

K222 Kryptofix®222

konz. konzentrierte

L Ligand

lat. Latein

m. Mitte

106 7 Abkürzungsverzeichnis

manu. manuell

max Maximum

MAO Monoaminooxidase

MeCN Acetonitril

MeOH Methanol

Mes Mesityl-

min Minimum

MOM Methoxymethyl-

NAc-2-FPEA N-(2-Fluorphenethyl)acetamid

NADP Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

n.c.a. trägerarm (engl. no-carrier-added)

NMe-2-FPEA 2-(2-Fluorphenyl)-N-methylethan-1-amin

o. oben

p.A. Für die Analyse (lat. pro analysi)

Pd(dppf)Cl2 [1,1′-Bis(diphenylphosphino)ferrocen]dichlorpalladium(II)

Phe L-Phenylalanin

POM Pivaloyloxymethyl

RCA Radiochemische Ausbeute

RCA* Nicht isolierte, radiochemische Ausbeute

RCY engl. radiochemical yield

RP Umkehrphase (engl. reversed phase)

RPM Umdrehungen pro Minute (engl. revolutions per minute)

Rt. Raumtemperatur

SA Standardabweichung

SiFA Silicium-basierter Fluoridakzeptor (engl. silicon-based fluoride acceptor)

Smp. Schmelzpunkt

SOP Standardisiertes Vorgehen (engl. standard operating procedures)

SPE Festphasenextraktion (engl. solid phase extraction)

Sub Dibenzosuberyl-

TBAF Tetrabutylammoniumfluorid

7 Abkürzungsverzeichnis 107

Tf Triflat- (Trifluormethansulfonyl-)

TFA Trifluoressigsäure (engl. trifluoroacetic acid)

TMSAc Trimethylsilylacetat

Tos Tosyl- (para-Toluolsulfonyl-)

Tr Trityl- (Triphenylmethyl-)

u. unten

w/o Ohne (engl. without)

108 8 Literaturverzeichnis

8 Literaturverzeichnis

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Jül-4412 • Juni 2018ISSN 0944-2952