This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Über die Trennung der freien Aminosäuren aus Seidenspinner-Blut mittels der Hochspannungs-Papierelektrophorese

V o n J . M . D E N U C É u n d H E R B E R T Z U B E R

Aus dem Laboratorium voor Zoologie der Universität Gent und dem Chemischen Institut der Universität Heidelberg

(Z. Naturforschg. 11 b, 381—383 [1956]; eingegangen am 13. März 1956)

Im Blut der Seidenraupe (Bombyx mori) wurden durch Hochspannungs-Elektrophorese Glycin, Alanin, Serin, Cystin, Histidin, Arginin, Lysin und Glutamin als freie Aminosäuren nachgewiesen. Glycin, Alanin und Serin nehmen während des 5. Larvenstadiums ab, während Histidin stark zunimmt. Peptide als mögliche Vorstufe von Proteinen der Spinndrüse (Fibroin und Sericin) wurden im Blut von Bombyx mori nicht gefunden.

T T T i e seit langem bekannt, ist die Körperflüssigkeit W der Insekten durch einen relativ hohen Gehalt an freien Aminosäuren gekennzeichnet 1. Von verschie-dener Seite wurde auch versucht, die Schwankungen, die der Aminosäure-Stickstoff im Laufe der Larven-entwicklung aufzeigt, mit bestimmten morphogene-tischen und physiologischen Äußerungen der Larve kausal zu verbinden.

Mit Einführung der papierehromatographischen Ar-beitsmethoden wurden darüber hinaus neue Mög-lichkeiten geschaffen, auch analytisch speziellere Er-kenntnisse hinsichtlich der in der Hämolymphe vor-kommenden freien Aminosäuren zu gewinnen. Außer-dem wurde versucht, die einzelnen Aminosäuren wäh-rend der Larvenentwicklung auch quantitativ zu be-stimmen. Es sei hier auf die Arbeiten von D r i 1 -h o n und B u s n e 1ä, A u c 1 a i r und P a 11 o n 3, P r a t t 4 , A u c l a i r und D u b r e u i 1 5, außerdem auf F u k u d a und Mitarbb. 6 hingewiesen.

In Zusammenhang mit früheren Lmtersuchungen über die biochemischen Beziehungen zwischen Hämo-lymphe und Spinndrüse bei Insektenlarven, die einen Proteinkokon spinnen (Bombyx mori, Galleria mello-nella), untersuchten wir das Verhalten der freien Aminosäuren (und evtl. Peptide) im Blut der Seiden-raupe Bombyx mori mit Hilfe der Hochspannungs-Elektrophorese. Diese neue Methode wurde bevor-zugt wegen der erhöhten Trennschärfe der einzelnen Aminosäuren. Zudem wird mit dieser Technik die bei

1 Literaturübersicht der letzten Jahre s. K. D. R o e -d e r , Insect Physiology S. 174, John Wiley and Sons, New York 1953.'

2 A. D r i 1 h o n u. R. G. B u s n e l , Rev. Ver ä Soie 1, 51 [1949].

3 J. L. A u c l a i r u. R. L. P a t t o n , Rev. canad. Biol. 9, 3 [1950],

4 J. J. P r a 11, Ann. Entom. Soc. Amer. 43, 573 [1950],

allen chromatographischen Verfahren erforderliche Reinigung der biologischen Flüssigkeit umgangen. Diese Vereinfachung bedeutet im Falle der Insekten-hämolymphe mit ihrem nicht zu vernachlässigenden Gehalt an Elektrolyten (z. B. N a " 14 mMol//; K~ 33—40 mMol//) und anderen störenden Substanzen einen erheblichen Vorteil.

Material und Methoden

Hämolymphe von Larven von Bombyx mori wurde mit einer gläsernen Mikropipette aus der Körperhöhle aufgesogen und sofort mit einem gleichen Volumen m/200-KCN-Lösung verdünnt. Dadurch wird die spontan auftretende Melaninbildung vermieden. Die Flüssigkeit wird zentrifugiert, um die Zellen vom Serum abzutren-nen. 10 ul Serum wurden als Strich an der Startlinie eines puffer-getränkten Streifens von Filtrierpapier aufgetra-gen. Für die elektrophoretische Trennung wurde eine Apparatur benützt, die von W e r n e r und W e s t -p h a 1 7 und W e r n e r 8 beschrieben wurde. Bei einer Spannung von 5000 V (5 bis 7 mA) konnte innerhalb 70 Min. eine sehr befriedigende Trennung erreicht wer-den. In den meisten Fällen betrug die Laufstrecke unge-fähr 35—40 cm. Die Temperatur in der Kühlsole war — 8° C. Als Puffer diente ein Gemisch von Essigsäure-Ameisensäure (pH 1,93). Bei diesem tiefen pH-Wert wan-derten alle in der Hämolymphe vorhandenen Amino-säuren kathodisch. Nach der Trennung wurden die Pa-pierstreifen getrocknet und mit einer Ninhydrin-Lösung angefärbt.

Die Untersuchungen erstreckten sich vom 1. Tag des 5. Larvenstadiums bis zu dem Stadium völlig eingespon-

5 J. L. A u c l a i r u. R. D u b r e u i l , Canad. J. Zool. 30, 109 [1952]; 31, 30 [1953].

6 T . F u k u d a , J. K i r i m u r a , M. M a t u d a u. T. S u z u k i , J. Biochemistry [Tokyo] 42, 341 [1955]; Nature [London] 175, 1041 [1955],

7 G. W e r n e r u. O. W e s t p h a 1 , Angew. Chem. 67, 251 [1955].

* G. W e r n e r , Recueil Trav. chim. Pays Bas, 74, 613 [1955].

nener Tiere (Kokongewicht z. B. 300 mg). Es wurden auch Aminosäuretrennungen mit der 2-dimensionalen, aufstei-genden papier-chromatographischen Methode durchge-führt. Als Lösungsmittel dienten Sekundärbutanol-Amei-sensäure-Wasser in der ersten und Phenol-Wasser in der zweiten Laufrichtung. Diese Trennungen waren durch die im Blut vorhandenen Beimengungen meistens un-scharf. Schließlich wurde auch in einer weiteren Ver-suchsreihe Hämolymphe mittels Niedervolt-Elektropho-rese (220 V) auf Filtrierpapier getrennt. Über die dabei aufgetrennten Proteinfraktionen soll in einer gesonderten Arbeit berichtet werden.

Ergebnisse

Die folgenden freien Aminosäuren konnten aus der Hämolymphe durch Hochspannungselektrophorese getrennt und identifiziert werden: Cvstin, Serin, Ala-

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Abb. 1. Abb. 2.

Abb. 1. Papierelektropherogramm von Hämolymphe aus einer nicht spinnenden Larve von Bombyx mori (2. Tag des 5. Stadiums, 1,768 g). pu 1,93; 5000 V; 7 mA; Sole-

temp. — 8 C; Laufzeit 70 Minuten.

Abb. 2. Papierelektropherogramm von Hämolymphe aus einer spinnenden Larve von Bombyx mori (14. Tag des 5. Stadiums, 2,833 g). Als Vergleichssubstanzen liefen mit: Cvstin, Lvsin, Glycin, Histidin, Serin, Glutaminsäure und Alanin. pH 1,93; 5000 V; 6 mA; Soletemp. — 8° C; Lauf-

zeit 70 Minuten.

nin, Glycin, Histidin (nach Kupplung mit dem Pauly-Reagenz besonders gut nachweisbar), Arginin und Lvsin (Abb. 1 und 2). Ein Fleck zwischen Cvstin und Serin ist entweder auf Glutaminsäure oder auf Glut-amin zurückzuführen *.

In quantitativer Hinsicht läßt die Beurteilung der Fleckengröße bzw. Intensität der Ninhydrinfärbung folgende Feststellungen zu:

* Auf 2-dimensionalen Chromatogrammen konnte keine Glutaminsäure, sondern nur Glutamin nachgewiesen werden.

1. Glycin und Alanin nehmen im Laufe des 5. Lar-venstadiums bedeutend ab.

2. Auch der Gehalt an Serin wird schwächer; die Aminosäure bleibt jedoch im Blut der spinnenden Larve feststellbar.

3. Histidin nimmt stark zu von den ersten Tagen des 5. Stadiums und weiter noch während des Ein-spinnens. In diesem Stadium übertrifft diese basische Aminosäure alle übrigen Flecke durch ihre Intensität (Ninhydrin und Kupplung mit diazotierter Sulfanil-säure).

4. Der Gehalt an den basischen Aminosäuren Argi-nin und Lysin bleibt gleich.

5. 1 oder 2 Tage vor Anfang der Spinnaktivität konnte eine bisher nicht näher definierte Fraktion (Peptid oder Protein?) nachgewiesen werden. Sie lo-kalisiert sich etwa 1 cm von der Auftragestelle und wandert kathodisch. Der Fleck nimmt im Laufe des Spinnprozesses an Stärke zu.

6. Mit der (in diesen Versuchen angewandten) Hochspannungs-Elektrophorese konnten im Blut des Seidenspinners keine Peptide nachgewiesen werden. Auch wenn durch weitere Untersuchungen die unter 5. beschriebene Fraktion sich als Peptid identifizieren läßt, so ist doch im allgemeinen feststellbar, daß in der Periode, die als vorbereitend zum Einspinnen betrachtet werden darf, keine Peptide als mögliche Vorstufen von Proteinen der Spinndrüse im Blut auf-treten.

Diskussion

D r i 1 h o n und B u s n e l - fanden im Blut von Bombyx-Larven folgende Aminosäuren: Glutamin-säure, Glycin, Tyrosin, Leucin und Cystin. Diese Aminosäuren nahmen während der Spinnzeit im all-gemeinen ab. Ungefähr 10 Tage nach dem Einspin-nen stiegen sie jedoch wieder an. Gleichzeitig konn-ten die Verff. einige neu auftretende Aminosäuren nachweisen: Histidin, Serin, Diphenylalanin (?) und Prolin. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, daß Histidin und Serin schon im 5. Larvenstadium reich-lich vorhanden sind. Es ist nicht unwahrscheinlich, daß diese Aminosäuren schon in früheren Stadien vorkommen.

Mit den Ergebnissen von F u k u d a und Mit-arbb. 6 zeigen unsere Untersuchungen größere Ähn-lichkeiten. F u k u d a konnte mit mikrobiologischen Methoden sehr viel Histidin, Lysin und Serin in der Hämolymphe des 5. Larvenstadiums nachweisen. Auf Grund von Versuchen mit Seidenraupen, bei denen

sich durch Herauspräparieren der Spinndrüsen not-wendigerweise die Aminosäuren des Fibroins bzw. Sericins in der Körperflüssigkeit anhäuften, ist F u -k u d a geneigt anzunehmen, daß Glycin, Threonin, Prolin, Serin und Tyrosin gegen Ende des 5. Stadiums unmittelbar vor dem Einspinnen von der Spinndrüse aus der Hämolymphe aufgenommen werden.

Das Fehlen von Peptiden im Blut der Seidenraupe vor Beginn der Spinnaktivität läßt uns annehmen,

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daß die eigentliche Peptid- und Eiweißsynthese erst in der Spinndrüse stattfindet.

Für die gewährte Gastfreundschaft am Neuen Chemi-schen Institut der Universität Heidelberg ist einer von uns (J. M. D.) Herrn Prof. Dr. K. F r e u d e n b e r g und Herrn Prof. Dr. H. Z a l i n zu großem Dank verpflichtet. Der Biologischen Forschungsanstalt für Kleintierzucht, Celle, danken wir für die freundliche Überlassung von Seidenraupen.

Die Bedeutung physikalischer Faktoren für die Wirkung von Heptachlordioxan auf Drosophila melanogaster MEIG.

V o n K A R L H A Y D U K u n d M A N F R E D L Ü D I C K E

Aus dem Zoologischen Institut der Universität Heidelberg (Z. Naturforschg. 11 b, 383 388 [1956]; eingegangen am 23. Februar 1956)

Die Bedeutung der physikalischen Faktoren bei der Wirkung von Kontaktinsektiziden wurde von H a d a w a v und B a r l o w 1 zusammenfassend dargestellt. In vorliegender Arbeit wird versucht, einige dieser Faktoren bei Heptachlordioxan aufzuklären.

1. Es wurde die Sublimations-Geschwindigkeit von Heptachlordioxan gravimetrisch ermittelt. 2. Die Giftwirkung von Heptachlordioxan und y-Hexachlorcyclohexan auf vier Altersstufen

von Drosophila melanogaster M e i g. wurde untersucht und eine geringe erhöhte Resistenz älterer Tiere gegenüber jüngeren festgestellt. In der Streuung der Effektzeiten ist ein statistisch gesicherter Unterschied zwischen den Altersstufen vorhanden.

3. Das Intoxikationsbild von Heptachlordioxan zeigt in seinen einzelnen Phasen eine gewisse Übereinstimmung mit dem von DDT.

4. Die Giftwirkung von Heptachlordioxan ist im Rahmen der Versuchsbedingungen um-gekehrt proportional der Teilchengröße.

Material und Methode

Für die Durchführung der Versuche wurden zwei In-sektizide verwendet: Heptachlordioxan und als Ver-

gleichspräparat die reine y-Isomere des Hexachlorcyelo-hexans.

Als Versuchsobjekt wurde Drosophila melanogaster M e i g. vg. gewählt, da die Tiere infolge ihrer Flug-unfähigkeit mit dem Präparat in Dauerkontakt bleiben. Als Testverfahren wurde das Depositverfahren bevorzugt, da sich dieses für die Bearbeitung des gestellten Problems günstig zeigte.

Zur Erzielung eines gleichmäßigen Belages wurden Cellophanfolien von je 132 cm- Fläche in eine 1-proz. ätherische Lösung des Insektizides getaucht, wobei die Substanz auf den Folien auskristallisierte. Die mit dem Insektizid gleichmäßig bedeckten Mittelstücke der Folien wurden mit Gummiringen auf Holzrähmchen gespannt und diese zu einem Kästchen von 200 cm- Gesamtfläche und 183,25 cm3 Inhalt zusammengesetzt, das gleichfalls mit Gummiringen zusammengehalten wurde. Die Menge des Belages pro cm- wurde durch Wägung von abge-

1 A. B. H a d a w a y u. F. B a r l o w , Trans. R. Soc. trop. Med. Hyg. 46, 236 [1952].

trennten Streifen der verwendeten Folien vor und nach der Sublimation des Belages in Wägegläschen auf einer Sartorius-Analysen-Dämpfungswaage ermittelt.

Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß alle Flächen homogen mit Belag versehen sind und durch Auswechseln der Folien ein sauberes und siche-res Arbeiten ohne umständliche Reinigung der Ver-suchsgefäße ermöglicht wird.

1. D i e S u b l i m a t i o n s - G e s c h w i n d i g k e i t v o n H e p t a c h l o r d i o x a n

Bei den ersten Untersuchungen über die kontakt-insektizide Wirkung dieser Substanz - war festgestellt worden, daß bei längerem Offenstehen der Versuchs-gefäße die insektizide Wirkung des Präparates deut-lich abnahm. Daher war es zunächst von Interesse, die Sublimations-Geschwindigkeit und die damit zu-sammenhängenden Vorgänge zu studieren.

- M. L ü d i c k e u. W. S t u m p f , Naturwissenschaf-ten 40, 363 [1953].