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Técnicas de análisis genético- NGS
MÓDULO 1: GENÓMICA EN ONCOLOGÍA
CURSO DE MEDICINA GENÓMICA EN ONCOLOGÍA Y SUS
APLICACIONES CLÍNICAS
Material didáctico: Módulo 1-Clase 4
Material didáctico creado por Mar Benito, MSc https://www.linkedin.com/in/marbenito/
Técnicas de análisis genético- NGS
Material didáctico: Módulo 1 - Clase 4
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ÍNDICE
MÓDULO 1: GENÓMICA EN ONCOLOGÍA
Clase 1.4: Técnicas de análisis genético- NGS
Profesor: Dr. Carlos Mackintosh
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1
2. TECNOLOGÍAS NGS .................................................................................................................... 1
3. GLOSARIO NGS .......................................................................................................................... 2
4. NGS DE SEGUNDA GENERACIÓN ............................................................................................... 2
5. NGS DE TERCERA GENERACIÓN ................................................................................................ 5
6. APLICACIONES Y CONCEPTOS CLAVE EN NGS ........................................................................... 6
Técnicas de análisis genético- NGS
Material didáctico: Módulo 1 - Clase 4
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1. INTRODUCCIÓN
El proyecto Genoma Humano se desarrolló durante más de una década y costo miles de
millones de dólares. Aquí se vio que la secuenciación Sanger que existía desde los 70 no era
capaz de afrontar la secuenciación de grandes partes del genoma. La secuenciación Sanger
fue evolucionando, se hacían máquinas cada vez más grandes, que podían procesar 96
muestras en paralelo y dar una información de 1 MB al día. En 2007 apareció la NGS y
bajaron muchísimo los precios.
Hay que diferenciar entre el ensamblaje de novo de un genoma, que es lo que se hizo en la
secuenciación del genoma humano, y la resecuenciación, que es lo que se hace hoy en día
con las técnicas NGS de segunda generación.
DIAPOSITIVAS 2-6
2. TECNOLOGÍAS NGS
Actualmente se utilizan tecnologías de segunda y tercera generación.
La primera generación de la secuenciación era en paralelo pero no era masiva, se tenían que
crear cultivos bacterianos con BACs, etc., y no era factible para grandes genomas.
Antes de la secuenciación por NGS hay que hacer una preparación de librería, le damos a la
secuencia problema una estructura y creamos unas secuencias de apoyo para que la
máquina la pueda leer. En este paso hay que fragmentar el ADN, reparar los extremos, y en
las técnicas de segunda generación, hay que hacer una amplificación clonal en soporte
sólido. Las máquinas de segunda generación no tienen la capacidad de leer una sola molécula,
por eso hay que hacer este paso de amplificación. Después de esto se deposita la librería
amplificada sobre la superficie sobre la que vamos a leer. Se pone la librería sobre una
especie de microcámara microfluídica que permite la entra y salida de reactivos en un
volumen muy pequeño.
Las dos tecnología más comunes para la fragmentación del ADN son la sonicación (física) y
la tagmentación (enzimática con transposasas). En la tagmentación las transposas cortan y
ya empalman los adaptadores (diapositiva 11).
Durante todo el proceso de la creación de librerías tenemos que tener un control de calidad.
Para ello se utiliza mucho una máquina que se llama Qubit, que es un fluorímetro, y que es
capaz de medir la concentración de ADN con mucha precisión intercalando un fluorocromo.
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También puede distinguir entre ADN y ARN, y ADN de cadena simple o doble, y ARN de
cadena simple o doble.
Otra técnica que se utiliza para el control de calidad es la electroforesis capilar, que puede
trabajar con concentraciones de ADN muy bajas, y nos da la concentración y el tamaño del
ADN.
DIAPOSITIVAS 7-12
3. GLOSARIO NGS
- Lectura o read: son cada una de las secuencias que nos da el secuenciador.
- Librería: ADN ya procesado y que está listo para ser leído.
- Multiplex: poner muchas muestras en paralelo en el secuenciador.
- Barcoding: es una pequeña secuencia de 8 nucleótidos que sirve para identificar cada
muestra dentro de una librería. Aunque se secuencien todas las muestras juntas al final
tenemos un archivo con la secuencia identificada de cada muestra.
- Paired-end sequencing: tenemos que diferenciar si estamos leyendo desde los dos extremos
o solo desde uno. El pair-end es la secuenciación desde los dos extremos, esto nos permite
alinear mejor y discriminar ciertas variantes tipo indel y variaciones estructurales. En la
segunda generación de NGS se ven muy mal estos tipos de variantes.
- Duplicados: son frecuentes en la NGS de segunda generación. No es lo mismo leer la
molécula original que las copias que se han amplificado por PCR. Tenemos que eliminar las
duplicaciones porque si no podemos tener un sesgo en la estimación de la fracción alélica.
- Cobertura o profundidad de lectura: este parámetro nos indica cuantas veces estamos
leyendo posición. Hay que leerla muchas veces porque cada secuenciador tiene una tasa de
error asociada, y esta es la manera de determinar si la variación está presente o no. Cada
aplicación tiene su estándar, por ejemplo, en cáncer se está yendo a una cobertura media de
1000X y una cobertura mínima de 200X.
DIAPOSITVAS 13-15
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4. NGS DE SEGUNDA GENERACIÓN
En la NGS de segunda generación se necesita hacer una PCR para tener la suficiente señal
para la detección. Esta PCR nos impone una restricción de tamaño, porque solo se pueden
hacer lecturas pequeñas.
La primera tecnología NGS que trabajaba con pirosecuenciación, la 454, fue inventada en
2005 por el grupo de Jonathan Rothberg, y fue comprada por Roche. Esta tecnología ya ha
sido superada y ya no se usa.
En la segunda generación de NGS la amplificación clonal en superficie sólida se puede
hacer de dos maneras:
- Ion Torrent. La amplificación clonal se hace sobre la superficie de una bolita con oligos. Se
hacen microreacciones en emulsiones de aceite en agua. Cada molécula va a capturar una de
las moléculas de la librería y la va a amplificar, de manera que la bolita quedará recubierta de
miles de copias de la molécula original. En la diapositiva 19 se puede ver este tipo de PCR de
forma más detallada.
- Illumina. La amplificación se da sobre la misma superficie en la que se va a llevar a cabo la
secuenciación. Es lo que se llama una PCR en puente, los oligos complementarios a los dos
adaptadores están pegados a la superficie, y el ADN sintetizado se va doblando haciendo
puentes entre los adaptadores. Al final tenemos una amplificación en forma de clon o cluster
(diapostiva 18). En la diapositiva 20 se muestra este tipo de PCR de forma más detallada.
Hay tecnologías nuevas que ya están haciendo la amplificación clonal sin soporte sólido. Por
ejemplo, la tecnología de Complete Genomics que compró BGI, hace una amplificación en
solución mediante un ADN circular, que acaba formando una nanobola.
DIAPOSITVAS 17-21
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Para la secuenciación se llevan a cabo ciclos de adición de dNTPs. La máquina tira dNTPs y
lee lo que pasa cada vez, en cada ciclo se avanza una posición.
- Ion Torrent. La bolita que teníamos con millones de copias se deposita sobre un soporte.
Cada bolita entra en un micropocillo, en los que fluyen los reactivos. Debajo de cada pocillo
hay un sensor de pH, que transforma el pH del pocillo en voltaje. Cuando la polimerasa
incorpora un nucleótido se forma un pirofosfato y un protón, como tenemos muchas
moléculas, se generarán millones de protones. Esto genera un cambio de pH que se traduce
en voltaje. Como sabemos que nucleótido se ha incorporado cada vez, porque solo se pone
un tipo de nucleótido por ciclo, la máquina puede ir leyendo. Se van haciendo ciclos con
lavados en medio, y así se puede leer toda la secuencia.
El problema que hay aquí es que con la adición de un solo nucleótido, por ejemplo, si hay 8
timidinas seguidas, la máquina no diferencia bien si son 6, 7 u 8. Esto se llama alto error de
homopolímero.
Este tipo de tecnología está muy extendida porque es muy rápida. Una carrera tarda dos
horas y media, y puede leer 400 pb. Hay aplicaciones clínicas que necesitan un resultado
muy rápido, por ejemplo, las enfermedades infecciosas y el cáncer.
En la diapositiva 24 se muestra una tabla comparativa de todas las máquinas de Ion Torrent,
de un artículo de 2016 de Nature Reviews Genetics.
DIAPOSITIVAS 22-24
- Illumina. Aquí partimos de los clones amplificados sobre la superficie de lectura, se aplica la
tecnología de total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, que es capaz de
identificar la incorporación de fluorocromos en los clusters. Se van haciendo ciclos de adición
de nucleótidos, cada vez se ponen los cuatro dNTPs, marcados con fluorocromos diferentes.
El microscopio mira en cada ciclo que color hay en cada cluster. En estos nucleótidos que se
añaden, el extremo 3' está bloqueado, así se elimina la posibilidad de error de homopolímero.
Este bloqueo es reversible, entre ciclo y ciclo se añade el reactivo TCEP, que desbloquea el
extremo 3' para que se pueda seguir con la lectura.
En la diapositiva 27 se muestra un vídeo oficial de Illumina en el que se ve en 3D todo el
proceso.
Illumina domina todo el mercado de la secuenciación de segunda generación. Es una técnica
muy fiable y contrastada, con una alta precisión, y que ya lleva muchos años. Tiene muchas
máquinas diferentes para todas las necesidades. Se pueden leer 75 pb desde un extremo y
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300 pb desde ambos extremos. Cuanto más queramos leer, más tarda porque son ciclo
aditivos. Si se quieren leer 300 pb se tarda 56 horas.
En la diapositiva 29 se muestra una tabla con las características de las diferentes máquinas
de Illumina.
DIAPOSITIVAS 25-29
En resumen, la NGS de segunda generación:
- es una tecnología lenta
- conlleva PCR
- es muy precisa
- no resuelve bien indels y variaciones esturcturales
- tiende a haber un error al final de la secuencia por el desfase de las cadenas
- son aparatos muy grandes
DIAPOSITIVAS 30 Y 31
5. NGS DE TERCERA GENERACIÓN
Esta tecnología todavía no está muy implantada. En este caso no se hace PCR, sino que se
leen directamente las moléculas originales, esto hace que las lecturas sean muy largas. La
empresa Pacific Bioscience ha desarrollado la tecnología single-molecule-real-time. En esta
técnica hay pocillos que al fondo tienen una polimerasa. El ADN cicular va pasando por la
polimerasa que va a ir incorporando dNTPs marcados con fluorocromo. Hay un
microscopio que es capaz de ver solo lo que pasa en el fondo del pocillo, y va a detectar en
cada momento que nucleótido se está incorporando. El fluorocromo está unido al final del
pirofosfato, de manera que cuando se incorpora un nucleótido se lee la fluorescencia en ese
momento y luego el fluorocromo se va.
Estas tecnologías todavía tienen una tasa muy alta de error en la lectura. Pac. Bio. Resuelve el
tema del 15% de error leyendo una y otra vez el ADN circular, lo que da una mayor precisión.
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Las lecturas de Pac. Bio. son de 10-15 Kb de media, dependiendo del tiempo que queramos
estar leyendo y de como fragmentemos el ADN de partida. La velocidad de secuenciación de 3
pb por segundo, lo que es un avance muy importante respecto a la segunda generación.
Hay dos máquinas de esta empresa en el mercado, que se están utilizando principalmente
para el ensamblado de novo.
La empresa Oxford Nanopore, en su tecnología no utiliza ADNpolimerasa, sino que se
basa en un poro de membrana de E.Coli, unido una proteína motor translocadora de
moléculas con mucha afinidad por el ADN. El poro está insertado en una membrana
sintética, parecida a una membrana celular, que separa dos espacios con distinta
concentración de iones. Los iones pasan libremente por el poro, pero cuando hay ADN se
obstruye la corriente de forma proporcional a la secuencia que está pasando. Ahora mismo
se está ajustando el algoritmo para la lectura de la secuencia, de manera que se puedan
diferenciar las bases metiladas, y abrir así puerta directamente a la lectura epigenética.
También se podrán secuenciar directamente el ARN y las proteínas.
En la diapositiva 37 se muestra un vídeo en 3D de esta técnica.
La secueciación mediante esta tecnología va a 500 pb por segundo. La precisión ha
aumentado hasta un 97% y va aumentar más, porque se está invirtiendo mucho dinero en
esta tecnología. Están desarrollando secuenciadores de distintos tamaños, tienen uno que
cabe en la palma de la mano, se puede enchufar a un portátil, y la secuenciación es en tiempo
real. Cuando hubo la epidemia de ébola en África se llevaron estos secuenciadores en los
hospitales de campaña, y en menos de 2 minutos se podía detectar el virus del ébola. Esto se
utilizó para caracterizar las distintas cepas.
DIAPOSITIVAS 33-38
En resumen, la NGS de tercera generación:
- es mucho más rápida que la de segunda generación.
- tiene unas lecturas muy rápidas, por encima de 500 Kb. Esto permitirá resolver genes muy
variables con haplotipos muy complejos, resolver la variación estructural (translocaciones,
inversiones, indels grandes, etc.).
- el mayor problema a día de hoy es que el error es bastante alto, comparado con el de la
segunda generación.
- las máquinas se están haciendo cada vez más pequeñas. Van a sacar un aparato que
permitirá secuenciar y almacenar la secuencia directamente en el teléfono móvil.
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DIAPOSITIVAS 39 Y 40
6. APLICACIONES Y CONCEPTOS CLAVE EN NGS
Las aplicaciones del NGS son innumerables.
Actualmente no se secuencian genomas enteros, lo máximo que se hace es el exoma, que en
total es un 2% del genoma. Para secuenciar solo la parte que nos interesa del genoma se
tiene que hacer una captura o enriquecimiento (target enrichment) de esa zona, para ello se
han desarrollado muchas tecnologías, aunque hoy en día hay dos que son las más
extendidas.
1. Targent enrichment por captura por hibridación: imaginemos que queremos la secuencia
codificante de 20 genes. Vamos a un fabricante y nos sintetizará sondas de ARN o ADN de
80-120 pb, s al final con biotina. A continuación cogeremos el ADN que queremos
secuenciar y lo hibridaremos con estas sondas, y así capturaremos la librería que nos
interesa. Después introducimos bolitas de estreptavidina, que tiene una alta afinidad por la
biotina, y así podremos aislar lo que ha hibridado con las sondas, que es lo que queremos
secuenciar (diapositiva 44). Esta tecnología se suele asociar a Illumina
2. Targent enrichment por captura por amplicones: básicamente son PCR multiplex
(diapositiva 45). Decimos al fabricante cuales son nuestras secuencias de interés, y ellos nos
optimizan una PCR multiplex. El producto de PCR que se obtiene, con unas pocas
modificaciones, ya está listo para secuenciar. El exoma entero se puede hacer con 24.000
PCR por tubo, y 8 tubos en total (Ion Torrent).
En la diapositiva 46 se muestran los pros y los contras de estos dos sistemas de captura.
La PCR permite partir de muy poca cantidad de ADN, mientras que la captura por
hibridación tiene una cobertura más homogénea. En los dos casos hay regiones que se
capturan mejor que otras.
Antes de empezar a secuenciar es muy importante saber que tecnología y que protocolo
vamos a utilizar.
DIAPOSITIVAS 42-46
