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Clonación y secuenciación del DNA 1
Clonación y secuenciación del DNA
Clonación y secuenciación del DNA
Clonación y secuenciación del DNA 2
Clonación y secuenciación del DNAClonación y secuenciación del DNADeberán quedar bien claros los siguientes puntos:
•¿Cómo se manipula el DNA?•Las endonucleasas (enzimas) de restricción•Mapas de restricción•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores•Métodos de detección a partir de una sonda de DNA: transferencia en Southern, sondeo de un gen clonado•Vectores eucarióticos•Organismos transgénicos•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)•La secuenciación del DNA
Deberán quedar bien claros los siguientes puntos:
•¿Cómo se manipula el DNA?•Las endonucleasas (enzimas) de restricción•Mapas de restricción•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores•Métodos de detección a partir de una sonda de DNA: transferencia en Southern, sondeo de un gen clonado•Vectores eucarióticos•Organismos transgénicos•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)•La secuenciación del DNA
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Manipulación del DNA
Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de secuencias.
Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico
La nueva tecnología se denomina:Tecnología del DNA recombinante, clonación
génica o ingeniería genética
Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica
Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:
El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado
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Herramienta básica
Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato.
•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar)
•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes
5´-GGATCC- 3´
3´-CCTAGG- 5´
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EcoRI: E. ColiBamHI: Bacillus amyloliquefaciens
Dos tipos de cortes:
•Corte plano: extremos romos
•Corte escalonado:extremos pegajosos o cohesivos
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Herramienta básica
Las enzimas de restricción tipo II:
Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos
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Población de fragmentos
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Separación fragmentos
Reptación de los
fragmentos a través del gel de agarosa
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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos
Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda
•Transferencia en Southern (Southern blotting)•Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA
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Transferencia en Southern
(esquema resumen)
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Uso de la enzimas de restricción para la construcción de mapas de restricción
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Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
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Usos de los Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
•Análisis de ligamiento que permite cartografiar y “cazar” genes asociados a enfermedades o rasgos fenotípicos (proyecto SNPs)
•Medicina forense: análisis de las huellas dactilares genéticas (DNA fingerprinting)
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Clonación del DNA
•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
•Vector de clonación (vehículo)
•Organismo huésped (E. Coli)
•Selección de vectores
Vector híbrido
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Vectores híbridos (quimera)Fragmentos de distintas procedencias que se unen in vitro tras cortarse con la misma enzima de restricción
Vectores de
clonación•Plásmido (1 sitio de corte) 2-15 kb•Fago (Lambda)•Cósmido
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Vectores de clonación
Fago (2 sitios de corte) < 24 kb
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Vectores de clonaciónCósmido: extremos cos + DNA plásmido (origen
replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb
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Huésped: E. coli
Inserción del vector híbrido en el huésped:
•Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma
•Fago (transducción, inserción en DNA huésped)
•Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)
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Selección de vectores híbridos
•Plásmido: resistencia a antibióticos
•Fago : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto foráneo)
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Obtención de la secuencia que se clona
•Un gen •Aislamiento a partir del mRNA: uso de la transcriptasa inversa que hace cDNA
•Síntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA con la ayuda del código (no región promotora ni controladora de la expresión) ~100bp
•Fragmentos del genoma por digestión con enzimas de restricción (perdigonada, Shotgun)
•Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo
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Transfección: Introducción de DNA foráneo en eucariotasOrganismo transgénico: un eucariota con DNA
foráneo
•Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente con fosfato cálcico (poco eficiente)
•Inyección en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma (ratones transgénicos 15% eficiencia)
Métodos transfección
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•Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA foráneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infección viral)
Métodos transfección
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•Electroporación: se usa corriente eléctrica para introducir DNA
•Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de membrana artificial)
•Biolística (mitocondrias y cloroplastos): disparo de proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA
•Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens) y elementos móviles
Métodos transfección
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•Sistemas marcadores (reporter systems): indican la expresión del gen insertado; p.e., enzima luciferasa de luciérnagas en plantas (el vector es el plásmido Ti de A. tumefaciens). Uso como marcador de la expresión de genes específicos
Sistemas de detección del inserto
Luciferina (substrato) + ATP -> luz->
luciferasa
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Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas
•Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs):
Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura)Puede incorporar más de 500 kb de DNA
Vectores eucarióticos
Origen de replicación del DNA de levadura
(ARS)
Región centromérica (CEN)
Resistencia a antibiótico (p.e., ampr)
Origen de replicación bacteriano (ori)
CEN ARSampr ori TelómeroTelómero
Linealización (con endonucleasas) y
adición de extremos teloméricos
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•Vectores animales: SV40, virus vacuolado del simio, de DNA, aunque partes cambiadas. Puede tranformar en cancerosas células conejo o hámster.
•Vectores de plantas: plásmido Ti de bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens, inductor de tumores cuando se integra en DNA huésped (agallas en dicotiledóneas)
Vectores eucarióticos
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La reacción
en cadena de la
polimerasa (PCR)
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Secuenciación de DNA
La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento más completo dela estructura y función de un gen.
Métodos:Secuenciación manual
Químico (Maxam y Gilbert 1977)
Didesoxi (Sanger 1977)
Secuenciación automatizada Didesoxi
Disoxi
•La base molecular de mutaciones específicas en un gen pueden investigarse•Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes•La comparación de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolución molecular
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Secuenciación del DNA
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Secuenciación automatizada del DNA
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